CN101638663B

CN101638663B - 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel1基因、蛋白制备方法及其应用

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Publication number: CN101638663B
Application number: CN2009100179951A
Authority: CN
Inventors: 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2009-09-02
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2029-09-02
Also published as: CN101638663A

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶基因Pcpel1及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白质水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉菌侵染辣椒寄主及其导致辣椒叶片疫病病程发生的过程，立足于植物病理学和细胞化学技术进一步证明了该基因编码的蛋白质接种于辣椒叶片后，使叶片接种部位产生了明显的枯萎、皱缩症状，并使受害叶片部位的细胞壁得到明显的降解，既该基因编码一种重要的病程相关蛋白，或者可能是辣椒疫霉菌果胶裂解酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉菌分子检测技术提供了重要的技术储备。

Description

辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel1基因、蛋白制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种辣椒疫霉菌果胶裂解酶基因的分离及其编码的蛋白质制备方法。此外，本发明还涉及该基因编码的果胶裂解酶对辣椒寄主的破坏和细胞壁的降解作用。

背景技术

植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中果胶裂解酶(PEL：EC 4.2.2.2)是许多植物病原卵菌分泌的一种重要致病酶，产生于病菌与寄主的互作过程中，该类酶通过降解或软化细胞壁的果胶、中胶层及其果胶聚合体，促使病原菌的侵入与定植。果胶裂解酶常通过β-转移-消除的方法作用于细胞壁的果胶、果胶酸盐或低甲基果胶的α-1，4-葡萄糖苷键，其中β-消除方式是通过断裂半乳糖醛酸的第5位β-碳原子的糖苷键，而裂解高度酸化的果胶。根据果胶裂解酶作用方式的不同，将果胶裂解酶分为内切型(endo-)和外切型(exo-)果胶裂解酶：内切型果胶裂解酶可随机裂解甲氧基果胶，外切型果胶裂解酶以果胶酸为底物，通过裂解果胶酸非还原末端的半乳糖醛酸二聚体糖苷键降解果胶。基于对果胶裂解酶作用机制的分析，果胶裂解酶可降解植物细胞壁的主要成分果胶，而导致细胞壁的降解。若干研究结果表明果胶裂解酶参与了植物病原菌侵染寄主而导致寄主发病的过程。已经报道了多种重要植物病原细菌、真菌的果胶裂解酶基因簇成员组成及其靶标基因功能特性，但目前还没有关于植物病原卵菌果胶裂解酶的基因克隆及其靶标基因功能研究的资料信息。

在世界范围内，植物病原卵菌导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重的损失，基于果胶裂解酶是多种植物病原菌分泌的重要致病酶，深入开展重要植物病原卵菌辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)果胶裂解酶的基因分离及其靶标基因编码的蛋白质制作和功能分析研究具重要的实践意义。在本发明申请之前，没有公开或发表过辣椒疫霉菌果胶裂解酶靶标基因在病菌-寄主互作过程的作用研究资料信息。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉菌果胶裂解酶基因Pcpel 1及其编码的蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于植物病理学和细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有导致辣椒叶片产生皱缩、坏死和破坏细胞壁的性能。因此，该基因是辣椒疫霉菌果胶裂解酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术提供充分的技术储备。

本发明所提供的果胶裂解酶基因，其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该基因开放阅读框有1233碱基，编码一种含有410个氨基酸的蛋白质，分子量为44kDa，有1个信号肽切割位点，信号肽含有21个氨基酸(为氨基酸序列SEQ ID NO：2中1-21氨基酸)，6个N-糖基化位点(分别为SEQ ID NO：2序列中的66-68，77-79，123-125，139-141，317-319，372-374氨基酸)，无内含子。

该果胶裂解酶基因与JGI(jgi/phycaf7/20609中的所有pel基因氨基酸序列比对，发现1个pel基因(38885)与Pcpel 1氨基酸同源性高达99.02％，但来自JGI的这个pel基因较Pcpel 1基因多1个N-糖基化位点，因此Pcpel 1基因是一个新pel基因，本发明提供的有关Pcpel 1基因的致病功能特性的信息具鲜明的原创性。

其具体的分离制备方法为：

1、分离克隆基因具体步骤：

A：用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂构建基因组DNA文库，将大小为1.5Kb-3.0Kb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定文库质量。

B：根据已报道的植物、细菌、真菌的果胶裂解酶基因保守序列，设计简并引物PELSP199：(其序列如Seq ID No：3所示)和PELASP638：(其序列如Seq ID No：4所示)，利用Pooling-PCR技术筛选DNA文库，阳性克隆测序获得基因金长。(上述的Pooling-PCR技术参见plantjournal，2000，23：687-695)

2、制备蛋白质的具体步骤：

A：Pcpel 1基因酵母表达载体构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中。

B：将上述重组表达载体线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子甲醇利用表型平板筛选。

C：酵母转化子培养和果胶裂解酶甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、SDS-PAGE分析，果胶裂解酶纯化，即可得到与目的基因表达的蛋白质。

本发明所用的载体和宿主菌均常见，pUC19为Pcpel 1基因宿主载体，DH5α为宿主细胞，pPIC9K为Pcpel 1基因表达载体，Pichia pastoris GS115为该基因的表达宿主菌。

通过这种方法克隆所得的基因及按照其编码的蛋白质，可以为研究该类病毒的在辣椒疫病株内转录表达水平和在辣椒疫病株内翻译表达水平而提供有效的依据，其具体的检测方式如下：

