CN101705245A - 一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非病毒基因载体的制备与应用。该非病毒基因载体为多苯并咪唑金属配合物。它是由多苯并咪唑TTHB、DTPB、EGTB、EDTB、IDB或者NTB为主配体，含苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，H₂O、Cl^-、NO₃ ^-、Ac^-或ClO₄ ^-为辅助配体或抗衡阴离子，合成和表征了大量含一个、两个或多个相同及不同的Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co^2+/3+、Mn²⁺、Fe^2+/3+或Ni²⁺金属离子的配合物。该类配合物作为新型基因载体，具有合成方法简单高效、水溶性好、细胞毒性低和转染效率高的特点。通过紫外-可见吸收光谱、光散射、透射电镜等实验发现这类配合物可有效诱导DNA凝聚；倒置荧光显微镜和细胞转染实验证实多苯并咪唑金属配合物作为载体释放的基因可以有效地进入细胞核内进行表达。

Description

一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种新型的非病毒基因载体，具体地讲是一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应用。

背景技术

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正基因缺陷从而达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键是获得安全、有效的进行基因转染的载体。基因治疗的载体一般分为病毒型和非病毒型，前者转染效率较高，但存在导向性差、携带能力低、具免疫原性和潜在致癌性等缺点；后者则具有低毒性、低免疫原性、低致癌性、易制备等优点因此近年来备受关注。

非病毒基因释放的载体包括阳离子脂类、金属配合物、聚合物(如聚-L-赖氨酸和聚胺等)、树状物(端基主要为胺基)、多肽(肽核酸)、纳米粒子(如量子点和碳纳米管等)和环糊精衍生物等，这些化合物具有低毒性、携带基因能力高、低免疫原性、低致癌性、易制备等优点。研究表明：大多数阳离子基因载体均能通过其带正电基团与DNA的带负电荷磷酸基发生静电作用，从而减弱DNA链上磷酸根负电荷之间的排斥作用，导致DNA弯曲、凝聚(压缩)，甚至使DNA被包裹。这些化合物的不足之处主要是：(1)由于受到细胞内外屏障的阻碍，细胞转染效率较低；(2)由于载体-DNA复合物是通过静电作用与生物膜结合，故不能转染膜表面含大量蛋白多糖的不带负电荷的细胞系；(3)由于载体的细胞毒性通常与其正电荷密度成正比，表面带过多正电荷的载体-DNA复合物易与血清白蛋白等血液组分相互作用，从而不利于靶细胞吸收。然而，非病毒基因载体优良的生物兼容性、对基因的大小基本没有限制和可大剂量生产等优点，使其在基因治疗中具有强大的吸引力和潜在的应用价值。研究者尽管设计合成了大量可驱动DNA凝聚的阳离子化合物，且在一定程度上能克服基因治疗中的体内、体外障碍，但金属配合物作为一类潜在有效的基因载体，却一直没有得到重视。

与其它阳离子化合物相比，多苯并咪唑金属配合物具有水溶性好、结构多样化、正电荷密度合理、制备容易等特点，故是一类潜力巨大的基因载体。由于这类配合物分子中具有较多电中性苯并咪唑基团，对细胞内的酸性环境具有显著的缓冲作用，这样由多种驱动力共同作用(包括静电作用以及金属配合物与DNA分子间碱基对的插入作用)诱导的DNA凝聚体不会因为稀释或与其他阴离子物种相互作用而解离，并且聚集体表面也不会积聚过高的正电荷，有助于减弱与血液中带负电物种间的相互作用，从而更加有利于凝聚体进入细胞核并被细胞吸收。申请人在工作中发现，驱动DNA凝聚的作用力包括静电作用和配合物与DNA碱基对间的插入作用。这是首次发现以多苯并咪唑为主配体的多核金属配合物对DNA凝聚具有显著促进作用。

发明内容

本发明目的旨在提供一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应用，该类金属配合物具有较好的水溶性、结构多样性和合理的正电荷密度等特点，而且容易制备，故是一类潜力巨大的基因载体。

本发明的技术方案包括：

一种非病毒基因载体，它是以多苯并咪唑为配体的多核金属配合物，具体是由1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺、N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亚胺或者三(2-苯并咪唑基甲基)胺为主配体，以苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，以H₂O、Cl^-、NO₃ ^-、Ac^-或C1O₄ ^-为辅助配体或抗衡阴离子，合成的同多核或杂多核Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co^2+/3+、Mn²⁺、Fe^2+/3+或Ni²⁺金属离子的配合物。

