CN101921586A

CN101921586A - 一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN101921586A
Application number: CN2010102281622A
Authority: CN
Inventors: 袁景利; 陈永刚; 叶志强; 王桂兰
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明涉及一种可用于一氧化氮特异性荧光测定的新型铕配合物荧光探针及其应用。该探针是以三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物(简称DATTA-Eu³⁺)，其中所述有机配位体结构式为：该探针在生理pH值的含氧水溶液中可以特异性地与一氧化氮反应，导致探针的荧光强度增加47倍以上，从而实现对体系中一氧化氮的选择性荧光测定。

Description

一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一氧化氮的荧光测定技术领域，具体地说是一种可用于水溶液及生物体系中一氧化氮荧光测定的铕配合物荧光探针及其应用。

背景技术

在生物体系中，一氧化氮(NO)能通过生物体自动合成并能在动物、植物、真菌、细菌体内与其他一些自由基分子或金属蛋白快速反应，从而发挥重要的生理、病理作用。在生物体内，低浓度的NO作为细胞内及细胞间一种信号传导分子在血液循环、免疫、神经系统中发挥重要的作用(文献1：R.M.J.Palmer，A.G.Ferrige，S.Moncada，Nature1987，327，524；文献2：S.H.Snyder，Science1992，257，494；文献3：V.Holan，M.Krulova，A.Zajicova，J.Pindjakova，Mol.Immunol.2002，38，989；文献4：S.Jasid，M.Simontacchi，C.G.Bartoli，S.Puntarulo，Plant Physiol.2006，142，1246)，而当NO的浓度过高时，便与体内其他活性氧物种(ROS)反应产生大量的活性氮物种(RNS)(文献5：F.L.M.Ricciardolo，P.J.Sterk，B.Gaston，G.Folkerts，Physiol.Rev.2004，84，731)，进而对核酸、脂肪以及蛋白质等生物分子造成损害。

由于NO具有非常重要的生理作用，建立灵敏的NO检测方法，特别是生物体系中的NO检测方法越来越引起人们的关注。目前，NO检测主要有以下几种方法：

(1)利用NO是一种自由基特征的磁共振波谱法(文献6：T.Yoshimura，H.Yokoyama，S.Fujii，F.Takayama，K.Oikawa，H.Kamada，Nat.Biotechnol.1996，14，992；文献7：Y.Katayama，N.Soh，M.Maeda，Chem.Phys.Chem.2001，2，655)，但是，由于NO在液相中半衰期极短，极容易被氧化成其它氮氧化物，使得该方法灵敏度、特异性、稳定性和应用范围上略有不足。

(2)分光光度法，利用NO易被氧化成NO₂ ^-，进而在酸性条件下与Griess试剂反应生成重氮化物的方法(文献8：L.C.Green，D.A.Wagner，J.Glogowski，P.L.Skipper，J.S.Wishnok，S.R.Tannenbaum，Anal.Biochem.1982，126，131)，该方法操作简单，但准确度、灵敏度较低。

(3)电化学法，利用NO容易被氧化而发生电化学反应，从而对NO浓度进行测定的方法(文献9：T.Malinski，Z.Taha，Nature1992，358，676；文献10：F.Bedioui，N.Villeneuve，Electroanal.2003，15，15)，该方法灵敏度高、电极稳定性好、使用寿命长，但可用于细胞内NO测定的电极制作困难，且将这种电极插入细胞会对细胞产生较大的损伤。

(4)化学发光法，用氧化剂将NO氧化成二氧化氮后利用激发态二氧化氮返回基态时释放能量而发光的方法(文献11：J.F.Brien，B.E.McLaughlin，K.Nakatsu，G.S.Marks，Methods Enzymol.1996，268，83)，该方法灵敏度高，但是操作复杂，而且在操作过程中使用的氧化剂如臭氧、过氧化氢等对细胞的损害很大，很难用于细胞体系中NO的测定。

