CN102676489B

CN102676489B - 来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶pcpel16及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102676489B
Application number: CN 201210140735
Authority: CN
Inventors: 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-05-08
Also published as: CN102676489A

Abstract

本发明公开了来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶PCPEL16及其编码基因与应用。本发明所提供的果胶裂解酶PCPEL16，是如下a）或b）或c）的蛋白质：a）由序列表中序列2第23-441位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第23-441位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶裂解酶活性的由a）衍生的蛋白质。果胶裂解酶PCPEL16具有较高的酶活性，其比活力达28±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中。

Description

来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶PCPEL16及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种果胶裂解酶及其编码基因与应用，特别涉及来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶及其编码基因与应用。

背景技术

辣椒疫病（Pepper Phytophthora Blight）是在世界范围内普遍发生的一种毁灭性病害。引起该病的病原为Phytophthora capsici Leonian，属卵菌门(Oomycetes)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科（Pythiaceae），疫霉属(Phytophthora)。病原菌通常以菌丝体、厚垣孢子及卵孢子在病株残体、土壤内越冬，也可以在其它寄主植物上越冬，成为第二年初侵染源。条件适宜时，越冬后的病原随灌水、气流等传到寄主各部位，引起发病，进行再侵染。在发病季节，一般病株率为20%左右,严重的达到80%以上。近年来，随着辣椒在各主产区的连茬种植，病害有逐渐加重的趋势，危害较为显著。该病原菌除危害辣椒外，也可侵染番茄、茄子、黄瓜、西瓜、南瓜等作物，对生产威胁极大。

植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中比较重要的三类细胞壁降解酶为以下三种：

(1)聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)能分解半乳糖醛酸中的a-1,4糖苷键。

(2)果胶甲基酯酶(pectin methylesterase,PME)可促使果胶脱酯，生成果胶酸。

(3)果胶裂解酶(pectate lyase,PL)由β消去反应裂解a-1,4糖苷键，在反应产物的非还原端残基C-4和C-5之间产生一个双键。可裂解高度酯化的果胶，能迅速降低粘度。

上述三类细胞壁降解酶均属于果胶酶。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。果胶物质在自然界中分布非常广泛，它是植物体中一类复杂的，胶体性质糖类，是天然的高分子化合物，分子量约50000-300000。它是植物细胞壁的重要组成成分，主要存在于细胞壁的中间层，初生壁也有一部分，而次生壁则很少有果胶物质存在。

在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重的损失。辣椒疫霉病是一种重要的卵菌病害，能导致多种植物发生严重病害，深入开展辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici)果胶裂解酶基因分离及靶标基因编码的蛋白制作和功能分析具重要的实践意义，可以实现对于植物病原卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究。而且，果胶裂解酶可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中，果胶裂解酶可用于增加果汁的产量，便于加压和过滤，而且可以提高果汁和酒的透明度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种果胶裂解酶。

本发明所提供的果胶裂解酶，名称为PCPEL16，来源于辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici)SD33，是如下a）或b）或c）的蛋白质：

a）由序列表中序列2第23-441位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第23-441位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶裂解酶活性的由a）衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由441个氨基酸残基组成，第1-22位氨基酸组成信号肽。a）所述的蛋白质是果胶裂解酶的成熟蛋白，b）所述的蛋白质是果胶裂解酶的前体蛋白。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（c）中的PCPEL16可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（c）中的PCPEL16的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至1326位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第67-1326位核苷酸的DNA分子；

2）其编码序列是序列表中序列1的第1-1326位核苷酸的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码上述果胶裂解酶PCPEL16的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码上述果胶裂解酶PCPEL16的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5% SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由1326个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的表达盒；

