CN104531139B - 一种咔唑类的pH荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种咔唑类的比率型pH荧光探针及其制备方法，以及该探针的应用，属于pH荧光探针领域。其制备方法是：将3-甲酰基-N-乙基咔唑和2-甲基苯并噻唑加入一定比例的二甲基亚砜和50％NaOH的混合溶液中微热使其溶解，再用微波辐射，抽滤得粗产品，粗产品用乙醇重结晶得到纯品。该探针对H⁺显示了高的灵敏性、选择性、可逆性和稳定性。通过结合激光共聚焦扫描显微技术，还可获取该新型荧光分子探针在活细胞内的荧光成像。与现有的pH响应荧光分子探针相比，本发明制备方法简单，Stocks位移值大。

Description

一种咔唑类的pH荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光探针，尤其涉及一种咔唑类的比率型pH荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞内pH_i在包括细胞循环调控、细胞的生长和凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩和多要耐药性等方面起着关键性的作用。pH_i值异常会引起细胞的功能紊乱以及一些常见疾病，如癌症和阿尔茨海默症。因此，检测细胞器的pH_i变化对于从分子水平上研究细胞的生理和病理过程具有非常重要的意义。相较于微电极、NMR、和紫外吸收光谱法等pH检测方法，荧光光谱检测技术具有分辨率高、灵敏度高、操作简便、非破坏性等特点，且基于荧光探针与氢离子作用引起的荧光信号变化的传感、荧光显微成像的荧光光谱法显示出独特的时间和空间上的优势，成为分子水平上实时原位监测细胞内pH_i的重要手段。

近几年来，咔唑及其衍生物由于其巨大的共轭系统和活跃的分子内电荷转移，被广泛用作荧光团来构造ICT荧光探针以获得一个大的Stocks位移。本发明制备了一种咔唑类衍生物ECBT作为荧光探针，用于pH响应荧光检测。与现有技术相比，本发明的荧光探针制备方法只需一步完成，且反应条件简单；将该荧光探针用于pH的检测可获得一个大的Stocks位移，反应灵敏且具有高度选择性；该荧光探针还可用于生物体内pH的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种咔唑类pH荧光探针及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种快速响应pH的荧光检测方法，而且这种方法具有良好的灵敏度、选择性、光稳定性和可逆性。以及这种探针可用于细胞内pH值的检测。

本发明提供的一种咔唑类pH荧光探针，是2-(N-乙基咔唑-3-乙烯基)苯并噻唑(ECBT)，其结构式为：

本发明提供的一种咔唑类pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在容器中按摩尔比1︰1加入3-甲酰基-N-乙基咔唑和2-甲基苯并噻唑，再加入体积比10︰3的二甲基亚砜和50％NaOH的混合溶液，微热使其溶解后放入微波炉中，用130W功率微波辐射5min，待冷却后取出。

(2)点板观察确认反应进行彻底后，将其倒入蒸馏水中，搅拌，静置，抽滤，得黄色粗产品；粗产品用乙醇重结晶得到亮黄色粒状晶体。

其合成路线如下：

本发明提供的一种快速响应pH的荧光检测方法，其步骤为：

(1)用乙腈配制1mM的ECBT荧光探针储备液；

(2)将2mL乙腈/水(1/1,v/v)体系和5μL荧光探针ECBT储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，496nm处的荧光强度逐渐减弱，583nm处荧光强度逐渐增强；

(3)用蒸馏水配制1M的H⁺溶液，将2mL乙腈/水(1/1,v/v)体系和5μL荧光探针ECBT储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验(pH变化范围3.3-1.0)；以pH为横坐标，荧光强度F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝1.76；通过线性拟合得到ECBT最佳线性响应范围为pH1.5-1.9,回归方程为：F＝1373.15-619.27′pH，线性系数为R²＝0.9940。

可逆性和稳定性实验证明ECBT荧光探针对pH的测定具有良好的光稳定性和可逆性。

经实验验证，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的测定。

本发明的探针具有很好的细胞膜穿透性，可用于细胞内pH值的检测。

与现有技术相比，本发明作为选择性检测生物体内pH的荧光探针有如下优点：1、本发明的荧光探针制备方法简单、快速；2、本荧光探针具有大的Stocks位移；3、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪；4、本发明荧光探针可用于细胞成像。

附图说明：

图1实施例2荧光探针ECBT的pH滴定荧光图

图2实施例3荧光探针ECBT与各种金属阳离子的荧光柱状图

图3实施例4荧光探针ECBT对pH响应的的工作曲线

图4实施例5可逆性和光稳定性图

图5实施例6细胞成像图

具体实施方式

实施例1咔唑类pH荧光探针ECBT的制备，步骤如下：

(1)100mL烧瓶中加入1.12g(5mmol)3-甲酰基-N-乙基咔唑、0.685g(5mmol)2-甲基苯并噻唑和加入5mL二甲基亚砜和1.5mL50％的NaOH溶液，微热使其溶解后放入微波炉中。用130W功率微波辐射5min，待冷却后取出。

(2)点板观察确认反应进行彻底后，将其倒入50mL蒸馏水中，搅拌，静置，抽滤，得黄色粗产品。用乙醇重结晶得到亮黄色粒状晶体1.1g，产率64.7％。

探针：ECBT用¹HNMR表征，结果如下：

¹HNMR(DMSO-D₆,δ/ppm):1.34(t,J＝13.8Hz,3H),4.50(m,2H),1.57(m,2H),7.24(t,J＝15.0,1H),7.45(m,3H),7.68(m,3H),7.87(d,J＝16.1,1H),7.95(m,2H),8.11(d,J＝7.8,1H),8.23(d,J＝7.5Hz,1H),8.64(s,1H).

