JP2021521135A - がん細胞を標的とする近赤外光線免疫療法および宿主免疫活性化の組合せ - Google Patents

がん細胞を標的とする近赤外光線免疫療法および宿主免疫活性化の組合せ Download PDF

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Abstract

本明細書では、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬の組合せによる、がんを有する被験体を処置する方法が提供される。特定の例では、方法は、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子をがんを有する被験体へと投与するステップであって、抗体が、腫瘍特異的抗原などのがん細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップを含む。方法は、治療有効量の１または複数の免疫調節薬（免疫系活性化剤、または免疫抑制細胞の阻害剤など）を、抗体−ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、約０〜２４時間以内）のいずれかで、被験体へと投与するステップも含む。被験体または被験体におけるがん細胞（例えば、腫瘍、または血液中のがん細胞）は、次いで、６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で照射される。

Description

関連出願の引用
本出願は、２０１８年４月１０日に出願された米国仮出願第６２／６５５，６１２号に対する優先権を主張し、その全体が本明細書に参考として援用される。
分野
本開示は、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートと、近赤外（ＮＩＲ）光による照射後に、細胞、例えば、がん細胞を死滅させる１または複数の免疫調節薬との組合せを用いる方法に関する。
連邦政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所の国立がん研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１ ＺＩＡ ＢＣ ０１１５１３およびＺ０１ ＺＩＡ ＢＣ ０１０６５７の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
がんには複数の療法が存在するが、腫瘍細胞を有効に死滅させる一方で、非がん性細胞は傷つけない療法が依然として必要とされている。
手術、放射線療法、および化学療法を含めた従来のがん療法の副作用を最小化するために、分子的に標的化されたがん療法が開発されている。既存の標的化療法の中では、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）療法の歴史が最も長い。２５を超える治療用ＭＡｂが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている（Waldmann、Nat Med、９巻：２６９〜２７７頁、２００３年；Reichertら、Nat Biotechnol、２３巻：１０７３〜１０７８頁、２００５年）。有効なＭＡｂ療法は従来、３つの機構：抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、および受容体の遮断に依存しており、複数の高用量のＭＡｂを必要とする。ＭＡｂはまた、より低い用量で、放射性核種などの治療剤を送達するためのベクター（Goldenbergら、J Clin Oncol ２４巻、８２３〜８３４頁、２００６年）として、または化学的毒素もしくは生物学的毒素（Pastanら、Nat Rev Cancer、６巻：５５９〜５６５頁、２００６年）としても用いられている。しかし、最終的に、用量制限毒性は、抗体コンジュゲートの生体分布および異化と関係している。
近赤外（ＮＩＲ）域の励起光自体は無害であるが、現行で利用可能な非標的化光増感剤はまた、正常組織にも取り込まれ、したがって、副作用を引き起こすため、光増感剤を非イオン化光の物理的エネルギーと組み合わせて細胞を死滅させる従来の光力学療法は、一般には、がん療法に使用されることが少ない。免疫調節性抗体、がんワクチンおよび細胞療法の使用を含むがん免疫療法も、がんの制御における戦略になっている（Chen and Mellman, Immunity 39:1-10, 2013；Childs and Carsten, Nat. Rev. Drug Discov. 14:487-498, 2015；June et al., Sci. Transl. Med. 7:280ps7, 2015；Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15:457-472, 2015）。
近赤外光線免疫療法（ＮＩＲ−ＰＩＴ）は、標的化モノクローナル抗体−光吸収体コンジュゲート（ＡＰＣ）を使用するがんの処置である。腫瘍細胞表面抗原へのＡＰＣの抗体局在化の後、ＮＩＲ光を使用して、非常に選択的な細胞溶解を誘導する。ＮＩＲ−ＰＩＴは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化する自然免疫リガンドをもたらす迅速な壊死性細胞死を誘導し、これは、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）と符合する。ＮＩＲ−ＰＩＴが腫瘍細胞を死滅させる方法の説明は、Sato et al. (ACS Cent. Sci. 4:1559-69, 2018)に記載されている。略述すると、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートのその標的への結合の後、ＮＩＲ光による活性化は、細胞膜内で物理的ストレスを誘導する抗体−抗原複合体の形状の物理的変化を引き起こし、膜貫通水流の増加をもたらし、最終的に細胞の破裂および壊死性細胞死をもたらす。しかし、野生型マウスにおける同系腫瘍のＮＩＲ−ＰＩＴ処置は、大部分は、確立された腫瘍の永続的な退縮をもたらさなかった。
Waldmann、Nat Med、９巻：２６９〜２７７頁、２００３年 Reichertら、Nat Biotechnol、２３巻：１０７３〜１０７８頁、２００５年 Goldenbergら、J Clin Oncol ２４巻、８２３〜８３４頁、２００６年 Pastanら、Nat Rev Cancer、６巻：５５９〜５６５頁、２００６年 Chen and Mellman, Immunity 39:1-10, 2013 Childs and Carsten, Nat. Rev. Drug Discov. 14:487-498, 2015 June et al., Sci. Transl. Med. 7:280ps7, 2015 Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15:457-472, 2015 Sato et al. (ACS Cent. Sci. 4:1559-69, 2018）
開示の概要
現在利用可能ながん療法は、がん細胞の直接標的化、または宿主免疫系の活性化のいずれかを意図する。がん細胞の殺滅、およびがん細胞に対する宿主免疫系の活性化の両方を達成する現在利用可能ながん療法はない。加えて、現在のがん免疫療法は、再発についての懸念なしに、完全ながんの処置のために必要な長期間有効なメモリーＴ細胞を産生させること、つまり、いわゆる「ワクチン」効果をもたらすことに成功していない。本明細書で開示される方法により、がんの局所的もしくは全身的再発を有意に減少させるか、またはさらに防止する、長期間作用するメモリーＴ細胞を効果的に産生することができる。
本明細書では、抗体−ＩＲ７００分子およびＮＩＲ光線免疫療法（ＰＩＴ）と免疫調節薬との組合せによる、がんを有する被験体を処置する方法が提供される。特定の例では、方法は、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子をがんを有する被験体へと投与するステップであって、抗体が、腫瘍特異的抗原などのがん細胞表面分子に特異的に結合するステップを含む。方法は、治療有効量の１または複数の免疫調節薬（免疫系活性化剤、または免疫抑制細胞の阻害剤など）を、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、互いに約０〜２４時間以内）のいずれかで、被験体へと投与するステップも含む。被験体または被験体におけるがん細胞（例えば、腫瘍、または血液中のがん細胞）は、次いで、６６０〜７１０ｎｍなど（例えば、６８０ｎｍ）、６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２（少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２など）の線量で照射される。一部の例では、方法が、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できるがん細胞表面タンパク質を発現する、腫瘍を有するがんまたはがんを有する被験体を選択するステップをさらに含みうる。
一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子は、がん細胞表面の１または複数のタンパク質（受容体など）に結合する抗体を含み、ここで、がん細胞表面のタンパク質は、非がん細胞（正常な健常細胞など）に有意には見出されず、したがって、抗体は、非がん細胞に有意には結合しない。一例では、がん細胞表面タンパク質が、ＣＤ４４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、またはＰＳＭＡなど、腫瘍特異的タンパク質である。さらなる例示的な腫瘍特異的タンパク質および抗体が本明細書（以下の表１を含む）で提供される。
特定の実施形態では、免疫調節薬には、拮抗性ＰＤ−１抗体、拮抗性ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＣＤ２５抗体−ＩＲ７００分子など、１または複数の免疫系活性化剤および／または免疫抑制細胞の阻害剤が挙げられる。一部の例では、免疫抑制細胞の阻害剤は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の活性を阻害し、および／または死滅させる。他の例では、免疫系活性化剤には、１または複数のインターロイキン（ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５など）が挙げられる。一部の例では、免疫調節薬は、がん細胞によって発現される１または複数のタンパク質に特異的なメモリーＴ細胞の産生を増加させうる。
また、標的細胞に特異的なメモリーＴ細胞を産生させる方法も提供される。特定の例では、方法は、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を被験体へと投与するステップであって、抗体が、標的細胞上の細胞表面分子（腫瘍特異的タンパク質など）に特異的に結合するステップを含む。方法は、治療有効量の１または複数の免疫調節薬（免疫系活性化剤、または免疫抑制細胞の阻害剤など）を、抗体−ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、約０〜２４時間以内）のいずれかで、被験体へと投与するステップも含む。被験体または被験体における標的細胞に、次いで、６６０〜７１０ｎｍ（例えば、６８０ｎｍ）など、６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２（少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２など）の線量で照射し、これにより、メモリーＴ細胞が産生する。
本開示の上記の特色および他の特色は、複数の実施形態についての以下の詳細な記載であって、付属の図面に言及しながら進む記載からいっそう明らかとなる。
図１Ａ〜１Ｅは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＮＩＲ−ＰＩＴと抗ＣＤ４４−ＩＲ７００のｉｎ ｖｉｔｒｏの効果を示す一連のパネルである。図１Ａは、ＦＡＣＳによるＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＣＤ４４の発現を示す。図１Ｂは、対照および抗ＣＤ４４−ＩＲ７００で処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の、微分干渉（ＤＩＣ）を示すデジタル画像、および蛍光顕微鏡法画像である。壊死性細胞死は、処置された細胞において、ＮＩＲ光での励起の際に観察された。図１Ｃは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＮＩＲ光線量依存性のルシフェラーゼ活性を示す１０ｃｍディッシュの生物発光イメージング（ＢＬＩ）のデジタル画像である。図１Ｄは、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図１Ｅは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いる死細胞カウントで測定された、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞における細胞死の百分率を示すグラフである。スチューデントのｔ検定により、＊非処置対照と対比してＰ＜０．０５；＊＊非処置対照と対比してＰ＜０．０１。 図１Ａ〜１Ｅは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＮＩＲ−ＰＩＴと抗ＣＤ４４−ＩＲ７００のｉｎ ｖｉｔｒｏの効果を示す一連のパネルである。図１Ａは、ＦＡＣＳによるＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＣＤ４４の発現を示す。図１Ｂは、対照および抗ＣＤ４４−ＩＲ７００で処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の、微分干渉（ＤＩＣ）を示すデジタル画像、および蛍光顕微鏡法画像である。壊死性細胞死は、処置された細胞において、ＮＩＲ光での励起の際に観察された。図１Ｃは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＮＩＲ光線量依存性のルシフェラーゼ活性を示す１０ｃｍディッシュの生物発光イメージング（ＢＬＩ）のデジタル画像である。図１Ｄは、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図１Ｅは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いる死細胞カウントで測定された、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞における細胞死の百分率を示すグラフである。スチューデントのｔ検定により、＊非処置対照と対比してＰ＜０．０５；＊＊非処置対照と対比してＰ＜０．０１。 図１Ｆおよび１Ｇは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いる死細胞カウントで測定された、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置された（Ｆ）ＬＬＣ細胞または（Ｇ）ＭＯＣ１細胞における細胞死の百分率を示すグラフである。スチューデントのｔ検定により、＊非処置対照と対比してＰ＜０．０５；＊＊非処置対照と対比してＰ＜０．０１。 図２Ａ〜２Ｃは、ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍区画内のベースラインのＣＤ４４発現である。（Ａ）サイズが一致したＭＯＣ１腫瘍（２４日目）、ＬＬＣ腫瘍（１０日目）およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目）を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して個別の細胞型におけるＣＤ４４発現について評価した（ｎ＝３／群）。代表的なドットプロットおよび腫瘍消化のゲーティング戦略を示した。各細胞型の細胞表面表現型を棒グラフの上部に示した。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４４−ＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＣＤ４４−ＩＲ７００のｉ．ｖ．注射２４時間後のＭＯＣ１腫瘍（１８日目）、ＬＬＣ腫瘍（４日目）およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（４日目）の画像を得た。ＣＤ４４−ＩＲ７００の蛍光強度は、他の２つの腫瘍と比較して、ＭＣ３８腫瘍で高かった。（Ｃ）ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍におけるＩＲ７００の強度の定量分析。蛍光強度は、他の腫瘍と比較して、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍で有意に高かった（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊＊ＭＯＣ１およびＬＬＣ腫瘍と対比して、ｐ＜０．００１）。 図２Ａ〜２Ｃは、ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍区画内のベースラインのＣＤ４４発現である。（Ａ）サイズが一致したＭＯＣ１腫瘍（２４日目）、ＬＬＣ腫瘍（１０日目）およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目）を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して個別の細胞型におけるＣＤ４４発現について評価した（ｎ＝３／群）。代表的なドットプロットおよび腫瘍消化のゲーティング戦略を示した。各細胞型の細胞表面表現型を棒グラフの上部に示した。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４４−ＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＣＤ４４−ＩＲ７００のｉ．ｖ．注射２４時間後のＭＯＣ１腫瘍（１８日目）、ＬＬＣ腫瘍（４日目）およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（４日目）の画像を得た。ＣＤ４４−ＩＲ７００の蛍光強度は、他の２つの腫瘍と比較して、ＭＣ３８腫瘍で高かった。（Ｃ）ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍におけるＩＲ７００の強度の定量分析。蛍光強度は、他の腫瘍と比較して、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍で有意に高かった（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊＊ＭＯＣ１およびＬＬＣ腫瘍と対比して、ｐ＜０．００１）。 図３Ａ〜３Ｇは、片側腫瘍モデルにおけるＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍についてのがん標的化ＰＩＴ（抗ＣＤ４４−ＩＲ７００）およびチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１）の組合せ療法のｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す一連のパネルである。（Ａ）片側腫瘍／ＮＩＲ−ＰＩＴについての処置スキーム、ならびに表示される時点での蛍光および生物発光イメージング；（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング；（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｄ）４つの処置群におけるルシフェラーゼ活性の定量（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｆ）腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂおよびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）；ならびに（Ｇ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のカプランマイヤー生存解析（＊＊ログランク検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ログランク検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図３Ａ〜３Ｇは、片側腫瘍モデルにおけるＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍についてのがん標的化ＰＩＴ（抗ＣＤ４４−ＩＲ７００）およびチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１）の組合せ療法のｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す一連のパネルである。（Ａ）片側腫瘍／ＮＩＲ−ＰＩＴについての処置スキーム、ならびに表示される時点での蛍光および生物発光イメージング；（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング；（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｄ）４つの処置群におけるルシフェラーゼ活性の定量（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｆ）腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂおよびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）；ならびに（Ｇ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のカプランマイヤー生存解析（＊＊ログランク検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ログランク検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図３Ａ〜３Ｇは、片側腫瘍モデルにおけるＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍についてのがん標的化ＰＩＴ（抗ＣＤ４４−ＩＲ７００）およびチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１）の組合せ療法のｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す一連のパネルである。（Ａ）片側腫瘍／ＮＩＲ−ＰＩＴについての処置スキーム、ならびに表示される時点での蛍光および生物発光イメージング；（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング；（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｄ）４つの処置群におけるルシフェラーゼ活性の定量（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｆ）腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂおよびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）；ならびに（Ｇ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のカプランマイヤー生存解析（＊＊ログランク検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ログランク検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図３Ａ〜３Ｇは、片側腫瘍モデルにおけるＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍についてのがん標的化ＰＩＴ（抗ＣＤ４４−ＩＲ７００）およびチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１）の組合せ療法のｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す一連のパネルである。（Ａ）片側腫瘍／ＮＩＲ−ＰＩＴについての処置スキーム、ならびに表示される時点での蛍光および生物発光イメージング；（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング；（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｄ）４つの処置群におけるルシフェラーゼ活性の定量（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｆ）腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、＊＊ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂおよびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）；ならびに（Ｇ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のカプランマイヤー生存解析（＊＊ログランク検定により、対照と対比してｐ＜０．０１；＃＃ログランク検定により、ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図４Ａ〜４Ｄは、片側ＬＬＣ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴ単独、またはＰＤ−１ ｍＡｂとの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｃ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のＬＬＣ腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、＊＊対照と対比してｐ＜０．０１、＃＃ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。（Ｄ）カプランマイヤー生存解析（ｎ≧１０、ログランク検定により、対照と対比して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；＃＃ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図４Ａ〜４Ｄは、片側ＬＬＣ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴ単独、またはＰＤ−１ ｍＡｂとの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｃ）ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のＬＬＣ腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーのｔ検定により、＊＊対照と対比してｐ＜０．０１、＃＃ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。（Ｄ）カプランマイヤー生存解析（ｎ≧１０、ログランク検定により、対照と対比して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；＃＃ＰＤ−１ ｍＡｂ群およびＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０１）。 図５Ａ〜５Ｄは、片側ＭＯＣ１腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴ単独、またはＰＤ−１ ｍＡｂとの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｃ）ＰＤ−１有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のＭＯＣ１腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊対照と対比してｐ＜０．０１）。（Ｄ）カプランマイヤー生存解析（ｎ≧１０、ログランク検定により、対照と対比して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図５Ａ〜５Ｄは、片側ＭＯＣ１腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴ単独、またはＰＤ−１ ｍＡｂとの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＰＤ−１ ｍＡｂ群におけるマウスもＣＤ４４−ＩＲ７００を受けたが、ＮＩＲで処置されなかった。（Ｃ）ＰＤ−１有りおよび無しのＮＩＲ−ＰＩＴ処置後のＭＯＣ１腫瘍成長曲線（ｎ≧１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊対照と対比してｐ＜０．０１）。（Ｄ）カプランマイヤー生存解析（ｎ≧１０、ログランク検定により、対照と対比して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図６Ａ〜６Ｆは、片側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）マルチプレックス免疫蛍光法を用いて、フローサイトメトリーのデータを検証した。代表的な４００倍の画像を示した。腫瘍当たり５つの高倍率視野（ＨＰＦ）からの浸潤ＴＩＬの定量、ｎ＝３／群。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）腫瘍浸潤好中球骨髄性細胞（ＰＭＮ−ミエロイド）および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｆ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、対照と比較して＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ＝５／群。 図６Ａ〜６Ｆは、片側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）マルチプレックス免疫蛍光法を用いて、フローサイトメトリーのデータを検証した。代表的な４００倍の画像を示した。腫瘍当たり５つの高倍率視野（ＨＰＦ）からの浸潤ＴＩＬの定量、ｎ＝３／群。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）腫瘍浸潤好中球骨髄性細胞（ＰＭＮ−ミエロイド）および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｆ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、対照と比較して＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ＝５／群。 図６Ａ〜６Ｆは、片側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）マルチプレックス免疫蛍光法を用いて、フローサイトメトリーのデータを検証した。代表的な４００倍の画像を示した。腫瘍当たり５つの高倍率視野（ＨＰＦ）からの浸潤ＴＩＬの定量、ｎ＝３／群。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）腫瘍浸潤好中球骨髄性細胞（ＰＭＮ−ミエロイド）および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｆ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、対照と比較して＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ＝５／群。 図７Ａ〜７Ｅは、片側ＬＬＣ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＬＬＣ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）腫瘍浸潤顆粒球ミエロイド由来サプレッサー細胞ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図７Ａ〜７Ｅは、片側ＬＬＣ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＬＬＣ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）腫瘍浸潤顆粒球ミエロイド由来サプレッサー細胞ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ａ〜８Ｅは、ＭＯＣ１腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＯＣ１腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図８Ａ〜８Ｅは、ＭＯＣ１腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＯＣ１腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図８Ａ〜８Ｅは、ＭＯＣ１腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＯＣ１腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図８Ａ〜８Ｅは、ＭＯＣ１腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴと、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ有りおよび無しとで処置されたＭＯＣ１腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）ならびに対照を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞およびＣＤ４５．２＋ＣＤ３１−免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図９は、相対的な腫瘍関連抗原の遺伝子発現である。ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞およびＭＯＣ１細胞を、処理し、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープをコードする領域に隣接するように設計された特別注文のプライマーを用いるｑＲＴ−ＰＣＲにより、ｐ１５Ｅ、Ｂｉｒｂ５、Ｔｗｉｓｔ１およびＴｒｐ５３の遺伝子発現について評価した（ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。各モデルについてＴＩＬにおけるベースラインの抗原特異的ＩＦＮγ応答に対する相対的抗原発現レベルの二次元プロットを下部に示した。 図１０Ａ〜１０Ｈは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、両側下側腹部腫瘍を担持するマウスにおいて、右側の腫瘍のみに投与した。処置されていない左側の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスにおける各腫瘍からのルシフェラーゼ活性の定量（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの右側および左側の腫瘍の成長曲線。（Ｈ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからのカプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１０Ａ〜１０Ｈは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、両側下側腹部腫瘍を担持するマウスにおいて、右側の腫瘍のみに投与した。