JP2014523907A - 光増感抗体−蛍光団コンジュゲート - Google Patents

光増感抗体−蛍光団コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞を死滅させる組成物および方法に関する。特定の例では、方法が、細胞表面タンパク質を有する細胞を、治療有効量の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、該抗体が、腫瘍細胞の表面の腫瘍特異的抗原などの、細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップを含む。その後、細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長の、少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量などで照射する。また、細胞を、例えば、細胞に照射した約０〜８時間後に、１または複数の治療剤（抗がん剤など）と接触させ、これにより、細胞を死滅させる。また、蛍光寿命イメージングを用いて、細胞致死をリアルタイムでイメージングする方法も提供される。また、衣料品、装身具、または被覆品；および開示される方法と共に用いられうる品目へと組み込まれたＮＩＲ ＬＥＤを含む装着用デバイスも提供される。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１１年７月１１日に出願された米国出願第１３／１８０，１１１号の一部継続出願であり、米国出願第１３／１８０，１１１号は、２０１０年７月９日に出願された米国仮出願第６１／３６３，０７９号に対する優先権を主張する。いずれの出願も、本明細書に参考として援用される。
開示の分野
本出願は、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートと、赤外（ＮＩＲ）光による照射後に、抗体に特異的に結合する細胞を死滅させるためのそれらの使用法とに関する。ＮＩＲ発光ダイオード（ＬＥＤ）を組み込むデバイスであって、開示されるコンジュゲートおよび方法と共にも用いられうるデバイスも提供される。
背景
がんは、２００７年における全てのヒト死亡者のうちの約１３％を占めた。がんには複数の療法が存在するが、腫瘍細胞を有効に死滅させる一方で、非がん性細胞は傷つけない療法が依然として必要とされている。
手術、放射線療法、および化学療法を含めた従来のがん療法の副作用を最小化するために、分子標的化がん療法が開発されている。既存の標的化療法の中では、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）療法の歴史が最も長く、現在のところ、２５を超える治療用ＭＡｂが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている（非特許文献１（Waldmann、Nat Med、９巻：２６９〜２７７頁、２００３年）；非特許文献２（Reichertら、Nat Biotechnol、２３巻：１０７３〜１０７８頁、２００５年））。有効なＭＡｂ療法は従来、３つの機構：抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、および受容体の遮断に依存しており、複数の高用量のＭＡｂを必要とする。ＭＡｂはまた、より低い用量で、放射性核種などの治療剤を送達するためのベクター（非特許文献３（Goldenbergら、J Clin Oncol ２４巻、８２３〜８３４頁、２００６年））として、または化学的毒素もしくは生物学的毒素（非特許文献４（Pastanら、Nat Rev Cancer、６巻：５５９〜５６５頁、２００６年））としても用いられている。しかし、最終的に、用量制限毒性は、抗体コンジュゲートの生体分布および異化と関係している。
近赤外（ＮＩＲ）域の励起光自体は無害であるが、現行の非標的化光増感剤はまた、正常組織にも取り込まれ、したがって、重大な副作用を引き起こすため、光増感剤を非イオン化光の物理的エネルギーと組み合わせて細胞を死滅させる従来の光力学療法（ＰＤＴ）は、一般には、がん療法に使用されることが少ない（図９）。
Waldmann、Nat Med、９巻：２６９〜２７７頁、２００３年 Reichertら、Nat Biotechnol、２３巻：１０７３〜１０７８頁、２００５年 Goldenbergら、J Clin Oncol ２４巻、８２３〜８３４頁、２００６年 Pastanら、Nat Rev Cancer、６巻：５５９〜５６５頁、２００６年
開示の概要
本明細書では、抗体−ＩＲ７００分子と、腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させるためのそれらの使用法とが提供される。特定の例では、方法が、正常細胞などの非標的細胞を相当数死滅させるわけではなく（死滅させるのは、正常細胞のうちの１％未満であるなど）、かなりの数の標的細胞を死滅させる点で特異的である。特定の例では、方法が、細胞表面タンパク質を有する細胞を、治療有効量の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、抗体（または他の特異的結合剤）が、細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップを含む。抗体−ＩＲ７００分子の特定の非限定的な例には、パニツムマブ−ＩＲ７００、トラスツズマブ−ＩＲ７００、およびＨｕＪ５９１−ＩＲ７００が挙げられる。細胞には、６６０〜７１０ｎｍ（例えば、６８０ｎｍ）など、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１Ｊｃｍ−２（少なくとも５０Ｊｃｍ−２など）の線量で照射する。方法はまた、例えば、細胞に照射した後約８時間以内に、細胞を、１または複数の治療剤（抗がん剤など）と接触させ、これにより、細胞を死滅させるステップも含む。このような方法は、例えば、細胞に照射した約０〜４８時間後に蛍光寿命（ＦＬＴ）イメージングで細胞を検出し、これにより、細胞致死（ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）のリアルタイムでの検出を可能とするステップをさらに含みうる。
また、細胞致死をリアルタイムで検出する方法も提供される。このような方法は、上記の通りに、細胞表面タンパク質を含む細胞を、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップと、細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも３０Ｊｃｍ−２（ＩＲ７００ ＦＬＴを少なくとも２５％短縮するのに十分な線量、例えば、３０〜５０Ｊｃｍ−２など）の線量で照射するステップと、約０〜４８時間（細胞に照射した少なくとも６時間後など）に蛍光寿命イメージングで細胞を検出し、これにより、細胞致死をリアルタイムで検出するステップとを含みうる。
開示される抗体−ＩＲ７００分子および方法により、例えば、標的細胞表面の１または複数のタンパク質（受容体など）に結合する１または複数の抗体を用いることにより、任意の標的細胞を死滅させる（そして、一部の例では、リアルタイムで検出する）ことができるが、ここで、標的細胞表面の（１または複数の）タンパク質は、非標的細胞（正常な健常細胞など）に著しくは見出されず、したがって、抗体は、非標的細胞に著しくは結合しない。一例では、細胞表面タンパク質が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、またはＰＳＭＡなどの腫瘍特異的タンパク質である。
一部の例では、死滅させる細胞が、被験体に存在する。このような例では、方法が、治療有効量の抗体−ＩＲ７００分子を、被験体へと投与するステップと、被験体に照射するステップ、例えば、被験体における腫瘍に照射するステップとを含みうる。一部の例では、方法が、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる細胞表面タンパク質を発現する腫瘍を有する被験体を選択するステップをさらに含みうる。
また、患者により装着されうるデバイスなどのデバイスも提供される。このようなデバイスには、衣料品、装身具、または被覆品、および衣料品、装身具、または被覆品へと組み込まれる近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオード（ＬＥＤ）が挙げられうる。このようなデバイスは、電源および／または冷却源をさらに含みうる。これは、患者がデバイスを、長期間にわたり装着する（またはデバイスにより被覆される）ことを可能とし、したがって、血液または循環系に存在する腫瘍細胞の処置を可能とする。また、デバイスを用いる方法も提供される。
本開示の上記の特色および他の特色は、複数の実施形態についての以下の詳細な記載であって、付属の図面に言及しながら進む記載からいっそう明らかとなる。
図１ａは、細胞の、トラスツズマブ−ＩＲ７００コンジュゲート（Ｔｒａ−ＩＲ７００）による、４℃で１時間にわたる標識化または３７℃で６時間にわたる標識化を示すデジタル画像である。また、光画像も示される。スケールバー、３０μｍ。図１ｂは、インキュベーションの６時間後における、Ｔｒａ−ＩＲ７００のリソソームへの局在化を示すデジタル画像である。スケールバー、５０μｍ。図１ｃは、Ｔｒａ−ＩＲ７００との、３７℃で６時間にわたるインキュベーションに続き、光免疫療法（ＰＩＴ）を行う前およびそれを行った後を示すデジタル画像である。スケールバー、５０μｍ。図１ｄは、Ｔｒａ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴに応答した、照射線量依存的および標的特異的な細胞死を示す棒グラフである。データは、平均値±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）（ｎ＝少なくとも４、＊＊＊スチューデントのｔ検定により、非処理対照と対比してＰ＜０．００１）である。図１ｅは、Ｔｒａ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴに応答した、長期にわたる成長阻害を示す棒グラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３、＊＊スチューデントのｔ検定により、非処理対照と対比してＰ＜０．０１）である。図１ｆは、ＴｒａＩＲ７００媒介ＰＩＴに応答した成長阻害についての顕微鏡検査による観察結果を示すデジタル画像である。スケールバー、１００μｍ。図１ｇは、Ｔｒａ−ＩＲ７００の内部移行が、光毒性による細胞死に必要とされなかったことを示す棒グラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。図１ｈは、標的特異的なＴｒａ−ＩＲ７００の膜結合だけが、光毒性による細胞死を誘導したことを示す棒グラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。図１ｉは、ＨＥＲ２発現が負であるＡ４３１細胞が、Ｔｒａ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴによる光毒性効果を示さなかったことを示すグラフである（ｎ＝３）。図１ｊは、Ｔｒａ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴにより誘導される光毒性による細胞死に対する、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）濃度依存的な阻害を示す棒グラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３、スチューデントのｔ検定により、２．０Ｊｃｍ−２での、ＮａＮ３を伴わないＰＩＴ処理である対照と対比して、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１）である。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト法。ＰａｎＩＲ：Ｐａｎ−ＩＲ７００。 図２ａは、Ｔｒａ−ＩＲ７００（ＴｒａＩＲ）で処理されて光に曝露されたＢａｌｂ／３Ｔ３（ＨＥＲ２陰性）細胞では、長期にわたる成長阻害が観察されなかったことを示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。図２ｂは、遊離ＩＲ７００色素が、３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞へと取り込まれなかったことを示すデジタル画像である。蛍光画像は、細胞を洗浄せずに取得した。細胞は、遊離ＩＲ７００色素を含有する培地より暗色であった。スケールバー、５０μｍ。図２ｃは、ＴｒａＩＲ７００媒介光毒性が、過剰な非結合体化トラスツズマブ（Ｔｒａ）により用量依存的に阻止されたことを示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。図２ｄは、Ｔｒａ−ＩＲ７００の３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞に対する結合が、非結合体化トラスツズマブにより、用量依存的な様式で阻止されたことを示すグラフである（ｎ＝３）。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト法。 図３ａは、標的特異的な光免疫療法（ＰＩＴ）の誘導が、ＨＥＲ２発現細胞特異的な壊死性細胞死をもたらすことを示すデジタル画像である。スケールバー、５０μｍ。図３ｂは、ＨＥＲ２特異的細胞死が、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｇｒｅｅｎ染色を用いる蛍光顕微鏡検査により確認されたことを示すデジタル画像である。スケールバー、１００μｍ。図３ｃは、Ｔｒａ−ＩＲ７００（ＴｒａＩＲ）媒介ＰＩＴにより誘導されるＨＥＲ２特異的細胞死を検出するためのフローサイトメトリー解析を示すプロットである。左上の四分図：ＴｒａＩＲ７００陽性、生細胞；右上の四分図：Ｔｒａ−ＩＲ７００陽性、死細胞；左下の四分図：Ｔｒａ−ＩＲ７００陰性、生細胞；右下の四分図：Ｔｒａ−ＩＲ７００陰性、死細胞（ｎ＝３）。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト法。 図４ａは、Ｔｒａ−ＩＲ７００の生体分布を示すデジタル画像である。３Ｔ３／ＨＥＲ２腫瘍（背部の両側）を、早ければＴｒａ−ＩＲ７００注射（３００μｇ）の１日後に、ＩＲ７００蛍光により視覚化した。１日目に、腫瘍の右側を、近赤外（ＮＩＲ）光で照射したのに対し、腫瘍の左側は、黒色のテープで覆った。７日目に、腫瘍の縮小が確認された。破線：照射された腫瘍、実線：照射されていない腫瘍。結合しなかった色素の排出に起因する、１日目の膀胱における蓄積を除き、ＩＲ７００の他の特異的な局在化は見出されなかった（ｎ＝５匹のマウス）。図４ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴｒａ−ＩＲ７００またはキャリア単独の投与に続いて、ＰＩＴ（５０Ｊｃｍ−２）を行った後の平均腫瘍体積を示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（各群において少なくともｎ＝１２匹ずつのマウス、事後検定を伴うクルスカル−ワリス検定により、非処置対照と対比して、＊＊＊Ｐ＜０．００１、”Ｐ＜０．０１）である。Ｔｒａ：トラスツズマブ。 図５ａは、Ｐａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴの前および後における顕微鏡検査による観察結果を示すデジタル画像である。スケールバー、５０ｕｍ。図５ｂは、Ｐａｎ−ＩＲ７００（ＰａｎＩＲ）媒介ＰＩＴに応答した線量依存的および標的特異的な細胞死を示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝少なくとも４、＊＊＊スチューデントのｔ検定により、非処理対照と対比して、Ｐ＜０．００１）である。図５ｄは、ＥＧＦＲ発現細胞特異的な壊死性細胞死が、Ｐａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴにより誘導されたことを示すデジタル画像である。スケールバー、５０μｍ。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト法。 図６ａは、Ａ４３１細胞を先に投与されたマウスにおけるパニツムマブ−ＩＲ７００コンジュゲート（Ｐａｎ−ＩＲ７００）の特異的な局在化を示すデジタル画像である。ＨＥＲ１陽性Ａ４３１腫瘍（左側背部）は、早ければＰａｎ−ＩＲ７００注射（５０μｇ）の１日後に選択的に視覚化された。ＨＥＲ１陰性３Ｔ３／ＨＥＲ２腫瘍（右背部）は、検出可能な蛍光を示さなかった（ｎ＝５匹のマウス）。 図６ｂは、２つの異なる用量（５０μｇおよび３００μｇ）のＰａｎ−ＩＲ７００を注射した後の経時的な、Ａ４３１腫瘍におけるＩＲ７００シグナル強度を示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝４匹ずつのマウス）である。 図６ｃは、２つの異なる用量（５０μｇおよび３００μｇ）のＰａｎ−ＩＲ７００を注射した後の経時的な、Ａ４３１腫瘍におけるＩＲ７００蛍光強度の、腫瘍対バックグラウンド比を示すグラフである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝４匹ずつのマウス）である。 図６ｄは、Ｐａｎ−ＩＲ７００の生体分布を示すデジタル画像である。Ａ４３１腫瘍（背部の両側）は、Ｐａｎ−ＩＲ７００注射（３００μｇ）の早ければ１日後に、ＩＲ７００蛍光により選択的に視覚化された。１日目に、腫瘍の右側を、近赤外（ＮＩＲ）光で照射したのに対し、腫瘍の左側は、黒色のテープで覆った。７日目に、腫瘍の縮小が確認された。破線：照射された腫瘍、実線：照射されていない腫瘍。 図６ｅは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰａｎ−ＩＲ７００またはキャリア単独の投与に続いて、ＰＩＴ（３０Ｊｃｍ−２）を行った後の平均腫瘍体積を示すグラフである。Ｐａｎ−ＩＲ７００注射（腫瘍接種後５日目）後１日目に、ＰＩＴを実施した。データは、平均値±標準誤差（各群において少なくともｎ＝１２匹のマウス、＊＊＊事後検定を伴うクルスカル−ワリス検定により、他の対照群と対比して、Ｐ＜０．００１）である。 図６ｆは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰａｎ−ＩＲ７００またはキャリア単独の投与に続いて、ＰＩＴ（３０Ｊｃｍ−２）を行った後の生存期間を示すグラフである（各群において少なくともｎ＝１２匹のマウス、＊＊＊多重性についてのボンフェローニによる補正を伴うログランク検定により、他の対照群と対比して、Ｐ＜０．００１）。 図６ｇは、ＰＩＴ処置した腫瘍（右）および処置していない腫瘍（左）の４日後の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色組織画像（４０倍および２００倍）を示すデジタル画像である。ｎ＝５匹のマウス；スケールバー、１００ｕｍ。Ｐａｎ：パニツムマブ。 図６ｈは、高用量のＰａｎ−ＩＲ７００投与が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴの、Ａ４３１腫瘍に対するより高い抗腫瘍効力をもたらすことを示すグラフである。Ｐａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴによる腫瘍成長の阻害は、Ｐａｎ−ＩＲ７００用量依存的に観察された。データは、平均値±標準誤差（各群において少なくともｎ＝１２匹のマウス）である。 図７は、Ｊ５９１−ＩＲ７００の生体分布を示すデジタル画像である。ＰＣ３−ＰＩＰ腫瘍は、Ｊ５９１−ＩＲ７００注射（１００μｇ）の後、ＩＲ７００蛍光により選択的に視覚化された。腫瘍の右側を、４、１２、および１３日目に、近赤外（ＮＩＲ）光で照射したのに対し、腫瘍の左側は、黒色テープで覆った。５日目に腫瘍の縮小が確認された。 図８は、様々な細胞についての、ＨＥＲ２＋細胞ではＴｒａ−ＩＲ７００存在下での、ＨＥＲ１＋細胞ではＰａｎ−ＩＲ７００存在下での、ＰＳＭＡ＋細胞ではｈｕＪ５９１−ＩＲ７００存在下での、ＰＩＴ前およびＰＩＴ後における顕微鏡検査による観察結果を示すデジタル画像である。スケールバー、５０μｍ。ＤＩＣ：微分干渉コントラスト法。 図９ａは、電磁波照射を使用する他の物理的がん療法との関連で、ＰＩＴによる選択的ながん療法を説明するための図式を示す概略図である。他の物理的がん療法は、正常組織に異なる種類の損傷を誘導するが、ＰＩＴは、正常細胞や正常組織を損傷することなく、もっぱらがん細胞を損傷する。図９ｂは、ＰＩＴの光物理学的、化学的、および生物学的基盤を説明するための図式を示す概略図である。ヒト化抗体は、臨床的に適用可能な標的化試薬の中でのその最高度の結合特異性、ｉｎ ｖｉｖｏで最大の標的への送達、低免疫原性のために、送達ビヒクルとして使用される。親水性のフタロシアニンは、その７００ｎｍの近赤外光の大きな吸収、および細胞膜と結合した場合に限り強力な細胞傷害作用が誘導されるために、活性化可能な細胞傷害性「ナノダイナマイト」試薬として使用される。７００ｎｍの近赤外光は、有害でない非イオン化フォトンの中でのその高エネルギーのため、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける大きな組織透過のために、細胞傷害作用を活性化する誘発剤として使用される。 図１０Ａ〜Ｄは、ＩＲ７００と結合体化させたパニツムマブ（Ｐａｎ−ＩＲ７００）の試料を、ＰＢＳで希釈することにより、２．５、５、２０、および４０ｊａｇ／ｍＬの濃度で調製したことを示す図である。（Ａ）Ｐａｎ−ＩＲ７００溶液の蛍光強度画像を示す図である：蛍光強度は、Ｐａｎ−ＩＲ７００濃度の低下に応じて低下した。（Ｂ）Ｐａｎ−ＩＲ７００溶液の蛍光寿命（ＦＬＴ）画像を示す図である：様々な濃度のＰａｎ−ＩＲ７００溶液におけるＦＬＴは、３．５６±０．０８１ナノ秒（ｎｓ）；３．６２（２．５ｐｇ／ｍＬ）、３．５８（５ｐｇ／ｍＬ）、３．４４（２０ｐｇ／ｍＬ）、３．６０ナノ秒（４０ｐｇ／ｍＬ）とほぼ同じ値であった。（Ｃ）Ａ４３１細胞ペレットに対するＬＥＤ光照射が、ＦＬＴを変化させることを示す図である。２４時間にわたり、Ｐａｎ−ＩＲ７００と共にインキュベートしたＡ４３１細胞系を、０、８、１５、および３０Ｊ／ｃｍ２の線量のＰＩＴで処理した。ＦＬＴは、光への曝露前における３．２８ナノ秒と比較して、３．０９、２．９４、および２．８５ナノ秒へと短縮した。これらは、それぞれ、９．１、１０．１、および１３．１％の短縮を表した。（Ｄ）Ａ４３１ペレットのＦＬＴは、Ｐａｎ−ＩＲ７００とのインキュベーション時間に依存する。ＦＬＴ値は、Ｐａｎ−ＩＲ７００とのインキュベーション時間と共に延長する。ＦＬＴは、２．９８ナノ秒（１時間）から３．４２ナノ秒（２４時間）へと変化する。 図１１は、Ｐａｎ−ＩＲ７００（１００ｊｉｇ／ｍ０と共に３７℃で２４時間プレインキュベートし、ＮＩＲ光へ曝露開始した５、１５、６０、および９０秒後の、Ａ４３１細胞の時系列蛍光（ｓｅｒｉａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の顕微鏡検査による画像（下）および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）の顕微鏡検査による画像（上）を示すデジタル画像である。Ｐａｎ−ＩＲ７００は、細胞膜へと結合した後、注入の最大２４時間後まで、Ａ４３１細胞の細胞質へと徐々に内部移行した。より高い線量のＮＩＲ光に曝露することにより、ＤＩＣにおける形態的変化は、より重大なものとなる。スケールバー、５０ｐｍ。 図１２Ａ〜Ｄは、照射された腫瘍のＦＬＴ（暗灰色のバー）の、照射されなかった腫瘍（明灰色のバー）との比較を示す図である。（Ａ）背部の両側にＡ４３１細胞を接種した同じマウスにおける、１０、３０、５０Ｊ／ｃｍ２の線量でのＰＩＴ前およびＰＩＴ後のＦＬＴ画像を示す図である。右側の腫瘍がＰＩＴにより処置されたのに対し、左側の腫瘍は覆われた。５０Ｊ／ｃｍ２（Ｂ）、３０Ｊ／ｃｍ２（Ｃ）、および１０Ｊ／ｃｍ２（Ｄ）でのＰＩＴで処置されたＡ４３１腫瘍のＦＬＴをプロットした。３０および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光線量でのＰＩＴは、照射されていない腫瘍と比較して速やかに、有意な（Ｐ＜０．０５）ＦＬＴの短縮を実証した。しかし、１０Ｊ／ｃｍ２の低線量では、ＦＬＴが有意に短縮しなかった。ＦＬＴの一過性の延長は、おそらくは反応性マクロファージによる取込みに起因して、ＰＩＴの６時間後に観察された。統計学的解析には、マン−ホイットニーのＵ検定を用いた。 図１３Ａ〜Ｃ。（Ａ）５０および３０Ｊ／ｃｍ２でのＰＩＴで処置された腫瘍におけるＦＬＴが、非処置対照（０Ｊ／ｃｍ２）（対照）と比較して、有意に（ｐ＜０．０１）短縮したことを示す図である。ＦＬＴは、それぞれ、５０および３０Ｊ／ｃｍ２でのＰＩＴにより、６９．１±１０．９％および６１．５＋１５．１％へと速やかに短縮した。１０Ｊ／ｃｍ２だけで照射されたＡ４３１腫瘍は、ＦＬＴの有意な短縮が速やかに認められないことを示した。ＦＬＴは、ＰＩＴの４８時間後に、非処置対照と比較して７．７％だけ短縮した。（Ｂ）ＰＩＴで処置されたマウスにおける、照射されなかった腫瘍のＦＬＴは、時間経過と共に、処置されていないマウスにおける腫瘍のＦＬＴよりわずかに短縮したが、これらの変化は、有意でなかったことを示す図である。統計学的解析には、スチューデントのｔ検定を用いた。（Ｃ）０、１０、３０、および５０Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴで処置されたＡ４３１腫瘍の組織学的検体を示す図である。全ての検体は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。処置された腫瘍の顕微鏡検査による評価は、ＰＩＴ後に健常であるかまたは損傷した腫瘍細胞のクラスターを伴う様々な程度の壊死および微小出血を明らかにした。壊死性損傷はびまん性でかつ激しく、３０および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施したときに、生存する腫瘍細胞が少ないことが認められた。これに対し、わずか１０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施したときに、壊死性細胞損傷が見出されたのは腫瘍における限られた領域だけであるのに対し、相当量の健常ながん病巣が維持された。スケールは、５０μｍを示す。 図１４Ａ〜Ｃ。Ａ．ＰＩＴ後におけるＰＥＧ化Ｑｄｏｔ８００の動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｑｄｏｔ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。Ｂ．ＰＩＴで処置された腫瘍（緑色；上）、対照腫瘍（青色；中）、および背部（黒色；下）における時間−シグナル強度曲線を示す図である。Ｃ．蛍光顕微鏡検査を示す図である。ＩＲ７００シグナルは、生存Ａ４３１細胞を示す。Ｑｄｏｔ８００は、ＰＩＴで処置された腫瘍組織に広範に分布し、ＩＲ７００とＱｄｏｔ８００との共局在化が部分的に観察されたのに対し、対照腫瘍におけるＱｄｏｔ８００のシグナルは、主血管の近傍に局在化した。 図１５Ａ．ＰＩＴ後におけるＳＰＩＯ動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。ＳＰＩＯは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。５分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。 図１５Ｂ．プルシアンブルー染色およびＨＥ染色を示す図である。 図１６Ａ〜１６Ｄ。Ａ．ＰＩＴ後におけるＰａｎ−ＩＲ８００の動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｐａｎ−ＩＲ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。Ｂ．Ｐａｎ−ＩＲ８００が、照射された光線量に依存して、ＰＩＴで処置された腫瘍に速やかに蓄積し得ることを示す図である。対照腫瘍では、シグナルが、観察されなかった。ＣおよびＤ．ＰＩＴの２４時間後には、血管の基底部が修復された（間質圧（ｉｎｔｒｅｓｔｉｔａｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が回復した）か、または血流が停止した可能性があるため、Ｐａｎ−ＩＲ８００が腫瘍により取り込まれ得ないことを示す図である。 図１７Ａ〜Ｆ。Ａ〜Ｃ：ＰＩＴ後におけるダウノルビシン含有リポソームの動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。ダウノルビシン含有リポソームは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。３０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。Ｄ．蛍光顕微鏡検査による研究：ＩＲ７００シグナルが、生存Ａ４３１細胞を示す図である。ダウノルビシン含有リポソームが、ＰＩＴで処置された腫瘍組織に広範に分布し、ＩＲ７００とＱｄｏｔ８００との共局在化が部分的に観察されたのに対し、対照腫瘍におけるＱｄｏｔ８００のシグナルは、主血管の近傍に局在化した。Ｅ．ＰＩＴを、ダウノルビシン含有リポソームと組み合わせる組合せ療法により、腫瘍成長が有意に抑制されたことを示す図であり、（Ｆ）Ａ４３１担持マウスの生存期間が延長されたことを示す図である。 図１８は、ＰＩＴおよび化学療法剤を用いて腫瘍を処置するための例示的な方法を示す概略図を提示する。方法は、腫瘍のイメージングを含みうる。 図１９Ａ〜１９Ｂ。Ａ．ＰＩＴ後におけるＴｒａ−ＩＲ８００の動的画像を示す図である。３Ｔ３／ＨＥＲ２マウスに、Ｔｒａ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｔｒａ−ＩＲ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。白色矢印は、３Ｔ３ＨＥＲ２腫瘍への光の照射が不十分な部位を示す。Ｔｒａ−ＩＲ８００は、腫瘍がＮＩＲ光に曝露された領域だけに蓄積し得る。Ｂ．ＰＩＴ後におけるＰａｎ−ＩＲ８００の動的画像を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８担持マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｐａｎ−ＩＲ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。 図２０Ａ．ＰＩＴ後におけるＵＳＰＩＯの動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。ＵＳＰＩＯは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。５分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。 図２０Ｂ．プルシアンブルー染色およびＨＥ染色を示す図である。 図２０Ｃ．ＰＩＴ後におけるＧ６−Ｇｄの動的画像を示す図である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｇ６−Ｇｄは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。５分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。 図２１Ａ〜２１Ｂ。Ａ．腫瘍の辺縁領域およびコア領域における蛍光顕微鏡検査による研究を示す図である。ＩＲ７００シグナルは、生存Ａ４３１細胞を示す。ダウノルビシン含有リポソームが、ＰＩＴで処置された腫瘍組織に広範に分布し、ＩＲ７００とダウノルビシン含有リポソームとの共局在化が部分的に観察された。とりわけ、コア領域では、ＤＸが、局所的な壊死性領域に取り込まれうる。Ｂ．療法後における体重の変化を示す図である。明白な群間差は認められなかった。
