CN109364246A - 磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针及其合成方法与应用。本发明旨在提供一种磁共振/激活型荧光双模态靶向光热纳米诊疗探针的设计、制备及其应用，此多模态靶向纳米诊疗探针分别带有特异性靶向肿瘤的光热治疗模块，磁共振成像功能模块，肿瘤特异性激活型荧光成像模块，能够荧光激活响应的荧光基团、高弛豫率可用作磁共振成像同时可以进行光热治疗的钆掺杂的硫化铜纳米颗粒以及肿瘤靶向基团，利用简单的化学反应将多个成像及光热治疗部分融合到一起，实现术前磁共振检测，术中高灵敏荧光导航下靶向光热治疗肿瘤及转移淋巴结。
Description
技术领域
本发明涉及医学分子影像探针，尤其涉及磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热纳米诊疗探针的合成及应用。
背景技术
分子影像成像手段越来越多地应用到医学前沿领域，不同的影像手段各有其特色，同时也各有缺陷，因此多模态融合成像逐渐成为一个研究热点。
目前常用的术前影像学评估手段，如CT、MR及PET/CT对于胃癌转移淋巴结的诊断仅具有中等程度的准确性。磁共振成像(MRI)对软组织具有高分辨率，可精确提供解剖定位信息，尽管淋巴靶向造影剂USPIO的问世和MR功能成像序列的应用使定性诊断胃癌转移淋巴结的敏感性和特异性分别达到96％和93％，86％和79％。然而，由于USPIO为非主动靶向的阴性对比剂，上腹部MR成像易受心跳、呼吸和磁敏感伪影的影响，USPIO和DWI功能成像诊断胃癌转移淋巴结的特异性仍不够理想。此外，由于现有的常规成像方法存在着不能术中实时成像淋巴结的固有缺陷，术前的影像学检查只能提供转移淋巴结的大概位置，难以让外科医生在术中实施对转移淋巴结“一一对应”的精确辨别和切除。
随着荧光技术的快速发展和成像设备的不断完善，术中实时成像恶性肿瘤已成为现实。荧光成像不仅具有极佳的时空分辨率，检测灵敏度高，而且无核辐射污染。尽管荧光的组织穿透力较为有限(<1cm)，但由于开腹下淋巴结位置相对表浅，因为完全能够满足术中指引外科医生对病灶组织进行辨别及切除。目前应用于临床的荧光染料主要为吲哚菁绿(ICG)。术前静脉注射ICG后，虽然可以通过非特异性的“通透性增强与滞留效应”(EPR)聚集于肿瘤原发灶及转移淋巴结中，并在术中荧光探测下，显示肿瘤原发灶的范围和转移淋巴结。但是，由于ICG本身并不具有肿瘤靶向性，其探测转移淋巴结的特异性仍不够理想。为此，人们开发了针对肿瘤细胞表面特异性受体、抗原或酶的各种靶向性荧光探针。近年来，设计针对活性氧(ROS)、乏氧、pH值以及酶等肿瘤微环境的响应性激活型荧光探针尤为引人关注。激活型荧光探针能够在与特定分子目标的相互作用下产生增强的成像信号，并可用于早期疾病诊断和快速监测治疗反应。其中一些酶在肿瘤细胞中相对正常细胞要高表达同时具有更高活性，以此设计的酶响应激活型荧光成像探针能够通过连续的酶催化从荧光“关闭”状态变为荧光“开启”状态，从而准确区分出肿瘤部位。迄今为止，已经有许多应用酶响应设计的激活荧光探针，如基质金属蛋白酶(MMPs)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，设计的探针能够实现非侵入性、实时活体肿瘤荧光成像。
要实现术中淋巴结的精准和无创清扫，需要摒弃以往唯有手术切除的传统思路。近些年来，随着肿瘤光热治疗技术的进步，这一难题的解决已初显曙光。肿瘤光热治疗是利用较强组织穿透力的近红外光照射激发具有光吸收能力的纳米材料产生热能而杀死肿瘤细胞，同时局部热疗可以刺激树突状细胞(DC)和CD8+T细胞的抗肿瘤活性，减少了肿瘤复发和转移几率，而邻近的正常组织因在近红外区的光吸收能力很弱而不会造成病理损伤。近些年，已有少数学者尝试将碳基纳米材料(例如石墨烯、碳纳米管)用于裸鼠胰腺癌和乳腺癌淋巴结转移的光热治疗，不仅获得令人鼓舞的疗效，而且淋巴结治疗区域周围的正常组织完好无损。同时研究发现病灶周围的正常淋巴组织因非特异性吞噬了部分纳米粒子，同样会出现一定程度温度升高，只是温度升高幅度低于肿瘤转移淋巴结而已。由此可见，单一靶向的纳米探针均存在着难以对肿瘤转移淋巴结实施选择性“光热切除”的致命弱点，需要用新的设计思路来破解这一难题。目前在医学成像领域，结合磁共振成像及激活型荧光成像指导下靶向光热治疗胃癌及其转移淋巴结的相关技术尚未见报道。
为实现多模态成像引导靶向光热治疗肿瘤病灶及转移淋巴结，构建多模态多功能探针是重要前提之一。如果仅使用一种纳米探针将术前MR成像与术中MMP酶响应激活型荧光成像功能结合，实现高空间分辨率和高组织穿透深度与高灵敏的荧光信号相结合，不仅可以通过核磁共振成像来精确检测深部癌症，还可以用于荧光成像精确引导光热治疗肿瘤病灶。