实施例2荧光探针ECBT的pH滴定荧光图

在2mL乙腈/水(1/1,v/v)体系中加入5μL荧光探针ECBT储备液进行pH荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测。随着待测样的加入，496nm处的荧光强度逐渐减弱，583nm处荧光逐渐增强。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、10.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λ_ex为452nm和最大荧光发射波长为:λ_em为583nm。

实施例3荧光探针ECBT与各种金属阳离子的荧光柱状图

在pH7.0和pH1.6的乙腈/水(1/1,v/v)体系中加入5μL荧光探针ECBT储备液，再分别加入其它的金属离子K⁺(150mM),Na⁺(150mM),Ca²⁺(10mM),Mg²⁺(2mM),Fe³⁺,Mg²⁺,Hg²⁺,Al³⁺,Pb²⁺,Cd²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Ni²⁺,Fe²⁺andAg⁺(0.2mM)，分别测其荧光光谱，绘制不同金属阳离子对应583nm处荧光强度的柱状图，见图2。

经试验证明，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的检测。

实施例4荧光探针ECBT对pH响应的的工作曲线

用蒸馏水配制1M的H⁺溶液，把2mL的乙腈/水(1/1,v/v)体系和5μL荧光探针ECBT储备液加到荧光比色皿中，进行pH滴定实验(pH变化范围为3.3-1.0)。以pH为横坐标，荧光强度F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝1.76。通过线性拟合得到了ECBT最佳线性响应范围为pH1.5-1.9,回归方程为：F＝1373.15-619.27′pH，线性系数为R²＝0.9940。

实施例5可逆性和光稳定性图

在乙腈/水(1/1,v/v)体系中加入5μL荧光探针ECBT储备液，调节pH在7.0和1.6之间变化时，分别记录583nm处荧光强度的变化。如图4-1所示，pH的降低会使荧光强度迅速升高，而快速升高pH至中性条件，则导致荧光强度瞬间淬灭，5次循环改变pH值后，酸性条件下的荧光强度仍然成功恢复。此外，探针对不同pH的响应和荧光恢复时间不超过1s。表明荧光探针ECBT对pH的响应具有很好的可逆性。

在pH3.5,4.5和7.0的乙腈/水(1/1,v/v)体系中，加入5μL荧光探针ECBT储备液，检测583nm处的荧光强度随时间的变化。如图4-2所示，100min内的荧光强度值基本保持不变，说明该荧光探针对外界空气、溶液体系等具有很好的光稳定性。

实施例6细胞成像图

实验之前用无水DMSO溶解固体ECBT得到浓度为1mM荧光探针ECBT储备液。分别在pH＝2.0,4.0和7.4的条件下取上述15μL荧光探针ECBT储备液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO₂培养箱中孵育15min后，用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)轻轻清洗三次，以除去培养基中过量的未进入细胞的探针储备液。将细胞固定后在奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜下，通过线性扫描进行荧光成像(40倍物镜)。分别用波长为405nm和559nm的激光激发，收集发射波段为425-475nm的蓝色荧光和560-620nm的红色荧光。如图5，探针在共聚焦荧光成像仪下显示强的蓝色荧光，红色通道没有荧光，随着pH的减小，蓝色荧光逐渐减弱直至淬灭，红色荧光逐渐增强。

Claims (4)

1.一种咔唑类pH荧光探针，特征在于，它是2-(N-乙基咔唑-3-乙烯基)苯并噻唑(ECBT)，其结构式为：

2.如权利要求1所述的一种咔唑类pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在容器中按摩尔比1︰1加入3-甲酰基-N-乙基咔唑和2-甲基苯并噻唑，再加入体积比10︰3的二甲基亚砜和50％NaOH的混合溶液，微热使其溶解后放入微波炉中，用130W功率微波辐射5min，待冷却后取出；

(2)点板观察确认反应进行彻底后，将其倒入蒸馏水中，搅拌，静置，抽滤，得黄色粗产品；粗产品用乙醇重结晶得到亮黄色粒状晶体。

3.一种快速响应pH的荧光检测方法，其特征在于，步骤为：

(1)用乙腈配制1mM的ECBT荧光探针储备液；

(2)将2mL体积比为1:1的乙腈/水溶液体系和5μL荧光探针ECBT储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，496nm处的荧光强度逐渐减弱，583nm处荧光强度逐渐增强；

(3)用蒸馏水配制1M的H⁺溶液，将2mL体积比为1:1的乙腈/水溶液体系和5μL荧光探针ECBT储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验；以pH为横坐标，荧光强度F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝1.76；通过线性拟合得到ECBT最佳线性响应范围为pH1.5-1.9,回归方程为：F＝1373.15-619.27×pH，线性系数为R²＝0.9940。

4.如权利要求1所述的一种咔唑类pH荧光探针用于细胞内pH的检测。