IT202000014974A1 - Anticorpo anti-cla coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l’uso nelle malattie della cute - Google Patents

Anticorpo anti-cla coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l’uso nelle malattie della cute Download PDF

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Description

ANTICORPO ANTI-CLA CONIUGATO AD UNA MOLECOLA FOTOSENSIBILIZZANTE PER L?USO NELLE MALATTIE DELLA CUTE.
DESCRIZIONE
La presente invenzione concerne un anticorpo specifico per la glicoproteina Antigene Linfocitario Cutaneo (CLA) coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso come medicinale nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, malattie immunitarie e/o degenerative della cute.
STATO DELL?ARTE
CLA, anche nota come Cutaneous Lymphocyte-associated Antigen oppure Antigene Linfocitario Cutaneo, ? una glicoproteina di membrana che, sulla cute, funge da ligando per le E-selectine ossia glicoproteine transmembrana espresse sulla superficie delle cellule endoteliali che, mediante interazione con CLA, mediano il processo di migrazione dei linfociti dallo spazio intravascolare al tessuto durante un?infiammazione.
Negli esseri umani CLA ? espressa in pi? del 90% delle cellule linfocitarie T che migrano nella cute durante disordini infiammatori o immunitari della cute (Fuhlbrigge RC et.al, Nature 1997).
Tali disordini infiammatori della cute comprendono a titolo di esempio non limitativo, la dermatite atopica, la psoriasi, l?alopecia areata e la vitiligine.
Nella psoriasi, ? stato mostrato come il numero di cellule T esprimenti CLA sia inversamente correlato alla severit? della patologia, a significare che tali cellule vengono bloccate nel tessuto cutaneo durante la fase acuta infiammatoria e ritornano invece nel flusso vascolare quando la lesione cutanea diminuisce (Ferran M. et al., Exp Dermatol, 2013).
Nei casi di dermatite atopica, la cute presenta un numero elevato di cellule linfocitarie T, analogamente alla cute di soggetti con psoriasi, e tali cellule T sono primariamente del tipo CD4+ esprimenti CLA (Czarnowicki T. et al., J Allergy Clin Immunol, 2015).
La glicoproteina CLA ? stata identificata inoltre nella membrana cellulare di linfociti T presenti in alcuni tumori cutanei di tipo maligno (Gelb AB et.al, Am J Pathol 1993).
In particolare, cellule T CLA+ sono state individuate in masse tumorali di melanomi cutanei di tipo primario. Tali cellule tuttavia tendono a diminuire fino a scomparire nelle lesioni metastatiche cutanee, indicando che negli stati avanzati di tale patologia tumorale la migrazione extravasale linfocitaria viene inibita (Nooijen PT et al., Am J Pathol 1998).
Il linfoma ? un tipo di tumore che origina nel sistema linfatico.
In particolare, un linfoma non-Hodgkin si sviluppa a partire da linfociti T CD4+ che preferenzialmente tendono a migrare sulla cute o in diversi organi quali linfonodi, stomaco, intestino e sistema nervoso centrale.
In alcune tipologie rare di linfomi a cellule T, come ad esempio la papulosi linfomatoide e il linfoma anaplastico cutaneo primitivo a cellule grandi, ? stata riportata la presenza nella cute di linfociti T esprimenti la proteina CLA (Magro CM et.al., J Cutan Pathol 2008).
Per quanto riguarda pazienti con la sindrome di S?zary (SS), una forma aggressiva di linfoma cutaneo alle cellule T, le cellule T di tipo maligno derivano da linfociti della memoria centrale e si presentano con diversi immunofenotipi esprimenti generalmente le proteine CCR7, L-selectina e CD27 (Wilcox RA et al., Am J Hematol 2017).
Tuttavia, nella cute di soggetti con SS sono state riscontrate percentuali variabili di cellule T maligne esprimenti CLA (Campbell JJ et al., Blood 2010).
Nella micosi fungoide (MF), un linfoma cutaneo non-Hodgkin, i linfociti T nella cute mostrano un immunofenotipo differente rispetto a SS.
In particolare, i linfociti T proliferanti nella cute del soggetto con MF sono linfociti T negativi per CCR7, L-selectina e/o CD27.
Al contrario, tali linfociti T migrati in corrispondenza delle lesioni cutanee esprimono elevate quantit? di CLA e CCR4.
Tali linfociti T CLA+ e CCR4+, una volta migrati nella cute, tendono a risiedere permanentemente in tale tessuto, senza ricircolare nel flusso sanguigno o entrare nei linfonodi.
Con la progressione della suddetta patologia, nei linfociti T viene inibita la sintesi delle molecole specifiche della cute, a favore di una maggiore espressione di molecole tipiche dei linfociti T presenti a livello dei linfonodi (Ferran M et.al., Exp Dermatol 2013).
La MF rappresenta la forma pi? diffusa di linfoma cutaneo ed ? presente in pi? del 50% di tutti i linfomi della cute.