目前已报道的纳米探针中，有报道使用了荧光素Cy5.5-共轭透明质酸硫化铜纳米粒子，实现激活荧光成像，并在使用808纳米激光照射下显著抑制肿瘤生长。半导体硫化铜纳米颗粒在近红外区域有较强的吸光度，较高的光热转换效率，高光稳定性，低毒性，能够通过光热治疗有效地抑制肿瘤，但上述造影剂荧光激活倍数低，成像方式较单一，同时仅仅实现皮下小鼠模型的成像及治疗功效，没有通过进一步的原位或转移模型加以验证。另外有人报告采用了一种白蛋白结合钆造影剂及硫化铜光热材料的纳米探针(Gd:CuS@BSA)，这种纳米探针具有较高的空间分辨率和组织穿透能力，可以实现光声及磁共振成像，同时可以进行肿瘤PTT治疗，但这样的活体成像方式将成像与治疗手段虽然整合到一个纳米探针上，但并不能同时进行，并且也不能指导外科医生在术中实施对病灶“一一对应”的精确辨别和切除。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中的尚未出现适于MR成像及激活型荧光成像同时具有靶向治疗功能的纳米探针，无法实现在纳米颗粒中掺杂钆MR成像金属离子之后具有高T1弛豫率、在纳米粒子表面稳定修饰可激活的荧光探针，进而提供一种可实现磁共振/荧光融合显像的、高灵敏度、高特异性、可实现全面诊疗功能的纳米探针。本发明解决的第二个技术问题是现有技术中的多模式多功能诊疗探针在稳定性、生物相容性、可降解性、毒性能等方面存在一定局限性，难以实现重复性好、生物相容性好、安全无毒纳米诊疗探针，进而限制临床转化的可能性。
技术方案：
一种磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针的合成方法，包括：
(1)合成(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH：将2-氯三苯甲基氯树脂用固相合成方法合成(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH；有机溶剂中，3～3.5nmol(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH，4.5～5nmol Cy5.5-NHS与9～10nmol N,N-二异丙基乙基胺反应2～3h，得到NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；有机溶剂中，1～1.5nmol NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH，1.5～2nmol QSY21-NHS与12～13nmol N-乙基二异丙胺反应2～3h，得QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；4.5～5nmolHBTU，4.5～5nmol N-乙基二异丙胺，0.9～1nmol QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH与4.5～5nmol氨基-4聚乙二醇-二硫戊环反应5～6h，得到(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH；
(2)合成油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘：4～5ml油胺，250～300mg氯化铜，0.1～0.3mmol氯化钆混合脱气然后加热到180～190℃；同时80～90℃在8～9ml油胺下溶解2.15～2.45mmol硫，之后将两个部分混在一起，将温度降到140～150℃反应20～30min，去除未反应的铜离子和油胺，得到油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘；
(3)合成水溶性硫化铜纳米颗粒：通过薄膜水化法，将DSPE-PEG-OMe、DSPE-PEG-NH2、油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘合成水溶性硫化铜纳米颗粒；
(4)将500～600ml 1～1.5μg/μL水溶性硫化铜纳米颗粒与500～600ml 0.1～0.2mmol/L的(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH及0.1～0.2μmolcRGD-SH混合搅拌4～5小时，超滤洗涤提纯，得到双模态成像靶向光热诊疗纳米探针。