在辣椒疫病株内转录表达水平的检测：

A：将用于克隆Pcpel 1基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片。

B：发病辣椒叶片总RNA提取及cDNA合成。

C：反转录cDNA第一链合成。

D：RT-PCR检测。

E：DIG-DNA探针制备。

F：RNA转移、固定及分子杂交检测。

本技术操作采用了常规基因转录表达检测方法，具体操作过程在后续的具体实施方式中加以详述。

在辣椒疫病株内翻译表达水平检测步骤：

A：将用于克隆Pcpel1基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片；

B：提取上述病叶中的粗蛋白；

C：利用获得的Pcpel 1基因表达纯化的蛋白制备特异抗血清；

D：将B步中制得的粗蛋白转N C膜后，利用上述的特异抗血清进行Western Blot分析(实验中采用HRP标记的羊抗兔为二抗)。

本技术操作采用了常规基因翻译表达检测方法，具体过程在后续的具体实施方式中加以详述。

同时为了进一步验证本发明所提供的Pcpel 1基因编码的果胶裂解酶具有破坏辣椒叶片和降解细胞壁的作用，本发明提供了该基因编码的蛋白质接种辣椒叶片的方法和降解细胞壁的电镜观察制作技术，具体操作步骤：

A：Pcpel1基因表达纯化蛋白接种健康辣椒叶片。

B：取接种表达纯化蛋白并呈现明显症状的辣椒叶片样品固定及脱水处理。

C：然后进行浸透、包埋及切片染色。

D：电镜观察。

致病蛋白接种方法是借鉴同类研究成熟的操作技术，电镜观察制作属常规操作技术，具体操作在后续的具体实施方式中加以详述。通过该技术进一步证明了在辣椒疫霉菌与辣椒寄主互作过程中，该基因编码的蛋白质具明显降的破坏辣椒叶片和降解细胞壁的性能。本技术为探索其它细胞壁降解酶基因簇成员致病功能特性研究提供有价值的借鉴。

综上所述，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶基因Pcpel 1及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有破坏叶片组织细胞及其细胞壁结构的性能，使受害部位产生明显的症状。因此，该基因是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制病菌分子检测技术提供充分的技术储备。

附图说明

图1.Pcpel 1基因重组表达载体示意图

图中Amp，Kana分别为氨苄抗性和卡那抗性，5′AOX1为启动子，3′AOX1为转录终止子，His 6是组氨酸脱氢酶基因筛选标记，EcoR I和Not I为双酶切位点，pcpel1为目的基因，SalI为线性化位点；

图2.Pcpel 1基因表达纯化蛋白结果

图中M：标准蛋白，1为Pcpel 1基因在毕赤酵母GS115中的表达结果；2为Pcpel 1基因表达纯化蛋白结果；3为空载体pPIC9K表达结果，2图示的蛋白带表明获得了该基因表达纯化的蛋白，2所示的蛋白带表明获得了该基因表达的纯化蛋白，由于氨基酸序列中存在有6个N-糖基化位点，因此导致其实际分子量大于预测分子量；

图3.Pcpel 1基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的RT-PCR检测结果

A：辣椒疫霉菌接种辣椒叶片后的1d、3d、5d、7d病叶的cDNA检测结果；CK+为辣椒疫霉菌的cDNA检测结果，CK-为健康辣椒叶片的cDNA检测结果；B：辣椒寄主β-actin基因的扩增结果。C：CK-为健康辣椒叶片的RNA扩增结果，1，3，5，7为接种7d内每间隔1d的辣椒病叶的RNA扩增结果，CK+为辣椒疫霉菌的RNA扩增结果；图A所示的RT-PCR检测图带亮度逐渐增强，说明接种辣椒疫霉菌的辣椒叶片(1d-7d)随着叶片发病程度的增强，该基因在辣椒病叶内的转录表达水平逐渐增强；

图4.Pcpel 1基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的Northem Blot检测结果

A：1，3，5，7为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片7d内每间隔1d病叶的RNA检测结果；CK+为参试辣椒疫霉菌的RNA检测结果(阳性对照)；CK-为健康辣椒叶片的RNA检测结果(阴性对照)；B：病株和健康叶片的RNA质量检测结果；图A所示由Pcpel 1基因制备的探针与接种辣椒疫霉菌的病叶(1d-7d)RNA杂交信号强度逐渐增强，说明在接种辣椒疫霉菌的7d内，随着发病程度的加重，该基因在辣椒病叶内的转录表达水平逐渐增强；

综合RT-PCR和Northern Blot检测结果表明，辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起叶片发病的过程中，在病菌接种辣椒叶片的7d内，该基因转录表达水平逐渐增强；

图5.Pcpel 1基因在辣椒疫病叶内翻译表达水平的Western Blot检测结果

1，3，5，7为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片7d内，每间隔1d Pcpel 1基因在病叶内翻译表达水平的检测结果；CK-为健康叶片粗蛋白的检测结果；CK+为辣椒疫霉菌粗蛋白的检测结果；

结果显示辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起发病的过程中，该基因翻译表达水平逐渐增强；

图6.Pcpel 1基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁降解电镜观察结果

A：Pcpel 1基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B：表达纯化蛋白钝化后对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示(阳性对照)；C：无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示(阴性对照)；结果显示该基因表达蛋白对辣椒叶片细胞壁具明显的降解效果，由此推断该该基因编码的蛋白是一种具降解细胞壁性能的蛋白，或在一定程度上是一种病程相关蛋白；

具体实施方式

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等(Blackwell科学出版社，1988)所述的操作技术规程，或按制造厂商的建议实验条件。

实施例1(参试辣椒疫霉菌基因组DNA文库构建)

选取强致病且具高PELs活性的辣椒疫霉菌株为参试材料，构建基因组DNA文库，具体步骤如下：

(1)采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组高质量DNA。

(2)基因组DNA超声波打断，电泳检测获得的1.5Kb-3.0Kb的DNA片段，采用QIAEXII GELExtraction Kit试剂盒回收纯化。

(3)基因组文库鉴定，适宜大小DNA片段连接载体后，转化大肠杆菌DH5α，取20μL菌液涂含Amp，X-gal和IPTG的LB平板，蓝白斑筛选。

(4)随机挑取96个克隆进行菌落PCR鉴定和测序分析，取保96个克隆中插入了所需大小的DNA片段成功率达80％以上。

实施列2(基因克隆及测序)