I primi segni clinici di tale patologia sono delle lesioni del derma, in forma di placche piatte, localizzate soprattutto sulle natiche e su altre zone non esposte al sole, come la parte bassa del tronco, le cosce e le mammelle, alle quali ? associato anche un forte prurito.
Con l?evolversi della patologia, ? presente una progressiva infiltrazione di placche e tumori nodulari di colore rosso-violetto oppure un eritroderma generalizzato.
Le sedi extracutanee maggiormente colpite sono i linfonodi, seguiti da alcuni organi come fegato, polmone e midollo spinale.
Ad oggi, i soggetti che presentano MF senza coinvolgimento extracutaneo, sono trattati limitatamente con terapia topica mediante applicazione locale o sulla intera cute di mecloretamina idrocloride. Mecloretamina ? un agente chelante altamente tossico che presenta numerosi effetti collaterali tra cui mielosoppressione a livello centrale, patologie gastrointestinali, alopecia e altri effetti tipici dei farmaci antitumorali sistemici.
In alternativa, il soggetto con MF viene sottoposto a fototerapia con raggi ultravioletti B (UVB), psoraleni e ultravioletti A (UVA) oppure con radioterapia localizzata con elettroni.
La fototerapia con UVB e UVA e somministrazione di psoraleni permette di ottenere risultati simili all?uso di mecloretamina, tuttavia, a causa dell?assorbimento sistemico, le potenziali complicanze ematologiche sono maggiori e la durata massima del trattamento ? limitata per ridurre il rischio di carcinogenesi della cute.
La radioterapia con elettroni ? essenzialmente atta ad essere utilizzata nei rari casi che presentano lesioni singole e, inoltre svantaggiosamente, deve essere seguita comunque da un regime di mantenimento con mecloretamina.
Esistono poi alcune terapie di tipo topico, che sono tuttavia ancora in fase di studio e che includono l?uso di steroidi topici, bexarotene gel, methotrexate topico e imiquimod crema.
Quando MF ? ormai diffusa oltre lo strato cutaneo del soggetto, la terapia ? generalmente caratterizzata dall?uso di agenti chemioterapici standard che, tuttavia, consentono soltanto di ottenere un temporaneo controllo della malattia, ed hanno quindi un ruolo essenzialmente palliativo.
Non esistono dunque ad oggi, terapie specializzate per MF e in generale per i disordini infiammatori, tumorali, immunitari e degenerativi della cute che coinvolgono migrazione linfocitaria dai vasi alla cute.
I trattamenti standard di tipo chemioterapico, cos? come i trattamenti con corticosteroidi o con farmaci antiinfiammatori non steroidei presentano numerosi svantaggi legati agli effetti collaterali e non sono comunque definitivi per la cura delle suddette patologie.
E? dunque scopo della presente invenzione realizzare un nuovo e migliorato medicinale e trattamento terapeutico che abbia il vantaggio di essere altamente specifico.
In pi?, ? scopo della presente invenzione che tale medicinale e trattamento terapeutico presenti minimi o addirittura assenti effetti collaterali, rispetto alle classiche terapie note per la cura delle malattie immunitarie, infiammatorie, neoplastiche e degenerative della cute, in particolare per la cura dei linfomi cutanei.
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata di seguito riportata, e dagli esempi realizzativi forniti a titolo illustrativo e non limitativo.
DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE
Gli inventori della presente invenzione hanno caratterizzato l?immunofenotipo delle cellule linfocitarie T CD4+ derivanti da biopsia cutanea di un soggetto umano affetto da Micosi Fungoide (MF) e l?immunofenotipo di cellule periferiche mononucleate estratte dal sangue di soggetti donatori sani come cellule controllo.
E? stato individuato che pi? del 90% delle cellule linfocitarie T di MF esprime la glicoproteina CLA (Antigene Linfocitario Cutaneo).
Tale caratterizzazione ha permesso di individuare un target specifico in grado di identificare i linfociti T extravasali presenti nella cute idonei a dare origine a placche patologiche e, soprattutto, differenziare tali linfociti T potenzialmente malati rispetto ai linfociti T normalmente presenti nell?organismo.
E? stato dunque studiato un approccio in grado di colpire in modo mirato tali cellule T CLA+ residenti nella cute.
Sono state realizzate delle molecole leganti la glicoproteina CLA espressa sulle cellule T, in particolare ? stato realizzato un anticorpo in grado di legarsi specificatamente a tale glicoproteina.
L?utilizzo di un anticorpo anti-CLA specifico permette di ridurre il rischio di immunosoppressione sistemica, che spesso si verifica dopo trattamento con anticorpi diretti verso altri target di membrana dei linfociti, come ad esempio anti-CD4, anti-CD52 o anti CCR4, che non rappresentano dei target specifici dei linfociti T extravasali ma possono essere presenti anche su linfociti T normalmente residenti dell?organismo.
Tale anticorpo anti-CLA ? stato poi coniugato ad una molecola fotosensibilizzante attivabile da una radiazione nella regione del vicino infrarosso compresa tra 650 e 900 nm al fine di aumentarne l?attivit? citotossica.
