CN111732667A - 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，其包含编码基因序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的融合蛋白。本发明通过将小反刍兽疫病毒（PPRV）的H、F蛋白改造后连接，获得融合蛋白（PPRV‑Fu），并以该PPRV‑Fu蛋白制备小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，所获疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对免疫后的动物没有致病性，同时本发明利用CHO细胞等表达该PPRV‑Fu蛋白，不仅表达量高，而且还可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

Description

小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）俗称羊瘟，又被称为小反刍兽假性牛瘟，是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性、热性和高度传染性的传染病，主要危害山羊、绵羊和羚羊等小反刍动物，同时一些野生动物如骆驼和水牛也易感，也有动物实验中感染白尾鹿和猪的报道（Abubakar M, ArshedMJ, Zahur AB, Ali Q, Banyard AC. Natural infection with peste des petitsruminants virus: a pre and post vaccinal assessment following an outbreakscenario[J]. Virus Res. 2012;167(1):43-7.）。该病主要侵害淋巴组织和消化道、呼吸道上皮细胞，临床上以发热、眼鼻口炎、腹泻、肺炎为主要特征。PPR爆发时发病率可达60％以上，病死率可达50％，严重时病死率可达100％。PPR给流行国家和地区的畜牧业造成了毁灭性的打击，造成了农场主和牧民严重的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报备A类烈性动物传染病，我国农业部将其列为一类动物疫病，是《国家动物疫病中长期防治规划（2012-2020年）》明确规定重点防范的外来动物疫病之一。

PPRV是一种单链RNA病毒，为副黏病毒科麻疹病毒属成员，成熟的PPRV通常为球形或椭球形，直径400-500nm。PPRV的基因组全长为15948bp，基因组从 3’端至 5’端依次编码八种蛋白，六种结构蛋白之间通过序列间隔，即衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、膜基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素（H）、大蛋白（L）；其中P基因转录单位除P蛋白外，还编码C和V两个非结构蛋白（Diallo A: Morbillivirus group: Genome organisation and proteins.Veterinary microbiology 1990; 23:155-163.）。H蛋白负责与细胞表面受体连接，调节病毒吸附并渗入宿主细胞。H蛋白含有抗原表位，刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫应答，是病毒的主要抗原成分，也是引起宿主细胞病变的决定性因素（Sinnathamby G,Renukaradhya GJ, Rajasekhar M, Nayak R, Shaila MS: Immune responses in goatsto recombinant hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of peste des petitsruminants virus: Identification of a t cell determinant. Vaccine 2001; 19:4816-4823.）。F蛋白是C末端锚定在细胞膜上的糖蛋白，属于I型糖蛋白，能够诱导产生细胞溶血素，并使细胞融合，与H蛋白共同作用，启动病毒感染细胞，诱发机体产生保护性免疫应答（Wild TF, Malvoisin E, Buckland R: Measles virus: Both the haemagglutininand fusion glycoproteins are required for fusion. The Journal of generalvirology 1991; 72(Pt 2): 439-442.）。

目前最为有效的预防小反刍兽疫的方法就是免疫接种，Nigeria75/1疫苗是目前全球应用最广泛的疫苗，但该疫苗的缺陷在于其存在病毒的重组、突变和毒力增强的风险，且无法区分自然感染动物与免疫接种动物。近年来有一些新型疫苗的研制包括核酸疫苗、重组疫苗等，如CN110684782A提供了一种制备小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗的方法，核酸疫苗诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险，且单独使用F蛋白表达免疫原性不高；CN101422607A提供了一种将PPRV免疫保护抗原H蛋白和F蛋白的基因重组山羊痘病毒基因组的方法，虽然可以同时预防PPR和山羊痘，但是该疫苗的有效免疫持续期和安全性方面尚需论证；CN107236047A提供了一种大肠肝菌表达系统表达小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的方法，但是大肠肝菌表达系统蛋白折叠性较差，易形成包涵体，其低效的体外折叠可能会抵消它的优势。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种融合蛋白，包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白的编码基因。优选的，所述编码基因包括序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例还提供了包含所述编码基因的重组载体。

本发明实施例还提供了包含所述编码基因的宿主细胞，主要为哺乳动物细胞。

进一步的，所述宿主细胞可以由哺乳动物细胞被所述重组载体转染后获得。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，其包括：

构建重组表达载体，所述重组杆表达载体包含所述的融合蛋白的编码基因；

将所述重组表达载体导入宿主细胞中，并在允许蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞，之后从所述宿主细胞的细胞培养物中分离和回收融合蛋白。

本发明实施例还提供了一种制备所述融合蛋白的制备方法，其包括：

将所述融合蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

将所述重组表达载体转染宿主细胞，通过选择、筛选得到悬浮稳定高效表达所述融合蛋白的宿主细胞；

发酵培养所述悬浮稳定高效表达融合蛋白的宿主细胞，之后从细胞培养物中分离、纯化所述融合蛋白。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒检测试剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受小反刍兽疫病毒感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例提供了一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受小反刍兽疫病毒感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受小反刍兽疫病毒感染的药剂的用途。

较之现有技术，本发明实施例通过将PPRV的H蛋白、F蛋白改造后再连接形成融合蛋白，所获融合蛋白能够形成异二聚体，免疫效果好，利用所述融合蛋白制备的小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对羊等动物没有致病性，同时本发明实施例利用CHO细胞等表达所述融合蛋白，表达量高达2-3g/L，可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是实施例1中密码子优化后Fu基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在4.6kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在4.6kbp位置出现目的条带。

图3是实施例1中真核表达载体pCI-Fu-GS的结构示意图。

图4是实施例3所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。

图5是实施例4中SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面提供的一种融合蛋白包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

即，本发明实施例提供的融合蛋白（亦可命名为PPRV-Fu融合蛋白或PRV-Fu蛋白）序列可以是原始序列，增加或截短的序列。

进一步的，本发明实施例的融合蛋白主要将PPRV的H蛋白、F蛋白改造后再连接形成，其可以表示为H-Fc-Linker-Fc-F（序列如SEQ ID NO:2所示）或F-Fc-Linker-Fc-H（序列如SEQ ID NO:4所示）的形式。其中，对F蛋白所进行的改造包括：删去了其中的跨膜区，并将F蛋白氨基酸161N、162N位突变成PP，形成柔性肽，这有利于促进F蛋白F2片段N端疏水区的折叠，显著提高抗原表达量。对H蛋白进行的改造包括：删去跨膜区，增加了一个信号肽。再将改造后的H蛋白和F蛋白分别连接于羊（或牛）IgG的Fc片段，然后通过GGGGSGGGGS（Linker可以改变，比如G的数目可以增多或者减少）连接，使得改造后的F和H蛋白通过Fc片段之间的二硫键形成异二聚体，其中Fc片段不但可以提高蛋白的半衰期，而且还可以被抗原递呈细胞的表面受体识别，促进抗原的递呈。以及，PPRV的H蛋白和F蛋白为重要抗原蛋白，都可以激发中和抗体，本发明实施例中改造后的H、F蛋白之间还可彼此协同，促进蛋白的折叠组装，进一步的将该两个抗原-Fc片段使用柔性肽连接起来形成异二聚体，还能够显著提高免疫原性（如果只有抗原-Fc片段就只可以形成同二聚体），使两者达成更强的协同促进作用，使得由此形成的融合蛋白的免疫原性远好于改造前后的H蛋白、F蛋白分别与Fc片段连接后的混合物，也远好于改造前后的H蛋白、F蛋白中的任一者与Fc片段的复合物，以及H蛋白与F蛋白形成的融合蛋白。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白的编码基因，其包括序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类重组载体，其中包含有所述融合蛋白的编码基因。所述重组载体可以是真核表达载体，例如可以选自但不限于pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS，优选为pCI-GS。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类宿主细胞，其中包含有所述融合蛋白的编码基因。

进一步的，所述宿主细胞可以是用包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体转染而形成。

进一步的，所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO细胞系，其可以选自但不限于DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株等，优选为CHO-S。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。进一步的，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素等中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，其包括：

