CN103703079B

CN103703079B - 核-壳微球

Info

Publication number: CN103703079B
Application number: CN201280036962.1A
Authority: CN
Inventors: J·Y·英; S·佩克; 派马克尔恩·皮塔克马诺罗姆; 西提·萨哈拉·穆哈默德
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: EP2718374A1; US9155707B2; US20140199381A1; WO2012169972A1; EP2718374A4; CN103703079A

Abstract

本说明书描述了一种包含多个微粒的物质。该微粒包括包含第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳，其中第二聚合物降解得比第一聚合物慢。本说明书还描述了用于制备该微粒的方法以及该微粒的用途。

Description

核-壳微球

领域

本发明涉及核-壳微球、其制备方法及其用途。本申请要求第61/495,328号美国临时申请的优先权，该申请的全部内容通过交叉引用并入本文中。

背景

在许多应用中，需要向介质受控的释放物质。过去一直通过将物质包封在颗粒中并且颗粒经过一段时间释放该物质的方式满足这种需要。精确控制向介质中释放物质的速率一直是一种挑战。更进一步的挑战是引入释放物质的延迟时段。例如，当需要一段时间使含有物质的颗粒到达期望的目的地从而在最有效的位置释放该物质时，这样的延迟时段是所期望的。对于在患者治疗方案的不同时间点上顺序递送多种活性物质中的每一种，或者对于多种不同激素的循环递送，这样的延迟时段也是所期望的。

本发明设计为至少部分地满足以上所述需要。

发明概述

本发明的各个方面阐述如下。

包含多个微粒的物质，所述微粒包括包含第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳，所述第二聚合物降解得比第一聚合物慢。在壳内的第一聚合物可以以连续通道的形式穿过所述壳。

段落[0005]中的物质，其中第二聚合物生物降解得比第一聚合物慢。

段落[0005]或[0006]中的物质，其中第二聚合物为半晶质的。

段落[0005]至[0007]中的任一段中的物质，其中第二聚合物的分子量为大约100kDa。

段落[0005]至[0007]中的任一段中的物质，其中第二聚合物的分子量为超过100kDa。

段落[0009]中的物质，其中第二聚合物的分子量为超过大约160kDa。

段落[0005]至[0010]中的任一段中的物质，其中第一聚合物的分子量为大约1到大约60kDa，例如大约7到大约24kDa。

段落[0005]至[0010]中的任一段中的物质，其中第一聚合物的分子量为大于约75kDa。

段落[0005]至[0012]中的任一段中的物质，其中微粒中第二聚合物与第一聚合物的重量比在大约1:1.25到大约2:1的范围内。

段落[0005]至[0012]中的任一段中的物质，其中微粒中第二聚合物与第一聚合物的重量比在大约1:1到大约1:1.25的范围内。

段落[0005]至[0014]中的任一段中的物质，其中第一聚合物的降解不产生有毒产物。

段落[0005]至[0015]中的任一段中的物质，其中第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

段落[0005]至[0016]中的任一段中的物质，其中第一聚合物在壳中以少于大约25wt%的量存在。

段落[0005]至[0017]中的任一段中的物质，其中第一聚合物和第二聚合物至少部分不互溶，任选地基本上不互溶。

段落[0018]中的物质，其中第一聚合物形成多个穿过壳的连续通道或途径(或者为多个穿过壳的连续通道或途径的形式)。

段落[0005]至[0019]中的任一段中的物质，其中核包含可释放材料。

段落[0020]中的物质，其中可释放材料为颗粒状的。

段落[0020]或[0021]中的物质，其中可释放材料吸附在核中的纳米颗粒上或吸附在其中、或既吸附在其上又吸附在其中。

段落[0022]中的物质，其中纳米颗粒为无机纳米颗粒。

段落[0023]中的物质，其中纳米颗粒包括磷灰石。

段落[0021]至[0024]中的任一段中的物质，其中第一聚合物和第二聚合物基本上不互溶并且第一聚合物形成多个穿过壳的连续通道并且其中纳米颗粒(如果存在)或可释放材料的颗粒(如果存在)小于该通道的直径。

段落[0020]至[0025]中的任一段中的物质，其中可释放材料为治疗性物质。

段落[0026]中的物质，其中治疗性物质为药物。

段落[0020]至[0027]中的任一段中的物质，其中可释放材料选自蛋白质、蛋白质片段、酶、DNA、DNA片段、RNA、RNA片段、多糖、激素、生长因子、非以上任一种的药物和它们的任何两种或更多种的混合物。

段落[0020]至[0028]中的任一段中的物质，其中可释放材料为亲水性的。

段落[0029]中的物质，其中可释放材料可以分散在水中或溶解在水中。

段落[0020]至[0028]中的任一段中的物质，其中可释放材料为疏水性的。

段落[0031]中的物质，其中可释放材料基本不溶于水。

段落[0005]至[0032]中的任一段中的物质，其中微粒分散在载体中。

段落[0033]中的物质，其中载体为水凝胶、膜或支架。

段落[0005]至[0033]中的任一段中的物质，其中微粒至少部分粘结在一起形成固体物质。

用于制备包含多个微粒的物质的方法，任选地用于制备段落[0005]至[0035]中的任一段中的物质，所述方法包括：将包含在第一溶剂中的第一聚合物的第一溶液与包含在第二溶剂中的第二聚合物的第二溶液合并，从而形成混合的聚合物溶液，所述第二聚合物降解得比第一聚合物慢并且第一聚合物和第二聚合物至少部分不互溶、任选地基本不互溶，并且所述第一溶剂和第二溶剂可相互混溶；在水性介质中乳化该混合的聚合物溶液以形成乳液，所述水性介质与第一溶剂和第二溶剂至少部分不互溶；将乳液老化一段足够长的时间以允许在乳液液滴中第一聚合物和第二聚合物至少部分分离，以形成包含第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳；以及除去第一溶剂和第二溶剂以形成作为水性悬浮液的该物质，其中每个微粒包括包含第一聚合物的核和包围在所述核周围且包含第一聚合物和第二聚合物的壳。

段落[0036]中的方法，其中第一溶剂和第二溶剂相同。

段落[0036]或[0037]中的方法，其中水性介质至少部分地被第一溶剂和/或第二溶剂饱和。

段落[0036]至[0038]中的任一段中的方法，其中水性介质包含乳化剂。

段落[0039]中的方法，其中乳化剂为甲基纤维素。

段落[0036]至[0040]中的任一段中的方法，其中第一溶液包含可释放材料，借此微粒的核包含所述可释放材料。

段落[0041]中的方法，其中可释放材料为颗粒状的。

段落[0041]或[0042]中的方法，其中可释放材料吸附在纳米颗粒上或吸附在其中，或既吸附在纳米颗粒上又吸附在其中。

段落[0041]至[0043]中的任一段中的方法，包括通过将前驱体溶液与可释放材料合并来制备第一溶液的步骤，所述前驱体溶液包含在第一溶剂中的第一聚合物。

段落[0041]至[0044]中的任一段中的方法，其中可释放材料与第一聚合物的重量比为小于1:1。

段落[0036]至[0045]中的任一段中的方法，其中第二聚合物为半晶质的。

段落[0036]至[0046]中的任一段中的方法，其中第二聚合物的分子量为大约100kDa。

段落[0036]至[0046]中的任一段中的方法，其中第二聚合物的分子量为超过100kDa。

段落[0048]中的方法，其中第二聚合物的分子量为超过大约160kDa。

段落[0036]至[0049]中的任一段中的方法，其中第一聚合物的分子量小于大约40kDa，任选地小于大约35kDa，任选地大约1kDa到大约40kDa，任选地大约3kDa到大约24kDa，任选地大约7kDa到大约24kDa。