処置されていない左側の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスにおける各腫瘍からのルシフェラーゼ活性の定量（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの右側および左側の腫瘍の成長曲線。（Ｈ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからのカプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１０Ａ〜１０Ｈは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、両側下側腹部腫瘍を担持するマウスにおいて、右側の腫瘍のみに投与した。処置されていない左側の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスにおける各腫瘍からのルシフェラーゼ活性の定量（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの右側および左側の腫瘍の成長曲線。（Ｈ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからのカプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１０Ａ〜１０Ｈは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、両側下側腹部腫瘍を担持するマウスにおいて、右側の腫瘍のみに投与した。処置されていない左側の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスにおける各腫瘍からのルシフェラーゼ活性の定量（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの右側および左側の腫瘍の成長曲線。（Ｈ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからのカプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１１Ａ〜１１Ｅは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＰＤ−１ ｍＡｂと、ＮＩＲ−ＰＩＴ有りおよび無しとで処置された両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）、ならびに両側対照腫瘍を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図１１Ａ〜１１Ｅは、両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの免疫相関効果ならびに機能性効果である。（Ａ）ＰＤ−１ ｍＡｂと、ＮＩＲ−ＰＩＴ有りおよび無しとで処置された両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍（１０日目、ｎ＝５／群）、ならびに両側対照腫瘍を、採取し、単一細胞懸濁物へと消化し、フローサイトメトリーを介して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤について解析した。解析される１．５×１０４個生細胞当たりの浸潤細胞の絶対数として表した。ＰＤ−１発現を差し込み図として示す（ＭＦＩ、平均蛍光強度）。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＴＩＬを、ＩＬ−２勾配を介して上記の通りに処置された腫瘍から抽出し（ｎ＝５／群）、負の磁気選択を介して富化し、選択された腫瘍関連抗原に由来する公知のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを提示するペプチドでパルスされた照射脾細胞で刺激した。刺激の２４時間後に収集された上清に由来するＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。脾細胞（ＡＰＣ）単独に由来する上清、ＴＩＬ（Ｔ）単独、およびオボアルブミン（ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを対照として用いた。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ発現に基づくマクロファージの極性化の定量による、腫瘍浸潤樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）腫瘍浸潤ＰＭＮ−ミエロイドおよびＴｒｅｇのフローサイトメトリー解析。ＡＮＯＶＡを用いたｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｅ）ＣＤ４５．２−ＣＤ３１−ＰＤＧＦＲ−腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のフローサイトメトリー解析。Ｎ＝５／群。 図１２Ａ〜１２Ｈは、複数のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、４つの腫瘍を担持するマウスにおいて、尾側の右側の腫瘍のみに投与した。全ての他の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）尾側の右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）尾側の右側の腫瘍のみのＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの全ての腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の定量。尾側の右側の腫瘍のみがＮＩＲ−ＰＩＴ処置を受けた（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せを受けているマウスに由来する処置された腫瘍および処置されていない腫瘍からの成長曲線。（Ｈ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１２Ａ〜１２Ｈは、複数のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、４つの腫瘍を担持するマウスにおいて、尾側の右側の腫瘍のみに投与した。全ての他の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）尾側の右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）尾側の右側の腫瘍のみのＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの全ての腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の定量。尾側の右側の腫瘍のみがＮＩＲ−ＰＩＴ処置を受けた（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せを受けているマウスに由来する処置された腫瘍および処置されていない腫瘍からの成長曲線。（Ｈ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１２Ａ〜１２Ｈは、複数のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、４つの腫瘍を担持するマウスにおいて、尾側の右側の腫瘍のみに投与した。全ての他の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）尾側の右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）尾側の右側の腫瘍のみのＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの全ての腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の定量。尾側の右側の腫瘍のみがＮＩＲ−ＰＩＴ処置を受けた（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せを受けているマウスに由来する処置された腫瘍および処置されていない腫瘍からの成長曲線。（Ｈ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１２Ａ〜１２Ｈは、複数のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果を示す。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ光を、４つの腫瘍を担持するマウスにおいて、尾側の右側の腫瘍のみに投与した。全ての他の腫瘍は、ＮＩＲ光から遮蔽した。（Ｃ）尾側の右側の腫瘍のみに対してＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。（Ｄ）尾側の右側の腫瘍のみのＮＩＲ−ＰＩＴ処置に応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＢＬＩ。（Ｅ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せで処置されたマウスからの全ての腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の定量。尾側の右側の腫瘍のみがＮＩＲ−ＰＩＴ処置を受けた（ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）切除された腫瘍（１０日目）をＨ＆Ｅで染色し、壊死および白血球浸潤について評価した。白色のスケールバー＝１００μｍ。黒色のスケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）対照、ならびにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せを受けているマウスに由来する処置された腫瘍および処置されていない腫瘍からの成長曲線。（Ｈ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝１０、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊ｐ＜０．０１；生存についてのログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１３Ａ〜１３Ｃは、ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂ処置の組合せによる完全な腫瘍拒絶後のＭＣ３８−ｌｕｃ細胞による再負荷に対する抵抗性である。（Ａ）組合せ処置により腫瘍が完全に拒絶された（ＣＲ）マウスにおける腫瘍再負荷のレジメン。腫瘍を、最初の接種の３０日後に反対側に接種した。ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の再接種を受けているマウス。（Ｂ）反対側の側腹部においてＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を負荷された対照およびＣＲマウスの成長曲線。（Ｃ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝９、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１；生存についてのログランク検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１３Ａ〜１３Ｃは、ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂ処置の組合せによる完全な腫瘍拒絶後のＭＣ３８−ｌｕｃ細胞による再負荷に対する抵抗性である。（Ａ）組合せ処置により腫瘍が完全に拒絶された（ＣＲ）マウスにおける腫瘍再負荷のレジメン。腫瘍を、最初の接種の３０日後に反対側に接種した。ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の再接種を受けているマウス。（Ｂ）反対側の側腹部においてＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を負荷された対照およびＣＲマウスの成長曲線。（Ｃ）カプランマイヤー生存解析（ｎ＝９、成長曲線についてのＡＮＯＶＡを用いたテューキーの検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１；生存についてのログランク検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１４Ａ〜１４Ｃは、抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の注射後のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光イメージング。（Ａ）腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍において、腫瘍は、抗体−光吸収体コンジュゲート（ＡＰＣ）注射後に高い蛍光強度を示し、強度は、注射の２４時間後まで徐々に増加し、安定になり、次いで４８時間後に低減した。（Ｂ）ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍（各群においてｎ＝５）における平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量分析。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍におけるＩＲ７００のＭＦＩは、ＡＰＣ注射後２４時間以内に高い取込みを示すとすぐに４８時間後に低減した。経時的な全体的なＭＦＩは、全ての時点でＭＯＣ１腫瘍と比較してＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍において有意に高く（＊テューキー−クレーマー検定により、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）、２４および４８時間でのＭＦＩは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＬＬ／２腫瘍において有意に高かった（＊＊テューキー−クレーマー検定により、ＬＬ／２腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍（各群においてｎ＝５）における標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）の定量分析。ＴＢＲは、ＡＰＣ注射の２４時間後まで徐々に増加し、続いて、４８時間後にＴＢＲは低減した。２４時間後でのＴＢＲは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬ／２腫瘍において有意に高く（＊テューキー−クレーマー検定により、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）、４８時間後でのＴＢＲは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＬＬ／２腫瘍において高かった（＊＊テューキー−クレーマー検定により、ＬＬ／２腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）。 図１４Ａ〜１４Ｃは、抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の注射後のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光イメージング。（Ａ）腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍において、腫瘍は、抗体−光吸収体コンジュゲート（ＡＰＣ）注射後に高い蛍光強度を示し、強度は、注射の２４時間後まで徐々に増加し、安定になり、次いで４８時間後に低減した。（Ｂ）ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍（各群においてｎ＝５）における平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量分析。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍におけるＩＲ７００のＭＦＩは、ＡＰＣ注射後２４時間以内に高い取込みを示すとすぐに４８時間後に低減した。経時的な全体的なＭＦＩは、全ての時点でＭＯＣ１腫瘍と比較してＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍において有意に高く（＊テューキー−クレーマー検定により、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）、２４および４８時間でのＭＦＩは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＬＬ／２腫瘍において有意に高かった（＊＊テューキー−クレーマー検定により、ＬＬ／２腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍（各群においてｎ＝５）における標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）の定量分析。ＴＢＲは、ＡＰＣ注射の２４時間後まで徐々に増加し、続いて、４８時間後にＴＢＲは低減した。２４時間後でのＴＢＲは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬ／２腫瘍において有意に高く（＊テューキー−クレーマー検定により、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）、４８時間後でのＴＢＲは、ＭＯＣ１腫瘍と比較してＬＬ／２腫瘍において高かった（＊＊テューキー−クレーマー検定により、ＬＬ／２腫瘍をＭＯＣ１腫瘍と対比してｐ＜０．０５）。 図１５Ａ〜１５Ｆは、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍モデルについてのＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴの前に、腫瘍は、およそ同じサイズであり、同様の生物発光を示した。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの後にルシフェラーゼ活性の低減を示し、そして、徐々に増加するか（再成長）、または消滅するか（治癒）のいずれかであった。（Ｄ）腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴの前後でのルシフェラーゼ活性の定量分析。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群におけるルシフェラーゼ活性は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、３、４、５、６および７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにおけるルシフェラーゼ活性は、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、５、７および１０日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７および１０日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合されたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｆ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１５Ａ〜１５Ｆは、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍モデルについてのＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴの前に、腫瘍は、およそ同じサイズであり、同様の生物発光を示した。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの後にルシフェラーゼ活性の低減を示し、そして、徐々に増加するか（再成長）、または消滅するか（治癒）のいずれかであった。（Ｄ）腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴの前後でのルシフェラーゼ活性の定量分析。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群におけるルシフェラーゼ活性は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、３、４、５、６および７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにおけるルシフェラーゼ活性は、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、５、７および１０日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７および１０日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合されたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｆ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１５Ａ〜１５Ｆは、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍モデルについてのＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴの前に、腫瘍は、およそ同じサイズであり、同様の生物発光を示した。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの後にルシフェラーゼ活性の低減を示し、そして、徐々に増加するか（再成長）、または消滅するか（治癒）のいずれかであった。（Ｄ）腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴの前後でのルシフェラーゼ活性の定量分析。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群におけるルシフェラーゼ活性は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、３、４、５、６および７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにおけるルシフェラーゼ活性は、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、５、７および１０日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７および１０日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合されたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｆ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１５Ａ〜１５Ｆは、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍モデルについてのＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。生物発光画像および蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴの前に、腫瘍は、およそ同じサイズであり、同様の生物発光を示した。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの後にルシフェラーゼ活性の低減を示し、そして、徐々に増加するか（再成長）、または消滅するか（治癒）のいずれかであった。（Ｄ）腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴの前後でのルシフェラーゼ活性の定量分析。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群におけるルシフェラーゼ活性は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、３、４、５、６および７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにおけるルシフェラーゼ活性は、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７日後に有意な低減を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｅ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２、５、７および１０日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの７および１０日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合されたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｆ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝１３〜１４匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１６Ａ〜１６Ｄは、ＬＬ／２腫瘍モデルにおけるＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。ＩＲ７００蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの５、７、１０および１２日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群の中で、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの１７日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝９匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｄ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝９匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１６Ａ〜１６Ｄは、ＬＬ／２腫瘍モデルにおけるＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。ＩＲ７００蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの５、７、１０および１２日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群の中で、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの１７日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝９匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｄ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝９匹のマウス、ログランク検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１７Ａ〜１７Ｄは、ＭＯＣ１腫瘍モデルにおけるＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。ＩＲ７００蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの４、７、１０、１４、１７、２１、２４および２８日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２８日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｄ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、ログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１７Ａ〜１７Ｄは、ＭＯＣ１腫瘍モデルにおけるＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏの効果である。（Ａ）ＮＩＲ−ＰＩＴレジメン。ＩＲ７００蛍光画像は、表示される各時点で得た。（Ｂ）ＮＩＲ−ＰＩＴに応答した腫瘍担持マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲ７００の蛍光のリアルタイムのイメージング。ＮＩＲ−ＰＩＴによって処置された腫瘍は、ＮＩＲ−ＰＩＴの直後にＩＲ７００の蛍光強度の低減を示した。（Ｃ）全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍成長は、対照群と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの４、７、１０、１４、１７、２１、２４および２８日後に有意に阻害された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊テューキー−クレーマー検定により、他の群と対比してｐ＜０．０５）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較してＮＩＲ−ＰＩＴの２８日後に有意な腫瘍減少を示した（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊テューキー−クレーマー検定により、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群と対比してｐ＜０．０５）。（Ｄ）有意に延長された生存は、対照群と比較して全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群において観察された（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、＊＊ログランク検定により、ｐ＜０．０１）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して有意に延長された生存を示した（各群においてｎ＝９〜１０匹のマウス、ログランク検定により、＊＊ｐ＜０．０１）。 図１８は、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ誘導免疫療法の提案機構を説明するスキームである。Ｔｒｅｇ細胞は、阻害性サイトカインおよび細胞溶解により、ならびにＩＬ−２摂取による代謝破壊により、および樹状細胞（ＤＣ）成熟または機能の調節により、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の抑制を通じて抗腫瘍免疫を制限する。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４＋腫瘍における免疫原性細胞死を誘導し、ＣＤ２５を高度に発現するＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる。第１に、免疫原性細胞死のプロセスの間に、表面カルレティキュリンの曝露、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）７０／９０、ならびに死滅した腫瘍細胞からのＡＴＰおよび高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出は、ＤＣ成熟を誘導する。第２に、Ｔｒｅｇ細胞枯渇は、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増大、ならびに同時に腫瘍特異的Ｔ細胞への分化を誘導する。総合すると、この組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴは、有効な腫瘍殺滅、および持続性の抗腫瘍免疫の促進をもたらす。
いくつかの実施形態の詳細な説明
別段に説明されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。文脈が明らかに別のことを示していない限り、単数形の用語である「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」は、複数形の言及を含む。同様に、「または」という語も、文脈が明らかに別のことを示していない限り、「および」を含むことを意図する。「〜を含む（complising）」は、「〜を含む（including）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む（complising A or B）」は、「Ａを含む（including A）」もしくは「Ｂを含む（including B）」、または「ＡおよびＢを含む（including A and B）」を意味する。
以下では、本開示の実施形態を実施および／または試行するのに適する方法および材料が記載される。このような方法および材料は、例示であるだけであって、限定することを意図するものではない。本明細書に記載される方法および材料と類似するかまたは同等な他の方法および材料も用いることができる。例えば、開示される発明が関係する、当技術分野で周知の従来の方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年; Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Press、２００１年; Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、１９９２年（および２０００年版への増補版）； Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、第４版、Wiley & Sons、１９９９年; HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９０年；ならびにHarlowおよびLane、Using Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９９年を含めた、様々な、一般的で、かつ、より具体的な参考文献に記載されている。
本明細書で言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号と関連する配列は、２０１８年４月１０日現在で入手可能な配列を参照することにより組み込まれる。
本開示の様々な実施形態の精査を容易とするために、特定の用語についての以下の説明が提供される。
投与：被験体に、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬などの作用物質（ａｇｅｎｔ）を、任意の有効な経路により服用させるかまたは施すこと。例示的な投与経路には、局所経路、全身または局所での注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）、経口経路、眼経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体：少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドであって、腫瘍特異的タンパク質など、抗原のエピトープを特異的に認識し、これに結合するポリペプチドリガンド。抗体は重鎖および軽鎖からなり、それらの各々が、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と称する可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は併せて、抗体により認識される抗原の結合に関与する。