いくつかの実施形態の詳細な説明
別段に説明されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。文脈が明らかに別のことを示していない限り、単数形の用語である「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」は、複数形の言及を含む。同様に、「または」という語も、文脈が明らかに別のことを示していない限り、「および」を含むことを意図する。「〜を含む（complising）」は、「〜を含む（including）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む（complising A or B）」は、「Ａを含む（including A）」もしくは「Ｂを含む（including B）」、または「ＡおよびＢを含む（including A and B）」を意味する。
以下では、本開示の実施形態を実施および／または試行するのに適する方法および材料が記載される。このような方法および材料は、例示であるだけであって、限定することを意図するものではない。本明細書に記載される方法および材料と類似するかまたは同等な他の方法および材料も用いることができる。例えば、開示される発明が関係する、当技術分野で周知の従来の方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年; Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Press、２００１年; Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、１９９２年（および２０００年版への増補版）； Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、第４版、Wiley & Sons、１９９９年; HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９０年；ならびにHarlowおよびLane、Using Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９９年を含めた、様々な、一般的で、かつ、より具体的な参考文献に記載されている。
本明細書で言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ受託番号と関連する配列は、２０１０年７月９日現在で入手可能な配列を参照することにより組み込まれる。
本開示の様々な実施形態の精査を容易とするために、特定の用語についての以下の説明が提供される。
投与：被験体に、抗体−ＩＲ７００分子などの作用物質（ａｇｅｎｔ）を、任意の有効な経路により服用させるかまたは施すこと。例示的な投与経路には、局所経路、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）、経口経路、眼経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体：少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドであって、腫瘍特異的タンパク質など、抗原のエピトープを特異的に認識し、これに結合するポリペプチドリガンド。抗体は重鎖および軽鎖からなり、それらの各々が、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と称する可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は併せて、抗体により認識される抗原の結合に関与する。
抗体には、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンおよびバリアント、ならびにＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）など、当技術分野で周知の抗体の部分が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質が、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域をリンカーで結合させた融合タンパク質であるのに対し、ｄｓＦｖでは、鎖の会合を安定化させるためのジスルフィド結合を導入するように、鎖を変異させている。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）など、遺伝子操作された形態も含む。また、Pierce Catalog and Handbook、１９９４〜１９９５年（Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）; Kuby, J.、Immunology、第３版、W. H. Freeman & Co.、New York、１９９７年も参照されたい。
典型的に、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続している重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖にはラムダ（λ）鎖およびカッパ（ｋ）鎖という２つの種類がある。５つの主要な重鎖のクラス（またはアイソタイプ）が存在し、それは、抗体分子：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの機能的活性を決定する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた、「ドメイン」としても公知である）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域が組み合わされて抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともまた呼ばれる３つの超可変領域を挟み込んだ、「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの広がりは規定されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services、１９９１年を参照されたい）。今日では、Ｋａｂａｔによるデータベースが、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなど、種内で比較的保存されている。構成要素の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを三次元空間に配置し整列させるように働く。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的に、Ｎ末端から始めて順次番号付けされてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称し、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨのＣＤＲ３が、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置する一方、ＶＬのＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ））を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体によって変化するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけが、抗原の結合に直接的に関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置を、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。
「ＶＨ」または「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの重鎖の可変領域を含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖の可変領域を含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「モノクローナル抗体」とは、Ｂリンパ球の単一クローンにより産生される抗体、または単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により、例えば、骨髄腫細胞の、脾臓の免疫細胞との融合体に由来する、ハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
「キメラ抗体」は、ヒトなど、１つの種に由来するフレームワーク残基と、メソテリンに特異的に結合するマウス抗体など、別の種に由来するＣＤＲ（一般に、抗原の結合を付与する）とを有する。
「ヒト化」免疫グロブリンとは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンに由来する１または複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンを、「ドナー」と称し、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンを、「アクセプター」と称する。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおいてドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は、存在しなくともよいが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、約９５％以上など、少なくとも約８５〜９０％同一でなければならない。よって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖免疫グロブリンとヒト化重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたはヒト化抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから選択したアミノ酸による、限られた数の置換を有しうる。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原の結合または他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換を有しうる。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
「ヒト」抗体（また、「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）とは、ヒト免疫グロブリンに由来するヒトフレームワーク領域と、ＣＤＲの全てとを含む抗体である。一例では、フレームワークとＣＤＲとが、同じ起源のヒト重鎖アミノ酸配列および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかし、１つのヒト抗体に由来するフレームワークを、異なるヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように操作することもできる。ヒト免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。
「〜に特異的に結合する」とは、個別の抗体が、非腫瘍タンパク質、例えば、β−アクチンなどの非類縁タンパク質に対する結合と比べて、腫瘍特異的抗原などの抗原と特異的に免疫反応する能力を指す。例えば、ＨＥＲ２特異的結合剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実質的にＨＥＲ−２タンパク質だけに結合する。本明細書で用いられる「腫瘍特異的結合剤」という用語は、腫瘍特異的抗体と、その調製物中の、実質的に腫瘍特異的タンパク質だけに結合する他の作用物質とを含む。
結合とは、抗体分子とＴ細胞表面分子の抗原決定基との間のランダムでない結合反応である。所望の結合特異性は、特に、２つの抗原が固有のエピトープを有する場合に、抗体がＴ細胞表面分子と非類縁抗原とに差次的に結合し、したがって、２つの異なる抗原間を識別する能力の基準点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｉｎｔ）から決定されることが典型的である。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を「特異的抗体」と称する。
一部の例では、抗体（抗体−ＩＲ７００分子など）が、標的（細胞表面タンパク質など）に特異的に、試料または被験体における他の分子に対する結合定数より少なくとも１０３Ｍ−１大きな、１０４Ｍ−１大きな、または１０５Ｍ−１大きな結合定数で結合する。一部の例では、抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその断片の平衡定数（Ｋｄ）が、１ｎＭ以下である。例えば、抗体は、腫瘍特異的タンパク質などの標的に、少なくとも約０．１×１０−８Ｍ、少なくとも約０．３×１０−８Ｍ、少なくとも約０．５×１０−８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０−８Ｍ、少なくとも約１．０×１０−８Ｍ、少なくとも約１．３×１０−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０−８Ｍ、または少なくとも約２．０×１０−８Ｍの結合アフィニティーで結合する。Ｋｄ値は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）により決定することもでき、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能な、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイスを用いて決定することもできる。
抗体−ＩＲ７００分子または抗体−ＩＲ７００コンジュゲート：ＩＲ７００に結合体化した腫瘍特異的抗体などの抗体を両方とも含む分子。一部の例では、抗体が、がん細胞の表面タンパク質に特異的に結合するヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体など）である。
抗原（Ａｇ）：動物へと注射または吸収される組成物（腫瘍特異的タンパク質を含む組成物など）を含め、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激しうる化合物、組成物、または物質。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘導される産物を含め、特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、それに対してＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子と共に提示される場合、そのエピトープに応答する。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより近接する連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成されうる。連続アミノ酸から形成されるエピトープが、典型的に、変性溶媒に曝露しても保持されるのに対し、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３、より通常には、少なくとも５、約９、または約８〜１０アミノ酸を、固有の空間的立体構造中に含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶構造解析および核磁気共鳴が挙げられる。
抗原の例には、免疫細胞により認識されるペプチド、脂質、多糖、および核酸など、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、および核酸が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、抗原に、腫瘍特異的ペプチド（がん細胞の表面に見出される腫瘍特異的ペプチドなど）またはその免疫原性断片が挙げられる。
がん：異常な細胞成長または制御不能の細胞成長を特徴とする悪性腫瘍。がんと関連することが多い他の特色には、転移、近傍細胞の正常な機能に対する妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出および炎症性応答または免疫応答の抑制または激化、例えば、リンパ節などの周囲または遠隔の組織または器官の浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」とは、元の腫瘍部位を離れ、例えば、血流またはリンパ系を介して、身体の他の部分へと移動するがん細胞を指す。一例では、開示される方法により死滅する細胞が、がん細胞である。
接触：固体形態および液体形態の両方を含め、直接的な物理的結合下に置くこと。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、腫瘍細胞などの単離された細胞と生じる場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、被験体（腫瘍を有する被験体など）に投与することにより生じる場合もある。
低減：いくらかの質、量、または強度を減少させること。一例では、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を含む治療組成物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）が、ＮＩＲによる（例えば、約６８０ｎｍの波長で）少なくとも１Ｊｃｍ２−の線量での、抗体−ＩＲ７００分子が特異的に結合する細胞への照射後、該細胞の生存率を、例えば、抗体−ＩＲ７００分子の非存在下における応答と比較して低減する。一部の例では、このような低減が、細胞致死を証拠とする。一部の例では、細胞の生存率の低減が、抗体−ＩＲ７００分子を含まない組成物により観察される生存率と比べて、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、なおまたは少なくとも９０％である。他の例では、低減が、細胞生存率の、抗体−ＩＲ７００分子を含まない組成物により観察される生存率と比べた、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、なおまたは少なくとも１５倍もしくは２０倍の低減などの倍数変化として表現される。このような低減は、本明細書で開示される方法を用いて測定することができる。
ＩＲ７００（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ）：以下の式：

を有する色素。
現在ＬＩ−ＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から市販されている。ＩＲ７００は、複数の好適な化学的特性を有する。アミノ反応性のＩＲ７００は、比較的親水性の色素であり、ＩＲ７００のＮＨＳエステルを用いて抗体（ａｎｔｉｂｏｉｄｙ）と共有結合的に結合体化することができる。ＩＲ７００はまた、吸光係数も、ヘマトポルフィリン誘導体（ｔｈｅｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）（６３０ｎｍで１．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）、メタ−テトラヒドロキシフェニルクロリン；Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）（６５２ｎｍで２．２×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）、およびモノ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６；ＮＰｅ６／Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ（登録商標）（６５４ｎｍで４．０×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）など、従来の光増感剤の５倍超高い（６８９ｎｍの吸収極大で２．１×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）。
薬学的組成物：被験体に適正に投与されると所望の治療効果または予防効果を誘導することが可能な化合物または組成物。薬学的組成物は、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子などの治療剤を含みうる。治療剤または薬学的作用物質（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）とは、単独で、またはさらなる化合物と併せて、所望の応答を誘導する（被験体に投与されると治療効果または予防効果を誘導するなど）治療剤または薬学的作用物質である。特定の例では、薬学的組成物が、治療有効量の、少なくとも１つの抗体−ＩＲ７００分子が挙げられる。
薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容されるキャリア（ビヒクル）は、従来のキャリア（ビヒクル）である。E. W. Martinによる、Remington’s Pharmaceutical Sciences、 Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１９版（１９９５年）は、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子など、１または複数の治療化合物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を医薬として送達するのに適する組成物および製剤について記載している。
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとしての水、生理食塩液、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどのような、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体が含まれる注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末形態、丸薬形態、錠剤形態、またはカプセル形態）のための従来の非毒性の固体キャリアには、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなど、少量の非毒性補助物質を含有しうる。
光免疫療法（ＰＩＴ）：細胞表面受容体を標的化するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）へと結合体化した近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン色素であるＩＲ７００に基づく標的特異的光増感剤を使用する分子標的化治療法。一例では、細胞表面受容体が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、またはＰＳＭＡなど、とりわけ、がん細胞で見出される細胞表面受容体であり、したがって、ＰＩＴは、このような細胞を死滅させるのに用いることができる。該細胞の細胞死は、抗体−ＩＲ７００分子が該細胞に結合し、これらの細胞がＮＩＲで照射される場合に生じるのに対し、抗体−ＩＲ７００分子により認識される細胞表面受容体を発現しない細胞が相当数死滅することはない。
被験体または患者：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む用語。一例では、被験体が、ヒト被験体またはマウスなどの獣医学的被験体である。一部の例では、被験体が、がんを有するかまたはがんを処置されている哺乳動物（ヒトなど）である。
治療有効量：単独で、または（１または複数の）さらなる治療剤（化学療法剤など）と共に、該治療剤で処置される被験体または細胞において所望の効果を達成するのに十分な組成物の量。該治療剤（抗体−ＩＲ７００分子など）の有効量は、処置される被験体または細胞、特定の治療剤、および治療組成物の投与様式が挙げられるがこれらに限られない複数の因子に依存し得る。一例では、治療有効量または治療有効濃度が、がんなどの疾患の進展（転移など）を防止するか、疾患の進行を遅延させるか、もしくは疾患の退縮を引き起こすのに十分な量または濃度、またはがんなどの疾患により引き起こされる症状を軽減することが可能な量または濃度である。一例では、治療有効量または治療有効濃度が、腫瘍を有する患者の生存期間を延長するのに十分な量または濃度である。