(5)使用荧光探针的测定法(文献12：H.Kojima，N.Nakatsubo，K.Kikuchi，S.Kawahara，Y.Kirino，H.Nagoshi，Y.Hirata，T.Nagano，Anal.Chem.1998，70，2446；文献13：M.H.Lim，D.Xu，S.J.Lippard，Nat.Chem.Biol.2006，2，375；文献14：E.W.Miller，C.J.Chang，Curr.Opin.Chem.Biol.2007，11，620)，该方法具有操作简单、灵敏度高、选择性好等特点，是目前最为理想的检测方法之一。但目前已有的NO荧光探针所使用的荧光团都是有机荧光分子，这些有机荧光团存在光稳定性差、易被光漂白、Stokes位移较小，在用于复杂生物体系测定时易受到体系共存杂质背景荧光干扰等缺点(文献15：Z.Zhang，S.Achilefu，Org.Lett.2004，6，2067)。另外，虽然这些荧光探针分子能够穿过细胞膜与细胞内的NO反应而产生荧光信号，但这些探针分子与NO的反应产物也很容易从细胞中溢出(文献16：L.E.McQuade，S.J.Lippard，Curr.Opin.Chem.Biol.2009，14，1)，从而在荧光测定时产生误差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、选择性及水溶性好、适用范围广、可用于水溶液及生物体系中NO荧光测定的铕配合物荧光探针及应用。

本发明的技术方案如下：

以三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物(简称DATTA-Eu³⁺)为一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体DATTA结构式为：

与细胞共培养可进入细胞的三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸的乙酸亚甲基酯形成的配合物为一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体结构式为：

所述基于上述铕配合物的NO荧光探针的应用过程为：在各类生物及非生物环境中，利用所述的铕配合物荧光探针-Eu³⁺与体系中NO反应生成DATTA的苯并三唑衍生物4’-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸与Eu³⁺的配合物(简称BPTTA-Eu³⁺)，导致探针在612nm波长处的荧光强度显著增强，然后通过荧光测定法确定NO的产生及生成量。所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还包括时间分辨荧光测定法、荧光显微镜成像测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。

所述NO测定用铕配合物荧光探针可用于含有其组份的测定试剂盒及相关试剂中。

本发明的荧光探针具有如下优点：

1.具有很好的水溶性，适用于水溶液中各种化学、生物化学、细胞及生物组织等体系中NO的测定。

2.荧光寿命长，可用于百微秒级的时间分辨荧光测定，以消除背景荧光对测定的干扰。

3.稳定性高，能长期保存使用。

4.具有较高的NO测定灵敏度，最低检测下限为8.4nmol/L。

5.对NO有很好的选择性，与其他的活性氧物种作用时荧光信号几乎无变化。

6.在生理pH值的水溶液中可迅速与NO反应导致荧光强度增强，其荧光量子效率增大47倍。

7.经溴甲基乙酸酯酯化后在普通培养条件下即可进入活细胞内，特异性地与细胞内的一氧化氮反应，引起探针的荧光强度显著增强，进而用于活细胞中NO的荧光测定。

附图说明

图1是有机配位体DATTA的合成路线图。

图2是BPTTA-Eu³⁺与NO的反应原理图及反应前后溶液的荧光颜色变化。

图3是在pH值7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中DATTA-Eu³⁺(2.0μmol/L，实线)及其与NO反应产物BPTTA-Eu³⁺(2.0μmol/L，虚线)的荧光光谱图。

图4是DATTA-Eu³⁺(2.0μmol/L)及其与NO反应产物BPTTA-Eu³⁺(2.0μmol/L)在不同pH值的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光强度变化图。

图5是DATTA-Eu³⁺(2.0μmol/L)及其与NO反应产物BPTTA-Eu³⁺(2.0μmol/L)在不同pH值的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光寿命变化图。

图6是DATTA-Eu³⁺(0.1μmol/L)在pH值7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中与各种活性氧物种(10μmol/L)反应产物的荧光强度比较图。

图7是DATTA-Eu³⁺(1.0μmol/L)与不同浓度NO在pH值7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中反应后其产物荧光光谱的变化情况图。

图8是DATTA-Eu³⁺在pH值7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中检测NO的工作曲线图。

图9是DATTA-Eu³⁺标记的栀子细胞在不同培养时间下的明场成像、荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果图。

具体实施方式

下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。本实施例仅用于对本发明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。