抗体（例えば、抗体−ＩＲ７００分子におけるもの）には、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンおよびバリアント、ならびにＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）など、抗体の部分が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質が、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域をリンカーで結合させた融合タンパク質であるのに対し、ｄｓＦｖでは、鎖の会合を安定化させるためのジスルフィド結合を導入するように、鎖を変異させている。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）など、遺伝子操作された形態も含む。また、Pierce Catalog and Handbook、１９９４〜１９９５年（Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）; Kuby, J.、Immunology、第３版、W. H. Freeman & Co.、New York、１９９７年も参照されたい。
典型的に、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続している重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖にはラムダ（λ）鎖およびカッパ（ｋ）鎖という２つの種類がある。５つの主要な重鎖のクラス（またはアイソタイプ）が存在し、それは、抗体分子：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの機能的活性を決定する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた、「ドメイン」としても公知である）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域が組み合わされて抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともまた呼ばれる３つの超可変領域を挟み込んだ、「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの広がりは規定されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services、１９９１年を参照されたい）。今日では、Ｋａｂａｔによるデータベースが、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなど、種内で比較的保存されている。構成要素の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを三次元空間に配置し整列させるように働く。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的に、Ｎ末端から始めて順次番号付けされてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称し、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨのＣＤＲ３が、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置する一方、ＶＬのＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ））を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体によって変化するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけが、抗原の結合に直接的に関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置を、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。
「ＶＨ」または「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの重鎖の可変領域を含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖の可変領域を含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、Ｂリンパ球の単一クローンにより産生される抗体、または単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞の、脾臓の免疫細胞との融合体に由来する、ハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子中の抗体は、ヒト化ｍＡｂなど、ｍＡｂである。
「キメラ抗体」は、ヒトなど、１つの種に由来するフレームワーク残基と、メソテリンに特異的に結合するマウス抗体など、別の種に由来するＣＤＲ（一般に、抗原の結合を付与する）とを有する。
「ヒト化」免疫グロブリンとは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンに由来する１または複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンを、「ドナー」と称し、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンを、「アクセプター」と称する。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおいてドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は、存在しなくともよいが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、約９５％以上など、少なくとも約８５〜９０％同一でなければならない。よって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖免疫グロブリンとヒト化重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたはヒト化抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから選択したアミノ酸による、限られた数の置換を有しうる。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原の結合または他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換を有しうる。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
「ヒト」抗体（また、「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）とは、ヒト免疫グロブリンに由来するヒトフレームワーク領域と、ＣＤＲの全てとを含む抗体である。一例では、フレームワークとＣＤＲとが、同じ起源のヒト重鎖アミノ酸配列および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかし、１つのヒト抗体に由来するフレームワークを、異なるヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように操作することもできる。ヒト免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。
「〜に特異的に結合する」とは、個別の抗体が、非腫瘍タンパク質、例えば、β−アクチンなどの非類縁タンパク質に対する結合と比べて、腫瘍特異的抗原などの抗原と特異的に免疫反応する能力を指す。例えば、ＨＥＲ２特異的結合剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実質的にＨＥＲ−２タンパク質だけに結合する。本明細書で用いられる「腫瘍特異的結合剤」という用語は、腫瘍特異的抗体（およびその断片）と、その調製物中の、実質的に腫瘍特異的タンパク質だけに結合する他の作用物質とを含む。
結合とは、抗体分子とＴ細胞表面分子の抗原決定基との間のランダムでない結合反応である。所望の結合特異性は、特に、２つの抗原が固有のエピトープを有する場合に、抗体がＴ細胞表面分子と非類縁抗原とに差次的に結合し、したがって、２つの異なる抗原間を識別する能力の基準点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｉｎｔ）から決定されることが典型的である。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を「特異的抗体」と称する。
一部の例では、抗体（抗体−ＩＲ７００分子におけるものなど）が、標的（細胞表面タンパク質、例えば、腫瘍特異的タンパク質など）に特異的に、試料または被験体における他の分子に対する結合定数より少なくとも１０３Ｍ−１大きな、１０４Ｍ−１大きな、または１０５Ｍ−１大きな結合定数で結合する。一部の例では、抗体（例えば、ｍＡｂ）またはその断片の平衡定数（Ｋｄ）が、１ｎＭまたはそれ未満である。例えば、抗体は、腫瘍特異的タンパク質などの標的に、少なくとも約０．１×１０−８Ｍ、少なくとも約０．３×１０−８Ｍ、少なくとも約０．５×１０−８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０−８Ｍ、少なくとも約１．０×１０−８Ｍ、少なくとも約１．３×１０−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０−８Ｍ、または少なくとも約２．０×１０−８Ｍの結合アフィニティーで結合する。Ｋｄ値は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）により決定することもでき、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能な、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイスを用いて決定することもできる。
抗体−ＩＲ７００分子または抗体−ＩＲ７００コンジュゲート：ＩＲ７００に結合体化した腫瘍特異的抗体などの抗体を両方とも含む分子。一部の例では、抗体が、がん細胞の表面タンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原）に特異的に結合するヒト化抗体（ヒト化ｍＡｂなど）である。
抗原（Ａｇ）：動物へと注射または吸収される組成物（腫瘍特異的タンパク質を含む組成物など）を含め、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激しうる化合物、組成物、または物質。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘導される産物を含め、特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、それに対してＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子と共に提示される場合、そのエピトープに応答する。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより近接する連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成されうる。連続アミノ酸から形成されるエピトープが、典型的に、変性溶媒に曝露しても保持されるのに対し、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３、より通常には、少なくとも５、約９、または約８〜１０アミノ酸を、固有の空間的立体構造中に含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶構造解析および核磁気共鳴が挙げられる。
抗原の例には、免疫細胞により認識されるペプチド、脂質、多糖、および核酸など、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、および核酸が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、抗原に、腫瘍特異的タンパク質もしくはペプチド（細胞（例えばがん細胞）の表面に見出される腫瘍特異的ペプチドなど）またはそれらの免疫原性断片が挙げられる。
がん：異常な細胞成長または制御不能の細胞成長を特徴とする悪性腫瘍。がんと関連することが多い他の特色には、転移、近傍細胞の正常な機能に対する妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出および炎症性応答または免疫応答の抑制または激化、例えば、リンパ節などの周囲または遠隔の組織または器官の浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」とは、元の腫瘍部位を離れ、例えば、血流またはリンパ系を介して、身体の他の部分へと移動するがん細胞を指す。一例では、開示される方法により死滅する細胞が、がん細胞である。
ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）：（例えば、ＯＭＩＭ１４７７３０）活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、一部の胸腺細胞、骨髄性前駆体および乏突起膠細胞に存在するＩ型膜貫通タンパク質。ＣＤ２５は、マウスにおけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を同定するマーカーとして用いられている。ＣＤ２５は、Ｂ細胞新生物、一部の急性非リンパ性白血病、神経芽細胞腫、肥満細胞症、および腫瘍浸潤リンパ球を含めた、一部のがん細胞の表面に見出される。これは、ＨＴＬＶ−１に対する受容体として機能し、その結果として、成人のＴ細胞リンパ腫／白血病における新生細胞において発現する。例示的なＣＤ２５配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース（例えば、受託番号ＣＡＡ４４２９７．１、ＮＰ＿０００４０８．１およびＮＰ＿００１２９５１７１．１）において見出すことができる。例示的なＣＤ２５に特異的なｍＡｂは、ダクリズマブおよびバシリキシマブであり、これらは、ＩＲ７００に結合することができ、ダクリズマブ−ＩＲ７００またはバシリキシマブ−ＩＲ７００を形成し、これらは、ＣＤ２５発現がん細胞を標的にするために開示される方法において用いることができ、または免疫調節分子（例えば、腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞を減少させるため）として用いることができる。
ＣＤ４４：（例えば、ＯＭＩＭ１０７２６９）細胞−細胞相互作用、細胞接着および遊走に関与する細胞表面糖タンパク質。ＣＤ４４は、がん幹細胞、頭頸部がん細胞、乳がん細胞、および前立腺がん細胞を含めた、一部のがん細胞の表面に見出される。例示的なＣＤ４４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース（例えば、受託番号ＣＡＪ１８５３２．１、ＡＣＩ４６５９６．１およびＡＡＢ２００１６．１）において見出すことができる。例示的なＣＤ４４に特異的なｍＡｂは、ビバツズマブであり、これは、ＩＲ７００に結合することができ、ビバツズマブ−ＩＲ７００を形成し、これは、ＣＤ４４発現がん細胞を標的にするために開示される方法において用いることができる。
接触：固体形態および液体形態の両方を含め、直接的な物理的結合下に置くこと。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、腫瘍細胞などの単離された細胞と生じる場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、被験体（腫瘍を有する被験体など）に投与することにより生じる場合もある。
低減：いくらかの質、量、または強度を減少させること。一例では、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を含む治療組成物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）が、ＮＩＲによる（例えば、約６８０ｎｍの波長で）少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量での、抗体−ＩＲ７００分子が特異的に結合する細胞への照射後、該細胞の生存率を、例えば、抗体−ＩＲ７００分子の非存在下における応答と比較して低減する。一部の例では、このような低減が、細胞致死を証拠とする。一部の例では、細胞の生存率の低減が、抗体−ＩＲ７００分子を含まない組成物により観察される生存率と比べて、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、なおまたは少なくとも９０％である。他の例では、低減が、細胞生存率の、抗体−ＩＲ７００分子を含まない組成物により観察される生存率と比べた、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、なおまたは少なくとも１５倍もしくは２０倍の低減などの倍数変化として表現される。このような低減は、本明細書で開示される方法を用いて測定することができる。
免疫調節薬：免疫調節薬は、免疫系の１または複数の機能を変更（例えば、増加または低減）する物質である。一部の例では、免疫調節薬は免疫系を活性化する。他の例では、免疫調節薬は、免疫抑制細胞の活性を阻害する（または死滅させる）。
ＩＲ７００（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ）：以下の式：
Figure 2021521135
 を有する色素。
ＬＩ−ＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から市販されている。アミノ反応性のＩＲ７００は、比較的親水性の色素であり、ＩＲ７００のＮＨＳエステルを用いて抗体（ａｎｔｉｂｏｉｄｙ）と共有結合的に結合体化することができる。ＩＲ７００はまた、吸光係数も、ヘマトポルフィリン誘導体（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）（６３０ｎｍで１．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）、メタ−テトラヒドロキシフェニルクロリン；Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）（６５２ｎｍで２．２×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）、およびモノ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６；ＮＰｅ６／Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ（登録商標）（６５４ｎｍで４．０×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）など、従来の光増感剤の５倍超高い（６８９ｎｍの吸収極大で２．１×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）。
薬学的組成物：被験体に適正に投与されると所望の治療効果または予防効果を誘導することが可能な化合物または組成物。薬学的組成物は、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および／または１もしくは複数の免疫調節薬などの治療剤を含みうる。治療剤または薬学的作用物質（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）とは、単独で、またはさらなる化合物と併せて、所望の応答を誘導する（被験体に投与されると治療効果または予防効果を誘導するなど）治療剤または薬学的作用物質である。特定の例では、薬学的組成物が、治療有効量の、少なくとも１つの抗体−ＩＲ７００分子が挙げられる。
薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容されるキャリア（ビヒクル）は、従来のキャリア（ビヒクル）である。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21st Edition (2005)は、１もしくは複数の抗体−ＩＲ７００分子など、１もしくは複数の治療化合物、および／または１もしくは複数の免疫調節薬を医薬として送達するのに適する組成物および製剤について記載している。
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとしての水、生理食塩液、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどのような、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体が含まれる注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末形態、丸薬形態、錠剤形態、またはカプセル形態）のための従来の非毒性の固体キャリアには、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなど、少量の非毒性補助物質を含有しうる。
光免疫療法（ＰＩＴ）：細胞表面タンパク質を標的化するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）へと結合体化した近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン色素であるＩＲ７００に基づく標的特異的光増感剤を使用する分子的に標的化された治療法。一例では、細胞表面タンパク質が、とりわけ、がん細胞で見出されるものであり、したがって、ＰＩＴは、このような細胞を死滅させるのに用いることができる。細胞死は、抗体−ＩＲ７００分子が該細胞に結合し、これらの細胞がＮＩＲで照射される場合に生じるのに対し、抗体−ＩＲ７００分子により認識される細胞表面タンパク質を発現しない細胞が相当数死滅することはない。
プログラム死１（ＰＤ−１）：（例えば、ＯＭＩＭ６００２４４）免疫系をダウンレギュレートすることにより、およびＴ細胞炎症活性を抑制することによる自己寛容の促進により、ヒト身体の細胞に対する免疫系の応答を調節する役割を有する、細胞の表面の１型膜タンパク質。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の２つのリガンドに結合する。例示的なＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース（例えば、受託番号ＣＡＡ４８１１３．１、ＮＰ＿００５００９．２およびＮＰ＿００１０７６９７５．１）において見出すことができる。
ＰＤ−１活性に拮抗する抗体は、本明細書で提示される方法において、例えば、腫瘍特異的抗原Ａｂ−ＩＲ７００分子と組み合わせて、免疫調節薬として用いることができる。例示的なＰＤ−１に特異的な拮抗性ｍＡｂには、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、セミプリマブ、ＰＤＲ００１、ＡＭＰ−２２４およびＡＭＰ−５１４が挙げられる。
プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）：（例えば、ＯＭＩＭ６０５４０２）妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患および肝炎などの特定の事象の間に、免疫系の適応アームを抑制する、細胞の表面の１型膜タンパク質。阻害性チェックポイント分子ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）のモチーフを介したホスファターゼ（ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２）との相互作用に基づく阻害性シグナルを伝える。ＰＤ−Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄性細胞において見出されるＰＤ−１に結合して、活性化または阻害をモジュレートする。例示的なＰＤ−Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース（例えば、受託番号ＡＤＫ７０９５０．１、ＮＰ＿０５４８６２．１およびＮＰ＿００１１５６８８４．１）において見出すことができる。
ＰＤ−Ｌ１活性に拮抗する抗体は、本明細書で提示される方法において、例えば、腫瘍特異的抗原Ａｂ−ＩＲ７００分子と組み合わせて、免疫調節薬として用いることができる（can be used can be used）。例示的なＰＤ−Ｌ１に特異的な拮抗性ｍＡｂには、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＣＫ−３０１およびＢＭＳ−９３６５５９が挙げられる。
被験体または患者：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む用語。一例では、被験体が、ヒト被験体またはマウス、ラット、イヌ、ネコもしくは非ヒト霊長類などの獣医学的被験体である。一部の例では、被験体が、がんを有するかまたはがんを処置されている哺乳動物（ヒトなど）である。
治療有効量：単独で、または（１または複数の）さらなる治療剤（化学療法剤など）と共に、該治療剤で処置される被験体または細胞において所望の効果を達成するのに十分な組成物の量。該治療剤（単独の、または免疫調節薬と組み合わせた、抗体−ＩＲ７００分子など）の有効量は、処置される被験体または細胞、特定の治療剤、および治療組成物の投与様式が挙げられるがこれらに限られない複数の因子に依存し得る。一例では、治療有効量または治療有効濃度が、がんなどの疾患の進展（転移など）を防止するか、疾患の進行を遅延させるか、もしくは疾患の退縮を引き起こすのに十分な量または濃度、またはがんなどの疾患により引き起こされる症状を軽減することが可能な量または濃度である。一例では、治療有効量または治療有効濃度が、腫瘍を有する患者の生存期間を延長するのに十分な量または濃度である。
一例では、所望の応答が、がんと関連する１または複数の症状を軽減または阻害することである。組成物が有効であるためには、１または複数の症状が完全に消失しなくともよい。例えば、照射と組み合わせた、抗体−ＩＲ７００分子を含有する組成物および免疫調節薬を含有する組成物（および／またはこれらの両方を含有する単一組成物）の投与により、腫瘍のサイズ（腫瘍の体積もしくは重量または腫瘍の転移など）を、処置の非存在下における腫瘍サイズと比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％低減することができる。特定の一例では、所望の応答は、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下における細胞殺滅と比較して、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％を死滅させることにより、細胞（がん細胞など）の集団を所望の量だけ死滅させることである。特定の一例では、所望の応答は、腫瘍を有する患者（または腫瘍を最近除去された患者）の生存期間を所望の量だけ延長する、例えば、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下における生存期間と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％生存を延長することである。一部の例では、所望の応答は、被験体におけるメモリーＴ細胞の量を増加させる、例えば、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下におけるメモリーＴ細胞の量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させることである。一部の例では、所望の応答は、被験体におけるＭＨＣタイプＩ拘束性腫瘍特異的抗原に対して応答するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣの量を増加させる、例えば、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下におけるＭＨＣタイプＩ拘束性腫瘍特異的抗原に対して応答するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣの量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させることである。一部の例では、所望の応答は、標的化腫瘍におけるＴｒｅｇ（ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞など）の量を低減させる、例えば、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下における標的化腫瘍におけるＴｒｅｇの量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％低減させることである。一部の例では、これらの効果の組合せは、開示される方法によって達成される。
開示される抗体−ＩＲ７００分子（単独の、または１もしくは複数の免疫調節薬と組み合わせた）のうちの１つまたは複数を含む作用物質であって、ヒト被験体または獣医学的被験体へと投与される作用物質の有効量は、この被験体と関連するいくつかの因子、例えば、被験体の全体的な健康に応じて変化する。作用物質の有効量は、その組成物の投与量を変化させ、腫瘍の退縮など、結果として得られる治療応答を測定することにより決定することができる。有効量はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕにおける様々なイムノアッセイを介して決定することもできる。開示される作用物質は、所望の応答を得るのに必要とされる通りの、単回投与で投与することもでき、複数回投与で投与することもできる。しかし、有効量は、適用される処置、処置される被験体、処置される状態の重症度および種類、ならびに投与様式に依存しうる。
特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子の治療有効用量が、６０キログラム当たり少なくとも０．５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、静脈内投与される場合、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量など、例えば、０．５〜５０ｍｇ／６０ｋｇである。別の例では、抗体−ＩＲ７００分子の治療有効用量が、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇまたは少なくとも５００μｇ／ｋｇなど、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば、腫瘍内投与または腹腔内投与される場合、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量など、例えば、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。一例では、治療有効用量が、局所用溶液で投与される１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌなど、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの間など、少なくとも５００μｇ／ｍｌなど、少なくとも１μｇ／ｍｌである。しかし、当業者は、また、例えば、特定の抗体−ＩＲ７００分子に応じて、より高い投与量またはより低い投与量も用いうることを認識する。特定の例では、このような毎日の投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与する。開示される抗体−ＩＲ７００分子は、単独で投与することもでき、薬学的に許容されるキャリアの存在下で投与することもでき、他の治療剤（他の抗新生物剤など）の存在下で投与することもできる。
一般に、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬の投与後における適切な照射線量は、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１Ｊ／ｃｍ２、例えば、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２、例えば、６６０〜７４０ｎｍの波長で１〜５００Ｊ／ｃｍ２である。一部の例では、波長が、６６０〜７１０ｎｍである。特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子の投与後における適切な照射線量が、６８０ｎｍの波長で少なくとも１．０Ｊ／ｃｍ２、例えば、６８０ｎｍの波長で少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、６８０ｎｍの波長で少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または６８０ｎｍの波長で少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２、例えば、６８０ｎｍの波長で１〜５００Ｊ／ｃｍ２である。特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬の投与後に、複数回にわたる照射を実施する（２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回にわたる個別の投与など、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４回にわたる照射など）。
処置：細胞または組織の治療剤による処置を指すのに用いられる場合の用語は、１または複数の作用物質（１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬など）を細胞もしくは組織と接触させるステップ、または該作用物質を細胞もしくは組織と共にインキュベートするステップ、ならびに／あるいは１または複数の作用物質を、被験体、例えば、がんを有する被験体へと投与するステップを含む。処置された細胞とは、所望の応答に十分な量で、かつ、所望の応答に十分な条件下で、所望の組成物と接触させた細胞である。一例では、処置された細胞とは、抗体−ＩＲ７００分子に、抗体が細胞の表面タンパク質に結合するのに十分な条件下で曝露され、免疫調節薬と接触され、十分な細胞殺滅が達成されるまでＮＩＲ光で照射される細胞である。他の例では、処置された被験体とは、抗体が細胞の表面タンパク質に結合するのに十分な条件下で１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与され、１または複数の免疫調節薬を投与され、十分な細胞殺滅が達成されるまでＮＩＲ光で照射される被験体である。
腫瘍、新生物、悪性腫瘍、またはがん：新生物とは、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長は、腫瘍をもたらしうる。個体における腫瘍の量とは、腫瘍の数、体積、または重量として測定されうる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と称する。周囲の組織に浸潤し、かつ／または転移しうる腫瘍を、「悪性」と称する。「非がん性組織」とは、悪性新生物が形成されているが、新生物に特徴的な病態を有さない同じ器官に由来する組織である。一般に、非がん性組織は、組織学的に正常な外見を呈する。「正常組織」とは、器官に由来する組織であって、該器官が、その器官のがんまたは別の疾患もしくは障害に冒されない組織である。「がんを有さない」被験体は、その器官のがんを有すると診断されておらず、検出可能ながんを有さない。
