CN105001857A - 用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于联动检测超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢的荧光探针，具体的说是一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物及其应用。荧光团衍生物如通式Ⅰ所示，通式Ⅰ中：R₁为C_1-22烷基、卤代苄基或C₁-C₁₂有机酸酯链；R₂为氢、磺酸基、氨基、羧基、硝基或卤素；X(定位功能基团)为-OH、丁基三苯基鏻基、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；Y₁为N、O或S；Y₂为N、O或S。本发明所述荧光探针，在超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢存在下，对应的荧光发射波长和强度发生变化，可用于生物体内超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢的检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，检测信噪比高、灵敏度和选择性好。具有重要的生物医学意义。

Description

用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及用于联动检测超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢的荧光探针，具体的说是一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物及其应用。

背景技术

硫化氢是近年来研究较多的一种内源性气体信号分子，它对生命体中心脑血管系统和神经系统都起着至关重要的调节作用。而有研究发现，硫化氢实际上是多硫化氢在细胞中作用的释放物，在细胞中实际起作用的是多硫化氢，在细胞的损伤和氧化应激中能起到抗氧化剂的作用。多硫化氢、H₂S以及其他的多硫化物能够产生一系列的生理反应来维持细胞的健康。我们还发现，多硫化氢的产生依赖于O₂ ^·-对细胞的刺激，细胞中的O₂ ^·-主要来源于线粒体。产生多硫化氢的细胞器实际上是线粒体。一定量的O₂ ^·-会使细胞产生氧化应激，在胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)的作用下产生多硫化氢。但是目前发表的检测O₂ ^·-和多硫化氢的探针都是单独检测，而细胞中的氧化还原过程是十分复杂的，是由很多种物质共同作用的结果，为了更好地研究O₂ ^·-和多硫化氢之间的互相作用，设计一种荧光探针同时检测活性氧和多硫化氢具有十分重要的意义。在未来研究中，区分细胞信号转导功能是H₂S诱导的效应，还是多硫化氢介导的效果将是重要的努力方向。因此，细胞线粒体内的多硫化氢在多大程度上以及通过什么机制受O₂ ^·-调控、并开启信号转导通路仍有待进一步明确。这就需要新的实验证据证明：在多硫化氢信号转导过程中，多硫化氢分子是否为实际的信号传导分子。如果该情况得到证实，那么H₂S可能只是基于多硫化氢信号传导终端所释放的终产物，即作为多硫化氢的还原产物。这也与生理状态的H₂S浓度总是保持在较低的浓度(nM)相一致。本专利中所涉及的荧光探针将有助于探索H₂S可能不是实际的细胞信号转导分子，许多生理效应是基于多硫化氢介导和调控的结果，以期解决这个关键的问题。

鉴于O₂ ^·-调控多硫化氢细胞信号转导通路的重要生物医学意义，发展用于检测O₂ ^·-和多硫化氢浓度变化水平的分析方法已经变得越来越迫切。目前，用于检测O₂ ^·-的方法有:电子顺磁共振法，SOD酶活性测定法，高效液相色谱法(HPLC)以及电化学方法；用于检测多硫化氢的方法有:比色法，电化学分析，色谱分析法。但是这些方法往往需要试样预处理，荧光探针方法以其高时空分辨、操作简便和原位非损伤检测等优点，在生物活性物种检测领域，已成为一种功能强大的研究辅助工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物，荧光团衍生物如通式Ⅰ所示，

通式Ⅰ中：

R₁为C_1-22烷基、卤代苄基或C₁-C₁₂有机酸酯链；

R₂为氢、磺酸基、氨基、羧基、硝基或卤素；

X(定位功能基团)为氢、丁基三苯基鏻基团、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；

Y₁为N、O或S；

Y₂为N、O或S。

一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物的应用，以所述通式Ⅰ所示的荧光团衍生物作为O₂ ^·-或多硫化氢的联动检测荧光探针。

一种荧光探针：荧光探针为通式Ⅰ所示的荧光团衍生物，其以花菁等染料作为荧光母体，并在母体引入亲脂性对具备线粒体、癌细胞定位功能团-OH、丁基三苯基鏻基团、N-丙基吗啉基团、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；以及在母体Y₂处所引入邻、间、对硝基苯基。