Tale approccio fotoimmunoterapico vantaggiosamente combina la specificit? di un anticorpo diretto verso le cellule T malate e/o potenzialmente malate con un gruppo chimico attivabile da radiazioni nella regione del vicino infrarosso.
E? stata quindi testata l?attivit? citotossica di tale anticorpo coniugato nei confronti di linfociti T presenti nelle placche di MF.
? stato dimostrato sorprendentemente, per la prima volta, che l?utilizzo di una radiazione del vicino infrarosso su cellule linfocitarie di MF trattate con un anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante ? efficace nel determinare la lisi cellulare delle cellule tumorali.
E? stato inoltre individuato che tale anticorpo anti-CLA coniugato non ? attivo nei confronti delle cellule linfocitarie T sane, diminuendo dunque i possibili effetti indesiderati derivanti dalla morte di cellule linfocitarie, o di altro tipo, sane.
E? stato dunque dimostrato che tale trattamento presenta una maggiore efficacia nel trattamento nelle cellule bersaglio e una maggiore specificit? rispetto alle terapie standard.
Grazie a tale maggiore specificit?, il trattamento con l?anticorpo antiCLA coniugato comporta una riduzione degli effetti collaterali dati dai trattamenti tradizionali non specifici.
In particolare, essendo tali linfociti T target dell?anticorpo anti-CLA presenti nella cute del soggetto, l?irradiazione attivante la molecola fotosensibilizzante pu? essere realizzata localmente, a livello delle porzioni cutanee ove tale anticorpo si ? legato, migliorando ulteriormente la specificit? della terapia e diminuendo gli effetti dannosi causati da una fototerapia totale aspecifica della cute del soggetto, come per i trattamenti noti.
L?anticorpo anti-CLA coniugato della presente invenzione rappresenta quindi un nuovo e migliorato strumento terapeutico per la cura di malattie neoplastiche della cute, nonch? di altre malattie legate all?infiltrazione cutanea di linfociti T, come malattie infiammatorie, malattie immunitarie e malattie degenerative della cute.
Un oggetto della presente invenzione ? pertanto un anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante avente una lunghezza d?onda di assorbimento nella regione del vicino infrarosso compresa tra 650 e 900 nm per l?uso come medicinale.
L?anticorpo anti-CLA pu? essere un anticorpo monoclonale, policlonale, umano, murino, umanizzato, chimerico, ricombinante, oppure un frammento di anticorpo come ad esempio un frammento scFv, un frammento Fab e un frammento F(ab?)2.
Con il termine ?anticorpo monoclonale? si definisce un insieme di anticorpi prodotti da un singolo clone di cellula immunitaria, e che sono dunque identici tra loro.
Con il termine ?anticorpo policlonale? si definisce una miscela di anticorpi geneticamente diversi perch? derivanti da plasmacellule diverse e che potrebbero dunque riconoscere un epitopo diverso dello stesso antigene.
Con il termine ?anticorpo umano? si intende un anticorpo monoclonale o policlonale interamente derivato da cellule umane.
Con il termine ?anticorpo murino? si intende un anticorpo monoclonale o policlonale interamente derivato da cellule murine.
Con il termine ?anticorpo umanizzato? si definisce un anticorpo di origine umana, la cui regione ipervariabile ? stata sostituita dalla regione omologa di anticorpi monoclonali non umani.
Il termine ?anticorpo chimerico? definisce un anticorpo contenente porzioni derivanti da anticorpi diversi.
Con il termine ?anticorpo ricombinante? si definisce un anticorpo ottenuto mediante tecnologia di DNA ricombinante.
Il termine ?frammento scFv? definisce frammenti immunoglobulinici del tipo single chain fragment variable, scFv, capaci di legarsi unicamente con l?antigene di interesse.
Tali frammenti scFv possono essere sintetizzati in forma di dimeri, trimeri e tetrameri mediante dei linker peptidici.
Con i termini ?frammento Fab? e ?frammento F(ab?)2? si definiscono frammenti immunoglobulinici composti da una catena leggera legata al frammento Fc della catena pesante contigua.
Quando le porzioni Fab sono a coppie il frammento ? definito Fab2. L?anticorpo della presente invenzione ? un anticorpo che si lega specificatamente all?antigene linfocitario cutaneo CLA che viene espresso sulla superficie cellulare delle cellule linfocitarie T presenti nella cute.
Un esempio noto di anticorpo anti-CLA ? l?anticorpo monoclonale HECA-452 prodotto da Miltenyl Biotech.
Con il termine ?molecola fotosensibilizzante? si intende una molecola in grado di assorbire una predefinita quantit? di radiazioni e, mediante rilascio di sostanze radicaliche oppure mediante emissione di radiazioni a lunghezze d?onde predefinite, favorire la decomposizione di altre molecole presenti nell?intorno.
La molecola fotosensibilizzante della presente invenzione ha una lunghezza d?onda di assorbimento nella regione del vicino infrarosso compresa tra 650 e 900 nm, preferibilmente di circa 689-690 nm.