一例では、所望の応答が、がんと関連する１または複数の症状を軽減または阻害することである。組成物が有効であるためには、１または複数の症状が完全に消失しなくともよい。例えば、抗体−ＩＲ７００分子を含有する組成物の投与の後の照射により、腫瘍のサイズ（腫瘍の体積もしくは重量または腫瘍の転移など）を、抗体−ＩＲ７００分子の非存在下における腫瘍サイズと比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％低減することができる。特定の一例では、所望の応答が、抗体−ＩＲ７００分子および照射の非存在下における細胞致死と比較して、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％を死滅させることにより、細胞集団を所望の量だけ死滅させることである。特定の一例では、所望の応答が、腫瘍を有する患者（または腫瘍を最近除去された患者）の生存期間を所望の量だけ延長する、例えば、抗体−ＩＲ７００分子および照射の非存在下における生存期間と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも１００％生存を延長することである。
開示される抗体−ＩＲ７００分子のうちの１つを含む作用物質であって、ヒト被験体または獣医学的被験体へと投与される作用物質の有効量は、この被験体と関連するいくつかの因子、例えば、被験体の全体的な健康に応じて変化する。作用物質の有効量は、その生成物の投与量を変化させ、腫瘍の退縮など、結果として得られる治療応答を測定することにより決定することができる。有効量はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕにおける様々なイムノアッセイを介して決定することもできる。開示される作用物質は、所望の応答を得るのに必要とされる通りの、単回投与で投与することもでき、複数回投与で投与することもできる。しかし、有効量（ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ）は、適用される供給源、処置される被験体、処置される状態の重症度および種類、ならびに投与様式に依存しうる。
特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子の治療有効用量が、６０キログラム当たり少なくとも０．５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、静脈内投与される場合、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量など、例えば、０．５〜５０ｍｇ／６０ｋｇである。別の例では、抗体−ＩＲ７００分子の治療有効用量が、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇまたは少なくとも５００μｇ／ｋｇなど、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば、腫瘍内投与または腹腔内投与される場合、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量など、例えば、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。一例では、治療有効用量が、局所用溶液で投与される１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌなど、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの間など、少なくとも５００μｇ／ｍｌなど、少なくとも１μｇ／ｍｌである。しかし、当業者は、また、例えば、特定の抗体−ＩＲ７００分子に応じて、より高い投与量またはより低い投与量も用いうることを認識する。特定の例では、このような毎日の投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与する。開示される抗体−ＩＲ７００分子は、単独で投与することもでき、薬学的に許容されるキャリアの存在下で投与することもでき、他の治療剤（他の抗新生物剤など）の存在下で投与することもできる。
一般に、抗体−ＩＲ７００の投与後における適切な照射線量は、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１Ｊｃｍ−２、例えば、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１０Ｊｃｍ−２、６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも５０Ｊｃｍ−２、または６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも１００Ｊｃｍ−２、例えば、６６０〜７４０ｎｍの波長で１〜５００Ｊｃｍ−２である。一部の例では、波長が、６６０〜７１０ｎｍである。特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子の投与後における適切な照射線量が、６８０ｎｍの波長で少なくとも１．０Ｊｃｍ−２、例えば、６８０ｎｍの波長で少なくとも１０Ｊｃｍ−２、６８０ｎｍの波長で少なくとも５０Ｊｃｍ−２、または６８０ｎｍの波長で少なくとも１００Ｊｃｍ−２、例えば、６８０ｎｍの波長で１〜５００１．０Ｊｃｍ−２である。特定の例では、抗体−ＩＲ７００分子の投与後に、複数回にわたる照射を実施する（２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回にわたる個別の投与など、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４回にわたる照射など）。
処置：細胞または組織の治療剤による処置を指すのに用いられる場合の用語は、作用物質（抗体−ＩＲ７００分子など）を細胞もしくは組織と接触させるステップ、または作用物質を細胞もしくは組織と共にインキュベートするステップを含む。処置された細胞とは、所望の応答に十分な量で、かつ、所望の応答に十分な条件下で、所望の組成物と接触させた細胞である。一例では、処置された細胞とは、抗体−ＩＲ７００分子に、該抗体が細胞の表面タンパク質に結合するのに十分な条件下で曝露された後、十分な細胞致死が達成されるまで照射される細胞である。
腫瘍、新生物、悪性腫瘍、またはがん：新生物とは、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長は、腫瘍をもたらしうる。個体における腫瘍の量とは、腫瘍の数、体積、または重量として測定されうる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と称する。周囲の組織に浸潤し、かつ／または転移しうる腫瘍を、「悪性」と称する。「非がん性組織」とは、悪性新生物が形成されているが、新生物に特徴的な病態を有さない同じ器官に由来する組織である。一般に、非がん性組織は、組織学的に正常な外見を呈する。「正常組織」とは、器官に由来する組織であって、該器官が、その器官のがんまたは別の疾患もしくは障害に冒されない組織である。「がんを有さない」被験体は、その器官のがんを有すると診断されておらず、検出可能ながんを有さない。
特許請求される方法で処置されうる、がんなどの例示的な腫瘍には、乳癌（例えば、小葉癌および腺管癌）、肉腫、肺癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌およびムチン性嚢胞腺癌など）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、および精巣胚細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、腺癌、および扁平上皮癌を含めた）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌および混合型ミュラー腫瘍（癌肉腫）を含めた）、子宮内頸部の癌、子宮外頸部の癌、および膣癌（これらの各々の腺癌および扁平上皮癌など）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅ ｔｕｍｏｒ）、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎ ａｄｎｅｘａｌ ｔｕｍｏｒ）、ならびに様々な種類の肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭癌および口腔咽頭癌（これらの扁平上皮癌および腺癌を含めた）、唾液腺癌、脳腫瘍および中枢神経系腫瘍（例えば、神経膠、神経細胞、および髄膜を起源とする腫瘍を含めた）、末梢神経腫瘍、軟組織肉腫および骨肉腫および軟骨肉腫などの固形腫瘍、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞悪性リンパ腫およびＴ細胞悪性リンパ腫を含めた）が挙げられる。一例では、腫瘍が、腺癌である。
本方法はまた、リンパ型の、白血球型の、または他の型の白血病などの液性腫瘍を処置するのにも用いることができる。特定の例では、処置される腫瘍が、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫など）、および骨髄腫など、血液の腫瘍である。
〜に十分な条件下で：所望の活性を可能とする任意の環境について記載するのに用いられる語句。一例では、「〜に十分な条件下で」が、抗体−ＩＲ７００分子が細胞表面タンパク質に結合することを可能とするのに十分な抗体−ＩＲ７００分子を被験体に投与することを包含する。特定の例では、所望の活性が、細胞に対する治療照射の後に、抗体−ＩＲ７００分子が結合している細胞を死滅させる。
処置されていない細胞：抗体−ＩＲ７００分子など、所望の作用物質と接触させていない細胞。ある例では、処置されていない細胞が、所望の作用物質を送達するビヒクルを施される細胞である。
ある特定の実施例の開示は、他の実施形態を除外することを意味するものではない。加えて、本明細書に記載される任意の処置は、他の処置に対して必ずしも除外的ではなく、他の生体活性作用物質または処置モダリティーと組み合わせることができる。
技法の概観
がん療法のための従来の光力学療法（ＰＤＴ）は、周囲の組織への損傷を最小限としながら光毒性をもたらすための、腫瘍における光増感剤の優先的な蓄積に基づく（Doughertyら、J Natl Cancer Inst、９０巻：８８９〜９０５頁、１９９８年）。従来、ＰＤＴは、酸素の存在下におけるＲＯＳ、とりわけ、一重項酸素の生成により媒介されると考えられている（Doughertyら、J Natl Cancer Inst、９０巻：８８９〜９０５頁、１９９８年）。しかし、既存の光増感剤が腫瘍選択性を欠く範囲内において、用量制限毒性をもたらす相当の損傷を正常組織に認めることができる。したがって、光増感剤によるより選択的な標的化および吸収されるフォトン１個当たりのより効率的な光毒性が可能であれば、現行のＰＤＴ法が改善されることになる。
本明細書では、抗体−ＩＲ７００分子と称する高度な標的化光増感剤が開示される。光増感剤であるＩＲ７００は、ＮＩＲの範囲で励起し、より深部の組織へと透過し、外部ＮＩＲ光を単回線量のみ照射した後に、皮下に異種移植された腫瘍の上首尾の根絶を結果としてもたらす。標的化光毒性は、抗体−ＩＲ７００分子の細胞膜への結合に主に依存し、内部移行およびＲＯＳ形成に依存する程度は低いようである。コンジュゲートにより誘導される蛍光を用いて、ＰＩＴおよび治療結果のモニタリングの両方を非侵襲的に導くことができる。
標的化光増感剤は、全身に分布しうるが、強い光が適用される場合に限り活性であり、これにより、オフターゲット作用の尤度が減少する。これに対し、既存の光増感剤は、がん細胞だけでなく、また、皮膚および他の上皮表面を含めた正常細胞にも結合して有害な光毒性を結果としてもたらす、選択性の低い低分子である。加えて、従来の光増感剤の標的特異的な送達は、該作用物質が、有効性を高めるために、細胞に到達した後、ミトコンドリアなどの細胞小器官へとさらに内部移行されなければならないため、理論的にも困難である。選択性を改善するために、従来の光増感剤とＭＡｂとの様々な組合せが調べられている（Mewら、J Immunol、１３０巻：１４７３〜１４７７頁、１９８３年; Sobolevら、Prog Biophys Mol Biol、７３巻：５１〜９０頁、２０００年; Carcenacら、Br J Cancer、８５巻：１７８７〜９３頁、２００１年; Vrouenraetsら、Cancer Res、５９巻：１５０５〜１３頁、１９９９年; Vrouenraetsら、Cancer Res、６１巻：１９７０〜１９７５頁、２００１年; Hamblinら、Cancer Res、５６巻：５２０５〜１０頁、１９９６年; Mewら、Cancer Res、４５巻：４３８０〜６頁、１９８５年）。しかし、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果により測定される場合、これらの成功はとりわけ限られたものである。なぜなら、従来の光増感剤は吸光係数が低く、このため、単一抗体分子への多数の光増感剤の結合体化を必要とし、したがって、結合アフィニティーを潜在的に低減するためであり；従来の光増感剤は、大部分が疎水性であって、免疫反応性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける標的への蓄積を損なわずに光増感剤を抗体へと結合体化するのが困難であるためであり；かつ、従来の光増感剤は一般に、可視範囲の光を吸収して組織透過を減少させるためである。
本明細書では、抗体ベースの光増感剤（ｍＡｂベースの光増感剤など）が、がんの細胞膜の標的分子へと結合する場合に限り、標的化光免疫療法（ＰＩＴ）に適したＮＩＲ光により活性化することが示される。フルオロフォアであるＩＲ７００（Ｌｉｃｏｒ Ｃｏ． Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）は、細胞表面受容体に特異的な抗体へと結合体化すると光増感剤となることが可能であり、したがって、腫瘍細胞またはがん細胞などの望ましくない細胞に対する標的特異的な光力学療法に用いることができる。さらに、これらの作用物質はまた、診断的蛍光も発光するため、光の適用を方向付けるように使用して、関係のない組織への光の曝露を最小化し、治療効果を非侵襲的にモニタリングすることができる。様々な数の個々の標的分子を発現する複数の異なる細胞に対する３つの異なるＭＡｂにより誘導される光毒性の類似性に基づき、免疫療法からの潜在的に付加的な利益を考慮すると、本方法は一般に、他のｍＡｂ（Nanusら、J. Urology、１７０巻：Ｓ８４〜Ｓ８８頁、２００３年；およびvan Dongenら、Adv Drug Deliv Rev、５６巻：３１〜５２頁、２００４年に開示されたｍＡｂなど）にも適用可能でありうる。
ＩＲ７００を、抗ＥＧＦＲ抗体（ＨＥＲ１またはＨＥＲ２）またはＰＳＭＡ抗体とコンジュゲートしたところ、このコンジュゲートに選択的に結合した細胞は、６８０ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）光に曝露されると死滅した。この新規の観察結果に基づき、患者に対する治療が提供される。この抗体依存的標的細胞特異的光力学療法は、ＮＩＲ光（例えば、６８０ｎｍ）での励起により達成され、抗体が結合したときに限り、高度に選択的な細胞傷害効果を示したので、ＩＲ７００を用いるこの新たな抗体依存的標的細胞特異的光力学療法を、がん患者において、副作用を最小限としながらがん療法を個別化する方途として用いることができる。
抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの選択性は、標的細胞の細胞膜への結合後におけるその活性化に由来し；結合しなかったコンジュゲートは、光毒性に寄与しない。短期間の生存度アッセイのほか、長期間の増殖アッセイも、このコンジュゲートが、特異的な細胞死を誘導しうることを実証した。受容体陽性細胞と受容体陰性細胞との共培養物を処理したところ、培養培地において結合しなかった抗体−ＩＲ７００が存在したにもかかわらず、受容体陽性細胞だけが死滅した。この選択的な細胞致死は、正常細胞に対する損傷を最小化する。
抗体−ＩＲ７００分子は、活性となるために、細胞膜へと結合しなければならない。例えば、エンドリソソームの破裂は、光への曝露後１秒以内に生じた。一重項酸素により誘導される細胞死は一般に、より緩徐なアポトーシス性細胞死を誘導する。本方法では、細胞膜損傷が、４℃であっても極めて速やかに誘導されたので、細胞死は、局所的に加熱された水の迅速な膨張により引き起こされるものであり、一重項酸素の作用に起因する作用は比較的小さいことが仮定される。
酸化還元剤であり、一重項酸素スカベンジャーであるアジ化ナトリウムによる処理は、光毒性を部分的に減少させたに過ぎず、コンジュゲートの有効性を完全に消失させたわけではなかった。これは、ＲＯＳの生成が、光毒性効果の重要部分ではないことを示す。光毒性が、４℃でわずか１時間後である、抗体−ＩＲ７００とのインキュベーションの後に誘導されたという観察結果は、コンジュゲートの内部移行が、活性に必要とされないことを示す。これは、有効であるには細胞内への局在化を必要とする現行のＰＤＴ剤と異なる。ビデオによる顕微鏡検査は、抗体−コンジュゲートが内部移行する３７℃で６時間超にわたるインキュベーション後の光への曝露後における、膜およびリソソームに対する迅速で明らかな損傷を実証した。
開示される抗体−ＩＲ７００コンジュゲートは、標的化した組織の検出を可能とした。これは、領域全体に照射するのではなく、ＰＩＴにより照射する特定の病変を同定することを可能としうる。診断に必要とされる用量（５０μｇ）は、治療に必要とされる用量（３００μｇ）より著しく低量であった。抗体の腫瘍における分布の改善は、治療用量で生じた。結合した作用物質の蛍光および結合しなかった作用物質の蛍光の両方のために、治療用量では比較的高いバックグラウンドシグナルが存在する。それにもかかわらず、ＰＩＴ後では、処置した腫瘍の蛍光が減少し、最終的に消滅したことから、処置をモニタリングする手段が示された。
遊離ＩＲ７００および異化ＩＲ７００は、いずれの特定の器官への蓄積を伴わずに、１時間以内に尿中に容易に排出される。ＰＩＴの他の構成要素である、ＮＩＲによる光照射（例えば、６９０ｎｍにおける）は、加熱量（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｏｓｅ）を除き、毒性ではなさそうである。ｘ線またはガンマ線などのイオン化放射線と異なり、ＮＩＲ光の累積照射線量には制限がないはずである（図９）。したがって、長期にわたるがん患者の管理のためにも、反復的ＰＩＴを用いることができる。３つの異なるレジメンによる反復的ＰＩＴ（抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの単回投与において３回または４回に分割されたＮＩＲ照射、および抗体の複数回投与の後で２週間ごとに４サイクルのＰＩＴ）は、腫瘍の再成長をコントロールし、４カ月間を超える無腫瘍生存を結果としてもたらすことが観察された。
本明細書ではまた、ＰＩＴと抗体−ＩＲ７００コンジュゲートとの使用が、例えば、ＰＩＴ後約８時間にわたり、腫瘍へのナノサイズの作用物質の送達を増強することも示される。ナノサイズの作用物質は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の枯渇を含めた体液性因子（ｈｕｍｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒ）による活性化によって血管内皮細胞を標的化することも可能であり、または、血管毒性剤を用いて血管内皮細胞を損傷することにより血管内皮細胞を標的化することも可能である。これらの観察結果に基づき、ＰＩＴ後における他の抗新生物療法の腫瘍への送達を増強するための方法が提供される。一例では、抗新生物療法の腫瘍への送達（または抗新生物療法の有効性）が、例えば、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの投与およびＰＩＴの非存在下における抗新生物療法の腫瘍への送達（または抗新生物療法の有効性）と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、なおまたは少なくとも９５％増加する。
細胞を死滅させて腫瘍を処置するための方法
本開示は、標的細胞などの細胞を死滅させるための方法を提供する。細胞は、その表面に、色素であるＩＲ７００に結合体化した抗体（本明細書では抗体−ＩＲ７００分子と称する）に特異的に結合できる腫瘍特異的抗原などのタンパク質を発現する。細胞を、治療有効量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子（例えば、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体など、薬学的に許容されるキャリアの存在下で）と、抗体が細胞表面タンパク質に特異的に結合することを可能とする条件下で接触させる。例えば、抗体−ＩＲ７００分子は、ビヒクルとしての水、生理食塩液、平衡塩類溶液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡなど）、水性デキストロース、ゴマ油、グリセロール、エタノール、またはこれらの組合せなど、薬学的に有効なキャリアに存在させることができる。キャリアおよび組成物は、無菌であり得、製剤は、投与方式に適する。
１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が、細胞表面におけるそれらの標的に結合することを可能とする条件下で、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を接触させるかまたは投与した後、次いで、細胞致死を可能とする条件下で、細胞に照射する、例えば、６６０〜７１０ｎｍの波長で少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量の照射を行う。一例では、細胞を抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップと、照射との間では、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間（１〜４時間、３０分間〜１時間、１０分間〜６０分間、または３０分間〜８時間など）を置く。ＮＩＲの励起光波長は、組織への少なくとも複数センチメートルの透過を可能とする。例えば、ディフューザーチップを有するファイバー結合型レーザーダイオードを用いることにより、ＮＩＲ光を、身体表面に対して深部に位置する、他の方法では到達不能な腫瘍の数センチメートル以内に送達することができる。循環腫瘍細胞が表在性血管を越えるときにそれを刺激させうるので、固形腫瘍を処置するのに加えて、循環腫瘍細胞も標的化しうる（例えば、本明細書で開示されるＮＩＲ ＬＥＤ装着用デバイスを用いて）。開示される方法はまた、移植片拒絶に対する療法としても用いることができる。
方法はまた、細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させるステップも含む。本発明者らは、照射（例えば、６６０〜７１０ｎｍの波長での、少なくとも１０〜１００Ｊｃｍ−２など、少なくとも１０Ｊｃｍ−２、少なくとも２０Ｊｃｍ−２、少なくとも３０Ｊｃｍ−２、少なくとも４０Ｊｃｍ−２、少なくとも５０Ｊｃｍ−２、少なくとも７０Ｊｃｍ−２、少なくとも８０Ｊｃｍ−２、または少なくとも１００Ｊｃｍ−２の線量の照射）後約８時間のウインドウであって、その間に、ＰＩＴで処置された細胞による、さらなる作用物質（例えば、直径が１〜５００ｎｍなど、直径が少なくとも約１ｎｍ、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、または直径が少なくとも２００ｎｍの作用物質など、ナノサイズの作用物質）の取込みが、予測外かつ上方へと増強されるウインドウが存在することを決定した。したがって、１または複数のさらなる治療剤を、ＰＩＴと併せてまたは逐次的に細胞とを接触させることができる。一例では、さらなる治療剤を、照射後に、例えば、細胞に照射した後の約０〜８時間に（照射後の少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、または少なくとも７時間など、例えば、照射後の１時間〜１０時間、１時間〜９時間 １時間〜８時間、２時間〜８時間、または４時間〜８時間など、１０時間を超えずに、９時間を超えずに、または８時間を超えずに）投与する。別の例では、さらなる治療剤を、照射の直前（照射前の１０分間〜６０分間、または１０分間〜３０分間など、照射前の約１０分間〜１２０分間など）に投与する。
一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴを、さらなる療法（抗新生物剤など）と組み合わせることにより、腫瘍の処置の有効性を増強する。例えば、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴを、さらなる療法（抗新生物剤など）と組み合わせる結果として、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴ単独またはさらなる療法単独のいずれかで処置された場合の腫瘍体積未満の腫瘍体積をもたらすことができる、すなわち、相乗作用的効果が存在する。一例では、組合せ療法で処置された腫瘍の体積（例えば、処置後の少なくとも７日間後、少なくとも１０日間後、少なくとも１４日間後、少なくとも３０日間後、少なくとも６０日間後、少なくとも９０日間後、または少なくとも１２０日間後における）が、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴ単独またはさらなる療法単独のいずれかで処置された腫瘍の体積の少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、なおまたは少なくとも５分の１である。一例では、組合せ療法で処置された腫瘍の体積（例えば、処置後の少なくとも７日間後、少なくとも１０日間後、少なくとも１４日間後、少なくとも３０日間後、少なくとも６０日間後、少なくとも９０日間後、または少なくとも１２０日間後における）が、対照の処置されていない腫瘍の体積の少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、なおまたは少なくとも１０分の１である。別の例またはさらなる例では、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴを、さらなる療法（抗新生物剤など）と組み合わせることにより、腫瘍を有する被験体の生存期間を、腫瘍が抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴ単独またはさらなる療法単独のいずれかで処置されたとした場合の被験体の生存期間と比べて延長させることができる、すなわち、相乗作用的効果が存在する。一例では、組合せ療法で処置された、腫瘍を有する被験体の生存期間が、抗体−ＩＲ７００分子／ＰＩＴ単独またはさらなる療法単独のいずれかで処置された、腫瘍を有する被験体の生存期間より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍長い（例えば、処置後の少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも５年間など、指定された期間の後、組合せ療法で処置された被験体が、いずれかの療法単独のいずれかで処置された場合より多く存命する）。一例では、組合せ療法で処置された、腫瘍を有する被験体の生存期間が、腫瘍が処置されていない被験体の生存期間の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、なおまたは少なくとも２０倍となる（例えば、処置後の少なくとも７日間後、少なくとも１０日間後、少なくとも１４日間後、少なくとも３０日間後、少なくとも６０日間後、少なくとも９０日間後、少なくとも１２０日間後、処置後の少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも５年間、組合せ療法で処置された被験体が、処置されていない場合より多く存命する）。