段落[0036]至[0049]中的任一段中的方法，其中第一聚合物的分子量为大于约75kDa。

段落[0036]至[0051]中的任一段中的方法，其中在混合的聚合物溶液中第二聚合物与第一聚合物的重量比使得所述方法形成微粒，所述微粒包括包含第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳。

所述方法中，在混合的聚合物溶液中第二聚合物与第一聚合物的重量比在大约1:1.25到大约2:1的范围内。

段落[0053]中的方法，其中在混合的聚合物溶液中第二聚合物与第一聚合物的重量比在大约1:1到大约1:1.25的范围内。

段落[0036]至[0054]中的任一段中的方法，包括以下步骤：选择第一聚合物的分子量、第二聚合物的分子量以及第一聚合物与第二聚合物的比例中的至少一种，使得可释放材料（如果存在于微粒的核中）可以以所需的速率或在所需的延迟时段里从微粒中释放。

段落[0036]至[0055]中的任一段中的方法，其中第一聚合物的降解不产生有毒产物。

段落[0036]至[0056]中的任一段中的方法，其中第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

段落[0036]至[0057]中的任一段中的方法，其中在连续搅拌下实施老化步骤。

段落[0036]至[0058]中的任一段中的方法，其中溶剂萃取步骤与老化步骤至少部分地同时实施，借此老化和溶剂萃取步骤有足够的时间以允许在乳液液滴中第一聚合物与第二聚合物至少部分地分离，以便形成包含第一聚合物的核和包围在该核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳。

段落[0036]至[0059]中的任一段中的方法，其中第一溶剂和第二溶剂与水性液体部分混溶，并且除去溶剂的步骤包括用水性液体稀释作为水性悬浮液的颗粒状物质，所述水性液体中既不含有第一溶剂也不含有第二溶剂。

段落[0036]至[0060]中的任一段中的方法，包括从水液中分离颗粒状物质。

段落[0061]中的方法，包括在模具中以足够的温度加热分离出的颗粒状物质足够的时间，使得微粒粘结在一起以便由颗粒状物质形成小球。

段落[0062]中的方法，其中足够的温度为第二聚合物的玻璃化转变温度。

段落[0062]或[0063]中的方法，其中第一溶液包含可释放材料并且该足够的温度低于所述可释放材料在该足够的时间内降解的温度。

用于向液体递送材料的方法，包括在能降解第一聚合物的降解剂的存在下将段落[0005]的物质暴露于所述液体，所述物质为其中微粒的核包含所述材料的物质。

段落[0065]中的方法，其中液体为降解剂或包含降解剂。

段落[0065]或[0066]中的方法，其用于非治疗、非诊断的目的。

段落[0065]或[0066]中的方法，其中所述材料为治疗性物质并且所述液体为体液，因此该方法用于将治疗性物质递送给患者。

段落[0068]中的方法，其中患者为非人类。

段落[0065]至[0069]中的任一段中的方法，其中所述物质的微粒粘结在一起。

根据段落[0020]的物质在治疗患者（任选非人类的患者）中的疾病状态的用途，其中可释放材料被指明用于治疗所述疾病状态。

根据段落[0071]的用途，其中所述疾病状态为疼痛并且可释放材料为止痛剂。

根据段落[0071]的物质的用途，其中所述疾病状态为青光眼，其中可释放材料被指明用于治疗青光眼。

根据段落[0073]的用途，其中可释放材料为酒石酸溴莫尼定(brimonidine)。

根据段落[0071]的用途，其中可释放材料为抗纤维化剂。

根据段落[0075]的用途，其中抗纤维化剂为氟尿嘧啶。

包含至少两种不同物质的组合物质，每种所述物质为根据段落[0005]到[0033]中的任一段中的物质，其中：每种物质的微粒的核包含可释放材料，并且不同物质的微粒的壳为使得它们在相同的条件下经过不同的时间降解，因此在不同物质的微粒中的可释放材料可以被顺序释放。

所述的组合物质，其中至少两种不同物质的可释放材料相同。

段落[0077]中的组合物质，其中每种不同物质的可释放材料与每种其他的不同物质的可释放材料不同。

段落[0077]至[0079]的任一段中的组合物质，其中不同物质的微粒的壳具有不同的厚度，使得它们在相同条件下经过不同的时间降解。

段落[0077]至[0080]的任一段中的组合物质，其中不同物质的微粒的第二聚合物的分子量不相同，使得不同物质的壳在相同条件下经过不同的时间降解。

段落[0077]至[0081]的任一段中的组合物质，其中每种不同物质的微粒的第一聚合物相同，并且每种不同物质的微粒的第二聚合物相同。

段落[0082]中的组合物质，其中第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

本发明的一些具体实施方案阐述如下。

包含多个微粒的物质，所述微粒包括包含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和聚(L-乳酸)(PLLA)的壳，其中所述核包含可释放材料。在该壳内的PLGA可以以通道的形式穿过所述壳。

包含多个微粒的物质，所述微粒包括包含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和聚(L-乳酸)(PLLA)的壳，其中所述核包含可释放材料，所述可释放材料为颗粒状的或吸附在该核中的无机纳米颗粒上、或吸附在其中、或既吸附在其上又吸附在其中。在该壳内的PLGA可以以通道的形式穿过所述壳。

包含至少两种不同物质的组合物质，每种所述物质包含多个微粒，所述微粒包括包含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的核和包围在所述核周围且包含PLGA和聚(L-乳酸)(PLLA)的壳，其中该核包含可释放材料，其中不同物质的微粒的壳为使得它们在相同的条件下经过不同的时间降解，因此在该不同物质的微粒中的可释放材料可以被顺序释放。

用于制备包含多个微粒的物质的方法，所述方法包括：将包含在DCM(二氯甲烷)或其它适合的溶剂如DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亚砜)、甲醇或其中任意一种或更多种与DCM的混合物中的聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的第一溶液，与包含在DCM或其它适合的溶剂如DMF、DMSO、甲醇或其中任意一种或更多种与DCM的混合物中的聚(L-乳酸)(PLLA)的第二溶液合并，以形成混合的聚合物溶液；将所述混合的聚合物溶液在水性介质中乳化以形成乳液，所述水性介质与第一溶剂和第二溶剂至少部分不互溶；将该乳液老化足够的时间以允许在乳液液滴中的PLGA和PLLA至少部分地分离，以便形成包含PLGA的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和PLLA的壳；以及除去DCM以形成作为水性悬浮液的该物质，其中每个微粒包括包含PLGA的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和PLLA的壳。

用于制备包含多个微粒的物质的方法，所述方法包括：将包含在DCM(二氯甲烷)中的聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和可释放材料的第一溶液与包含在DCM中的聚(L-乳酸)(PLLA)的第二溶液合并以形成混合的聚合物溶液，所述可释放材料为颗粒状的或吸附在无机纳米颗粒上、或吸附在其中、或既吸附在其上又吸附在其中；将所述混合的聚合物溶液在水性介质中乳化以形成乳液，所述水性介质与第一溶剂和第二溶剂至少部分不互溶；将该乳液老化足够的时间以允许在乳液液滴中的PLGA和PLLA至少部分地分离，以便形成包含PLGA的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和PLLA的壳；以及除去DCM以形成作为水性悬浮液的该物质，其中每个微粒包括包含PLGA的核和包围在所述核周围并且包含PLGA和PLLA的壳，所述核包含可释放材料，所述可释放材料为颗粒状的或吸附在该核中的无机纳米颗粒上、或吸附在其中、或即吸附在其上又吸附在其中。