根据已报道的果胶裂解酶基因序列设计简并引物，PELSP199：(其序列如Seq ID No：3所示)和PELASP638：(其序列如Seq ID No：4所示)，利用Pooling-PCR方法筛选基因组文库，快速分离获得目的基因家族的多个基因成员。

1.96个克隆总质粒DNA提取(碱裂解法)

(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含有抗生素LB的培养基96深孔板中，37℃，220rpm震荡，至对数生长后期。

(2)将培养的菌液移至80mL离心管中，4℃，8000rpm离心15min，弃上清。

(3)将离心获得的菌体于盛有5mL溶液I[50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]的离心管中重新悬浮，于摇床缓慢摇动10min，然后加0.5mL的溶菌酶(浓度为10mg/mL)，静置10min。

(4)加10mL溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]混匀，室温下放置10min。

(5)每管中加7.5mL冷冻溶液III[5MKAC60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL]，充分混匀，于冰块表面放置10min，并震荡混合3次。

(6)4℃，10000rpm离心10min，重复离心至大分子DNA沉淀至全部清除为止。

(7)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混合后室温下放置10min，然后室温下，10000rpm离心15min，取沉淀用70％的乙醇洗两次，倒置离心管干燥。

(8)DNA溶于3mL TE内，将溶解后的提取物移至50mL的离心管中，加等体积冷冻的5mol/LLiCl，混合后置于冰块2-5min后，4℃，10000rpm离心10min(沉淀大分子RNA)。

(9)将上清移至于30-50mL的干净离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀10min，10000rpm离心10min。

(10)倒掉上清，倒置离心管，除去残余上清，用70％的乙醇洗2次，倒置离心管干燥几分钟。

(11)沉淀溶于1mLTE或水中，-20℃下保存待用。

2.16个克隆总质粒DNA提取

步骤同上，各种溶液用量均为前述的1/6。

3.单克隆质粒DNA提取

(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡，培养至对数生长期。

(2)取1ml菌液至1.5ml的离心管中，8000rpm离心1min，去上清，收集菌体。

(3)加入200μL预冷的溶液I，震荡悬浮菌体。

(4)加入400μL溶液II，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。

(5)加入300μL预冷的溶液III，颠倒混匀液体，置冰块表面5min，12000rpm离心5min，上清转入另一只离心管中。

(6)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。

(7)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。

(8)沉淀用70％乙醇洗2次，倒置干燥。

(9)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测后，置于-20℃保存。

4.Pooling-PCR筛选基因组文库

采用96深孔板(2.2mL)培养单克隆，将每一深孔板所培养的克隆作为一个Super Pool，再将此Super Pool分为6个Matrix Pool，提取Super Pool质粒，以基因组DNA作为阳性对照，水作为阴性对照。

PCR反应程序为：95℃4min；94℃1min，55℃45s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应体系为：ddH₂O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL₂(4μL)，dNTP(4μL)，PELSP199(1μL)，PELASP638(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。

取10μL反应产物电泳，确定含有目基因单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。借助NCBI中的BLAST程序对获得基因全长进行同源序列比较，确定目的基因。根据基因全长序列推测获得相应的氨基酸序列，推算目的基因编码的蛋白质分子量，约为44kDa。

实施列3(基因表达与蛋白纯化)

1.Pcpel 1基因成熟肽序列分离

(1)根据已获得的Pcpel 1基因全长DNA序列，以参试辣椒疫霉菌的RNA为摸板进行RT-PCR扩增，获得其cDNA全长。

(2)根据其cDNA全长，设计表达引物，去除信号肽序列和3’、5’非编码区序列，并在上游引物PLGSP1：(其序列如Seq ID No：5所示)引入EcoR I酶切位点和组氨酸标签，下游引物PLGSP2：(其序列如Seq ID No：6所示)引入Not I酶切位点，扩增产物含Pcpel 1基因编码的成熟蛋白序列。

反应体系为50μL：扩增Pcpel 1基因全长获得cDNA模板(2μL)，5×Prime STARTMBuffer(Mg²⁺Plus)(10μL)，dNTP(4μL)，PLGSP1(1μL)，PLGSP2(1μL)，Prime STARTM HS DNA Ploymera se(0.5μL)，ddH₂O(31.5μL)。

PCR反应程序为：94℃4min；98℃10s，68℃1min，共30个循环。

取10μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，送上海博亚生物有限公司测序，获得Pcpel1基因表达序列，然后目的基因回收连接与pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选、质粒DNA酶切鉴定，筛选阳性克隆质粒pGEM-T/Pcpel1。

2.Pcpel 1基因毕赤酵母表达

2.1酵母表达载体的构建

(1)EcoR I和Not I双酶切pGEM-T/Pcpel 1质粒，回收插入片断。

(2)与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5α。

(3)转化后的DH5α经Amp抗性筛选，获得菌落经37℃摇培过夜提取质粒。

(4)重组质粒pPIC9K/Pcpel 1酶切及测序鉴定。

2.2重组表达载体线性化

用Sal I限制性内切酶(位于5’AOX1区域)进行线性化酶切，以获得GS115 His⁺Mut⁺表型转化子，反应体系为：

(1)取质粒pPIC9K/Pcpel 110μL(10-20μg)，加入5μL 10X H buffer，再加入SalI 3μL。

(2)加ddH ₂O 22μL，总体积为40μL(空载体pPIC9K线性化反应体系相同)。

(3)37℃反应4h后，取少量反应液电泳检测酶切效果。

(4)酶切完成后，将线性化载体DNA电泳，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收并纯化目的片断，-20℃保存以备转化。

2.3酵母转化

2.3.1毕赤酵母GS115感受态细胞制备

(1)接种毕赤酵母GS115于3mL YPD液体培养基，30℃振荡培养过夜，然后取1mL于50mL YPD液体培养基，30℃，振荡培养16-18h，OD600＝1.3-1.5，4℃，3400rpm离心5min。