Preferibilmente la molecola fotosensibilizzante dell?invenzione appartiene al gruppo delle ftalocianine.
Ancor pi? preferibilmente, la molecola fotosensibilizzante dell?invenzione ? la molecola IR700 (IRDye? 700DX).
IR700 ? una molecola colorante presentante la seguente formula di struttura:
IR700 ? commercializzata dalla ditta LI-COR (Lincoln, NE).
Preferibilmente, l?anticorpo anti-CLA ? coniugato alla molecola fotosensibilizzante mediante una catena laterale amminoacidica, l?estremit? N-terminale oppure l?estremit? C-terminale dell?anticorpo. Ancora preferibilmente, l?anticorpo anti-CLA ? coniugato alla molecola fotosensibilizzante dalla parte opposta rispetto al sito di legame con l?antigene CLA.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? l?uso del suddetto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante nel metodo di trattamento di malattie che coinvolgono la migrazione di cellule linfocitarie T in corrispondenza della cute.
Tali malattie possono essere malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, malattie immunitarie e/o degenerative della cute.
A titolo di esempio, tali malattie comprendono linfomi cutanei, la psoriasi e la dermatite atopica
Tali malattie sono preferibilmente malattie neoplastiche.
Preferibilmente tali malattie neoplastiche sono linfomi cutanei.
Ancor pi? preferibilmente, tali linfomi cutanei sono micosi fungoide. In un aspetto della presente invenzione, il suddetto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante pu? essere somministrato ad un mammifero, specificatamente all?uomo.
In particolare, l?anticorpo anti-CLA coniugato ? usato nel metodo di trattamento che comprende le seguenti fasi:
- somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di una o pi? molecole di tale anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante in modo da porre in contatto almeno una cellula linfocitaria T cutanea con una o pi? molecole del suddetto anticorpo anti-CLA coniugato, ed in cui la cellula linfocitaria T cutanea comprende sulla propria superficie cellulare l?antigene linfocitario cutaneo CLA;
- irradiare tale almeno una cellula linfocitaria T cutanea del soggetto con una radiazione ad infrarossi avente lunghezza d?onda compresa tra 650 e 900 nm, preferibilmente avente lunghezza d?onda di circa 690 nm, ad una dose preferibilmente di circa 0,05 W/cm<2>.
Con il termine ?somministrare? si intende l?introduzione dell?anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante della presente invenzione nell?organismo mediante una qualsiasi via di somministrazione nota.
Tale via di somministrazione comprende a titolo di esempio da non considerarsi limitativo la via orale, sublinguale, buccale, rettale, vaginale, oculare, auricolare, nasale, cutanea topica o sistemica e via transdermica, oppure mediante iniezione intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intranodale o intrasplenica, mediante inalazione o per nebulizzazione.
Il termine ?soggetto? si riferisce ad un soggetto umano o altro soggetto animale.
Preferibilmente, nella presente invenzione ?soggetto? ? riferito ad un mammifero, in particolare all?uomo.
Non si esclude che il suddetto anticorpo anti-CLA coniugato possa essere utilizzato in un metodo di trattamento attuato su soggetti animali diversi da quanto indicato oppure su cellule in vitro.
Una quantit? terapeuticamente efficace indica la quantit? di anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante sufficiente a trattare la condizione patologica del paziente, ma sufficientemente bassa da evitare effetti secondari gravi, in un ragionevole rapporto beneficio/rischio, secondo l?intento dei criteri medici.
Tale quantit? terapeuticamente efficace pu? dipendere da diversi fattori quali, a titolo di esempio non limitativo, la via di somministrazione scelta, la malattia da trattare, la severit? della malattia da trattare, l?et?, la statura, il peso e la condizione fisica del soggetto da trattare, la storia medica del soggetto da trattare, la durata del trattamento, la natura di terapie concomitanti, gli effetti terapeutici desiderati.
Ancora a titolo di esempio, la quantit? terapeuticamente efficace ? la quantit? sufficiente per prevenire la progressione della malattia neoplastica, infiammatoria, immunitaria e/o degenerativa della cute, oppure per causare la regressione della patologia, oppure atta a ridurre i sintomi causati dalla patologia o, ancora, atta ad aumentare l?aspettativa di vita del soggetto con la suddetta patologia.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di almeno l?anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante descritto poc?anzi ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Una ?quantit? terapeuticamente efficace? indica la quantit? della suddetta composizione farmaceutica sufficiente a trattare la condizione patologica del paziente, ma sufficientemente bassa da evitare effetti secondari gravi, in un ragionevole rapporto beneficio/rischio, secondo l?intento dei criteri medici.
Con il termine "eccipiente" si intende un composto o una sua miscela ottimale per l'utilizzo in una formulazione allestita per il trattamento delle malattie indicate poc?anzi, in particolare per il trattamento di linfomi cutanei, preferibilmente per il trattamento della micosi fungoide.