实施例1：有机配位体DATTA的合成

合成路线如图1所示，基体操作过程如下。

(1)4’-(4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物1)的合成

在300mL含有24.2克(0.2mol)2-乙酰基吡啶的溶液中加入20mL的10mol/L氢氧化钾，室温搅拌30分钟后加入13.6克的4-甲氧基苯甲醛(0.1mol)，室温继续搅拌15分钟后再加入150mL的浓氨水。反应液在50℃下搅拌12小时，过滤收集沉淀，用水充分洗涤后再用少量的冷甲醇洗涤。粗产品经过乙醇重结晶后得到17克的化合物1，产率50％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.74(s，2H)，8.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.92-7.90(m，4H)，7.37(t，J＝6.4Hz，2H)，7.04(d，J＝8.0Hz，2H)，3.89(s，3H)。

(2)6，6”-二腈基-4’-(4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物2)的合成

将1.82克化合物1(5.4mmol)溶于100mLCH₂Cl₂后加入3.70克的间氯过氧化苯甲酸(m-CPBA，21.4mmol)，反应液室温搅拌24小时。用100mL的10％Na₂CO₃水溶液洗涤有机相2次，再用无水硫酸钠干燥有机相，蒸去溶剂。所得固体真空干燥后溶于40mL的CH₂Cl₂中，加入3.73克的三甲基氰基硅(37.5mmol)，室温搅拌20分钟后，慢慢滴加入3.02克的苯甲酰氯，反应液室温搅拌24小时。蒸去一半的溶剂后，加入30mL的10％K₂CO₃水溶液，室温搅拌1小时。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后再用少量的CH₃CN洗涤，真空干燥。粗产品经二氧六环重结晶后得到1.40克的目标化合物2，产率67％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.86(d，J＝8.4Hz，2H)，8.79(s，2H)，8.02(t，J＝8.0Hz，2H)，7.89(d，J＝8.4Hz，2H)，7.76(d，J＝7.6Hz，2H)，7.10(d，J＝8.4Hz，2H)，3.92(s，3H)。

(3)4’-(4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲酸二甲酯(化合物3)的合成

将1.56克的化合物2(4.0mmol)加入50mL的40％氢溴酸与25mL的冰乙酸中，110℃下搅拌反应8小时后反应液倒入200mL的冰水中，过滤收集沉淀，水充分洗涤后真空干燥。将产物加入到含有在4.77克氯化亚砜(40.1mmol)的120mL甲醇溶液中，搅拌回流18小时后，减压蒸去溶剂，产物用饱和NaHCO₃水溶液及纯水洗涤后，真空干燥。粗产品经二氧六环重结晶后得到1.17克的目标化合物3，产率64％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.84(d，J＝8.0Hz，2H)，8.79(s，2H)，8.19(d，J＝7.6Hz，2H)，8.03(t，J＝8.0Hz，2H)7.88(d，J＝8.8Hz，2H)，7.06(d，J＝8.4Hz，2H)，4.07(s，6H)，3.90(s，3H)。

(4)6，6”-二羟甲基-4’-(4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物4)的合成将1.50克的化合物3(3.3mmol)及0.50克的NaBH₄(13.2mmol)加入60mL的无水乙醇中，反应液室温搅拌2小时后，再回流搅拌8小时。减压蒸除溶剂，加入10mL的饱和NaHCO₃水溶液，回流搅拌10分钟，反应液倒入30mL的冰水中。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后再用少量的CH₃CN洗涤，真空干燥，得到1.22克的目标化合物4，产率93％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.68(s，2H)，8.58(d，J＝7.6Hz，2H)，7.89(t，J＝8.0Hz，2H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝7.6Hz，2H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，4.88(s，4H)，4.06(br，2H)，3.91(s，3H)。

(5)6，6”-二溴甲基-4’-(4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物5)的合成

将3.65克PBr₃(13.5mmol)加入70mL的干燥二甲基甲酰胺，室温搅拌15分钟后加入2.17克的化合物4(5.4mmol)，继续搅拌反应24小时。溶液中加入饱和NaHCO₃水溶液中和，过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用少量CH₃CN洗涤，真空干燥，得到2.67克的目标化合物5，产率94％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.73(s，2H)，8.57(d，J＝7.6Hz，2H)，7.86-7.92(m，4H)，7.51(d，J＝7.6Hz，2H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，4.69(s，4H)，3.91(s，3H)。