(2)用50mL冰冷无菌水重悬细胞，然后用25mL冰冷无菌水重悬细胞，同上离心。

(3)用5mL冰冷的1M山梨醇重悬细胞，同上离心。

(4)同上离心，用0.5mL冰冷的1M山梨醇重悬细胞，终体积大为1.5mL，制备感受态细胞，用于转化。

2.3.2重组表达载体pPIC9K/Pcpel 1转化感受态细胞

(1)取80μL酵母感受态细胞与5-20μg线性化重组表达载体(溶于5-10μL TE)(空载体做对照)。

(2)将样品加入预冷的0.2cm电转杯，冰浴5min后电专。

(3)加入1mL 1mol/L冰冷的山梨醇于电转杯，后转至一个新离心管中。

(4)将转化后的酵母菌于30℃下放置1-2h。

(5)取200-600μL菌液涂于MD平板上，30℃倒置培养2-3d，检测转化子后，进行Mut⁺/Mut^s表型筛选。

2.3.3酵母转化子筛选与鉴定

2.3.3.1酵母转化子甲醇利用表型平板筛选

(1)酵母转化子对应接种于MD和MM平板。

(2)30℃培养2-4d，测定菌落大小及数量。

(3)入选均能在MD和MM平板正常生长的酵母转化子，然后用PCR鉴定阳性克隆。

2.3.3.2酵母转化子基因组DNA提取

(1)取酵母细胞，12000rpm离心1min，吸除上清。

(2)加入600μl山梨醇buffer，加入大约50μl Lyt icase，充分混匀，30℃/30min，4000rpm离心10min，弃上清，破除酵母细胞壁。

(3)加入200μl缓冲液重悬沉淀，充分混匀。

(4)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

(5)加入220μl GB缓冲液，充分混匀，70℃放置10min，离心除去管盖内壁水珠。

(6)加入220μl无水乙醇，充分混匀，离心除去管盖内壁水珠。

(7)再加入一个吸附柱于CB2中，12000rpm离心30s，倒掉废液，然后将吸附柱放入收集管中。

(8)向吸附柱中分别加入500μl、700μl GD缓冲液，分别12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(9)12000rpm离心2min，倒掉废液，置于室温数分钟晾干。

(10)将吸附柱转入新离心管中，滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，收集至离心管中。

2.3.3.3pPIC9K AOX1通用引物鉴定

反应体系50μL：

(1)加入AOX1通用引物：5’AOX11μL，3’AOX1 1μL；

(2)加入10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL。

(3)加入MgCl₂(25mmol/L)4μL。

(4)dNTP混合(2.5mmol/Leach)4μL。

(5)重组酵母基因组DNA 5μL。

(6)Tap聚合酶(5U/μL)0.5μL。

(7)ddH₂O 29.5μL。

扩增反应条件：95℃4min；94℃1min，54℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min，取10μL PCR产物检测。

2.3.3.4Pcpel 1基因特异性引物鉴定

反应体系：

(1)加Pcpel 1基因特异引物PLSP(其序列如Seq ID No：7所示)，(20μmol/L)和PLASP：(其序列如Seq ID No：8所示).(20μmol/L)各1μL。

(2)加10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL。

(3)加MgCl₂(25mmol/L)4μL。

(4)加dNTP混合(2.5mmol/Leach)4μL。

(5)加重组酵母基因组DNA 5μL。

(6)加Tap聚合酶(5U/μL)0.5μL。

(7)加ddH₂O 29.5μL。

扩增反应条件：94℃4min；94℃1min，63℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min，取样1.0％琼脂糖电泳检测。

2.3.3.5外源基因多拷贝转化子筛选

(1)制备适量YPD培养基，加入适当体积的100mg/mLG418贮备液，混匀铺制平板，制备含不同浓度的G418(0mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1.00mg/mL，2.00mg/mL，4.00mg/mL)的YPD平板。

(2)吸取2mL无菌水至每个含有His⁺转化子的MD平板，用无菌涂布器刮取菌落，将菌体重悬于灭菌水中。

(3)菌悬液混合后，转至50mL无菌离心管中，涡漩振荡5-10s，分光光度计测定细胞浓度。

(4)分别取1×105个菌体细胞涂布于已制备的含不同G418浓度YPD平板。

(5)30℃培养2-5d后，挑取对G418最高浓度具有抗性的菌落于YPD平板划线纯化，作为果胶裂解酶诱导表达待选菌株。

2.4酵母转化子培养和果胶裂解酶诱导表达

(1)挑取对G418具最高抗性水平的阳性菌落，接种于盛有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，28-30℃振荡培养(250-300rpm)16-18h，至生长对数期，转化pPIC9K空载体GS115菌株为对照。

(2)5000rpm离心5min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，OD600值达1.0。

(3)将培养液置于500ml摇瓶中，28-30℃摇床震荡培养。

(4)间隔24h补加100％甲醇至终浓度0.5％，维持诱导。

(5)间隔24h取样一次，至168h，每次取诱导培养液1mL于1.5mL离心管中，最大转速离心2-3min，取上清液和细胞沉淀均冻存于-70℃冰柜中。

(6)表达产物SDS-PAGE分析，然后利用DNS法测定诱导表达的果胶裂解酶酶活性。

2.5果胶裂解酶融合蛋白纯化

2.5.1蛋白样品的制备

(1)收集诱导表达的酵母转化子培养物，6000rpm离心30min，弃沉淀，取上清。

(2)将上清液按照60％的饱和度加入(NH₄)₂SO₄沉淀果胶裂解酶，8000rpm离心30min，收集沉淀。

(3)沉淀用8ml Native Binding Buffer重新悬浮后，透析过夜弃除盐离子，透析产物即待纯化的蛋白样品。

2.5.2蛋白纯化步骤

2.5.2.1Ni-NTA凝胶纯化柱准备

(1)吸取1.5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中，轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