Eccipienti idonei a tale utilizzo sono edulcoranti, diluenti, disaggreganti, glidanti, coloranti, leganti, lubrificanti, stabilizzanti, adsorbenti, conservanti, tensioattivi, umettanti, aromi, ammorbidenti, sostanze filmogene, emulsionanti, bagnanti, ritardanti di rilascio, colloidi, composti non permeanti, conservanti e loro miscele.
L?esperto del settore ? in grado di stabilire se e quanto determinati eccipienti farmaceutici possono servire ad una o pi? funzioni in relazione a quanto esso ? presente nella formulazione, a quali altri eccipienti sono presenti nella formulazione e alla via di somministrazione della formulazione.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? l?uso di tale composizione come medicinale.
Preferibilmente, la suddetta composizione ? usata nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, immunitarie e/o degenerative della cute.
Pi? preferibilmente, la suddetta composizione ? utilizzata nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche.
Ancor pi? preferibilmente tale malattia neoplastica ? un linfoma cutaneo.
Ulteriormente preferibilmente, la suddetta composizione farmaceutica ? utilizzata nel metodo di trattamento della micosi fungoide.
In particolare, fa parte dell?invenzione l?uso della suddetta composizione farmaceutica nel metodo di trattamento che comprende le seguenti fasi:
- somministrare ad un soggetto, preferibilmente un mammifero, pi? preferibilmente un umano, una quantit? terapeuticamente efficace di tale composizione in modo da porre in contatto almeno una cellula linfocitaria T cutanea con una o pi? molecole del suddetto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante, ed in cui la cellula linfocitaria T cutanea comprende sulla propria superficie cellulare l?antigene linfocitario cutaneo CLA;
- irradiare tale almeno una cellula linfocitaria T cutanea del soggetto con una radiazione ad infrarossi avente lunghezza d?onda compresa tra 650 e 900 nm, preferibilmente avente lunghezza d?onda di circa 690 nm, ad una dose preferibilmente di circa 0,05 W/cm<2>.
La composizione farmaceutica della presente invenzione pu? essere formulata in una forma adatta alla somministrazione orale oppure parenterale o topica.
Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione orale sono compresse, capsule, polveri, sciroppi, elisir, sospensioni, soluzioni, emulsioni, bustine e cachets o formulazioni adatte per inalazione come aerosol, soluzioni o polveri.
Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione topica sono crema, unguento, pomata, soluzione, sospensione, collirio, ovulo, aerosol, spray, polvere e gel.
Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione parenterale sono soluzione tampone acquosa e sospensione oleosa. Si specifica che per somministrazione parenterale si intende la somministrazione per via intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intranodale o intrasplenica.
Secondo la presente invenzione, sia l?anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante che la composizione farmaceutica descritta poc?anzi, possono essere usati in combinazione rispettivamente con uno o pi? agenti terapeutici di tipo noto, nel trattamento di malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, immunitarie e/o degenerative della cute, preferibilmente della micosi fungoide.
In particolare, la composizione farmaceutica della presente invenzione pu? comprendere inoltre uno o pi? composti selezionati nel gruppo comprendente agenti ad azione chemioterapica, interferone alfa-2a, retinoidi e steroidi topici.
Gli agenti chemioterapici sono preferibilmente selezionati tra gli agenti chemioterapici utilizzati nel trattamento delle malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, immunitarie e/o degenerative della cute.
A titolo di esempio, tali agenti chemioterapici comprendono gemcitabina, fludarabina, antracicline, denileukin diftitox, alemtuzumab.
I retinoidi comprendono a titolo di esempio bexarotene.
Gli steroidi topici comprendono ad esempio idrocortisone, prednisone, clobetasone butirrato, triamcinolone acetonide, betametasone benzoato e valerato, diflucortolone valerato, betametasone dipropionato, fluocinamide, clobetasolo propionato.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
- la figura 1 mostra la caratterizzazione immunofenotipica al citofluorimetro delle cellule My-La CD4+ e delle cellule periferiche mononucleate del sangue di donatori sani (PBMC). Entrambe le tipologie di cellule sono state marcate con anticorpi monoclonali anti CD2, CD3, CD4, CD25 e CLA;
- la figura 2 mostra le immagini di microscopia confocale di cellule My-La CD4+ trattate con anticorpi fluorescenti anti-CD4 (riquadro in alto a sinistra), anti-CLA (riquadro in alto a destra), propidio ioduro (PI) per identificare i nuclei (riquadro in basso a sinistra) e l?immagine sovrapposta di tali colorazioni (Merge, riquadro in basso a destra), barra di scala 20 ?m;