其中，步骤(1)中，氨基-4聚乙二醇-二硫戊环的合成方法包括：
将0.2～0.3mmolα-硫辛酸溶解于4～5ml无水二氯甲烷中，将0.2～0.3mmol N-羟基丁二酰亚胺和0.2～0.3mmol EDC在氮气保护下加入上述溶液中，并室温进行搅拌4～5h，接着加入0.2～0.25mmol DIPEA并在室温搅拌过夜，最终得到的氨基-4聚乙二醇-二硫戊环通过液相色谱仪加以提纯。
步骤(3)包括：将14～15mg DSPE-PEG2000-OMe及1.5～2mg DSPE-PEG2000-NH2溶解在9～10ml氯仿加1～2ml乙醇中，再加入2～3mg油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘，搅拌20～30min，旋蒸去除溶剂，加入10～12ml水后超滤，再加入20～22ml 10mg/L的Mal-PEG4-NHS，搅拌4～5h。
本发明还提供了所述的合成方法合成得到的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针。
本发明探针结构为：内核为钆掺杂的CuS纳米片提供磁共振成像及光热治疗功能，表面修饰基团cRGD来靶向肿瘤组织，同时进一步修饰对MMP-2响应的激活型近红外荧光团引导术中激活型肿瘤荧光成像。本发明探针呈球形纳米颗粒结构，粒径在40～50nm，平均水合粒径为60～70nm。
本发明还提供了所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针在制备影像制剂中的应用。
其中，影像制剂用于磁共振或/和荧光成像。
其中，影像制剂用于肿瘤或/和肿瘤转移淋巴结的成像。
所述肿瘤包括胃癌。
本发明还提供了所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针在制备肿瘤光热治疗药剂中的应用。
所述肿瘤包括胃癌。
发明原理：本发明旨在提供一种基于简单化学反应的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗探针、制备方法及其应用，磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗探针分别带有特异性靶向肿瘤的光热治疗模块，磁共振成像功能模块，肿瘤特异性激活型荧光成像模块，应用时将特异性因子靶向到肿瘤组织后，利用磁共振成像功能进行术前肿瘤成像评估，利用特异性激活多肽与肿瘤组织高表达的MMP-2选择性快速高效反应，释放近红外段荧光，实现术中精准肿瘤定位，解决现有肿瘤多模态探针或方法功能不全的问题，同时靶向光热成像解决现有成像与治疗一定程度分离的问题，从而提高探针生物相容性，检测灵敏度与特异性，进一步精准定位肿瘤，实现肿瘤成像引导下的靶向光热治疗。
有益效果：
本发明旨在提供一种磁共振/激活型荧光双模态靶向光热纳米诊疗探针的设计、制备及其应用，此多模态靶向纳米诊疗探针包括能够荧光激活响应的荧光基团、高弛豫率可用作磁共振成像同时可以进行光热治疗的钆掺杂的硫化铜纳米颗粒以及肿瘤靶向基团，利用简单的化学反应将多个成像及光热治疗部分融合到一起，实现术前磁共振检测，术中高灵敏荧光导航下靶向光热治疗肿瘤及转移淋巴结。
1)本发明首先应用的可激活荧光分子部分简单易得，可实现较高倍数(185倍)荧光激活。
2)本发明使用的氯化铁、氯化钆、硫等原材料便宜简单易得，使用简单的加热搅拌等简单操作就可以实现合成最终纳米颗粒。同时可实现95.3％的油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘包裹率，减少原材料废弃物的污染。
3)本发明最终形成的是40nm的水溶性纳米粒子，可以有效上载磁共振成像的金属纳米粒子、可激活的荧光分子及肿瘤靶向基团，并能够进行每个纳米粒子连接的分子精确数目的定量计算，同时形成的该大小的纳米尺寸不仅可以实现肿瘤的主动靶向成像功能，同时也能够有效区分转移及正常的淋巴结。
4)本发明的纳米探针具有较高的光热转化效率，光热转化效率高达71％，与已有报道的硫化铜纳米颗粒相比(最高目前报告的是58％)，具有更好的光热性能。
5)本发明的纳米探针具有更高的磁共振弛豫率，在0.5T下可以达到62.7mM-1s-1。跟已报告的(Gd:CuS@BSA，16.032mM-1s-1)以及临床常用的钆造影剂(4mM-1s-1)具有更高的MR对比增强性能。
附图说明
图1为多模态纳米诊疗探针的合成路线示意图；
图2为探针及合成过程产物的结构检测结果，其中a-c图是油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘的透射电镜图及元素谱图，d图是多模态纳米诊疗探针透射电镜及DLS分析；