2）含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的重组表达载体；

3）含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的重组微生物；

4）含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达果胶裂解酶PCPEL16的DNA，该DNA不但可包括启动果胶裂解酶PCPEL16基因转录的启动子，还可包括终止果胶裂解酶PCPEL16转录的终止子。进一步，所述含有果胶裂解酶PCPEL16表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pPIC9K的多克隆位点插入果胶裂解酶PCPEL16编码基因得到的重组表达载体。3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。其中，酵母可来巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明的又一个目的是提供一种制备果胶裂解酶PCPEL16的方法。

本发明所提供的制备果胶裂解酶PCPEL16的方法，包括将果胶裂解酶PCPEL16编码基因在生物细胞中进行表达得到果胶裂解酶的步骤；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

本发明的再一个目的是提供一种制备表达果胶裂解酶PCPEL16的重组微生物的方法。

本发明所提供的制备表达果胶裂解酶PCPEL16的重组微生物的方法，包括将果胶裂解酶PCPEL16的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达果胶裂解酶PCPEL16的重组微生物的步骤。

其中，所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。其中，酵母可来巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。

果胶裂解酶PCPEL16、编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子或含有编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子的生物材料在降解果胶中的应用，也属于本发明的保护范围。

扩增编码果胶裂解酶PCPEL16的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。如扩增序列1的第67-1326位核苷酸的引物对。

实验证明，果胶裂解酶PCPEL16可降解辣椒细胞壁。果胶裂解酶PCPEL16在降解植物细胞壁，如降解辣椒细胞壁中的应用也属于本发明的保护范围。

果胶裂解酶PCPEL16具有较高的酶活性，其比活力达28±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中。

附图说明

图1为pPIC9K-PCPEL16m/GS115表达产物的SDS-PAGE电泳。

左图中M为标准蛋白分子量，1为空载体pPIC9K/GS115表达产物，2-8为pPIC9K-PCPEL16m/GS115于1-7天表达产物。右图中M为标准蛋白分子量，1和2为PCPEL16表达纯化蛋白。

图2为pPIC9K-PCPEL1m/GS115表达产物的SDS-PAGE电泳。

左图中M为标准蛋白分子量，1为空载体pPIC9K/GS115表达产物，2-8为pPIC9K-PCPEL1m/GS115于1-7天表达产物。右图中M为标准蛋白分子量，1、2和3为PCPEL1表达纯化蛋白。

图3为果胶裂解酶PCPEL16接种辣椒叶片168小时的电镜照片。

图中A为PCPEL16对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B为钝化的PCPEL16对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示（阳性对照），C为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示（阴性对照）。

图4为果胶裂解酶PCPEL1接种辣椒叶片168小时的电镜照片。

图中A为PCPEL1对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B为钝化的PCPEL1对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示（阳性对照），C为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示（阴性对照）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、果胶裂解酶的制备

1．果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1的表达

1.1制备果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1的编码基因

本申请的发明人从辣椒疫霉(P.capsici)SD33（J.Phytopathol 157:585-591,2009)（山东农业大学）中发现了果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1基因。其中，果胶裂解酶PCPEL16基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码序列是序列1的第1-1326位，编码序列2的蛋白质；序列1的第1-66位编码由22个氨基酸残基组成的信号肽。PCPEL1基因核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码序列是序列3的第1-1233位；序列3的第1-63位编码由21个氨基酸残基组成的信号肽。

根据序列表中序列1所示的果胶裂解酶PCPEL16基因设计扩增序列表中序列2第23-441位的果胶裂解酶PCPEL16成熟蛋白的一对引物PCPEL16mF、PCPEL16mR，并在上下游引物两端分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。PCPEL16mF和PCPEL16mR扩增的序列是序列1的第67-1326位，PCPEL16mF的序列为：ccggaattccaccaccaccaccaccacactatcggttcgccctcc，PCPEL 16mR的序列为：atttgcggccgcctagtcgagcttaccgacgc。