- la figura 3 riporta la distribuzione gaussiana della fluorescenza, rilevata al citofluorimetro, delle cellule My-La CD4+ marcate con anticorpo anti-CLA (a sinistra, anti-CLA) e l?anticorpo anti-CLA coniugato con IR700 (a destra, anti-CLA+IR700);
- la figura 4a riporta il grafico delle percentuali di cellule My-La CD4+ morte dopo trattamento di 24 ore con anticorpo anti-CLA a concentrazioni rispettivamente di 2 ?g, 5 ?g e 10 ?g per ogni 5x10<5 >cellule rispetto alle cellule controllo (CNT) non trattate (media ? errore standard);
- la figura 4b riporta il grafico delle percentuali di cellule My-La CD4+ morte dopo irradiazione a 690 nm per 5 minuti (IRR); di cellule My-La CD4+ morte dopo trattamento di 24 ore con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 alla concentrazione di 5 ?g per ogni 5x10<5 >cellule (CLA-IR700) e di cellule My-La CD4+ morte dopo trattamento di 24 ore con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 alla concentrazione di 5 ?g per ogni 5x10<5 >cellule e irradiazione a 690 nm per 5 minuti (CLA-IR700-IRR) (media ? errore standard; * = p <0,01). ;ESEMPI ;1. Caratterizzazione immunofenotipica della linea cellulare My-La e dei linfociti T periferici di soggetti donatori sani mediante citofluorimetria. ;Le cellule neoplastiche di micosi fungoide (MF) sono note presentare un fenotipo simile alle cellule linfocitarie T-helper di memoria mature (TCR-?/?). Tali cellule T-helper di memoria mature esprimono i marcatori CD3, CD4, CD5 e CD45RO, e non esprimono CD8 e TIA-85. ;Al fine di saggiare nuove possibili strategie terapeutiche da utilizzare per il trattamento della MF ? stata utilizzata una linea cellulare in vitro denominata My-La CD4+ (cod. 95051033, Sigma-Aldrich) derivante dalla biopsia cutanea di un soggetto umano affetto da micosi fungoide in fase di placca. L?immunofenotipo delle cellule My-La CD4+ ? stato determinato marcando le cellule con i seguenti anticorpi monoclonali CD2, CD3, CD4, CD25, CLA (Miltenyi Biotec). ;Per la marcatura, 5x10<5 >cellule My-La CD4+ sono state incubate con 100 ?l di tampone fosfato salino (PBS) addizionato del 10% di siero fetale bovino (FCS) e 2 ?l di ciascuno degli anticorpi monoclonali sopraindicati. Il campione ? stato lasciato in incubazione per 10 minuti al riparo dalla luce. Il campione ? stato poi analizzato con un citofluorimetro (Biosceinces, BD-LSRII) dotato di 4 laser rispettivamente a 405 nm, 488 nm, 560 nm e 647 nm. ;Le cellule periferiche mononucleate (PBMC) utilizzate come gruppo di cellule controllo sono state ottenute da prelievo di sangue venoso periferico da donatori sani dietro sottoscrizione del consenso informato. ;Ciascun campione di sangue ? stato raccolto in una o pi? provette contenente l?anticoagulante EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) e mantenuto a temperatura ambiente prima dell?estrazione dei PBMC. Per ciascun campione, 5 ml di sangue sono stati stratificati su 4 ml di Ficoll Histopaque, in tubi di polipropilene da 15 ml. Esso ? stato poi centrifugato a 1800 rpm per 30 minuti a 21?C in centrifuga Heraeus Megafuge (ThermoFisher Scientific). ;Successivamente, mediante l?uso di una pipetta Pasteur, ? stato aspirato il plasma sovrastante e raccolto l'anello bianco di PBMC rinvenibile nel tubo da 15 ml all?interfaccia tra le due fasi. L?anello di PBMC ? stato poi trasferito in un tubo di polipropilene da 15 ml sterile, lavato con terreno RPMI 1640 a temperatura ambiente e centrifugato nuovamente a 1200 rpm per 5 minuti a 21?C. ;Il pellet ottenuto dalla centrifugazione ? stato infine aggiunto di 1 ml di PBS-FCS al 10%. ;Come visibile dai grafici di figura 1, l?analisi citofluorimetrica ha dimostrato che pi? del 90% delle cellule My-La CD4+ esprime l?antigene CLA. ;Anche circa l?8% dei linfociti CD4+ circolanti nei donatori sani esprime l?antigene CLA. ;Si ipotizza che tali linfociti T provenienti da donatori sani potrebbero rappresentare una sottopopolazione linfocitaria destinata a localizzarsi a livello del tessuto cutaneo per dare origine a delle placche patologiche. ;2. Caratterizzazione immunofenotipica della linea cellulare My-La e dei linfociti T periferici di soggetti donatori sani mediante microscopia confocale. ;Le cellule My-La CD4+ sono state seminate in piastre da 24 pozzetti con una densit? di 5x10<5 >cellule/pozzetto e coltivate per 48 ore in Vitrogel. Le cellule sono state successivamente marcate con anticorpi primari rat anti-CLA e mouse anti-CD4 (Miltenyi Biotec) diluiti 1:100 in PBS-FCS 10% mediante incubazione con 300 ?l di ciascuno di tali anticorpi primari per 45-60 minuti. ;Le cellule sono state in seguito lavate in PBS ed incubate con 300 ?L di una soluzione di PBS-FCS al 10% contenente gli anticorpi secondari anti-Rat Alexa Fluor 488 e anti-Mouse Alexa Fluor 647 diluiti 1:1000, per un tempo di circa 30-45 minuti. Le cellule sono quindi state fissate in formaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente e infine lavate nuovamente in soluzione di PBS. ;Per eseguire la colorazione dei nuclei ioduro di propidio (PI) concentrato ? stato aggiunto direttamente al mezzo di montaggio (ProLong Diamond Antifade). ;La caratterizzazione immunofenotipica ? stata eseguita in triplicato. Tali preparati cellulari sono stati dunque analizzati al microscopio confocale LSM510 (Zeiss). ;Le immagini ottenute dal microscopio confocale, riportate in figura 2, confermano i dati ottenuti alla citofluorimetria, cio? un?elevata distribuzione di antigene CLA in corrispondenza prevalentemente della membrana plasmatica delle suddette cellule. ;3. Sintesi dell?anticorpo anti-CLA coniugato alla molecola fotosensibilizzante IR700 ;1 mg di anticorpo anti-CLA puro (clone REA1101, n. 130119043, Miltenyi Biotec) ? stato coniugato alla molecola fotosensibilizzante IR700 (IRDye? 