例示的なさらなる治療剤には、化学療法剤および抗脈管形成剤などの抗新生物剤、または放射線療法などの療法が挙げられる。一例では、上記剤が、化学療法免疫抑制剤（リツキシマブ、ステロイドなど）、またはサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど）である。当技術分野では、化学療法剤が公知である（例えば、SlapakおよびKufe、Principles of Cancer Therapy、Harrison’s Principles of Internal Medicine、第１４版、８６章; Perryら、Chemotherapy、Abeloff、Clinical Oncology、第２版、１７章、２０００年、Churchill Livingstone, Inc; BaltzerおよびBerkery（編）、Oncology Pocket Guide to Chemotherapy、第２版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９５年；Fischer Knobf、およびDurivage（編）、The Cancer Chemotherapy Handbook、第４版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９３年を参照されたい）。本明細書で提示される方法と共に用いられうる例示的な化学療法剤には、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イリノテカン、ゲムシタビン、チアゾフリン（iazofurine）、ゲムシタビン、エトポシド、ビノレルビン、タモキシフェン、バルスポダール、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ミトキサントロン、ドキシル（リポソームに封入されたドキソルビシン（doxiorubicine））、およびビノレルビンが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、さらなる治療剤を、直径が少なくとも１ｎｍ（例えば、直径が１ｎｍ〜５００ｎｍ、１ｎｍ〜３００ｎｍ、１ｎｍ〜１００ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、または１０ｎｍ〜３００ｎｍなど、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも３０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、直径が少なくとも２００ｎｍ、直径が少なくとも３００ｎｍ、直径が少なくとも５００ｎｍ、または直径が少なくとも７５０ｎｍ）のナノ粒子などのナノ粒子へと結合体化する（または他の方法でこれと会合させる）。
本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、培養で、細胞を、抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の治療剤と共にインキュベートすることにより、細胞を死滅させるのに用いることもでき、または、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および１または複数の治療剤を被験体へと投与することにより、細胞を死滅させるのに用いることもできる。例えば、処置される被験体には、治療有効量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与した後、被験体（または被験体における腫瘍または腫瘍細胞）を、治療線量で照射し、１または複数のさらなる治療剤を投与する（照射の約８時間以内など）ことができる。
一例では、標的細胞を１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させた後に、照射および、該抗体に特異的に結合する細胞表面タンパク質を発現する標的細胞を死滅させるさらなる治療剤の投与を行う。例えば、開示される方法により、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子による処置とそれに続く照射および１または複数の治療剤の投与の非存在と比べて、処置された細胞のうちの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多くを死滅させることができる。
一例では、腫瘍を有する被験体への、照射および１または複数の治療剤の投与と組み合わせた１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与により、該抗体に特異的に結合できる細胞表面タンパク質を発現する細胞を死滅させ、これにより、腫瘍を処置する。例えば、開示される方法により、腫瘍のサイズもしくは体積を低減することもでき、腫瘍の成長を遅延させることもでき、腫瘍の転移を低減または遅延させることもでき（例えば、転移の数を減少させるか、または転移の体積もしくはサイズを低減することにより）、または、これらの組合せを行うこともできる。例えば、開示される方法により、腫瘍細胞のサイズもしくは体積および／または転移性腫瘍細胞の体積（または転移性腫瘍の数）を、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与とそれに続く照射の非存在と比べて、例えば、少なくとも１０％まで、例えば、少なくとも２０％まで、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより大きく減少させることができる。加えて、開示される方法により、腫瘍と関連する症状および／または転移性腫瘍の低減が結果としてもたらされうる。一例では、開示される組成物の投与により、腫瘍の成長を、抗体−ＩＲ７００分子の投与とそれに続く照射の非存在と比べて、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより大きく遅延させる。当技術分野では、腫瘍体積／サイズ／転移をモニタリングする方法が日常的である。一部の例では、開示される方法により、被験体（腫瘍を有する被験体または腫瘍を先に除去した被験体など）の生存期間を、例えば、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与、照射、および１または複数の治療剤の投与の非存在と比べて、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより長い延長など、延長させることができる。例えば、開示される方法により、被験体の生存期間を、抗体−ＩＲ７００分子の投与、照射、および１または複数の治療剤の投与が非存在の場合における平均生存期間と比べて、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも２４カ月間、少なくとも３６カ月間またはそれより長く延長させることができる。
治療有効量の抗体−ＩＲ７００分子を投与した後で、治療有効線量の照射および１または複数の治療剤の投与を行うことにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞を選択的に死滅させることが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の重量または体積を低減させることが可能である。正常細胞と比べて腫瘍細胞の選択的な致死とは、その方法が、腫瘍細胞を、例えば、投与された抗体に特異的に結合する細胞表面タンパク質を発現してない細胞などの正常細胞より効果的に死滅させることが可能なことを意味する。
開示される方法を用いて、身体における固定腫瘍（ｆｉｘｅｄ ｔｕｍｏｒ）のほか、循環中の腫瘍（例えば、白血病細胞、転移、循環腫瘍細胞）を処置することができる。しかし、循環細胞は、それらの性質により、長期間にわたり光に曝露することができない。したがって、死滅させる細胞が、全身を循環する細胞である場合は、装着されうるデバイスまたは身体の部分を覆うするデバイスを用いることにより、本方法を達成することができる。例えば、このようなデバイスは、長期間にわたり装着することができる。ＮＩＲ発光型発光ダイオード（ＬＥＤ）およびバッテリーパックを組み込む日常的装着用品（ｅｖｅｒｙｄａｙ ｗｅａｒａｂｌｅ ｉｔｅｍ）（例えば、腕時計、装身具（ネックレスまたはブレスレットなど）、ブランケット、衣料品（例えば、下着、靴下、および靴の中敷き）、および他の日常的装着用品）を用いることができる。このようなデバイスは、長期間にわたってデバイスの下の皮膚へと光をもたらし、長期間にわたる表在性血管への光の連続的な曝露をもたらす。循環腫瘍細胞は、デバイスの下の領域を通過するときに、光に曝露される。例として述べると、このデバイスの腕時計形またはブレスレット形には、一日の大半にわたり装着される、バッテリー電源パックを有する一連のＮＩＲ ＬＥＤが含まれうる。
１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与（例えば、静脈内投与）の後、循環細胞は、抗体−ＩＲ７００コンジュゲートに結合し、ＰＩＴによる致死に対して感受性となる。これらの細胞は、日常的装着用品（例えば、ブレスレットまたは腕時計）に存在するＬＥＤと隣接する血管内を流れるので、それらはＮＩＲ光に曝露され、細胞致死に対して感受性となる。光線量は、診断および細胞型に応じて調整可能でありうる。
一部の例では、本方法が、腫瘍細胞致死などの治療をモニタリングするステップをさらに含む。このような例では、上記の通りに抗体−ＩＲ７００コンジュゲートを細胞と接触させ、細胞に照射する。しかし、より低い用量の抗体−ＩＲ７００コンジュゲートおよびより低い線量のＮＩＲ光も用いることができる（細胞致死は必要とされず、治療のモニタリングだけが必要とされうる場合）。一例では、モニタリングのために投与される抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの量が、少なくとも２分の１（治療用量の少なくとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１など）である。一例では、モニタリングのために投与される抗体−ＩＲ７００コンジュゲートの量が、治療用量より少なくとも２０％、または少なくとも２５％少ない。一例では、モニタリングのために用いられるＮＩＲ光の量が、治療線量の少なくとも１／１０００、または少なくとも１／１０，０００である。これは、処置される細胞の検出を可能とする。例えば、このような方法を用いることにより、腫瘍のサイズおよび転移をモニタリングすることができる。
一部の例では、本方法が、内視鏡手順などの手術中に有用である。例えば、上記の通りに抗体−ＩＲ７００コンジュゲートを細胞と接触させ、細胞に照射した後で、これは、細胞致死を結果としてもたらすだけでなく、外科医または他の医療ケア従事者が腫瘍の辺縁部を可視化することを可能とし、腫瘍（皮膚、乳房、肺、結腸、または前立腺の腫瘍など）の切除が完了すること、および辺縁部が無病変であることを確認する一助ともなる。一部の例では、少なくとも２分の１（治療線量の少なくとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１など）など、低用量の抗体−ＩＲ７００コンジュゲートを、可視化のために用いることができる。
リアルタイムでの細胞致死の検出またはモニタリングを可能とする方法が提供される。このような方法は、例えば、十分量の抗体−ＩＲ７００分子および／あるいは１もしくは複数の治療剤または十分量の照射を細胞または腫瘍へと送達して、細胞致死を促進することを確実にするのに有用である。これらの方法は、形態的変化が明らかとなる前に細胞致死の検出を可能とする。一例では、本方法が、細胞表面タンパク質を有する細胞を、治療有効量の、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子（１ｎＭの１または複数の抗体−ＩＲ７００分子など、０．１〜２ｎＭ、０．５〜１．５ｎＭなど、少なくとも０．０１ｎＭ、少なくとも０．１ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、または少なくとも１０ｎＭなど）と接触させるステップであって、該抗体が、細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；細胞を６６０〜７４０ｎｍの波長で少なくとも２０Ｊｃｍ−２の線量で照射するステップと；細胞に照射した後、約０〜４８時間（細胞に照射した後少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、例えば、細胞に照射した後１分間〜３０分間、１０分間〜３０分間、１０分間〜１時間、１時間〜８時間、６時間〜２４時間、または６時間〜４８時間など）に、蛍光寿命イメージングで細胞を検出し、これにより、細胞致死をリアルタイムで検出するステップとを含む。ＦＬＴの短縮は、ＰＩＴにより誘導される急性膜損傷の指標として働く。したがって、細胞に、ＩＲ７００ ＦＬＴを少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％など、少なくとも２５％短縮するのに十分な条件下で照射する。一例では、細胞に、６６０ｎｍ〜７４０ｎｍ（６８０ｎｍ〜７００ｎｍなど）の波長で３０〜５０Ｊｃｍ−２など、少なくとも４０Ｊｃｍ−２、または少なくとも５０−２Ｊｃｍ−２、または少なくとも６０Ｊｃｍ−２など、少なくとも２０Ｊｃｍ−２、または少なくとも３０Ｊｃｍ−２の線量で照射する。
一部の例では、細胞致死をリアルタイムで検出する方法が、例えば、細胞に照射した後、約０〜８時間に、細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させるステップを含む。リアルタイムのイメージングは、細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させるステップの前または後に行うことができる。例えば、リアルタイムのイメージングにより決定される通り、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与した後に不十分な細胞致死が生じる場合は、これらの細胞を１または複数のさらなる治療剤と接触させることができる。しかし、一部の例では、細胞致死をリアルタイムで検出する前に、細胞を抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤と接触させる。
例示的な細胞
標的細胞は、腫瘍細胞など、所望でないかまたはその成長が所望でない細胞でありうる。細胞は、培養で成長する場合もあり、がんを有する患者など、処置される哺乳動物に存在する場合もある。任意の標的細胞を、特許請求される方法で処置することができる。一例では、標的細胞が、他の正常（所望の）細胞の表面では実質的に見出されない細胞表面タンパク質を発現し、このようなタンパク質に特異的に結合する抗体を選択し、かつ、このタンパク質に対する抗体−ＩＲ７００分子を生成することができる。一例では、細胞表面タンパク質が、腫瘍特異的タンパク質である。一例では、細胞表面タンパク質が、望ましくない移植片拒絶と関連する細胞を標的とするのに用いうるＣＤ２５である。
一例では、腫瘍細胞が、がんを有する患者における細胞などのがん細胞である。開示される方法により死滅させうる例示的な細胞には、以下の腫瘍：急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病）を含めた白血病などの液性腫瘍の細胞が挙げられる。別の例では、細胞が、肉腫および癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌（hepatocellular carcinomna）、肺がん、結腸直腸がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部、または食道の腺癌）、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌、ＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）などの固形腫瘍細胞である。
例示的な被験体
一部の例では、開示される方法を用いて、本明細書に記載される腫瘍などの腫瘍を有する被験体を処置する。一部の例では、外科的または化学的に除去されるなど、腫瘍が先に処置されており、その後、開示される方法を用いて、患者に残存しうる任意の望ましくない残存腫瘍細胞を死滅させる。
開示される方法を用いて、がんなどの腫瘍を有するヒト、またはこのような腫瘍を先に除去または処置したことのあるヒトなど、任意の哺乳動物被験体を処置することができる。開示される療法を必要とする被験体には、がん細胞が、それらの表面で、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる腫瘍特異的タンパク質を発現するがんを有するヒト被験体が含まれうる。例えば、開示される方法を、がんに対する初期処置として、単独で、または放射線療法または他の化学療法と組み合わせるかのいずれかで用いることもできる。開示される方法はまた、以前の放射線療法または化学療法が失敗した患者においても用いることができる。したがって、一部の例では、被験体が、他の療法を施されたが、これらの他の療法が所望の治療応答をもたらさなかった被験体である。開示される方法はまた、限局性がんおよび／または転移性がんを有する患者においても用いることができる。
一部の例では、本方法が、抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる細胞表面タンパク質（腫瘍特異的タンパク質など）を発現する腫瘍を有する被験体を選択するステップなど、開示される療法から利益を得る被験体を選択するステップを含む。例えば、被験体が、ＨＥＲ２を発現する乳癌を有すると決定された場合、この被験体を選択して、実施例１に記載されるＴｒａ−ＩＲ７００など、抗ＨＥＲ２−ＩＲ７００分子で処置し、その後、この被験体を、本明細書に記載される通りに照射することができる。
例示的な細胞表面タンパク質
一例では、死滅させる標的細胞の細胞表面のタンパク質が、他の細胞に相当量は存在しない。例えば、細胞表面タンパク質は、標的細胞型だけに見出される受容体でありうる。
特定の例では、細胞表面タンパク質が、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー（例えば、ＨＥＲ１、２、３、および４）およびサイトカイン受容体のメンバー（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ５２など）など、腫瘍特異的タンパク質（当技術分野ではまた、腫瘍特異的抗原としても公知）である。腫瘍特異的タンパク質とは、がん細胞に固有であるか、または、正常細胞など、他の細胞と比較して、がん細胞でより豊富なタンパク質である。例えば、ＨＥＲ２が、乳がんに主に見出されるのに対し、ＨＥＲ１は、膵臓、乳房、前立腺、および結腸など、多くの器官に見出されうる腺癌に主に見出される。
標的細胞（そして、この標的細胞に対する抗体−ＩＲ７００分子を製剤化するのに、このタンパク質に特異的な抗体を用いることができる）に見出されうる例示的な腫瘍特異的タンパク質には、ＭＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７４８１およびＡＡＡ０３２２９）、ＭＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１８９２０およびＡＡＡ１７７２９）、ＭＡＧＥ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０３７３５およびＡＡＡ１７４４６）、ＭＡＧＥ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３２０７５およびＡ０６８４１．１）などを含めた様々なＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか；様々なチロシナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１８７３およびＡＡＢ６０３１９）のうちのいずれか；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４１５６、ＣＡＡ３８０９５、およびＡＡ４９４３１１）；ｐ９７黒色腫抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２１５４およびＡＡＡ５９９９２）；乳房腫瘍と関連するヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ５６１５１およびＡＡＢ１９７７１）；ＢＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０７２）およびＢＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２４８２およびＮＰ＿８７２２８８）を含めた様々なＢＡＧＥ（ヒトＢ型黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか；ＧＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０６５）、またはＧＡＧＥ２〜６うちのいずれかを含めた様々なＧＡＧＥ（Ｇ抗原）のうちのいずれか；様々なガングリオシド；ＣＤ２５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４０８．１およびＮＭ＿０００４１７．２）が挙げられるがこれらに限定されない。
他の腫瘍特異的抗原には、子宮頸がんと関連するＨＰＶ １６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ＦＪ９５２１４２．１、ＡＤＢ９４６０５、ＡＤＢ９４６０６、およびＵ８９３４９）、乳癌と関連するムチン（ＭＵＣ １）−ＫＬＨ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３６５１およびＡＡＡ３５７５６）、結腸直腸がんと関連するＣＥＡ（がん胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８３１１およびＣＡＡ６６９５５）、例えば、黒色腫と関連するｇｐ１００（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３およびＡＡＣ６０６３４）、黒色腫と関連するＭＡＲＴ１抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５０２）、卵巣がんおよび他のがんと関連するがん抗原１２５（ＣＡ１２５、また、ムチン１６またはＭＵＣ１６としても公知）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４６９０およびＮＰ＿０７８９６６）；肝臓がんと関連するアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３４およびＮＰ＿００１１２５）；結腸直腸がん、胆道がん、乳がん、小細胞肺がん、および他のがんと関連するＬｅｗｉｓ Ｙ抗原；腺癌と関連する腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；および前立腺がんと関連するＰＳＡ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８１０およびＣＡＡ３２９１５）が挙げられる。
他の例示的な腫瘍特異的タンパク質には、固形腫瘍による新生血管系のほか、前立腺がんと関連するＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６０２０９およびＡＡＢ８１９７１．１）；乳がん、卵巣がん、胃がん、および子宮がんと関連するＨＥＲ−２（ヒト上皮成長因子受容体２、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１およびＡＡＡ５８６３７）、肺がん、肛門がん、および神経膠芽腫（gliobastoma）のほか、腺癌と関連するＨＥＲ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８およびＮＰ＿００５２１９）；黒色腫、肉腫、精巣癌、および他のがんと関連するＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８７４５９およびＡＡＢ４９６９３）、ｈＴＥＲＴ（別名、テロメラーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１９８２５３およびＮＰ＿９３７９８３（バリアント１）、ＮＭ＿１９８２５５およびＮＰ＿９３７９８６（バリアント２））；プロテイナーゼ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８、Ｘ５６６０６、ＣＡＡ３９９４３およびＡＡＡ３６３４２）、およびウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３７８およびＮＰ＿０００３６９（バリアントＡ）、ＮＭ＿０２４４２４およびＮＰ＿０７７７４２（バリアントＢ）、ＮＭ＿０２４４２５およびＮＰ＿０７７７４３（バリアントＣ）、ならびにＮＭ＿０２４４２６およびＮＰ＿０７７７４４（バリアントＤ））がさらに挙げられるがこれらに限定されない。
一例では、腫瘍特異的タンパク質が、慢性リンパ性白血病と関連するＣＤ５２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ２７４９５．１およびＣＡＩ１５８４６．１）；急性骨髄性白血病と関連するＣＤ３３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２３０６８およびＣＡＤ３６５０９．１）；および非ホジキンリンパ腫と関連するＣＤ２０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７６９ ＮＰ＿０３１６６７）である。
したがって、開示される方法を用いて、腫瘍特異的タンパク質を発現する任意のがんを処置することができる。
例示的な抗体−ＩＲ７００分子
細胞表面タンパク質配列は、公開されている（例えば、上記で示される通り）ため、このようなタンパク質に特異的な抗体（またはＩＲ７００へと結合体化しうる他の低分子）を作製または購入することは、日常的であることを、当業者は認識する。例えば、腫瘍特異的タンパク質ＨＥＲ２を標的として選択する場合は、ＨＥＲ２に特異的な抗体（トラスツズマブなど）を購入するかまたは生成させ、ＩＲ７００色素へと接合させることができる。一例では、患者を、少なくとも２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子で処置する。一例では、２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子が、同じタンパク質（ＨＥＲ−２など）に特異的であるが、このタンパク質の異なるエピトープ（ＨＥＲ−２のエピトープ１およびエピトープ２など）に特異的である。別の例では、２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子が、例えば、Ｔ細胞白血病を処置するのに用いうる、ＣＤ４に特異的である１つの抗体およびＣＤ２５に特異的である別の抗体など、２つの異なるタンパク質または抗原に特異的である。例えば、抗ＨＥＲ１−ＩＲ７００および抗ＨＥＲ２−ＩＲ７００を、カクテルとして併せて注射すれば、ＨＥＲ１またはＨＥＲ２のいずれかを担持する細胞の致死を容易としうる。以下の表では、他の特定の例が提示される。一例では、抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である。抗体−ＩＲ７００分子は、下記の実施例１に記載される方法など、日常的な方法を用いて生成させることができる。したがって、本開示はまた、抗体−ＩＲ７００分子、このような分子を含む組成物、およびこのような分子を含むキットも提供する（例えば、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子、および化学療法剤、もしくは分子標的化剤、またはこれらの組合せを含むキット）。


また、ＩＬ−２Ｒα受容体（ＣＤ２５）を標的とするバシリキシマブまたはダクリズマブを用いて、移植片拒絶を処置するための抗体−ＩＲ７００分子も生成することができる。
抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤の投与
抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤（抗新生物剤など）は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を、細胞が成長する（ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｏｒ ｇｒｏｗｉｎｇ）成長培地に添加することにより、細胞と接触させることもでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を、処置される被験体へと投与することにより、細胞と接触させることもできる。
抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、例えば、がんなどの腫瘍を有する被験体、または腫瘍を先に除去した（例えば、手術を介して）被験体へと、局所投与することもでき、全身投与することもできる。特定の例が提示されるが、当業者は、開示される抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤の代替的投与法を用いうることを十分に理解する。このような方法には、例えば、数時間〜数日間の期間にわたり、処置を必要とする被験体への連続注入をもたらすためのカテーテルまたは植込み式ポンプの使用が含まれうる。
