CN104371707A

CN104371707A - 荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用

Info

Publication number: CN104371707A
Application number: CN201410606425.7A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 李平; 张雯; 肖海滨
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用，荧光探针的结构式如下：该荧光探针的制备方法为在惰性气体保护下，将三聚氰胺、咖啡酸溶于DMF和CH₂Cl₂的混合液中，再加入HOBT和EDC.HCL，室温下搅拌反应8～16小时；反应后，浓缩，除去溶剂，得荧光探针粗产品；再将荧光探针粗产品用硅胶薄层色谱板分离提纯，即得荧光探针纯品。本发明的荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。

Description

荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用

技术领域

本发明涉及一种荧光探针，及其制备方法，以及在检测超氧阴离子中的应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

大量证据表明，活性氧(ROS)与许多疾病的发生发展密切相关，例如退行性疾病，手术中的缺血在灌注损伤等。由于超氧阴离子自由基(O₂ ^˙-)是其他ROS(包括过氧化氢，过氧化亚硝酰阴离子等)的前体，因此揭示O₂ ^˙-的水平与疾病的关系显得尤为重要。

灵敏性高是单光子(OP)荧光成像的明显优势，所以应用OP荧光显微镜可视化细胞内的O₂ ^˙-水平是一种有效检测O₂ ^˙-的方法。但是，目前检测细胞内O₂ ^˙-的荧光探针仍然存在诸多问题，例如：来自其他ROS对小分子荧光探针测定的干扰；响应时间较长；不可逆反应等。

双光子(TP)荧光成像的优势包括更深的穿透深度和更低的样本光损伤，这是由于TP荧光是同时吸收两个能量更低的光子激发造成的。但是目前检测细胞和活体内O₂ ^˙-的TP荧光探针尚未见报道。鉴于细胞内O₂ ^˙-的浓度极低、寿命短、对环境敏感等特点，检测O₂ ^˙-的探针既需要具备深组织成像和光损伤低的特性，还需要高灵敏度、瞬时和可逆性；此外，还应便于根据不同样品的厚度灵活地选择成像方式。因此检测O₂ ^˙-的探针的设计仍是生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种动态、可逆检测超氧阴离子的荧光探针，及其制备方法，以及其基于单双光子双模式荧光成像在检测细胞和活体内超氧阴离子的应用，该荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的荧光探针，其结构式如下式Ⅰ所示：

上述荧光探针的制备方法，步骤如下：

在惰性气体保护下，将三聚氰胺、咖啡酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)和CH₂Cl₂的混合液中，再加入1-羟基苯并三唑(HOBT)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，室温下搅拌反应8～16小时；反应后，在25℃～50℃减压浓缩30～60分钟去掉部分溶剂，得荧光探针粗产品；

再将荧光探针粗产品用硅胶薄层色谱板分离提纯，得荧光探针纯品。

所述三聚氰胺、咖啡酸、HOBT和EDC.HCL四者的物质的量比为1:(2-3.5)：(2-3.5)：(2-3.5)；其中，HOBT、EDC.HCL是反应催化剂，作用是活化咖啡酸的羧基。

所述三聚氰胺和DMF和CH₂Cl₂的混合液的比为1mmol：(5-10)ml：(10-20)ml

所述DMF和CH₂Cl₂的混合液中，DMF和CH₂Cl₂的体积比为1：2-6；所述用硅胶薄层色谱板分离提纯时，洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为2-6：1。

优选的，所述三聚氰胺、咖啡酸、HOBT和EDC四者的物质的量比为1:2：2：2。

优选的，所述DMF和CH₂Cl₂的混合液中，DMF和CH₂Cl₂的体积比为1：4。

优选的，所述用硅胶薄层色谱板分离提纯时，洗脱剂中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为5：1。

本发明的荧光探针，单光子激发波长为491nm,双光子激发波长为800nm,最大发射波长为515nm。

本发明的荧光探针可以用于检测细胞内或活体内的O₂ ^˙-。具体应用时，可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂中进行应用。细胞内O₂ ^˙-检测的一般方法是：将培养好的细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵化，孵化一定的时间后将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像。

本发明的有益效果：

(1)本发明的荧光探针化学稳定性和光物理稳定性好；在酸性、中性、碱性等宽pH范围内探针对O₂ ^˙-响应敏感，为可逆反应，且响应时间极短，测定灵敏度较高，与O₂ ^˙-反应后荧光强度至少有5倍的变化。

(2)探针分子Ⅰ对O₂ ^˙-有很好的选择性，过氧化氢(H₂O₂)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、次氯酸根(OCl^-)、单线态氧(¹O₂)、过氧化亚硝酰(ONOO^-)、羟基自由基(·OH)、一氧化氮(NO),以及金属离子Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Cu⁺与Zn²⁺对检测没有干扰；探针分子细胞渗透性好，对细胞没有毒副作用，适于细胞内O₂ ^˙-浓度变化的检测。

(3)合成步骤相对简单，容易纯化。

附图说明

图1：本发明的探针Ⅰ的荧光强度和O₂ ^˙-变化的关系，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；

图2：本发明的探针Ⅰ的荧光强度和O₂ ^˙-的滴定曲线，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，右上的小图横坐标为O₂ ^˙-浓度，纵坐标为荧光强度；

图3:本发明的探针Ⅰ的选择性。10μM本发明的探针Ⅰ对不同的活性氧和活性氮60min内的荧光响应(20mM H₂O₂,200μM TBHP,200μM NaClO,200μM ¹O₂,33μM ONOO^–,200μM·OH,200μM NO以及O₂ ^˙- 20μM)，图标为不同的测试时间(0到60min)；