图3为探针及合成过程产物的光谱检测结果，其中a图为每一步修饰的紫外吸收光谱图，b-c图显示纳米探针荧光检测结果；
图4为探针及轧剂的磁共振成像及光热成像结果；其中，a图上排是多模态纳米诊疗探针在不同浓度下磁共振成像图，下排是临床使用的造影剂成像图，b图是对应的弛豫率计算，c-d图显示多模态纳米诊疗探针的不同浓度光热成像图及升温曲线以及五次循环照射的光热升温曲线图；
图5为MKN45胃癌细胞与探针孵育，再与溶酶体绿色染料Lyso-tracker Green的荧光成像图及共定位分析；
图6为胃癌细胞在光照前后使用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞光热治疗后的细胞存活率；
图7为胃癌原位模型的磁共振成像图，其中a图是小鼠磁共振T1平扫成像图以及尾静脉注射0.05mmol/kg探针12小时之后磁共振增强图像，箭头指示肿瘤位置，b图是小鼠的实时荧光成像图及生物自发光图像，箭头指示肿瘤位置；
图8为胃癌光热成像图；其中，a-b图为原位胃癌模型小鼠尾静脉注射探针12小时之后胃癌组织或者正常胃组织光热成像图及对应的升温曲线，c-d图为对照组小鼠及治疗组小鼠在光热治疗后第16天将胃癌组织取出，进行生物自发光拍摄并进行具体的定量分析(n＝3)，**P<0.01；
图9为淋巴转移检测结果图；其中a-b图是转移淋巴结及正常淋巴结磁共振平扫图像以及造影剂打入后不同时间点的成像图像，以及对应的磁共振信号增强比率，c-d图是转移淋巴结及正常淋巴在造影剂打入前后不同时间点的荧光成像示意图，以及对应测量的荧光信号强度；
图10为小鼠转移淋巴结接受探针注射后进行激光光照后光热成像示意图以及对应的温度升温曲线示意图。
具体实施方式
以下对本发明原理和特征进行举实例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明具体实施方式所用实验试剂与仪器：
所有的化学品和生物试剂都是从商业供应商处购买的，并在没有进一步净化的情况下使用。氯化铜是从J&KScientific Ltd(百灵威科技有限公司)购买的。氯化钆是从Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)公司购买的。油胺和环己烷是从阿拉丁公司购买。硫是从西亚试剂购买的。DSPE-PEG2000-OME和DSPE-PEG2000-NH2是上海芃硕生物科技公司购买的。cRGD-SH是从吉尔生化(上海)有限公司购买的。重组基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其抑制剂SB-3CT是从美国R&D Systems公司购买。Calcein AM，propidium iodide(碘化丙啶，PI)，Lyso-Tracker Green(溶酶体绿色荧光探针)，and Hoechst 33342染料是从江苏凯基生物技术股份有限公司购买。
透射电子显微镜(TEM)图像是由JEM-2800透射电子显微镜(JEOL，日本)测得。HRTEM和元素图像是由TECNAI F20高分辨电子显微镜测得。x射线衍射(XRD)是由BrukerD8advance spectrometer测得。x射线光电子能谱(XPS)是由PHI 5000VersaProbe system测得。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)是Optima 5300DV等离子光谱质谱仪测得。合成纳米粒子的数量是由ViewSizer(MANTA仪器，美国)测得。动态光散射(DLS)和zeta电位分析是由90 Plus/BI-MAS equipment(美国布鲁克海文)测得。荧光光谱是由HORIBA InstrumentsIncorporated Fluomax-4测得。紫外-可见光光谱(UV-visspectra)是用Ocean OpticsMaya 2000Pro光谱仪测量的。高效液相色谱(HPLC)由Thermo Scientific DionexUltimate 3000测得。荧光图像是在奥林巴斯IX73荧光倒置显微镜(奥林巴斯，日本)上获得的。活体成像图由IVIS Lumina XR III system测得，荧光强度由Living imagingsoftware(PerkinElmer)定量。小动物磁共振成像是由1.0T小动物核磁共振成像系统(Bruker)测得。
实施例1
探针合成步骤如下：