(6)6，6”-二溴甲基-4’-(4-羟基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物6)的合成

在0℃氩气氛围下将含有2.82克BBr3(11.3mmol)的15mLCH₂Cl₂溶液慢慢滴加入含有1.48克的化合物5(2.8mmol)的130mLCH₂Cl₂溶液中，反应液在搅拌下逐渐升至室温并继续搅拌过夜。滴加入80mL的冷水，搅拌30分钟后，过滤收集沉淀，用水充分洗涤，真空干燥。粗产品经甲醇重结晶后得到0.71克的目标化合物6，产率49％。¹HNMR(DMSO-d₆)测定结果：8.67(s，2H)，8.60(d，J＝7.6Hz，2H)，8.08(t，J＝8.0Hz，2H)，7.81(d，J＝8.4Hz，2H)，7.71(d，J＝7.6Hz，2H)，7.02(d，J＝8.4Hz，2H)，4.87(s，4H)。

(7)4’-(4-羟基苯基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(化合物7)的合成

在氩气氛围下将0.13克NaH(5.4mmol)加入到含有1.02克二乙酸乙酯基胺(5.4mmol)的60mL干燥CH₃CN中，室温搅拌15分钟后加入1.15克的化合物6(2.2mmol)。室温搅拌14小时后过滤收集滤液，蒸除溶剂，产物再溶于20mLCHCl₃中，用20mL水洗涤CHCl₃溶液2次，无水Na₂SO₄干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物用硅胶柱分离，淋洗剂为1∶1的石油醚-乙酸乙酯，产物再用1∶5的乙醇-水重结晶得到0.67克的目标化合物7，产率41％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.61(s，2H)，8.53(d，J＝7.6Hz，2H)，7.88(t，J＝7.6Hz，2H)，7.69(d，J＝8.4Hz，2H)，7.66(d，J＝8.0Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，4.22(s，4H)，4.16(q，J＝7.2Hz，8H)，3.70(s，8H)，1.23(t，J＝7.2Hz，12H)。

(8)4’-[4-(3-氨基-4-硝基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(化合物8)的合成

在氩气氛围下将0.024克NaH(1.0mmol)加入到含有0.73克化合物7(1.0mmol)的35mL干燥CH₃CN中，室温搅拌15分钟后加入0.23克的5-氟-2-硝基苯胺(1.5mmol)。反应液50℃下搅拌8小时，过滤收集滤液，蒸除溶剂，产物再溶于20mLCHCl₃中，用20mL水洗涤CHCl₃溶液2次，无水Na₂SO₄干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以2∶1的石油醚-乙酸乙酯为淋洗剂用硅胶柱分离纯化，得到0.71克的目标化合物8，产率82％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.71(s，2H)，8.56(d，J＝7.6Hz，2H)，8.13(d，J＝9.6Hz，1H)，7.92(d，J＝8.4Hz，2H)，7.88(t，J＝8.0Hz，2H)，7.65(d，J＝7.6Hz，2H)，7.22(d，J＝8.0Hz，2H)，6.39(d，J＝9.6Hz，1H)，6.35(br，2H)，6.27(s，1H)，4.21(s，4H)，4.16(q，J＝7.2Hz，8H)，3.70(s，8H)，1.24(t，J＝7.2Hz，12H)。

(9)4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(化合物9)的合成

将0.82克化合物8(0.95mmol)溶于40mL乙醇后加入0.05克10％的Pd/C催化剂，在氩气氛围下滴加入20mL含有1.0克NaH₂PO₂(11.4mmol)的水溶液，反应液搅拌回流6小时，过滤除去Pd/C催化剂，滤液减压蒸去溶剂，产物再溶于20mL的CHCl₃中，用20mL水洗涤CHCl₃溶液2次，无水Na₂SO₄干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以1∶5的石油醚-乙酸乙酯为淋洗剂用硅胶柱分离纯化，得到0.46克的目标化合物9，产率58％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.68(s，2H)，8.54(d，J＝8.0Hz，2H)，7.86(t，J＝7.6Hz，2H)，7.83(d，J＝8.8Hz，2H)，7.63(d，J＝7.6Hz，2H)，7.09(d，J＝8.8Hz，2H)，6.72(d，J＝8.0Hz，1H)，6.50(s，1H)，6.46(d，J＝8.0Hz，1H)，4.19(s，4H)，4.16(q，J＝7.2Hz，8H)，3.70(s，8H)，1.23(t，J＝7.2Hz，12H)。