其中，所述的配体1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)的合成，由三乙四胺六乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶4～1∶8，优选1∶6，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入适量无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

所述的配体1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)的合成(参见图1、图2)，由二乙三胺五乙酸(DTPA)与邻苯二胺按物质的量之比1∶5，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

所述的配体N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷(EGTB)的合成，由乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)与邻苯二胺按物质的量之比1∶2～1∶6，优选1∶4，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

所述的配体N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺(EDTB)的合成，由乙二胺四乙酸(EGTA)和邻苯二胺按物质的量之比1∶2～1∶6，优选1∶4，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

所述的配体三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)的合成，由胺基三乙酸(NTA)与邻苯二胺按物质的量之比1∶1～1∶5，优选1∶3，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品.

所述的配体N，N-二(2’-苯并咪唑甲基)亚胺(IDB)的合成，由亚胺基二乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶1～1∶3，优选1∶2，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

本发明的非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)、N，N，N’，N’-四-(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷(EGTB)、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺(EDTB)、或者N，N-二(2’-苯并咪唑甲基)亚胺(IDB)为配体的金属配合物的合成：将配体溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金属离子的可溶性盐，配体和金属盐的摩尔比为1∶0.5～1∶4，60～90℃反应1～4小时，然后过滤、干燥得到产品，用自然挥发或扩散法得到多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体晶体。

以三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)为配体的金属配合物的合成，合成步骤为：

步骤1、配合物[Cu(NTB)(H₂O)](ClO₄)₂·5.2(H₂O)的合成：

将4mL CuCl₂·2H₂O(0.02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0.02mol)乙醇溶液中，搅拌，水浴加热30～90℃，反应半个小时后，加入10mlNaClO₄(0.04mmol)水溶液，继续使反应进行2～6个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出，过滤，洗涤，真空干燥得到浅黄绿色片状固体，即为目的配合物；

步骤2、将步骤1得到的配合物和所述金属离子的可溶性盐按摩尔比1∶0.5～1∶4加入蒸馏水中，然后在每一种配体和金属离子的溶液中再分别加入苯甲酸钠、4，4’-联吡啶、对苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、烟酸、异烟酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二酸或已二酸桥连配体，桥连配体和金属盐的摩尔比为1∶0.5～1∶5，调节溶液pH 4.0～9.0，将混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中并封闭在80～180℃反应36～80h，然后以5℃/h的速率降低反应温度至室温，在混合液中得到适于X-射线单晶衍射的多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体晶体。

本发明的非病毒基因载体的应用，其特征是，用于诱导DNA凝聚形成凝聚体。该载体和DNA形成的凝聚体，用于细胞核的转染染色。

附图说明

图1、配体DTPB合成路线。

图2、配体DTPB配体分子结构图。

图3、配合物[Cu₂(DTPB)Cl₂]Cl₂·5H₂O·2CH₃OH分子结构图。

图4、用ctDNA滴定配合物[Cu₂(DTPB)Cl₂]Cl₂·5H₂O·2CH₃OH的紫外-可见光谱图。

测试方法：不同浓度的ctDNA在20mM Tris-HCl(pH7.4)的缓冲体系中滴定浓度为4μM的配合物，37℃下反应相同时间，扫描测定体系在200～450nm的吸收值，采用双通道方法，用相应浓度的ctDNA样品作为空白，测定紫外吸收光谱.

图5、配合物[Cu₂(DTPB)Cl₂]Cl₂·5H₂O·2CH₃OH与λDNA凝聚体电镜图。

测试方法：浓度为2～50μM的配合物与λDNA在20mM Tris-HCl(pH7.4)的缓冲体系中，37℃反应不同的时间，然后取5μL的样品，滴加于铜网上，自然干燥，用Tecnai G220透射电镜在175kV观察(未染色)，单独DNA体系作为对照一并进行。图5中图a、b、c、d依次表示的是5.6μMλDNA和10μM配合物分别反应30min、30min、60min、120min形成凝聚体的形貌。

图6、配合物[Cu₂(EGTB)(ClO₄)₂(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O与λDNA凝聚体在细胞中的定位。