将所述融合蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

以所述重组表达载体转染宿主细胞，并筛选出悬浮稳定高效表达所述融合蛋白的宿主细胞，再发酵培养，之后从细胞培养物中分离和回收所述融合蛋白。

其中，所述真核表达载体、宿主细胞可以是如前所述。

在本发明的以上实施例中，通过采用真核表达系统，并使用悬浮培养CHO细胞等宿主细胞进行表达，糖基化水平高，表达水平高（可达2-3g/L），免疫效果好。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒检测试剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受小反刍兽疫病毒感染的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面提供了一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受小反刍兽疫病毒感染的试剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受小反刍兽疫病毒感染的药剂的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向羊等受试动物施用所述小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种保护受试动物免受小反刍兽疫病毒感染的方法，所述方法包括向羊等受试动物施用所述小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例的另一个方面还提供一种适用于在受试动物中产生针对小反刍兽疫病毒感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的融合蛋白以及佐剂分子。

进一步的，所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方式中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

在一些实施方式中，一种小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法具体包括：

1）克隆包含优化后的PPRV-Fu融合蛋白编码基因的真核表达载体；

2）转染CHO细胞，通过选择、筛选得到悬浮稳定高效表达PPRV-Fu融合蛋白的CHO细胞株；

3）发酵培养步骤2筛选出的细胞株，纯化后得到重组PPRV-Fu融合蛋白；

4）将重组PPRV-Fu融合蛋白充分混合，然后与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

本发明以上实施例提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本，适于大规模工业化生产，并且由此制得的疫苗能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒。

而且，本发明以上实施例使用CHO悬浮培养PPRV-Fu融合蛋白并制备基因工程亚单位疫苗，不涉及到野生病毒，还能通过检测N蛋白抗体而区分野毒感染和疫苗免疫。

本说明书所用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本说明书所述的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本说明书所述的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本说明书所述的“免疫反应”意指响应于抗原如小反刍兽疫病毒感染共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本说明书所述的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

在本说明书中，核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

在本说明书中，所述编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

在应用时，可将本发明实施例的融合蛋白与医药学上可接受的载体，制成亚单位疫苗组合物，将有效量接种于羊等哺乳动物。在一实施例中，前述医药学上可接受的载剂包含佐剂及/或免疫增效剂，其中前述佐剂的种类不限，其具体例子可包括但不限于铝胶佐剂、油质佐剂(例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)或上述的任意组合。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明实施例通过使用CHO细胞表达融合蛋白，所获融合蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对免疫后的动物没有致病性，并且本发明实施例的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，分泌表达的抗原表达量非常高，免疫原性强，也大大降低了疫苗生产成本，可以大规模批量生产，质控容易，安全性高，免疫原性好，批次间稳定。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1重组真核表达载体pCI-Fu-GS的构建

1. PPRV-Fu基因扩增与纯化 在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的PPRV-Fu基因（SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3）并克隆到pUC-57载体上，酶切位点为Kpn Ⅰ、XhoⅠ，得到pUC-Fu质粒载体。以pUC-Fu作为模板，Fu-F、Fu-R作为引物进行PCR扩增（Fu-F、Fu-R的基因序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示），扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 PPRV-Fu基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在4.6kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2. 酶切 将pCI-GS质粒和纯化后的PPRV-Fu基因PCR产物分别使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 PPRV-Fu基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3. 连接 将酶切过的pCI-GS质粒和PPRV-Fu基因酶切产物使用T4 DNA 连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 PPRV-Fu基因与pCI-GS质粒连接体系

4. 转化 取10 μl连接产物加入100 μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900 μl 不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0 ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5. 菌落PCR和测序鉴定 挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，Fu-F和Fu-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现4.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-Fu-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

实施例2 表达PPRV-Fu蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

1. 细胞转染

1.1 准备细胞 取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶ cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000 rpm离心4分钟后，弃上清，用20 ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000 rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷ cells/ml。

1.2 质粒与细胞混合 取实施例1中pCI-Fu-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3 电转 280V 20 ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶ cells/ml时，添加50μMMSX（L-methionine sulphoximine，MCE公司）加压筛选。

2. 单克隆筛选

2.1 用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2 铺板 稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育4-6 h。记录单个细胞的孔。

2.3 待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100 μl 0.25%trypsin-EDTA，室温消化2 min左右，加入2 mL CHO-WM 培养基 (含10% FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3. 细胞摇瓶发酵

3.1 传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2 从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3 稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30 mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5% CO₂恒温摇床中100 rpm/min孵育过夜。

3.4 每隔24 h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1 mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

另外按照上面的实施例方法构建表达如表5所示蛋白的细胞株：

表5

实施例3 SDS-PAGE检测

将实施例2中收获的PPRV-Fu蛋白、对照1的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，并使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40 μl收获的细胞培养物，加入10 μl的5×SDS 凝胶上样缓冲液（取1mol/L Tris-HCI(pH6.8)1.25 mL，溴酚蓝25 mg，甘油2.5 mL，SDS0.5g溶于 ddH₂O中，定容至5mL，0.5mL/管分装，室温保存，使用前每管加入25μLβ-巯基乙醇混匀），沸水浴5分钟，12000 r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图4所示，PPRV-Fu、对照1在分子量约168kDa、120kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。其中PPRV-Fu的蛋白表达量明显高于对照1的蛋白表达量。

实施例4 Western Blot检测

将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，羊源抗PPRV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的兔抗羊多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例5 蛋白含量与琼扩检测

将实施例2中收获的CHO细胞培养上清液中PPRV-Fu蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释羊抗PPRV多抗血清至合适浓度，每孔100 µl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1%BSA封闭1 h。加入不同浓度的抗原标准品(通过离子子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测PPRV-Fu蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的羊抗羊IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中PPRV-Fu蛋白的量。

按照实施例5，大规模制备的PPRV-Fu蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的平均含量达到3.5g/L。

使用琼扩方法检测表达的Fu蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入PPRV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72 h后观察沉淀线，出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：PPRV-Fu蛋白琼扩效价为1:512。

实施例6 疫苗制备

将适量CHO细胞表达的PPRV-Fu蛋白稀释后加入到MONTANIDE ISA15 VG佐剂中（体积比为46：54），使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100µg/ml，乳化，质检合格后置于4℃保存。以同样的方法将实施例2中的对照2、对照3和对照4分别制备成疫苗；将对照2和对照31:1等比例混合后制备疫苗设为对照5。

实施例7 免疫实验

选取小反刍兽疫病毒阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感羊25头，将实验用羊分成5组，每组4头。分别将实施例6中制备的疫苗左右腹股沟内侧皮内途径各一注射点接种羊，每点注射0.75ml，分别于免疫前、免疫后第21天采血并分离血清，进行中和抗体测定。结果如表6所示。

表6 中和抗体检测结果

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司、苏州米迪生物技术有限公司

<120> 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4563

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

agactgcacc gcgccaccgt gggcacatct gagatccagt ccagactgaa caccaatatc 120

aagctggctg agtccatcga tcatcagacc aaggacgtgc tgacaccact gttcaagatc 180

atcggcgacg aagtgggcat ccgcatcccc cagaagttct ccgatctggt gaagtttatc 240

agcgacaaga tcaagttcct gaaccctgat agagagtacg acttcaggga cctgcggtgg 300

tgcatgaacc cccctgagcg cgtgaagatc aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc 360

gctgtgaagt ctatcgagca catcttcgag tcccctctga acaagagcaa gaagctgcag 420

tctctgaccc tgggaccagg cacaggatgc ctgggcagga ccgtgacaaa ggcccacttt 480

tccgagctga ccctgacact gatggatctg gacctggaga tgaagcataa cgtgtcctcc 540

gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttt ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat 600

gccagggacc cctctacaga tctgggcatc ggccacttcc tgagggtgtt tgagatcgga 660

ctgatccggg acctgggact gggaccaccc gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg 720