(10)DATTA的合成

在氩气氛围下将0.46克的化合物9(0.55mmol)加入0.93克KOH-20mL乙醇-5mL水的溶液中，室温搅拌24小时后，减压蒸去溶剂，产物再溶于15mL水中，用1.0mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2-3，室温搅拌3小时。过滤收集沉淀，用水洗涤后真空干燥。将产物加入20mL的干燥CH₃CN中，搅拌回流10分钟，过滤收集沉淀真空干燥，得到0.24克的目标化合物DATTA，产率60％。¹MR(DMSO-d₆)测定结果：8.65(s，2H)，8.53(d，J＝7.6Hz，2H)，8.01(t，J＝7.6Hz，2H)，7.89(d，J＝8.4Hz，2H)，7.62(d，J＝7.6Hz，2H)，7.08(d，J＝8.4Hz，2H)，6.59(d，J＝8.4Hz，1H)，6.35(s，1H)，6.22(d，J＝8.4Hz，1H)，4.10(s，4H)，3.57(s，8H)。¹³CNMR(DMSO-d₆)测定结果：172.93，160.6，159.05，156.0，154.80，149.25，147.72，138.42，137.53，131.17，128.79，123.89，119.83，117.85，115.99，108.74，106.89，59.54，54.91。元素分析测定结果：计算值(C₃₇H₃₅N₇O₉·1.5H₂O)：C＝59.35％，H＝5.12％，N＝13.09％；测定值：C＝58.96％，H＝5.08％，N＝12.94％。质谱(ESI-MS)测定结果：m/z＝720.2[M-H]^-。

实施例2：DATTA的乙酸亚甲基酯(简称AM-DATTA)的合成

在氩气氛围下将11.58毫克的DATTA·1.5H₂O(15.5μmol)溶于193微升的二甲基亚砜中，加入61微升的乙酸溴甲基酯(618μmol)及89微升的三乙基胺(617μmol)，溶液室温下搅拌14小时，离心除去微量的不溶物后，上清液即为AM-DATTA的溶液，4℃保存待用。质谱(ESI-MS)测定结果：m/z＝1009.8，[M+H]⁺。

实施例3：DATTA与NO反应产物(简称BPTTA)的合成

(1)4’-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(化合物10)的合成

将430毫克4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(实施例1中化合物9，0.52mmol)溶于含有63毫克乙酸的4mL水中，5℃下滴加入含有43毫克NaNO₂(0.62mmol)的2mL水溶液，5℃下搅拌10分钟后再室温搅拌5小时。反应液中加入20mL的CHCl₃搅拌10分钟，分出有机相。用20mL水洗涤CHCl₃溶液2次，无水Na₂SO₄干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以1∶2的石油醚-乙酸乙酯为淋洗剂用硅胶柱分离纯化，得到171毫克的目标化合物，产率39％。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：8.64(s，2H)，8.54(d，J＝7.6Hz，2H)，7.93(d，J＝8.8Hz，1H)，7.85(t，J＝7.6Hz，2H)，7.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.60(d，J＝7.6Hz，2H)，7.34(s，1H)，7.17(d，J＝7.6Hz，1H)，7.12(d，J＝8.4Hz，2H)，4.22(s，4H)，4.15(q，J＝7.2Hz，8H)，3.71(s，8H)，1.20(t，J＝7.2Hz，12H)。