(2)加入6ml双蒸水，重新悬浮树脂。

(3)轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

(4)加入6ml Native Binding Buffer，重新悬浮树脂。

(5)重复步骤3三次。

(6)重复步骤4-5三次。

2.5.2.2果胶裂解酶纯化

(1)取可溶性蛋白8ml加入Ni-NTA柱中。

(2)轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮，吸附30-60min，去掉上清。

(3)用8ml Native Wash Buffer冲洗，使树脂沉淀至柱子底部，去掉上清。

(4)重复步骤3三次。

(5)用8-12ml Native Elution Buffer洗脱蛋白。

(6)重复步骤5一次，收集洗脱样品，取1ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。

(7)将洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，获得纯的融合蛋白，SDS-PAGE分析后，按照上述方法测定纯化蛋白的活性。

实施列4(Pcpel 1基因于辣椒疫病叶内转录表达水平的RT-PCR和Northern Blot检测)

1.参试辣椒疫霉菌接种辣椒叶片

(1)参试辣椒疫霉菌于OMA基质上培养7d。

(2)利用Petri溶液诱导产生孢子囊，4℃处理30min诱导产生游动孢子，配制成浓度为1×10⁵/ml游动孢子悬浮液。

(3)悬滴法接种辣椒叶片，观察病害症状。

2.辣椒病叶总RNA提取与cDNA合成

(1)接种1d、3d、5d、7d的辣椒病叶经DEPC水处理后，分别取0.1g样品经液氮研磨，移入1ml Trizol溶液室温静置5min。

(2)加入0.2mL氯仿，充分混合混匀，4℃下12000rpm离心15min，吸取上清，重复一至多次。

(3)吸取上清，每1ml Trizol加入0.25倍异丙醇和0.25倍RNA沉淀剂，充分混匀，室温放置10min，4℃下12000rpm离心10min。

(4)收集RNA沉淀，用75％乙醇洗涤2次，重复离心。

(5)吸尽残余乙醇，或使残余乙醇挥发掉。

(6)加50-100μl DEPC处理水，将RNA溶液于-70℃下保存备用。

3.反转录合成cDNA第一链

(1)取1-2μg总RNA，加入ddH₂O至9.5μL，75℃变性5min，冰浴5min，稍微离心。

(2)加10X扩增缓冲液2μL。

(3)加10mmol/L dNTP混合液2μL。

(4)加25mmol/L MgCl₂ 4μL。

(5)加引物Oligo-dT 1μL。

(6)加RNA酶抑制剂0.5μL。

(7)加反转录酶M-MLV 1μL。

(8)反应总体系20μL。

(9)反应液混合后，室温放置10min，42℃温浴60min，85℃水浴放置10min。

(10)加入180μL ddH₂O混匀，稍微离心，-20℃下保存，设阴性对照3个分别是：①加入第一链cDNA反应所需的所有试剂，不加模板RNA；②加除反转录酶外的所有试剂；③加除引物外的所有试剂。

4.RT-PCR

反应体系：(1)加双蒸水32.5μL，10×buffer 5μL，加MgCL₂ 4μL，dNTP 4μL，引物RT-PF(其序列如Seq ID No：9所示)1μL，RT-PR(其序列如Seq ID No：10所示)1μL，cDNA2μL，TaqE 0.5μL。

扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，取10μL PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测。

β-actin参比体系同上，引物为：β-actinF(其序列如Seq ID No：11所示)；β-actinR(其序列如Seq ID No：12所示)。

β-actin扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，经1％琼脂糖凝胶电泳分析。

5.Northern Blot

5.1辣椒病叶总RNA提取方法同上

5.2DIG-DNA探针标记制备

(1)在一离心管中加入1μg RT-PCR扩增产物于灭菌的双蒸水中至终体积为16μL。

(2)沸水浴10min，迅速置于冰浴冷却，变性DNA。

(3)充分摇匀DIG-High Prime，加4μL于变性DNA溶液中，混合并短暂离心。

(4)37℃温浴1h或过夜。

(5)加2μL 0.2M EDTA(pH8.0)或65℃温浴10min以终止反应。

5.3RNA转移与固定

5.3.1凝胶制备

(1)取0.72g琼脂糖溶于56.7ml的MOPS中，加热融解后冷却至60℃左右，加入37％甲醛溶液3.3ml于制胶盒中冷却。

(2)取30μL RNA加入等体积上样缓冲液中混匀。

(3)65℃温育15min后，立即放入冰浴中冷却，离心5s。

(4)加样前，将凝胶预电泳5min，随后将样品加至凝胶加样孔。

(5)将凝胶浸入1X甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4V/cm电压电泳。

(6)电泳后取出凝胶，用DEPC处理水淋洗数次，每次3min。

(7)将凝胶在20×SSC中浸泡两次，每次15min，除去凝胶中的甲醛。

(8)将尼龙膜在20×SSC中浸泡30min。

(9)利用虹吸式转膜法转膜过夜。

(10)转膜后，用2XSSC于室温下泡膜5-10min，夹于两层滤纸间晾干，然后80℃下烤2h固定RNA。

5.3.2分子杂交

(1)预热适当体积的DIG Easy Hyb(10mL/10cm2膜)至68℃，在杂交管中轻轻摇动膜预杂交30min。

(2)煮沸地高辛一标记DNA探针5min，快速冰/水浴冷却，使之变性(大约25ng/mL DIG EasyI-Iyb)。

(3)加变性地高辛标记DNA探针至预热的DIG Easy Hyb(3.5mL/100cm2)膜中，充分混匀并避免产生泡沫。

(4)倒掉预杂交液，把探针/杂交混合液加至膜上，在杂交炉中，68℃温育4h或过夜，并温和摇动。

5.3.3免疫学检测

(1)分别用2X SSC和0.5X SSC洗膜，每次5min后，再在清洗缓冲液中冲洗尼龙膜1-5min。

(2)在100mL封闭溶液中温育30min。

(3)在20mL抗体溶液中温育30min。

(4)在100mL漂洗缓冲液中洗15min。

(5)在20mL检测缓冲液中平衡2-5min。

(6)膜上滴加显影液，15-25℃温育5min后，37℃温育湿膜10min。

(7)X光片于5-25℃显影15-25min。

实施列5(Pcpel 1基因在辣椒疫病病叶内翻译表达水平的Western Blot检测)