aatatgtccg acgattatag gcggtgcctg ctggctgtgg gagagctgaa gctgaccgcc 780

ctgtgcacat cttccgagac cgtgacactg agcgagaggg gagctcctaa gagggagcca 840

ctggtggtgg tcatcctgaa cctggctgga cccaccctgg gaggagagct gtactccgtg 900

ctgcctacaa gcgatctgat ggtggagaag ctgtatctga gctctcacag aggcatcatc 960

aaggacgatg aggccaactg ggtggtgcct agcaccgatg tgagggacct gcagaataag 1020

ggcgagtgcc tggtggaggc ttgtaagacc cggcctccat ctttttgcaa tggcacaggc 1080

agcggaccat ggtctgaggg aagaatccct gcctacggcg tgatccgcgt gtctctggat 1140

ctggcttccg atcccgacgt ggtcatcacc tccgtgttcg gcccactgat cccccatctg 1200

tccggcatgg acctgtacaa caatcctttt agccgcgcca tctggctggc tgtgccccct 1260

tatgagcaga gcttcctggg catgatcaac acaatcggct ttccaaatag ggccgaagtg 1320

atgccccaca tcctgaccac agagatcagg ggacctaggg gccggtgtca tgtgccaatc 1380

gagctgtcca ggcgcgtgga cgatgacatc aagatcggct ccaacatggt catcctgcca 1440

accatggatc tgagatacat caccgccaca tatgacgtgt cccgcagcga gcacgctatc 1500

gtgtactata tctatgacac aggcaggtcc agctcttact tctatcccgt gcggctgaac 1560

tttaagggca atcctctgtc tctgagaatc gagtgctttc catggcgcca caaagtgtgg 1620

tgctaccatg attgtctgat ctataacacc atcacagacg aggaggtgca taccaggggc 1680

ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatccc gtgcccggat gcccggaccc atgcaaacat 1740

tgccgatgcc caccccctga gctccccgga ggaccgtctg tcttcatctt cccaccgaaa 1800

cccaaggaca cccttacaat ctctggaacg cccgaggtca cgtgtgtggt ggtggacgtg 1860

ggccaggatg accccgaggt gcagttctcc tggttcgtgg acaacgtgga ggtgcgcacg 1920

gccaggacaa agccgagaga ggagcagttc aacagcacct tccgcgtggt cagcgccctg 1980

cccatccagc accaagactg gactggagga aaggagttca agtgcaaggt ccacaacgaa 2040

gccctcccgg cccccatcgt gaggaccatc tccaggacca aagggcaggc ccgggagccg 2100

caggtgtacg tcctggcccc accccaggaa gagctcagca aaagcacgct cagcgtcacc 2160

tgcctggtca ccggcttcta cccagactac atcgccgtgg agtggcagaa aaatgggcag 2220

cctgagtcgg aggacaagta cggcacgacc acatcccagc tggacgccga cggctcctac 2280

ttcctgtaca gcaggctcag ggtggacaag aacagctggc aagaaggaga cacctacgcg 2340

tgtgtggtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacacac agaagtcgat ctctaagcct 2400

ccgggtaaag gaggaggagg aggaggatca ggaggaggag gaggaggatc acccggatgc 2460

ccggacccat gcaaacattg ccgatgccca ccccctgagc tccccggagg accgtctgtc 2520

ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc cttacaatct ctggaacgcc cgaggtcacg 2580

tgtgtggtgg tggacgtggg ccaggatgac cccgaggtgc agttctcctg gttcgtggac 2640

aacgtggagg tgcgcacggc caggacaaag ccgagagagg agcagttcaa cagcaccttc 2700

cgcgtggtca gcgccctgcc catccagcac caagactgga ctggaggaaa ggagttcaag 2760

tgcaaggtcc acaacgaagc cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc caggaccaaa 2820

gggcaggccc gggagccgca ggtgtacgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 2880

agcacgctca gcgtcacctg cctggtcacc ggcttctacc cagactacat cgccgtggag 2940

tggcagaaaa atgggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgaccac atcccagctg 3000

gacgccgacg gctcctactt cctgtacagc aggctcaggg tggacaagaa cagctggcaa 3060

gaaggagaca cctacgcgtg tgtggtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacacag 3120

aagtcgatct ctaagcctcc gggtaaatgc cagattcatt ggggcaacct gagcaaaatt 3180

ggcattgtgg gcaccggcag cgcgagctat aaagtgatga cccgcccgag ccatcagacc 3240

ctggtgatta aactgatgcc gaacattacc gcgattaaca actgcaccaa aagcgaaatt 3300

gcggaatata aacgcctgct gattaccgtg ctgaaaccgg tggaagatgc gctgagcgtg 3360

attaccaaaa acgtgcgccc gattcagacc ctgaccccgg gccgccgcac ccgccgcttt 3420

gcgggcgcgg tgctggcggg cgtggcgctg ggcgtggcga ccgcggcgca gattaccgcg 3480

ggcgtggcgc tgcatcagag cctgatgaac agccaggcga ttgaaagcct gaaaaccagc 3540

ctggaaaaaa gcaaccaggc gattgaagaa attcgcctgg cgaacaaaga aaccattctg 3600

gcggtgcagg gcgtgcagga ttatattccg ccggaactgg tgccgagcgt gcatcgcatg 3660

agctgcgaac tggtgggcca taaactgggc ctgaaactgc tgcgctatta taccgaaatt 3720

ctgagcattt ttggcccgag cctgcgcgat ccgattgcgg cggaaattag cattcaggcg 3780

ctgagctatg cgctgggcgg cgatattaac aaaattctgg ataaactggg ctatagcggc 3840

ggcgattttc tggcgattct ggaaagcaaa ggcattaaag cgcgcgtgac ctatgtggat 3900

acccgcgatt attttattat tctgagcatt gcgtatccga ccctgagcga aattaaaggc 3960

gtgattgtgc ataaaattga agcgattacc tataacattg gcgcgcagga atggtatacc 4020

accattccga aatatgtggc gacccagggc tatctgatta gcaactttga tgaaaccagc 4080

tgcgtgttta ccccggaagg caccgtgtgc agccagaacg cgctgtatcc gatgagcccg 4140

ctgctgcagg aatgctttcg cggcagcacc aaaagctgcg cgcgcaccct ggtgagcggc 4200

accattagca accgctttat tctgagcaaa ggcaacctga ttgcgaactg cgcgagcgtg 4260

ctgtgcaaat gctataccac cgaaaccgtg attagccagg atccggataa actgctgacc 4320

gtggtggcga gcgataaatg cccggtggtg gaagtggatg gcgtgaccat tcaggtgggc 4380

agccgcgaat atccggatag cgtgtatctg cataaaattg atctgggccc ggcgattagc 4440

ctggaaaaac tggatgtggg caccaacctg ggcaacgcgg tgacccgcct ggaaaacgcg 4500

aaagaactgc tggatgcgag cgatcagatt ctgaaaaccg tgaaaggcgc gccgttttaa 4560

tga 4563

<210> 2

<211> 1519

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Arg Leu His Arg Ala Thr Val Gly Thr Ser Glu Ile

20 25 30

Gln Ser Arg Leu Asn Thr Asn Ile Lys Leu Ala Glu Ser Ile Asp His

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu

50 55 60

Val Gly Ile Arg Ile Pro Gln Lys Phe Ser Asp Leu Val Lys Phe Ile

65 70 75 80

Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg

85 90 95

Asp Leu Arg Trp Cys Met Asn Pro Pro Glu Arg Val Lys Ile Asn Phe

100 105 110

Asp Gln Phe Cys Glu Tyr Lys Ala Ala Val Lys Ser Ile Glu His Ile

115 120 125

Phe Glu Ser Pro Leu Asn Lys Ser Lys Lys Leu Gln Ser Leu Thr Leu

130 135 140

Gly Pro Gly Thr Gly Cys Leu Gly Arg Thr Val Thr Lys Ala His Phe

145 150 155 160

Ser Glu Leu Thr Leu Thr Leu Met Asp Leu Asp Leu Glu Met Lys His

165 170 175

Asn Val Ser Ser Val Phe Thr Val Val Glu Glu Gly Leu Phe Gly Arg

180 185 190

Thr Tyr Thr Val Trp Arg Ser Asp Ala Arg Asp Pro Ser Thr Asp Leu

195 200 205

Gly Ile Gly His Phe Leu Arg Val Phe Glu Ile Gly Leu Ile Arg Asp

210 215 220

Leu Gly Leu Gly Pro Pro Val Phe His Met Thr Asn Tyr Leu Thr Val

225 230 235 240

Asn Met Ser Asp Asp Tyr Arg Arg Cys Leu Leu Ala Val Gly Glu Leu

245 250 255

Lys Leu Thr Ala Leu Cys Thr Ser Ser Glu Thr Val Thr Leu Ser Glu

260 265 270

Arg Gly Ala Pro Lys Arg Glu Pro Leu Val Val Val Ile Leu Asn Leu

275 280 285

Ala Gly Pro Thr Leu Gly Gly Glu Leu Tyr Ser Val Leu Pro Thr Ser

290 295 300

Asp Leu Met Val Glu Lys Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly Ile Ile