图4：本发明的探针Ⅰ对肝细胞(HL7702)的荧光成像，其中，图中，a,c,e为单光子成像，b,d,f为双光子成像；c和d为PMA刺激后肝细胞成像；e和f为加入O₂ ^˙-清除剂后的荧光成像。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：探针Ⅰ的合成

步骤如下：

在N₂保护下，将三聚氰胺(1.5mmol)和咖啡酸(3.0mmol)溶于DMF和CH₂Cl₂的混合液(DMF1.2mL，CH₂Cl₂ 6.0mL)中，再加入HOBT(0.636g,3.0mmol)和EDC.HCL(0.576g,3.0mmol)，室温下搅拌过夜(12h)。旋转蒸发浓缩得到粗产品后，通过硅胶薄层色谱板分离提纯产品，硅胶薄层色谱板的制备方法为：在烧杯中放入30g硅胶GF254，加入80ml 0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的20×20玻璃片上，室温下晾干待用；洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为5：1。最终得到浅黄色产品，即为荧光探针Ⅰ，mp：240℃。

核磁及质谱表征：

¹H NMR(300MHz,DMSO):δ7.973(m,6H),δ7.898(d,2H),δ7.810(d,2H),δ8.500(s,8H)；¹³C HNMR(600MHz,DMSO):δ167.5,143.2,143.0,129.5,128.0,125.9,120.2,118.1,110.2,109.3,106.9；MS data,m/z:451.4496(M+H)；IR:1719cm^-1。

实施例2：荧光探针的合成

在N₂保护下，将三聚氰胺(1.0mmol)和咖啡酸(3.5mmol)溶于DMF和CH₂Cl₂的混合液(DMF2.0mL，CH₂Cl₂ 6.0mL)中，再加入HOBT(0.636g,3.0mmol)和EDC.HCL(0.576g,3.0mmol)，室温下搅拌过夜(12h)。旋转蒸发浓缩得到粗产品后，通过硅胶薄层色谱板分离提纯产品，硅胶薄层色谱板的制备方法同实施例1；洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为4：1。最终得到浅黄色产品，即为荧光探针。

实施例3：荧光探针的合成

在N₂保护下，将三聚氰胺(1.0mmol)和咖啡酸(2.0mmol)溶于DMF和CH₂Cl₂的混合液(DMF1.2mL，CH₂Cl₂ 5.0mL)中，再加入HOBT(3.5mmol)和EDC.HCL(3.5mmol)，室温下搅拌过夜(12h)。旋转蒸发浓缩得到粗产品后，通过硅胶薄层色谱板分离提纯产品，硅胶薄层色谱板的制备方法同实施例1；洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为2：1。最终得到浅黄色产品，即为荧光探针。

实施例4效果实验

(1)探针Ⅰ对O₂ ^˙-的响应性实验

使用实施例1合成的探针Ⅰ评价其对O₂ ^˙-的响应性

将10μM的实施例1合成的探针Ⅰ加入到Tris buffer,pH 7.4，单光子激发波长为491nm,双光子激发波长为800nm,最大发射波长为515nm。当加入O₂ ^˙-后，探针的单光子和双光子荧光都明显增强。测试结果如图1、图2所示。图1为荧光光谱，图2为滴定曲线。由图1、2可知，探针Ⅰ对O₂ ^˙-变化响应敏感，可以作为O₂ ^˙-探针使用。

(2)探针Ⅰ对细胞内O₂ ^˙-的荧光成像

HL7702细胞(选自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)由高糖的DMEM培养液(Gibco)培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，刺激组细胞中加入佛波酯(PMA)(1.0μg/mL)预处理(图4中c,d)。图4中，e,f为PMA刺激组加入O₂ ^˙-清除剂钛铁试剂。30min后，加入10μM探针的缓冲液(Tris缓冲液，pH 7.4)中，37℃中孵育30分钟，然后将细胞用灭菌过的PBS缓冲液(pH 7.4)洗去多余的探针，然后进行单光子或双光子激光荧光显微成像。结果如图4所示，由图中c(单光子成像)和图中d(双光子成像)可知受到PMA刺激的细胞内，荧光强度明显增强。图e和f表明加入O₂ ^˙-清除剂钛铁试剂后，荧光强度明显减弱。可以看到探针能够对细胞中O₂ ^˙-进行可视化研究。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构式如式Ⅰ所示：

2.权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤如下：

在惰性气体保护下，将三聚氰胺、咖啡酸溶于DMF和CH₂Cl₂的混合液中，再加入HOBT和EDC.HCL，室温下搅拌反应8～16小时；反应后，浓缩，除去溶剂，得荧光探针粗产品；

再将荧光探针粗产品用硅胶薄层色谱板分离提纯，即得荧光探针纯品；

所述三聚氰胺、咖啡酸、HOBT和EDC.HCL四者的物质的量比为1:(2-3.5)：(2-3.5)：(2-3.5)；

所述DMF和CH₂Cl₂的混合液中，DMF和CH₂Cl₂的体积比为1：2-6。

3.如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述三聚氰胺、咖啡酸、HOBT和EDC四者的物质的量比为1:2：2：2。

4.如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述DMF和CH₂Cl₂的混合液中，DMF和CH₂Cl₂的体积比为1：4。

5.如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述用硅胶薄层色谱板分离提纯时，洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为5：1。

6.权利要求1所述的荧光探针在检测细胞内O₂ ^˙-中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法为：将培养好的待检测细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵化，孵化后，将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像。