1、辣椒疫病病叶总RNA提取方法同上

2、Pcpel 1基因表达蛋白特异抗血清制备

(1)将制备的Pcpel 1基因表达纯化蛋白稀释至1mg/mL，制成抗原液。

(2)取适量纯化蛋白按1∶1比例加入弗氏不完全佐剂进行乳化，乳化45min左右，制备约含有500μg/mL表达产物的抗原油乳剂。

(3)取一只健康家兔用乳化的Pcpel1基因表达蛋白进行免疫，连续免疫3次，每次免疫间隔时间为1周，1周后进行第4次免疫，两周后取血。

(4)将血样放置于4℃冰柜，过夜沉淀，然后吸取适量血清。

(5)利用琼脂扩散方法检测制备的血清效价和专化性。

3、Western Blot

3.1SDS-PAGE电泳分析同上。

3.2电转移步骤

(1)切取与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜(NC膜)于甲醇中浸泡30min，使膜至半透明。

(2)滤纸和海绵浸泡于电转缓冲液PBST(100mL的PBS缓冲液中加入Tween-2050ul混合均匀)中至使用。

(3)采用电转化液(25mM Tris pH8.0，192mM甘氨酸，20％甲醇)进行转化。

(4)转化过程，先用100V电压150mA电流转移1-2h，然后用100V电压240mA电流转化30min。

(5)SDS-PAGE电泳后，将凝胶置于双蒸水中清洗2次。

(6)按照海绵垫，滤纸，凝胶，NC膜，滤纸，海绵垫的顺序，将凝胶固定于电转移仪上，加入1.5L电转缓冲液。

(7)按照凝胶为负极，NC膜为阳极的顺序电泳，电转反应在4℃下进行。

3.2融合蛋白与一抗结合步骤

(1)取NC膜浸泡于15ml阻断缓冲液(PBST缓冲液中加入脱脂奶粉，加入比例为w/v＝5∶100)，然后水平缓慢振荡1-2h。

(2)用25ml PBST缓冲液洗脱表面封闭液3次，每次洗脱5min。

(3)将膜转至含一抗的溶液中，一抗配置参照其效价，按照1∶1000比例与阻断缓冲液均匀混合，然后水平缓慢振荡2-3h。

(4)用20ml电转缓冲液洗脱NC膜，每次5min。

3.3二抗结合与显色

(1)含有一抗的NC膜转至二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)溶液中(二抗溶液用阻断缓冲液按照1∶200比例稀释)，室温缓慢摇动2-3h。

(2)用电转缓冲液20ml洗脱3-4次，每次5min，并将膜转至黑暗处。

(3)按照北京希凯公司提供的DAB显色试剂盒进行显色操作，将膜转至其中，黑暗条件下显色5-20min。

(4)待蛋白条带显色清晰时，用20ml ddH2O终止反应，然后用数码相机或凝胶成像系统照相。

实施列6(Pcpel 1基因表达纯化蛋白对辣椒叶片的破坏作用和细胞壁降解)

1、Pcpel 1基因表达纯化蛋白接种辣椒叶片操作

(1)将Pcpel 1基因表达纯化蛋白稀释至浓度为700μg/mL。

(2)利用针刺法，将适宜浓度的表达纯化蛋白接种于4-6叶期的辣椒叶片。

(3)采用同样接种方法，将辣椒疫霉游动孢子悬浮液(浓度为1×10⁵)、700μg/mL的钝化蛋白、无菌水接种于同时期的健康辣椒叶片。

结果表达纯化蛋白对辣椒叶片具明显的破坏作用，导致接种叶片坏死、皱缩，而经钝化后的蛋白与无菌水一致，对辣椒叶片几乎无任何破坏作用。

2、Pcpel 1基因表达纯化蛋白对辣椒叶片的破坏症状及降解细胞壁的透射电镜观察

2.1症状观察

(1)接种蛋白的辣椒叶片症状观察。

(2)接种游动孢子的辣椒叶片症状观察。

(3)阳性、阴性对照辣椒叶片症状观察，综合比较Pcpel 1基因表达纯化蛋白对辣椒叶片的破坏作用。

2.2透射电镜观察

(1)取样和固定：蛋白接种辣椒叶片1-7d期间，间隔24h取样一次，所取小块样品放入2.5％戊二醛溶液中，抽气，确保细胞迅速固定。

(2)脱水步骤：70％丙酮15min-80％丙酮14min-90％丙酮15min-100％丙酮2×10min，确保包埋介质完全渗入细胞内，将细胞内水分全部驱除。

(3)浸透和包埋步骤：将脱水处理的材料于环氧树脂和十二烷基琥珀酸酐浸透1d后，在多孔橡胶包埋模板中处理，然后于45℃烤箱内处理12h，再于60℃烤箱内处理36h使树脂聚合硬化，形成包埋块。

(4)切片及染色

①修块：将包埋块夹于夹持器中，解剖镜下将组织置于45度角度，除去包埋剂，并修成椎体形。

②半薄切片定位：利用超薄切片机将处理材料切制成厚度为1-1μm的切片，然后用小毛刷移置于载玻片上，加温使切片展平，待干燥后，用甲苯胺蓝染色，然后光学显微镜观察定位。