305 310 315 320

Lys Asp Asp Glu Ala Asn Trp Val Val Pro Ser Thr Asp Val Arg Asp

325 330 335

Leu Gln Asn Lys Gly Glu Cys Leu Val Glu Ala Cys Lys Thr Arg Pro

340 345 350

Pro Ser Phe Cys Asn Gly Thr Gly Ser Gly Pro Trp Ser Glu Gly Arg

355 360 365

Ile Pro Ala Tyr Gly Val Ile Arg Val Ser Leu Asp Leu Ala Ser Asp

370 375 380

Pro Asp Val Val Ile Thr Ser Val Phe Gly Pro Leu Ile Pro His Leu

385 390 395 400

Ser Gly Met Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Arg Ala Ile Trp Leu

405 410 415

Ala Val Pro Pro Tyr Glu Gln Ser Phe Leu Gly Met Ile Asn Thr Ile

420 425 430

Gly Phe Pro Asn Arg Ala Glu Val Met Pro His Ile Leu Thr Thr Glu

435 440 445

Ile Arg Gly Pro Arg Gly Arg Cys His Val Pro Ile Glu Leu Ser Arg

450 455 460

Arg Val Asp Asp Asp Ile Lys Ile Gly Ser Asn Met Val Ile Leu Pro

465 470 475 480

Thr Met Asp Leu Arg Tyr Ile Thr Ala Thr Tyr Asp Val Ser Arg Ser

485 490 495

Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Asp Thr Gly Arg Ser Ser Ser

500 505 510

Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Leu Asn Phe Lys Gly Asn Pro Leu Ser Leu

515 520 525

Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Arg His Lys Val Trp Cys Tyr His Asp

530 535 540

Cys Leu Ile Tyr Asn Thr Ile Thr Asp Glu Glu Val His Thr Arg Gly

545 550 555 560

Leu Thr Gly Ile Glu Val Thr Cys Asn Pro Val Pro Gly Cys Pro Asp

565 570 575

Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro

580 585 590

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser

595 600 605

Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp

610 615 620

Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr

625 630 635 640

Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

645 650 655

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu

660 665 670

Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg

675 680 685

Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

690 695 700

Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr

705 710 715 720

Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln

725 730 735

Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser

740 745 750

Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val

755 760 765

Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met

770 775 780

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro

785 790 795 800

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

805 810 815

Ser Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro

820 825 830

Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

835 840 845

Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

850 855 860

Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp

865 870 875 880

Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

885 890 895

Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp

900 905 910

Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu

915 920 925

Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg

930 935 940

Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys

945 950 955 960

Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr

965 970 975

Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys

980 985 990

Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu

995 1000 1005

Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr

1010 1015 1020

Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

1025 1030 1035 1040

Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys Cys Gln Ile His Trp Gly Asn

1045 1050 1055

Leu Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val

1060 1065 1070

Met Thr Arg Pro Ser His Gln Thr Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn

1075 1080 1085

Ile Thr Ala Ile Asn Asn Cys Thr Lys Ser Glu Ile Ala Glu Tyr Lys

1090 1095 1100

Arg Leu Leu Ile Thr Val Leu Lys Pro Val Glu Asp Ala Leu Ser Val

1105 1110 1115 1120

Ile Thr Lys Asn Val Arg Pro Ile Gln Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg

1125 1130 1135

Thr Arg Arg Phe Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val

1140 1145 1150

Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu His Gln Ser Leu

1155 1160 1165

Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu Ser Leu Lys Thr Ser Leu Glu Lys Ser

1170 1175 1180

Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile Arg Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ile Leu

1185 1190 1195 1200

Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Pro Pro Glu Leu Val Pro Ser

1205 1210 1215

Val His Arg Met Ser Cys Glu Leu Val Gly His Lys Leu Gly Leu Lys

1220 1225 1230

Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu

1235 1240 1245

Arg Asp Pro Ile Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala

1250 1255 1260

Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Ile Leu Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gly

1265 1270 1275 1280

Gly Asp Phe Leu Ala Ile Leu Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala Arg Val

1285 1290 1295

Thr Tyr Val Asp Thr Arg Asp Tyr Phe Ile Ile Leu Ser Ile Ala Tyr

1300 1305 1310

Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Ala

1315 1320 1325

Ile Thr Tyr Asn Ile Gly Ala Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Ile Pro Lys

1330 1335 1340

Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Thr Ser

1345 1350 1355 1360

Cys Val Phe Thr Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr

1365 1370 1375

Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Phe Arg Gly Ser Thr Lys Ser

1380 1385 1390

Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr Ile Ser Asn Arg Phe Ile Leu

1395 1400 1405

Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Val Leu Cys Lys Cys

1410 1415 1420

Tyr Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Gln Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr

1425 1430 1435 1440

Val Val Ala Ser Asp Lys Cys Pro Val Val Glu Val Asp Gly Val Thr

1445 1450 1455

Ile Gln Val Gly Ser Arg Glu Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Leu His Lys

1460 1465 1470

Ile Asp Leu Gly Pro Ala Ile Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr

1475 1480 1485

Asn Leu Gly Asn Ala Val Thr Arg Leu Glu Asn Ala Lys Glu Leu Leu

1490 1495 1500

Asp Ala Ser Asp Gln Ile Leu Lys Thr Val Lys Gly Ala Pro Phe

1505 1510 1515

<210> 3

<211> 4563

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

tgccagattc attggggcaa cctgagcaaa attggcattg tgggcaccgg cagcgcgagc 120

tataaagtga tgacccgccc gagccatcag accctggtga ttaaactgat gccgaacatt 180

accgcgatta acaactgcac caaaagcgaa attgcggaat ataaacgcct gctgattacc 240

gtgctgaaac cggtggaaga tgcgctgagc gtgattacca aaaacgtgcg cccgattcag 300

accctgaccc cgggccgccg cacccgccgc tttgcgggcg cggtgctggc gggcgtggcg 360

ctgggcgtgg cgaccgcggc gcagattacc gcgggcgtgg cgctgcatca gagcctgatg 420

aacagccagg cgattgaaag cctgaaaacc agcctggaaa aaagcaacca ggcgattgaa 480

gaaattcgcc tggcgaacaa agaaaccatt ctggcggtgc agggcgtgca ggattatatt 540

ccgccggaac tggtgccgag cgtgcatcgc atgagctgcg aactggtggg ccataaactg 600

ggcctgaaac tgctgcgcta ttataccgaa attctgagca tttttggccc gagcctgcgc 660

gatccgattg cggcggaaat tagcattcag gcgctgagct atgcgctggg cggcgatatt 720

aacaaaattc tggataaact gggctatagc ggcggcgatt ttctggcgat tctggaaagc 780

aaaggcatta aagcgcgcgt gacctatgtg gatacccgcg attattttat tattctgagc 840

attgcgtatc cgaccctgag cgaaattaaa ggcgtgattg tgcataaaat tgaagcgatt 900

acctataaca ttggcgcgca ggaatggtat accaccattc cgaaatatgt ggcgacccag 960

ggctatctga ttagcaactt tgatgaaacc agctgcgtgt ttaccccgga aggcaccgtg 1020

tgcagccaga acgcgctgta tccgatgagc ccgctgctgc aggaatgctt tcgcggcagc 1080

accaaaagct gcgcgcgcac cctggtgagc ggcaccatta gcaaccgctt tattctgagc 1140

aaaggcaacc tgattgcgaa ctgcgcgagc gtgctgtgca aatgctatac caccgaaacc 1200

gtgattagcc aggatccgga taaactgctg accgtggtgg cgagcgataa atgcccggtg 1260

gtggaagtgg atggcgtgac cattcaggtg ggcagccgcg aatatccgga tagcgtgtat 1320

ctgcataaaa ttgatctggg cccggcgatt agcctggaaa aactggatgt gggcaccaac 1380

ctgggcaacg cggtgacccg cctggaaaac gcgaaagaac tgctggatgc gagcgatcag 1440

attctgaaaa ccgtgaaagg cgcgccgttt taatgacccg gatgcccgga cccatgcaaa 1500

cattgccgat gcccaccccc tgagctcccc ggaggaccgt ctgtcttcat cttcccaccg 1560

aaacccaagg acacccttac aatctctgga acgcccgagg tcacgtgtgt ggtggtggac 1620

gtgggccagg atgaccccga ggtgcagttc tcctggttcg tggacaacgt ggaggtgcgc 1680

acggccagga caaagccgag agaggagcag ttcaacagca ccttccgcgt ggtcagcgcc 1740

ctgcccatcc agcaccaaga ctggactgga ggaaaggagt tcaagtgcaa ggtccacaac 1800

gaagccctcc cggcccccat cgtgaggacc atctccagga ccaaagggca ggcccgggag 1860

ccgcaggtgt acgtcctggc cccaccccag gaagagctca gcaaaagcac gctcagcgtc 1920

acctgcctgg tcaccggctt ctacccagac tacatcgccg tggagtggca gaaaaatggg 1980

cagcctgagt cggaggacaa gtacggcacg accacatccc agctggacgc cgacggctcc 2040

tacttcctgt acagcaggct cagggtggac aagaacagct ggcaagaagg agacacctac 2100

gcgtgtgtgg tgatgcacga ggctctgcac aaccactaca cacagaagtc gatctctaag 2160

cctccgggta aaggaggagg aggaggagga tcaggaggag gaggaggagg atcacccgga 2220

tgcccggacc catgcaaaca ttgccgatgc ccaccccctg agctccccgg aggaccgtct 2280

gtcttcatct tcccaccgaa acccaaggac acccttacaa tctctggaac gcccgaggtc 2340

acgtgtgtgg tggtggacgt gggccaggat gaccccgagg tgcagttctc ctggttcgtg 2400

gacaacgtgg aggtgcgcac ggccaggaca aagccgagag aggagcagtt caacagcacc 2460

ttccgcgtgg tcagcgccct gcccatccag caccaagact ggactggagg aaaggagttc 2520

aagtgcaagg tccacaacga agccctcccg gcccccatcg tgaggaccat ctccaggacc 2580

aaagggcagg cccgggagcc gcaggtgtac gtcctggccc caccccagga agagctcagc 2640

aaaagcacgc tcagcgtcac ctgcctggtc accggcttct acccagacta catcgccgtg 2700

gagtggcaga aaaatgggca gcctgagtcg gaggacaagt acggcacgac cacatcccag 2760

ctggacgccg acggctccta cttcctgtac agcaggctca gggtggacaa gaacagctgg 2820

caagaaggag acacctacgc gtgtgtggtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacaca 2880

cagaagtcga tctctaagcc tccgggtaaa agactgcacc gcgccaccgt gggcacatct 2940

gagatccagt ccagactgaa caccaatatc aagctggctg agtccatcga tcatcagacc 3000

aaggacgtgc tgacaccact gttcaagatc atcggcgacg aagtgggcat ccgcatcccc 3060

cagaagttct ccgatctggt gaagtttatc agcgacaaga tcaagttcct gaaccctgat 3120

agagagtacg acttcaggga cctgcggtgg tgcatgaacc cccctgagcg cgtgaagatc 3180

aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc gctgtgaagt ctatcgagca catcttcgag 3240

tcccctctga acaagagcaa gaagctgcag tctctgaccc tgggaccagg cacaggatgc 3300

ctgggcagga ccgtgacaaa ggcccacttt tccgagctga ccctgacact gatggatctg 3360

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ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat gccagggacc cctctacaga tctgggcatc 3480

ggccacttcc tgagggtgtt tgagatcgga ctgatccggg acctgggact gggaccaccc 3540

gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg aatatgtccg acgattatag gcggtgcctg 3600

ctggctgtgg gagagctgaa gctgaccgcc ctgtgcacat cttccgagac cgtgacactg 3660

agcgagaggg gagctcctaa gagggagcca ctggtggtgg tcatcctgaa cctggctgga 3720

cccaccctgg gaggagagct gtactccgtg ctgcctacaa gcgatctgat ggtggagaag 3780

ctgtatctga gctctcacag aggcatcatc aaggacgatg aggccaactg ggtggtgcct 3840

agcaccgatg tgagggacct gcagaataag ggcgagtgcc tggtggaggc ttgtaagacc 3900

cggcctccat ctttttgcaa tggcacaggc agcggaccat ggtctgaggg aagaatccct 3960

gcctacggcg tgatccgcgt gtctctggat ctggcttccg atcccgacgt ggtcatcacc 4020

tccgtgttcg gcccactgat cccccatctg tccggcatgg acctgtacaa caatcctttt 4080

agccgcgcca tctggctggc tgtgccccct tatgagcaga gcttcctggg catgatcaac 4140

acaatcggct ttccaaatag ggccgaagtg atgccccaca tcctgaccac agagatcagg 4200

ggacctaggg gccggtgtca tgtgccaatc gagctgtcca ggcgcgtgga cgatgacatc 4260

aagatcggct ccaacatggt catcctgcca accatggatc tgagatacat caccgccaca 4320

tatgacgtgt cccgcagcga gcacgctatc gtgtactata tctatgacac aggcaggtcc 4380

agctcttact tctatcccgt gcggctgaac tttaagggca atcctctgtc tctgagaatc 4440

gagtgctttc catggcgcca caaagtgtgg tgctaccatg attgtctgat ctataacacc 4500

atcacagacg aggaggtgca taccaggggc ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatccc 4560

gtg 4563

<210> 4

<211> 1519

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Cys Gln Ile His Trp Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly

20 25 30

Ile Val Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Arg Pro Ser

35 40 45

His Gln Thr Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Ile Thr Ala Ile Asn

50 55 60

Asn Cys Thr Lys Ser Glu Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Ile Thr

65 70 75 80

Val Leu Lys Pro Val Glu Asp Ala Leu Ser Val Ile Thr Lys Asn Val

85 90 95

Arg Pro Ile Gln Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg Thr Arg Arg Phe Ala

100 105 110

Gly Ala Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln

115 120 125

Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu His Gln Ser Leu Met Asn Ser Gln Ala

130 135 140

Ile Glu Ser Leu Lys Thr Ser Leu Glu Lys Ser Asn Gln Ala Ile Glu

145 150 155 160

Glu Ile Arg Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ile Leu Ala Val Gln Gly Val

165 170 175

Gln Asp Tyr Ile Pro Pro Glu Leu Val Pro Ser Val His Arg Met Ser

180 185 190

Cys Glu Leu Val Gly His Lys Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr

195 200 205

Thr Glu Ile Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ala

210 215 220

Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile

225 230 235 240

Asn Lys Ile Leu Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Phe Leu Ala

245 250 255

Ile Leu Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala Arg Val Thr Tyr Val Asp Thr

260 265 270

Arg Asp Tyr Phe Ile Ile Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu

275 280 285

Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Ala Ile Thr Tyr Asn Ile

290 295 300

Gly Ala Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Ile Pro Lys Tyr Val Ala Thr Gln

305 310 315 320

Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Thr Ser Cys Val Phe Thr Pro

325 330 335

Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu

340 345 350

Leu Gln Glu Cys Phe Arg Gly Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg Thr Leu

355 360 365

Val Ser Gly Thr Ile Ser Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu

370 375 380

Ile Ala Asn Cys Ala Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Glu Thr

385 390 395 400

Val Ile Ser Gln Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr Val Val Ala Ser Asp