附图说明

图1为说明药物释放的假定机理的图。

图2示出了使用核-壳PLLA-PLGA微球的酒石酸溴莫尼定（brimonidine,BT）药物释放曲线图，其中PLLA：PLGA的重量比为1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为7kDa(左)和24kDa(右)。图例中指明了负载在250mg的微球中的BT的量。7kDa的PLGA导致药物释放前的滞后时间为4天，而24kDa的PLGA导致药物释放前的滞后时间为25天。在图2中，左图中曲线的顺序从下到上为30mg、60mg、90mg和120mg，右图中曲线的顺序从下到上为5mg、15mg、30mg和60mg。

图3为说明允许吸附和递送蛋白质的负载在富含PLGA的核相内的额外的无机磷灰石纳米颗粒的图。

图4为说明联合递送药物和蛋白质的图。

图5示出了通过将具有不同滞后时间的核-壳微球结合的药物和/或蛋白质的长期释放(a)和脉动释放(b)的图。

图6为通过压紧获得的微粒的小球的照片。

图7为示出在水相中引入饱和的药物溶液以允许改善负载在微球上的药物负载的图。

图8为示出使用核-壳PLLA-PLGA微球的丁哌卡因(bupivacaine)体外释放的图，其中以PLLA：PLGA的重量比1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为7kDa(◆)和24kDa(■)合成PLLA-PLGA微球。

图9示出了将紧凑的微球插入左膝关节(a)和右膝关节(b)的空隙中的照片。

图10示出了随着丁哌卡因的体内释放滑液(■)和血浆(●)中的丁哌卡因的水平对时间的函数。阴影区域指明了缓解膝关节疼痛所需的药物治疗窗口。虚线表示血浆(4000ng/ml)中容许的药物毒性限度。

图11示出了第28天的膝关节的组织切片的照片。

图12示出了用核-壳PLLA-PLGA微球获得的BT释放的滞后时间和释放速率的图，其中以PLLA：PLGA的重量比1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为7kDa(a)和24kDa(b)合成PLLA-PLGA微球。图例中指明了负载在250mg的微球中的BT的量。在(a)中，获得了4天的滞后时间，接着在随后的8天里0.56mg/天的线性释放。在(b)中，获得了25天的滞后时间，接着在随后的18天里0.76mg/天的线性释放。在图12a中，曲线从下到上的顺序为30、60、90和120mg并且在图12b中，曲线从下到上的顺序为5、15、30和60mg。

图13示出了用核-壳PLLA-PLGA微球获得的BT释放的滞后时间和释放速率，其中以PLLA：PLGA的重量比1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为3.4kDa合成PLLA-PLGA微球。图例中指明了负载在250mg的微球中的BT的量。当使用3.4kDaPLGA时观察不到滞后时间，并且在第一个8小时内获得0.13mg/h的线性释放速率。在第一天中大部分BT都被释放了，随后释放速率下降到0.12mg/天。基于第一天后释放的BT的量(2.8mg)，计算得出发生在第一个21小时内的初始线性释放。在图13a中，曲线从下到上的顺序为30、60、90和120mg并且在图13b中，曲线从下到上的顺序为30、60和90mg，其中120mg与90mg的曲线几乎重合。

图14为示出了在兔子眼睛中的包封的微球的照片。核-壳PLLA-PLGA微球以PLLA：PLGA的重量比1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为24kDa所合成。这些微球负载有BT并且包封在明胶-HPA水凝胶载体中，并将其插入诱导患有青光眼病的兔子的眼睛里。

图15为示出了在植入BT-负载的核-壳PLLA-PLGA微球30天后在诱导患有青光眼病的兔子中IOP(眼内压)水平下降的图，其中以PLLA：PLGA的重量比1:1，PLLA为100kDa，并且PLGA为24kDa合成PLLA-PLGA微球。眼内压持续下降直到第50天，之后缓慢上升直到在第84天回到初始的青光眼IOP水平。微球被设计为体外滞后时间为25天，随后18天线性释放BT(参见图12b中的释放曲线)。正常兔子的IOP作为参照(◆)。

图16为第一聚合物溶解后本发明的颗粒的显微图像。

实施方案的描述

本发明涉及用于可调控的延迟释放例如药物、蛋白质和活性成分的核-壳聚合物/聚合物-无机微球。本技术提供了用于制备可以以延迟特性释放物质如药物、蛋白质和/或活性成分的微球的方法。以本技术方式，可以在物质以恒定速率释放之前指定一段滞后时间。因此，可以通过将具有不同滞后时间的各批微球结合实现长期持续地释放，使得当药物、蛋白质或活性成分已经完全(或部分地)从特定批次的微球中释放时，将有另一批次的微球准备开始释放这种或另一种药物、蛋白质或活性成分。

可以将这些微球加入载体如水凝胶、膜或支架中，以便将其植入所需的释放位置。当所有的药物、蛋白质或活性成分均已释放后，可以将这个载体替换。

众所周知，通常不同聚合物之间不能完全混溶(参见例如Kim,J.H.等人,Macromolecules2006,39,1297-1299,第1297页)。因此，聚合物的混合物通常会发生相分离。在本实例中，将两种不同的聚合物在溶液中的乳液液滴中合并。初始相分离提供了两个同心的相，内部(其变成核)富含第一聚合物而外部(其变成壳)富含第二聚合物。随着进一步发生相分离，被认为外部相形成第二聚合物的基质，该基质具有在第二聚合物基质中或贯穿第二聚合物基质的第一聚合物的途径或通道。一旦从液滴中收回或至少部分地收回溶剂，这些相就会固化，以便形成最终颗粒并且“冻住”最终结构。

如果将可释放材料，例如活性化合物如药物，提供给(例如负载到或合并入)第一聚合物，那么可以形成可释放材料位于颗粒的核中的层状颗粒。然后考虑通过将该颗粒放置在能降解所述第一聚合物的环境中而降解第一聚合物，以打开贯穿该壳的途径，通过该途径可释放材料可以被释放。

在本文中，术语“降解”和相关术语应采取其最广泛的意义。因此，这个术语可以指一个过程，通过该过程使得第一方法具有流动性或者转变成具有流动性的种类。这可以包括解聚或部分解聚、溶解、化学分解或某种其它方法。降解涉及使用颗粒或打算使用颗粒的环境，通常由该环境引发。因此如果颗粒将要释放可释放材料到工业液体中，那么第一聚合物可以被该液体或被其中的组分降解。例如，如果可释放材料将要被释放至酸性环境中，那么第一聚合物可以在酸性环境中降解。例如，如果可释放材料是碱，那么这可能是有用的，以便该颗粒可以用于阻止过度酸化。在另一个例子中，如果可释放材料将要被释放至生物液体(例如体内)中，那么第一聚合物可以为可生物降解的。在又一个例子中，第一聚合物可以为可光降解的，并且对颗粒的悬浮液进行辐照可以促进可释放材料的释放。辐照可以在专门适合第一聚合物的降解的波长下进行。因此，在具体的实施方式中，本发明提供用于向环境释放可释放材料的包含多个微粒的物质，所述微粒包括包含分散在第一聚合物中的可释放材料的核和包围在该核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳，所述第一聚合物在所述环境中为可降解的并且在所述环境中第二聚合物降解得比第一聚合物慢，并且第一聚合物在该壳中形成贯穿第二聚合物的连续通道。