腫瘍には、元の（原発性）腫瘍、再発腫瘍および転移（二次性）腫瘍が挙げられる。腫瘍の再発（recurrence）は、例えば、腫瘍が手術、薬物もしくは他の処置によって除去されたか、またはそうでなければ消滅した後に、元の（原発性）腫瘍と同じ部位での腫瘍の再発（return）である。転移は、身体の一部分から別の部分への腫瘍の拡散である。拡散した細胞から形成された腫瘍は、二次性腫瘍と呼ばれ、元の（原発性）腫瘍における細胞と類似の細胞を含有する。これらは、原発性腫瘍または転移のいずれかの再発でありうる。
開示される方法で処置されうる、がんなどの例示的な腫瘍には、乳癌（例えば、小葉癌および腺管癌）、肉腫、肺癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺中皮腫、結腸直腸腺癌、頭頸部がん（例えば、ＨＰＶ１６など、ＨＰＶまたはエプスタインバーウイルスによって引き起こされるがんなど、腺癌、扁平上皮癌、転移性扁平上皮癌；口、舌、鼻咽頭、喉、下咽頭、喉頭および気管のがんを含みうる）、胃癌、前立腺癌、卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌およびムチン性嚢胞腺癌など）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、および精巣胚細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、腺癌、および扁平上皮癌を含めた）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌および混合型ミュラー腫瘍（癌肉腫）を含めた）、子宮内頸部の癌、子宮外頸部の癌、および膣癌（これらの各々の腺癌および扁平上皮癌など）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅ ｔｕｍｏｒ）、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎ ａｄｎｅｘａｌ ｔｕｍｏｒ）、ならびに様々な種類の肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭癌および口腔咽頭癌（これらの扁平上皮癌および腺癌を含めた）、唾液腺癌、脳腫瘍および中枢神経系腫瘍（例えば、神経膠、神経細胞、および髄膜を起源とする腫瘍を含めた）、末梢神経腫瘍、軟組織肉腫および骨肉腫および軟骨肉腫などの固形腫瘍、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞悪性リンパ腫およびＴ細胞悪性リンパ腫を含めた）が挙げられる。一例では、腫瘍が、腺癌である。
本方法はまた、リンパ型の、白血球型の、または他の型の白血病などの液性腫瘍（例えば、血液学的悪性腫瘍）を処置するのにも用いることができる。特定の例では、処置される腫瘍が、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫など）、および骨髄腫など、血液の腫瘍である。
〜に十分な条件下で：所望の活性を可能とする任意の環境について記載するのに用いられる語句。一例では、「〜に十分な条件下で」が、抗体−ＩＲ７００分子がその標的化された細胞表面タンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原）に結合することを可能とするのに十分な抗体−ＩＲ７００分子を被験体に投与することを包含する。特定の例では、所望の活性が、細胞に対する治療照射の後に、抗体−ＩＲ７００分子が結合している細胞を死滅させる。
処置されていない：処置されていない細胞は、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬、ならびに／または照射など、治療剤と接触していない細胞である。ある例では、処置されていない細胞は、治療剤（複数可）が送達されたビヒクルを受ける細胞である。同様に、処置されていない被験体は、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬、ならびに／または照射など、治療剤を投与されていない被験体である。ある例では、処置されていない被験体は、治療剤（複数可）が送達されたビヒクルを受ける被験体である。
ある特定の実施例の開示は、他の実施形態を除外することを意味するものではない。加えて、本明細書に記載される任意の処置は、他の処置に対して必ずしも除外的ではなく、他の生体活性作用物質または処置モダリティーと組み合わせることができる。
技法の概観
近赤外光線免疫療法（ＮＩＲ−ＰＩＴ）は、壊死／免疫原性細胞死を誘導する非常に選択的ながん処置であり、光吸収体であるＩＲ７００ＤＸへと結合体化したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＮＩＲ光とを使用する。ＣＤ４４は、がん処置に対する抵抗性に関連するが、抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００コンジュゲートを使用するＮＩＲ−ＰＩＴは、本明細書において、細胞成長を阻害し、複数の腫瘍の種類における生存を延長することを示す。ＣＤ４４ ｍＡｂ−ＩＲ７００ ＮＩＲ−ＰＩＴは、がん抗原を標的にし、ほとんどの他のがん療法が誘導するアポトーシス性細胞死とは違い、壊死／免疫原性細胞死を開始する。免疫調節薬（免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体など）によるさらなる処置は、抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００コンジュゲートの抗がん効果に相乗作用した。
さらに、方法は、成功裏に、ＰＩＴ処置されていない遠隔腫瘍（例えば、転移）の減少を誘導し、同じ種類の腫瘍細胞による後の負荷の際に腫瘍の再発を阻害した。したがって、開示される方法により、宿主の免疫を誘発することによって、再発または転移も処置することができる（例えば、一部の例では、方法は、腫瘍の再発を減少または消失させる）。ＰＤ−１免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）は、近赤外光線免疫療法の後に適応免疫抵抗性を反転させて、ポリクローナルＴ細胞応答を増強し、処置された腫瘍および遠隔の処置されていない腫瘍の両方における確立された同系腫瘍の拒絶を誘導した。これらのポリクローナル応答は、再発を抑制する免疫原性の記憶の形成も増強することができる。この働きは、腫瘍標的化細胞溶解療法の後、デノボポリクローナルＴ細胞応答（例えば、樹状細胞によって処理された複数の腫瘍関連抗原に対する）の発生を明確に実証する最初のものである。一部の例では、開示される方法により、Ｔｒｅｇの選択的な枯渇を引き起こし、メモリーＴ細胞（腫瘍抗原特異的Ｔ細胞など）の数を増加させ、樹状細胞の腫瘍浸潤を増加させ、またはこれらの組合せを行う。
一部の同系マウスモデルでは、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＴＬＡ４軸またはエフェクターＴ細胞もしくはＮＫ細胞の活性化を通じてＤＣ機能を阻害することによって媒介される宿主の抗腫瘍免疫を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の存在下で、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における腫瘍抗原への曝露の増加は、抗原特異的エフェクターＴ細胞よりもむしろ抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を優位に活性化しうる。これを克服するために、がんおよびＴｒｅｇ細胞は、組み合わされたＣＤ４４およびＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴを用いて同時に標的にされ、これは、いずれかの標的単独を用いるＮＩＲ−ＰＩＴと比較して、優れた抗腫瘍効果をもたらし、生存を延長した。比較すると、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独は、調査された３つの同系腫瘍モデル全てにおいて、顕著に有効性が劣った。Ｔｒｅｇ細胞は、様々な免疫抑制機構を用いて、腫瘍免疫回避を媒介するが、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、選択的なＴｒｅｇ細胞枯渇により、これらの機構の全てを無効にすることができる。これらの結果は、開示される方法が、がん抗原標的化ＮＩＲ−ＰＩＴまたは免疫抑制機能のみの消失のいずれとりも優れたｉｎ ｖｉｖｏでの治療利益（例えば、腫瘍成長阻害および生存の延長）をもたらすことを示す。この組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴは、一部の完全寛解を達成したが、これは、いずれかの種類のＮＩＲ−ＰＩＴ単独による場合ではなかった。したがって、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ法は、従来のがん抗原標的化ＮＩＲ−ＰＩＴと比較して長期間の生存をもたらすことができ、同様に直接的な腫瘍殺滅の相加効果に起因して、免疫原性細胞死による腫瘍免疫原性の誘導、およびＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴによる選択的Ｔｒｅｇ細胞枯渇に由来する宿主の抗腫瘍免疫細胞の有効な活性化をもたらすことができる。一緒に作用するこれらの３つの事象は、他の点では抵抗性の腫瘍において長期間の腫瘍応答を誘発しうる。したがって、ＣＤ２５およびＣＤ４４標的化作用物質と組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴは、標的化腫瘍内で、腫瘍細胞およびＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の両方を消失させることができる。加えて、ＴＭＥにおいて、がん抗原および免疫抑制細胞の同時の標的化と組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴは、一種類のＮＩＲ−ＰＩＴ単独よりもさらにいっそう高効率的であり得、これは、腫瘍ワクチン化を誘導するために用いることができる。
ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の存在は、腫瘍特異的な高アビディティのエフェクターＴ細胞の発生を妨げるが、低アビディティのエフェクターＴ細胞は、機能するおよび拡大増殖する（expand）ことができる。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ネイティブＴ細胞前駆体に由来する腫瘍特異的な高アビディティのＴ細胞の活性化および増大を可能にし、強力な抗腫瘍免疫応答を媒介することができる高アビディティのエフェクターＴ細胞へのそれらの分化を可能にする。これが起こると、腫瘍ワクチン化は、持続性の抗腫瘍免疫をもたらしうる、腫瘍特異的な高アビディティのエフェクターＴ細胞またはメモリーＴ細胞の活性化に起因して、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにより可能性がある（図１８）。ＮＩＲ−ＰＩＴは、これが周囲の正常な隣接細胞への最小限の損傷を引き起こすので、反復的に実施することができる。抗体−光吸収体コンジュゲート（ＡＰＣ）およびＮＩＲ光の反復投与は、ＮＩＲ−ＰＩＴの有効性を改善することができ、標的化腫瘍における成功裏のワクチン化の頻度を増加させる。
これらの観察に基づいて、免疫調節と組み合わせてＮＩＲ−ＰＩＴを用いる被験体を処置する方法が本明細書で提供され、これは、周囲の細胞または抗体−ＩＲ７００分子によって標的にされない他の細胞への最小限の損傷を伴って、がん細胞を局所的に死滅させることができ、有効な抗腫瘍宿主免疫活性化を提供することもでき、最小限の副作用を伴って、局所的、および処置された部位から離れた遠隔の転移においてさえもの両方で、被験体自身の免疫系を用いる様々ながんの非常に有効な処置をもたらす。一部の例では、開示される方法による単一の局所部位の処置は、がんに対する全身の宿主免疫を可能とし、最小限の副作用を誘導しながら、処置された部位および処置されていない遠隔の転移性病変で迅速な腫瘍縮小をもたらす。
がんを処置するための方法
本開示は、腫瘍または血液学的悪性腫瘍を有する被験体など、がんを有する被験体を処置するための方法を提供する。方法は、色素ＩＲ７００へと結合体化した抗体（本明細書において抗体−ＩＲ７００分子と称する）を被験体へと投与するステップであって、抗体が、がん（例えば、腫瘍）細胞表面タンパク質（本明細書において腫瘍特異的抗原またはタンパク質とも称する）に特異的に結合するステップを含む。被験体は、治療有効量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子（例えば、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体など、薬学的に許容されるキャリアの存在下で）を、抗体ががん細胞表面タンパク質に特異的に結合することを可能とする条件下で投与される。例えば、抗体−ＩＲ７００分子は、ビヒクルとしての水、生理食塩液、平衡塩類溶液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡなど）、水性デキストロース、ゴマ油、グリセロール、エタノール、またはこれらの組合せなど、薬学的に有効なキャリアに存在させることができる。キャリアおよび組成物は、無菌であり得、製剤は、投与方式に適する。特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子はＣＤ４４抗体−ＩＲ７００である。
方法は、（例えば、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体など、薬学的に許容されるキャリアの存在下で）、治療有効量の、１もしくは複数の免疫系活性化剤および／または１もしくは複数の免疫抑制細胞の阻害剤など、１または複数の免疫調節薬を被験体へと投与するステップも含む。特定の例では、免疫調節剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体である。別の特定の例では、免疫調節剤は、ＣＤ２５抗体−ＩＲ７００である。一部の例では、１または複数の免疫調節薬は、例えば、同じ組成物において、がん細胞表面タンパク質に結合する１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と併せて（例えば、同時に、または実質的に同時に）、または別個の組成物として投与される場合、互いに約１時間以内に（例えば、約５分以内、約１０分以内、約１５分以内、約２０分以内、約３０分以内、約４０分以内、約５０分以内、または約６０分以内）に、被験体へと投与される。他の例では、がん細胞表面タンパク質に結合する１または複数の抗体−ＩＲ７００分子、および１または複数の免疫調節薬は、逐次的に（いずれかの順序で）、例えば、少なくとも約１時間〜１週間離れて（例えば、約２時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、または約７日離れて）、被験体へと投与される。
１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与するステップの後、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子は、標的化腫瘍に蓄積することを可能にする。がん細胞（またはがんを有する被験体）は、次いで、細胞の殺滅を可能にする条件下、例えば、６６０〜７１０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量での照射で照射される。一例では、抗体−ＩＲ７００分子を投与するステップと照射との間に、少なくとも約１０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間（約１〜４時間、３０分間〜１時間、１０分間〜６０分間、３０分間〜８時間、２〜１０時間、１２〜２４時間、１８〜３６時間、または２４〜４８時間など）がある。一例では、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子は、投与され（例えば、ｉ．ｖ．）、少なくとも約１０分後、少なくとも約３０分後、少なくとも約１時間後、少なくとも約４時間後、少なくとも約８時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、または少なくとも約４８時間後（約２４時間後など、約１〜４時間後、３０分〜１時間後、１０分〜６０分後、３０分〜８時間後、２〜１０時間後、１２〜２４時間後、１８〜３６時間後、または２４〜４８時間後など）、腫瘍（または被験体）は照射される。１または複数の免疫調節薬は、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の前もしくは後、および／または照射の前もしくは後に、投与されうる。一部の例では、１または複数の免疫調節薬は、照射の前および後、例えば、照射前に少なくとも１用量の免疫調節薬、および照射後に少なくとも１用量の免疫調節薬（例えば、照射の２４時間前、および照射の２４、４８、７２、９６、またはそれよりも長い時間のうちの１つまたは複数の後）に投与される。さらなる例では、免疫調節薬の用量は、少なくとも１回の照射処置と同じ日にも投与されうる。
一部の例では、複数用量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬、およびＮＩＲによる照射は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の用量（または投与）などで、被験体へと投与される。特定の例では、被験体は、少なくとも１用量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子、少なくとも２用量の１または複数の免疫調節薬、および少なくとも２回投与のＮＩＲ照射を投与される。
ＮＩＲの励起光波長は、組織への少なくとも数センチメートルの透過を可能とする。例えば、ディフューザーチップを有するファイバー結合レーザーダイオードを用いることにより、ＮＩＲ光を、身体表面に関して深部に位置する、他の方法では到達不能な腫瘍の数センチメートル以内に送達することができる。循環腫瘍細胞が表在性血管を越えるときにそれを励起しうるので、固形腫瘍を処置するのに加えて、循環腫瘍細胞（血液学的悪性腫瘍を含めるがこれらに限られない）も標的化しうる（例えば、本明細書で記載されるＮＩＲ ＬＥＤ装着用デバイスを用いて）。
一例では、照射と組み合わせて１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬を被験体へと投与するステップは、抗体に特異的に結合する細胞表面タンパク質（腫瘍特異的抗原など）を発現する標的細胞（がん細胞など）を死滅させる。例えば、一部の例では、開示される方法により、照射と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子による処置および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、処置された標的細胞のうちの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより多くを死滅させる。
一例では、照射と組み合わせた、腫瘍を有する被験体への、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与により、抗体に特異的に結合できる細胞表面タンパク質（腫瘍特異的抗原など）を発現する細胞を死滅させ、これにより、腫瘍を処置する。正常細胞と比べて腫瘍細胞の選択的な殺滅とは、その方法が、腫瘍細胞を、例えば、投与された抗体に特異的に結合する細胞表面タンパク質（腫瘍特異的抗原など）を発現してない細胞などの正常細胞より効果的に死滅させることが可能なことを意味する。例えば、一部の例では、開示される方法により、腫瘍のサイズもしくは体積を低減し、腫瘍の成長を遅延させ、腫瘍の再発を低減または遅延させ、腫瘍の転移を低減または遅延させ（例えば、転移の数を減少させるか、または転移の体積もしくはサイズを低減することにより）、または、これらの組合せを行う。例えば、一部の例では、開示される方法により、照射と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより多くなど、腫瘍のサイズ（腫瘍の重量または体積など）もしくは腫瘍の数を減少させ、および／または転移性腫瘍のサイズまたは転移性腫瘍の数を減少させる。
一例では、照射と組み合わせた、腫瘍を有する被験体への、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与は、Ｔｒｅｇ（ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞）を低減する。例えば、一部の例では、開示される方法により、照射と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより多く、循環Ｔｒｅｇの数を低減する。一部の例では、開示される方法により、照射と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより多く、腫瘍中のＴｒｅｇの数を低減する。
一例では、照射と組み合わせた、腫瘍を有する被験体への、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与は、メモリーＴ細胞を増加させる。例えば、一部の例では、開示される方法により、照射と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、またはそれより多く、循環メモリーＴ細胞の数を増加させる。
一部の例では、開示される方法により、腫瘍、再発および／または転移性腫瘍と関連する１もしくは複数の症状を低減する。一例では、開示される方法により、照射と組み合わせた抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多くなど、腫瘍の成長を遅延させる。一例では、開示される方法により、照射と組み合わせた抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬の投与の非存在と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、なおまたは１００％など、腫瘍の再発を減少または消失させる。
一部の例では、開示される方法により、被験体（腫瘍を有する被験体または腫瘍を先に除去した被験体など）の生存期間を、例えば、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与、および１または複数の免疫調節薬、ならびに照射の投与の非存在と比べて、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより長い延長など、延長させることができる。例えば、一部の例では、開示される方法により、抗体−ＩＲ７００分子、１または複数の免疫調節薬および照射の投与の非存在における平均生存期間と比べて、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月、少なくとも３６カ月、少なくとも４８カ月、少なくとも６０カ月、またはそれより長い、被験体の全生存期間および／または無増悪生存期間（例えば、原発性腫瘍の再発の欠如、または転移の欠如）を延長する。
一例では、原発性腫瘍のＮＩＲ照射と組み合わせた、抗体−ＩＲ７００分子を含有する組成物の投与および１または複数の免疫調節薬の投与（併せて、または逐次的）により、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬、および原発性腫瘍のＮＩＲ照射の非存在における遠隔腫瘍または転移の体積／重量／数と比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％、遠隔の照射されていない腫瘍または腫瘍の転移のサイズおよび／または数（例えば、遠隔腫瘍もしくは転移の体積、遠隔腫瘍もしくは転移の重量、遠隔腫瘍もしくは転移の数、またはこれらの組合せ）を低減することができる。
一例では、開示される方法により、被験体におけるＭＨＣタイプＩ拘束性腫瘍特異的抗原に対して応答するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣの量を増加させる、例えば、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射の非存在下におけるＭＨＣタイプＩ拘束性腫瘍特異的抗原に対して応答するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣの量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させる。
一例では、これらの効果の組合せは、開示される方法によって達成される。
開示される方法を用いて、身体における固定腫瘍（ｆｉｘｅｄ ｔｕｍｏｒ）のほか、循環中の血液学的悪性腫瘍および／または腫瘍（例えば、白血病細胞、転移、循環腫瘍細胞）を処置することができる。しかし、循環細胞は、それらの性質により、長期間にわたり光に曝露することができない。したがって、死滅させる細胞が、全身を循環する細胞である場合は、装着されうるデバイスまたは身体の部分を覆うデバイスを用いることにより、本方法を達成することができる。例えば、このようなデバイスは、長期間にわたり装着することができる。ＮＩＲ発光型発光ダイオード（ＬＥＤ）およびバッテリーパックを組み込む日常的装着用品（ｅｖｅｒｙｄａｙ ｗｅａｒａｂｌｅ ｉｔｅｍ）（例えば、腕時計、装身具（ネックレスまたはブレスレットなど）、ブランケット、衣料品（例えば、下着、靴下、および靴の中敷き）、および他の日常的装着用品）を用いることができる。このようなデバイスは、長期間にわたってデバイスの下の皮膚へと光をもたらし、長期間にわたる表在性血管への光の連続的な曝露をもたらす。循環腫瘍細胞は、デバイスの下の領域を通過するときに、光に曝露される。例として述べると、このデバイスの腕時計形またはブレスレット形には、一日の大半にわたり装着される、バッテリー電源パックを有する一連のＮＩＲ ＬＥＤが含まれうる。１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与（例えば、静脈内投与）の後、循環細胞は、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートに結合し、ＰＩＴによる致死に対して感受性となる。これらの細胞は、日常的装着用品（例えば、ブレスレットまたは腕時計）に存在するＬＥＤと隣接する血管内を流れるので、それらはＮＩＲ光に曝露され、細胞致死に対して感受性となる。光線量は、診断および細胞型に応じて調整可能でありうる。
一部の例では、本方法が、腫瘍細胞致死などの治療をモニタリングするステップをさらに含む。このような例では、本明細書に記載の通りに、被験体に抗体−ＩＲ７００コンジュゲートおよび免疫調節薬が投与され、照射される。しかし、より低い用量の抗体−ＩＲ７００コンジュゲートおよびより低い線量のＮＩＲ光もモニタリングのために用いることができる（細胞致死は必要とされず、治療のモニタリングだけが必要とされうる場合）。一例では、モニタリングのために投与される抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの量が、少なくとも２分の１（治療用量の少なくとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１など）である。一例では、モニタリングのために投与される抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの量が、治療用量より少なくとも２０％、または少なくとも２５％少ない。一例では、モニタリングのために用いられるＮＩＲ光の量が、治療線量の少なくとも１／１０００、または少なくとも１／１０，０００である。これは、処置される細胞の検出を可能とする。例えば、このような方法を用いることにより、腫瘍のサイズおよび転移をモニタリングすることができる。
一部の例では、本方法が、内視鏡手順などの手術中に有用である。例えば、上記の通りに、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートおよび免疫調節薬が被験体に投与され、細胞に照射された後で、これは、細胞致死を結果としてもたらすだけでなく、外科医または他の医療ケア従事者が腫瘍の辺縁部を可視化することを可能とし、腫瘍（皮膚、乳房、肺、結腸、頭頸部、または前立腺の腫瘍など）の切除が完了すること、および辺縁部が無病変であることを確認する一助ともなる。一部の例では、少なくとも２分の１（治療線量の少なくとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１など）など、低用量の抗体−ＩＲ７００コンジュゲートを、可視化のために用いることができる。
抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬は、例えば、がんなどの腫瘍を有する被験体、または腫瘍を先に除去した（例えば、手術を介して）被験体へと、局所投与することもでき、全身投与することもできる。特定の例が提示されるが、当業者は、開示される抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬の代替的投与法を用いうることを十分に理解する。このような方法には、例えば、数時間〜数日間の期間にわたり、処置を必要とする被験体への連続注入をもたらすためのカテーテルまたは植込み式ポンプの使用が含まれうる。
一例では、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬を、腫瘍（腫瘍内）への直接の注射または注入を含めた非経口的手段により投与する。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬を、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬の腫瘍への適用により、例えば、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬の局所注射、抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬を含有する溶液への腫瘍の浸漬により、あるいは抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬を腫瘍に注ぐことにより、腫瘍へと投与する。
加えて、または代替的に、開示される組成物は、腫瘍（がんなど）を有する被験体へと全身投与、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、または経口投与することができる。１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬は、同じまたは異なる経路によって投与されうる。一例では、抗体−ＩＲ７００分子は腫瘍内に投与されてもよく、免疫調節薬は全身に送達されてもよい（例えば、静脈内または腹腔内）。別の例では、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬は、全身に投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。一例では、抗体−ＩＲ７００分子は静脈内に投与され、免疫調節薬は腹腔内に投与される。一例では、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬は静脈内に投与される。
被験体に投与される抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬の投与量は、絶対的な制限を受けるわけではなく、組成物の性質、その有効成分ならびにその潜在的な望ましくない副作用（例えば、抗体に対する免疫応答）、処置される被験体および処置される状態の種類、ならびに投与様式に依存する。一般に用量とは、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズ（例えば、体積および／または重量）を低減するか、またはさらなる腫瘍の成長を減弱させるか、または腫瘍の望ましくない症状を低減するのに有効な量などの治療有効量である。
抗体−ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体−ＩＲ７００分子、および免疫調節薬抗体−ＩＲ７００分子を含めた）を静脈内投与する場合、単回の処置で被験体へと投与するための例示的な投与量は、体重６０ｋｇ当たり０．５〜１００ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜５０ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜２０ｍｇの範囲であることが可能であり、例えば、体重６０ｋｇ当たり約１または２ｍｇでありうる。さらに別の例では、腹腔内投与または腫瘍内投与される抗体−ＩＲ７００分子の治療有効量は、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇなど、体重１ｋｇ当たり１０μｇ〜５０００μｇの抗体−ＩＲ７００分子である。一例では、ヒト患者へと投与される抗体−ＩＲ７００分子の用量が、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、なおまたは１ｇなど、少なくとも５０ｍｇである。ＩＲ７００へと結合体化していない抗体（ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的なものなど、免疫調節薬抗体など）の類似の量も用いうる。
開示される抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬による処置は、１日で完了させることもでき、複数日に同じ投与量または異なる投与量で反復的に行うこともできる。処置の反復は、同日に行うこともでき、連日に行うこともでき、１〜３日間ごとに行うこともでき、３〜７日間ごとに行うこともでき、１〜２週間ごとに行うこともでき、２〜４週間ごとに行うこともでき、１〜２カ月間ごとに行うこともでき、なお長期の間隔で行うこともできる。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬は、同日に投与される。他の例では、抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬は、異なる日に投与される。非限定的な一例では、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬は、同日に被験体へと投与され、１または複数の免疫調節薬の反復用量（同じまたは異なる投薬レベルで）は、連日、１〜３日間ごと、３〜７日間ごと、１〜２週間ごと、２〜４週間ごと、１〜２カ月間ごと、なお長期の間隔で被験体へと投与される（例えば、免疫調節薬の１、２、３、４、５、またはそれよりも多くのさらなる用量で）。一部の例では、免疫調節薬の反復用量の量は、初期用量と比較して減少する（例えば、一部の場合では、５０％減少する）。
さらなる実施形態では、方法は、１または複数のさらなる治療剤を被験体へと投与するステップも含む。国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／００９４７５号（その全体が本明細書に参考として援用される）に記載される通り、照射（例えば、６６０〜７１０ｎｍの波長で、少なくとも１０〜１００Ｊ／ｃｍ２など、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも７０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも８０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２の線量での照射）後約８時間のウインドウであって、その間に、ＰＩＴで処置された細胞による、さらなる作用物質（例えば、直径が１〜５００ｎｍなど、直径が少なくとも約１ｎｍ、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、または直径が少なくとも２００ｎｍの作用物質など、ナノサイズの作用物質）の取込みが増強されるウインドウが存在する。したがって、１または複数のさらなる治療剤を、ＰＩＴと同時にまたは逐次的に被験体へとさらに投与することができる。一例では、さらなる治療剤を、照射後に、例えば、細胞に照射した後の約０〜８時間に（照射後の少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、または少なくとも７時間など、例えば、照射後の１時間〜１０時間、１時間〜９時間、１時間〜８時間、２時間〜８時間、または４時間〜８時間など、１０時間を超えずに、９時間を超えずに、または８時間を超えずに）投与する。別の例では、さらなる治療剤を、照射の直前（照射前の１０分〜６０分、または１０分〜３０分など、照射前の約１０分〜１２０分など）に投与する。用いられうるさらなる治療剤は、下記で論じる。