所述母体Y₂处所引入邻、间、对硝基苯基，与Y₂共同形成检测基团。

所述荧光探针用于定性/定量的联动检测生理环境下细胞或生物体内外的O₂ ^·-或多硫化氢浓度。

本发明的有益效果：

本发明化合物用于作为O₂ ^·-和多硫化氢联动检测的荧光探针，其在检测O₂ ^·-前后荧光探针吸收和荧光发射最大波长会有改变；检测多硫化氢前后荧光探针荧光发射强度会有所改变。可用于水体系、模拟生理环境和细胞内O₂ ^·-和多硫化氢水平的联动检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。本发明化合物用作荧光探针，可用于细胞内O₂ ^·-和多硫化氢联动检测，这对深入研究O₂ ^·-和多硫化氢在生物体内的信号转导过程和机理，进一步了解O₂ ^·-和多硫化氢的生理和毒理作用具有重要的生物医学意义。

附图说明

图1为本发明实施例提供的采用的荧光探针对O₂ ^·-检测前后荧光变化。

图2为本发明实施例提供的采用的荧光探针对不同浓度O₂ ^·-与荧光强度的线性关系图。

图3为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对O₂ ^·-的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：空白、超氧阴离子、羟基自由基、双氧水、脂质过氧化物、枯烯氢过氧化物、过氧化叔丁醇、一氧化氮、过氧化亚硝、次氯酸。

图4为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对多硫化氢检测前后荧光光谱的变化。

图5为本发明实施例提供的采用的荧光探针对不同浓度的Na₂S₄与荧光强度的线性关系图。

图6为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对多硫化氢的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：空白、过硫化钠、多硫化氢、PhCH₂S₄CH₂Ph、多硫半胱氨酸、斜方硫、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、胱氨酸、氧化型谷胱甘肽、生育酚、抗坏血酸。

图7为细胞对照组。

图8为超氧阴离子处理组。

图9为多硫化氢处理组。

具体实施方式

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

荧光探针通式为：

通式Ⅰ中，

R₁为C_1-22烷基、卤代苄基或C₁-C₁₂有机酸酯链；R₂为氢、磺酸基、氨基、羧基、硝基或卤素；X(定位功能基团)为氢、丁基三苯基鏻基团、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；Y₁为N、O或S；Y₂(检测基团)为N、O或S。

优选为：

检测基团Y₂处所引入的取代基为间硝基苯基团，Y₁为O，X为H时，所述花菁类化合物的通式为：

通式II中：

Y₁为N，R₁为乙基链，R₂为氢，时；

将通式Ⅰ与待测定水体、模拟生理环境或生物体内外的超氧阴离子反应从而导致荧光强度的改变，所得通式III结构的化合物；

将通式III与待测定水体、模拟生理环境或生物体内外的多硫化氢反应从而导致荧光强度的改变，所得通式IV结构的化合物；

将通式II结构应用于检测超氧阴离子时，与O₂ ^·-作用后，生成具有通式VI结构的化合物，从而导致荧光强度的改变；

将通式VI结构应用于检测多硫化氢时，与多硫化氢作用后，生成具有通式VII结构的化合物，从而导致荧光波长的改变；

通式II可对O₂ ^·-或多硫化氢进行定性、定量的检测。

本发明中使用的术语“有机酸酯链”包括直链有机酸酯基和支有机酸酯基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本发明中使用的术语糖基指单糖、双糖、类单糖或类双糖。

实施例1.花菁类化合物的制备：

通式Ⅰ中所示花菁类荧光团来自市售商品，然后在荧光团相应的位置分别修饰上不同的定位基团。最后将修饰定位基团的荧光团和取代苯甲酸在二氯甲烷溶剂中反应得到的相应的花菁类化合物。具体实施例如下：

制备式一化合物：

将间硝基苯酚(0.696g，5.00mmol)溶解在30ml无水DMF的圆底烧瓶中，室温条件下，加入0.208g(60％in oil)NaH,在氩气保护下搅拌15min。如上所述七碳花菁荧光团(0.5g,0.83mmol)加入上述溶液，室温搅拌反应24h，用饱和碘化钾溶液洗涤，二氯甲烷萃取，旋蒸。粗产品用柱层析色谱进行纯化，洗脱剂选择乙酸乙酯和甲醇(4:1/v/v)，得到0.293g绿色固体，产率50％。将上一步产品(0.07g，0.1mmol)溶于10ml甲醇，冰水浴下分批滴加硼氢化钠(0.0057g,0.15mmol)，反应持续15分钟后以稀盐酸(10％)中和至中性，然后二氯甲烷(100ml×3)萃取，加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(200-300目)分离。洗脱剂为二氯甲烷和石油醚(1:1/v/v)，收集黄色组分，蒸干溶剂后得得产品0.053g，收率:75％。