700DX, LiCor) mediante kit per la coniugazione delle proteine IRDye? 700DX (LiCor n. 92838046) seguendo le indicazioni fornite dalla casa produttrice. ;In figura 3 sono mostrati i picchi corrispondenti alla fluorescenza delle cellule My-La CD4+ marcate con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 (picco a destra) e delle cellule controllo My-La CD4+ marcate con anticorpo anti-CLA (picco a sinistra). Nel grafico, lo spostamento del picco verso destra sull?asse delle ascisse dimostra l?avvenuta corretta coniugazione tra anticorpo anti-CLA e la molecola IR700. 4. Valutazione della citotossicit? dell?anticorpo anti-CLA coniugato alla molecola fotosensibilizzante IR700 ;5x10<5>/ml cellule My-La CD4+ in sospensione sono state seminate in piastre da 24 pozzetti in terreno RPMI 1640 completo. Le cellule sono state trattate per 24 ore con anticorpo anti-CLA a concentrazioni crescenti rispettivamente di 2 ?g, 5 ?g e 10 ?g per ogni 5x10<5 >cellule. Le cellule utilizzate come controllo (CNT) non sono state sottoposte a trattamento con l?anticorpo. ;I risultati ottenuti sono mostrati in figura 4a ove ? possibile notare che, anche ad elevate concentrazioni di anticorpo, la vitalit? cellulare non risulta modificata dall?esposizione all?anticorpo anti-CLA, indicando che l?effetto del trattamento con anticorpo anti-CLA non provoca degradazione cellulare. ;5. Morte selettiva di cellule My-La dopo trattamento con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 e irradiazione ;Cellule My-La CD4+ in sospensione sono state seminate ad una concentrazione di 5x10<5 >cellule/ml in terreno RPMI 1640 completo in 3 piastre da 24 pozzetti. Le cellule di ciascun pozzetto di una prima piastra sono state incubate per 30 minuti a 37?C con 5 ?g di anticorpo anti-CLA coniugato ad IR700, sintetizzato secondo quanto riportato nell?esempio 3. ;Al termine del trattamento, le cellule sono state irraggiate per 5 minuti con una lampada ad infrarossi con un diodo luminescente Near-Infra Red e picco di emissione a 690 nm (MIC-LED-690M Prizmatix Ltd). L? irraggiamento ottenuto ? stato di circa 0,05 W/cm<2>. ;Un collimatore ? stato utilizzato per ottenere una distribuzione uniforme sulla superficie della piastra. ;Dopo 24 ore dall?irradiazione, le cellule sono state marcate con 2?g/ml di ioduro di propidio (PI) in terreno RPMI1640 per 10 min a temperatura ambiente ed analizzate mediante citofluorimetro a flusso (BDTM LSR II Flow Cytometer-Becton Dickinson) equipaggiato con quattro laser a 405 nm, 488 nm, 563 nm e 646 nm, per la valutazione della morte cellulare. ;Per analizzare la specificit? del trattamento mediante irradiazione delle cellule trattate con anticorpo anti-CLA coniugato ad IR700, ciascun pozzetto di una seconda piastra delle cellule My-La CD4+ indicate poc?anzi, ? stato irradiato per 5 minuti con una lampada ad infrarossi con un diodo luminescente Near-Infra Red e picco di emissione a 690 nm (MIC-LED-690M Prizmatix Ltd) senza precedente incubazione con l?anticorpo coniugato. ;L? irraggiamento ottenuto ? stato di circa 0,05 W/cm<2>. ;Un collimatore ? stato utilizzato per ottenere una distribuzione uniforme sulla superficie della piastra. ;La morte cellulare ? stata valutata in modalit? analoga al gruppo di cellule trattate con anticorpo coniugato e irradiazione. ;Ulteriormente, ciascun pozzetto di una terza piastra di cellule My-La CD4+ ? stato incubato per 30 minuti a 37?C con 5 ?g di anticorpo anti-CLA coniugato ad IR700 sintetizzato secondo quanto riportato nell?esempio 3 senza essere successivamente irradiate. ;La mortalit? cellulare ? stata valutata secondo quanto riportato precedentemente. ;Ciascuna analisi ? stata eseguita in triplicato. ;I risultati di questi trattamenti sono riportati in figura 4b, ove ? mostrato che circa il 60% delle cellule trattate (60,2 ? 6; media ? errore standard) con l?anticorpo anti-CLA coniugato ad IR700 e successivamente irradiate sono morte. ;Le cellule trattate rispettivamente solo con irradiazione o con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 senza irradiazione presentano una percentuale di mortalit? cellulare di circa 8,1 ? 1,7 e 15,2 ? 