さらなる実施形態では、リアルタイムでの細胞殺滅の検出またはモニタリングを可能とする方法が提供される。このような方法は、例えば、十分量の抗体−ＩＲ７００分子および／もしくは免疫調節薬または十分量の照射を細胞または腫瘍へと送達して、細胞殺滅を促進することを確実にするのに有用である。これらの方法は、形態的変化が明らかとなる前に細胞殺滅の検出を可能とする。一例では、方法は、細胞表面タンパク質を有する細胞を、治療有効量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬と接触させるステップであって、抗体が、細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップ（例えば、抗体−ＩＲ７００分子（複数可）および免疫調節薬（複数可）を被験体へと投与するステップ）と；細胞を６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２の線量で照射するステップと；細胞に照射した後、約０〜４８時間（細胞に照射した後少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、例えば、細胞に照射した後１分〜３０分、１０分〜３０分、１０分〜１時間、１時間〜８時間、６時間〜２４時間、または６時間〜４８時間など）に、蛍光寿命イメージングで細胞を検出し、これにより、細胞殺滅をリアルタイムで検出するステップとを含む。ＦＬＴの短縮は、ＰＩＴにより誘導される急性膜損傷の指標として働く。したがって、細胞に、ＩＲ７００ ＦＬＴを少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％など、少なくとも２５％短縮するのに十分な条件下で照射する。一例では、細胞に、６６０ｎｍ〜７４０ｎｍ（６８０ｎｍ〜７００ｎｍなど）の波長で、かつ３０〜５０Ｊ／ｃｍ２など、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも６０Ｊ／ｃｍ２など、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも３０Ｊ／ｃｍ２の線量で照射する。
一部の例では、細胞殺滅をリアルタイムで検出する方法が、例えば、細胞に照射した後、約０〜８時間に、細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させるステップを含む。リアルタイムのイメージングは、細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させるステップの前または後に行うことができる。例えば、リアルタイムのイメージングにより決定される通り、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬を投与した後に不十分な細胞殺滅が生じる場合は、これらの細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させることができる。しかし、一部の例では、細胞殺滅をリアルタイムで検出する前に、細胞を抗体−ＩＲ７００分子および免疫調節薬、ならびにさらなる治療剤と接触させる。
例示的な細胞
標的細胞は、がん細胞（例えば、腫瘍細胞）など、所望でないかまたはその成長が所望でない細胞でありうる。細胞は、がんを有する被験体（例えば、ヒトまたは獣医学的被験体）など、処置される哺乳動物に存在し得る。任意の標的細胞を、特許請求される方法で処置することができる。一例では、標的細胞が、他の正常（所望の）細胞の表面では実質的に見出されない細胞表面タンパク質を発現し、このようなタンパク質に特異的に結合する抗体を選択し、かつ、このタンパク質に対する抗体−ＩＲ７００分子を生成することができる。一例では、細胞表面タンパク質が、腫瘍特異的タンパク質（例えば、抗原）である。非限定的な一例では、細胞表面タンパク質がＣＤ４４である。
一例では、腫瘍細胞が、がんを有する患者における細胞などのがん細胞である。開示される方法により死滅させうる例示的な細胞には、以下の腫瘍：急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病）を含めた白血病などの血液学的悪性腫瘍の細胞が挙げられる。別の例では、細胞が、肉腫および癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、肺がん、結腸直腸がん、扁平上皮癌、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌など）、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部、または食道の腺癌）、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳがん（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）からの細胞などの固形腫瘍細胞である。
特定の例では、細胞が、肺がん細胞である。
特定の例では、細胞が、乳がん細胞である。
特定の例では、細胞が、結腸がん細胞である。
特定の例では、細胞が、頭頸部がん細胞である。
特定の例では、細胞が、前立腺がん細胞である。
例示的な被験体
一部の例では、開示される方法を用いて、がんを有する被験体、または本明細書に記載される腫瘍などの腫瘍を有する被験体を処置する。一部の例では、外科的または化学的に除去されるなど、腫瘍が先に処置されており、その後、開示される方法を用いて、患者に残存しうる任意の望ましくない残存腫瘍細胞を死滅させるか、および／または腫瘍の再発もしくは転移を減少させる。
開示される方法を用いて、がんなどの腫瘍を有するヒト、またはこのような腫瘍を先に除去または処置したことのあるヒトなど、任意の哺乳動物被験体（ヒト、またはイヌもしくはネコなど、獣医学的被験体など）を処置することができる。開示される療法を必要とする被験体には、がん細胞が、それらの表面で、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる腫瘍特異的タンパク質を発現する、がんを有するヒト被験体が含まれうる。例えば、開示される方法を、がんに対する初期処置として、単独で、または放射線療法または他の化学療法と組み合わせるかのいずれかで用いることもできる。開示される方法はまた、先の放射線療法または化学療法が失敗した患者においても用いることができる。したがって、一部の例では、被験体が、他の療法を受けたが、これらの他の療法が所望の治療応答をもたらさなかった被験体である。開示される方法はまた、限局性がんおよび／または転移性がんおよび／または原発性腫瘍の再発を有する患者においても用いることができる。
一部の例では、方法が、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる細胞表面タンパク質（腫瘍特異的タンパク質など）を発現する腫瘍を有する被験体を選択するステップなど、開示される療法から利益を得る被験体を選択するステップを含む。例えば、被験体が、ＨＥＲ２を発現する乳がんを有すると決定された場合、この被験体を選択して、トラスツズマブ−ＩＲ７００など、抗ＨＥＲ２−ＩＲ７００分子、および１または複数の免疫調節薬で処置し、その後、この被験体を、本明細書に記載される通りに照射することができる。
例示的な細胞表面タンパク質
一例では、死滅させる標的細胞の細胞表面のタンパク質が、他の細胞に相当量は存在しない。例えば、細胞表面タンパク質は、標的細胞型だけに見出される受容体でありうる。
特定の例では、細胞表面タンパク質が、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー（例えば、ＨＥＲ１、２、３、および４）およびサイトカイン受容体のメンバー（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ５２など）など、がんまたは腫瘍特異的タンパク質（当技術分野ではまた、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原としても公知）である。したがって、一部の例では、細胞表面タンパク質は、腫瘍細胞の細胞膜で発現した抗原である。腫瘍特異的タンパク質とは、がん細胞に固有であるか、または、正常細胞など、他の細胞と比較して、がん細胞でより豊富なタンパク質である。例えば、ＨＥＲ２が、乳がんに主に見出されるのに対し、ＨＥＲ１は、膵臓、乳房、前立腺、および結腸など、多くの器官に見出されうる腺癌に主に見出される。
標的細胞（そして、この標的細胞に対する抗体−ＩＲ７００分子を製剤化するのに、このタンパク質に特異的な抗体を用いることができる）に見出されうる例示的な腫瘍特異的タンパク質には、ＭＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７４８１およびＡＡＡ０３２２９）、ＭＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１８９２０およびＡＡＡ１７７２９）、ＭＡＧＥ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０３７３５およびＡＡＡ１７４４６）、ＭＡＧＥ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３２０７５およびＡ０６８４１．１）などを含めた様々なＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか；様々なチロシナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１８７３およびＡＡＢ６０３１９）のうちのいずれか；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４１５６、ＣＡＡ３８０９５、およびＡＡ４９４３１１）；ｐ９７黒色腫抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２１５４およびＡＡＡ５９９９２）；乳腺腫瘍と関連するヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ５６１５１およびＡＡＢ１９７７１）；ＢＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０７２）およびＢＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２４８２およびＮＰ＿８７２２８８）を含めた様々なＢＡＧＥ（ヒトＢ型黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか；ＧＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０６５）、またはＧＡＧＥ２〜６うちのいずれかを含めた様々なＧＡＧＥ（Ｇ抗原）のうちのいずれか；様々なガングリオシド；ＣＤ２５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４０８．１およびＮＭ＿０００４１７．２）が挙げられるがこれらに限定されない。
他の腫瘍特異的抗原には、子宮頸がんと関連するＨＰＶ １６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ＦＪ９５２１４２．１、ＡＤＢ９４６０５、ＡＤＢ９４６０６、およびＵ８９３４９）、乳癌と関連するムチン（ＭＵＣ １）−ＫＬＨ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３６５１およびＡＡＡ３５７５６）、結腸直腸がんと関連するＣＥＡ（がん胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８３１１およびＣＡＡ６６９５５）、例えば、黒色腫と関連するｇｐ１００（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３およびＡＡＣ６０６３４）、黒色腫と関連するＭＡＲＴ１抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５０２）、卵巣がんおよび他のがんと関連するがん抗原１２５（ＣＡ１２５、また、ムチン１６またはＭＵＣ１６としても公知）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４６９０およびＮＰ＿０７８９６６）；肝臓がんと関連するアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３４およびＮＰ＿００１１２５）；結腸直腸がん、胆道がん、乳がん、小細胞肺がん、および他のがんと関連するＬｅｗｉｓ Ｙ抗原；腺癌と関連する腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；および前立腺がんと関連するＰＳＡ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８１０およびＣＡＡ３２９１５）が挙げられる。
他の例示的な腫瘍特異的タンパク質には、固形腫瘍による新生血管系のほか、前立腺がんと関連するＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６０２０９およびＡＡＢ８１９７１．１）；乳がん、卵巣がん、胃がん、および子宮がんと関連するＨＥＲ−２（ヒト上皮成長因子受容体２、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１およびＡＡＡ５８６３７）、肺がん、肛門がん、および神経膠芽腫（gliobastoma）のほか、腺癌と関連するＨＥＲ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８およびＮＰ＿００５２１９）；黒色腫、肉腫、精巣癌、および他のがんと関連するＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８７４５９およびＡＡＢ４９６９３）、ｈＴＥＲＴ（別名、テロメラーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１９８２５３およびＮＰ＿９３７９８３（バリアント１）、ＮＭ＿１９８２５５およびＮＰ＿９３７９８６（バリアント２））；プロテイナーゼ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８、Ｘ５６６０６、ＣＡＡ３９９４３およびＡＡＡ３６３４２）、およびウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３７８およびＮＰ＿０００３６９（バリアントＡ）、ＮＭ＿０２４４２４およびＮＰ＿０７７７４２（バリアントＢ）、ＮＭ＿０２４４２５およびＮＰ＿０７７７４３（バリアントＣ）、ならびにＮＭ＿０２４４２６およびＮＰ＿０７７７４４（バリアントＤ））が挙げられるがこれらに限定されない。
一例では、腫瘍特異的タンパク質が、慢性リンパ性白血病と関連するＣＤ５２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ２７４９５．１およびＣＡＩ１５８４６．１）；急性骨髄性白血病と関連するＣＤ３３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２３０６８およびＣＡＤ３６５０９．１）；および非ホジキンリンパ腫と関連するＣＤ２０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７６９ ＮＰ＿０３１６６７）である。
特定の例では、腫瘍特異的タンパク質が、ＣＤ４４（例えば、ＯＭＩＭ １０７２６９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＩ４６５９６．１およびＮＰ＿０００６０１．３）である。ＣＤ４４は、がん幹細胞のマーカーであり、細胞間接着、細胞遊走、細胞の空間的配向、およびマトリックス由来の生存シグナルの促進に関与する。腫瘍の細胞膜におけるＣＤ４４の高発現は、腫瘍の攻撃性および転帰不良に関連しうる。
したがって、開示される方法を用いて、腫瘍特異的タンパク質を発現する任意のがんを処置することができる。
例示的な抗体−ＩＲ７００分子
細胞表面タンパク質配列は、公開されている（例えば、上記で示される通り）ため、このようなタンパク質に特異的な抗体（またはＩＲ７００へと結合体化しうる他の低分子）を作製または購入することを、達成することができる。例えば、腫瘍特異的タンパク質ＨＥＲ２を標的として選択する場合は、ＨＥＲ２に特異的な抗体（トラスツズマブなど）を購入するかまたは生成させ、ＩＲ７００色素へと結合させることができる。他の特定の例が、表１に提示される。一例では、抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である。抗体−ＩＲ７００分子は、ＷＯ２０１３／００９４７５号（その全体が本明細書に参考として援用される）に記載されている方法などの方法を用いて生成させることができる。
Figure 2021521135
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ＩＲ７００へと結合体化できるさらなる抗体には、３Ｆ８、アバゴボマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アルツモマブペンテテート、アナツモマブマフェナトクス、アポリズマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、シタツズマブボガトクス、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、ガリキシマブ、グレンバツムマブベドチン、イゴボマブ、イミシロマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ノフェツモマブメルペンタン、ピンツモマブ、サツモマブペンデチド、ソネプシズマブ、タプリツモマブペプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、ＴＮＸ−６５０、またはトレメリムマブが挙げられる。
一例では、患者を、がん細胞表面抗原に特異的な少なくとも２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子で処置する。一例では、２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子が、同じタンパク質（ＨＥＲ−２など）に特異的であるが、このタンパク質の異なるエピトープ（ＨＥＲ−２のエピトープ１およびエピトープ２など）に特異的である。別の例では、２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子が、２つの異なるタンパク質または抗原に特異的である。例えば、抗ＨＥＲ１−ＩＲ７００および抗ＨＥＲ２−ＩＲ７００を、カクテルとして併せて注射すれば、ＨＥＲ１またはＨＥＲ２のいずれかを担持する細胞の殺滅を容易としうる。
特定の一例では、抗体−ＩＲ７００分子は、ＲＧ７３５６−ＩＲ７００またはビバツズマブ−ＩＲ７００など、抗ＣＤ４４−ＩＲ７００である。ＲＧ７３５６は、ＣＤ４４標準だけでなく全てのＣＤ４４スプライスバリアントに存在する、ヒト細胞表面糖タンパク質ＣＤ４４の細胞外ドメインの定常領域に特異的に結合するＩｇＧ１カッパアイソタイプの組換えヒト抗体である。ビバツズマブは、ＣＤ４４ ｖ６に特異的なヒト化ｍＡｂである。
免疫調節薬
開示される方法で用いられる免疫調節薬には、免疫系を活性化する、および／または免疫抑制細胞（本明細書において抑制細胞とも称する）を阻害する、作用物質または組成物が挙げられる。理論によって拘束されないが、図１８に示す通り、免疫抑制細胞の阻害、および／または免疫応答の活性化は、腫瘍の細胞殺滅を増加させ、メモリーＴ細胞の産生ももたらし、これは、再発および／または遠隔腫瘍もしくは転移に対する「ワクチン」効果を提供できる。
一部の実施形態では、免疫調節薬は、免疫抑制細胞の阻害剤、例えば、免疫抑制細胞の活性を阻害または減少させる作用物質である。一部の場合では、免疫調節薬は、免疫抑制細胞を死滅させる。一部の例では、免疫抑制細胞は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。一部の例では、全ての抑制細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで死滅させられるわけではない。そうなってしまったら、自己免疫の発生につながりうるからである。したがって、一部の例では、方法は、被験体の領域において、例えば腫瘍の領域または腫瘍があった領域において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、免疫抑制細胞の活性または数を減少させる。一部の例では、方法は、被験体における抑制細胞の総数を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減じる。
免疫抑制細胞の阻害剤には、チロシンキナーゼ阻害剤（ソラフェニブ、スニチニブおよびイマチニブなど）、化学療法剤（シクロホスファミド、またはインターロイキン−毒素融合体、例えば、デニロイキンジフィトクス（denileukin difitox）（ＩＬ２−ジフテリア毒素融合体など）、もしくは抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブまたはバシリキシマブなど）、または抑制細胞表面タンパク質に結合する他の抗体（下記に記載する抗体など）が挙げられる。他の例では、免疫抑制細胞の阻害剤には、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１拮抗抗体が挙げられ、それによって、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを予防する（本明細書において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ媒介免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）と称する）。したがって、一部の例では、免疫調節薬は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ピディリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＭＥＤＩ−０６８０、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ−３２８０Ａ、ＭＧＡ−２７１、インドキシモド、エパカドスタット、ＢＭＳ−９８６０１６、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＥＤＩ−４７３７、ＭＫ−４１６６、ＢＭＳ−６６３５１３、ＰＦ−０５０８２５６６（ＰＦ−２５６６）、リリルマブ、およびＭＳＢ−００１０７１８Ｃなど、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１拮抗抗体である。チェックポイント阻害剤には、イピリムマブおよびトレメリムマブを含めた、抗ＣＴＬＡ−４抗体も挙げられる。免疫抑制細胞の阻害剤はまた、ＢＭＳ−９８６０１６およびＭＧＡ２７１などのＬＡＧ−３またはＢ７−Ｈ３アンタゴニストでありうる。一部の例では、２つまたはそれより多くの免疫抑制細胞の阻害剤を被験体に投与することができる。非限定的な一例では、被験体に、抗ＰＤ１および抗ＬＡＧ−３抗体を投与する。
一部の例では、抑制細胞の活性を阻害または減少させる作用物質には、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が挙げられ、抗体は、抑制細胞表面タンパク質（ＣＤ２５、ＣＤ４、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＣＲ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０、葉酸受容体４（ＦＲ４）、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ１２２、ＣＤ２３、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、ＣＤ１４、インターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ−４Ｒａ）、インターロイキン−１受容体アルファ（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−１デコイ受容体、ＣＤ１０３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＸＣＲ２、ＣＤ３３、およびＣＤ６６ｂなど）に特異的に結合し、一部の例では、機能性Ｆｃ領域（例えば、１または複数のＦ（ａｂ’）２断片からなる）を含まない。機能性Ｆｃ部分の存在は、自己免疫毒性（抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）など）をもたらしうる。ＡＤＣＣの結果は、ＮＩＲ光に曝露された抑制細胞だけでなく、あまりにも多くの抑制細胞が死滅させられる可能性があることである。したがって、抗体のＦｃ部分は、その機能を実質的に低減するように（Ｆｃγ受容体に結合する能力など、非変異Ｆｃ領域と比較してＦｃ機能の少なくとも５０％、少なくとも７５％ 少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の減少など）、変異または除去され得る。抑制細胞の活性を減少させるため、または抑制細胞を死滅させるための方法および組成物は、国際特許公開第２０１７／０２７２４７号（その全体が本明細書に参考として援用される）に記載されている。
非限定的な例では、免疫調節薬は、ダクリズマブ−ＩＲ７００またはバシリキシマブ−ＩＲ７００など、ＣＤ２５抗体−ＩＲ７００分子である。
他の実施形態では、免疫調節薬は免疫系活性化剤である。一部の例では、免疫系活性化剤は、１もしくは複数のＴ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激する（活性化する）。一例では、免疫系活性化剤には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２１など、１または複数のインターロイキン（ＩＬ）が挙げられる。非限定的な例では、免疫調節薬には、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が挙げられる。別の例では、免疫系活性化剤には、４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＧＩＴＲなど、共刺激受容体に対する１または複数のアゴニストが挙げられる。非限定的な例では、免疫調節薬には、刺激性抗４−１ＢＢ、抗ＯＸ４０、および／または抗ＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
一部の例では、１または複数（１、２、３、４、５またはそれより多くなど）の用量の免疫調節薬を、被験体に投与する。したがって、免疫調節薬を投与するステップは、１日で完了させることもでき、複数日（少なくとも２回の異なる時点、３回の異なる時点、４回の異なる時点、５回の異なる時点、または１０回の異なる時点における投与など）に、同じ投与量または異なる投与量で、反復的に行うこともできる。一部の例では、反復投与は同じ用量である。他の例では、反復投与は異なる用量である（先行する用量より高いその後の用量、または先行する用量よりも低いその後の用量など）。免疫調節薬の反復投与は、同日に行うこともでき、連日に行うこともでき、１日おきに行うこともでき、１〜３日間ごとに行うこともでき、３〜７日間ごとに行うこともでき、１〜２週間ごとに行うこともでき、２〜４週間ごとに行うこともでき、１〜２カ月間ごとに行うこともでき、なお長期の間隔で行うこともできる。一部の例では、少なくとも１用量の免疫調節薬は照射の前に投与され、少なくとも１用量の免疫調節薬は、照射の後に投与される。
照射
被験体が１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与された後、および被験体が１または複数の免疫調節薬を投与された後（または必要に応じて前に）、被験体（または被験体における腫瘍）に照射する。細胞表面タンパク質を発現する細胞だけが抗体により認識されるので、これらの細胞だけに十分量の抗体−ＩＲ７００分子が結合して、細胞を死滅させる。照射は、抗体−ＩＲ７００分子が結合する細胞だけを死滅させ、他の細胞は死滅させないので、これは、正常細胞の殺滅など、望ましくない副作用の尤度を低減する。
被験体（例えば、被験体における腫瘍）は、６６０〜７００ｎｍ、６８０〜７０００ｎｍ、６７０〜６９０ｎｍ、例えば、６８０ｎｍなど、６６０〜７１０ｎｍの波長の、治療線量の放射線で照射する。特定の例では、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも５００Ｊ／ｃｍ２、例えば、１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、１〜５００Ｊ／ｃｍ２、３０〜５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜１００Ｊ／ｃｍ２、または１０〜５０Ｊ／ｃｍ２など、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で細胞に照射する。
被験体に１または複数回照射することができる。したがって、照射は、１日で完了させることもでき、複数日（少なくとも２回の異なる時点、３回の異なる時点、４回の異なる時点、５回の異なる時点、または１０回の異なる時点における照射など）に、同じ線量または異なる線量で、反復的に行うこともできる。一部の例では、反復照射は同じ線量である。他の例では、反復照射は異なる線量（different does）である（先行する線量より高いその後の線量、または先行する線量よりも低いその後の線量など）。反復照射は、同日に行うこともでき、連日に行うこともでき、１日おきに行うこともでき、１〜３日間ごとに行うこともでき、３〜７日間ごとに行うこともでき、１〜２週間ごとに行うこともでき、２〜４週間ごとに行うこともでき、１〜２カ月間ごとに行うこともでき、なお長期の間隔で行うこともできる。一例では、第１の照射は５０Ｊ／ｃｍ２であり、第２の照射は１００Ｊ／ｃｍ２であり、照射は、連日である（例えば、約２４時間離して）。
一部の例では、照射は、ＮＩＲ ＬＥＤが組み込まれた装着用デバイスで提供される。他の例では、開示される方法と共に用いられうる別の種類のデバイスは、ＮＩＲ ＬＥＤを伴う閃光様デバイスである。このようなデバイスは、手術中における病変の局所療法のために用いることもでき、１または複数のＰＩＴ剤の投与後、内視鏡へと組み込んで、ＮＩＲ光を体表面へと適用することもできる。このようなデバイスは、医師または有資格の保健従事者が用いることにより、身体の特定の標的に対する処置に向けることができる。
装着用ＮＩＲ ＬＥＤを用いる処置
本明細書に記載される通り、開示される方法は、がん細胞に高度に特異的である。しかし、体内を循環するかまたは皮膚に存在する細胞を死滅させるために、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込むデバイスを装着することができる。一部の例では、患者が、少なくとも２つのデバイス、例えば、昼間における衣料品または装身具、および夜間におけるブランケットを用いる。一部の例では、患者が、少なくとも２つのデバイス、例えば、２つの衣料品を同時に用いる。これらのデバイスは、処置が個人性を維持し、日常的活動に干渉しないように、日常携帯型の衣料品および装身具を用いて、患者を、ＮＩＲ光に曝露することを可能とする。一部の例では、デバイスを、ＰＩＴ療法のために、昼間に目立たないように装着することができる。ＮＩＲ ＬＥＤが組み込まれる例示的なデバイスは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／００９４７５号（本明細書に参考として援用される）に開示されている。
一例では、本明細書に記載される方法を用いて、患者に、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の免疫調節薬を投与する。次いで、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込むデバイスを装着し、血液もしくはリンパに存在するかまたは皮膚に存在する腫瘍細胞の、長期にわたる治療および処置を可能とする。一部の例では、線量が、少なくとも少なくとも１Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、例えば２０Ｊ／ｃｍ２もしくは３０Ｊ／ｃｍ２である。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子の投与が、ある期間にわたり反復される（治療レベルが身体において存在することを確実にするために、隔週または毎月など）。
一部の例では、患者が、デバイスまたはデバイスの組合せを、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも４カ月間、少なくとも６カ月間、なおまたは少なくとも１年間にわたり装着するかまたは用いる。一部の例では、患者が、デバイスまたはデバイスの組合せを、１日少なくとも４時間、例えば１日少なくとも１２時間、１日少なくとも１６時間、１日少なくとも１８時間、または１日２４時間にわたり装着するかまたは用いる。処置期間中には、同じ患者が、類似の「日常的」という特徴を有する複数のデバイス（ブランケット、ブレスレット、ネックレス、下着、靴下、靴の中敷き）を装着しうることが十分可能である。夜間には、患者が、ＮＩＲ ＬＥＤブランケットまたは他の被覆品を用いうる。
さらなる療法の投与
上記で論じた通り、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および／または照射の投与前、投与中、または投与後に、被験体に対し、１または複数の他の療法を施すことができる。一例では、被験体に、１または複数の処置を施して腫瘍を除去または減らし、その後に抗体−ＩＲ７００分子を投与する。他の例では、さらなる処置または治療剤（抗新生物剤など）を、例えば、照射後に、例えば、細胞に照射した後の約０〜８時間に（照射後の少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、または少なくとも７時間など、例えば、照射後の１時間〜１０時間、１時間〜９時間、１時間〜８時間、２時間〜８時間、または４時間〜８時間など、１０時間を超えずに、９時間を超えずに、または８時間を超えずに）、処置すべき被験体へと投与することができる。別の例では、さらなる治療剤を、照射の直前（照射前の１０分〜６０分、または１０分〜３０分など、照射前の約１０分〜１２０分など）に投与する。
開示される方法と組み合わせて用いうる療法であって、該ＰＩＴ後約８時間にわたり、さらなる治療剤への腫瘍の接触可能性を増強する療法の例としては、腫瘍を除去または減らすための外科的処置（外科的切除、寒冷療法、または化学塞栓術など）のほか、放射性治療剤、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤、ならびに他の作用物質が含まれうる抗腫瘍の薬学的処置が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、さらなる治療剤を、ナノ粒子へと結合体化する。用いうるさらなる治療剤の特定の例には、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤またはＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、および遺伝子調節剤が挙げられる。これらの作用物質（治療有効量で投与される）および処置は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。このような作用物質の方法および治療投与量は、当業者に公知であり、熟練した臨床家により決定されうる。