1、合成(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH。将2-氯三苯甲基氯树脂(CAS:42074-68-0)用固相合成方法合成(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH(此步为现有方法)，接下来用3.25纳摩尔(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH，4.86纳摩尔Cy5.5-NHS(GE生命科学，货号PA15604)，9.75纳摩尔N,N-二异丙基乙基胺(CAS:7087-68-5)溶解在DMF中，室温搅拌2小时，经过HPLC提纯得到NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；接下来将1.25纳摩尔NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH，1.5纳摩尔QSY21-NHS(赛默飞世尔公司，货号Q20132)以及12.5纳摩尔DIPEA(N-乙基二异丙胺，CAS:7087-68-5)溶解在500毫升DMF溶液中室温搅拌2小时，通过HPLC提纯得到QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；
将0.242毫摩尔α-硫辛酸(CAS：1077-28-7)溶解于4毫升无水二氯甲烷中，将0.29毫摩尔N-羟基丁二酰亚胺(CAS：6066-82-6)和0.29毫摩尔EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，CAS：1892-57-5)在氮气保护下加入上述溶液中，并室温进行搅拌4小时。接着将0.242毫摩尔DIPEA(N-乙基二异丙胺，CAS：7087-68-5)缓慢加入溶液中并在室温搅拌过夜。最终得到的amido-PEG4-dithiolane(氨基-4聚乙二醇-二硫戊环)通过液相色谱仪加以提纯。
在0.99纳摩尔QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH溶液中，投入4.99纳摩尔HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，CAS:94790-37-1)，4.99纳摩尔DIPEA(N-乙基二异丙胺，CAS:7087-68-5)，4.99纳摩尔amido-PEG4-dithiolane(氨基-4聚乙二醇-二硫戊环)，室温搅拌6小时。通过液相色谱仪加以提纯。
2、合成油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘。首先，将4毫升油胺，268.9毫克氯化铜，0.1～0.3毫摩尔氯化钆放入一个三颈烧瓶中，通过净化氮气进行脱气然后加热到180度；同时80度在8毫升油胺下溶解2.15～2.45毫摩尔硫，之后将两个部分混在一起。然后将温度降到150度搅拌30分钟，之后在溶液中加入20毫升冷的环己烷，待溶液冷却至室温，用10毫升乙醇和10毫升环己烷在50毫升离心管中以4000转速离心洗涤去除未反应的铜离子和油胺，得到合成油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘。
3、合成水溶性硫化铜纳米颗粒。首先将14.4毫克DSPE-PEG2000-OMe及1.6毫克DSPE-PEG2000-NH2溶解在9毫升氯仿加1毫升乙醇溶液中，再加入2毫克油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘，室温搅拌30分钟。然后在旋蒸去除溶剂，在烧瓶的内壁上形成一个深绿色的薄膜，之后加入10毫升二次蒸馏水，室温超声10分钟，得到的纳米颗粒，加入10kDa的超滤管，使用4000转速超滤进行提纯。进一步，在得到的纳米颗粒中加入22微升10毫克每毫升的Mal-PEG4-NHS(西格玛奥德里奇公司，货号712582)，室温搅拌4小时。
4、将第三步骤中得到的500微升1微克每微升纳米颗粒溶液与500微升0.12毫摩尔每升的(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH及cRGD-SH(0.15微摩尔)混合搅拌4小时，最终的纳米颗粒通过超滤洗涤提纯，得到多模态成像靶向纳米诊疗探针(本发明中简称探针)。
探针的结构、性能检测及结果分析：
采用ICP-MS分析方法确定了DSPE-PEG包裹后探针铜离子的浓度为46.6微克/毫升，油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘48.9g/mL。两者探针体积相同。因此，包裹率为46.6/48.9＝95.3％。