根据序列表中序列3所示的果胶裂解酶PCPEL1基因设计扩增序列表中序列3第22-410位氨基酸残基所示的果胶裂解酶PCPEL1成熟蛋白的一对引物Pcpel1mF、Pcpel1mR，并在上下游引物两端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。Pcpel1mF和Pcpel1mR扩增的序列是序列3的第64-1233位核苷酸，Pcpel1mF的序列为：5’-actcgaattccaccaccaccaccaccacgacgacgacgacaagatcacgatcggttctc-3’），Pcpel1mR的序列为：5’-acttgcggccgcttattcgaggtcaccaac-3’。

以辣椒疫霉(P.capsici)SD33（J.Phytopathol 157:585-591,2009)（山东农业大学）的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用上述引物分别进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与pGEM-T Easy Vector（Promega）连接，并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，将含有序列1的第67-1326位的重组质粒命名为pGEM-PCPEL16m，将含有序列3的第64-1233位核苷酸的重组质粒命名为pGEM-PCPEL1m。

2.在巴斯德毕赤酵母中表达果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1

2.1制备表达载体及工程菌

将pGEM-PCPEL16m和pGEM-PCPEL1m分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，分别回收插入片段，并与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K（Invitrogen）进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化的JM109经Amp抗性筛选，菌落经37℃摇培过夜后抽提质粒，重组质粒用酶切及鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，将在pPIC9K载体的EcoRⅠ和NotⅠ位点之间定向插入序列1的第67-1326位的重组质粒命名为pPIC9K-PCPEL16m，将在pPIC9K载体的EcoRⅠ和NotⅠ位点之间定向插入序列3的第64-1233位核苷酸的重组质粒命名为pPIC9K-PCPEL1m。

将pPIC9K、pPIC9K-PCPEL16m和pPIC9K-PCPEL1m用SalⅠ限制性内切酶（位于HIS4区域内）进行线性化酶切，以获得GS115 His^＋Mut⁺表型转化子。将回收纯化目的片段采用电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115（Invitrogen）感受态细胞，筛选His⁺Mut⁺（即组氨酸快速利用型）的酵母重组子。以酵母转化子基因组DNA为模板，使用AOX1特征引物（5’AOX1 Primer:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′和3’AOX1 primer:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’）和上述基因特异性引物进行PCR扩增，将用PCPEL16mF和PCPEL16mR扩增得到约1200bp和用AOX1特征引物扩增得到约1700bp的pPIC9K-PCPEL16m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-PCPEL16m/GS115（PCPEL16基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中）。将用PCPEL1mF和PCPEL1mR扩增得到约1200bp和用AOX1特征引物扩增得到约1700bp的pPIC9K-PCPEL1m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-PCPEL1m/GS115（PCPEL1基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中）。将用AOX1特征引物扩增得到约500bp的转化pPIC9K的重组巴斯德毕赤酵母命名为pPIC9K/GS115（空载体对照）。

2.2酵母工程菌的培养和果胶裂解酶的诱导分泌表达

1）分别挑取pPIC9K-PCPEL16m/GS115、pPIC9K-PCPEL1m/GS115和pPIC9K/GS115菌落，接种于含25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，28-30℃振荡培养（250－300rpm）至对数生长期（OD₆₀₀达2-6，约16-18小时）。

2）室温下以3000g离心5min回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0（约100-200mL）。

3）将培养液置于1L摇瓶中，覆盖两层无菌纱布，置摇床中，28-30℃继续培养并开始诱导表达。

4）诱导表达起始后，每隔24小时补加100%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导。

5）诱导后，取诱导培养液1mL于1.5mL离心管中，室温下以最大转速离心2-3min，取上清液进行SDS-PAGE电泳（以不加甲醇诱导剂的质粒诱导的蛋白为对照）。

电泳结果如图1-2所示，表明pPIC9K-PCPEL16m/GS115经甲醇诱导后，在58.7kDa处有一条特异蛋白带，而空载体对照则无此带，说明PCPEL16基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达；pPIC9K-PCPEL1m/GS115经甲醇诱导后，在66kDa处有一条特异蛋白带，而空载体对照则无此带，说明PCPEL1基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达。