405 410 415

Lys Cys Pro Val Val Glu Val Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser

420 425 430

Arg Glu Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Leu His Lys Ile Asp Leu Gly Pro

435 440 445

Ala Ile Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala

450 455 460

Val Thr Arg Leu Glu Asn Ala Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ser Asp Gln

465 470 475 480

Ile Leu Lys Thr Val Lys Gly Ala Pro Phe Pro Gly Cys Pro Asp Pro

485 490 495

Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser

500 505 510

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly

515 520 525

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro

530 535 540

Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala

545 550 555 560

Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

565 570 575

Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe

580 585 590

Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr

595 600 605

Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu

610 615 620

Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys

625 630 635 640

Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys

645 650 655

Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln

660 665 670

Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp

675 680 685

Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His

690 695 700

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro

705 710 715 720

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

725 730 735

Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu

740 745 750

Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

755 760 765

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

770 775 780

Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn

785 790 795 800

Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

805 810 815

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

820 825 830

Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu Pro

835 840 845

Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu

850 855 860

Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser

865 870 875 880

Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile

885 890 895

Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr

900 905 910

Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr

915 920 925

Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr

930 935 940

Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

945 950 955 960

Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys Arg Leu His Arg Ala Thr Val Gly

965 970 975

Thr Ser Glu Ile Gln Ser Arg Leu Asn Thr Asn Ile Lys Leu Ala Glu

980 985 990

Ser Ile Asp His Gln Thr Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile

995 1000 1005

Ile Gly Asp Glu Val Gly Ile Arg Ile Pro Gln Lys Phe Ser Asp Leu

1010 1015 1020

Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu

1025 1030 1035 1040

Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Arg Trp Cys Met Asn Pro Pro Glu Arg Val

1045 1050 1055

Lys Ile Asn Phe Asp Gln Phe Cys Glu Tyr Lys Ala Ala Val Lys Ser

1060 1065 1070

Ile Glu His Ile Phe Glu Ser Pro Leu Asn Lys Ser Lys Lys Leu Gln

1075 1080 1085

Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gly Thr Gly Cys Leu Gly Arg Thr Val Thr

1090 1095 1100

Lys Ala His Phe Ser Glu Leu Thr Leu Thr Leu Met Asp Leu Asp Leu

1105 1110 1115 1120

Glu Met Lys His Asn Val Ser Ser Val Phe Thr Val Val Glu Glu Gly

1125 1130 1135

Leu Phe Gly Arg Thr Tyr Thr Val Trp Arg Ser Asp Ala Arg Asp Pro

1140 1145 1150

Ser Thr Asp Leu Gly Ile Gly His Phe Leu Arg Val Phe Glu Ile Gly

1155 1160 1165

Leu Ile Arg Asp Leu Gly Leu Gly Pro Pro Val Phe His Met Thr Asn

1170 1175 1180

Tyr Leu Thr Val Asn Met Ser Asp Asp Tyr Arg Arg Cys Leu Leu Ala

1185 1190 1195 1200

Val Gly Glu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Cys Thr Ser Ser Glu Thr Val

1205 1210 1215

Thr Leu Ser Glu Arg Gly Ala Pro Lys Arg Glu Pro Leu Val Val Val

1220 1225 1230

Ile Leu Asn Leu Ala Gly Pro Thr Leu Gly Gly Glu Leu Tyr Ser Val

1235 1240 1245

Leu Pro Thr Ser Asp Leu Met Val Glu Lys Leu Tyr Leu Ser Ser His

1250 1255 1260

Arg Gly Ile Ile Lys Asp Asp Glu Ala Asn Trp Val Val Pro Ser Thr

1265 1270 1275 1280

Asp Val Arg Asp Leu Gln Asn Lys Gly Glu Cys Leu Val Glu Ala Cys

1285 1290 1295

Lys Thr Arg Pro Pro Ser Phe Cys Asn Gly Thr Gly Ser Gly Pro Trp

1300 1305 1310

Ser Glu Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Gly Val Ile Arg Val Ser Leu Asp

1315 1320 1325

Leu Ala Ser Asp Pro Asp Val Val Ile Thr Ser Val Phe Gly Pro Leu

1330 1335 1340

Ile Pro His Leu Ser Gly Met Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Arg

1345 1350 1355 1360

Ala Ile Trp Leu Ala Val Pro Pro Tyr Glu Gln Ser Phe Leu Gly Met

1365 1370 1375

Ile Asn Thr Ile Gly Phe Pro Asn Arg Ala Glu Val Met Pro His Ile

1380 1385 1390

Leu Thr Thr Glu Ile Arg Gly Pro Arg Gly Arg Cys His Val Pro Ile

1395 1400 1405

Glu Leu Ser Arg Arg Val Asp Asp Asp Ile Lys Ile Gly Ser Asn Met

1410 1415 1420

Val Ile Leu Pro Thr Met Asp Leu Arg Tyr Ile Thr Ala Thr Tyr Asp

1425 1430 1435 1440

Val Ser Arg Ser Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Asp Thr Gly

1445 1450 1455

Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Leu Asn Phe Lys Gly Asn

1460 1465 1470

Pro Leu Ser Leu Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Arg His Lys Val Trp

1475 1480 1485

Cys Tyr His Asp Cys Leu Ile Tyr Asn Thr Ile Thr Asp Glu Glu Val

1490 1495 1500

His Thr Arg Gly Leu Thr Gly Ile Glu Val Thr Cys Asn Pro Val

1505 1510 1515

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atactcgaga tggaaacaga tacactcctc ctctgggtgc tgctcctctg g 51

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ataggtacct cattaaaacg gcgcgccttt cacggttttc agaatctgat c 51

<210> 7

<211> 4503

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

agactgcacc gcgccaccgt gggcacatct gagatccagt ccagactgaa caccaatatc 60

aagctggctg agtccatcga tcatcagacc aaggacgtgc tgacaccact gttcaagatc 120

atcggcgacg aagtgggcat ccgcatcccc cagaagttct ccgatctggt gaagtttatc 180

agcgacaaga tcaagttcct gaaccctgat agagagtacg acttcaggga cctgcggtgg 240

tgcatgaacc cccctgagcg cgtgaagatc aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc 300

gctgtgaagt ctatcgagca catcttcgag tcccctctga acaagagcaa gaagctgcag 360

tctctgaccc tgggaccagg cacaggatgc ctgggcagga ccgtgacaaa ggcccacttt 420

tccgagctga ccctgacact gatggatctg gacctggaga tgaagcataa cgtgtcctcc 480

gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttt ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat 540

gccagggacc cctctacaga tctgggcatc ggccacttcc tgagggtgtt tgagatcgga 600

ctgatccggg acctgggact gggaccaccc gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg 660

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ctgcctacaa gcgatctgat ggtggagaag ctgtatctga gctctcacag aggcatcatc 900

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tccggcatgg acctgtacaa caatcctttt agccgcgcca tctggctggc tgtgccccct 1200

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tgctaccatg attgtctgat ctataacacc atcacagacg aggaggtgca taccaggggc 1620

ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatccc gtgcccggat gcccggaccc atgcaaacat 1680

tgccgatgcc caccccctga gctccccgga ggaccgtctg tcttcatctt cccaccgaaa 1740

cccaaggaca cccttacaat ctctggaacg cccgaggtca cgtgtgtggt ggtggacgtg 1800

ggccaggatg accccgaggt gcagttctcc tggttcgtgg acaacgtgga ggtgcgcacg 1860

gccaggacaa agccgagaga ggagcagttc aacagcacct tccgcgtggt cagcgccctg 1920

cccatccagc accaagactg gactggagga aaggagttca agtgcaaggt ccacaacgaa 1980

gccctcccgg cccccatcgt gaggaccatc tccaggacca aagggcaggc ccgggagccg 2040

caggtgtacg tcctggcccc accccaggaa gagctcagca aaagcacgct cagcgtcacc 2100

tgcctggtca ccggcttcta cccagactac atcgccgtgg agtggcagaa aaatgggcag 2160

cctgagtcgg aggacaagta cggcacgacc acatcccagc tggacgccga cggctcctac 2220

ttcctgtaca gcaggctcag ggtggacaag aacagctggc aagaaggaga cacctacgcg 2280

tgtgtggtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacacac agaagtcgat ctctaagcct 2340

ccgggtaaag gaggaggagg aggaggatca ggaggaggag gaggaggatc acccggatgc 2400

ccggacccat gcaaacattg ccgatgccca ccccctgagc tccccggagg accgtctgtc 2460

ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc cttacaatct ctggaacgcc cgaggtcacg 2520

tgtgtggtgg tggacgtggg ccaggatgac cccgaggtgc agttctcctg gttcgtggac 2580

aacgtggagg tgcgcacggc caggacaaag ccgagagagg agcagttcaa cagcaccttc 2640

cgcgtggtca gcgccctgcc catccagcac caagactgga ctggaggaaa ggagttcaag 2700

tgcaaggtcc acaacgaagc cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc caggaccaaa 2760