如图2a-c，透射电子显微镜(TEM)结果分析显示了油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘结构均匀，平均直径为13纳米，厚度为3纳米(图2a)。高分辨率TEM(HRTEM)图像(图2b)揭示了纳米盘六角形Gd(102)和(006)平面的边缘，它们的晶格间距分别为0.30和0.27纳米。通过元素映射进一步分析了元素组成部分(图2中c)，证实了铜、钆和硫信号的存在。如图2中d，透射电子显微镜(TEM)显示最终形成的多模态成像靶向纳米诊疗探针呈现球形纳米颗粒结构，粒径在40nm。动态光散射(DLS)分析表明，多模态成像靶向纳米诊疗探针在水溶液中有良好的单分散性，平均水合粒径为60纳米。
1)光谱测量的基本步骤：将多模态成像靶向纳米诊疗探针分散到酶反应缓冲液中(TCNB缓冲液：150mMNaCl,10mM CaCl2,100mMTris·HCl,0.05％Brij35,pH＝7.4)，然后加入MMP-2，多模态成像靶向纳米诊疗探针的浓度为0.5μM，MMP-2的浓度为10nM，37℃孵育不同的时间，并测量每个时间点的荧光光谱(Ex＝670nm；Em＝680-800nm)。
结果分析：图3中，a显示探针制备过程中每一步修饰的紫外吸收光谱图，b-c显示多模态成像靶向纳米诊疗探针荧光强度随着时间及MMP浓度的增加的荧光光谱。如图3b所示，690nm处的荧光发射峰强度逐渐增强，并在2h达到饱和，690nm处的荧光信号激活倍数达到～185倍。
2)灵敏度测量：在酶反应缓冲液TCNB中，将多模态成像靶向纳米诊疗探针(0.5μM)与不同浓度的MMP-2(0-15nM)在37℃孵育2h后。荧光扫描测得荧光光谱(Ex＝670nm；Em＝680-800nm)。检测限由3σ/k计算而得，其中σ代表11次空白样品测量结果的标准偏差，k代表荧光强度与MMP-2浓度之间线性关系的斜率。
结果分析：如图3中c所示，一旦与MMP-2共同孵育，690nm荧光即随着MMP-2浓度的增大逐渐增长，最终在MMP-2浓度达到10nM时饱和。在0.2-1nM的MMP-2浓度范围内，690nm处的荧光强度与MMP-2浓度呈良好的线性关系。
3)纵向弛豫率的测量。用水稀释多模态成像靶向纳米诊疗探针或临床用的造影剂钆剂(Dotarem，钆特酸葡胺)，准备5个不同浓度：0.03、0.06、0.16、0.26和0.33毫摩尔每升。T1值是通过一个0.5T的扫描仪(TE/TR＝18/120ms)(NMI20-015V-I，NIUMAG)测得，对应浓度的磁共振扫描图像(TR/TE＝276.1/5.0ms)是在一个1.0T小动物MR扫描仪(Bruker I-CON)测得。
结果分析：如图4a-b所示，多模态成像靶向纳米诊疗探针弛豫率(62.7)测量远高于临床使用造影剂Dotarem(4.4)，同时对应的磁共振图像可以看到多模态成像靶向纳米诊疗探针明显变亮，证明相同的浓度下探针比临床使用的造影剂有更好的磁共振成像性能。
4)光热效应在体外的评价。将多模态成像靶向纳米诊疗探针用PBS稀释成不同浓度(0、12.5、24、50和100微克每毫升，使用808nm近红外激光辐照10分钟。使用热红外相机实时记录热红外图像及对应的具体温度。
结果分析：如图4c-d所示，探针经过808nm激光照射后，随着多模态成像靶向纳米诊疗探针浓度的增加，温度逐渐上升，同时探针经过五轮照射依然能够保持升温的稳定性，证明探针具有很好的光热性能及光热稳定性。
5)细胞荧光成像实验及共定位实验：在细胞成像实验中，首先将MKN45胃癌细胞与1.5μM探针孵育，然后除掉探针溶液，PBS洗涤后再加入200nM的溶酶体绿色染料Lyso-Tracker Green及0.1μg/mL细胞核蓝色染料Hoechst 33342孵育20min，PBS洗涤三次后进行荧光成像。
结果分析：如图5所示，MKN45胃癌细胞与探针孵育4小时之后，可以在细胞内观察到明显的探针的近红外荧光，为了进一步确定荧光产物在细胞内的分布，我们将细胞共染以溶酶体指示剂(Lyso-Tracker Green)及细胞核指示剂(Hoechst 33342)。可以观察到MKN45细胞与探针孵育之后产生的近红外荧光(加以红色伪彩)与溶酶体指示剂(加以绿色伪彩)重合很好，这表明酶反应产物主要被细胞内吞并分布在溶酶体中。
