CN112680366B - 一种淡紫拟青霉用液体培养基及淡紫拟青霉菌剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种淡紫拟青霉用液体培养基及淡紫拟青霉菌剂制备方法，是将菌糠、水、氯化锌和硝酸钠混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水6‑8毫升，每克菌糠中加入氯化锌0.04‑0.06g，每克菌糠中加入硝酸钠0.08‑0.12g，再将淡紫拟青霉接种液接入液体培养基中，在27～31℃培养4～6d后收获淡紫拟青霉菌剂。本发明原材料为农业废料，经济易得，培养方法操作简单，生产成本较低，产孢量高。

Description

一种淡紫拟青霉用液体培养基及淡紫拟青霉菌剂制备方法

技术领域

本发明属于发酵培养技术领域，尤其涉及一种淡紫拟青霉用液体培养基及淡紫拟青霉菌剂制备方法。

背景技术

淡紫拟青霉 （Paecilomyces lilacinus）是一种广泛分布于土壤和植物根系的习居菌，被认为是最有前途的防治植物线虫病的生物介质。其具有高效、光谱、长效、安全、无污染、无残留等特点。淡紫拟青霉能够寄生植物线虫的卵、幼虫及成虫，侵染过程中通过菌丝机械压力和分泌的胞外酶联合作用，使线虫和虫体破裂而死，而且在代谢过程中能够产生具有杀线虫活性的物质，抑制线虫卵的孵化，并强烈抑杀 2 龄幼虫从而控制作物线虫病害。此外，淡紫拟青霉还能产生促进植物生长的生物活性物质。因此，淡紫拟青霉在植物线虫病的生物防治上具有巨大的潜力。

淡紫拟青霉经济、快速大量增殖生产是淡紫拟青霉大量用于生物防治实践的前提条件。目前国内外学者尝试使用当地农业废料进行淡紫拟青霉的培养，并且得到了孢子数量可观的淡紫拟青霉。

菌糠是指食用菌栽培采收后的培养基剩余物，若将其进行利用，可以达到变废为宝的效果。作为一种农业生产中的废弃物，其主要组成为食用菌菌丝体，纤维素含量约10%-30%，粗蛋白含量约6%-13%，粗脂肪含量约1%-3%。如若不及时处理利用，还会造成资源浪费和环境污染。研究发现，废弃的菌糠中的营养物质可以作为作物的养料，也可以用来培养其他食用菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种淡紫拟青霉用液体培养基，实现快速生产淡紫拟青霉，其是将菌糠、水、氯化锌和硝酸钠混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水6-8毫升，每克菌糠中加入氯化锌0.04-0.06g，每克菌糠中加入硝酸钠0.08-0.12g。

作为本发明更优的技术方案，所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、平菇菌糠或滑子蘑菌糠。

作为本发明更优的技术方案，所述的每克菌糠中加入水6毫升，每克菌糠中加入氯化锌0.05g，每克菌糠中加入硝酸钠0.10g。

作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸汽压力为0.11MPa。

作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽灭菌时间30min。

本发明还有一个目的是提供一种淡紫拟青霉菌剂制备方法，生产成本较低并且周期较短，具体如下：将淡紫拟青霉接种液接入淡紫拟青霉用液体培养基，按每克干菌糠加入接种液0.14-0.28ml，密封后在25-27°C摇床中以150rpm速度培养4-6d后收获淡紫拟青霉菌剂。

作为本发明更优的技术方案，按每克干菌糠加入接种液0.07ml。

作为本发明更优的技术方案，所述的淡紫拟青霉接种液通过冲洗长有淡紫拟青霉的平板得到，所述的淡紫拟青霉平板的制备过程为将淡紫拟青霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养7-10天后收获。

有益效果如下：

本发明中的液体发酵所需时间为6天，得到的孢子量浓度为1.24×10¹⁰，而常见的固体发酵时间大体都在8-10天，得到的孢子量浓度达到0.1×10¹⁰左右。

本发明使用由菌糠和添加剂制备得到的液体培养基培养生防菌淡紫拟青霉，为淡紫拟青霉的生长提供大部分的营养物质，硝酸钠和氯化锌作为菌糠培基的补充物质，为淡紫拟青霉的增殖提供N源和生长所需的无机盐成分，产孢量高；同时菌糠作为农业废料，其经济易得，使用菌糠培养淡紫拟青霉，在获得生防菌的同时也提高了菌糠的利用价值。