③超薄切片：用自动切片机将切片切制后，放置于载网膜上。

④染色：用醋酸铀对超薄切片染色。

(5)电镜观察、照相

①观察：将制作完备的超薄切片于3万倍透射电镜下观察细胞壁的降解。

②照相：选择细胞壁被明显降解的材料进行照相。

<110>山东农业大学

<120>辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel1基因、蛋白的制备方法及其应用

<160>12

<210>1

<211>1233

<212>DNA

<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)…(63)

<221>CDS

<222>(1)…(1233)

<400>

atg gca cga ctt cag ttc ctt ttc gct gct gcc gtg gcg ctc gtg gct 48

MET Ala Arg Leu Gln Phe Leu Phe Ala Ala Ala Val Ala Leu Val Ala

1 5 10 15

cag tca gca acc gcc atc acg atc ggt tct cct tct ggt ttg gcc acg 96

Gln Ser Ala Thr Ala Ile Thr Ile Gly Ser Pro Ser Gly Leu Ala Thr

20 25 30

gga act acc ggc ggt ggc gac gct gct ccg gtg tat ccg aag acc acg 144

Gly Thr Thr Gly Gly Gly Asp Ala Ala Pro Val Tyr Pro Lys Thr Thr

35 40 45

aaa gag ctg gtt gcg ctc ctg aga gac ccc gcg ccc cag gtg gtt atc 192

Lys Glu Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp Pro Ala Pro Gln Val Val Ile

50 55 60

ctc aac acg acc ttc gac ttc cgt acg ctg gag ggc aac aca acc gcc 240

Leu Asn Thr Thr Phe Asp Phe Arg Thr Leu Glu Gly Asn Thr Thr Ala

65 70 75 80

gag gga tgt cgc cca gat tac atg cgc aag tgc atc gag ctc aac aat 288

Glu Gly Cys Arg Pro Asp Tyr Met Arg Lys Cys Ile Glu Leu Asn Asn

85 90 95

ggc ttc aaa agc cag gac gtc att ctc cag gac gga gga atg agc aac 336

Gly Phe Lys Ser Gln Asp Val Ile Leu Gln Asp Gly Gly Met Ser Asn

100 105 110

acg ggc ggg tgc acc aat ggc gtc agc gtc aac gtc acc tac gac aac 384

Thr Gly Gly Cys Thr Asn Gly Val Ser Val Asn Val Thr Tyr Asp Asn

115 120 125

gcg ccg ttc aac cgc ctg aac gtc cga agc aac aaa acg atc cgc ggt 432

Ala Pro Phe Asn Arg Leu Asn Val Arg Ser Asn Lys Thr Ile Arg Gly

130 135 140

gtt ggt caa agc gga gtg atc atg ggc aag gga ctc gcg ctc aac ggc 480

Val Gly Gln Ser Gly Val Ile Met Gly Lys Gly Leu Ala Leu Asn Gly

145 150 155 160

gac aac atc atc gtg cag aac atc cac atc acc gaa atc aac ccg cac 528

Asp Asn Ile Ile Val Gln Asn Ile His Ile Thr Glu Ile Asn Pro His

165 170 175

ctc gtg tgg ggt gga gac gcc att acg atc cag ggg ctc acg gac ggc 576

Leu Val Trp Gly Gly Asp Ala Ile Thr Ile Gln Gly Leu Thr Asp Gly

180 185 190

acg gtg ccg ttg aag cac att tgg ctc gac cat atc aag atc tcc cgc 624

Thr Val Pro Leu Lys His Ile Trp Leu Asp His Ile Lys Ile Ser Arg

195 200 205

atc ggc cgc cag ttc atc gca gtg gac aag gct gga gct tct act atg 672

Ile Gly Arg Gln Phe Ile Ala Val Asp Lys Ala Gly Ala Ser Thr Met

210 215 220

acc atc agc aac tcg gac ttc gat gga cac acc gag ttc tcc aag acg 720

Thr Ile Ser Asn Ser Asp Phe Asp Gly His Thr Glu Phe Ser Lys Thr

225 230 235 240

tgc gat ggt cat cac tac tgg agc ttc ctg ctc tat ggt agg tac acg 768

Cys Asp Gly His His Tyr Trp Ser Phe Leu Leu Tyr Gly Arg Tyr Thr

245 250 255

ggc att agt atg gtg aac aac tac atc cac tac ctg tcc ggt cgt ctc 816

Gly Ile Ser Met Val Asn Asn Tyr Ile His Tyr Leu Ser Gly Arg Leu

260 265 270

ccg aag gtt ggt ggc acg gcg gac agc aac gtg gtc acg cac att gcc 864

Pro Lys Val Gly Gly Thr Ala Asp Ser Asn Val Val Thr His Ile Ala

275 280 285

aac aat ttc tac aag gac aac tcg tac cac tcg atg gag atc ggc acc 912

Asn Asn Phe Tyr Lys Asp Asn Ser Tyr His Ser Met Glu Ile Gly Thr

290 295 300

aac gcc tac gtc ctc gct gag gga aac tac ttc gtc aac acg act aag 960

Asn Ala Tyr Val Leu Ala Glu Gly Asn Tyr Phe Val Asn Thr Thr Lys

305 310 315 320

cca ctc tac gac gga gac gac ccg gac gtt ccc ggt atg act gac ggg 1008

Pro Leu Tyr Asp Gly Asp Asp Pro Asp Val Pro Gly Met Thr Asp Gly

325 330 335

tct atc tac gca cca ctg gag tca tcg gaa gac gag tgc aag gct caa 1056

Ser Ile Tyr Ala Pro Leu Glu Ser Ser Glu Asp Glu Cys Lys Ala Gln

340 345 350

ctg gga cgt ccg tgt gta gcg aac gtc ctg gaa ggc agc gga ccc ttt 1104

Leu Gly Arg Pro Cys Val Ala Asn Val Leu Glu Gly Ser Gly Pro Phe

355 360 365

ggc tcg cgc aac ggc act acc gct ctc gcc aag gtc aag ccg cac cct 1152

Gly Ser Arg Asn Gly Thr Thr Ala Leu Ala Lys Val Lys Pro His Pro

370 375 380

acc atc gcc cgc cac gca ccg aag caa gcc cag cag ttg aag tta tcg 1200

Thr Ile Ala Arg His Ala Pro Lys Gln Ala Gln Gln Leu Lys Leu Ser

385 390 395 400

act ggc aac ttc ggt gtt ggt gac ctc gaa taa 1233

Thr Gly Asn Phe Gly Val Gly Asp Leu Glu ***

405 410

<210>2

<211>410

<212>PRT

<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)…(21)