6)原位动物模型及成像治疗实验：为了建立原位胃肿瘤模型，我们做了以下步骤。首先，收集胃癌MKN45/Luc细胞，并分散在1:1比率的PBS：基质胶中。小鼠取仰卧位，在上腹部进行中线垂直切口，将胃轻轻暴露在腹膜腔外。然后，在解剖显微镜下，将细胞慢慢注射入胃的浆膜下层。注射部位用棉签按压几分钟，以防止细胞悬浮液分散到不需要的区域。然后，胃被回纳到腹膜腔中，然后将腹膜和皮肤缝合起来。18天后，上腹部显示出明显的生物发光信号，并同时进行磁共振成像、荧光成像及PTT治疗(光热治疗)。小鼠荧光成像实验是在一个IVIS Lumina XR III成像系统上进行。每个实验重复三次，并使用LivingImageSoftware(4.5.2,PerkinElmer,MA,U.S.A)进行荧光定量分析。所有的磁共振成像实验采用1.0T小动物MR扫描仪(Bruker I-CON)进行，小动物全身线圈，俯卧位，尾先进。T1RARE冠状位扫描采用成像参数如下：repetition time ms/echo time ms,446/15.0；矩阵,256×256；层厚，1.000mm；层数,10；field of view,35mm×35mm.采集时间为11min 25s。
结果分析：如图7中a所示，由于非侵入性的T1加权磁共振成像具有较高的空间分辨率及良好的组织穿透深度，通过尾静脉注射0.05mmol/kg探针之后，在12小时后的肿瘤部位采集图像，可以看到造影剂到达后，胃部肿块显著强化，表明探针可以有效地进入并在原位胃癌组织中蓄积。之后，取小鼠仰卧位腹部正中切口，轻轻暴露胃部肿瘤，采集小鼠生物自发光及荧光图像，如图7中b所示，在小鼠中可以观察到原位胃癌肿瘤区域的强近红外荧光，并与小鼠肿瘤的生物自发光图像肿瘤位置一致。这些结果表明，探针的近红外荧光可以有效地在原发胃癌肿瘤中有效地激活，激活后的探针可以有效在肿瘤部位蓄积。进一步采用808纳米激光精确地对原位胃癌肿瘤进行照射光热治疗，红外图像如8中a-b显示，在5分钟原位MKN45/Luc肿瘤的温度从25.3摄氏度上升到57.4摄氏度，而与此同时，在使用探针激光治疗后，无肿瘤胃组织只显示了较少的温度增量(25.3到33.9摄氏度)，升高后的温度并不会对胃组织造成损伤，这一结果表明探针可以选择性对胃癌组织进行靶向光热治疗，而对正常的胃组织并不造成组织伤害。如8中c-d所示，在治疗后第16天，在体外解剖原位胃癌器官，并进行生物自发光成像，治疗组相对未接受治疗的对照组中，生物自发光的信号明显较低，这些结果表明探针能够精确地对原位胃癌组织进行有效的靶向光热治疗。。
7)淋巴结转移模型及成像实验：将～1×106MKN45细胞悬浮液注射到每只老鼠的右足趾皮下。三周后，右腘淋巴结肿大，通过进一步HE及免疫组化观察到肿瘤细胞的存在。小鼠荧光成像实验是在一个IVIS Lumina XR III成像系统上进行。每个实验重复三次，并使用Living Image Software(4.5.2,PerkinElmer,MA,U.S.A)进行荧光定量。所有的磁共振成像实验都是在一个1.0T小动物MR扫描仪(Bruker I-CON)上进行的。所有的磁共振成像实验采用1.0T小动物MR扫描仪(Bruker I-CON)进行，小动物全身线圈，俯卧位，尾先进。T1RARE冠状位扫描采用成像参数如下：repetition time ms/echo time ms,446/15.0；矩阵,256×256；层厚，1.000mm；层数,10；field of view,35mm×35mm.采集时间为11min25s。
结果分析：如图9中a-b所示，磁共振增强图像显示，在尾静脉注射100微升，0.5毫摩尔每千克体重探针之后的转移淋巴结增强图像中，转移淋巴结明显显著强化，在1h，磁共振信号增强比率达到了163％，在小鼠正常淋巴结仅得到68％的增强比率。4h之后，转移淋巴结(％SE＝109％)中MR信号仍然明显增高，而在正常的淋巴结中增强信号减弱(％SE＝16.6％)，这表明探针可以有效地进入转移淋巴结并在其中蓄积。与此同时，图9中c-d荧光成像显示，转移的淋巴结荧光信号逐渐变亮，在注射后2h观察到最强的荧光信号。与之相反的是，正常淋巴结中荧光信号很弱，与转移淋巴结形成了鲜明的对比。在2小时的转移性淋巴结中，荧光强度比正常的淋巴结要高54倍，综合上述实验结果发现，探针在转移淋巴结中产生的明显磁共振增强信号和荧光信号可以用来轻松区分转移及正常的淋巴结。进一步，如图10中b所示，通过注射探针之后辅助激光照射进行光热治疗，可以有效升高转移淋巴结中的温度，触发对转移淋巴结的有效靶向光热治疗。
Claims (10)
1.一种磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针的合成方法，其特征在于，包括：