「微小管結合剤」とは、チューブリンと相互作用して、微小管形成を安定化させるか、または微小管形成の安定化を解除し、これにより、細胞分裂を阻害する作用物質を指す。開示される方法と共に用いうる微小管結合剤の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、およびリゾキシンが挙げられるが、それらに限定されない。また、このような化合物の類似体および誘導体も用いることができる。例えば、適切なエポチロンおよびエポチロン類似体は、国際公開第ＷＯ２００４／０１８４７８号に記載されている。パクリタキセルおよびドセタキセルのほか、米国特許第６，６１０，８６０号；同第５，５３０，０２０号；および同第５，９１２，２６４号により教示されるパクリタキセルの類似体などのタキソイドを用いることができる。
以下のクラスの化合物は、本明細書で開示される方法と共に用いることができる。アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない適切なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写調節剤は、開示される療法と組み合わせた使用にもまた適する。被験体に投与しうるＤＮＡ挿入剤およびＤＮＡ架橋形成剤には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない。治療剤としての使用に適するＤＮＡ合成阻害剤には、メトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、およびこれらの類似体が挙げられるが、それらに限定されない。適切な酵素阻害剤の例には、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない。遺伝子調節に影響を及ぼす適切な化合物には、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン、ならびにこれらの誘導体および類似体など、１または複数の遺伝子の発現の増大または低減を結果としてもたらす作用物質が挙げられるが、それらに限定されない。キナーゼ阻害剤には、成長因子のリン酸化および活性化を防止するＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブ）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）、およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）が挙げられる。
抗血管新生剤の非限定的な例には、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えベクターなどの分子、ならびに血管成長を減少させるまたはさらに阻害するために機能する低分子が挙げられる。適切な血管新生阻害剤の例には、アンジオスタチンＫ１−３、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン−アルファ、メタロプロテイナーゼインヒビター、血小板因子４、ソマトスタチン、トロンボスポンジン（thromobospondin）、エンドスタチン、サリドマイド、ならびにそれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）またはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２抗体）に特異的に結合する抗体である。一例では、抗血管新生剤には、ＶＥＧＦＲ２抗体もしくはＤＭＸＡＡ（ＶａｄｉｍｅｚａｎまたはＡＳＡ４０４としても公知；例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販）またはこれらの両方が挙げられる。抗血管新生剤は、ベバシズマブ、スニチニブ、抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、スニチニブ、キシチニブおよびダサチニブであり得る。これらは、個々に、または任意の組合せで用いることができる。
また、他の治療剤、例えば、上記分類のうちの１または複数の下に収まる場合もあり、収まらない場合もある抗腫瘍作用物質も、開示される方法と組み合わせた投与に適する。例を目的として述べると、このような作用物質には、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられる。
一部の例では、治療抗体−ＩＲ７００分子の組成物を施される被験体に、例えば、静脈内投与を介して、インターロイキン２（ＩＬ−２）もまた投与する。特定の例では、ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を、静脈内ボーラスとして、少なくとも５００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で、抗体−ＩＲ７００分子の投与の翌日から始めて８時間ごとに１５分間にわたり投与し、最長５日間にわたり継続する。投与は、被験体の忍容性に応じて省略することができる。
例示的なさらなる治療剤には、化学療法剤および抗血管新生剤などの抗新生物剤、または放射線療法などの療法が挙げられる。一例では、この薬剤が、化学療法免疫抑制薬（リツキシマブ、ステロイドなど）、またはサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど）である。当技術分野では、化学療法剤が公知である（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer and Berkery. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer Knobf, and Durivage (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照されたい）。化学療法剤の組合せは、がんを処置する２以上の薬剤の投与である。
本明細書で提示される方法と共に用いられうる例示的な化学療法剤には、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イリノテカン、ゲムシタビン、チアゾフリン（iazofurine）、ゲムシタビン、エトポシド、ビノレルビン、タモキシフェン、バルスポダール、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ミトキサントロン、ドキシル（リポソームに封入されたドキソルビシン（doxiorubicine））、およびビノレルビンが挙げられるがこれらに限定されない。用いられうる化学療法剤のさらなる例には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、またはホルモン、およびそれらのアンタゴニストが挙げられる。アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンまたはダカルバジンなど）が挙げられる。アルキル化剤の特定の非限定的な例は、テモゾロミドおよびダカルバジンである。代謝拮抗薬の例には、葉酸類似体（メトトレキサートなど）、ピリミジン類似体（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびメルカプトプリンまたはチオグアニンなどのプリン類似体が挙げられる。天然産物の例には、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンまたはマイトマイシン（mitocycin）Ｃなど）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が挙げられる。種々の薬剤の例には、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知のｃｉｓ−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換ウレア（ヒドロキシウレアなど）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質（adrenocrotical）抑制薬（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例には、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（magestrol）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）、およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。
一般に用いられる化学療法薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ゼローダ（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゼベリン、およびカルシトリオールが挙げられる。用いられうる免疫調節薬の非限定的な例には、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．製）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
一部の例では、さらなる治療剤を、直径が少なくとも１ｎｍ（例えば、直径が１ｎｍ〜５００ｎｍ、１ｎｍ〜３００ｎｍ、１ｎｍ〜１００ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、または１０ｎｍ〜３００ｎｍなど、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも３０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、直径が少なくとも２００ｎｍ、直径が少なくとも３００ｎｍ、直径が少なくとも５００ｎｍ、または直径が少なくとも７５０ｎｍ）のナノ粒子などのナノ粒子へと結合体化する（または他の方法でこれと会合させる）。
一例では、開示される療法の投与（抗体−ＩＲ７００分子および／または免疫調節薬の投与など）の前に、腫瘍の少なくとも一部（転移性腫瘍など）を外科的に除去する（例えば、外科的切除および／または寒冷療法を介して）か、照射するか（例えば、腫瘍の根絶またはその縮小を助ける腫瘍部位への放射性物質またはエネルギー（対外照射治療など）の投与）、化学的に処置するか（例えば、化学塞栓術を介して）、またはこれらの組合せを施す。例えば、転移性腫瘍を有する被験体は、開示される療法を投与する前に、腫瘍の全部または一部を、外科的に切除することができる。ある例では、１または複数の化学療法剤を、抗体−ＩＲ７００分子、免疫調節薬および照射による処置の後に投与する。別の特定の例では、被験体が転移性腫瘍を有し、放射線療法、化学塞栓療法、またはこれらの両方が、開示される療法の投与と併せて投与される。
一部の例では、投与されるさらなる治療剤は、モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブペンテテート、アナツモマブマフェナトクス、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブベドチン、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イミシロマブ、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブペンデチド、シブロツズマブ、ソネプシズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タプリツモマブペプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、ティガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはそれらの組合せが挙げられる。
メモリーＴ細胞の産生
また、標的細胞に特異的なメモリーＴ細胞を産生させる方法も提供される。特定の例では、方法は、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を被験体へと投与するステップであって、抗体が、腫瘍特異的抗原（表１に列挙されるものなど）など、標的細胞表面分子に特異的に結合するステップを含む。方法は、治療有効量の１または複数の免疫調節薬（免疫系活性化剤、または免疫抑制細胞の阻害剤など）を、抗体−ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、約０〜２４時間以内）のいずれかで、被験体へと投与するステップも含む。特定の例では、免疫調節剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１拮抗抗体である。別の特定の例では、免疫調節剤は、ＣＤ２５抗体−ＩＲ７００分子である。被験体または被験体における細胞に、次いで、６６０〜７１０ｎｍ（例えば、６８０ｎｍ）など、６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２（少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２など）の線量を照射する。
メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得、通常、ＣＤ４５ＲＯを発現する。したがって、一部の例では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯを発現している細胞を検出することによって同定される。いくつかのメモリーＴ細胞のサブタイプが公知である。例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ７（ＣＣＲ７）、およびＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）を発現する。セントラルメモリーＴ細胞はＣＤ４４を高発現する中間体も有する。このメモリー亜集団は、一般に、リンパ節および末梢循環において見出される。エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）は、ＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＣＲ７およびＬ−セレクチンの発現を欠く。これらはＣＤ４４を高発現する中間体も有する。これらのメモリーＴ細胞は、リンパ節ホーミング受容体を欠き、したがって、末梢循環および組織において見出される。ＴＥＭＲＡ細胞は、ＣＤ４５ＲＡも発現する。組織常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）は、インテグリンαｅβ７を発現する。他の種類のＴ細胞よりもおよそ２０〜３０倍活性の非常に活性な脂質代謝に関与する遺伝子は、ＴＲＭに特異的である。ステムメモリー（ＴＳＣＭ細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋であるが、これらは、大量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１も発現する。
一部の例では、開示される方法により、開示される方法で処置されていない被験体におけるメモリーＴ細胞の量と比較して、少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれより高く）メモリーＴ細胞が増加する。一部の例では、総メモリーＴ細胞は増加するが、他の例では、メモリーＴ細胞の１または複数のサブタイプが、処置されていない被験体と比較して増加する。他の例では、方法により、開示される方法で処置されていない被験体におけるメモリーＴ細胞の量と比較して、少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれより高く）、腫瘍特異的抗原などの特異的抗原に対するメモリーＴ細胞が増加する。非限定的な例では、メモリーＴ細胞は、ｐ１５Ｅ、ｂｉｒｃ５、ｔｗｉｓｔ、およびｐ５３のうちの１または複数を認識する（実施例３を参照されたい）。
メモリーＴ細胞の数および／または種類は、被験体（処置された被験体など）に由来する試料において決定することができる。一部の例では、イムノアッセイおよび／または遺伝分析を用いて、被験体に由来する血液試料中のメモリーＴ細胞を検出する。例えば、１または複数のメモリーＴ細胞表面マーカーの存在および／または量は、例えば、フローサイトメトリーによって測定することができる。別の例では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、処置された被験体から入手し、腫瘍特異的抗原などの抗原に対する機能的反応性についてチェックすることができる。例示的な方法を下記の実施例３に提示する。メモリーＴ細胞の数、種類および／または反応性プロファイルを、処置されていない被験体、処置の前の被験体、および／または参照数値（正常な（例えば、健常な）個体の集団から入手した平均など）など、対照と比較することができる。
ポリクローナル抗原特異的ＴＩＣの産生
また、ＭＨＣタイプＩ拘束性腫瘍特異的抗原に対するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣ応答を増加させる方法も提供される。特定の例では、方法は、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を被験体へと投与するステップであって、抗体が、腫瘍特異的抗原（表１に列挙されるものなど）など、標的細胞表面分子に特異的に結合するステップを含む。方法は、治療有効量の１または複数の免疫調節薬（免疫系活性化剤、または免疫抑制細胞の阻害剤など）を、抗体−ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、約０〜２４時間以内）のいずれかで、被験体へと投与するステップも含む。特定の例では、免疫調節剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１拮抗抗体である。別の特定の例では、免疫調節剤は、ＣＤ２５抗体−ＩＲ７００分子である。被験体または被験体における細胞に、次いで、６６０〜７１０ｎｍ（例えば、６８０ｎｍ）など、６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２（少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２など）の線量を照射する。
（実施例１）
材料および方法
この実施例では、実施例２〜９における結果を得るために用いる材料および方法について記載する（その全体が本明細書に参考として援用されるNagaya et al., Cancer Immunol. Res. 7:401-13, 2019も参照されたい）。
試薬
水溶性、ケイ素−フタロシアニン誘導体であるＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳエステル（ＩＲ７００）は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）から得た。抗マウス／ヒトＣＤ４４特異的ｍＡｂ（クローンＩＭ７）および抗マウスＰＤ−１（ＣＤ２７９）特異的ｍＡｂ（クローンＲＭＰ１−１４）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）から得た。他の全ての化学物質は、試薬グレードであった。
ＩＲ７００と結合体化した抗ＣＤ４４ ｍＡｂの合成
抗ＣＤ４４ ｍＡｂ（１．０ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ）を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）中のＩＲ７００ ＮＨＳエステル（６５．１μｇ、３３．３ｎｍｏｌ）と共に、室温で１時間にわたりインキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で精製した。タンパク質濃度は、５９５ｎｍでの吸収を、紫外−可視（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定することにより、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で決定した。ＩＲ７００の濃度は、６８９ｎｍでの吸収によって測定して、ｍＡｂ当たりのフルオロフォア分子の数を確認した。平均２つのＩＲ７００分子が各ＣＤ４４抗体に結合するように、ＣＤ４４−ＩＲ７００コンジュゲートの合成を制御した。ＣＤ４４−ＩＲ７００コンジュゲートの７００ｎＭでの蛍光および分子量を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド（４〜２０％勾配）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて検証した。
細胞培養
ルシフェラーゼを安定的に発現するＭＣ３８（結腸がん）細胞（ＭＣ３８−ｌｕｃ）、ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ肺癌）細胞、およびＭＯＣ１（マウス口腔癌）細胞を、既に記載されている通りに培養において維持した（Farsaci et al., Cancer Immunol Res. 2014; 2:1090-102；Hodge et al., Cancer Biother Radiopharm. 2012; 27:12-22；Judd et al., Cancer Res. 2012; 72:365-74）。細胞を、３０継代以下の間、培養において維持し、マイコプラズマに対して陰性を日常的に試験した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＩＲ−ＰＩＴ
ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞またはＭＯＣ１細胞（２×１０５個）を、１２ウェルプレートへと播種し、２４時間にわたりインキュベートし、次いで、１０μｇ／ｍＬのＣＤ４４−ＩＲ７００を含有する培地に３７℃で６時間にわたり曝露した。細胞に、赤色発光ダイオード（ＬＥＤ、６９０±２０ｎｍの波長、Ｌ６９０−６６−６０；Ｍａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、５０ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で照射した。細胞を、細胞スクレーパーで採取し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、２μｇ／ｍＬ）で室温で３０分間にわたり染色し、次いで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。
動物および腫瘍モデル
６〜８週齢の雌性野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（系統＃０００６６４）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。マウスは注射の前に皮下腫瘍移植の部位を剪毛した。腫瘍を各モデルに対する６×１０６個細胞の皮下注射を介して確立した。一部の実験では、複数のＭＣ３８腫瘍を確立した。確立された腫瘍をおよそ５０ｍｍ３の体積で処置した（直径４〜５ｍｍ；ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について４日目；ＭＯＣ１腫瘍について１８日目）。ＮＩＲ−ＰＩＴ処置および蛍光／生物発光イメージング（ＢＬＩ）のために、マウスに、３〜５％のイソフルランの吸入および／または１ｍｇのペントバルビタールナトリウム（ネンブタールナトリウム溶液、Ｏｖａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）の腹腔内注射を介して麻酔をかけた。ＣＤ４４−ＩＲ７００をＩＶ（尾静脈）注射を介して投与し、ＮＩＲ光を、５日目に５０Ｊ／ｃｍ２、および６日目に１００Ｊ／ｃｍ２で投与した。２回のＮＩＲ光の線量により標的発現細胞の８０％までを死滅させるということが以前の結果から実証された（Mitsunaga et al., Nat Med. 2011; 17:1685-91；Nagaya et al., Mol Cancer Res. 2017; 15:1667-77）。複数の腫瘍を担持したマウスについて、ＮＩＲに曝露されない腫瘍をアルミホイルでＮＩＲ光の曝露から遮蔽した。ＰＤ−１ ｍＡｂを、標準的な技法を用いて、腹腔内注射を介して投与した。腫瘍体積は、ノギス測定に基づいた（腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５）。一部のＭＣ３８の実験では、ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せの処置後に治癒したマウスに、反対側の側腹部にＭＣ３８（６×１０６個）細胞の皮下注射による負荷を与えた。腫瘍体積および動物の体重を、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について週に３回、ＭＯＣ１腫瘍について週に２回、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達するまで測定し、それから、マウスを二酸化炭素ガスの吸入で安楽死させた。全ての免疫相関実験のために、マウスを覚醒中の頸椎脱臼を介して安楽死させた。
蛍光イメージング
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞またはＭＯＣ１細胞（１×１０４個）を、カバーガラス底皿上に播種し、２４時間にわたりインキュベートし、次いで、１０μｇ／ｍＬのＣＤ４４−ＩＲ７００に３７℃で６時間にわたり曝露した。次いで、細胞を、５９０〜６５０ｎｍの励起フィルターおよび６６５〜７４０ｎｍの帯域発光フィルターを用いて、蛍光顕微鏡法（ＢＸ６１；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）により解析した。また、透過光微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像も収集した。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＩＲ７００蛍光および白色光画像を、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（７００ｎｍ蛍光チャネル）を用いて得て、Ｐｅａｒｌ Ｃａｍソフトウェア（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて解析した。腫瘍内の目的の領域（ＲＯＩ）を、バックグラウンドとしての隣接する非腫瘍領域（左背）と比較した。各ＲＯＩの平均蛍光強度を計算した（ｎ≧１０）。
生物発光イメージング（ＢＬＩ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を、１２ウェルプレート（２×１０５個細胞／ウェル）、または１０ｃｍディッシュ（２×１０７個細胞）へと播種し、２４時間にわたりインキュベートし、次いで、１０μｇ／ｍＬのＣＤ４４−ＩＲ７００に３７℃で６時間にわたり曝露した。細胞を、フェノールレッド不含培養培地中、ＬＥＤまたはＮＩＲレーザー光（６９０±５ｎｍ、ＢＷＦ５−６９０−８−６００−０．３７；Ｂ＆Ｗ ＴＥＫ ＩＮＣ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、ＵＳＡ）で処置した。ルシフェラーゼ活性のために、細胞を、ＮＩＲ−ＰＩＴ処置の１時間後に１５０μｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に曝露し、ルシフェラーゼ活性（フォトン／分）を、Ｍ３ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を用いて、ＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ；Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で得た。ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｄ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）を腹腔内注射し、マウスを、ルシフェラーゼ活性（フォトン／分／ｃｍ２）についてＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ）において解析した。ＲＯＩを、隣接する非腫瘍領域をバックグラウンドとして、腫瘍全体を含むように設定した。
組織学的解析
腫瘍（ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について１０日目、ＭＯＣ１腫瘍について２４日目）を、切除し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、１０μｍの薄片を作製した。標準のＨ＆Ｅ染色の後、切片（sectioned）をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡で解析した。
免疫蛍光法
ホルマリン固定パラフィン包埋切片を、記載（１８）の通りに染色した。略述すると、切片を、エタノール勾配中で脱パラフィン化し、次いで、ｂｌｏｘａｌｌ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２．５％の正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ａｂ希釈剤（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）との別個のインキュベーションでブロッキングした。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ａｂ希釈剤中のＣＤ４標的化一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、クローン４ＳＭ９５、１：７５希釈）をオービタルシェーカー上で４５分間にわたり添加した。スライドを５回洗浄し、次いで、抗ラット二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。さらに４回の洗浄の後、スライドをＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｌｕｓ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中のＴＳＡ結合体化Ｏｐａｌ６５０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１：１５０希釈）で染色した。スライドを１×ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。スライドを洗浄し、抗原ストリッピングバッファー（０．１Ｍグリシン ｐＨ１０＋０．５％ｔｗｅｅｎ２０）に曝し、上記の通りに再度ブロッキングした。Ｒｅｉｎａｓｓａｎｃｅ Ａｂ希釈剤中のＣＤ８標的化一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、クローン４ＳＭ１５、１：７５希釈）を４５分間にわたり添加した。抗ラット（A nti-rat）二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を上記の通りに添加した。さらに４回の洗浄の後、スライドをＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｌｕｓ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中のＴＳＡ結合体化Ｏｐａｌ５２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１：１５０希釈）で染色した。核対比染色をＳｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１：５００）で達成した。スライドをｄｄＨ２Ｏで１回すすぎ、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｈａｒｄ ｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でカバースリップし、マニキュア液でシールした。
フローサイトメトリー
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞またはＭＯＣ１細胞（２×１０５個）を、１２ウェルプレートへと播種し、２４時間にわたりインキュベートし、次いで、１０μｇ／ｍＬのＣＤ４４−ＩＲ７００を含有する培地に３７℃で６時間にわたり曝露した。細胞を、採取し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。ＣＤ４４−ＩＲ７００の特異的結合を検証するために、細胞を、ＣＤ４４−ＩＲ７００とのインキュベーションの前に、過剰の結合体化されていないＣＤ４４抗体（１００μｇ）と共にインキュベートした。ｉｎ ｖｉｖｏで、腫瘍を、採取し（ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について１０日目、ＭＯＣ１腫瘍について２４日目）、既に記載されている通りに直ぐに消化した（Moore et al., Cancer Immunol Res. 2016; 4:1061-71）。ＦｃγＲ（ＣＤ１６／３２）ブロックの後、単一細胞懸濁液を一次抗体で染色した。懸濁液を、抗マウスＣＤ４５．２クローン１０４、ＣＤ３クローン１４５−２Ｃ１１、ＣＤ８クローン５３−６．７、ＣＤ４クローンＧＫ１．５、ＰＤ−１クローン２９Ｆ．１Ａ１２、ＣＤ１１ｃクローンＮ４１８、Ｆ４／８０クローンＢＭ８、ＣＤ１１ｂクローンＭ１／７０、Ｌｙ−６ＣクローンＨＫ１．４、Ｌｙ−６Ｇクローン１Ａ８、Ｉ−Ａ／Ｉ−ＥクローンＭ５／１１４．１５．２、ＰＤ−Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２、ＣＤ２５クローンＰＣ６１．５．３、ＣＴＬＡ−４クローンＵＣ１０−４Ｂ９、ＣＤ３１クローン３９０、ＰＤＧＦＲクローンＡＰＡ５、およびＣＤ４４クローンＩＭ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含んだ、フルオロフォア結合体化一次抗体で、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ緩衝液中で１時間にわたり染色した。懸濁液を、洗浄し、生存率マーカー（７ＡＡＤまたはｚｏｍｂｉｅ色素；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて、ＢＤ Ｃａｎｔｏにおけるフローサイトメトリーにより解析した。アイソタイプ対照および「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ」法を用いて、染色特異性を検証した。ＦｏｘＰ３＋調節性ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球（Ｔｒｅｇ）を、製造者のプロトコールに従い、マウス調節性Ｔ細胞染色キット＃１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。取得後解析をＦｌｏｗＪｏ ｖＸ１０．０．７ｒ２で実施した。
抗原特異的ＴＩＬ反応性
新鮮な腫瘍の切り刻んだ断片を、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、５％のＦＢＳ、および１００Ｕ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ １６４０系培地中で７２時間にわたりインキュベートして、ＴＩＬを抽出した。無傷のＴＩＬを、負の磁気選別（ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で富化した。抗原提示細胞（ＡＰＣ；５０Ｇｙに照射されたナイーブＷＴ Ｂ５マウスに由来する脾細胞）を、クラスＩ拘束性抗原のｐ１５Ｅ６０４−６１１（Ｈ−２Ｋｂ拘束性ＫＳＰＷＦＴＴＬ）、サバイビン／Ｂｉｒｃ５５７−６４（Ｈ−２Ｋｂ拘束性ＱＣＦＦＣＦＫＥＬ）、Ｔｗｉｓｔ１２５−１３３（Ｈ−２Ｄｂ拘束性ＴＱＳＬＮＥＡＦＡ）、およびＴｒｐ５３２３２−２４０（Ｈ−２Ｄｂ拘束性ＫＹＭＣＮＳＳＣＭ）抗原−パルス化ＡＰＣを含んだ目的のペプチドで１時間にわたりパルス化し、ＴＩＬを、３：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で２４時間共インキュベートした。上清を、製造者の推奨に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）により、ＩＦＮγ産生について解析した。ＴＩＬ単独、ＡＰＣ単独、ならびにオボアルブミン２５７−２６４（Ｈ−２Ｋｂ拘束性ＳＩＩＮＦＥＫＬ）およびＶＳＶ−Ｎ５２−５９（Ｈ−２Ｄｂ拘束性ＲＧＹＶＹＱＧＬ）によるペプチド刺激を対照として用いた。