在本发明的微粒中，第一聚合物可以形成多个穿过壳的连续通道或途径(或可以为多个穿过壳的连续通道或途径的形式)。第一聚合物可以设置在壳内，使得一旦将其去除(例如通过降解)便会暴露出多个贯穿壳的通道或途径。(第一聚合物的或者通过将其去除而暴露的)通道或途径在该壳的外表面和该壳的内表面之间可以为由互相连接的通道或途径形成的网状物的形式，或者可以形成独立的通道或途径。通过去除第一聚合物而暴露出的通道或途径可以为使得它们允许在该壳的外表面和该壳的内表面之间的液体通路。因此，该壳可以为第一聚合物和第二聚合物的相互贯穿的网状物的形式。

鉴于本发明设想了对患者释放治疗或诊断的物质的一种应用，也设想了其它非治疗和/或非诊断的用途，例如在衣物清洗过程中释放增白剂、在工业生产过程中释放催化剂/酶等。甚至在使用诊断或治疗应用的情况下，患者可以是非人类患者，例如哺乳动物、脊椎动物、鸟、鱼、家畜(例如牛、马、狗、猫、羊、猪等)或一些其它类型的非人类患者。在一些应用中，患者为人类患者。在颗粒用于体内的情况下，优选地第一聚合物或第二聚合物或它们任一的任何生物降解产物都没有毒性或不对使用该颗粒或施用它们的有机体有害。本发明可以在体外应用。它也可以在体内应用。

如上所述，第一聚合物应该比第二聚合物更容易被降解。在一些例子中，第一聚合物为可降解的并且第二聚合物为不可降解的或仅能非常缓慢的降解。在具体实施方案中，第一聚合物为可生物降解的并且第二聚合物为不可以生物降解的或仅能非常缓慢的生物降解。另外，第一聚合物和第二聚合物优选为互相不完全互溶。如上所示，这个需求很容易满足，因为完全互溶的聚合物对不常见。各个聚合物可以独立地为均聚物或共聚物。在一个为共聚物的情况下，聚合物主链可以包含至少两种不同的共聚单体。在一些实施方案中，第一聚合物为共聚物并且第二聚合物为均聚物。第二聚合物的单体可以是第一聚合物的共聚单体。在这类情况下，第一聚合物的又一个(或另一个)共聚单体可以为共聚物引入增加的降解性。这可能由于其本身为可降解的(例如可生物降解的、可光降解的等)或具有连接至另一个共聚单体的可降解的连接。

在颗粒形成的温度(或在15、20、25或30℃)下，第一聚合物在第二聚合物中的混溶性可以小于以重量或体积计大约10%，或小于5、4、3、2、1、0.5、0.2或0.1%，或可以为以重量或体积计大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10%。在颗粒形成的温度下第二聚合物在第一聚合物中的混溶性可以小于以重量或体积计大约10%，或小于大约5、4、3、2、1、0.5、0.2或0.1%，或可以为以重量或体积计大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10%。

在颗粒形成的温度下第一聚合物与第二聚合物可以基本上不互溶。用于本发明的合适的聚合物(独立地第一聚合物和第二聚合物)包括缩聚物，例如聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酸酐等。尤其合适的聚合物包括羟基官能化羧酸的聚合物和共聚物。这些可以独立地是C2到C6的羟基官能化羧酸，例如C2、C3、C4、C5或C6的羟基官能化羧酸。它们可以是单羧酸。它们可以是单羟基官能化的。它们可以是伯羟基官能化的，或者可以是仲羟基官能化的，或者可以是叔羟基官能化的。使用无毒单体的聚合物可能是有用的，以便在降解聚合物时避免产生有毒产物。合适的第一聚合物为乳酸(D、L或DL)和另一个羟基酸如乙醇酸的共聚物。第一聚合物可以为无定形的。它可以为非晶质的。这可以促进其降解。独立地，第二聚合物可以为羟基官能化羧酸如乳酸(D、L或DL)的聚合物。在本发明中使用的有用的聚合物对是作为第一聚合物的聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和作为第二聚合物的聚(L-乳酸)(PLLA)。第二聚合物可以为半晶质的或可以为晶质的。这可以抑制其降解。第一聚合物和第二聚合物可以独立地为线性的。它们可以是非交联的。在共聚物的情况下，在共聚物主链上可以存在至少两个共聚单体。当本说明书中提到在聚合物中存在的单体(或相关说法)时，是指来自聚合物中存在的单体的单体单元的存在。

如上所述，在本发明中第一聚合物在其所使用的环境中为可以降解的是很重要的。在其所暴露的且不希望释放可释放材料的其他环境中，它可以为不可降解的或非常缓慢的降解。例如在中性水或空气中它可以为不可降解的或非常缓慢的降解。第一聚合物可以为由其分子量决定其降解速率。这使得可以通过第一聚合物的分子量来控制可释放材料从该颗粒中的释放。第一聚合物的分子量可以为可以获得所需要的可释放材料的释放特性。例如它可以大于大约1kDa，或大于大约2、3、4、5、7、10、15、20、30、50、75或100kDa，或它可以小于大约40kDa，或小于大约35、30、25、20、15或10kDa，或可以在大约1到大约100kDa之间，或可以在大约1和60、1和58、1和35、3和35、5和35、10和35、20和35、1和5、1和10、1和5、4和7、5和75、5和50、5和25、5和20、5和15、5和10、10和100、20和100、50和100、10和50、20和50、10和20、7和24、7和15、15和24或75和100kDa之间，例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100。第二聚合物可以具有高分子量。这可以抑制其在使用中降解。其分子量可以大于大约50kDa，或大于75、100、125、150或200kDa，或在大约50和大约250kDa之间，或在大约50和200、50和1050、100和250或100和200kDa之间，或大约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或250kDa。在一些例子中，第二聚合物可以具有较低的分子量，例如低至2kDa。第二聚合物的分子量可以为2至50kDa、或2至20、2至10、10至50、20至50、10至30或15至20kDa，例如大约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50kDa。在一个实例中，第一聚合物的分子量为大约4至大约7kDa并且第二聚合物的分子量为大约15到大约20kDa。以上分子量可以为数均分子量、或者可以为重均分子量、或者可以为粘均分子量。它们可以是与聚苯乙烯等价的分子量(例如使用已知分子量的聚苯乙烯标准进行测量)或它们可以是使用Mark-Houwink-Sakurada方程计算得到的分子量。第一聚合物和第二聚合物可以独立地具有窄或宽的分子量。它们可以独立地具有小于20或小于15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.5、1.4、1.3、1.2或1.1，或大约1至20、1至10、1至5、1至2、1至1.5、1至1.2、2至20、5至20、10至20、15至20、2至10、2至5或5至10，例如大约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20的多分散性(定义为Mw/Mn)，尽管在一些情况下可以使用多分散性大于20的聚合物。

可以选择第一聚合物和第二聚合物的分子量，以使核相对于壳降解得更快，即第一聚合物比第二聚合物降解得更快。在使用的条件下第二聚合物应该相对于第一聚合物降解得更缓慢。因此，如果在核内的第一聚合物的分子量非常低并且第一聚合物降解非常快，那么可以在该壳中使用分子量非常低的第二聚合物。优选地壳在使用时在整个释放可释放材料的时间和核的降解时间里保持完整。在一些应用中，可以期望在药物完全释放之后不久该壳完全降解。在这种情况下，在壳中的第二聚合物应选择具有尽可能低的分子量，以在完成药物释放之后尽早降解同时在药物释放期间仍保持完整。

在一个实例中，2kDaPLLA用作壳内的第二聚合物，与分子量小于7kDa的核内的PLGA第一聚合物配对。发现分子量为7kDa的PLGA的降解显著快于分子量为2kDa的PLLA。这导致在使用高分子量的PLLA/PLGA时，药物释放方案为10天左右而不是几个月。