(2)4’-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸(BPTTA)的合成

将171毫克的化合物10(0.20mmol)加入336毫克KOH-20mL乙醇-5mL水的溶液中，室温搅拌24小时后，减压蒸去溶剂，产物再溶于15mL水中，用1.0mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2-3，室温搅拌3小时。过滤收集沉淀，用水洗涤后真空干燥。将产物加入10mL的干燥CH₃CN中，搅拌回流10分钟，过滤收集沉淀真空干燥，得到56毫克的目标化合物BPTTA，产率38％。¹HNMR(DMSO-d₆)测定结果：8.71(s，2H)，8.58(d，J＝7.6Hz，2H)，8.07-8.00(m，5H)，7.66(d，J＝7.6Hz，2H)，7.54(s，1H)，7.28-7.26(m，3H)，4.20(s，4H)，3.68(s，8H)。¹³CNMR(DMSO-d₆)测定结果：172.55，158.75，158.23，156.02，154.66，149.10，138.63，133.02，129.29，128.67，124.13，120.05，119.54，118.14，59.49，54.90。元素分析测定结果：计算值(C₃₇H₃₂N₈O₉·4H₂O)：C＝55.20％，H＝5.01％，N＝13.92％；测定值：C＝55.41％，H＝4.88％，N＝14.12％。质谱(ESI-MS)测定结果：m/z＝731.3[M-H]^-。

实施例4：探针DATTA-Eu³⁺及其与NO反应产物BPTTA-Eu³⁺的性质测定

(1)光谱性质

用pH值为7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液作为溶剂测定了配合物DATTA-Eu³⁺及BPTTA-Eu³⁺(两种配合物中配位体与金属离子的摩尔比为1∶1)的紫外可见光谱、荧光光谱、摩尔消光系数(ε)、荧光量子收率(φ)及荧光寿命(τ)。紫外可见光谱测定用仪器为Perkin Elmer Lambda 35型分光光度计，荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计，荧光量子产率使用4’-苯基-2，2’：6’，2”-联三吡-6，6”-二甲胺四乙酸与Eu³⁺及Tb³⁺的配合物作为标准物按文献方法测得(文献16：M.Latva，H.Takalo，J.Kankare，J.Lumin.1997，75，149)。测定结果见表1。

表1.DATTA-Eu³⁺及BPTTA-Eu³⁺在硼酸缓冲溶液中的吸收及荧光性质

由表1可见，探针DATTA-Eu³⁺与NO反应前后其荧光量子产率发生了很大的变化，DATTA-Eu³⁺的荧光量子产率只有0.25％，而BPTTA-Eu³⁺的荧光量子产率达到了11.8％，表明探针DATTA-Eu³⁺与NO反应后其量子产率增加了47倍。DATTA-Eu³⁺与NO的化学反应式如图2所示，两种化合物的荧光光谱如图3所示。

(2)溶液pH值对DATTA-Eu³⁺及BPTTA-Eu³⁺荧光性质的影响

用不同pH值的0.05mol/L的硼酸缓冲溶液作为溶剂测定了配合物DATTA-Eu³⁺及BPTTA-Eu³⁺在不同pH值下的荧光强度与荧光寿命，结果见图4及图5。由图4可见，当pH大于6时，DATTA-Eu³⁺的荧光非常微弱且稳定，但当pH小于6时，DATTA-Eu³⁺的荧光随着溶液酸度的增加而逐渐变强，产生这种现象的原因是在酸性溶液中DATTA的2个氨基可发生质子化反应，导致其对铕配合物发光部位的光诱导电子转移消光作用减弱。与DATTA-Eu³⁺相比，BPTTA-Eu³⁺在pH小于6的溶液中可发出很强的荧光且强度不受pH的影响，但当pH大于6时，BPTTA-Eu³⁺的荧光随着溶液酸度的减小而逐渐变弱，这是由于在碱性溶液中BPTTA的三唑环上的氢可发生电离形成三唑环负离子，导致其对铕配合物发光部位的光诱导电子转移消光作用增强。总体来看，在生理pH值范围内，BPTTA-Eu³⁺与DATTA-Eu³⁺的荧光强度比值很大(在pH＝6.5和pH＝7.4时两者的荧光强度比值分别为50.5和47.4)，说明DATTA-Eu³⁺可作为荧光探针用于生理条件溶液中NO的高灵敏测定。另外，图5结果说明DATTA-Eu³⁺及BPTTA-Eu³⁺的荧光寿命基本不受溶液pH值的影响。