测试方法：5μM的配合物和5μM的λDNA反应30min后与细胞共培养，然后加入荧光染料DAPI和Greenview分别对对细胞核和凝聚体进行标记，然后通过倒置荧光显微镜观察凝聚体在细胞中的定位。图六中箭头所指黄色部分为凝聚体在细胞核内的定位，绿色部分为整个细胞核。

图7、配合物1、2、3、4与λDNA凝聚体的毒性实验结果。

其中，配合物1为[Cu₂(EGTB)(ClO₄)₂(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O，

配合物2为[Cu₂(DTPB)Cl₂(H₂O)](NO₃)₂·2CH₃OH·H₂O，

配合物3为[Co₂(DTPB)Cl₃]Cl·5H₂O，

配合物4为[Cu₂(DTPB)(NO₃)Cl(H₂O)](NO₃)₂·3CH₃OH·5H₂O。

测试方法：不同浓度的配合物和λDNA反应30min后与细胞共培养，MTT法检测凝聚体的细胞毒性。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

图8、单独配合物1、2、3、4的细胞毒性

其中，配合物1为[Cu₂(EGTB)(ClO₄)₂(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O，

配合物2为[Cu₂(DTPB)Cl₂(H₂O)](NO₃)₂·2CH₃OH·H₂O，

配合物3为[Co₂(DTPB)Cl₃]Cl·5H₂O，

配合物4为[Cu₂(DTPB)(NO₃)Cl(H₂O)](NO₃)₂·3CH₃OH·5H₂O的细胞毒性。

图9、配合物l、2、3、4与质粒pGL3-Control Vector凝聚体的转染实验结果。

配合物1为[Cu₂(EGTB)(ClO₄)2(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O，

配合物2为[Cu₂(DTPB)Cl₂(H₂O)](NO₃)₂·2CH₃OH·H₂O，

配合物3为[Co₂(DTPB)Cl₃]Cl·5H₂O、

配合物4为[Cu₂(DTPB)(NO₃)Cl(H₂O)](NO₃)₂·3CH₃OH·5H₂O。

测试方法：不同浓度的配合物和质粒pGL3-Control Vector反应30min后和细胞共培养，通过荧光素酶检测法分析配合物种类及配合物浓度对pGL3-Control Vector质粒转染效率的影响。

具体实施方式

实施例1

[Mn₂(TTHB)Cl₂]Cl₂□2/3C₂H₅OH□4H₂O的合成

称取提纯后的TTHB(0.5mmol)粉末溶解于20mL乙醇中，然后加入含有MnCl₂·2H₂O(1.5mmol)乙醇溶液，控温75℃搅拌反应5h，冷却、过滤，得到澄清的无色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物。

实施例2

[Cu₂(DTPB)Cl₂]Cl₂·5H₂O·2CH₃OH的合成

称取提纯后的DTPB(0.5mmol)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有CuCl₂·2H₂O(1mmol)甲醇溶液，控温60℃搅拌反应2h，冷却、过滤，得到澄清的绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物(参见图3)。

实施例3

[Cu₂(EGTB)(H₂O)₂](ClO₄)₄的合成

称取提纯后的EGTB(0.5mmol)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有Cu(ClO₄)₂·6H₂O(1mmol)的甲醇溶液，控温60℃搅拌反应2h，冷却、过滤，得到绿色的粉末与绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的块状单晶即为目的物。

实施例4

Cu(EDTB)(ClO₄)₂·CH₃OH的合成

称取提纯后的EDTB(1mmol)粉末溶解于2mL乙二醇中，然后加入含有(Cu(ClO₄)₂·6H₂O)(1mmol)的10mL水溶液中，控温60℃搅拌反应2h，冷却、过滤，得到绿色的粉末与绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的块状单晶即为目的物。

实施例5

[Cu(IDB)Cl₂]·CH₃OH的合成

称取提纯后的IDB(0.5mmol)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有CuCl₂·2H₂O(1mmol)甲醇溶液，控温60℃搅拌反应2h，冷却、过滤，得到澄清的绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物。

实施例6

由芳香羧酸桥连的铜的NTB配合物：

步骤1、[Cu(NTB)(H₂O)](ClO₄)₂·5H₂O的合成

将4mL CuCl₂·2H₂O(0.02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0.02mol)乙醇溶液中，搅拌，水浴加热60℃，反应半个小时后，加入10mLNaClO₄(0.04mmol)水溶液，继续使反应进行3个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出。过滤，依次用少量乙醇，乙醚，洗涤，真空干燥得到浅黄绿色片状固体即为目的物。