第二聚合物的量(即重量)可以大于第一聚合物。第二聚合物与第一聚合物的比例可以在大约1和大约5之间(即大约1:1到大约5:1)，或大约1至4、1至3、1至2、2至3、1至1.5、1.5至2、1至1.25、1.25至2、1.25至1.5、1.5至2或1.5至1.75，例如大约1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。

颗粒的壳可以包含少于以重量或体积计大约25%的第一聚合物，或少于大约20、15或10%，或可以包含大约5和大约25%之间的第一聚合物，或在大约10和25、15和25、20和25、5和15或15和20%之间，例如大约5、10、15、20或25%。一旦第一聚合物在使用时已经降解，这个比例可以接近等于在壳内的孔体积的比例。

本发明的微粒的直径可以在大约0.5和大约1000微米之间，或在大约0.5和大约500微米之间，或在大约0.5和200、0.5和100、0.5和50、0.5和20、0.5和10、0.5和5、0.5和2、0.5和1、1和500、2和500、5和500、10和500、50和500、100和500、200和500、1和100、1和10、10和100、10和50或50和100微米之间，例如大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米，或甚至更大，例如550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000微米。这可以是平均直径。微粒可以为基本上单分散的，或可以具有一定范围的颗粒尺寸。颗粒的直径与核的直径的比可以为大约1.05至大约5，或大约1.05至3、1.05至2、1.05至1.5、1.1至5、1.5至5、2至5、3至5、1.5至2、1.5至3、1.5至2.5或1.2至2，例如大约1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。核的直径可以为大约0.2到大约500微米，或大约0.5到500、1到500、20到500、5到500、10到500、20到500、50到500、100到500、200到500、0.2到200、0.2到100、0.2到50、0.2到20、0.2到10、0.2到5、0.2到2、1到200、10到50、10到100、50到250、10到20或5到10微米，例如大约0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米。微粒可以为球形或接近球形。它们可以为扁圆球形、卵形、多面体或某一其它合适的形状。它们应为固体。

可释放材料可以以不可溶的形式存在在颗粒的核中，或可以溶解在第一聚合物中。它可以为颗粒状的。它可以吸附在支撑颗粒上或吸附在其中。支撑颗粒可以为无机颗粒。无机颗粒可以为例如盐颗粒、矿物颗粒、沸石颗粒或某一其它颗粒。磷灰石颗粒是一个合适的例子。支撑颗粒(或可释放材料的颗粒)可以为纳米颗粒。其直径可以为大约1到大约20nm、或大约1到10、1到5、1到2、2到20、5到20、10到20、2到10或5到10nm，例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm，或可以比这更大(例如大约30、40、50或100nm)或更小。支撑颗粒或可释放材料的颗粒可以足够小以穿过通过壳中的第一聚合物的降解形成的在微粒的壳中的孔。那些孔的直径可以为大约10到大约1000nm，或大约10到500、10到200、10到100、10到50、20到1000、50到1000、100到1000、200到1000、500到1000、100到500、50到200、10到20、20到50或20到30nm，例如大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000nm。在一些例子中，它们可以比这些更大，例如大约1至大约50微米或大约1到20、1到10、1到5、5到50、10到50、20到50、5到20、10到20或20到30微米，例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米。可以通过控制支撑颗粒的大小或可释放材料的颗粒(本文中称为“可释放颗粒”)的大小控制可释放材料的释放速率。因此可释放颗粒越大，它们穿过的孔释放得越慢，该孔为通过第一聚合物的降解在壳中所形成的。在极端情况下，如果可释放颗粒大于该孔，那么释放的机理仅为通过降解/溶解第二聚合物，或者通过溶解可释放颗粒或至少可释放材料，随后可释放材料扩散出该孔。PLGA降解的酸性产物可以降解磷灰石核并释放所吸附的材料。

可释放材料可以为蛋白质、蛋白质片段、酶、DNA、DNA片段、RNA、RNA片段、多糖、激素、生长因子、皮质类固醇、抗生素、放射性药物、非以上任意一种的药物、放射性示踪剂、显像剂、染料、药妆试剂或其任意两种或更多种的混合物，或可以为某一其它物质。

本发明的核-壳颗粒可以为独立的颗粒的形式，或可以相互粘结，或部分地相互粘结。例如可以将它们烧结以形成颗粒块。这可以通过将颗粒加热到合适的烧结温度来实现。当然这将取决于第二聚合物的性质。该温度可以高于第二聚合物的玻璃化转变温度。例如，其可以为大约35到55℃，或大约40到50、35到50或40到55℃，例如大约35、40、45、50或55℃。另外地或作为一种选择可以压紧颗粒以使它们形成颗粒的固体块。作为另一种选择粘性物质(例如胶水或聚合物)可以用于粘结颗粒。胶水或聚合物可以在第一聚合物降解的条件下为可降解的，以使得在使用中颗粒分离从而促进可释放材料的释放。在另一种选择中，可以将微粒包埋在一种物质(例如凝胶、蜡等)中。在使用的条件下，例如在第一聚合物降解的条件下，该物质可以为可降解的、可溶的或为可除去的。

可以通过将包含在第一溶剂中的第一聚合物的第一溶液和包含在第二溶剂中的第二聚合物的第二溶液合并以形成混合的聚合物溶液来制备本发明的微粒(因此物质包含所述微粒)。或者，第一聚合物和第二聚合物可以溶解在溶剂中，任选地包含第一溶剂和第二溶剂的混合溶剂。第一溶剂和第二溶剂可以相同，或者可以混溶并且不同。随后在介质中乳化混合的聚合物溶液，在该介质中第一溶剂和第二溶剂最多微混溶(通常为水性介质)以形成乳液。随后将乳液老化足够的时间以允许第一聚合物和第二聚合物在乳液液滴中至少部分分离以形成包含第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含第一聚合物和第二聚合物的壳。随后除去乳液液滴中的第一溶剂和第二溶剂，从而形成作为水性悬浮液的微粒。

优选地第一溶剂和第二溶剂相同。第一溶剂应为第一聚合物的溶剂，并且第二溶剂应为第二聚合物的溶剂。通常第一溶剂和第二溶剂为疏水溶剂。它们可以独立地是芳族烃溶剂、卤化溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂或一些其它合适的溶剂，或可以是合适溶剂的混合物。合适用作第一溶剂和第二溶剂的溶剂为二氯甲烷(DCM)。其它合适的溶剂包括或其它合适的溶剂例如DMF、DMSO、甲醇或其中任意一种或多种与DCM的混合物。在一个实例中，使用最小量的DMF和/或DMSO和/或甲醇，以在将溶解药物与PLGA-DCM溶液混合之前辅助溶解一些种类的药物，以促进药物并入PLGA-DCM溶液中。如果固体药物直接加入至PLGA-DCM，那么在合成过程中它可以在一些情况下沉淀析出进入PLLA相中或进入乳化缓冲液中。乳液的连续相通常为水性的。它可以包含水和一种或多种溶质。溶质可以为聚合物，例如甲基纤维素。溶质可以以重量计大约0.01到1%，或大约0.01到0.1、0.1到1或0.05到0.5%，例如大约0.01、0.05、0.1、0.5或1%的水平存在。乳液可以通过表面活性剂得到稳定。表面活性剂可以为无毒的。其可以是可生物降解的。为了避免第一溶剂和第二溶剂在乳液液滴中过早地耗尽，在连续相中可以溶解有少量的第一溶剂和/或第二溶剂。连续相可以为第一溶剂和/或第二溶剂所饱和。它另外地或作为一种选择可以包含有可释放材料。它可以为可释放材料所饱和。

在第一溶剂中的第一聚合物的浓度和在第二溶剂中的第二聚合物的浓度可以独立地为大约5到大约50%w/v，或大约5到20、5到10、10到50、20到50或10到20%，例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%.