<400>2

Met Ala Arg Leu Gln Phe Leu Phe Ala Ala Ala Val Ala Leu Val Ala

1 5 10 15

Gln Ser Ala Thr Ala Ile Thr Ile Gly Ser Pro Ser Gly Leu Ala Thr

20 25 30

Gly Thr Thr Gly Gly Gly Asp Ala Ala Pro Val Tyr Pro Lys Thr Thr

35 40 45

Lys Glu Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp Pro Ala Pro Gln Val Val Ile

50 55 60

Leu Asn Thr Thr Phe Asp Phe Arg Thr Leu Glu Gly Asn Thr Thr Ala

65 70 75 80

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85 90 95

Gly Phe Lys Ser Gln Asp Val Ile Leu Gln Asp Gly Gly Met Ser Asn

100 105 110

Thr Gly Gly Cys Thr Asn Gly Val Ser Val Asn Val Thr Tyr Asp Asn

115 120 125

Ala Pro Phe Asn Arg Leu Asn Val Arg Ser Asn Lys Thr Ile Arg Gly

130 135 140

Val Gly Gln Ser Gly Val Ile Met Gly Lys Gly Leu Ala Leu Asn Gly

145 150 155 160

Asp Asn Ile Ile Val Gln Asn Ile His Ile Thr Glu Ile Asn Pro His

165 170 175

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180 185 190

了hr Val Pro Leu Lys His Ile Trp Leu Asp His Ile Lys Ile Ser Arg

195 200 205

Ile Gly Arg Gln Phe Ile Ala Val Asp Lys Ala Gly Ala Ser Thr Met

210 215 220

Thr Ile Ser Asn Ser Asp Phe Asp Gly His Thr Glu Phe Ser Lys Thr

225 230 235 240

Cys Asp Gly His His Tyr Trp Ser Phe Leu Leu Tyr Gly Arg Tyr Thr

245 250 255

Gly Ile Ser Met Val Asn Asn Tyr Ile His Tyr Leu Ser Gly Arg Leu

260 265 270

Pro Lys Val Gly Gly Thr Ala Asp Ser Asn Val Val Thr His Ile Ala

275 280 285

Asn Asn Phe Tyr Lys Asp Asn Ser Tyr His Ser Met Glu Ile Gly Thr

290 295 300

Asn Ala Tyr Val Leu Ala Glu Gly Asn Tyr Phe Val Asn Thr Thr Lys

305 310 315 320

Pro Leu Tyr Asp Gly Asp Asp Pro Asp Val Pro Gly Met Thr Asp Gly

325 330 335

Ser Ile Tyr Ala Pro Leu Glu Ser Ser Glu Asp Glu Cys Lys Ala Gln

340 345 350

Leu Gly Arg Pro Cys Val Ala Asn Val Leu Glu Gly Ser Gly Pro Phe

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Thr Gly Asn Phe Gly Val Gly Asp Leu Glu ***

405 410

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a，c或t

<222>(3，27)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝t或c

<222>(4，6，24)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a，t，g或c

<222>(9)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝g或c

<222>(12，21)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a或c

<222>(15，18)

<400>3

ggnntngcng cnggnacnac nggnggngg 29

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a或g

<222>(9，21)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a，c或g

<222>(18)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝c或t

<222>(20，26)

<400>4

gtgatgtgna tgttctgnan natgangttg 30

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

actcgaattc caccaccacc accaccacga cgacgacgac aagatcacga tcggttctc 59

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acttgcggcc gcttattcga ggtcaccaac 30

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atcacgatcg gttctccttc tg 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttattcgagg tcaccaacac cg 22

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgaccttcga cttccgtac 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccgtgttgct cattcctcc 19

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ctgggacgac atggagaaga tc 22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cgctccgtca ggatcttcat c 21

Claims

1.一种辣椒疫霉菌果胶裂解酶Pcpel 1基因，其特征在于：该基因所编码的蛋白质具有导致辣椒叶片皱缩和坏死，并使叶片受害部位的细胞壁得到明显的降解，其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

2.一种辣椒疫霉菌果胶裂解酶Pcpel 1基因分离克隆及其蛋白质制备方法，其步骤如下：

1)Pcpel 1基因分离克隆的具体步骤：

A：采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂建议构建基因组DNA文库，将大小为1.5Kb-3.0Kb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定文库质量；

B：根据已报道植物、细菌、真菌的果胶裂解酶基因保守序列，设计简并引物PELSP199，其序列如Seq ID No：3所示，和PELASP638，其序列如Seq ID No：4所示，利用Pooling-PCR技术筛选DNA文库，阳性克隆测序得到基因全长序列；

2)制备蛋白质的具体步骤：

A：Pcpel1基因酵母表达载体构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中；

B：将上述重组表达载体线性化后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子甲醇利用表型平板筛选；

C：酵母转化子培养和果胶裂解酶甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、SDS-PAGE分析，果胶裂解酶的纯化；

其中所述的Pcpel 1基因，其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种由Pcpel1基因编码的蛋白质，应用于对接种辣椒叶片破坏和叶片受害部位细胞壁的降解效果检测，所述的Pcpel 1基因，其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。