本发明的淡紫拟青霉菌剂的制备方法操作简单、流程清晰，对生产环境和生产设备要求低，生产成本较低生产周期较短，在培养过程中使用摇床培养基进行混合，在增加其供氧量的同时，也减少了生产中杂菌的污染问题，非常适合小型企业和生产单位快速生产淡紫拟青霉。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施列来进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅限于下面的实施例，不能理解为对发明保护范围的限制。

所述的淡紫拟青霉购自广东省微生物菌种保藏中心，编号为3.405。

实施例1：

第一步：淡紫拟青霉的液体培养基的制备；

在50ml锥形瓶中放入2g菌糠、0.10g氯化锌、0.20g硝酸钠、12ml蒸馏水充分混合高压蒸汽121℃，灭菌30min得到。

第二步：淡紫拟青霉平板制备；

将淡紫拟青霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养10天后收获。

第三步：通过冲洗长有淡紫拟青霉的平板，得到浓度为10⁷孢子/ml的淡紫拟青霉接种液。

第四步：接入实施例1中的菌糠培养基，在灭菌的装有菌糠培养基的50ml锥形瓶中加入0.14ml的接种液，瓶口用封口膜封口，放在29℃的摇床中培养6d后收获。

第五步：将收获产物进行测量，使用4层无菌纱布过滤，得到滤液。测量滤液中的孢子数。

实施例1使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例2：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的蒸馏水的体积为14ml。实施例2使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例3：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的硝酸钠的质量为0.16g。实施例3使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例4：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的氯化锌的质量为0.12g。实施例4使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例5：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所设定的温度为27℃。实施例5使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例6：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所加入的接菌量的体积为0.20ml。实施例6使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

实施例7：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所培养的时间为4d。实施例7使用各种菌糠制备淡紫拟青霉液体培养基及产孢量见表1

表1

实施例1中木耳菌糠作为培养基发酵的淡紫拟青霉孢子液浓度最大，比同等条件下其他菌糠提高2.41-4.83%，比淡紫拟青霉孢子液浓度最低的实施例2的平菇菌糠提高了31.5%。

本发明相对于现有的固体发酵减少了发酵时间，并且增加了产孢量。本发明中的液体发酵所需时间为6天，得到的孢子量浓度为1.24×10¹⁰，而常见的固体发酵时间大体都在8-10天，得到的孢子量浓度达到0.1×10¹⁰左右。

本发明的培养基配方和制作方法简单，材料易得，成本低廉，淡紫拟青霉孢子产量高，培养方法操作简单，生产工艺流程清晰，生产周期短，孢子产量大，对生产环境和生产设备要求低，可操作性强，生产成本较低，非常适合小型企业和生产单位快速生产淡紫拟青霉用于根结线虫生物防治需要。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多种实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种淡紫拟青霉用液体培养基，其特征在于：是将菌糠、水、氯化锌和硝酸钠混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水6-8毫升，每克菌糠中加入氯化锌0.04-0.06g，每克菌糠中加入硝酸钠0.08-0.12g；

所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、平菇菌糠或滑子蘑菌糠。

2.如权利要求1所述的一种淡紫拟青霉用液体培养基，其特征在于：所述的每克菌糠中加入水6毫升，每克菌糠中加入氯化锌0.05g，每克菌糠中加入硝酸钠0.10g。

3.如权利要求1所述的一种淡紫拟青霉用液体培养基，其特征在于：所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸气压力为0.11MPa。

4.如权利要求1所述的一种淡紫拟青霉用液体培养基，其特征在于：所述的高压蒸汽灭菌的时间为30min。

5.一种淡紫拟青霉菌剂制备方法，其特征在于，将淡紫拟青霉接种液接入如权利要求1所述的淡紫拟青霉用液体培养基，按每克干菌糠加入接种液0.14-0.28ml，密封后在25-27°C摇床中以150rpm速度培养4-6d后收获淡紫拟青霉菌剂。

6.如权利要求5所述的一种淡紫拟青霉菌剂制备方法，其特征在于：所述的淡紫拟青霉接种液通过将淡紫拟青霉菌块加入到PDA培养基中，在29℃培养箱中培养7-10天后冲洗平板，得到淡紫拟青霉接种液。