2.3果胶裂解酶纯化及酶活测定

其中，果胶裂解酶的纯化方法如下：

2.3.1蛋白样品的制备

按照步骤2.2中1）-4）的方法进行诱导表达，诱导168小时后取诱导培养液按照如下方法进行蛋白样品的制备。

(1)收集诱导培养液，6000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。

(2)将上清液按照60%的饱和度加入(NH₄)₂SO₄沉淀果胶裂解酶，8000rpm离心30min，收集沉淀。

(3)沉淀用8ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15）重新悬浮后，透析过夜弃除盐离子，透析产物即待纯化的蛋白样品。

2.3.2果胶裂解酶的纯化

2.3.2.1Ni-NTA凝胶纯化柱准备

(1)吸取1.5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中，轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

(2)加入6ml双蒸水，重新悬浮树脂。

(3)轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

(4)加入6ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15），重新悬浮树脂。

(5)连续重复步骤3三次。

(6)连续重复步骤4-5三次。

2.3.2.2果胶裂解酶纯化

(1)取可溶性蛋白8ml注入Ni-NTA柱中。

(2)轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮，吸附30-60min，去掉上清。

(3)用8ml Native Wash Buffer（Invitrogen R901-15）冲洗，使树脂沉淀至柱子底部，去掉上清。

(4)重复步骤3三次。

(5)用8-12ml Native Elution Buffer（Invitrogen R901-15）洗脱蛋白。

(6)重复步骤5一次，收集洗脱样品，取1ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。

(7)将洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，获得纯的果胶裂解酶的酶液。

2.3.3果胶裂解酶的酶活测定

其中，果胶裂解酶酶活分析方法如下：

酶液利用BCA蛋白质定量试剂盒定量测定蛋白质含量。

果胶裂解酶能够催化果胶产生4，5-不饱和双键，引起235nm处吸光值增加，本实验采用分光光度计测定235nm处吸光值增加的方法果胶裂解酶的活性：取2ml缓冲液配置的质量百分含量为0.5%果胶溶液（Solarbio P9135-25g）（0.15M柠檬酸-磷酸缓冲液，0.75mM Ca²⁺，pH=6.0）于试管中，40℃平衡5min，加入待测酶液0.5ml，40℃水浴10min，加入0.25ml 50mM HCl充分混匀终止反应，测235nm处吸光值。用热灭活的酶液作为空白对照。以每分钟分解果胶使235nm处吸光值增加1.0所需要的酶量作为1个果胶裂解酶的活力单位。

实验设三次重复。结果表明由pPIC9K-PCPEL16m/GS115表达的果胶裂解酶PCPEL16的酶活力为28±0.2U/mg蛋白，pPIC9K-PCPEL1m/GS115表达的果胶裂解酶PCPEL1的酶活力为15±0.2U/mg蛋白。pPIC9K/GS115的表达产物中没有果胶裂解酶活性。

实施例2、果胶裂解酶对辣椒叶片细胞壁的降解

将实施例1中纯化的果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1采用针刺法接种辣椒叶片。具体方法如下：取4-6叶期中椒6号辣椒苗，采用针刺法接种辣椒叶片，PCPEL16和PCPEL1的接种浓度均为700ug/mL。同时以无菌水接种和钝化的PCPEL16和PCPEL1作为对照。蛋白接种辣椒叶片1-7天期间，间隔24小时取样一次，进行透射电镜观察细胞壁降解情况。其中，钝化的PCPEL16和PCPEL1按照如下方法获得：将实施例1中纯化果胶裂解酶PCPEL16和PCPEL1经热水煮沸5min后用于活性检测。

果胶裂解酶PCPEL16在接种168小时时将辣椒叶片细胞壁降解至接近全部破裂的程度，钝化的PCPEL16和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用（图3）；果胶裂解酶PCPEL1在接种168小时时对辣椒叶片细胞壁降解程度明显较轻，只对辣椒叶片细胞壁轻微降解，钝化的PCPEL1和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用（图4）。