步骤2、[Cu(NTB)(PhCOO)]ClO₄的合成(PhCOO代表苯甲酸)

将步骤1得到的化合物(0.2mmol)加入到15mL蒸馏水中，然后加入1mL苯甲酸钠(0.2mmol)水溶液，并调节溶液pH7.2，将混合好的溶液转移到25mL聚四氟乙烯反应釜中并封闭在120℃反应72h，然后以5℃/h的速率降低反应温度至室温，滤液中得到适于X-射线单晶衍射的黄绿色块状晶体，手工分离出晶体即为目的物。

实施例7

由脂肪羧酸桥连的铜的NTB配合物：

{[Cu(NTB)]₂(μ-fuma)}(ClO₄)₂·8(H₂O)的合成(fuma代表反丁烯二酸根)

将实施例6步骤1得到的化合物(O.2mmol)加入到10mL蒸馏水中，然后加入5mL反丁烯二酸(0.1mmol)水溶液，并调节溶液pH值pH7.2；将混合好的溶液转移到25mL聚四氟乙烯反应釜中并封闭在120℃反应72h，然后以5℃/h的速率降低反应温度至室温，滤液中得到适于X-射线单晶衍射的蓝色片状晶体，手工分离出晶体即为目的物.

实施例8

透射电子显微镜(TEM)观察DNA凝聚体形态

在20mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中，加入5.6μMλDNA和2～50μM浓度的配合物(Cu₂(DTPB)Cl₂]Cl₂·5H₂O·2CH₃OH)，37℃反应5min～2h不同时间。然后取5μL样品，滴加于铜网上，自然干燥，用Tecnai G2 20透射电镜在175kV观察(未染色)，单独DNA体系作为对照一并进行，结果见图5。

实施例9

共聚焦显微镜观察凝聚体跨膜实验

凝聚体制备：实验在细胞培养用D-Hank’s缓冲液中进行，5μM的ctDNA分别与5μM的配合物(Cu₂(EGTB)(ClO₄)₂(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O)于37℃反应30min；加入荧光染料Greenview(一种可替代溴化乙锭的新型核酸染料)于37℃继续反应30min，实验中Greenview用于双链DNA凝聚体染色，4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)用于细胞核染色。

细胞培养：HepG2肝癌细胞培养于含10％新生小牛血清及双抗(100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。每隔一天更换一次细胞培养液，每隔三天细胞传代一次。培养一段时间后以合适的密度接种细胞至6孔培养板进行分组培养，培养条件为37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h。分组情况为：空白组(加入无血清培养基50μL)、配合物系列组(各孔加入对应样品50μL)。

细胞样后处理：(1)加入药物培养24h后，加入DAPI继续培养20min；(2)用磷酸盐缓冲液PBS(含有EDTA的磷酸盐缓冲液：称取适量EDTA钠盐溶于pH为8.3的0.1M磷酸盐溶液中配成含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3次；(3)用0.25％胰蛋白酶消化细胞使其从培养板上脱落，即时制板于激光共聚焦显微镜下观察，结果参见图6。

实施例10

凝聚体细胞毒性实验

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至1000～10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(5、10、20、40、75微摩尔/升)的药物。5％CO₂，37℃孵育16～48小时，倒置显微镜下观察；每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)结果参见图7、图8。

实施例11

荧光素酶报告基因检测试剂盒检测凝聚体的转染效率

采用上述图9中所述的配合物1：[Cu₂(EGTB)(ClO₄)₂(H₂O)₂](ClO₄)₂·6H₂O，

配合物2：[Cu₂(DTPB)Cl₂(H₂O)](NO₃)₂·2CH₃OH·H₂O，

配合物3：[Co₂(DTPB)Cl₃]Cl·5H₂O，

配合物4：[Cu₂(DTPB)(NO₃)Cl(H₂O)](NO₃)₂·3CH₃OH·5H₂O，

在37℃，5％CO₂条件下，在含0.5％双抗和10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养人肝癌细胞HepG2，当细胞铺满培养瓶壁95％左右时，接种到96孔板在相同的条件下继续培养24h至细胞铺满率达90％。pGL3-Control Vector质粒分别与不同浓度的配合物反应，在室温下于pH7.4，20mM Tris-HCl缓冲液中反应30min。用180μL不含血清DMEM培养基置换培养板中的细胞培养介质，30min后，每孔加入20μL转染溶液(质粒-配合物凝聚体溶液)，质粒最终碱基对浓度为1.5μM，配合物浓度依次为1、2、3、4、5μM，细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养4h，然后每孔加入200μL含10％小牛血清的新鲜DMEM培养基溶液置换原来的培养液。细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养48h。