ＲＴ−ＰＣＲ
全腫瘍溶解物に由来するＲＮＡを、製造者のプロトコールに従い、ＲＮＥａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ｃＤＮＡを、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる高性能ｃＤＮＡ逆転写キットを利用して合成した。Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスを用いて、Ｖｉｉａ７ ｑＰＣＲ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＧＡＰＤＨと比較して、標的遺伝子の相対発現を評価した。特別注文のプライマーを、各腫瘍関連抗原について、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープをコードするヌクレオチド領域に隣接するように設計した。
統計学的解析
別段に示されない限り、データは、５つの実験の最小値に由来する平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実行した。スチューデントのｔ検定を用いて、処置の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏでの対照の処置の効果と比較した。ＭＣ３８−ｌｕｃの再接種腫瘍モデルにおける腫瘍成長を比較するために、マンホイットニー検定を用いた。多重比較のために、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーの検定を用いた。体積（２０００ｍｍ３）に基づく生存の累積確率は、各群において、カプラン−マイヤー生存曲線解析により推定し、結果を、ログランク検定を用いて比較した。＜０．０５のｐ値を、統計学的有意とみなした。
（実施例２）
がん細胞に対するＮＩＲ−ＰＩＴのｉｎ ｖｉｔｒｏの効果
ＭＣ３８−ｌｕｃは、ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するマウス結腸がん細胞系である（Zabala et al., Mol. Cancer 8:2, 2009）。ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ肺癌）細胞およびＭＯＣ１（マウス口腔癌）細胞も用いた。抗ＣＤ４４−ＩＲ７００を、ＷＯ２０１３／００９４７５号（本明細書に参考として援用される）に記載の方法を用いて産生させた。略述すると、抗ＣＤ４４ ｍＡｂ（１．０ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ製のクローンＩＭ７）を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）中のＩＲ７００ ＮＨＳエステル（６５．１μｇ、３３．３ｎｍｏｌ）と共に、室温で１時間にわたりインキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で精製した。平均２つのＩＲ７００分子が各ＣＤ４４抗体に結合するように、ＣＤ４４−ＩＲ７００コンジュゲートの合成を制御した。コンジュゲートは、強い蛍光強度および６９０ｎｍ周辺のピーク吸光度を実証した。
ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞における抗ＣＤ４４−ＩＲ７００の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。抗ＣＤ４４−ＩＲ７００結合を検証するために、抗ＣＤ４４−ＩＲ７００とのインキュベーション後の細胞からの蛍光を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を、１２ウェルプレートへと播種し、２４時間にわたりインキュベートした。培地を、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００を含有する新鮮な培養培地で置きかえ、３７℃で６時間にわたりインキュベートした。結合体化した抗体の特異的結合を検証するために、過剰の抗体（１００ｍｇ）を用いて、１０ｍｇの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００をブロッキングした（図１Ａ）。
抗原特異的な局在化およびＮＩＲ−ＰＩＴの効果を検出するために、蛍光顕微鏡法（ＢＸ６１；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）を実施した。ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞またはＭＯＣ１細胞（１×１０４個）をカバーガラス底皿上に播種し、２４時間にわたりインキュベートした。次いで、抗ＣＤ４４−ＩＲ７００を１０ｍｇ／ｍＬで培養培地に添加し、３７℃で６時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した。５９０〜６５０ｎｍの励起フィルター、６６５〜７４０ｎｍの帯域発光フィルターからなるフィルターを設定して、ＩＲ７００を検出した。また、透過光微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像も収集した。図１Ｂは、対照および抗ＣＤ４４−ＩＲ７００で処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の、微分干渉（ＤＩＣ）を示すデジタル画像および蛍光顕微鏡法画像である。壊死性細胞死は、処置された細胞において、ＮＩＲ光での励起の際に観察された。このシグナルは、過剰の結合体化していないＣＤ４４ ｍＡｂの存在下で完全に反転しており、結合特異性が検証された。ＣＤ４４−ＩＲ７００に曝露された腫瘍細胞のＮＩＲ光曝露は、即時に、３つの細胞系（ＭＣ３８−ｌｕｃ、ＬＬＣおよびＭＯＣ１）全てにおいて、壊死性細胞死を表す細胞の腫脹、ブレブ形成、および小胞の破裂を誘導した。これらの形態変化は、ＮＩＲ曝露の１５分以内に観察された（図１Ｂ）。
生物発光イメージング（ＢＬＩ）のために、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を、１２ウェルプレート（２×１０５個細胞／ウェル）へと播種するか、または１０ｃｍディッシュ（２×１０７個細胞）を１０ｃｍディッシュに播種し、２４時間にわたりプレインキュベートした。培地を１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００を含有する新鮮な培養培地で置きかえた後、細胞を、加湿インキュベーター中、３７℃で６時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、フェノールレッド不含培養培地を添加した。次いで、細胞を、フェノールレッド不含培養培地中、６８５〜６９５ｎｍの波長で発光するＬＥＤまたはＮＩＲレーザー（ＢＷＦ５−６９０−８−６００−０．３７；Ｂ＆Ｗ ＴＥＫ ＩＮＣ．）で曝露した。ｍＷ／ｃｍ２の出力密度は、光出力計（ＰＭ １００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で測定した。図１Ｃは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるＮＩＲ光線量依存性のルシフェラーゼ活性を示す１０ｃｍディッシュの生物発光イメージング（ＢＬＩ）のデジタル画像である。
ルシフェラーゼ活性のために（図１Ｄ）、１５０ｍｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン含有培地（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、ＮＩＲ−ＰＩＴの１時間後にＰＢＳ洗浄細胞に投与し、画像をＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ；Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）で得た。目的の領域（ＲＯＩ）を各ウェル全体に配置し、次いで、ルシフェラーゼ活性（フォトン／分）をＭ３ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を用いて計算した。
抗ＣＤ４４−ＩＲ７００によるＮＩＲ−ＰＩＴの細胞傷害効果を、損なわれた細胞膜を検出することができる、フローサイトメトリーのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）染色により決定した。２０万個のＭＣ３８−ｌｕｃ細胞を、１２ウェルプレートへと播種し、２４時間にわたりインキュベートした。培地を、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００を含有する新鮮な培養培地で置きかえ、３７℃で６時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳを添加し、細胞を、光出力計（ＰＭ １００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で測定される場合に、５０ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、６７０〜７１０ｎｍの波長（Ｌ６９０−６６−６０；Ｍａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏ．）で発光する赤色発光ダイオード（ＬＥＤ）で照射した。細胞を処置の１時間後にこすってはがした。次いで、ＰＩを細胞懸濁液（最終２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、室温で３０分間にわたりインキュベートし、続いてフローサイトメトリーを行った。各値は、５つの実験の平均値±標準誤差を表す。図１Ｅは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いる死細胞カウントで測定された、ＮＩＲと、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４４−ＩＲ７００有りまたは無しとで処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞における細胞死の百分率を示す。
生物発光イメージングは、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞において、光線量依存性の様式で減少したルシフェラーゼ活性を実証した（図１Ｃ、１Ｄ）。ヨウ化プロピジウムの組込み（例えば、膜透過性）に基づいて、ＮＩＲは、ＣＤ４４−ＩＲ７００に曝露されたＭＣ３８−ｌｕｃ細胞（図１Ｅ）、ＬＬＣ細胞（図１Ｆ）およびＭＯＣ１細胞（図１Ｇ）において、光線量依存性の様式で細胞死を誘導した。ＮＩＲまたはＣＤ４４−ＩＲ７００単独は、細胞生存率における有意な変化を誘導しなかった。
これらのデータは、ＮＩＲ−ＰＩＴ標的化ＣＤ４４が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞およびＭＯＣ１細胞における特異的な細胞死を誘導したことを実証する。
（実施例３）
ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍区画内のＣＤ４４発現
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４４の標的発現を検証するために、サイズが一致したＭＯＣ１腫瘍（２４日目）、ＬＬＣ腫瘍（１０日目）、およびＭＣ３８腫瘍（１０日目）を、フローサイトメトリーを介して異なる腫瘍区画内でのＣＤ４４発現について評価した（図２Ａ）。腫瘍および間質細胞に特異的なＣＤ４４発現における有意な不均質性が観察され、ＬＬＣ腫瘍細胞およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍細胞はＭＯＣ１と比較して有意に高いレベルのＣＤ４４を発現していた。免疫細胞サブセットにおけるＣＤ４４の発現は、ＭＯＣ１腫瘍、ＬＬＣ腫瘍およびＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の間でより均質であり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定した場合、細胞毎に、腫瘍および間質細胞においてＣＤ４４発現よりも大きかった。標的抗原発現および血管分布を含んだ複数の因子に依存する、注射の１日後のＣＤ４４−ＩＲ７００の全腫瘍蓄積は、ＬＬＣ腫瘍またはＭＯＣ１腫瘍と比較して、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍において有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図２Ｂ、２Ｃ）。
（実施例４）
腫瘍におけるＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏの効果
抗ＣＤ４４−ＩＲ７００および抗ＰＤ１との組合せ療法の効果を、マウスにおける片側、両側および複数の腫瘍モデルで試験した。図３Ａは、マウスにおける片側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍についての処置スキームを示す（各群において１０〜１３匹のマウス）。マウスに、６百万個の腫瘍細胞を側腹部に片側に注射した（０日目）。確立された腫瘍をおよそ５０ｍｍ３の体積で処置した（直径４〜５ｍｍ；ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について４日目；ＭＯＣ１腫瘍について１８日目）。４日目に、マウスに、１００μｇの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００ ｉ．ｖ．（尾静脈）単独、または２００μｇの抗ＰＤ１ ｉ．ｐ．（互いに１時間以内）（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）からの抗マウスＰＤ−１（ＣＤ２７９）特異的ｍＡｂ（クローンＲＭＰ１−１４））との組合せを投与し、その後、１００μｇの抗ＰＤ１ ｉ．ｐ．を６日目、８日目および１０日目に投与した。ＮＩＲ−ＰＩＴを、５日目（５０Ｊ／ｃｍ２）および６日目（１００Ｊ／ｃｍ２）に実施した。複数の腫瘍を担持したマウスについて、ＮＩＲに曝露されない腫瘍をアルミホイルでＮＩＲ光の曝露から遮蔽した。
腫瘍を、蛍光イメージングおよび生物発光イメージングによりモニタリングした（図３Ａ）。ｉｎ ｖｉｖｏのＩＲ７００蛍光画像を、７００ｎｍの蛍光チャネルによるＰｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得た。ＲＯＩを腫瘍上に配置し、ＩＲ７００シグナルの平均蛍光強度を、Ｐｅａｒｌ Ｃａｍソフトウェア（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて各ＲＯＩについて計算した。ｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩのために、Ｄ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）をｉ．ｐ．注射し、マウスを、ルシフェラーゼ活性についてＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ）において解析した。ＲＯＩを、ＢＬＩを定量するために、腫瘍全体を含むように設定した。ＲＯＩを、バックグラウンド（フォトン／分／ｃｍ２）として、隣接する非腫瘍領域にも配置した。各ＲＯＩの平均ルシフェラーゼ活性を計算した。
腫瘍における抗原特異的な微細分布を検出するために、蛍光顕微鏡法を実施した。腫瘍異種移植片を、処置無しの右側面の異種移植片から切除した（ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬＣ腫瘍について１０日目、ＭＯＣ１腫瘍について２４日目）。抽出された腫瘍を、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物（ＳＡＫＵＲＡ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．）と共に凍結し、凍結切片（１０μｍ厚さ）を調製した。蛍光顕微鏡法を、ＩＲ７００蛍光のために、以下のフィルター：５９０〜６５０ｎｍの励起波長、６６５〜７４０ｎｍロングパスの発光波長を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡を用いて実施した。ＤＩＣ画像も取得した。組織学的変化を評価するために、光学顕微鏡法をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１を用いて実施した。腫瘍異種移植片を、抗ＣＤ４４−ＩＲ７００（ｉ．ｖ．）の注射の２４時間後、およびＮＩＲ−ＰＩＴの２４時間後に、処置無しのマウスから切除した。腫瘍を、右側腫瘍のＮＩＲ−ＰＩＴの２４時間後に、両側腹部の腫瘍（処置された右側腫瘍および処置されていない左側腫瘍）を有するマウスからも切除した。抽出された腫瘍も１０％のホルマリン中に置き、一連の１０ｍｍの薄切片を、スライドガラスに固定してＨ＆Ｅ染色した。
対照またはＰＤ−１ ｍＡｂ単独群と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴは、死滅した細胞からのＩＲ７００の分布におそらく起因して、腫瘍蛍光シグナルのほぼ即時の低減をもたらした（図３Ｂ）。ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂ処置の組合せは、対照または単一処置群と比較して、劇的な生物発光の低減をもたらした（図３Ｃ、図３Ｄにおいて定量した）。処置された腫瘍の組織学的（Ｈ＆Ｅ）解析は、ＮＩＲ−ＰＩＴで処置された腫瘍における広範囲の腫瘍壊死および微小出血を明らかにしたが、ＰＤ−１ ｍＡｂで処置された群は、より高い白血球浸潤を実証した（図３Ｅ）。原発性腫瘍成長は、対照と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴまたはＰＤ−１ ｍＡｂ単独の後に阻害されたが（図３Ｆ）、組合せ処置は、１３匹のうち９匹のマウス（７０％）において確立されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の有意な腫瘍制御および完全な拒絶をもたらした。この応答は、組合せ処置を受けているマウスにおける有意に延長された生存をもたらした（図３Ｇ）。抗体処置または抗ＣＤ４４−ＩＲ７００ ＮＩＲ−ＰＩＴは、対照と比較して生存期間を延長したが、ＮＩＲ−ＰＩＴ群における動物は、４０日目まで生存せず、抗体のみの群（ＮＩＲ−ＰＩＴ無しの抗ＣＤ４４−ＩＲ７００＋抗ＰＤ１）におけるこれらの９％だけが研究の最後まで生存していた（図３Ｇ）。これに対し、組合せ処置群の動物の８０％が研究の最後まで生存していた。皮膚の壊死も全身毒性も、いずれの処置群において観察されなかった。
同様のアプローチは、類似の処置レジメンおよびイメージングプロトコールを用いて、確立された片側ＬＬＣまたはＭＯＣ１腫瘍を担持するマウスにおいて行った（図４Ａ、５Ａ）。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍と同様に、ＬＬＣ腫瘍またはＭＯＣ１腫瘍のＮＩＲ−ＰＩＴによる処置は、オンターゲット効果を示すＩＲ７００蛍光シグナルのほぼ即時の喪失をもたらした（図４Ｂ、５Ｂ）。ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せによるＬＬＣ腫瘍担持マウスの処置は、対照またはいずれかの単独の処置に対して、原発性腫瘍の制御（図４Ｃ）および生存（図４Ｄ）を有意に増強し、確立された腫瘍１２のうち１つ（８％）の拒絶をもたらした。ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂの組合せによるＭＯＣ１腫瘍担持マウスの処置は、確立された腫瘍１３のうち１つ（８％）の拒絶を誘導し、対照と比較して生存の統計的な増強をもたらしたが、組合せ処置後の累積の原発性腫瘍成長は、いずれかの単独の処置に対して、増強されなかった（図５Ｃ、５Ｄ）。
総合すると、これらの結果は、ＭＣ３８−ｌｕｃモデルおよびＬＬＣモデルにおけるＰＤ−１免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）の追加による原発性腫瘍の制御および生存の有意な増強と共に、ＭＣ３８−ｌｕｃ、ＬＬＣおよびＭＯＣ１腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴのＣＤ４４オンターゲット効果を実証する。
（実施例５）
ＰＤ−１ ＩＣＢによるＮＩＲ−ＰＩＴを用いる抗原特異的免疫誘導の増強
処置の終了後、一部のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を、単一細胞懸濁液へと処理し、フローサイトメトリーで免疫細胞の浸潤について評価した。ＮＩＲ−ＰＩＴで処置された腫瘍は、より高いレベルのＰＤ−１を発現するＣＤ８およびＣＤ４腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（図６Ａ）による有意に増強された浸潤を実証した。全身ＰＤ−１ ｍＡｂで処置されたマウスは、同じＡｂクローン（ＲＭＰ１−１４）での染色後、フローサイトメトリーによるこれらの腫瘍に由来するＴＩＬの表面で非常に低レベルのＰＤ−１が検出可能であるため、ＰＤ−１標的飽和であることを実証した。この増強されたＣＤ８およびＣＤ４ ＴＩＬ浸潤を、マルチプレックス免疫蛍光法（ＩＦ）により検証した。対照またはＰＤ−１ ｍＡｂ処置腫瘍では、わずかなＣＤ８＋ＴＩＬが、腫瘍−間質の境界面に沿って入れ子になっていたが、腫瘍に浸潤していなかった（図６Ｂ、左パネル）。ＮＩＲ−ＰＩＴの後、より多くのＣＤ８＋ＴＩＬが腫瘍全体にわたって浸潤したが、多くのＴＩＬは依然として腫瘍−間質の境界面に留まった。腫瘍への浸潤は、ＰＤ−１ ｍＡｂの添加により有意に増強された（図６Ｂ、右パネル）。実験に加えて、ＴＩＬを、ＩＬ−２を介して対照または処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍から抽出し、複数のＨ−２ＫｂまたはＨ−２Ｋｄ拘束性ＴＡＡに対する抗原特異的ＩＦＮγ応答について評価した（図６Ｃ）。対照腫瘍に由来するＴＩＬは、Ｈ−２Ｋｂ拘束性ｐ１５Ｅ６０４−６１１（ＫＳＰＷＦＴＴＬ）に対する測定可能な応答を実証したが、他の抗原に対する応答は欠如した。ＰＤ−１ ｍＡｂ処置は、ベースラインのｐ１５Ｅ６０４−６１１応答を増強したが、他の抗原に対する応答を誘導しなかった。ＮＩＲ−ＰＩＴ処置は、Ｈ−２Ｋｂ拘束性サバイビン／Ｂｉｒｃ５５７−６４（ＱＣＦＦＣＦＫＥＬ）およびＨ−２Ｄｂ拘束性Ｔｒｐ５３２３２−２４０（ＫＹＭＣＮＳＳＣＭ）に対するベースラインで非存在であったデノボ応答を誘導し、ｐ１５Ｅ６０４−６１１に対するベースライン応答を増強した。ＰＤ−１ ｍＡｂによる処置は、これらの誘導されたＮＩＲ−ＰＩＴ応答を増強したか、または抗原特異的応答を増強した。ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＭＨＣクラスＩＩ陽性樹状細胞（ＤＣ）、およびより高いレベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するように極性化したＦ４／８０＋マクロファージの腫瘍浸潤も増強した（図６Ｄ）。免疫抑制好中球ミエロイド（ＰＭＮ−ミエロイド）および調節性ＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）は、組合せ処置により様々に変化した（図６Ｅ）。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍細胞特異的ＰＤ−Ｌ１発現を、検証したが、処置により変化しなかった一方、免疫細胞ＰＤ−Ｌ１の浸潤は、腫瘍細胞発現より有意に高く、組合せ処置により増加した（図６Ｆ）。
類似の免疫相関実験を、ＬＬＣ腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍において行った。ＰＤ−１ ｍＡｂおよびＮＩＲ−ＰＩＴ単独、または組合せにより処置されたＬＬＣ腫瘍は、ＴＩＬ浸潤の増強を実証した（図７Ａ）。抗原特異的ＬＬＣ ＴＩＬは、ｐ１５Ｅ６０４−６１１およびＨ−２Ｄｂ拘束性Ｔｗｉｓｔ１２５−１３３（ＴＱＳＬＮＥＡＦＡ）に対する測定可能なベースライン応答を実証した。ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍に類似して、ＮＩＲ−ＰＩＴ処置は、サバイビン／Ｂｉｒｃ５５７−６４に対する応答を誘導した。ｐ１５ＥではなくＢｉｒｃ５およびＴｗｉｓｔに対する応答は、ＰＤ−１ ｍＡｂ処置により増強された（図７Ｂ）。ＬＬＣ腫瘍のＮＩＲ−ＰＩＴ処置は、マクロファージにおけるＭＨＣクラスＩＩ陽性ＤＣの浸潤およびＭＨＣクラスＩＩ発現を増強した（図７Ｃ）。ＰＭＮ骨髄性細胞およびＴｒｅｇは、処置後に様々に変化し（図７Ｄ）、ＬＬＣ腫瘍および免疫細胞特異的ＰＤ−Ｌ１発現は処置により増強された（図７Ｅ）。
ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍またはＬＬＣ腫瘍とは異なり、ＮＩＲ−ＰＩＴで処置されたＭＯＣ１腫瘍は、わずかな免疫相関の変化を実証した。ＣＤ８およびＣＤ４ ＴＩＬ浸潤は、ＰＤ−１ ｍＡｂにより中程度で増強されたが、ＮＩＲ−ＰＩＴにより増強されなかった（図８Ａ）。ｐ１５Ｅ６０４−６１１に対するベースラインのＴＩＬ抗原特異的応答は、全身ＰＤ−１ ｍＡｂ処置により増強されたが、他の共有腫瘍抗原に対する応答は、ＮＩＲ−ＰＩＴ処置により誘導されなかった（図８Ｂ）。ＭＨＣクラスＩＩ＋ＤＣおよびマクロファージのＭＯＣ１腫瘍浸潤は中程度に増強され、このモデルにおける骨髄性細胞のプライミングおよび活性化の欠如が示された。ＰＭＮ骨髄性細胞もしくはＴｒｅｇ、またはＭＯＣ１腫瘍の浸潤、あるいは免疫細胞特異的ＰＤ−Ｌ１発現における有意な変化は観察されなかった（図８Ｃ、８Ｄ）。
ＭＯＣ１における腫瘍関連抗原に対するＴＩＬ応答の欠如についての可能な説明を調査するために、各抗原の相対発現を、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬＣ細胞およびＭＯＣ１細胞において測定した。ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープのコード領域に隣接するように設計されたプライマーを用いると、ＰＣＲの結果は、ＭＣ３８−ｌｕｃおよびＬＬＣと比べて、ＭＯＣ１においてＢｉｒｃ５、Ｔｗｉｓｔ１およびＴｒｐ５３遺伝子の転写の低発現を示した（図９）。より高い抗原発現は、一般に、ベースラインのＴＩＬ応答と相関した。興味深いことに、ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞におけるより高い相対Ｔｒｐ５３発現、およびＬＬＣ細胞におけるＴｗｉｓｔ１発現は、ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂ処置の組合せ後に、これらの遺伝子に由来するクラスＩ拘束性エピトープに対するＴＩＬ応答の増強と相関した。したがって、処置後の増強されたＴＩＬ応答は、ベースラインの腫瘍抗原発現に依存しうる。
これらの結果は、ＮＩＲ−ＰＩＴが、ＭＣ３８−ｌｕｃおよびＬＬＣ腫瘍担持マウスにおけるＭＨＣクラスＩ拘束性腫瘍抗原に対するデノボのポリクローナル抗原特異的ＴＩＬ応答を誘導することができること、ならびにこれらの応答が、全身ＰＤ−１ ＩＣＢにより増強されうることを示す。
（実施例６）
ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ＩＣＢの組合せは両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるアブスコパル抗腫瘍効果を誘導した
ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍担持マウスにおけるＮＩＲ−ＰＩＴ後の腫瘍抗原特異的免疫の誘導の証拠が得られたので、全身ＰＤ−１ ｍＡｂと組み合わせた局所ＮＩＲ−ＰＩＴが、ＮＩＲ−ＰＩＴで処置されていない別の遠隔腫瘍において抗腫瘍免疫を誘導できるかどうかを決定した。処置およびイメージングレジメン（図１０Ａ）は、上記に記載の通りに両側ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスについて同様であったが、右側腹部腫瘍のみをＮＩＲ−ＰＩＴで処置した（図１０Ｂ）。
ＮＩＲ−ＰＩＴは、処置された腫瘍におけるＩＲ７００蛍光シグナルのほぼ即時の喪失を誘導したが、処置されていない腫瘍におけるＩＲ７００シグナル強度の喪失は、数日間遅延した（図１０Ｃ）。逆に、右側（ＮＩＲ−ＰＩＴで処置）および左側（処置されていない）のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の両方の生物発光は、組合せ処置後に併せて低減した（図１０Ｄ、図１０Ｅにおいて定量した）。右側及び左側の腫瘍の両方の組織学的解析は、同様の壊死のパターン、および微小出血を明らかにし、白血球浸潤を増加させた（図１０Ｆ）。組合せ処置は、１０匹のうちの８匹（８０％）のマウスにおいて、右側および左側の腫瘍の両方の、有意な原発性腫瘍の制御および完全な腫瘍拒絶をもたらし（図１０Ｇ）、処置されていないマウスと比較して生存の増強をもたらした（図１０Ｈ）。
（実施例７）
ＮＩＲ−ＰＩＴで処置されていない遠隔腫瘍における抗原特異的免疫の誘導
右側（ＮＩＲ−ＰＩＴで処置）および左側（処置されていない）の腫瘍の両方からの単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析は、類似レベルの増強されたＣＤ８およびＣＤ４ ＴＩＬ蓄積を明らかにした（図１１Ａ）。抗原特異的反応性の評価は、処置された腫瘍および処置されていない腫瘍の両方に由来するＴＩＬが同じＭＨＣクラスＩ拘束性抗原と反応したことを実証し（図１１Ｂ）、全身抗原特異的免疫の存在を示した。ＴＩＬ応答は、ｐ１５Ｅ６０４−６１１およびサバイビン／Ｂｉｒｃ５５７−６４と大きさが類似していたが、Ｔｒｐ５３２３２−２４０に対する応答は、処置された腫瘍と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴで処置されていない腫瘍において減少した。ＭＨＣクラスＩＩ陽性ＤＣおよびマクロファージの増加（図１１Ｃ）、ＰＭＮ骨髄性細胞の増加、ならびにＴｒｅｇの低減（図１１Ｄ）が、処置された腫瘍で観察されたが、処置されていない腫瘍では観察されず、これらの変化が、ＮＩＲ−ＰＩＴの直接の結果であるが、全身抗腫瘍免疫の結果ではないことが示された。ＭＣ３８−ｌｕｃが浸潤した免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現（図１１Ｅ）は、組合せ処置を受けたマウスにおける右側の処置された腫瘍および左側の処置されていない腫瘍の両方で増強され、免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現がＮＩＲ−ＰＩＴとは独立であり得ることが示された。
したがって、ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ＩＣＢの組合せは、確立された処置されていない腫瘍を消失させることができる全身腫瘍抗原特異的免疫の発生をもたらすことができるが、自然免疫の増強および免疫抑制細胞サブセットにおける変化は、より直接的なＮＩＲ−ＰＩＴの効果を局所的に生じるように見える。
（実施例８）
ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ＩＣＢの組合せは高い疾患負荷を有するマウスにおける複数の遠隔腫瘍を制御する
単一のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の処置が、個々のマウス内の複数の確立された遠隔腫瘍の拒絶をもたらすことを実証するために、以下の方法を用いた。同様の処置（図１２Ａ）を用いて、４つの確立されたＭＣ３８腫瘍の１つにＮＩＲ−ＰＩＴを送達した（図１２Ｂ）。ＮＩＲ−ＰＩＴは、単一の処置された腫瘍におけるＩＲ７００蛍光シグナルのほぼ即時の喪失を誘導したが、３つの処置されていない腫瘍におけるＩＲ７００シグナル強度の消散は、数日間遅延した（図１２Ｃ）。逆に、単一の処置されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍および３つの処置されていないＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の両方の生物発光は、組合せ処置後に併せて低減した（図１２Ｄ、図１２Ｅにおいて定量した）。組織学的解析は、処置されたマウスに由来する全ての腫瘍における壊死および増加した白血球浸潤を明らかにしたが、対照マウスに由来する腫瘍ではそうではなかった（図１２Ｆ）。全身ＰＤ−１ ｍＡｂ、およびＮＩＲ−ＰＩＴによる単一のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の処置は、複数のＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍の劇的な成長制御をもたらした。１５匹のうちの１２匹（８０％）の処置されたマウス（図１２Ｇ）は、４つの腫瘍全てを完全に拒絶し、対照と比較して生存の増強をもたらした（図１２Ｈ）。
したがって、局所のＮＩＲ−ＰＩＴによる腫瘍の単一病巣の処置と全身ＰＤ−１ ＩＣＢは、ＮＩＲ−ＰＩＴで処置されていない遠隔疾患の複数の部位を消失させることができる全身免疫を誘導するのに十分である。
（実施例９）
ＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ＩＣＢの組合せ後に腫瘍を拒絶したマウスは免疫記憶を生じた
免疫記憶の存在について評価するために、マウスを、上記に記載の通りにＮＩＲ−ＰＩＴおよびＰＤ−１ ｍＡｂで処置した（図１３Ａ）。組合せ処置に対する完全応答を実証したマウスを、３０日後に、反対側の側腹部にＭＣ３８−ｌｕｃ細胞の注射による負荷を与えた（図１３Ａ）。対照マウスは、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍がすぐに生着したが、確立されたＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍を以前に拒絶したマウスは、生着に抵抗し、腫瘍が成長せず（図１３Ｃ、図１３Ｄにおいて生存）、免疫記憶の存在を実証した。
図１８に表した通り、上記の実施例の結果は、ＮＩＲ−ＰＩＴがＣＤ４４特異的腫瘍細胞死を誘導し、複数の腫瘍抗原の放出をもたらしたことを実証する。ＮＩＲ−ＰＩＴは、炎症誘発性の腫瘍微小環境も促進し、複数の抗原のクロスプライミングおよびポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞応答の発生をもたらす。このエフェクター応答は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現、および適応免疫抵抗性により制限され、ＰＤ−１ ＩＣＢの添加はこの制限を有効に反転させる。
（実施例１０）
材料および方法
この実施例では、実施例１１〜１４に記載の結果を得るために用いる材料および方法について提供する。
細胞培養
ＣＤ４４およびルシフェラーゼを発現するＭＣ３８−ｌｕｃ細胞、ＬＬ／２細胞、ならびにＣＤ４４抗原を安定的に発現するＭＯＣ１細胞を、加湿インキュベーターにおいて、組織培養フラスコ中の１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、９５％空気および５％二酸化炭素の雰囲気下、３７℃で培養した。
試薬
水溶性、ケイ素−フタロシアニン誘導体であるＩＲＤｙｅ７００ＤＸ ＮＨＳエステルは、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）から得た。抗マウス／ヒトＣＤ４４ ｍＡｂ（ＩＭ７）および抗マウスＣＤ２５ ｍＡｂ（ＰＣ−６１．５．３）は、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌから得た。他の全ての化学物質は、試薬グレードであった。