混合的聚合物溶液乳化所在的介质可以为水性的。它可以是水溶液。它可以包含乳化剂。乳化剂可以是高分子乳化剂。它可以为表面活性剂。它可以为单体表面活性剂，或者可以为聚合物表面活性剂。它可以为非离子的，或可以为阳离子的，或可以为阴离子的，或可以为两性离子的。水溶液还可以包含辅助表面活性剂。合适的乳化剂包括甲基纤维素，聚山梨酯/失水山梨醇表面活性剂，例如吐温司盘聚氧乙烯表面活性剂，例如布里杰环氧乙烷以及环氧丙烷表面活性剂，例如普鲁洛尼克等。

如文中所讨论的，可释放材料的释放(如果存在)可以由多种因素控制，所述因素包括第一聚合物的分子量、第一聚合物的化学性质(和由此的降解速率)、可释放物质的颗粒尺寸、或它吸附在其上和/或所吸收的支撑颗粒的颗粒尺寸和在一些情况中第一聚合物与第二聚合物的比例。因此，所述方法可以包括选择以下一个或多个的步骤：第一聚合物的分子量、第一聚合物的化学性质(和由此的降解速率)、可释放物质的颗粒尺寸或它吸附在其上和/或所吸收的支撑颗粒的颗粒尺寸和第一聚合物与第二聚合物的比例，以在预定应用中获得需要的可释放材料的释放特性。释放特性可以是释放延迟或滞后时间(即将颗粒暴露在第一聚合物降解条件下直到开始释放的时间)，或者可以是释放开始后的释放速率。延迟或滞后时间可以为从大约0.5到大约100天，或从大约0.5到50、0.5到20、0.5到10、0.5到5、0.5到2、0.5到1、1到50、50到50、10到50、20到50、1到10、5到20或10到20天，例如大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、15、30、35、40、45或50天，或者在具体的情况下可以比这更多或更少。在一些情况下可以没有或有微不足道的延迟或滞后时间。释放速率可以为使得可释放材料在一段时间内释放，该段时间为从大约0.5到大约100天，或从大约0.5到50、0.5到20、0.5到10、0.5到5、0.5到2、0.5到1、1到50、50到50、10到50、20到50、1到10、5到20或10到20天，例如大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、15、30、35、40、45或50天，或者在具体的情况下可以比这更多或更少。

第一溶液还可以包含可释放材料并且因此可以通过将可释放材料加入至第一溶剂中的第一聚合物的溶液中或通过将第一聚合物溶解在第一溶剂和可释放材料（任选地在支撑物上）的混合物中的方式制备。可以以颗粒形式或吸附于颗粒状支撑物上的形式提供可释放材料。(可释放材料的或者可释放材料在其上和/或其中的支撑物的)颗粒的直径可以为大约1到大约20nm、或大约1到10、1到5、1到2、2到20、5到20、10到20、2到10或5到10nm，例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm，或可以比这更大(例如大约30、40、50或100nm)或更小。在以下讨论中，假设存在可释放材料。然而，应该认识到在一些情况下除了第一聚合物以外没有可释放材料。在这种情况下，方法是相同的，除去省略了可释放材料和它吸附在其上/所吸附的支撑物(如果存在)。

通过合并第一溶液和第二溶液形成第一聚合物和第二聚合物以及可释放物质同时存在的溶液，可释放物质通常是尽管不总是在悬浮液中或吸附于颗粒上。随后在介质中乳化该混合的聚合物溶液从而使该混合的聚合物溶液形成乳液分散相(液滴)。该液滴的直径可以为大约1到大约1000微米，或大约1到500、1到200、1到100、1到50、1到20、1到10、10到1000、100到1000、500到1000、10到100、10到50或50到100微米，例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000微米。该方法可以包括搅拌(例如摇动、超声处理、微粉化等)介质和混合的聚合物溶液的混合物以获得需要的液滴尺寸。

一旦形成乳液，应为发生相分离留有足够的时间以形成一个壳溶液包围核溶液的结构，该核溶液中含有相对于第二聚合物来说富集的第一聚合物，该壳溶液中含有相对于第一聚合物来说富集的第二聚合物。然而该壳溶液应该含有一些第一聚合物(通常为相对于第二聚合物少于大约25%)。

为了固化聚合物以形成颗粒，应除去颗粒中第一溶剂和/或第二溶剂。一个方便地获得该效果的方法为用混合溶液稀释该乳液，该混合溶液与不含有第一和/或第二溶剂的连续相(通常为水性液体)混溶。之后从液滴中分离出溶剂以使第一和第二聚合物固化。可以快速或逐渐地实施稀释。因此，可以加入(任选地伴随搅拌)乳液至稀释的连续相，抑或向乳液中加入稀释的连续相，通常为伴随搅拌逐渐加入。可以容易地理解其它除去在液滴中的溶剂的方法，例如通过将乳液加热到接近、正好或高于第一溶剂和/或第二溶剂的沸点的温度，或者将乳液抽部分真空以蒸发第一溶剂和/或第二溶剂。对于这些方法，优选第一溶剂和/或第二溶剂的沸点低于乳液连续相的沸点。

人们认为由于从液滴的颗粒中除去第一溶剂和/或第二溶剂，核溶液形成颗粒的核，(如果可释放材料为颗粒状或吸附于颗粒支撑物上)可释放材料或支撑颗粒分散于其中。包围在核周围的壳溶液形成壳。由于从壳溶液中除去了溶剂，在壳中发生进一步地相分离，形成贯穿第二聚合物的壳基质的第一聚合物的通道。应该理解，无论如何第一聚合物和第二聚合物可以有少量的相互混溶性，因此在核中的第一聚合物可以包含少量第二聚合物，并且相似地壳中的第二聚合物可以包含少量第一聚合物。

一旦颗粒完全形成，可以通过任何通常使用的方法(例如过滤、离心、沉降/浮选、蒸发等)将其从所得悬浮液中分离。随后可以将其洗涤以除去残留的不希望的材料诸如连续相中的溶质、表面活性剂等，并且随后可以干燥。

本发明允许通过将具有不同特性的多批次的颗粒混合形成组合物来按需设计出不同释放特性。例如，如果同时释放两种单独的可释放材料，可以将它们分别地并入除此以外相同的微粒的核中。随后可以将这些合并入将同时释放两种可释放材料的单一组合物中。或者，如果要顺序释放两种可释放材料，可以将包含第一可释放材料(在核中)的第一批次的微粒的壳设计为很短或可忽略不计的延迟并且可以将在核中包含第二可释放材料的第二批次设计为使得该壳具有对应为第一批次的延迟加上第二批次的释放时间的延迟。这样获得的组合物会顺序释放两种可释放物质。在又一种选择中，单一可释放物质可以并入两个批次的微粒中，该两个批次的微粒设计为使得第二批次的延迟大于第一批次的延迟加上第一批次的释放时间。这样可释放物质将被递送到两个分离的相中，在两个相之间存在其间没有释放发生的间隙。技术人员会容易认识到可以通过合并两个或更多个不同批次的本发明的微粒任意制备其它释放特性。如前讨论，通过能够独立地控制可释放物质的释放速率和释放发生前的延迟时间，提供了这种多功能性。