一例では、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を、腫瘍への直接の直接の注射または注入（腫瘍内注射または腫瘍内注入）を含めた非経口的手段により投与する。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を腫瘍へと適用することにより、例えば、腫瘍を、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を含有する溶液に浸すことにより、または抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を腫瘍に注ぐことにより、抗体−ＩＲ７００分子およびさらなる治療剤を腫瘍へと投与する。
加えて、または代替的に、開示される組成物は、腫瘍（がんなど）を有する被験体へと全身投与、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、または経口投与することができる。
被験体に投与される抗体−ＩＲ７００分子（およびさらなる治療剤）の投与量は、絶対的な制限を受けるわけではなく、組成物およびその有効成分の性質、ならびにその有害な副作用（例えば、抗体に対する免疫応答）、処置される被験体および処置される状態の種類、ならびに投与様式に依存する。一般に用量とは、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズ（例えば、体積および／または重量）を低減するか、またはさらなる腫瘍の成長を減弱させるか、または腫瘍の望ましくない症状を低減するのに有効な量などの治療有効量である。当技術分野では、さらなる治療剤の投与量が公知である。
抗体−ＩＲ７００分子を静脈内投与する場合、単回の処置で被験体へと投与するための例示的な投与量は、体重６０ｋｇ当たり０．５〜１００ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜５０ｍｇ、体重６０ｋｇ当たり１〜２０ｍｇの範囲であることが可能であり、例えば、体重６０ｋｇ当たり約１または２ｍｇでありうる。さらに別の例では、腹腔内投与または腫瘍内投与される抗体−ＩＲ７００分子の治療有効量は、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇなど、体重１ｋｇに対して１０μｇ〜５０００μｇの抗体−ＩＲ７００分子で変化しうる。
一例では、ヒト患者へと投与される抗体−ＩＲ７００分子の用量が、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、なおまたは１ｇなど、少なくとも５０ｍｇである。
開示される抗体−ＩＲ７００分子（およびさらなる治療剤）による処置は、１日で完了させることもでき、複数日に同じ投与量または異なる投与量で反復的に行うこともできる。処置の反復は、同日に行うこともでき、連日に行うこともでき、１〜３日間ごとに行うこともでき、３〜７日間ごとに行うこともでき、１〜２週間ごとに行うこともでき、２〜４週間ごとに行うこともでき、１〜２カ月間ごとに行うこともでき、なお長期の間隔で行うこともできる。
細胞の照射
細胞を１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させた後に、該細胞に照射する。当技術分野では、照射法が周知である。細胞表面タンパク質を発現する細胞だけが該抗体により認識されるので、これらの細胞だけに十分量の抗体−ＩＲ７００分子が結合することになる。照射は、抗体−ＩＲ７００分子が結合する細胞だけを死滅させ、他の細胞は死滅させないので、これは、正常細胞の致死など、望ましくない副作用の尤度を低減する。
一部の例では、組織培養ディッシュ内など、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞に照射する。他の例では、例えば、抗体−ＩＲ７００分子を先に投与された被験体に照射して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞に照射する。一部の例では、被験体に照射する。例えば、被験体における腫瘍に照射することができる。
細胞は、６６０〜７００ｎｍ、６８０〜７０００ｎｍ、６７０〜６９０ｎｍ、例えば、６８０ｎｍなど、６６０〜７１０ｎｍの波長の、治療線量の放射線で照射する。特定の例では、少なくとも１０Ｊｃｍ−２、少なくとも３０Ｊｃｍ−２、少なくとも５０Ｊｃｍ−２、少なくとも１００Ｊｃｍ−２、または少なくとも５００Ｊｃｍ−２、例えば、１〜１０００Ｊｃｍ−２、１〜５００Ｊｃｍ−２、３０〜５０Ｊｃｍ−２、１０〜１００Ｊｃｍ−２、または１０〜５０Ｊｃｍ−２など、少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量で細胞に照射する。
細胞（または患者）には、１回または複数回にわたり照射することができる。したがって、照射は、１日で完了させることもでき、複数日（少なくとも２回の異なる時点、３回の異なる時点、４回の異なる時点、５回の異なる時点、または１０回の異なる時点における照射など）に、同じ投与量または異なる投与量で、反復的に行うこともできる。照射の反復は、同じ日に行うこともでき、連日に行うこともでき、１〜３日間ごとに行うこともでき、３〜７日間ごとに行うこともでき、１〜２週間ごとに行うこともでき、２〜４週間ごとに行うこともでき、１〜２カ月間ごとに行うこともでき、なお長期の間隔で行うこともできる。
ＮＩＲ ＬＥＤを含有する例示的なデバイス
身体に装着または置くことができ、ＮＩＲ ＬＥＤの組込みに適する任意の種類の品目を用いることができる。一例では、デバイスは、患者に挿入するチャンバーである。このようなデバイスを、白血病、リンパ腫など、血液またはリンパを循環する腫瘍細胞のほか、血液またはリンパに存在する転移性細胞を処置するのに用いることができる。一部の例では、このようなデバイスを、黒色腫など、皮膚に存在する腫瘍細胞を処置するのに用いることができる。
体内を循環する全ての細胞を死滅させるためには、数週間または数カ月間など、長期間にわたりデバイスを装着することが必要でありうる。したがって、これらのデバイスは、日常的衣料品、装身具、およびブランケットなどの寝具へと組み込むことができる。これらのデバイスは、処置が個人性を保持し、日常的活動に干渉しないように、携帯型の日常的衣料品および装身具を用いて、患者をＮＩＲ光に曝露することを可能とする。例えば、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込むネックレスは、昼間に、ＰＩＴ療法（例えば、頸動脈および頸部における他の血管系を介して通過する腫瘍細胞を死滅させることにより）のために患者の趣味に合わせてカスタマイズ可能であり、目立たないように装着することが可能である。類似の「日常的」という特徴を有する複数のデバイス（ブランケット、ブレスレット、ネックレス、下着、靴下、および靴の中敷きなど）であれは、処置期間中、同じ患者により装着されうる。例えば、睡眠中に、患者は、ＮＩＲブランケットを用いうる。デバイスはまた、バッテリーなどの電源、ブランケットのようなデバイスなどの過剰加熱を防止する冷却用エレメントも含みうる。
一例では、デバイスが、指輪、時計、ブレスレット、またはネックレスなど、装身具である。別の例では、品目が、シャツ、ベルト、ズボン、下着、靴下、コート、靴の中敷き、スカーフ、帽子、リストサポーター、および手袋などのような衣料品またはアクセサリーである。別の例では、デバイスが、ブランケットまたはタオルなど、身体を覆うことができる品目である。別の例では、デバイスが、皮膚を直接曝露する全身用光チャンバーである（このようなデバイスにはまた、電源および／または冷却源も含まれ得る）。
１または複数のＮＩＲ ＬＥＤ（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも５０のＮＩＲ ＬＥＤなど）を組み込むデバイスを装着することにより、血液またはリンパに存在する、死滅させるべき腫瘍細胞または他の細胞は、ＮＩＲ ＬＥＤ（６７０〜７００ｎｍまたは６８０〜７２０ｎｍなど、６６０〜７４０ｎｍで発光するＮＩＲ ＬＥＤなど）により生成する光に曝露される。ＮＩＲ ＬＥＤから発光した光は、皮膚および血管（頸動脈または皮膚内の微小血管系など）を透過し、したがって、光が、標的細胞へと結合した抗体−ＩＲ７００分子を活性化し、したがって、抗体−ＩＲ７００分子が結合した細胞を死滅させることを可能としうる。ＮＩＲ ＬＥＤは、皮膚または血管またはリンパ系を標的にすることを確実にするようにデバイスに配置することができる。
本明細書で提示される方法において用いうるＮＩＲ ＬＥＤデバイスは、市販されている。１つの製造元であるＭａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ製の適用可能な製品を下記に列挙する。第１の製品であるｍｏｌｄｅｄ ＬＥＤは、低出力であるが、より長い曝露時間にわたり用いうる。他の選択肢は、出力がより大きく、したがって、さらなる冷却のための備品から利益を得る可能性がある。２５ｍｍ×１８ｍｍの金属ケースに収納される最後の１品を除き、他の品は、ブレスレット、ネックレス、下着、靴下、手袋、帽子、および他の装着用品などの装着用デバイスに適用可能である。全ての品は、ブランケット、携帯用デバイス、またはチャンバーで用いることができる。
例えば、Ｍａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（tech-led.com/index.shtml）は、照射パターンを設定するためのレンズオプションを伴う以下のＮＩＲ ＬＥＤ：直径が５ｍｍで、総放射出力が４ｍＷであり、計算出力密度（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｐｏｗｅｒ ｄｅｎｓｉｔｙ）が５ｍＷｃｍ−２であり、出力要件（ｐｏｗｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）が１．８Ｖ ２０ｍＡであるＭｏｌｄｅｄ ＬＥＤ（www.tech-led.com/data／L680-AU.pdf）；３．５ｍｍ×２．７ｍｍで、総放射出力が３ｍＷであり、計算出力密度が３２ｍＷｃｍ−２であり、出力要件が１．９Ｖ ５０ｍＡであるＳｕｒｆａｃｅ Ｍｏｕｎｔ ＬＥＤ；７．６ｍｍ×７．６ｍｍで、総放射出力が２０〜５２ｍＷであり、計算出力密度が３４〜９０ｍＷｃｍ−２であり、出力要件が１．６５Ｖ １００ｍＡであるＳｕｐｅｒ Ｂｅａｍ（tech-led.com/Superbeam_LEDs.shtml）；５ｍｍ×５ｍｍまたは直径７ｍｍで、総放射出力が９０ｍＷであり、計算出力密度が３６０ｍＷｃｍ−２であり、出力要件が２．４Ｖ ５００ｍＡであるＨｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｕｎｔ（tech-led.com/SMB_BL_LEDs.shtml）；および２５ｍｍ×１８ｍｍで、総放射出力が１５０ｍＷであり、計算出力密度が３３ｍＷｃｍ−２であり、出力要件が１０Ｖ １２０ｍＡであるＨｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒｓ（tech-led.com/High_Power_Illuminators.shtml）を提供している。代替的に、６９０ｎｍの、類似する出力で、短く強力な間欠パルスを伴う光を発光するデバイスも作製することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験では、出力密度が２．２ｍＷｃｍ−２（または２．２ｍＪ秒−１ｃｍ−２）であるＮＩＲ光により細胞死を誘導した。組織についての減衰係数を４ｃｍ−１と推定すると、光の強度は、５．８ｍｍでは１０％まで、１２ｍｍでは１％まで低下する。これは、ｉｎ ｖｉｖｏの適用に必要とされる出力密度が、１０〜１００倍である必要があることを示す。すなわち、一部の例のＮＩＲ ＬＥＤデバイスにより発光される光線量は、少なくとも５０ｍＷｃｍ−２、少なくとも１００ｍＷｃｍ−２、少なくとも１５０ｍＷｃｍ−２、少なくとも２００ｍＷｃｍ−２、または少なくとも３００ｍＷｃｍ−２など、少なくとも２０ｍＷｃｍ−２である。複数のＮＩＲ ＬＥＤを二次元アレイに配列して、大きな面積を適用範囲とすることができる。一例では、レーザーを、ＬＥＤに対する代替物としてのＮＩＲ光供給源として用いる。
ＮＩＲ ＬＥＤには、電源（直接的または間接的にデバイスの一部でありうる）を用いることにより電力供給することができる。電源の要件は、デバイスにおけるＬＥＤの数に依存する。例えば、１または複数のバッテリーを用いて、ＮＩＲ ＬＥＤに電力供給することができる。一部のＬＥＤでは、４つのＡＡバッテリーで、３つの直列ＬＥＤに電力供給することができる。アルカリＡＡバッテリーは、最大３０００ｍＡｈの定格であるので、この構成により、２０、５０、および１００ｍＡで最長１５０、６０、および３０時間にわたる電力が供給される。
一部の例では、デバイスが、冷却用デバイス（直接的または間接的にデバイスの一部でありうる）をさらに含む。例えば、受動冷却または能動冷却のために熱だめを用いることができる。別の代替法は、熱電効果（ペルチエ効果）である。これならば、さらなる電力を消費するが、出力要件が差込み式のＡＣアダプターを必要とする適用でも用いることができる。
開示される方法と共に用いられうる別の種類のデバイスは、ＮＩＲ ＬＥＤを伴う閃光様デバイスである。このようなデバイスは、手術中における病変の限局的治療のために用いることもでき、ＰＩＴ剤の投与後、ＮＩＲ光を体表面へと適用するように内視鏡へと組み込むこともできる。このようなデバイスは、医師または有資格の保健従事者が用いることにより、身体の特異的な標的に対する処置に向けることができる。
装着用ＮＩＲ ＬＥＤを用いる処置
本明細書に記載される通り、開示される方法は、がん細胞に高度に特異的である。しかし、体内を循環するかまたは皮膚に存在する細胞を死滅させるために、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込むデバイスを装着することができる。一部の例では、患者が、少なくとも２つのデバイス、例えば、昼間における衣料品または装身具、および夜間におけるブランケットを用いる。一部の例では、患者が、少なくとも２つのデバイス、例えば、２つの衣料品を同時に用いる。これらのデバイスは、処置が個人性を維持し、日常的活動に干渉しないように、日常携帯型の衣料品および装身具を用いて、患者を、ＮＩＲ光に曝露することを可能とする。一部の例では、デバイスを、ＰＩＴ療法のために、昼間に目立たないように装着することができる。
一例では、本明細書に記載される方法を用いて、患者に、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与する。次いで、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込むデバイスを装着し、血液もしくはリンパに存在するかまたは皮膚に存在する腫瘍細胞の、長期にわたる治療および処置を可能とする。一部の例では、線量が、少なくとも少なくとも１Ｊｃｍ−２、少なくとも１０Ｊｃｍ−２、少なくとも２０Ｊｃｍ−２、または少なくとも３０Ｊｃｍ−２、例えば２０Ｊｃｍ−２もしくは３０Ｊ／ｃｍ２である。一部の例では、抗体−ＩＲ７００分子の投与が、ある期間にわたり反復される（治療レベルが身体において存在することを確実にするために、隔週または毎月など）。
一部の例では、患者が、デバイスまたはデバイスの組合せを、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも４カ月間、少なくとも６カ月間、なおまたは少なくとも１年間にわたり装着するかまたは用いる。一部の例では、患者が、デバイスまたはデバイスの組合せを、１日少なくとも４時間、例えば１日少なくとも１２時間、１日少なくとも１６時間、１日少なくとも１８時間、または１日２４時間にわたり装着するかまたは用いる。処置期間中には、同じ患者が、類似の「日常的」という特徴を有する複数のデバイス（ブランケット、ブレスレット、ネックレス、下着、靴下、靴の中敷き）を装着しうることが十分可能である。夜間には、患者が、ＮＩＲ ＬＥＤブランケットまたは他の被覆品を用いうる。
さらなる処置
上記で論じた通り、１または複数の抗体−ＩＲ７００分子の投与前、投与中、または投与後に、被験体に対し、１または複数の他の療法を施すことができる。一例では、被験体に、１または複数の処置を施して腫瘍を除去または減らし、その後に抗体−ＩＲ７００分子を投与する。
開示されるＰＩＴ法と組み合わせて用いうる療法であって、該ＰＩＴ後約８時間にわたり、さらなる治療剤への腫瘍の接触可能性を増強する療法の例は、腫瘍を除去または減らすための外科的処置（外科的切除、寒冷療法、または化学塞栓術など）のほか、放射性治療剤、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤、ならびに他の作用物質が含まれうる抗腫瘍の薬学的処置であるがこれらに限定されない。一部の例では、さらなる治療剤を、ナノ粒子へと結合体化する。用いうるさらなる治療剤の特定の例には、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤またはＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、および遺伝子調節剤が挙げられる。これらの作用物質（治療有効量で投与される）および処置は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。このような作用物質の方法および治療投与量は、当業者に公知であり、熟練した臨床家により決定されうる。
「微小管結合剤」とは、チューブリンと相互作用して、微小管形成を安定化させるか、または微小管形成の安定化を解除し、これにより、細胞分裂を阻害する作用物質を指す。開示される抗体−ＩＲ７００分子療法と共に用いうる微小管結合剤の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、およびリゾキシンが挙げられるが、それらに限定されない。また、このような化合物の類似体および誘導体も用いることができ、当業者にはこれらが公知である。例えば、適切なエポチロンおよびエポチロン類似体は、国際公開第ＷＯ２００４／０１８４７８号に記載されている。パクリタキセルおよびドセタキセルのほか、米国特許第６，６１０，８６０号；同第５，５３０，０２０号；および同第５，９１２，２６４号により教示されるパクリタキセルの類似体などのタキソイドを用いることができる。
以下のクラスの化合物は、本明細書で開示されるＰＩＴ法と共に用いることができる。アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない適切なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写調節剤は、開示される療法と組み合わせた使用にもまた適する。被験体に投与しうるＤＮＡ挿入剤およびＤＮＡ架橋形成剤には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない。治療剤としての使用に適するＤＮＡ合成阻害剤には、メトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、およびこれらの類似体が挙げられるが、それらに限定されない。適切な酵素阻害剤の例には、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられるが、それらに限定されない。遺伝子調節に影響を及ぼす適切な化合物には、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン、ならびにこれらの誘導体および類似体など、１または複数の遺伝子の発現の増大または低減を結果としてもたらす作用物質が挙げられるが、それらに限定されない。キナーゼ阻害剤には、成長因子のリン酸化および活性化を防止するＧｌｅｅｖａｃ、Ｉｒｅｓｓａ、およびＴａｒｃｅｖａが挙げられる。
また、他の治療剤、例えば、上記分類のうちの１または複数の下に収まる場合もあり、収まらない場合もある抗腫瘍作用物質も、開示されるＰＩＴ療法と組み合わせた投与に適する。例を目的として述べると、このような作用物質には、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジン、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられる。
一部の例では、治療抗体−ＩＲ７００分子の組成物を施される被験体に、例えば、静脈内投与を介して、インターロイキン２（ＩＬ−２）もまた投与する。特定の例では、ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を、静脈内ボーラスとして、少なくとも５００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で、ペプチド投与の翌日から始めて８時間ごとに１５分間にわたり投与し、最長５日間にわたり継続する。投与は、被験体の忍容性に応じて省略することができる。
一部の例では、開示される抗体−ＩＲ７００分子を、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４に対する完全ヒト抗体（抗ＣＴＬＡ−４）と共に共投与する（または照射直前もしくは直後に投与する）ことができる。一部の例では、被験体に、少なくとも１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４（３週間ごとに３ｍｇ／ｋｇ、または初期用量として３ｍｇ／ｋｇ、その後３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇへと用量を減少させるなど）を施す。
一例では、開示される療法を施す（抗体−ＩＲ７００分子の投与など）前に、腫瘍の少なくとも一部（転移性腫瘍など）を外科的に除去する（例えば、寒冷療法を介して）か、照射するか、化学的に処置する（例えば、化学塞栓術を介して）か、またはこれらの組合せを施す。例えば、転移性腫瘍を有する被験体は、開示される療法を施す前に、腫瘍の全部または一部を、外科的に切除することができる。ある例では、１または複数の化学療法剤を、抗体−ＩＲ７００分子および照射による処置の後に投与する。別の特定の例では、被験体が転移性腫瘍を有し、放射線療法、化学塞栓療法、またはこれらの両方が、開示される療法の投与と併せて投与される。
（実施例１）
ＩＲＤｙｅ ７００と結合体化したトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）の合成
この実施例では、モノクローナル抗体トラスツズマブを、ＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒへと結合体化するのに用いられる方法について記載する。当業者は、標的細胞表面タンパク質に特異的な任意のモノクローナル抗体など、任意の抗体を、同様の方法を用いてＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒへと結合体化しうることを認識する。
ヒト化抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（Ｔｒａ；Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）（１ｍｇ、６．８ナノモル（ｎｍｏｌ））を、０．１モル／ＬのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）中のＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ＩＲ７００；ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）（ＤＭＳＯ中６６．８μｇ、３４．２ナノモル、５ミリモル／Ｌ）と共に、室温で３０〜１２０分間にわたりインキュベートした。トラスツズマブとは、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）２（ＨＥＲ２）チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインに対して指向する組換えヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。混合物は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した。タンパク質濃度は、５９５ｎｍにおける吸収を、紫外−可視システム（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で測定することにより、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で決定した。ＩＲ７００の濃度は、紫外−可視システムによる吸収によって測定して、各トラスツズマブ分子へと結合体化したフルオロフォア分子の数を確認した。トラスツズマブ１つ当たりのＩＲ７００の数は、約３であった。
Ｔｒａ−ＩＲ７００コンジュゲートの純度は、解析的サイズ除外ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、３２ Ｋａｒａｔソフトウェアにより制御される、モデル１２６溶媒送達モジュール、モデル１６８ＵＶ検出器、およびＪＡＳＣＯ蛍光検出器（励起：６８９ｎｍおよび発光：７００ｎｍ）を装備した、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて実施した。ＳＥクロマトグラフィーは、０．５ｍＬ／分のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を用いて４５分間にわたり溶出される、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）で実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、勾配４％〜２０％のポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により実施した。タンパク質を分離した直後、蛍光強度を、励起については６７０ｎｍの内部レーザーおよび発光については７０５ｎｍのロングパスフィルターを用いるＦｕｊｉｆｉｌｍ ＦＬＡ−５１００蛍光スキャナー（Ｖａｌｈａｌｌａ、ＮＹ）で解析した。各バンドの蛍光強度は、Ｍｕｌｔｉｇａｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で解析した。次いで、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、デジタル走査した。各バンド内のタンパク質濃度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで解析した。トラスツズマブ−ＩＲ７００（Ｔｒａ−ＩＲ７００）調製物およびパニツムマブ−ＩＲ７００（Ｐａｎ−ＩＲ７００；実施例８を参照されたい）調製物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される通り、強力な会合を実証し、検出可能なＭＡｂ凝集物を含有しなかった。
ＩＲ７００コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合特徴を決定するために、このコンジュゲートの、Ｉｎｄｏ−Ｇｅｎによる手順を用いる１２５Ｉ標識化を実施した。放射性標識された抗体の比活性は、トラスツズマブが８．５２ｍＣｉ／ｍｇであり、パニツムマブが７．８４ｍＣｉ／ｍｇであった（下記の実施例８を参照されたい）。各ＭＡｂコンジュゲートのそれぞれにより、７３．３８±０．３９％（１２５Ｉ−Ｔｒａ−ＩＲ７００）および７８．６１±０．８９％（１２５Ｉ−Ｐａｎ−ＩＲ７００）の結合が達成されることが観察され、結合の特異性も、過剰な天然の非結合体化ＭＡｂでブロッキングする（１．４％未満）ことにより確認した。同じ方法で測定された１２５Ｉ−Ｔｒａおよび１２５Ｉ−Ｐａｎの免疫反応性が、それぞれ、７８±２％および８２±３％であったので、ＩＲ７００コンジュゲーションによるＭＡｂの喪失が最小限であることが確認された。免疫反応性アッセイは、既に記載されている通りに実施した。略述すると、トリプシン処理の後、２×１０６個の３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞またはＡ４３１細胞を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳに再懸濁させた。１２５Ｉ−Ｔｒａ−ＩＲ７００または１２５Ｉ−Ｐａｎ−ＩＲ７００（１ｍＣｉ、０．２μｇ）を添加し、氷上で１時間にわたりインキュベートした。細胞を洗浄し、ペレット化し、上清をデカントし、２４７０ Ｗｉｚａｒｄ２γカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ）によりカウントした。細胞に対する非特異的結合を抗体過剰の条件下（２００μｇの標識されていないトラスツズマブまたはパニツムマブ）で調べた。