ＩＲ７００と結合体化した抗ＣＤ２５ ｍＡｂおよび抗ＣＤ４４ ｍＡｂの合成
抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（１ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ／Ｌ）および抗ＣＤ４４ ｍＡｂ（１ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ／Ｌ）を、それぞれ、ＩＲ７００（６５．１μｇ、３３．３ｎｍｏｌ、ＤＭＳＯ中１０ｍｍｏｌ／Ｌ）および０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）と共に室温で１時間にわたりインキュベートした。混合物は、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム、ＰＤ−１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で精製した。タンパク質濃度は、分光法（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）による５９５ｎｍでの吸収の測定により、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で決定した。本明細書では、ＩＲ７００と結合体化した抗ＣＤ２５ ｍＡｂおよび抗ＣＤ４４ ｍＡｂは、それぞれ、抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００および抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００と略する。
動物モデル
６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（系統＃０００６６４）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスの身体の下部を、照射および画像解析のために剪毛した。およそ１５０ｍｍ３の体積に達した腫瘍を有するマウスを実験のために用いた。腫瘍体積は、ノギス測定に基づいて、以下の式を用いて最も長い縦径（長さ）および最も長い横径（幅）から計算した；腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５。マウスを各日にモニタリングし、腫瘍体積を、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬ／２腫瘍について週に３回、ＭＯＣ１腫瘍について週に２回、腫瘍体積が２，０００ｍｍ３に達するまで測定し、それから、マウスを二酸化炭素ガスの吸入で安楽死させた。
ｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージング（ＢＬＩ）およびＩＲ７００蛍光イメージング
ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍担持マウスにおける生物発光画像を得るために、Ｄ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ、１５０μＬ）をマウスに腹腔内注射した。ルシフェラーゼ活性を、相対光単位（ＲＬＵ）を用いて、ＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ；Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で解析した。目的の領域（ＲＯＩ）を腫瘍全体にわたって配置した。ＲＬＵの１分当たりのカウントをＭ３ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を用いて計算し、ＮＩＲ−ＰＩＴの前のＲＬＵに基づく百分率（％ＲＬＵ）に変換した。ＢＬＩを、０日目〜７日目に、ＮＩＲ−ＰＩＴの前および後に実施した。ｉｎ ｖｉｖｏのＩＲ７００蛍光画像を、７００ｎｍの蛍光チャネルによるＰｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得た。
ｉｎ ｖｉｖｏの蛍光イメージング研究
ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞（８百万個）、ＬＬ／２細胞（８百万個）およびＭＯＣ１細胞（４百万個）を、マウスの背に皮下注射した。腫瘍を有するマウスを、腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達した後、研究した。一連のＩＲ７００の背部の蛍光画像を、尾静脈を介して１００μｇの抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の静脈内注射の１時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後に、７００ｎｍの蛍光チャネルを用いて、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒで得た。目的の領域（ＲＯＩ）を、腫瘍、およびバックグラウンドとして隣接する非腫瘍領域に配置した。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を各ＲＯＩについて計算した。標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）を、以下の式により、腫瘍の蛍光強度およびバックグラウンドの蛍光強度から計算した；（腫瘍の蛍光強度）−（バックグラウンドの蛍光強度）／（バックグラウンドの蛍光強度）。
ＮＩＲ−ＰＩＴ
ＭＣ３８−ｌｕｃ細胞（８百万個）、ＬＬ／２細胞（８百万個）およびＭＯＣ１細胞（４百万個）を、マウスの背に皮下注射した。およそ１５０ｍｍ３の体積に達した腫瘍を有するマウスを、選択し、以下の処置のために４つの実験群に無作為に分割した：（１）処置なし（対照）；（２）０日目に、１００μｇの抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００、続いて１００Ｊ／ｃｍ２で外部ＮＩＲ光照射（ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ）；（３）０日目に、１００μｇの抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００、続いて１００Ｊ／ｃｍ２で外部ＮＩＲ光照射（ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ）；ならびに（４）１００μｇの抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００、および１００μｇの抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００の静脈内注射（組み合されたＮＩＲ−ＰＩＴ）。
ＮＩＲ−ＰＩＴ処置群におけるＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍、ＬＬ／２腫瘍およびＭＯＣ１腫瘍を有するマウスについて、ＡＰＣの静脈内注射を、腫瘍接種の５日後、５日後および２８日後にそれぞれ実施し、続いて、ＡＰＣ注射の１日後に１００Ｊ／ｃｍ２で外部ＮＩＲ光照射を実施した。ＮＩＲ光を、光出力計（ＰＭ １００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で測定される場合に、５０ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、６７０〜７１０ｎｍの波長（Ｌ６９０−６６−６０；Ｍａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏ．）の範囲で発光する赤色発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いて、腫瘍担持マウスにおける標的化腫瘍の上部から照射した。ＩＲ７００はおよそ６９０ｎｍで光を吸収する。ＩＲ７００蛍光画像を、療法の前および後に得た。
統計学的解析
定量的データを平均値±標準誤差として表した。多重比較（≧３群）のために、一元分散分析、続いてテューキー−クレーマー検定を用いた。生存の累積確率を、カプラン−マイヤー生存曲線解析により解析し、結果を、ログランク検定を用いて比較した。統計学的解析を、ＪＭＰ １３ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）で実施した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。
（実施例１１）
抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００の投与後のｉｎ ｖｉｖｏの蛍光イメージング
高い蛍光ＭＦＩが、抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００（ＡＰＣ）注射の１時間後に、ＭＣ３８−ｌｕｃ、ＬＬ／２およびＭＯＣ１において観察され、全ての細胞型における蛍光は、注射後２４時間まで徐々に増加した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ＡＰＣ注射の４８時間後の蛍光は、２４時間での蛍光と比較して、低下していた。全ての細胞型における抗ＣＤ２５−ｍＡｂ−ＩＲ７００のＴＢＲも、２４時間まで徐々に増加し、続いて、ＡＰＣの注射の４８時間後にＴＢＲは低下した（図１４Ｃ）。最も高いＭＦＩおよびＴＢＲは、ＡＰＣ注射の２４時間後に観察され、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍およびＬＬ／２腫瘍は、ＭＯＣ１腫瘍よりも高いＭＦＩおよびＴＢＲの値を示した（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。
これらのデータは、下記の実施例におけるＣＤ２５および／またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴの両方について、ＡＰＣ注射の１日後の治療的ＮＩＲ光の曝露の送達についての論拠を実証する。
（実施例１２）
ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍に対する組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴの有効性
ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は腫瘍内で頻繁に見出される。いくつかの種類のがんでは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞に対する比の減少は、予後不良に関連しうる。ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴを用いて、他の器官中の局所エフェクター細胞またはＴｒｅｇ細胞を消失させることなく、腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させ、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の免疫抑制細胞を除去し、その後腫瘍を死滅させて腫瘍指向性ＮＩＲ−ＰＩＴ（ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴにより達成）を増強することにより、許容ＴＭＥの反転をもたらした。
ＮＩＲ−ＰＩＴレジメンおよびイメージングプロトコールを図１５Ａに表す。抗ＣＤ２５および／または抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００の注射の１日後に、腫瘍を、ＬＥＤ光を介して１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光に曝露した。ＩＲ７００腫瘍蛍光シグナルは、全ての場合において、死滅しつつある細胞に由来するフルオロフォアの分散および部分的な光の退色に起因して低下した（図１５Ｂ）。
ＮＩＲ−ＰＩＴ後の腫瘍殺滅の有効性を調査するために、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を、ＮＩＲ−ＰＩＴの前および後、７日目まで、実施した（図１５Ｃ）。ＢＬＩを、処置前のＲＬＵに基づいて、ＲＬＵの百分率として定量的に評価した（ＲＬＵ後／ＲＬＵ前×１００＝％ＲＬＵ）。ＢＬＩは、ＮＩＲ−ＰＩＴ後に腫瘍細胞を評価するための高感度のツールであり、その強度は、酸素、Ｍｇ２＋およびＡＴＰによって媒介されるルシフェラーゼによるルシフェリンの触媒に依存する。
ＮＩＲ−ＰＩＴ処置群のほとんどのマウスにおいて、相対光単位％（％ＲＬＵ）は、ＮＩＲ−ＰＩＴ後すぐに大きく低下し、次いで、徐々に増加した（図１５Ｃ）。％ＲＬＵ変化のこのパターンは、大量の最初の細胞殺滅、続くもともと死滅させられていない細胞のゆっくりとした再成長に起因する可能性がある。これに対し、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴを受けていない一部のマウス、および組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群では、ルシフェラーゼ活性は、ＮＩＲ−ＰＩＴ後すぐに大きく低下し、その後、消滅した（図１５Ｃ）。％ＲＬＵ変化のこのパターンは、大量の最初の細胞殺滅、続く免疫応答の増強に起因する処置された腫瘍の完全寛解に起因する可能性がある。
全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における処置後％ＲＬＵは、対照群におけるよりも、ＮＩＲ−ＰＩＴ後の全ての時点で有意に低かった（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１５Ｄ）。加えて、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴの７日後に、有意に低い％ＲＬＵを示した（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１５Ｄ）。これらのデータは、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴが、いずれかのＡＰＣ単独と比較して、優れたｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍殺滅効果を誘導することができることを示す。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍体積は、対照群の腫瘍体積と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴの５、７および１０日後に、有意に阻害されたが（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１５Ｅ）、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴの７および１０日後に、有意に高い腫瘍減少を示した（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１５Ｅ）。有意な腫瘍阻害は、他の群では観察されなかった。
これらのデータは、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴが、他のＮＩＲ光曝露群と比較して、最も遅い速度の腫瘍の再成長をもたらしたことを示す。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独（ｐ＜０．０５、ログランク検定）、およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独（ｐ＜０．０１、ログランク検定）と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴ後に有意に延長された生存にも関連した（図１５Ｆ）。また、組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群における１４匹のうちの８匹のマウスは、ＮＩＲ−ＰＩＴの単一ラウンド後に、完全寛解を達成した。
これらの結果は、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴが、ＭＣ３８−ｌｕｃ腫瘍について、他の２種類のＮＩＲ−ＰＩＴと比較して、優れたｉｎ ｖｉｖｏの治療応答を可能にすることを示す。
（実施例１３）
ＬＬ／２腫瘍に対するＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴとの組合せの有効性
ＮＩＲ−ＰＩＴレジメンおよびイメージングプロトコールを図１６Ａに表す。抗ＣＤ２５および／または抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００の注射の１日後に、腫瘍を、１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光に曝露した。ＩＲ７００腫瘍蛍光シグナルは、死滅しつつある細胞に由来するフルオロフォアの分散および部分的な光の退色に起因して低下した（図１６Ｂ）。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍体積は、対照群の腫瘍体積と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴの５、７、１０および１２日後に有意に阻害された（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１６Ｃ）。３つのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群の中で、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＮＩＲ−ＰＩＴの１７日後のＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して、有意な高い腫瘍減少を示した（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１６Ｃ）。長期間の追跡では、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独、またはＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴ後に有意に生存が延長された（ｐ＜０．０５、ログランク検定）（図１６Ｄ）。組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群における９匹のうちの３匹のマウスは、ＮＩＲ−ＰＩＴの単一ラウンドのみの後に、腫瘍の完全寛解を達成した。
したがって、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＬＬ／２腫瘍において、他の２種類のＮＩＲ−ＰＩＴよりも治療的に優れていた。
（実施例１４）
ＭＯＣ１腫瘍に対する組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴの有効性
ＮＩＲ−ＰＩＴレジメンおよびイメージングプロトコールを図１７Ａに表す。抗ＣＤ２５および／または抗ＣＤ４４−ｍＡｂ−ＩＲ７００の注射の１日後に、腫瘍を、１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光に曝露した。ＩＲ７００腫瘍蛍光シグナルは、死滅しつつある細胞に由来するフルオロフォアの分散および部分的な光の退色に起因して低下した（図１７Ｂ）。全てのＮＩＲ−ＰＩＴ処置群における腫瘍体積は、対照群と比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴ後の全ての時点で有意に阻害された（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１７Ｃ）。組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴと比較して、ＮＩＲ−ＰＩＴの２８日後に有意に高い腫瘍減少を示した（ｐ＜０．０５、テューキー−クレーマー検定）。
長期間の追跡では、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴと比較して、有意に延長された生存を示した（ｐ＜０．０５、ログランク検定）（図１７Ｄ）。他方、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独の間、ならびにＣＤ２５標的化ＮＩＲ−ＰＩＴ単独および組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴの間で、腫瘍体積および生存における有意差はなかった（ｐ＞０．０５、テューキー−クレーマー検定）（図１７Ｄ）。組み合わされたＮＩＲ−ＰＩＴ群における９匹のうちの１匹のマウスは、ＮＩＲ−ＰＩＴの単一ラウンド後に、完全寛解を達成した。したがって、組み合わされたＣＤ２５およびＣＤ４４標的化ＮＩＲ−ＰＩＴは、ＭＯＣ１腫瘍において、他の２種類のＮＩＲ−ＰＩＴよりも治療的に優れていた。
（実施例１５）
腫瘍を処置する方法
一例では、抗体−ＩＲ７００分子（抗ＣＤ４４−ＩＲ７００など）および免疫調節薬（抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＣＤ２５−ＩＲ７００など）を、腫瘍を有する被験体、例えば、がんを有する被験体へと投与する（１日目）。次いで、被験体に、約２４時間後に５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光で照射し（２日目）、必要に応じて最初の照射の２４時間後に１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光で照射する（３日目）。免疫調節薬も、同じまたは異なる（例えば、より低い）用量で、３日目、５日目および７日目に被験体へと投与する。
被験体を、腫瘍サイズの減少（腫瘍の重量または体積など）、転移のサイズもしくは数の減少、および／または生存（全生存、無増悪生存および／または無病生存）について定期的にモニタリングする。
本開示の原則が適用されうる多くの可能な実施形態を考慮して、例示される実施形態は、本開示の例に過ぎず、本発明の範囲に対する限定と考えるべきではないことを認識されたい。そうではなくて、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神の内に収まる全てを、本発明者らによる発明として主張する。

Claims (32)

  1. がんを有する被験体を処置するための方法であって、
    治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合するステップと；
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で、前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体におけるがん細胞に照射するステップと；
    治療有効量の１または複数の免疫調節薬を前記被験体へと投与するステップと
    を含み、
    前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および前記１または複数の免疫調節薬が、逐次的または併せて投与され、前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が、前記照射するステップの前に投与され、
    これにより、がんを有する前記被験体を処置する、方法。
  2. 前記がん細胞が、乳房、肝臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、脳、子宮頸部、腎臓、骨、皮膚、頭頸部、肺、または血液のがん細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記腫瘍特異的タンパク質が、ＣＤ４４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、メソテリン、ＣＥＡ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記被験体および／または前記がん細胞に、６８０ｎｍの波長で照射する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記がん細胞が被験体の血液に存在し、前記がん細胞に照射するステップが、前記被験体により装着されたデバイスを用いることにより前記血液に照射するステップを含み、前記デバイスが近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合する前記腫瘍特異的タンパク質を発現するがんを有する被験体を選択するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記がんの体積またはサイズを、処置の非存在と比べて少なくとも２５％減少させる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記被験体の生存期間を、処置の非存在と比べて延長する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記被験体の無増悪生存期間および／または無病生存期間を、処置の非存在と比べて延長する、請求項８に記載の方法。
  10. ６６０〜７４０ｎｍの波長で照射されていないがんの重量、体積もしくはサイズおよび／または転移を、少なくとも２５％減少させる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  11. 前記１または複数の免疫調節薬が、免疫系活性化剤、および／または免疫抑制細胞の阻害剤である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記免疫抑制細胞の阻害剤が、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の活性を低減する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記免疫抑制細胞の阻害剤が、ダクリズマブ、デニロイキンジフィトクス、シクロホスファミド、ソラフェニブ、イマチニブ、抗ＰＬ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、またはその２つもしくはそれよりも多くの組合せである、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
  14. 前記抗ＰＬ−１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、またはセミプリマブである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはＢＭＳ−９３６５５９である、請求項１３に記載の方法。
  16. Ｔｒｅｇ細胞の活性の前記低減が、Ｔｒｅｇ細胞を死滅させるステップを含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. Ｔｒｅｇ細胞を死滅させるステップが、
    治療量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップであって、前記抗体が、前記抑制細胞表面タンパク質に特異的に結合し、
    前記抗体が機能性Ｆｃ領域を含まず；および／または
    前記抑制細胞表面タンパク質が、表面抗原分類４（ＣＤ４）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＣＲ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０、葉酸受容体４（ＦＲ４）、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ１２２、ＣＤ２３、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、ＣＤ１４、インターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ−４Ｒａ）、インターロイキン−１受容体アルファ（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−１デコイ受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤ１０３、ＣＸＣＲ２、ＣＤ３３、およびＣＤ６６ｂのうちの１または複数であるステップ；ならびに／または
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも４Ｊ／ｃｍ２の線量で、前記抑制細胞に照射し、これにより、前記抑制細胞を死滅させるステップ
    を含む、
    請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗体が、ＣＤ２５に特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。
  19. ＣＤ２５に特異的に結合する前記抗体が、ダクリズマブまたはバシリキシマブである、請求項１８に記載の方法。
  20. ＣＤ２５に特異的に結合する前記抗体が、機能性Ｆｃ領域を含まない、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
  21. 前記免疫系活性化剤が、１または複数のインターロイキンを含む、請求項１１に記載の方法。
  22. 前記１または複数のインターロイキンが、インターロイキン−２、インターロイキン−１５、またはこれらの両方である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体におけるがん細胞に照射するステップが、前記がん細胞表面タンパク質に特異的に結合する前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与した、約０〜４８時間後、例えば、約２４時間後に、前記被験体に照射するステップおよび／または前記がん細胞に照射するステップを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体におけるがん細胞に照射するステップが、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で、２回またはそれよりも多くの回数の線量の照射を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記２回またはそれよりも多くの回数の線量の照射が、互いに、約１２〜３６時間以内、例えば、約２４時間以内に投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記被験体が、２もしくはそれよりも多くの用量の前記１または複数の免疫調節薬を投与される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記２もしくはそれよりも多くの用量の前記免疫調節薬が、約２４〜４８時間離される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記照射するステップの約０〜４８時間後に、蛍光寿命イメージングで前記がん細胞を検出するステップをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. がんを有する被験体を処置するための方法であって、
    治療有効量の抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップと；
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で、前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体におけるがん細胞に照射するステップと；
    治療有効量の抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはこれらの両方を前記被験体へと投与するステップと
    を含み、
    前記抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子、および前記抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはこれらの両方が、逐次的にまたは併せて投与され、前記抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子が、前記照射するステップの前に投与され、
    これにより、がんを有する前記被験体を処置する、方法。
  30. がんを有する被験体を処置するための方法であって、
    治療有効量の抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップと；
    治療有効量の抗ＣＤ２５−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップと；
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で、前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体におけるがん細胞に照射するステップと
    を含み、
    前記抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子および前記抗ＣＤ２５−ＩＲ７００分子が、逐次的にまたは併せて投与され、前記抗ＣＤ４４−ＩＲ７００分子および前記ＣＤ２５−ＩＲ７００分子が、前記照射するステップの前に投与され、
    これにより、がんを有する前記被験体を処置する、方法。
  31. メモリーＴ細胞を産生させる方法であって、
    治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を被験体へと投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合するステップと；
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で、前記被験体に照射するステップおよび／または前記被験体における細胞に照射するステップと；
    治療有効量の１または複数の免疫調節薬を前記被験体へと投与するステップと
    を含み、
    前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および前記１または複数の免疫調節薬が、逐次的にまたは併せて投与され、前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が、前記照射するステップの前に投与され、
    これにより、メモリーＴ細胞を産生させる、方法。
  32. 被験体の血液中のがん細胞を死滅させる方法であって、
    治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を前記被験体へと投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合するステップと；
    ６６０〜７４０ｎｍの波長で、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２の線量のＮＩＲ ＬＥＤで前記がん細胞に照射するステップであって、前記ＮＩＲ ＬＥＤが、前記被験体により装着された装着用デバイスに存在するステップと；
    有効量の１または複数の免疫調節薬を前記被験体へと投与するステップと
    を含み、
    前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および前記１または複数の免疫調節薬が、逐次的にまたは併せて投与され、前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が、前記照射するステップの前に投与され、
    これにより、前記がん細胞を死滅させる、方法。
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