在一些应用中，可以对患者施用本发明的微粒。这可以用于治疗可释放材料所指明的用于治疗的疾病状态，或者可以用于可释放材料作为显影剂(例如MRI显像剂、PET显像剂等)的身体局部成像。施用可以通过摄入、吸入、栓剂、注射或通过其他合适的途径。微粒或包含微粒的物质可以用于制备治疗疾病状态的药物。本文中可治疗的疾病包括疼痛、发烧、癌症、细菌感染等。该技术可以适用于疏水性的(例如不溶于水的)物质的释放，例如疏水性药物，尽管也可以使用亲水性(例如水溶性)药物或其它可释放物质。

该技术可以用于递送用于包括骨科、视力保健、消费品、食品/营养产品的多种应用的药物、蛋白质和/或其它活性成分。该技术提供如下独一无二的特性：

·在药物、蛋白质和/或活性成分释放之前的可调节的滞后时间。

·可以合并多个延迟释放配方，以便以预先设定的顺序受控的释放不同药物、蛋白质和/或活性成分。

·可以合并多个延迟释放配方，以便重复地以脉动方式释放相同药物、蛋白质和/或活性成分，或用于长期持续释放。

·可以大量生产用于体内应用或市售品的微球。

·通过(i)在升温下压紧或者(ii)包封在诸如水凝胶、膜和支架的载体中，可以易于将微球递送到和保留在所需的植入位点。

实施例

开发了具有富含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的核和富含聚(L-乳酸)(PLLA)的壳的核-壳纳米复合微球，该微球作为延迟释放媒介物用于顺序递送单一或多种药物。通过控制PLLA和PLGA的相分离形成核-壳结构。将药物并入PLGA相(核)。PLGA的降解会在富含PLLA的壳中产生孔，使得药物可以通过扩散穿过富含PLLA的壳得以释放(图1)。因此通过PLGA的降解时间控制药物释放前的滞后时间，PLGA的降解时间取决于PLGA的分子量(图2)。在PLGA相中并入额外的无机(磷灰石)纳米颗粒将促进蛋白质的吸附和递送(图3)。通过降解富含PLGA的核，蛋白质可以从微球中释放，富含PLGA的核的降解导致生成酸性产物并溶解磷灰石纳米颗粒，以及随后释放在磷灰石纳米颗粒上预先吸附的蛋白质。通过在PLGA相中并入吸附了药物和蛋白质的无机纳米颗粒，可以同时释放药物和蛋白质并且最小化总的微球体积(图4)。通过合并含有不同分子量的PLGA的微球，可以获得药物和/或蛋白质的长期持续释放(图5a)。还可以脉动释放(图5b)。为了方便植入，可以将微球压紧为小球(图9)。或者，可以将它们并入诸如水凝胶、膜或支架的载体中，并在药物和/或蛋白质完全释放后替换该载体(图14)。

A1.核-壳微球的制备

A1.1.用于药物递送的PLLA-PLGA微球

使用水包油包固体乳液溶剂萃取技术合成PLLA-PLGA核-壳微球。在典型的合成中，制备两种单独的溶液，分别是1ml二氯甲烷(DCM)中含有125mgPLLA的溶液和1mlDCM中含有125mgPLGA的溶液。随后在PLGA溶液中加入多达125mg的药物形成油包固体悬浮液。将该悬浮液和PLLA溶液合并、混合，并且随后使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器在200ml0.1wt%甲基纤维素的水溶液中将其乳化，以生成水包油包固体乳液。用1.8mlDCM部分饱和在乳化步骤中使用的甲基纤维素溶液以最小化不希望的水对油液滴中DCM的萃取，并且避免在两种聚合物能发生相分离前微球的过早硬化。在搅拌30min之后，通过使用蠕动泵以1-7ml/min的速率加入另外的不含有DCM的200ml0.1wt%甲基纤维素溶液，开始可控的萃取DCM并且使聚合物液滴硬化。再连续搅拌4h确保DCM完全萃取。过滤得到硬化的微球，用水洗涤，并且冷冻干燥过夜。

A1.2.用于蛋白质递送的PLLA-PLGA-磷灰石微球

通过在双膦酸分子(例如羟乙磷酸：1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸)存在下用磷酸氢铵碱沉淀硝酸钙来合成羟乙磷酸盐封端的碳酸磷灰石(eCAP)纳米颗粒，以减少颗粒的聚集。在典型的合成中，快速将100ml硝酸钙溶液(8mM)加入到100ml包含磷酸氢铵(5mM)、碳酸氢铵(5mM)、羟乙磷酸(3mM)和氢氧化铵(pH值为10.4)的碱溶液中，从而得到eCAP纳米颗粒。24h后浓缩并通过超滤水洗该纳米颗粒，以去除任何未反应的试剂。随后将8.5mg蛋白质加入到20mgeCAP颗粒中，搅拌该悬浮液过夜以使得蛋白质吸附到eCAP纳米颗粒上。浓缩并通过超滤水洗所获得的悬浮液，以去除任何未结合的蛋白质。然后将该颗粒冷冻干燥过夜以制得负载蛋白质的eCAP。

随后制备两种单独的溶液，分别是1mlDCM中含有125mgPLLA的溶液和1mlDCM中含有125mgPLGA的溶液。随后将30mg负载蛋白质的eCAP加入PLGA溶液中形成油包固体悬浮液。将该悬浮液和PLLA溶液合并、混合，并且随后使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器在200ml0.1wt%甲基纤维素的水溶液中将其乳化，以生成水包油包固体乳液。用1.8mlDCM部分饱和在乳化步骤中使用的甲基纤维素溶液以最小化不希望的水对油液滴中DCM的萃取，并且避免在两种聚合物能发生相分离前微球的过早硬化。在搅拌30min之后，通过使用蠕动泵以1-7ml/min的速率加入另外不含有DCM的200ml0.1wt%甲基纤维素溶液，开始可控的萃取DCM并且使聚合物液滴硬化。再连续搅拌4h确保完全萃取DCM。过滤得到硬化的微球，用水洗涤，并且冷冻干燥过夜。

A1.3.用于递送组合的药物和蛋白质的微球

依照A1.2部分中描述的方法制备吸附蛋白质的eCAP纳米颗粒。随后将吸附蛋白质的eCAP纳米颗粒和药物可结合载入PLGA溶液中形成油包固体悬浮液。随后将该悬浮液和PLLA溶液合并，并且进行如上述A1.2部分中描述的多个步骤。

A2.微球的大规模生产

使用水包油包固体乳液溶剂萃取技术合成负载蛋白质的PLLA/PLGA核-壳微球。在典型的合成中，制备两种单独的溶液，分别是100mlDCM中含有12.5gPLLA的溶液和100mlDCM中含有12.5gPLGA的溶液。随后将多达10g的染料、药物或蛋白质加入PLGA溶液中形成油包固体悬浮液。将该悬浮液和PLLA溶液合并、混合，并且随后使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器在600ml0.1wt%甲基纤维素的水溶液中将其乳化，以生成水包油包固体乳液。用5.4mlDCM部分饱和在乳化步骤中使用的甲基纤维素溶液，以最小化不希望的水对油液滴中DCM的萃取，并且避免在两种聚合物能发生相分离前微球的过早硬化。在搅拌30min之后，通过使用蠕动泵以1-7ml/min的速率加入另外不含有DCM的600ml0.1wt%甲基纤维素溶液，开始可控的萃取DCM并且使聚合物液滴硬化。将混合物进一步搅拌24h以确保完全萃取DCM。过滤得到的硬化微球，用水洗涤，并且冷冻干燥过夜。