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ctggtgatta aactgatgcc gaacattacc gcgattaaca actgcaccaa aagcgaaatt 3240

gcggaatata aacgcctgct gattaccgtg ctgaaaccgg tggaagatgc gctgagcgtg 3300

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gcgggcgcgg tgctggcggg cgtggcgctg ggcgtggcga ccgcggcgca gattaccgcg 3420

ggcgtggcgc tgcatcagag cctgatgaac agccaggcga ttgaaagcct gaaaaccagc 3480

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gcggtgcagg gcgtgcagga ttatattaac aacgaactgg tgccgagcgt gcatcgcatg 3600

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ctgagcattt ttggcccgag cctgcgcgat ccgattgcgg cggaaattag cattcaggcg 3720

ctgagctatg cgctgggcgg cgatattaac aaaattctgg ataaactggg ctatagcggc 3780

ggcgattttc tggcgattct ggaaagcaaa ggcattaaag cgcgcgtgac ctatgtggat 3840

acccgcgatt attttattat tctgagcatt gcgtatccga ccctgagcga aattaaaggc 3900

gtgattgtgc ataaaattga agcgattacc tataacattg gcgcgcagga atggtatacc 3960

accattccga aatatgtggc gacccagggc tatctgatta gcaactttga tgaaaccagc 4020

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ctgctgcagg aatgctttcg cggcagcacc aaaagctgcg cgcgcaccct ggtgagcggc 4140

accattagca accgctttat tctgagcaaa ggcaacctga ttgcgaactg cgcgagcgtg 4200

ctgtgcaaat gctataccac cgaaaccgtg attagccagg atccggataa actgctgacc 4260

gtggtggcga gcgataaatg cccggtggtg gaagtggatg gcgtgaccat tcaggtgggc 4320

agccgcgaat atccggatag cgtgtatctg cataaaattg atctgggccc ggcgattagc 4380

ctggaaaaac tggatgtggg caccaacctg ggcaacgcgg tgacccgcct ggaaaacgcg 4440

aaagaactgc tggatgcgag cgatcagatt ctgaaaaccg tgaaaggcgc gccgttttaa 4500

tga 4503

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accgcgatta acaactgcac caaaagcgaa attgcggaat ataaacgcct gctgattacc 180

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accctgaccc cgggccgccg cacccgccgc tttgcgggcg cggtgctggc gggcgtggcg 300

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ccgccggaac tggtgccgag cgtgcatcgc atgagctgcg aactggtggg ccataaactg 540

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gatccgattg cggcggaaat tagcattcag gcgctgagct atgcgctggg cggcgatatt 660

aacaaaattc tggataaact gggctatagc ggcggcgatt ttctggcgat tctggaaagc 720

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attgcgtatc cgaccctgag cgaaattaaa ggcgtgattg tgcataaaat tgaagcgatt 840

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tgcagccaga acgcgctgta tccgatgagc ccgctgctgc aggaatgctt tcgcggcagc 1020

accaaaagct gcgcgcgcac cctggtgagc ggcaccatta gcaaccgctt tattctgagc 1080

aaaggcaacc tgattgcgaa ctgcgcgagc gtgctgtgca aatgctatac caccgaaacc 1140

gtgattagcc aggatccgga taaactgctg accgtggtgg cgagcgataa atgcccggtg 1200

gtggaagtgg atggcgtgac cattcaggtg ggcagccgcg aatatccgga tagcgtgtat 1260

ctgcataaaa ttgatctggg cccggcgatt agcctggaaa aactggatgt gggcaccaac 1320

ctgggcaacg cggtgacccg cctggaaaac gcgaaagaac tgctggatgc gagcgatcag 1380

attctgaaaa ccgtgaaagg cgcgccgttt taatgacccg gatgcccgga cccatgcaaa 1440

cattgccgat gcccaccccc tgagctcccc ggaggaccgt ctgtcttcat cttcccaccg 1500

aaacccaagg acacccttac aatctctgga acgcccgagg tcacgtgtgt ggtggtggac 1560

gtgggccagg atgaccccga ggtgcagttc tcctggttcg tggacaacgt ggaggtgcgc 1620

acggccagga caaagccgag agaggagcag ttcaacagca ccttccgcgt ggtcagcgcc 1680

ctgcccatcc agcaccaaga ctggactgga ggaaaggagt tcaagtgcaa ggtccacaac 1740

gaagccctcc cggcccccat cgtgaggacc atctccagga ccaaagggca ggcccgggag 1800

ccgcaggtgt acgtcctggc cccaccccag gaagagctca gcaaaagcac gctcagcgtc 1860

acctgcctgg tcaccggctt ctacccagac tacatcgccg tggagtggca gaaaaatggg 1920

cagcctgagt cggaggacaa gtacggcacg accacatccc agctggacgc cgacggctcc 1980

tacttcctgt acagcaggct cagggtggac aagaacagct ggcaagaagg agacacctac 2040

gcgtgtgtgg tgatgcacga ggctctgcac aaccactaca cacagaagtc gatctctaag 2100

cctccgggta aa 2112

<210> 9

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

agactgcacc gcgccaccgt gggcacatct gagatccagt ccagactgaa caccaatatc 120

aagctggctg agtccatcga tcatcagacc aaggacgtgc tgacaccact gttcaagatc 180

atcggcgacg aagtgggcat ccgcatcccc cagaagttct ccgatctggt gaagtttatc 240

agcgacaaga tcaagttcct gaaccctgat agagagtacg acttcaggga cctgcggtgg 300

tgcatgaacc cccctgagcg cgtgaagatc aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc 360

gctgtgaagt ctatcgagca catcttcgag tcccctctga acaagagcaa gaagctgcag 420

tctctgaccc tgggaccagg cacaggatgc ctgggcagga ccgtgacaaa ggcccacttt 480

tccgagctga ccctgacact gatggatctg gacctggaga tgaagcataa cgtgtcctcc 540

gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttt ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat 600

gccagggacc cctctacaga tctgggcatc ggccacttcc tgagggtgtt tgagatcgga 660

ctgatccggg acctgggact gggaccaccc gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg 720

aatatgtccg acgattatag gcggtgcctg ctggctgtgg gagagctgaa gctgaccgcc 780

ctgtgcacat cttccgagac cgtgacactg agcgagaggg gagctcctaa gagggagcca 840

ctggtggtgg tcatcctgaa cctggctgga cccaccctgg gaggagagct gtactccgtg 900

ctgcctacaa gcgatctgat ggtggagaag ctgtatctga gctctcacag aggcatcatc 960

aaggacgatg aggccaactg ggtggtgcct agcaccgatg tgagggacct gcagaataag 1020

ggcgagtgcc tggtggaggc ttgtaagacc cggcctccat ctttttgcaa tggcacaggc 1080

agcggaccat ggtctgaggg aagaatccct gcctacggcg tgatccgcgt gtctctggat 1140

ctggcttccg atcccgacgt ggtcatcacc tccgtgttcg gcccactgat cccccatctg 1200

tccggcatgg acctgtacaa caatcctttt agccgcgcca tctggctggc tgtgccccct 1260

tatgagcaga gcttcctggg catgatcaac acaatcggct ttccaaatag ggccgaagtg 1320

atgccccaca tcctgaccac agagatcagg ggacctaggg gccggtgtca tgtgccaatc 1380

gagctgtcca ggcgcgtgga cgatgacatc aagatcggct ccaacatggt catcctgcca 1440

accatggatc tgagatacat caccgccaca tatgacgtgt cccgcagcga gcacgctatc 1500

gtgtactata tctatgacac aggcaggtcc agctcttact tctatcccgt gcggctgaac 1560

tttaagggca atcctctgtc tctgagaatc gagtgctttc catggcgcca caaagtgtgg 1620

tgctaccatg attgtctgat ctataacacc atcacagacg aggaggtgca taccaggggc 1680

ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatccc gtgcccggat gcccggaccc atgcaaacat 1740