荧光素酶检测：实验通过荧光素酶检测法分析配合物种类及配合物浓度对pGL3-Control Vector质粒转染效率的影响。吸净培养基后，每孔细胞用100μL PBS/Triton裂解液裂解，然后加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后在酶标仪上设定激发波长为338nm，最大发射波长为590nm测定荧光强度，结果参见图9。

Claims (16)

1.一种非病毒基因载体，其特征是：它是以多苯并咪唑为配体的多核金属配合物，具体是由1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺、N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亚胺或者三(2-苯并咪唑基甲基)胺为主配体，以苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，以H₂O、Cl^-、NO₃ ^-、Ac^-或ClO₄ ^-为辅助配体或抗衡阴离子，合成的同多核或杂多核Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co^2+/3+、Mn²⁺、Fe^2+/3+或Ni²⁺金属离子的配合物。

2.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺，由三乙四胺六乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶4～1∶8，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

3.如权利要求2所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的三乙四胺六乙酸与邻苯二胺的物质的量之比为1∶6。

4.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺，由二乙三胺五乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶5，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

5.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷，由乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶2～1∶6，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

6.如权利要求5所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸与邻苯二胺的物质的量之比为1∶4。

7.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺，由乙二胺四乙酸和邻苯二胺按物质的量之比1∶2～1∶6，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

8.如权利要求7所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的乙二胺四乙酸和邻苯二胺的物质的量之比为1∶4。

9.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体三(2-苯并咪唑基甲基)胺，由胺基三乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶1～1∶5，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品.

10.如权利要求9所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的胺基三乙酸与邻苯二胺的物质的量之比为1∶3。

11.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亚胺，由亚胺基二乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1∶1～1∶3，以乙二醇为溶剂，160～180℃共热缩合6～8小时，直到无水蒸汽放出为止；缩合产物冷却至120℃倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2～3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。

12.如权利要求11所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的亚胺基二乙酸与邻苯二胺的物质的量之比为1∶2。

13.权利要求1所述的一种非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四-(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺，或者N，N-二(2’-苯并咪唑甲基)亚胺为配体的金属配合物的合成步骤：将配体溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金属离子的可溶性盐，配体和金属盐的摩尔比为1∶0.5～1∶4，60～90℃反应1～4小时，然后过滤、干燥得到产品，用自然挥发或扩散法得到非病毒基因载体晶体。

14.权利要求1所述的一种非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以三(2-苯并咪唑基甲基)胺为配体的金属配合物的合成步骤为：

步骤1、配合物[Cu(NTB)(H₂O)](ClO₄)₂·5.2(H₂O)的合成：

将4mL CuCl₂·2H₂O(0.02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0.02mol)乙醇溶液中，搅拌，水浴加热30～90℃，反应半个小时后，加入10mlNaClO₄(0.04mmol)水溶液，继续使反应进行2～6个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出，过滤，洗涤，真空干燥得到浅黄绿色片状固体，即为目的配合物；

步骤2、将步骤1得到的配合物和所述金属离子的可溶性盐按摩尔比1∶0.5～1∶4加入蒸馏水中，然后在每一种配体和金属离子的溶液中再分别加入苯甲酸钠、4，4’-联吡啶、对苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、烟酸、异烟酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二酸或己二酸桥连配体，桥连配体和金属盐的摩尔比为1∶0.5～1∶5，调节溶液pH 4.0～9.0，将混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中并封闭在80～180℃反应36～80h，然后以5℃/h的速率降低反应温度至室温，在混合液中得到适于X-射线单晶衍射的非病毒基因载体晶体。

15.权利要求1所述的一种非病毒基因载体的应用，其特征是用于诱导DNA凝聚形成凝聚体。

16.按权利要求15所述的一种非病毒基因载体的应用，其特征是，该载体和DNA形成的凝聚体，用于细胞核的转染染色。

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