式一化合物:¹HNMR(500MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):8.01-7.94(m,2H),7.69-7.54(m,4H),7.39-7.22(m,10H),6.84-6.82(m,2H),6.21-6.11(m,2H),5.48(s,1H),4.56(s,1H),4.12-4.06(m,2H),3.56-3.54(m,1H),3.07-3.05(m,3H),2.85(m,4H),1.37-1.05(m,18H).¹³CNMR(125MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):178.01,172.56,163.12,160.01,156.03,146.12,143.43,141.63,141.29,141.02,140.40,138.03,134.20,129.83,129.42,128.47,128.04,127.90,127.01,126.30,125.08,122.08,120.85,115.04,110.58,99.79,91.25,70.09,49.00,38.89,31.58,26.62,11.04.LC-MS(API-ES):m/z C₄₆H₅₀N₄O₃Calcd 706.3883,found[M-H]^-705.3804.

制备式二化合物：

在氩气保护下，在氩气保护下，将花菁荧光团(0.282g，0.4mmol)溶解在25ml无水DMF中，室温下加入NaH(60％in oil)(0.016g，0.4mmol)搅拌反应30min，在上述溶液中加入对苄基氯(0.35g，2mmol)搅拌反应24h，旋蒸，产物用硅胶色谱柱进行纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(15:1/v/v)，得到绿色固体0.219g，产率65％。将上一步产品(0.07g，0.1mmol)溶于10ml甲醇，冰水浴下分批滴加硼氢化钠(0.0057g,0.15mmol)，反应持续15分钟后以稀盐酸(10％)中和至中性，然后二氯甲烷(100ml×3)萃取，加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(200-300目)分离。洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯(5:1/v/v)，收集黄色组分，蒸干溶剂后得得产品0.056g，收率:80％。

式二化合物¹HNMR(500MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):7.73-7.70(m,1H),7.56-7.54(m,1H),7.42-6.70(m,16H),6.56-6.45(m,4H),5.94-5.91(m,2H),5.14(s,2H),4.71(s,2H),4.52(s,1H),4.17-4.12(m,4H),3.73-3.71(m,1H),3.13-3.10(m,1H),2.13-2.15(m,4H),1.10-1.09(m,18H).¹³CNMR(125MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):178.02,172.55,163.11,160.12,157.82,147.67,146.11,143.48,141.63,141.01,140.39,138.03,135.74,135.38,134.21,129.85,129.41,128.48,127.41,127.02,126.29,126.05,125.10,122.10,120.86,116.25,116.12,110.28,99.82,90.30,71.12,70.96,50.10,38.46,32.20,26.08,13.60.LC-MS(API-ES):m/z C₅₄H₅₇ClN₄O₃Calcd 844.4119,found[M+H]⁺845.4191.

另外，通式Ⅰ所示的其它化合物按照上述的说明制备获得。

现以式一所指化合物为例说明测定过程，以下实施例中涉及到的探针化合物均为式一所指化合物：

实施例2

将制备所得式一化合物作为探针应用于水体系、模拟生理环境和细胞内进行对超氧阴离子和多硫化氢的检测，模拟生理条件，以下各项实验均在pH＝7.4条件下进行(HEPES缓冲溶液，浓度为40mM)，探针浓度采用10μM。

上述制备所得化合物式一对超氧阴离子的响应：

pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10μM式一化合物，再加入40mM HEPES，然后加入10μM超氧阴离子，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡2min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱在检测超氧阴离子前后的变化如图1所示。为了评估式一化合物对O₂ ^·-浓度的测定的能力，所述探针与不同浓度O₂ ^·-反应。Hcy-Mi的最终浓度保持在10μM，而O₂ ^·-的浓度变化为0至25μM。在730nm的条件下荧光强度与O₂ ^·-的浓度是成线性关系的，如图2所示。本化合物可用于实现生物体内的超氧阴离子检测。同时，本发明实施例提供的探针与超氧阴离子反应后产物结构如下：