tgccgatgcc caccccctga gctccccgga ggaccgtctg tcttcatctt cccaccgaaa 1800

cccaaggaca cccttacaat ctctggaacg cccgaggtca cgtgtgtggt ggtggacgtg 1860

ggccaggatg accccgaggt gcagttctcc tggttcgtgg acaacgtgga ggtgcgcacg 1920

gccaggacaa agccgagaga ggagcagttc aacagcacct tccgcgtggt cagcgccctg 1980

cccatccagc accaagactg gactggagga aaggagttca agtgcaaggt ccacaacgaa 2040

gccctcccgg cccccatcgt gaggaccatc tccaggacca aagggcaggc ccgggagccg 2100

caggtgtacg tcctggcccc accccaggaa gagctcagca aaagcacgct cagcgtcacc 2160

tgcctggtca ccggcttcta cccagactac atcgccgtgg agtggcagaa aaatgggcag 2220

cctgagtcgg aggacaagta cggcacgacc acatcccagc tggacgccga cggctcctac 2280

ttcctgtaca gcaggctcag ggtggacaag aacagctggc aagaaggaga cacctacgcg 2340

tgtgtggtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacacac agaagtcgat ctctaagcct 2400

ccgggtaaa 2409

<210> 10

<211> 3129

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

agactgcacc gcgccaccgt gggcacatct gagatccagt ccagactgaa caccaatatc 120

aagctggctg agtccatcga tcatcagacc aaggacgtgc tgacaccact gttcaagatc 180

atcggcgacg aagtgggcat ccgcatcccc cagaagttct ccgatctggt gaagtttatc 240

agcgacaaga tcaagttcct gaaccctgat agagagtacg acttcaggga cctgcggtgg 300

tgcatgaacc cccctgagcg cgtgaagatc aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc 360

gctgtgaagt ctatcgagca catcttcgag tcccctctga acaagagcaa gaagctgcag 420

tctctgaccc tgggaccagg cacaggatgc ctgggcagga ccgtgacaaa ggcccacttt 480

tccgagctga ccctgacact gatggatctg gacctggaga tgaagcataa cgtgtcctcc 540

gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttt ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat 600

gccagggacc cctctacaga tctgggcatc ggccacttcc tgagggtgtt tgagatcgga 660

ctgatccggg acctgggact gggaccaccc gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg 720

aatatgtccg acgattatag gcggtgcctg ctggctgtgg gagagctgaa gctgaccgcc 780

ctgtgcacat cttccgagac cgtgacactg agcgagaggg gagctcctaa gagggagcca 840

ctggtggtgg tcatcctgaa cctggctgga cccaccctgg gaggagagct gtactccgtg 900

ctgcctacaa gcgatctgat ggtggagaag ctgtatctga gctctcacag aggcatcatc 960

aaggacgatg aggccaactg ggtggtgcct agcaccgatg tgagggacct gcagaataag 1020

ggcgagtgcc tggtggaggc ttgtaagacc cggcctccat ctttttgcaa tggcacaggc 1080

agcggaccat ggtctgaggg aagaatccct gcctacggcg tgatccgcgt gtctctggat 1140

ctggcttccg atcccgacgt ggtcatcacc tccgtgttcg gcccactgat cccccatctg 1200

tccggcatgg acctgtacaa caatcctttt agccgcgcca tctggctggc tgtgccccct 1260

tatgagcaga gcttcctggg catgatcaac acaatcggct ttccaaatag ggccgaagtg 1320

atgccccaca tcctgaccac agagatcagg ggacctaggg gccggtgtca tgtgccaatc 1380

gagctgtcca ggcgcgtgga cgatgacatc aagatcggct ccaacatggt catcctgcca 1440

accatggatc tgagatacat caccgccaca tatgacgtgt cccgcagcga gcacgctatc 1500

gtgtactata tctatgacac aggcaggtcc agctcttact tctatcccgt gcggctgaac 1560

tttaagggca atcctctgtc tctgagaatc gagtgctttc catggcgcca caaagtgtgg 1620

tgctaccatg attgtctgat ctataacacc atcacagacg aggaggtgca taccaggggc 1680

ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatccc gtgtgccaga ttcattgggg caacctgagc 1740

aaaattggca ttgtgggcac cggcagcgcg agctataaag tgatgacccg cccgagccat 1800

cagaccctgg tgattaaact gatgccgaac attaccgcga ttaacaactg caccaaaagc 1860

gaaattgcgg aatataaacg cctgctgatt accgtgctga aaccggtgga agatgcgctg 1920

agcgtgatta ccaaaaacgt gcgcccgatt cagaccctga ccccgggccg ccgcacccgc 1980

cgctttgcgg gcgcggtgct ggcgggcgtg gcgctgggcg tggcgaccgc ggcgcagatt 2040

accgcgggcg tggcgctgca tcagagcctg atgaacagcc aggcgattga aagcctgaaa 2100

accagcctgg aaaaaagcaa ccaggcgatt gaagaaattc gcctggcgaa caaagaaacc 2160

attctggcgg tgcagggcgt gcaggattat attccgccgg aactggtgcc gagcgtgcat 2220

cgcatgagct gcgaactggt gggccataaa ctgggcctga aactgctgcg ctattatacc 2280

gaaattctga gcatttttgg cccgagcctg cgcgatccga ttgcggcgga aattagcatt 2340

caggcgctga gctatgcgct gggcggcgat attaacaaaa ttctggataa actgggctat 2400

agcggcggcg attttctggc gattctggaa agcaaaggca ttaaagcgcg cgtgacctat 2460

gtggataccc gcgattattt tattattctg agcattgcgt atccgaccct gagcgaaatt 2520

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tataccacca ttccgaaata tgtggcgacc cagggctatc tgattagcaa ctttgatgaa 2640

accagctgcg tgtttacccc ggaaggcacc gtgtgcagcc agaacgcgct gtatccgatg 2700

agcccgctgc tgcaggaatg ctttcgcggc agcaccaaaa gctgcgcgcg caccctggtg 2760

agcggcacca ttagcaaccg ctttattctg agcaaaggca acctgattgc gaactgcgcg 2820

agcgtgctgt gcaaatgcta taccaccgaa accgtgatta gccaggatcc ggataaactg 2880

ctgaccgtgg tggcgagcga taaatgcccg gtggtggaag tggatggcgt gaccattcag 2940

gtgggcagcc gcgaatatcc ggatagcgtg tatctgcata aaattgatct gggcccggcg 3000

attagcctgg aaaaactgga tgtgggcacc aacctgggca acgcggtgac ccgcctggaa 3060

aacgcgaaag aactgctgga tgcgagcgat cagattctga aaaccgtgaa aggcgcgccg 3120

ttttaatga 3129

Claims (16)

1.一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:3所示。

4.包含权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS。

6.包含权利要求2或3所述编码基因的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞选自CHO细胞系。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞选自DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。

9.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

10.如权利要求9所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素中的任意一种或者两种以上的组合。

11.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：

将权利要求1所述融合蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

以所述重组表达载体转染宿主细胞，并筛选出悬浮稳定高效表达所述融合蛋白的宿主细胞，再发酵培养，之后从细胞培养物中分离和回收所述融合蛋白。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞选自CHO细胞系。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞选自DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。

15.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求9或10所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对小反刍兽疫病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受小反刍兽疫病毒感染的药剂中的用途。

16.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求9或10所述免疫组合物在制备小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

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