2,5 (media ? errore standard). ;Il valore percentuale di cellule morte che sono state trattate con anticorpo anti-CLA coniugato ad IR700 e irradiate ? statisticamente maggiore (p=<0,01) rispetto al valore percentuale relativo alle cellule trattate solo con irradiazione o con anticorpo anti-CLA coniugato a IR700 senza irradiazione, a dimostrazione della specificit? del presente trattamento. ;6. Analisi statistica ;L?analisi statistica dei dati ? stata realizzata mediante software SigmaPlot version 13.0 ;E? stato adottato il test non parametrico Mann?Whitneyrank-sum per il confronto tra ciascuna coppia di gruppi. ;In base a quanto detto quindi, l?anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante raggiunge tutti gli scopi prefissati. ;In particolare, ? raggiunto lo scopo di realizzare un nuovo e migliorato medicinale ad azione altamente specifica per la cura delle malattie immunitarie, infiammatorie, neoplastiche e degenerative della cute, in particolare per la cura dei linfomi cutanei. ;Tale anticorpo anti-CLA coniugato ? particolarmente selettivo per l?uso nel metodo di trattamento della micosi fungoide. ;Inoltre, ? raggiunto lo scopo che l?uso di tale anticorpo sia specifico e non agisca in maniera dannosa nei confronti delle cellule sane. *

Claims (19)

RIVENDICAZIONI
1) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante avente una lunghezza d?onda di assorbimento nella regione del vicino infrarosso compresa tra 650 e 900 nm per l?uso come medicinale.
2) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo la rivendicazione precedente, nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, malattie immunitarie e/o degenerative della cute.
3) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo la rivendicazione precedente, nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche.
4) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta malattia neoplastica ? un linfoma cutaneo.
5) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto linfoma cutaneo ? micosi fungoide.
6) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta molecola fotosensibilizzante ? la molecola IR700.
7) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto anticorpo anti-CLA ? un anticorpo che si lega specificatamente all?antigene linfocitario cutaneo CLA espresso sulla superficie cellulare di cellule linfocitarie T cutanee.
8) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto anticorpo anti-CLA ? scelto tra un anticorpo monoclonale, anticorpo policlonale, anticorpo umano, anticorpo murino, anticorpo umanizzato, anticorpo chimerico, anticorpo ricombinante, oppure tra un frammento di anticorpo scFv, un frammento Fab o un frammento F(ab?)2.
9) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8, caratterizzato dal fatto che detto metodo di trattamento comprende:
- somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di una o pi? molecole di detto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante in modo da porre in contatto almeno una cellula linfocitaria T cutanea con una o pi? molecole di detto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante, detta cellula linfocitaria T cutanea comprendendo sulla propria superficie cellulare l?antigene linfocitario cutaneo CLA; - irradiare detta almeno una cellula linfocitaria T cutanea del soggetto con una radiazione ad infrarossi avente lunghezza d?onda compresa tra 650 e 900 nm, preferibilmente avente lunghezza d?onda di circa 690 nm.
10) Anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto soggetto ? un mammifero.
11) Composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di un anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
12) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto di comprendere uno o pi? composti selezionati nel gruppo comprendente agenti chemioterapici, interferone alfa-2a, retinoidi e steroidi topici.
13) Composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 11 o 12 per l?uso come medicinale.
14) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche, malattie infiammatorie, malattie immunitarie e/o degenerative della cute.
15) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, nel metodo di trattamento di malattie neoplastiche.
16) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che detta malattia neoplastica ? un linfoma cutaneo
17) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che detto linfoma cutaneo ? micosi fungoide.
18) Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 17, caratterizzata dal fatto che detto metodo di trattamento comprende:
- somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di detta composizione farmaceutica in modo da porre in contatto almeno una cellula linfocitaria T cutanea con una o pi? molecole di detto anticorpo anti-CLA coniugato ad una molecola fotosensibilizzante, detta cellula linfocitaria T cutanea comprendendo sulla propria superficie cellulare l?antigene linfocitario cutaneo CLA; - irradiare detta almeno una cellula linfocitaria T cutanea del soggetto con una radiazione ad infrarossi avente lunghezza d?onda compresa tra 650 e 900 nm, preferibilmente avente lunghezza d?onda di circa 690 nm.
19) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che detto soggetto ? un mammifero.
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