实施例3

化合物式一对超氧阴离子的选择性

pH采用HEPES缓冲溶液控制。取多个10ml比色管，并在每个10ml比色管中加入2μM化合物式一，再加入40mM pH为7.4的HEPES缓冲液，然后分别加入如图3所示，待测物依次为：1、空白；2、超氧阴离子(25μM)；3、羟基自由基(25μM)；4、双氧水(200μM)；5、过氧化亚油酸(400μM)；6、枯烯氢过氧化物(300μM)；7、过氧化叔丁醇(250μM)；8、一氧化氮(300μM)；9、过氧化亚硝酰阴离子(25μM)；10、次氯酸(200μM)。最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，25℃下平衡10min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对超氧阴离子的选择性如图3所示。并由图可知式一化合物对超氧阴离子具有很好的选择性。

实施例4

以实施例2操作后，继续向待测液中加入10μM多硫化氢(Na₂S₄)，摇匀溶液，平衡10min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱在检测超氧阴离子前后的变化如图4所示。为了评估式一化合物对多硫化氢浓度的测定的能力，所述探针与不同浓度H₂S₂反应。多硫化氢的最终浓度保持在10μM，而多硫化氢的浓度变化为0至100μM。在730nm的条件下荧光强度与多硫化氢的浓度是成线性关系的，如图5所示。本化合物可用于实现生物体内的多硫化氢的检测。同时，本发明实施例提供的探针与多硫化氢反应后产物结构如下：

实施例5

以实施例2操作后，向待测液中加入化合物如图6所示，待测物依次为：1、空白；2、Na₂S₂(100μM)；3、Na₂S₄(100μM)；4、PhCH₂S₄CH₂Ph(100μM)；5、多硫化半胱氨酸(100μM)；6、S₈(100μM)；7、硫氢化钠(100μM)；8、谷胱甘肽(1mM)；9、半胱氨酸(500μM)；10、同型半胱氨酸(500μM)；11、胱氨酸(500μM)；12、氧化型谷胱甘肽(500μM)；13、生育酚(50μM)；14、抗坏血酸(50μM)。摇匀溶液，25℃下平衡10min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对多硫化氢的选择性如图6所示。并由图可知式一化合物对多硫化氢具有很好的选择性。多硫化氢包含Na₂S₂、Na₂S₄、PhCH₂S₄CH₂Ph、多硫化半胱氨酸、S₈。

实施例6

化合物式二在人脐静脉上皮细胞内的成像

选择人脐静脉上皮细胞作为生物模型，首先，在37℃下，细胞用式一化合物(1μM)孵育15分钟作为对照组，细胞没有显示荧光(图7)。然后，图8细胞的处理和对照组一样，用细胞培养液冲洗细胞三次，再加入超氧阴离子(2μM)孵育15分钟，有明显的荧光生成。因此，探针可以用来直接检测活细胞外源添加的超氧阴离子。在37℃下，图9细胞的处理和对照组一样，用细胞培养液冲洗细胞三次，再加入Na₂S₄(10μM)孵育15分钟，有强烈的荧光生成。因此，探针可以用来直接检测活细胞外源添加的多硫化氢。

本发明所述荧光探针，在超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢存在下，对应的荧光发射波长和强度发生变化，可用于生物体内超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢的检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，检测信噪比高、灵敏度和选择性好。这类化合物作为荧光探针可用于复杂生物样品中超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢水平的联动检测，对研究超氧阴离子(O₂ ^·-)和多硫化氢的细胞信号转导，具有重要的生物医学意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物，其特征在于：荧光团衍生物如通式Ⅰ所示，

通式Ⅰ中：

R₁为C_1-22烷基、卤代苄基或C₁-C₁₂有机酸酯链；

R₂为氢、磺酸基、氨基、羧基、硝基或卤素；

X(定位功能基团)为-OH、丁基三苯基鏻基、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；

Y₁为N、O或S；

Y₂为N、O或S。

2.一种权利要求1所述的用于测定超氧阴离子和多硫化氢的荧光团衍生物的应用，其特征在于：以所述通式Ⅰ所示的荧光团衍生物作为O₂ ^·-或多硫化氢的联动检测荧光探针。

3.一种荧光探针，其特征在于：

荧光探针为通式Ⅰ所示的荧光团衍生物，其以花菁等染料作为荧光母体，并在母体引入亲脂性对具备线粒体、癌细胞定位功能团-OH、丁基三苯基鏻基、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基、苄基氯或C_1-22烷基；以及在母体Y₂处所引入邻、间、对硝基苯基。

4.按权利要求3所述的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针用于定性/定量的联动检测生理环境下细胞或生物体内外的O₂ ^·-或多硫化氢浓度。