（実施例２）
ＨＥＲ２＋細胞の選択的致死
この実施例では、実施例１に記載されるトラスツズマブ−ＩＲ７００化合物（本明細書ではＴｒａ−ＩＲ７００と称する）を用いて、ＨＥＲ２を発現する（ＨＥＲ２＋）細胞を選択的に死滅させるが、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）細胞に対する負の作用は最小限としうることを示すのに用いられる方法について記載する。
ＨＥＲ２遺伝子でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３／ＨＥＲ２＋）細胞を、光力学療法（ＰＤＴ）の標的に用いた。対照としては、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質は発現するが、ＨＥＲ２は発現しないＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ）を使用した。細胞は、９５％の空気および５％の二酸化炭素の雰囲気下、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコの中の１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０で成長させた。
蛍光顕微鏡検査は、ＢＸ５１顕微鏡またはＩＸ８１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で実施した。ＩＲ７００を検出するためのフィルターを設置したが、これは、５９０〜６５０ｎｍの励起フィルター、および６６５〜７４０ｎｍの帯域発光フィルターからなった。ＤｓＲｅｄタンパク質を検出するために、４８０〜５５０ｎｍの励起フィルター、および５９０ｎｍのロングパス発光フィルターからなるフィルターセットを使用した。
蛍光顕微鏡検査を実施して、３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞におけるＩＲ７００の細胞内局在化について調べた。細胞を底部がカバーガラスのディッシュ（ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｄｉｓｈ）上に播種し、２４時間にわたりインキュベートした。Ｔｒａ−ＩＲ７００を、１０μｇ／ｍＬで培養培地に添加した。図１ａに示される通り、Ｔｒａ−ＩＲ７００は、氷上で１時間にわたるインキュベーション後に細胞表面に検出され、３７℃でのインキュベーションの６時間後に、主に、リソソームに局在化したことから、緩やかな内部移行が示された。４２０〜４８０ｎｍの励起フィルター、および５２０ｎｍのロングパス発光フィルターからなるフィルターセットにより検出される、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）による共染色は、ＩＲ７００のエンドリソソーム区画との共局在化を明らかにした（図１ｂ）。Ｔｒａ−ＩＲ７００とのインキュベーションの１時間後および６時間後に、励起光（蛍光顕微鏡；２．２ｍＷｃｍ−２の出力密度）は、蛍光のほか、壊死性細胞死を表す細胞の腫脹、ブレブ形成、および小胞の破裂を誘導した（図１ｃ）。
光免疫療法（ＰＩＴ）のために、細胞を、３５ｍｍの底部がカバーガラスのディッシュ上に播種し、２４時間にわたりインキュベートした。培地を、Ｔｒａ−ＩＲ７００を１０μｇ／ｍＬで含有する新鮮な培養培地で置きかえ、３７℃で６時間にわたりインキュベートした。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した後、培養培地をフェノールレッド非含有培地で置きかえた。赤色発光ダイオード（ＬＥＤ；ＦｌｕｏｒＶｉｖｏ；ＩＮＤＥＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｃａｐｉｔｏｌａ、ＣＡ）を用いて、細胞を６７０ｎｍ〜６９０ｎｍの、出力密度が光出力計（ＰＭ １００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）で測定される場合に２．６ｍＷｃｍ−２の光で照射した。細胞生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による処理の１時間後に評価した。処理の後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。緑色蛍光反応色素を細胞懸濁液に添加し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で細胞を解析した。
図１ｃに示される通り、３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞に対する１．０Ｊｃｍ−２での照射は、細胞膜の突出（ｂｕｄｄｉｎｇ）および腫脹を表す、迅速な壊死性細胞死を結果としてもたらした。
（実施例３）
照射線量の同定
異なる線量の光の照射に応答した光毒性を決定するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを用いて、ＰＤＴで処理した３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞を、フローサイトメトリーによりアッセイした。膜が損傷した細胞を検出しうるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイは、処理後１時間以内に実施した。図１ｄに示される通り、Ｔｒａ−ＩＲ７００媒介ＰＤＴに応答した細胞死は、ＰＩＴの１時間後において光線量依存的であった。ＰＩＴなしの細胞やＴｒａ−ＩＲ７００なしの細胞は、顕著な光毒性を示さなかった。
（実施例４）
経時的な細胞生存率の測定
細胞生存率を経時的にモニタリングするために、細胞を標識し、実施例２に記載される通りこれらに照射し、次いでその後、実施例２に記載される通りに顕微鏡検査を行なって、これらを経時的に（５日間にわたり）モニタリングした。
図１ｆに示される通り、光毒性による細胞死は、Ｔｒａ−ＩＲ７００で処理した３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞のみに観察されたが、非照射群（ＰＩＴなし）や照射したがＴｒａ−ＩＲ７００は施さなかった群（Ｔｒａ−ＩＲ７００なし）では観察されなかった。
（実施例５）
Ｔｒａ−ＩＲ７００の標的特異的な光毒性
ＰＩＴは、実施例２に記載される通りに実施した。図１ｇに示される通り、Ｔｒａ−ＩＲ７００との１時間のインキュベーションと６時間のインキュベーションとの間では、光毒性に有意差がなかったことから、Ｔｒａ−ＩＲ７００の膜結合は、細胞死を誘導するのに十分であったことが示された。Ｔｒａ−ＩＲ７００は、エンドリソソーム区画に局在して（図１ｂ）、照射後における細胞の腫脹およびブレブ形成を伴う小胞の破裂もまた誘導した。しかし、これは、細胞死の主要な原因ではないようであった。なぜなら、細胞死は、４℃でのインキュベーションの１時間以内にＴｒａ−ＩＲ７００のエンドリソソームへの局在化を伴わずに観察されたからであった。照射の前に細胞を洗浄しなくとも光毒性効果には影響が及ばなかったことから、コンジュゲートの存在だけでなく、細胞膜の結合性も、コンジュゲートの光毒性効果に重要であることが示された。さらに、ＩＲ７００色素単独（２００ｎＭ；Ｔｒａ−ＩＲ７００コンジュゲートと同等なＩＲ７００濃度）は、細胞へと取り込まれないし、細胞における光毒性も誘導しなかった（図１ｈおよび図２ｂ）。加えて、光毒性は、過剰な非結合体化トラスツズマブにより用量依存的に阻止された（図２ｃおよび２ｄ）。さらに、Ｔｒａ−ＩＲ７００は、Ａ４３１細胞に対して治療効果を誘導しなかった。（図１ｉ）。これらの結果により、細胞死は、Ｔｒａ−ＩＲ７００の特異的な膜結合に依存することが確認される。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、従来のＰＤＴと関連する細胞死に関与している。Ｔｒａ−ＩＲ７００による光毒性の生成における、フォトンに誘導される酸化還元反応（例えば、一重項酸素（１Ｏ２））の役割を明らかにするため、細胞に照射するときに、酸化還元クエンチャーであるアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を培地に添加した。細胞死の百分率は、アジ化ナトリウムの存在下で、用量依存的な様式で、部分的に低減した（図１ｊ）。
光毒性が標的特異的であることを確認するために、３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞およびＢａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ細胞（ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質でトランスフェクトしたＨＥＲ２陰性Ｂａｌｂ／３Ｔ３親細胞）を共培養し、３７℃でＴｒａ−ＩＲ７００とともに１または６時間にわたるインキュベーションの後、１．０Ｊｃｍ−２で照射した。Ｔｒａ−ＩＲ７００がＨＥＲ２特異的な様式で分布したのに対し、ＤｓＲｅｄを発現するＢａｌｂ／３Ｔ３細胞は、照射しても光毒性を示さなかった（図３ａ）。加えて、多色蛍光顕微鏡検査（図３ｂ）およびフローサイトメトリー解析（図３ｃ）により決定される通り、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｇｒｅｅｎ染色は、細胞死のＨＥＲ２特異的誘導を実証した。
（実施例６）
Ｔｒａ−ＩＲ７００は、ＨＥＲ２＋細胞の増殖を低減する
３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞を、３５ｍｍ細胞培養ディッシュへと、１×１０４個の密度で播種した。翌日、細胞を、Ｔｒａ−ＩＲ７００有りまたは無しでインキュベートし、実施例２に記載される通りにこれらに照射した。細胞生存率は、細胞播種後１、３、および５日目にトリパンブルー色素排除アッセイにより決定した。処理した対照または処理していない対照の生存細胞は、トリプシン処理の後に血球計でカウントした。細胞成長はまた、各時点において顕微鏡下でも写真撮影した。
図１ｅに示される通り、Ｔｒａ−ＩＲ７００で処理し、次いで、２．０Ｊｃｍ−２のＰＤＴにかけられた細胞の生存率は、Ｔｒａ−ＩＲ７００だけで処理した細胞、ＰＤＴだけで処理した細胞、または処理していない細胞と比較して著しく減少した。
（実施例７）
Ｔｒａ−ＩＲ７００はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＥＲ２＋細胞を選択的に死滅させる
この実施例では、Ｔｒａ−ＩＲ７００が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨＥＲ２＋腫瘍を処置しうることを示すのに用いられる方法について記載する。当業者は、同様の方法を、他の腫瘍／抗体−ＩＲ７００の組合せと共に用いうることを十分に理解する。
６〜８週齢の雌性ホモ接合無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）にイソフルランで麻酔をかけた。３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞またはＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（２００万個）を、マウスの左側背部に皮下注射した。細胞注射の４日後、５０または３００μｇのＴｒａ−ＩＲ７００のいずれかを静脈内投与した。腫瘍異種移植片におけるＨＥＲ２特異的Ｔｒａ−ＩＲ７００の蓄積は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける蛍光イメージングシステム（Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で確認した。３Ｔ３／ＨＥＲ２＋腫瘍特異的ＩＲ７００−Ｔｒａの局在化が観察された。これに対し、Ｂａｌｂ／３Ｔ３腫瘍は、ＨＥＲ２特異的ＩＲ７００蛍光を示さなかった。
ＩＲ７００−Ｔｒａによる標的化ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏにおける効力を評価するために、１００万個の３Ｔ３／ＨＥＲ２＋細胞またはＢａｌｂ／３Ｔ３細胞を、雌性ヌードマウスの両側の背部へと皮下注射した。両方の腫瘍の体積が、約７０ｍｍ３に達したとき（約４日間）、動物を、以下の処置：（１）処置なし；（２）３００μｇトラスツズマブの静脈内注射、ＰＩＴなし；（３）３００μｇ Ｔｒａ−ＩＲ７００の静脈内注射、ＰＩＴなし；（４）３Ｔ３／ＨＥＲ２腫瘍に対する、Ｔｒａ−ＩＲ７００なしの、５０Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴ；（５）３００μｇ Ｔｒａ−ＩＲ７００の静脈内注射、５０Ｊ／ｃｍ２でＰＤＴを実施した、について１群当たり少なくとも１２匹の動物からなる５つの群へと無作為化した。
Ｔｒａ−ＩＲ７００投与の２４時間後、ＰＩＴを施すマウスにおいて、腫瘍を含む右背部を包含する直径１ｃｍの領域に照射した（線量レベル：５０Ｊｃｍ−２）。腫瘍の左側背部は、黒色テープで覆い、光への曝露を防止した。ＰＩＴに応答した効果を毎日モニタリングし、腫瘍体積を、それが５００〜１０００ｍｍ３に達する（この時点で、マウスを二酸化炭素ガスで安楽死させた）まで、ノギスで週に２回測定した。腫瘍体積を決定するために、最大の縦径（長さ）および最大の横径（幅）を、外側ノギス（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｐｅｒ）で決定した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、以下の式：腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５により計算した。別段に示されない限り、データは、３つの実験の最小値に由来する平均値±標準誤差（ｓｅｍ）として表される。統計学的解析は、統計学プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて実行した。多重比較のために、事後検定を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）（事後検定を伴うクルスカル−ワリス検定）を用いた。本明細書において腫瘍体積が５００ｍｍ３に達しなかったとして決定する、生存の累積確率は、各群において、カプラン−マイヤー生存曲線解析を用いて推定し、結果を、多重性についてのボンフェローニによる補正を伴うログランク検定を用いて比較した。Ｐ＜０．０５を、統計学的な有意差を示すと考えた。
図４ａおよび４ｂに示される通り、５０Ｊｃｍ−２の照射が、処置の４、７、１０、および１４日後の３Ｔ３／ＨＥＲ２＋腫瘍において有意な腫瘍成長の阻害を結果としてもたらしたのに対し、処置されていない腫瘍は、腫瘍成長に対するいかなる検出可能な効果も示さなかった。加えて、Ｂａｌｂ／３Ｔ３腫瘍に対する照射は、有意な治療効果を示さなかった。さらに、処置中または処置後に、致死的な副作用は見出されなかった。
（実施例８）
ＩＲＤｙｅ ７００を結合体化したＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（抗ＨＥＲ１）の合成
ヒトＥＧＦＲに対して指向する完全ヒト化ＩｇＧ２ＭＡｂであるパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））は、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）から購入し、実施例１に記載される方法を用いてＩＲ７００に結合体化させた。この化合物を、パニツムマブ−ＩＲ７００またはＰａｎ−ＩＲ７００と称する。パニツムマブ１当たりのＩＲ７００の数は、約３であった。
（実施例９）
Ｐａｎ−ＩＲ７００はＨＥＲ１＋細胞を選択的に死滅させる
この実施例では、実施例８に記載されるＰａｎ−ＩＲ７００化合物を用いて、ＨＥＲ１を発現する細胞（ＨＥＲ１＋）を選択的に死滅させうるが、ＨＥＲ１陰性（ＨＥＲ１−）細胞に対する負の作用は最小限であることを示すのに用いられる方法について記載する。
ＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞を、標的のＨＥＲ１＋細胞として用いた。対照としては、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質は発現するが、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲは発現しないＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ）を用いた。細胞は、９５％の空気および５％の二酸化炭素の雰囲気下、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコの中の１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０で成長させた。Ａ４３１細胞またはＢａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ細胞を、底部がカバーガラスのディッシュ上に播種し、２４時間にわたりインキュベートした。Ｐａｎ−ＩＲ７００を、１０μｇ／ｍＬで、培養培地に添加し、氷上で１時間または３７℃で６時間にわたりインキュベートし、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した後、培養培地を、フェノールレッド非含有培地で置きかえた。
実施例に記載される通りに蛍光顕微鏡検査を実施して、ＩＲ７００の抗原特異的局在化を検出した。Ｐａｎ−ＩＲ７００は、氷上で１時間にわたるインキュベーション後に、Ａ４３１細胞の細胞表面に検出され、３７℃でのインキュベーションの６時間後に、リソソームへと主に局在化した。Ｂａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ細胞については、有意なＩＲ７００シグナルが観察されなかった。
実施例２および３に記載される通りにＰＩＴを実施した。図５ａに示される通り、Ａ４３１細胞への０．５〜２Ｊｃｍ−２での照射は、線量依存的な様式で、細胞膜の突出および腫脹を表す、迅速な細胞死を結果としてもたらした。図５ｂに示される通り、処理していない対照細胞と対比した標的細胞における細胞死の百分率は、励起光線量に著明に影響された。加えて、励起光を伴わないＰａｎ−ＩＲ７００への曝露またはＴｒａ−ＩＲ７００なしでの光への曝露と関連する有意な細胞傷害は存在しなかった。しかし、パニツムマブはそれ自体、ＨＥＲ１の下方調節およびシグナル阻害に起因して、Ａ４３１細胞に対する注目すべき処理効果を有した（Yangら、Cancer Res、５９巻：１２３６〜４３頁、１９９９年）。
標的特異的光毒性はまた、Ａ４３１細胞およびＢａｌｂ／３Ｔ３／ＤｓＲｅｄ（ＨＥＲ１陰性）共培養細胞における、Ｐａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴによっても確認された（図５ｃ）。まとめると、Ｔｒａ−ＩＲ７００およびＰａｎ−ＩＲ７００は、それぞれ、ＨＥＲ２陽性（３Ｔ３／ＨＥＲ２）細胞およびＨＥＲ１陽性（Ａ４３１）細胞に対して、用いられた用量で、非結合体化パニツムマブは注目すべき成長阻害を示したが、非結合体化トラスツズマブは成長を減少させなかった点を除き、同様の治療効果を示した。
（実施例１０）
Ｐａｎ−ＩＲ７００はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＥＲ１＋細胞を選択的に死滅させる
この実施例では、Ｐａｎ−ＩＲ７００が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＥＲ１＋腫瘍を処置しうることを示すのに用いられる方法について記載する。当業者は、同様の方法を、他の腫瘍／抗体−ＩＲ７００の組合せと共に用いうることを十分に理解する。
６〜８週齢の雌性ホモ接合無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）にイソフルランで麻酔をかけた。１００万個のＡ４３１細胞を、マウスの左側背部に皮下注射した。細胞注射の４日後、５０または３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００のいずれかを静脈内投与した。
抗原特異的なＰａｎ−ＩＲ７００の局在化を確認するために、１×１０６個の３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞（ＨＥＲ１陰性）を、Ａ４３１細胞の注射と同時に右背部に皮下注射した。７００ｎｍの蛍光チャネルを用いるＰｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、表示される時点で、蛍光画像を得た。腫瘍およびバックグラウンドの両方の対象の領域（ＲＯＩ）を、同数のピクセルを含有する同等サイズの領域について設定した。腫瘍対バックグラウンド比（ＴＢＲ）は、以下の式：ＴＢＲ＝（（平均腫瘍強度）−（平均バックグラウンド強度））／（（平均非腫瘍強度）−（平均バックグラウンド強度））を用いて計算した。
図６ａに示される通り、Ｐａｎ−ＩＲ７００は、Ａ４３１腫瘍に局在した。Ａ４３１腫瘍におけるＰａｎ−ＩＲ７００の蛍光強度が日数の経過と共に徐々に低減したのに対し、腫瘍対バックグラウンド比（ＴＢＲ）は増大した（図６ｂおよび６ｃ）。３Ｔ３／ＨＥＲ２腫瘍の蛍光強度は、バックグラウンド（非腫瘍病変）の蛍光強度と同じであった。３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を静脈内投与したところ、Ａ４３１腫瘍の蛍光強度は、注射の１日後に、５０μｇの注射の場合の３倍超高かったが、ＴＢＲはバックグラウンドシグナルが高いためにより低かった（図６ｂおよび６ｃ）。５０μｇのＰａｎ−ＩＲ７００注射を施されたマウスでは、照射後に抗腫瘍活性がより低いこと（３００μｇと対比した）がわかったので、より高量の注射用量を用いた（図６ｈ）。二重標識により放射性標識したＰａｎ−ＩＲ７００１５を用いる場合、組織における放射性活性レベルおよび蛍光レベルは、それらの排出経路および異化が異なることに起因して異なりうるため、Ｔｒａ−ＩＲ７００の生体分布は、ＩＲ７００蛍光により決定した。おそらくは異化されて結合しなかった色素の排出に起因する１日目の膀胱における蓄積を除き、ＩＲ７００の他の特異的な局在化は認められなかった（図６ｄ）。
図６ｄに示される通り、ＰＩＴで処置しなかった腫瘍であって、縮小しなかった腫瘍とは異なり、Ｐａｎ−ＩＲ７００の投与後におけるＰＩＴ処置は、２日目に腫瘍を縮小させ始めた。
ＰＩＴ後におけるＰａｎ−ＩＲ７００またはキャリア単独の効果を決定するために、以下の方法を用いた。腫瘍体積を決定するために、最大の縦径（長さ）および最大の横径（幅）を、外側ノギスで決定した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、以下の式：腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５２８により計算した。上記の通りのＡ４３１細胞注射の４日後に、約４０ｍｍ３に達した腫瘍体積を研究のために選択した。動物を、以下の処置：（１）処置なし；（２）３００μｇパニツムマブの静脈内注射、ＰＩＴなし；（３）３００μｇ Ｐａｎ−ＩＲ７００の静脈内注射、ＰＩＴなし；（４）Ｐａｎ−ＩＲ７００なしで、ＰＩＴを３０Ｊ／ｃｍ２で実施した；（５）３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００と同等用量の遊離ＩＲ７００色素を静脈内注射し、かつＰＩＴを３０Ｊｃｍ−２で実施した；（６）５０μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を静脈内注射し、ＰＩＴを３０Ｊｃｍ−２で実施した；（７）５０μｇのＰａｎ−ＩＲ７００および２５０μｇのパニツムマブを静脈内注射し、ＰＩＴを３０Ｊｃｍ−２で実施した；および（８）３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を静脈内注射し、ＰＩＴを３０Ｊｃｍ−２で実施した、について、１群当たり少なくとも１２匹の動物からなる８つの群へと無作為化した。処置後、マウスを毎日モニタリングし、腫瘍体積を、それが５００ｍｍ３に達する（この時点で、マウスを二酸化炭素ガスで安楽死させた）まで週２回測定した。非腫瘍担持マウスについて短期的な毒性について調べるため、３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を、週２回、４週間にわたり反復的に静脈内投与した。
図６ｅに示される通り、Ｐａｎ−ＩＲ７００および３０Ｊｃｍ−２の照射による処置が、処置の３、７、１０、１４、および１７日後に、Ａ４３１（ＨＥＲ１＋）腫瘍における有意な腫瘍成長の阻害を結果としてもたらしたのに対し、処置されていない腫瘍は、腫瘍成長に対する検出可能な効果を示さなかった。加えて、図６ｆに示される通り、Ｐａｎ−ＩＲ７００および３０Ｊｃｍ−２の照射による処置は、Ａ４３１（ＨＥＲ１＋）腫瘍を有するマウスの生存期間の有意な延長も結果としてもたらした。さらに、処置中または処置後に、致死的な副作用は見出されなかった。図６ｇは、Ｐａｎ−ＩＲ７００による処置に続き、ＰＩＴ療法を行わないかまたはＰＩＴ療法を行った４日後における細胞の顕微鏡画像を示す。病理学的解析は、Ｐａｎ−ＩＲ７００媒介ＰＩＴの後に存在する生存Ａ４３１腫瘍細胞はわずかであるに過ぎず、腫瘍小結節に炎症性変化を伴う塊状の肉芽形成が観察されることを明らかにした。また、組織浮腫が表在性に発生していることも観察された。Ｐａｎ−ＩＲ７００の急性相の毒性を評価するために、本発明者らは、３００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を、週２回、４週間にわたり反復的に静脈内投与したが、対照群と比較した有害作用は８週間後まで（ｎ＝４）観察されなかった。
（実施例１１）
ＨｕＪ５９１−ＩＲ７００はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＳＭＡ＋細胞を選択的に死滅させる
この実施例では、ＨｕＪ５９１−ＩＲ７００が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）＋腫瘍（前立腺がんに見出されるものなど）を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて処置しうることを示すのに用いられる方法について記載する。当業者は、同様の方法を、他の腫瘍／抗体−ＩＲ７００の組合せと共に用いうることを十分に理解する。
ヒトＰＳＭＡに対して指向する完全ヒト化ＩｇＧ２ＭＡｂであるＪ５９１は、コーネル大学のＮｅｉｌ Ｂａｎｄｅｒ教授から恵与され、実施例１に記載される方法を用いてＩＲ７００に結合体化した。この化合物を、Ｊ５９１−ＩＲ７００と称する。Ｊ５９１ １つ当たりのＩＲ７００の数は、約２であった。
６〜８週齢の雌性ホモ接合無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）にイソフルランで麻酔をかけた。０日目に、２００万個のＰＣ３−ＰＩＰ細胞（ＰＳＭＡ＋）を、マウスの下側背部に皮下注射し、ＰＣ３−ＦＬＵ細胞（ＰＳＭＡ−）を、マウスの上側背部に皮下注射した。３日目、１００μｇのＰＳＭＡ−ＩＲ７００を腹腔内投与した。
抗原特異的なＪ５９１−ＩＲ７００の局在化を確認するために、２×１０６個のＰＣ３−ＦＬＵ細胞（ＰＳＭＡ−）を、ＰＣ３−ＰＩＰ細胞の注射と同時に異なる領域に皮下注射した。実施例７および１０に記載される通り、７００ｎｍの蛍光チャネルを用いるＰｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、表示される時点で、蛍光画像を得た。
図７に示される通り、Ｊ５９１−ＩＲ７００は、ＰＣ３−ＰＩＰ腫瘍に局在した。非特異的な血液プールおよび透過性増強および保持効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ）（ＥＰＲ効果）により、ＰＣ３−ＦＬＵ（ＰＳＭＡ−）腫瘍がかろうじて示される。
ＨｕＪ５９１−ＩＲ７００の効果を、ＰＩＴの存在下または非存在下で決定するために、実施例７および１０に記載される通り、マウスの右側には照射したが、左側には照射しなかった。とりわけ、４日目には、マウスの右側腫瘍に５０Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴを施し、５日目には、右側腫瘍に１００Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴを施し（そして、画像を得）、１１日目には、Ｊ５９１−ＩＲ７００を投与（１００μｇの腹腔内投与）して、画像を得、１２日目には、右側腫瘍に５０Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴを施し、１３日目には、右側腫瘍に１００Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴを施し、１９日目には、Ｊ５９１−ＩＲ７００を投与（１００μｇの腹腔内投与）した。２０日目には、画像を得、腫瘍を切除し、イメージングした。図７に示される通り、ＰＩＴで処置しなかった腫瘍であって、縮小しなかった腫瘍とは異なり、Ｊ５９１−ＩＲ７００の投与後におけるＰＩＴ処置は、５日目に腫瘍を縮小させ始めた。