(1)合成(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH：将2-氯三苯甲基氯树脂用固相合成方法合成(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH；有机溶剂中，3～3.5nmol(Boc)GGPLGVR(Pbf)GK-OH，4.5～5nmol Cy5.5-NHS与9～10nmol N,N-二异丙基乙基胺反应2～3h，得到NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；有机溶剂中，1～1.5nmol NH2-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH，1.5～2nmol QSY21-NHS与12～13nm N-乙基二异丙胺反应2～3h，得QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH；4.5～5nmolHBTU，4.5～5nmol N-乙基二异丙胺，0.9～1nmol QSY21-GGPLGVRGK(Cy5.5)-OH与4.5～5nmol氨基-4聚乙二醇-二硫戊环反应5～6h，得到(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH；
(2)合成油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘：4～5ml油胺，250～300mg氯化铜，0.1～0.3mmol氯化钆混合脱气然后加热到180～190℃；同时80～90℃在8～9ml油胺下溶解2.15～2.45mmol硫，之后将两个部分混在一起，将温度降到140～150℃反应20～30min，去除未反应的铜离子和油胺，得到油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘；
(3)合成水溶性硫化铜纳米颗粒：通过薄膜水化法，将DSPE-PEG-OMe、DSPE-PEG-NH2、油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘合成水溶性硫化铜纳米颗粒；
(4)将500～600ml 1～1.5μg/μL水溶性硫化铜纳米颗粒与500～600ml 0.1～0.2mmol/L的(QSY21)-GGPLGVRGK-(Cy5.5)-SH及0.1～0.2μmolcRGD-SH混合搅拌4～5小时，超滤洗涤提纯，得到双模态成像靶向光热诊疗纳米探针。
2.根据权利要求1所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针的合成方法，其特征在于，步骤(3)包括：将14～15mg DSPE-PEG2000-OMe及1.5～2mg DSPE-PEG2000-NH2溶解在9～10ml氯仿加1～2ml乙醇中，再加入2～3mg油胺包裹的钆掺杂的硫化铜纳米盘，搅拌20～30min，旋蒸去除溶剂，加入10～12ml水后超滤，再加入20～22ml 10mg/L的Mal-PEG4-NHS，搅拌4～5h。
3.根据权利要求1或2所述的合成方法合成得到的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针。
4.根据权利要求3所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针，其特征在于，结构呈球形纳米颗粒结构，粒径在40～50nm，平均水合粒径为60～70nm。
5.根据权利要求3或4所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针在制备影像制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，影像制剂用于磁共振或/和荧光成像。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，影像制剂用于肿瘤或/和肿瘤转移淋巴结的成像。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌。
9.根据权利要求3或4所述的磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针在制备肿瘤光热治疗药剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌。
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