(3)探针DATTA-Eu³⁺对NO测定的选择性

分别考察了活性物种H₂O₂、·OH、OCl^-、单线态氧(¹O₂)、NO₂ ^-、NO₃ ^-、ONOO^-、O₂ ^-以及NO与探针DATTA-Eu³⁺的反应情况，在相同浓度与反应条件(所有反应都在0.05mol/L的pH值7.4的硼酸缓冲溶液中室温下进行，反应时间为1小时，DATTA-Eu³⁺浓度＝0.1μmol/L；活性物种浓度＝10μmol/L)下9种活性物种与DATTA-Eu³⁺反应产物的荧光强度测定结果如图6所示(测定仪器为PerkinElmer Victor 1420时间分辨荧光测定仪)。由图6可见，探针DATTA-Eu³⁺与H₂O₂、·OH、OCl^-、¹O₂、NO₂ ^-、NO₃ ^-、ONOO^-、O₂ ^-反应后的荧光强度没有发生明显变化，表明DATTA-Eu³⁺不与这些活性物种发生反应。当DATTA-Eu³⁺与NO反应后，由于形成了强荧光性的BPTTA-Eu³⁺，导致探针的荧光强度显著增强。上述结果表明探针DATTA-Eu³⁺对NO测定具有很好的选择性。

实施例5：使用DATTA-Eu³⁺测定水溶液中NO的浓度

在pH值为7.4的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中分别加入DATTA-Eu³⁺(0.1μmol/L)和不同浓度的NO，搅拌反应0.5小时后测定荧光强度。测定用仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计，测定结果如图7所示。从图7可以看出，伴随着NO浓度的增加，探针的荧光强度也逐渐增加，表明DATTA-Eu³⁺可用于定量测定溶液中生成的NO的浓度。

图8给出了使用DATTA-Eu³⁺检测NO的工作曲线(测定仪器为Perkin ElmerVictor 1420时间分辨荧光测定仪)。如图所示，NO的浓度与荧光强度具有很好的线性关系，用本底信号标准偏差的3倍计算最低检出限为8.4nmol/L，表明使用DATTA-Eu³⁺定量检测NO具有很高的灵敏度。

实施例6：探针DATTA-Eu³⁺用于植物细胞中内源性NO的荧光成像测定

将培养中的栀子细胞过滤收集后加入到含有200μmol/L的AM-DATTA及200μmol/L的EuCl₃的等渗盐溶液中形成密度为每毫升1.7×10⁵细胞的悬浮液，在室温下振荡培养。每隔一段时间取一定量的细胞液在4℃下每分钟600转离心5分钟后，用等渗盐溶液充分洗涤除去未进入细胞的配合物，将洗涤后的细胞置于载玻片上进行明场成像、荧光成像及时间分辨荧光成像测定(测定用仪器为配有时间分辨荧光成像功能的Nikon TE2000-E型倒置式荧光显微镜，见文献17：B.Song，G.L.Wang，M.Q.Tan，J.L.Yuan，J.Am.Chem.Soc.2006，128，13442)。

图9给出了不同培养时间下栀子细胞的成像测定结果，由图可见，随着培养时间的增加，细胞发出的荧光也明显增强，表明在培养过程中栀子细胞内可持续产生NO。通过对细胞的荧光强度分布进行分析，发现细胞核区域的荧光强度要明显高于细胞质区域，说明植物细胞内NO的生成发生在细胞核区域。另外，与常规荧光成像结果比较可以发现，时间分辨荧光成像中不存在细胞的背景荧光，表明时间分辨荧光成像测定方式可有效消除生物样品背景荧光对测定的干扰。

Claims

1.一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针，其特征在于：以三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物为一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针，其特征在于：与细胞共培养进入细胞的三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸的乙酸亚甲基酯形成的配合物为一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体结构式为：

。

3.权利要求1或2所述一氧化氮荧光探针的应用，其特征在于：在各类生物及非生物体系中，利用所述的铕配合物荧光探针与体系中的NO特异性反应，使得探针的荧光发光显著增强，然后通过荧光测定法来确定NO的生成量及分布情况；所述荧光测定法包括常规的荧光分光光度计测定法、时间分辨荧光分光光度计测定法、荧光显微镜成像测定法或时间分辨荧光荧光显微镜成像测定法。

4.根据3所述的应用，其特征在于：所述一氧化氮测定用铕配合物荧光探针用于含有其组份的测定试剂盒及相关试剂中。