（実施例１２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗体−ＩＲ７００分子による選択的な致死
この実施例では、開示される抗体−ＩＲ７００化合物が、特有のタンパク質を発現する細胞を選択的に死滅させることを示すさらなる結果について記載する。光免疫療法（ＰＩＴ）の方法は、実施例２に記載されている。
図８に示される通り、Ｔｒａ−ＩＲ７００は、ＨＥＲ２を発現する３Ｔ３／１−ＩＥＲ２細胞、ＳＨＡＷ細胞、ＳＫＯＶ３細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を特異的に死滅させ、Ｐａｎ−ＩＲ７００は、ＨＥＲ１を発現するＡ４３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を特異的に死滅させ、ｈｕＪ５９１−ＩＲ７００は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現するＬＮＣａＰ細胞を特異的に死滅させた。
（実施例１３）
トラスツズマブ−ＩＲ７００による転移の処置
この実施例では、Ｔｒａ−ＩＲ７００が、肺転移を処置しうることを示すのに用いられる方法について記載する。
ＨＥＲ２を発現する３Ｔ３／ＨＥＲ２細胞（０．５〜２００万個の細胞）を、雌性ヌードマウスの尾静脈へと静脈内注射した。トラスツズマブ−ＩＲ７００（１００μｇ）を、腫瘍細胞注射の５日後に静脈内注射した。ｅｘ ｖｉｖｏイメージングにおいて、Ｔｒａ−ＩＲ７００の局在を有する複数の微小な肺転移が確認されたので、トラスツズマブ−ＩＲ７００注射の２日後、肺を、身体の外側から３０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光で処置した。肺転移は除去されたことが観察され、マウスの全体的な生存期間の、Ｔｒａ−ＩＲ７００を施さなかったマウスの生存期間と比較した延長が観察された。
（実施例１４）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける急性壊死性がん細胞死のリアルタイムでのモニタリング
この実施例では、近赤外線光免疫療法により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏにおける急性壊死性がん細胞死を、蛍光寿命イメージングを用いてリアルタイムでモニタリングするのに用いられる方法について記載する。Ｐａｎ−ＩＲ７００の特定の例について記載されるが、他の腫瘍には他の抗体−ＩＲ−７００分子を用いうることが十分に理解される。
本明細書に記載される通り、モノクローナル抗体ベースの高度に特異的な光療法（光免疫療法；ＰＩＴ）は、ｍＡｂと結合体化した近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン色素であるＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（ＩＲ７００）を使用する。ＮＩＲ光への曝露は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける即時の標的選択的な壊死性細胞死をもたらす。ｉｎ ｖｉｖｏにおける即時の細胞死を検出することは、腫瘍のサイズが縮小し始めるのに少なくとも３日間を要するためにいっそう困難である。この実施例では、ＰＩＴ前およびＰＩＴ後における、ＮＩＲによって媒介されるｍＡｂ−ＩＲ７００ＰＩＴの即時の細胞傷害効果をモニタリングするために、蛍光寿命（ＦＬＴ）を評価した。抗ＥＧＦＲパニツムマブ−ＩＲ７００を、ＥＧＦＲを発現するＡ４３１腫瘍細胞を標的化するのに用いた。様々な線量のＮＩＲ光でのＰＩＴを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ペレットで、およびｉｎ ｖｉｖｏのマウス皮下に異種移植された腫瘍で実施した。ＦＬＴの測定値は、ＰＩＴ前、ならびにＰＩＴの０、６、２４、および４８時間後に得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、より高い線量のＮＩＲ光でのＰＩＴは、Ａ４３１細胞で、大幅なＦＬＴ短縮を速やかにもたらした。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＩＴは、３０Ｊ／ｃｍ２の閾値線量もしくはそれより高い線量のＮＩＲの後、処置された腫瘍では、即時のＦＬＴの短縮を誘導した。これに対し、より低いレベルのＮＩＲ光（１０Ｊ／ｃｍ２もしくはそれより低い）は、ＦＬＴの短縮を誘導しなかった。これらの観察結果に基づき、標的化された腫瘍において形態的変化を認めることができる前であっても、ＦＬＴイメージングを用いて、ｍＡｂ−ＩＲ７００に誘導されるＰＩＴの早期で大規模な細胞傷害効果をモニタリングすることができる。
材料および方法
試薬。ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲ１に対して指向する完全ヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるパニツムマブは、ＡＭＧＥＮ Ｉｎｃ．から購入した。水溶性、ケイ素−フタロシアニン誘導体であるＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳエステル（ＩＲ７００；Ｃ７４Ｈ９６Ｎ１２Ｎａ４０２７Ｓ６Ｓｉ３；分子量：１９５４．２２）は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。用いられる他の全ての化学物質は、試薬グレードであった。
ＩＲ７００と結合体化したパニツムマブの合成。パニツムマブ（１ｍｇ、６．８ナノモル）を、０．１モル／Ｌ（ｍｏｌｌＬ）のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）中、室温で１時間にわたり、ＩＲ７００（６６．８ｊｉｇ、３４．２ナノモル、ＤＭＳＯ中５ミリモル／Ｌ）と共にインキュベートした。次いで、混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。タンパク質濃度は、５９５ｎｍにおける光の吸収を測定する（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ことによる、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で決定した。ＩＲ７００の濃度を、分光法による吸収により測定して、各パニツムマブ分子に結合体化したフルオロフォア分子の平均数を確認した。１：４．５の反応条件について、抗体１つ当たりのＩＲ７００の数は、約４であった。０．４％のＳＤＳを試料へと添加することにより、フルオロフォアを互いから引き離して、脱消光を有効に引き起こした。特定のコンジュゲーションについての消光効率（ＱＥ）は、ＳＤＳを伴わない場合の蛍光強度で除した、ＳＤＳを伴う場合の蛍光強度として定義する。パニツムマブ−ＩＲ７００コンジュゲート（Ｐａｎ−ＩＲ７００）は、ｐＨ７．２のときに、約４．０のＱＥを実証した。Ｐａｎ−ＩＲ７００は、冷蔵庫内４℃で、原液として保存した。
蛍光寿命の測定。ＦＬＴ実験は、ｅＸｐｌｏｒｅ ＯｐｔｉｘＴｍ−ＭＸ２システム（ＡＲＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により実施した（Hutchinsonら、Biophys J、６８巻：１５７４〜８２頁、１９９５年；Maら、Appl Opt、４６巻：１６５０〜７頁、２００７年）。固定パルスレーザーダイオードを、６７０ｎｍの波長で励起源として用いた。スポットサイズを１．５ｍｍとする対象の領域（ＲＯＩ）における測定値は、画像平面において選択した。レーザー出力は、フォトン検出器を飽和させない最高出力として自動選択した。寿命解析は、ＡＲＴ ＯｐｔｉＶｉｅｗ（ＡＲＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いることにより実施した。寿命値および寿命マッピングを計算して、Ｆｉｔ ＴＰＳＦツールにより、蛍光時間点拡がり関数（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐｏｉｎｔ−ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＴＰＳＦ）を、単一指数関数モデルとして当てはめた。
光免疫療法のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデル。波長６８０〜７００ｎｍの赤色光の発光ダイオード（ＬＥＤ）（Ｔｅｃｈ−ＬＥＤ、Ｍａｒｕｂｅｎｉ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏ．）によりＰＩＴを実施した（Mitsunagaら、Bioconjug Chem.、２３巻：６０４〜９頁、２０１２年）。出力密度は、光出力計（ＰＭ １００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で測定した。
Ｐａｎ−ＩＲ７００のＦＬＴの決定。Ｐａｎ−ＩＲ７００の試料を、ＰＢＳで希釈することにより、２．５、５、２０、４０ｐｇ／ｍＬの濃度で調製した。各試料の蛍光強度および蛍光寿命は、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２システムを、室温、１．７ｍｌの遠心分離管内で用いて決定した。Ｐａｎ−ＩＲ７００を用いるＰＩＴの効果を調査するためには、濃度５０ｐｇ／ｍＬの各試料のＦＬＴを、０、２、４、８、１５、３０Ｊ／ｃｍ２のＰＩＴ線量で試料に照射した後に測定した。
細胞系。ＨＥＲ１陽性細胞系であるＡ４３１を、パニツムマブコンジュゲートによるＨＥＲ１標的化研究に用いた。該細胞系を、５％のＣＯ２中、３７℃の、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．０３％Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００ｐｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長させた。
細胞ペレットのＦＬＴ研究 Ａ４３１。細胞を、７５ｍｍ２の細胞培養用フラスコへと播種し、コンフルエントとなるまでインキュベートした。次いで、Ｐａｎ−ＩＲ７００コンジュゲートを、培地（１ｐｇ／ｍＬ）へと添加し、細胞を、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。インキュベーションが完了したら、細胞をフラスコから取り出し、遠心分離して、ペレットを得た。結果として得られる細胞ペレットを、ＰＢＳで３回にわたり洗浄し、１．７ｍＬの遠心分離管に入れた。次いで、各試料の蛍光強度および蛍光寿命を得た。細胞によるＰａｎ−ＩＲ７００コンジュゲートの内部移行の効果を調査するために、Ａ４３１細胞を７５ｍｍ２のフラスコへと播種し、Ｐａｎ−ＩＲ７００と共に、１、２、４、６、１５、および２４時間にわたりインキュベートした。フラスコから取り出して、Ａ４３１細胞ペレットを得た後、Ａ４３１ペレットのＦＬＴ測定値を得た。Ａ４３１細胞ペレットを、Ｐａｎ−Ｒ７００と共に一晩にわたりインキュベートした後、細胞ペレットを、０、２、４、８、１５、３０Ｊ／ｃｍ２の線量で照射した。この後、これらのペレットを、ＰＢＳで静かに１回洗浄し、蛍光強度画像および蛍光寿命画像を収集した。抗原特異的なＩＲ７００の局在化を検出し、ＰＩＴ前およびＰＩＴ後におけるＡ４３１細胞の形態的変化を確認するために、以下のフィルター：５９０〜６５０ｎｍの励起フィルター、６６５〜７４０ｎｍの帯域発光フィルターを装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて蛍光顕微鏡検査を実施した。また、透過光微分干渉コントラスト画像（ＤＩＣ）も収集した。Ａ４３１細胞を、底部がカバーガラスの培養ウェルに播種し、２４時間にわたりインキュベートした。Ｐａｎ−ＩＲ７００を培地に添加して（１０ｐｇ／ｍＬ）、細胞を、６または２４時間にわたりインキュベートした。完了したら、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＩＴ前およびＰＩＴ後に、蛍光顕微鏡検査を実施した。
マウスモデル。Ａ４３１細胞（ＨＥＲ１＋、ＨＥＲ２−；１×１０６個）を、雌性ヌードマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）の背部の両側に皮下注射した。細胞を注射した６〜９日後に実験を実施した。
ＰＩＴ後におけるｉｎ ｖｉｖｏＦＬＴイメージング研究。腫瘍担持マウスを、ＰＩＴの以下の照射線量：１０、３０、および５０Ｊ／ｃｍ２について、１群当たりのマウス５匹からなる３群に分けた。対照としては、ＰＩＴを伴わない５匹のマウスを準備した。１００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を、ＰＩＴの２４時間前に、尾静脈を介して全てのマウスへと静脈内注射した。背部の右側におけるＡ４３１腫瘍をＰＩＴで処置する一方、対側性の対照腫瘍は、アルミニウムホイルで光の曝露から遮蔽した。ＰＩＴ後におけるＦＬＴ画像は、以下の時点：０、６、２４、および４８時間に得た。０時間における収集は、ＰＩＴ直後に実施した。ＦＬＴ画像における各ＲＯＩの最大のスポット値を、背部の両側の腫瘍について計算した。
組織学的解析。一連の組織学的変化を、様々なＮＩＲ光線量でのＰＩＴ後、速やかに（５分以内に）評価するために、顕微鏡検査を実施した（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ）。Ａ４３１腫瘍は、０、１０、３０、および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光への曝露後速やかに、１０％ホルマリン中に採取した。一連の１０μｍの薄切片を、スライドガラスに固定してＨ−Ｅ染色した。
統計学的解析。統計学的解析は、統計学プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を用いて実行した。マン−ホイットニーのＵ検定を用いて、処置した腫瘍と処置していない腫瘍の蛍光寿命との間で寿命値を比較した。スチューデントのｔ検定を用いて、処置した腫瘍の寿命を、非処置対照と比較した。Ｐ＜０．０５を、統計学的な有意差を示すと考えた。
結果
ＦＬＴは溶液中のＰａｎ−ＩＲ７００濃度に依存しない。様々な濃度のＰａｎ−ＩＲ７００のＦＬＴが、３．５６±０．０８１ナノ秒；３．６２（２．５ｐｇ／ｍＬ）、３．５８（５ｐｇ／ｍＬ）、３．４４（２０ｐｇ／ｍＬ）、３．６０ナノ秒（４０ｐｇ／ｍＬ）とほぼ同じであったのに対し、蛍光強度は、濃度と比例して低下した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
ＮＩＲ光への曝露だけではＰａｎ−ＩＲ７００のＦＬＴに影響しない。Ｐａｎ−ＩＲ７００（５０ｐｇ／ｍＬ）はそれ自体照射され、ＦＬＴが測定された。蛍光強度および蛍光寿命のいずれも、０、２、４、８、１５、３０Ｊ／ｃｍ２の線量でのＬＥＤの照射によって変化しなかった。ＦＬＴは、約３．４４±０．０５８ナノ秒であった。
Ｐａｎ−ＩＲ７００の内部移行はＩＲ７００のＦＬＴを延長させた。Ａ４３１細胞のＦＬＴは、Ｐａｎ−ＩＲ７００とのインキュベーションの持続時間と共に増大した。インキュベーションの１、２、４、６、１５、および２４時間におけるＡ４３１細胞ペレットのＦＬＴは、それぞれ、２．９８、３．０５、３．１３、３．１５、３．３６、および３．４１ナノ秒であった。１５時間にわたるインキュベーションの後、ＩＲ７００のＦＬＴはそのピークに達し、さらなる延長を示さなかった（図１０Ｄ）。
ＮＩＲ光の大量の曝露はＩＲ７００を含有するＡ４３１細胞のＦＬＴを短縮した。より大きなＮＩＲ光線量でのＰＩＴは、ＮＩＲ光への曝露前２４時間にわたり、Ｐａｎ−ＩＲ７００と共にインキュベートされたＡ４３１細胞ペレットにおけるＦＬＴの大幅な短縮を誘導した（図１０Ｃ）。０、８、１５、および３０Ｊ／ｃｍ２の線量でのＰＩＴは、Ａ４３１ペレットのＦＬＴを、それぞれ、３．２８、３．０９、２．９４、および２．８５ナノ秒まで短縮した。
ＰＩＴは、Ａ４３１細胞における典型的な壊死性細胞死のほかリソソームの破裂も誘導した。顕微鏡検査下では、Ｐａｎ−ＩＲ７００が、インキュベーションの２４時間後における細胞膜に、およびエンドリソソーム内に認められた。ＮＩＲ光への曝露後には、細胞膜およびリソソームに、すみやかな損傷が誘導された。細胞膜では、ＰＩＴにより誘導される壊死性細胞死に特徴的な多巣性のブレブ形成が認められた（図１１）。
有効なＰＩＴはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＲ７００のＦＬＴの即時の短縮を誘導した。１００ｐｇのＰａｎ−ＩＲ７００の投与の１日後のｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡ４３１腫瘍の平均ＦＬＴは、３．２７±０．４６ナノ秒（ｎ＝４０）であった。実験腫瘍に対する３０および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光線量によるＰＩＴの直後に、ＦＬＴの有意な短縮が誘導された（右背部、３０Ｊ／ｃｍ２；同じマウスにおける処置していない腫瘍の６１．５％±５．０５％まで；Ｐ＜０．０１、５０Ｊ／ｃｍ２；同じマウスにおける処置していない腫瘍の６９．０％＋１１０．９２％まで；Ｐ＜０．０５）。
ＰＩＴ処置した腫瘍の内部および周囲では、３０および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光線量でのＰＩＴの６時間後に、ＩＲ７００ ＦＬＴの一過性の延長が見出されたが、ＰＩＴの＞２４時間後では、ＩＲ７００ ＦＬＴの短縮が続いた。１０Ｊ／ｃｍ２でのＰＩＴは、ＦＬＴのこの一過性の延長を示さなかった。また、処置していない対照腫瘍におけるＩＲ７００ ＦＬＴも、後の時点でわずかに短縮した（図１２Ａ）。
同じマウスにおける、３０および５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光で曝露した腫瘍のＩＲ７００ ＦＬＴと、曝露しなかった腫瘍のＩＲ７００ ＦＬＴとの間の比較は、ＰＩＴの０、２４、および４８時間後に有意差を示した（Ｐ＜０．０５；図１２Ｂおよび１２Ｃ）。ＰＩＴの６時間後におけるＩＲ７００ ＦＬＴの差違は、曝露した腫瘍の周囲における拡散時間の増大（ｔｈｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅ）に起因して、統計学的に有意ではなかった。１０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光で曝露した腫瘍のＩＲ７００ ＦＬＴと、曝露しなかった腫瘍のＩＲ７００ ＦＬＴとは、いかなる時点においても有意差を示さなかった（図１２Ｄ）。
５０および３０Ｊ／ｃｍ２ＰＩＴで処置した腫瘍におけるＦＬＴは、非処置対照（０Ｊ／ｃｍ２）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）短縮した。ＦＬＴは、５０および３０Ｊ／ｃｍ２でのＰＩＴにより、それぞれ、６９．１±１０．９％および６１．５±５．１％へと速やかに短縮した。１０Ｊ／ｃｍ２だけで照射したＡ４３１腫瘍は、ＰＩＴの直後に有意なＦＬＴの短縮を示さなかった。ＦＬＴは、ＰＩＴの４８時間後に、処置していない対照と比較して、７．７％だけ短縮した（図１３Ａ）。興味深いことに、ＰＩＴ処置マウスにおける非照射腫瘍のＦＬＴは、処置していないマウスにおけるＦＬＴよりわずかに短縮したが、これらの変化は、有意でなかったものの、ＦＬＴは、処置した腫瘍に対するＮＩＲ光の線量が大きくなると短縮した（図１３Ｂ）。これらの変化は、軟組織を介して、「処置した」側から「処置していない」側へ拡散する少量の光により引き起こされ得、したがって、これにより、線量依存性の効果を説明し得る。
組織学的解析。
処置した腫瘍についての顕微鏡検査は、ＰＩＴ後における、健常であるか、または損傷しているが潜在的に生存可能な腫瘍細胞のクラスターを伴う様々な程度の壊死および微小出血を明らかにした。壊死性損傷はびまん性でかつ激しく、３０または５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施したときに、生存する腫瘍細胞の量が減少した。これに対し、１０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施したときに、壊死性細胞損傷が見出されたのは限られた領域だけであり、生存可能ながん細胞の比較的大きな領域が組織の大部分を占めた（図１３Ｃ）。
考察
蛍光顕微鏡検査による研究は、Ｐａｎ−ＩＲ７００が、３７℃でＡ４３１細胞内のリソソームへと徐々に内部移行されることを示した（図１１）。Ｐａｎ−ＩＲ７００が内部移行されるにつれて（図１０Ｄ）、ＩＲ７００ ＦＬＴは、インキュベーション時間の関数として延長した。ＩＲ７００は、最終的にリソソームに蓄積した。閾値強度のＮＩＲ光への曝露後、Ｐａｎ−ＩＲ７００は、細胞質内および細胞外腔におけるＩＲ７００の蓄積を結果としてもたらす、即時の細胞外膜（ｏｕｔｅｒ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）損傷およびリソソーム損傷を誘導した。この損傷は、ＩＲ７００ ＦＬＴの有意な減少と関連した。これは、Ｐａｎ−ＩＲ７００コンジュゲートの細胞への内部移行それ自体が、このコンジュゲートがエンドリソソームに蓄積するにつれ、ＩＲ７００ ＦＬＴを延長することを意味する。しかし、リソソームの膜を含めた膜構造を損傷することにより、ＰＩＴは、細胞死を誘導し、ＦＬＴが長いＩＲ７００が細胞質内に放出されるとすぐ、ＦＬＴは顕著に短縮する。したがって、ＦＬＴの短縮は、ＰＩＴにより誘導される急性膜損傷の指標として役立つ。
有効な治療的光線量のＮＩＲでのＰＩＴによる処置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのがん細胞でＩＲ７００ ＦＬＴの短縮をもたらすが、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍でもＩＲ７００ ＦＬＴの短縮をもたらす。ＦＬＴの短縮は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＮＩＲ光曝露の線量に依存した（図１０Ｃ）。最適未満線量（１０Ｊ／ｃｍ２）のＮＩＲ光でのＰＩＴは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＩＲ７００ ＦＬＴの有意な短縮を示さなかった。これらの差違は、ＰＩＴ効果を受けたがん細胞集団に帰すことができる。図７は、５０Ｊ／ｃｍ２もしくはそれより大きいＮＩＲ光曝露を伴うＰＩＴであれば、Ａ４３１腫瘍を根絶し得ることを実証している。３０Ｊ／ｃｍ２でのＰＩＴは、腫瘍を完全に根絶するのには十分でなかったが、腫瘍の縮小および成長の遅延を引き起こしたことから、全ての細胞が死滅したわけではないが、大半の細胞は重度に、かつ、不可逆的に損傷していることが示された（Mitsunagaら、Bioconjug. Chem.、２３巻：６０４〜９頁、２０１２年）。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける処置した腫瘍のＦＬＴの短縮は、単回の有効線量のＮＩＲ光の３０分以内に観察され、腫瘍のサイズおよび形状が変化する数日前に生物学的効果を示した。病変のサイズは、細胞死の主要な指標と考えられるが、細胞死は、処置が有効であったかどうかを決定するのに十分なほど速くは生じない。必要な場合に光を再適用することができるＰＩＴの特定の場合には、細胞死のより速やかな読取りが必要とされる。サイズの変化は、細胞傷害効果をモニタリングするのに十分なほど迅速には生じない。これはとりわけ、１回のセッティングで処置を完了することが好ましい外科的手順または内視鏡手順に当てはまる（Mitsunagaら、Bioconjug. Chem.、２３巻：６０４〜９頁、２０１２年）。ＦＬＴは、腫瘍の状態の即時の読取りであるため、処置後速やかにがん細胞に対するＰＩＴの治療効果を評価することが可能であり、手順の間に追加線量のＮＩＲ光曝露が必要であるか否かを判断する一助となる（Kosakaら、Int J Cancer、１２９巻：１６７１〜７頁、２０１１年; Longmireら、Cancer Sci、１００巻：１０９９〜１０４頁、２００９年）。
興味深いことに、ＦＬＴは、初期の短縮の後、ＰＩＴの約６時間後に一時的に延長する。ＰＩＴの２４時間後までに、ＦＬＴは、再度減少した（図１２）。ＩＲ７００が内部移行するにつれてＩＲ７００ ＦＬＴの延長が観察されたので、ＰＩＴにより引き起こされる細胞膜の破壊の後、ＩＲ７００は、細胞外腔へと漏出し、この細胞外腔に、細胞壊死と関連するサイトカインの放出に応答して移動したマクロファージにより内部移行されることが提案される。これは、ＰＩＴの６時間後の組織学的所見であって、炎症性浸潤物が、生存腫瘍により元は占有されていた空間に侵入しているマクロファージからなることを示す所見により支持される（Mitsunagaら、Nat Med、１７巻：１６８５〜９１頁、２０１１年）。したがって、この一過性のＩＲ７００ ＦＬＴの延長は、有効な細胞損傷の徴候であり得、この後、断片化されたＤＮＡおよび脂質二重層により誘導される、ケモカインの放出またはｔｏｌｌ様受容体系によりおそらくは媒介される、組織修復が開始される（Emeagiら、Cancer Res、７２巻：１３４２〜５２頁、２０１２年; Shiratsuchiら、J Immunol １７２巻：２０３９〜４７頁、２００４年; Zhuら、Cell、２４巻：６１５〜２９頁、２００６年）。
蛍光タンパク質（ＦＰ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長をモニタリングするための潜在的な代替物である（Kimuraら、J Cell Biochem、１１０巻：１４３９〜４６頁、２０１０年; Tsaiら、Anticancer Res、３０巻：３２９１〜４頁、２０１０年; Yamamotoら、Cancer Res、６４巻：４２５１〜６頁、２００４年; HoffmanおよびYang、Nat Protoc、１巻：１４２９〜３８頁、２００６年）。ＦＰを用いる蛍光のイメージングは、光療法の効果の縦断的モニタリングにより良好に適する（Jiangら、Cell Cycle、５巻：１１９８〜２０１頁、２００６年; HoffmanおよびYang、Nat Protoc、１巻：７７５〜８２頁、２００６年）。短期的に、ＦＰは、細胞の生存率に関わらずそれらのシグナルを保持し、壊死性細胞においてもなお、マクロファージにより取り込まれうる。したがって、ＦＬＴは、それが蛍光シグナルの後処理（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を必要とし、比較的高価な装置を用いるにせよ、ＦＰより急性の変化を検出するのにより良好に適する（HoffmanおよびYang、Nat Protoc、１巻：９２８〜３５頁、２００６年; Hoffman、Nat Rev Cancer、５巻：７９６〜８０６頁、２００５年）。ＦＰによる蛍光のイメージングは、ＰＩＴの治療効果の縦断的モニタリングに用いられている（Mitsunagaら、Bioconjug Chem、２３巻：６０４〜９頁、２０１２年）。しかし、ＰＩＴに誘導される急性の細胞死が、ＦＬＴなどの光学的方法でのみ検出し得るのに対し、より長期にわたる変化はＦＰでも測定することができる。ＦＬＴが臨床的にトランスレーション可能であるのに対し、細胞のトランスフェクションを必要とするＦＰは、臨床的に用いられる可能性が低い。
このデータは、Ｐａｎ−ＩＲ７００のＦＬＴが、溶液中のＰａｎ−ＩＲ７００の濃度または光への曝露に依存しない頑健な測定値であることを実証する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰａｎ−ＩＲ７００溶液は、様々な濃度で、または様々な線量によるＮＩＲ光曝露の後、そのＦＬＴを変化させなかった。したがって、周囲の化学的な微小環境だけが、ＩＲ７００ ＦＬＴに影響を及ぼすようである。ＩＲ７００は通常、蛍光性であり、腫瘍負荷を反映するが、リソソーム内における異化および光退色の後、蛍光が減少し得、したがって、組織の生存率に関して曖昧さをもたらす。しかし、これらの光化学物質および生化学物質の変化は、ＦＬＴに影響を及ぼさない。したがって、ＦＬＴの短縮は、ＩＲ７００蛍光強度より良好なバイオマーカーである。
結論的に述べると、外科的手順または内視鏡手順の間、ＭＡｂ−ＩＲ７００コンジュゲートを使用するＰＩＴの細胞傷害効果をニアリアルタイムで評価するためにＦＬＴを用いることができる。ＦＬＴは、エンドリソソーム（endolysomal）への内部移行の間に延長するが、細胞損傷の後、急速に短縮する。ＦＬＴはまた、遊走するマクロファージによる内部移行に起因して、ＰＩＴ後の約６時間という短期間にわたり延長する。その後、ＦＬＴは安定して減少する。したがって、ＦＬＴのイメージングは、したがって、形態的変化が明らかとなる前に、ＰＩＴの効果の評価を可能とする。
（実施例１５）
光免疫療法と化学療法との組合せ
この実施例では、ＰＩＴを、化学療法など、がんを処置するための他の療法と組み合わせるのに用いられる方法について記載する。ＰＩＴの間に生じる透過性の増強により、ナノサイズの作用物質の送達が増強されることが実証される。
材料および方法
細胞。ＨＥＲ１を発現するＡ４３１細胞を、ＰＩＴに用いた。細胞は、９５％の空気および５％の二酸化炭素の雰囲気下、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコの中の１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０で成長させた。
試薬。ＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ ＮＨＳエステル（ＩＲ７００；Ｃ７４Ｈ９６Ｎ１２Ｎａ４Ｏ２７Ｓ６Ｓｉ３；分子量：１９５４．２２）およびＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ＮＨＳエステル（ＩＲ８００；Ｃ５０Ｈ５４Ｎ３Ｎａ３Ｏ１７Ｓ４；分子量：１１６６．２０）は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）に対して指向する完全ヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるパニツムマブは、Ａｍｇｅｎから得た。ヒトＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）に対して指向する組換えヒト化ｍＡｂであるトラスツズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから得た。Ｑｔｒａｃｋｅｒ ８００非標的化量子ドットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。用いる他の全ての化学物質は、試薬グレードであった。
ＩＲ７００およびＩＲ８００と結合体化したｍＡｂの合成：色素とｍＡｂとのコンジュゲーションは、上記実施例で報告した手順に従って実施した。０．１モルｌ−１のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）中、室温で１時間にわたり、各ｍＡｂ（１ｍｇ、６．８ナノモル）を、ＩＲ７００（６０．２μｇ、３０．８ナノモル）またはＩＲ８００（３５．９μｇ、３０．８ナノモル）と共にインキュベートした。混合物は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。色素およびタンパク質の濃度を、分光法（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による吸収により測定して、各ｍＡｂ分子に結合体化したフルオロフォア分子の数を確認した。
光免疫療法の後におけるｉｎ ｖｉｖｏナノ薬物送達。６週齢〜８週齢の雌性ホモ接合無胸腺ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）から購入した。処置の間、マウスにイソフルランで麻酔をかけた。２００万個のＡ４３１細胞を、各マウスの右側背部および左側背部に皮下注射した。細胞注射の５日後、１００μｇのＰａｎ−ＩＲ７００を静脈内投与し、１日後、いずれかの側の腫瘍に、赤色発光ダイオードからの６７０〜６９０ｎｍの波長の、および光出力計（ＰＭ １００（Ｔｈｏｒｌａｂｓ））で測定される１０〜１００Ｊｃｍ−２の出力密度の、ＮＩＲ光で照射した。ＰＩＴの１時間後、Ｐａｎ−ＩＲ８００（１００μｇ）、Ｑｔｒａｃｋｅｒ ８００非標的化量子ドット（３２．５ピコモル）、またはＤａｕｎｏＸｏｍｅ（３０ｍｇｋｇ−１）を静脈内注射し、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＭａｅｓｔｒｏ Ｉｍａｇｅｒ（ＣＲｉ）により、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光画像を得た。ＭＲイメージングのためには、ＳＰＩＯ（Ｆｅｒｉｄｅｘ）を、ＰＩＴの１時間後に静脈内投与し、ＭＲ画像を得た。腫瘍を切除し、ｅｘ ｖｉｖｏイメージングの後の組織学的研究および蛍光顕微鏡検査研究のために凍結するかまたはパラフィン包埋した。
ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング。２００万個のＡ４３１細胞または３Ｔ３−ＨＥＲ２細胞を右側背部および左側背部に注射した５日後、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を乳房体（ｍａｍｍａｒｙ ｐａｄ）に注射した７日後、約７５ｍｍ３の腫瘍体積を選択した。ＩＲ７００およびＩＲ８００のシグナルは、７００および８００ｎｍの蛍光チャネルを用いる、蛍光カメラ（Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ、ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。Ｑｄｏｔ８００は、５７５〜６０５ｎｍの間（励起）の範囲にわたる帯域フィルター、および８００ｎｍ（発光）を超えるロングパスＮＩＲフィルターを用いる、Ｍａｅｓｔｒｏ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲｉ）により検出した。また、ダウノルビシンの蛍光画像も、５０３〜５５５ｎｍ（励起）の帯域フィルターおよび５８０ｎｍ（発光）を超えるロングパス緑色フィルターを用いるＭａｅｓｔｒｏにより得た。調整可能な発光フィルターは、曝露を一定とするときのＮＩＲフィルターセットおよび緑色フィルターセットについて、６５０から９５０ｎｍまで、および５００から８００ｎｍまでの１０ｎｍ増分を自動的に進行させたた。蛍光スペクトル画像は、自己蛍光スペクトルならびにＱｄｏｔ８００およびダウノルビシンに由来するスペクトルからなり、したがって、市販のソフトウェア（Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェア；ＣＲｉ）を用いて、それらのスペクトルパターンに基づき、それらを分離した。マウスは、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングの後速やかに、二酸化炭素で屠殺した。腫瘍を切除し、ｅｘ ｖｉｖｏイメージングの後の組織学的研究および蛍光顕微鏡検査研究のために凍結するかまたはパラフィン包埋した。
治療研究。超ＥＰＲ効果の腫瘍治療に対する有効性を決定するために、ＰＩＴがＤａｕｎｏＸｏｍｅの治療効果を増強しうるかどうかを以下の通りに調査した。１００万個のＡ４３１細胞をマウスの右背部に皮下注射した。腫瘍体積を決定するために、最大の縦径（長さ）および最大の横径（幅）を、外側ノギスで決定した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、以下の式：腫瘍体積＝長さ×幅×０．５により計算した。約４０ｍｍ３の体積に達した腫瘍を選択した。選択したマウスを、以下の処置：（１）処置なし；（２）ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（６ｍｇｋｇ−１）；（３）ＰＩＴ（５０Ｊｃｍ−２）；（４）ＰＩＴ（５０Ｊｃｍ−２）、１時間後のＤａｕｎｏＸｏｍｅ（６ｍｇｋｇ−１）、について、１群当たり少なくとも１０匹のマウスからなる４つの群へと無作為化した。処置後、マウスを毎日モニタリングし、腫瘍体積を、それが７５０ｍｍ３に達する（このとき、マウスを二酸化炭素ガスで安楽死させた）まで週２回測定した。
蛍光顕微鏡検査。１０μｍ厚の凍結切片またはパラフィン切片を調製し、以下のフィルター：５９０〜６５０ｎｍおよび４８０〜５５０ｎｍの励起波長フィルター、ＩＲ７００、Ｑｄｏｔ８００、およびダウノルビシンのそれぞれについて、発光波長６６２．５〜７４７．５ｎｍ、７６５〜８５５ｎｍ、および５９０ｎｍのロングパスフィルターを装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ８１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて腫瘍切片における蛍光を検出した。また、透過光微分干渉コントラスト法による画像も収集した。標準的なプロトコールに従い、Ｈ＆Ｅ染色およびプルシアンブルー染色を実施した。
２回目の注射の最適のタイミング。２回目の注射（ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｏｔ）の最適のタイミングを決定するために、Ｐａｎ−ＩＲ８００（１００μｇ）を、Ａ４３１担持マウスへと、ＰＩＴ処置の１、６、および２４時間後に静脈内投与し、上記のプロトコールに従い、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒにより、１時間にわたる動的イメージングを実行した。
統計学的解析：別段に示されない限り、データは、３つの実験の最小値に由来する平均値±標準誤差として表される。統計学的解析は、統計学プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実行した。多重比較のために、事後検定を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）（事後検定を伴うクルスカル−ワリス検定）を用いた。本明細書では腫瘍体積が７５０ｍｍ３に達しなかった場合に決定される生存の累積確率は、各群において、カプラン−マイヤー生存曲線解析を用いて推定し、結果を、多重性についてのボンフェローニによる補正を伴うログランク検定を用いて比較した。Ｐ＜０．０５を、統計学的な有意差を示すと考えた。
結果
ＰＩＴは腫瘍における灌流を増大させる
ＰＩＴ処置後の腫瘍における灌流の変化を検証するために、Ａ４３１（ＨＥＲ１陽性）担持マウスにおけるＰＥＧ化量子ドット８００（非標的化Ｑｄｏｔ８００）の動的分布を評価した。Ａ４３１腫瘍は、ＩＲ７００と結合体化した抗ＨＥＲ１ｍＡｂ（パニツムマブ）（Ｐａｎ−ＩＲ７００）の注射１日後に、ＮＩＲ光（５０Ｊｃｍ−２）の単回投与で処置した。光照射の１時間後にＱｄｏｔ８００を投与し、ｉｎ ｖｉｖｏ動的イメージング研究を実行した。Ｑｄｏｔ８００の直径は、平均５０ｎｍであり、これは、サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。Ｑｄｏｔ８００の迅速な蓄積が、ＰＩＴで処置した腫瘍において１時間以内に観察されたのに対し、ＮＩＲ光への曝露なしの対照腫瘍では有意な取込みが検出されなかった（図１４Ａ）。１分〜６０分の間におけるシグナル強度（ＳＩ）の増大率は、ＰＩＴで処置した腫瘍では、対照腫瘍における場合の２５．７倍高かったが、これは、超ＥＰＲ指数として、以下の式により計算した：［（ＳＩＰＩＴ ａｔ ６０ ｍｉｎ−ＳＩＢａｃｋ ａｔ ６０ ｍｉｎ）−（ＳＩＰＩＴ ａｔ １ ｍｉｎ−ＳＩＢａｃｋ ａｔ １ ｍｉｎ）］／［（ＳＩＣｏｎｔｒｏｌ ａｔ ６０ ｍｉｎ−ＳＩＢａｃｋ ａｔ ６０ ｍｉｎ）−（ＳＩＣｏｎｔｒｏｌ ａｔ １ ｍｉｎ−ＳＩＢａｃｋ ａｔ １ ｍｉｎ）］（図１４Ｂ）。ＰＩＴで処置した腫瘍におけるシグナルが２４時間後まで高値で維持されたことから、Ｑｄｏｔ８００の長期間にわたる保持が示された。
病理学的解析および蛍光顕微鏡検査による研究は、ＰＩＴが、腫瘍細胞の壊死性損傷を結果としてもたらし、Ｑｄｏｔ８００が、ＰＩＴで処置した腫瘍における壊死性領域および間質において広範に分布することを明らかにした（図１４Ｃ）。ＣＤ３１染色は、腫瘍における血管の大半が、弱っており、また、周囲の腫瘍細胞も重度に損傷していることを実証した（図１４Ｃ）。他方、Ａ４３１細胞は、対照腫瘍でほぼ生存しており、Ｑｄｏｔ８００の蛍光シグナルは、主血管の近傍に限局性であった（図１４Ｃ）。
透過性の破断点を決定するために、臨床使用の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の造影剤である超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）（直径：２００ｎｍ）を負荷した。ＳＰＩＯの注射後５分以内に、ＰＩＴで処置した腫瘍ではシグナル強度が劇的に減少したが、対照腫瘍ではわずかな低減が観察された（図１５Ａ）。６０分におけるシグナル強度の低減率は、ＰＩＴで処置した腫瘍では、対照腫瘍における低減率より大きかった。ＳＰＩＯは、ＰＩＴで処置された腫瘍における壊死性領域および間質に蓄積し、これは、プルシアンブルー染色で確認した（図１５Ｂ）。Ｔ１造影剤およびＴ２造影剤としての、ガドリニウム（Ｇｄ）で標識したポリアミドアミンデンドリマー（第６世代）（Ｇ６−Ｇｄ）およびＵＳＰＩＯのそれぞれによっても類似の結果が得られた。ＰＩＴで処置された腫瘍では、Ｇ６−Ｇｄ（直径１０ｎｍ）が、時間と共に縞状に分布した。対照的に、対照腫瘍では、腫瘍表面の主血管だけが強く描写された（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）。
また、ＵＳＰＩＯ（直径：３０ｎｍ）も、プルシアンブルー染色により示唆される通り、ＰＩＴで処置した腫瘍により、とりわけ、間質および壊死性領域に迅速に取り込まれた。これらの結果は、直径が少なくとも２００ｎｍのナノ粒子が、ＰＩＴにより処置された腫瘍組織への大量で迅速な漏出を示すことを実証し、したがって、この超ＥＰＲ法は、がん治療へと適用することができる。
ＰＩＴは抗がん薬の送達および効力を増強する
Ａ４３１担持マウスにおけるパニツムマブ（直径１０ｎｍ）の２回目の注射により、超ＥＰＲレジメンについて調べた。パニツムマブは、ＥＧＲＲを発現する転移性結腸直腸癌を処置するための臨床使用の治療モノクローナル抗体である。パニツムマブの有用性はまた、乳がん、肺がん、頭頸部がんにおいても検証されている。ＰＩＴが、１０〜６０分以内に、処置した腫瘍におけるＰａｎ−ＩＲ８００の透過性を促進したのに対し、対照腫瘍におけるシグナル強度の変化は検出されず、Ｑｄｏｔ８００およびＧ６−Ｇｄを含めたナノ粒子の場合と一致する（図１６Ａ）。抗がん薬（Ｐａｎ−ＩＲ８００）の十分な送達を達成するのに必要とされる有効な光線量を決定した。ＰＩＴで処置した腫瘍におけるＩＲ８００のシグナル強度は、時間と共に、光線量依存的な様式で増大し（図１６Ｂ）、プローブ注射の１分〜６０分後の間における、ＰＩＴで処置した腫瘍におけるＰａｎ−ＩＲ８００の超ＥＰＲ指数は、対照腫瘍における超ＥＰＲ指数より有意に高値であった。高線量のＮＩＲ光で照射された群における対照腫瘍では、おそらくは散乱したＮＩＲ光が照射された側から交差したために、シグナル強度のわずかな増大が観察された（図１６Ａ）。病理学的研究は、ＰＩＴで処置した腫瘍における壊死性細胞死が、高線量のＮＩＲ光に曝露されると強化されることを明らかにした。興味深いことに、ＰＩＴによる灌流の変化は、処置後に時間と共に徐々に弱まり、２４時間以内に完全に止まった（図１６Ｃおよび１６Ｄ）ことから、血管と腫瘍組織との間の障壁の修復（ｒｅｐａｉｒｍｅｎ）または血流の完全な遮断が示された。これらの結果は、２回目の注射の最適のタイミングが、６時間までであることを示した。したがって、様々な数の個々の標的分子を発現する３つの異なる細胞（Ａ４３１（ＨＥＲ１陽性）、３Ｔ３−ＨＥＲ２（ＨＥＲ２陽性）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ１陽性））に対する２つの異なるｍＡｂ（パニツムマブおよびトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ））により誘導される、ＰＩＴ後の腫瘍における灌流の変化の類似性に基づき、この超ＥＰＲは一般に、他のｍＡｂおよび抗原に対しても適用可能である（図１８）。
超ＥＰＲ効果に基づく効率的ながん治療のための分子非標的化治療剤の可能性を調査するため、ダウノルビシン含有リポソーム（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ；ＤＸ）（直径：５０ｎｍ）を調べ、治療研究に適用した。ＤＸは、ＳＰＩＯおよびＵＳＰＩＯと同様に、１時間にわたりＰＩＴで処置した腫瘍に迅速に蓄積し、そこに保持された（図１７Ａ、および１７Ｂ）。ＰＩＴで処置した腫瘍における６０分のシグナル強度の増大率は、対照腫瘍における増大率と比較して大きかった（図１７Ｃ）。Ｑｄｏｔ８００と同様に、ＤＸは、ＰＩＴで処置した腫瘍における生存した腫瘍組織を取り囲みながら広範に分布し、ＩＲ７００（生存した腫瘍細胞を示す）とＤＸとの共局在化も部分的に観察されたが、対照腫瘍におけるＤＸのシグナルは、主血管の近傍に局在化した（図１７Ｄ）。この現象は、腫瘍の辺縁部およびコアのいずれにおいても実証された。Ａ４３１腫瘍を、Ｐａｎ−ＩＲ７００の注射の１日後に、単一の線量（５０Ｊｃｍ−２）の光で処置した。本方法の効力を、４群のＡ４３１担持マウス（各群においてｎ≧１０）で決定した。本発明者らが処置した全ての腫瘍の面積は７５０ｍｍ３未満であった。より大きい腫瘍は副作用（皮下出血、腫瘍の出血、または衰弱状態）と関連するので、本発明者らの施設の動物のケアおよび使用についてのガイドラインに従い、マウスを安楽死させることを必要とした。Ａ４３１腫瘍の腫瘍体積は、ＰＩＴとＤＸとの組合せ療法により、処置されていない対照マウス、ＤＸだけで処置したマウス、およびＰＩＴだけで処置したマウスと比較して有意に減少し（図１７Ｅ）、ＰＩＴとＤＸとによる組合せ療法により、マウスにおける生存も他の群より有意に延長した（図１７Ｆ）。ＰＩＴにＤＸを加えた群では、体重の明白な低下が観察されなかった。
別の実験では、３Ｔ３／ＨＥＲ２マウスに、Ｔｒａ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｔｒａ−ＩＲ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。図１９Ａに示される通り、１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。したがって、その腫瘍がＮＩＲ光に曝露された領域だけにＴｒａ−ＩＲ８００が蓄積した可能性がある。別の実験では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８担持マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｐａｎ−ＩＲ８００は、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。図１９Ｂに示される通り、１０分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。
Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。ＵＳＰＩＯは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。図２０Ａに示される通り、５分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。図２０Ｂにプルシアンブルー染色およびＨＥ染色を示す。ＰＩＴ後におけるＧ６−Ｇｄの動的画像である。Ａ４３１マウスに、Ｐａｎ−ＩＲ７００を注射し、２４時間後、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を右側の腫瘍に照射した。Ｇ６−Ｇｄは、ＰＩＴ処置の１時間後に投与した。図２０Ｃに示される通り、５分以内に、右側の腫瘍だけが明瞭に示された。
腫瘍の辺縁領域およびコア領域における蛍光顕微鏡検査による研究を実施した（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）。図２１ＡにおけるＩＲ７００シグナルは、生存したＡ４３１細胞を示す。ダウノルビシン含有リポソームが、ＰＩＴで処置した腫瘍組織に広範に分布し、ＩＲ７００とダウノルビシン含有リポソームとの共局在化が部分的に観察された。とりわけ、コア領域では、ＤＸが、局所的な壊死性領域に取り込まれうる。図２１Ｂは、治療後における体重の変化を示す。明白な差は群間になかった。
結論的に述べると、抗体−ＩＲ７００ＰＩＴ療法は、抗体コンジュゲートが細胞膜へと結合する場合に限り有効であり、抗体コンジュゲートが結合しないか、またはＮＩＲ光で照射されない場合は、光毒性を示さなかった。加えて、ＰＩＴは、ナノサイズの作用物質の送達の一助となる超透過性増強および保持効果（ｓｕｐｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ）（超ＥＰＲ効果）も誘導した。したがって、ＭＡｂ−ＩＲ７００とナノサイズの作用物質との組合せを用いるＰＩＴを、がんの高度に選択的で有効な処置のためのセラノスティックに用いることができる。
本開示の原則が適用されうる多くの可能な実施形態を考慮して、例示される実施形態は、本開示の例に過ぎず、本発明の範囲に対する限定と考えるべきではないことを認識されたい。そうではなくて、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神の内に収まる全てを、本発明者らによる発明として主張する。

Claims (23)

  1. 細胞を死滅させる方法であって、
    細胞表面タンパク質を含む細胞を、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、該抗体が該細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；
    該細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量で照射するステップと；
    該細胞に照射した約０〜８時間後に、該細胞を１または複数の治療剤と接触させ、これにより、該細胞を死滅させるステップと
    を含む方法。
  2. 細胞致死をリアルタイムで検出する方法であって、
    細胞表面タンパク質を含む細胞を、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、該抗体が該細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；
    該細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも３０Ｊｃｍ−２の線量で照射するステップと；
    該細胞に照射した約０〜４８時間後に、蛍光寿命イメージングで該細胞を検出し、これにより、該細胞致死をリアルタイムで検出するステップと
    を含む方法。
  3. 前記細胞に照射した約０〜４８時間後に、蛍光寿命イメージングで該細胞を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記腫瘍細胞が、がん細胞である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記がん細胞が、乳房、肝臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、脳、子宮頸部、骨、皮膚、または肺のがん細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記がん細胞が、血液のがん細胞である、請求項５に記載の方法。
  8. 前記細胞表面タンパク質が、腫瘍特異的タンパク質である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記腫瘍特異的タンパク質が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｌｏｕｉｓ Ｙ、メソテリン、ＣＥＡ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記抗体−ＩＲ７００分子が、パニツムマブ−ＩＲ７００分子、トラスツズマブ−ＩＲ７００分子、バシリキシマブ（Basilitumab）−ＩＲ７００分子、ゼナパックス−ＩＲ７００分子、Ｓｉｍｉｔｅｃｔ−ＩＲ７００分子、またはＪ５９１−ＩＲ７００分子を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記細胞に、６８０ｎｍの波長で照射する、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子が、少なくとも２つの異なる抗体−ＩＲ７００分子を含み、第１の抗体−ＩＲ７００分子が、第１の抗原に対して特異的であり、第２の抗体−ＩＲ７００分子が、該第１の抗原の異なるエピトープに対して特異的であるか、または第２の抗原に対して特異的である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記細胞が被験体に存在し、該細胞を前記１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および前記１または複数の治療剤と接触させるステップが、治療有効量の、該１または複数の抗体−ＩＲ７００分子および該１または複数の治療剤を、該被験体へと投与するステップを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記細胞が被験体に存在し、該細胞に照射するステップが、
    該被験体に照射するステップ；および／または
    該被験体における腫瘍に照射するステップ
    を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記細胞が被験体の血液に存在し、該細胞に照射するステップが、該被験体により装着されたデバイスを用いることにより該血液に照射するステップを含み、該デバイスが近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記細胞が被験体に存在する、請求項１から１５のいずれかに記載の方法であって、
    前記抗体−ＩＲ７００分子に特異的に結合できる細胞表面タンパク質を発現する腫瘍を有する被験体を選択するステップ
    をさらに含む、方法。
  17. 前記腫瘍の体積またはサイズを、処置の非存在と比べて少なくとも２５％減少させる、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記被験体の生存期間を、前記抗体−ＩＲ７００分子の投与および照射の非存在と比べて延長する、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記細胞を、前記治療有効量未満の量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップと；
    該細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも０．００１Ｊｃｍ−２の線量で照射し、これにより、該細胞の検出を可能とするステップと
    をさらに含む、請求項１または３から１８のいずれかに記載の方法。
  20. パニツムマブ−ＩＲ７００分子、トラスツズマブ−ＩＲ７００分子、またはＪ５９１−ＩＲ７００分子を含む組成物。
  21. 衣料品、装身具、または被覆品と；
    該衣料品、装身具、または被覆品へと組み込まれたＮＩＲ ＬＥＤと
    を含む、装着用デバイス。
  22. 前記衣料品、装身具、または被覆品へと組み込まれた電源および／または冷却源をさらに含む、請求項２１に記載の装着用デバイス。
  23. 被験体の血液中の腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
    該被験体に治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子を投与するステップであって、該抗体が該腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；
    該腫瘍細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長の、少なくとも２０Ｊｃｍ−２の線量のＮＩＲ ＬＥＤで照射し、これにより、該細胞を死滅させるステップであって、該ＮＩＲ ＬＥＤが、該被験体により装着された請求項２１または２２のいずれかに記載の装着用デバイスに存在するステップと
    を含む方法。
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