A2.1.放大100倍的程序

1.在玻璃瓶中将12.5gPLLA(90kDa)溶解在100mlDCM中，玻璃瓶加盖以防止挥发。

2.在玻璃瓶中将12.5gPLGA(例如7kDa、24kDa)溶解在100mlDCM中，玻璃瓶加盖以防止挥发。

3.在PLGA溶液中加入多达10g的药物或蛋白质，并且将其混合以形成油包固体悬浮液。

4.将PLGA-药物混合物加入至PLLA溶液，并且混合。

5.使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器将上述溶液与600ml用5.4mlDCM饱和了的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/L磷酸盐缓冲液(PBS))混合30min从而制得水包油包固体乳液。

6.在连续搅拌的同时，使用蠕动泵加入600ml不含DCM的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/LPBS)。

7.以1500rpm离心4-5min，并且倒出甲基纤维素。

8.用水洗涤和旋降(spindown)多次直到水澄清并且不再为紫色。空气干燥获得的微球。

A2.2.放大到千克的程序

1.在容器中将1.25kgPLLA(90kDa)溶解在10lDCM中。

2.在容器中将1.25kgPLGA(例如7kDa、24kDa)溶解在10lDCM中。

3.在PLGA溶液中加入多达1kg的药物或蛋白质，并且混合以形成油包固体悬浮液。

4.将PLGA-药物混合物加入至PLLA溶液，并且混合。

5.使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器将如上溶液与60l用540mlDCM饱和了的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/LPBS)混合30min从而制得水包油包固体乳液。

6.在连续搅拌的同时，使用蠕动泵以1ml/min加入另外的60l不含DCM的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/LPBS)。

7.以1500rpm离心4-5min，并且倒出甲基纤维素。

8.用水洗涤和旋降多次直到水澄清并且不再为紫色。空气干燥获得的微球。

A3.用于将微球递送并保留在所需的植入位点的方法

A3.1.在升温下压紧

使微球经受PLLA外壳的玻璃化转变温度(下限为45-50℃)，该微球不会熔化或损坏，并且可以重新机械分离。当微球负载有不能耐受45℃以上的温度的蛋白质或药物时，这样行不通。

通过使用加热同时使用或不使用离心，将微球压紧成圆柱状或其他形状的小球。典型地，将微球倾倒或离心加入模具中。随后将装满的模具放入45-50℃的烘箱中24h。将微球保持在PLLA外壳的玻璃化转变温度的下限可以使PLLA稍微软化，从而允许微球相互之间轻微粘连。去掉磨具后，微球保持所需要的模具的形状，但是通过施加合适的力或摩擦可以将其重新分离并且不遭破坏。

A3.2.用于获得高度压紧的微球的程序

1.在微球合成的最终洗涤和旋降步骤中，应将微球旋降为分批的所需要的小球的量。例如，如果使用100g干燥的原料制备每个10g的小球，离心前将样品等分加入10个单独的管中。

2.将离心管顶部的溶液倒出，仅留下离心管底部的固体。

3.直接将该管放入45-50℃的烘箱中24h。

4.将获得的微球高度压紧，其将需要很大的力气去分离得到单独的微球。

A3.3.用于获得压紧程度较小的微球的程序

2.将离心管顶部的溶液倒出，仅留下离心管底部的固体。

3.加入少量水，并且涡旋以使微球松散。

4.将该管放入45-50℃的烘箱中24h。

5.与A3.2部分中的相比，将所获得的微球程度更小地压紧，且更容易分离。

A3.4.用于获得微型片状高度压紧的微球的程序

使用液压机将微球压紧，并且使微球小球的体积最小化。这有利于微球插入特定的植入部位，尤其是那些具有空间限制的部位(例如眼睛)。

1.冷冻干燥之后，称重微球以提供所需量的待递送药物。

2.将微球转移到具有所需尺寸的片剂模具冲床(tablediepunch)上。

3.将含有微球的片剂模具冲床放置在液压机上。

4.使用液压机施加合适的压力以获得高度压紧的片剂。

5.从模具冲床中取出片剂。

A4.用于增加微球药物负载容量的方法

通过增加PLGA核中的药物负载量，微球可以获得更长的持续释放。

A4.1.用于通过再利用药物饱和的乳化溶液增加负载的程序

在之前的微球制备步骤中得到的药物饱和的乳化溶液的再利用允许在乳化液滴内部和外部环境之间建立药物量的平衡，从而减少了药物在环境水溶液中的净损失。

1.使用机械涡旋，在玻璃瓶中将125mgPLLA(100kDa)溶解在1mlDCM中，玻璃瓶加盖以防止挥发。

2.使用机械涡旋，在玻璃瓶中将125mgPLGA(7kDa、12.9kDa、24kDa或其它分子量)溶解在1mlDCM中，玻璃瓶加盖以防止挥发。

3.将多达120mg药物加入PLGA溶液中，并且混合形成油包固体悬浮液。

4.将PLGA-药物混合物加入PLLA溶液中，并且混合生成药物-PLGA-PLLA悬浮液。

5.在烧杯中加入200ml再利用的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/LPBS)，其中包含用于负载在微球上的相同药物。用1.8mlDCM部分饱和该溶液。

6.使用搅拌速度为250rpm的顶置式搅拌机，将步骤4中的药物-PLGA-PLLA悬浮液加入步骤5中的表面活性剂溶液中生成水包油包固体乳液。

7.30min后，持续以250rpm搅拌，使用蠕动泵加入另外200ml再利用的甲基纤维素表面活性剂溶液(0.1wt%、1g/LPBS)，其中包含用于负载在微球上的相同药物。这也控制了DCM溶剂萃取速率。

8.搅拌6h至过夜从而完全萃取DCM。

9.以2500-3000rpm离心5min，并且倒出表面活性剂溶液。硬微球集中在底部。该步骤将适当形成的微球与过量的聚合物分离。

10.用PBS洗涤微球3次并且在每次清洗后旋降。该步骤除去未被包封在微球上的过量药物。

A5.在载体(例如水凝胶、膜和支架)中包封微球

微球悬浮在液体状态下的水凝胶中，例如明胶-羟基苯基丙酸(HPA)、明胶-低聚(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯(OEGCG)、透明质酸(HA)-酪胺和HA-OEGCG。随后将它们注入所需要的植入位点，之后水凝胶通过交联反应(例如针对HA-酪胺的由辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢催化的酶介导反应)固化。

制备冷冻干燥或空气干燥的包封药物或蛋白质的微球。

1.制备水凝胶溶液例如明胶-HPA、明胶-OEGCG、HA-酪胺、HA-OEGCG。

2.均匀地涡旋微球和水凝胶溶液。

3.正好就在注入所需植入位点之前，将水凝胶与用于交联的试剂(例如用于HA-酪胺体系的HRP和过氧化氢)混合。

4.用≤18g的针将混合溶液注入所需位点。或者，将溶液注入所需尺寸的模具，并且使其在植入前形成固定形状(例如盘状)。通过将微球悬浮液和聚合物或熟化之前的支架溶液混合，还可以将微球捕获在多孔聚合物材料或支架中。

使用核-壳聚合物微球的药物递送

B1.将丁哌卡因递送至山羊膝关节大于2周用于缓解外科手术术后疼痛

第三方GLP认证的公司(AginkoAG)实施该测试作为概念验证研究的一部分来判断在膝关节手术后通过将治疗水平镇痛的丁哌卡因递送至膝关节至少2周以缓解术后疼痛的可行性。

在这项研究中，丁哌卡因负载在核-壳PLLA-PLGA微球上，该微球使用重量比为1:1的PLLA：PLGA(PLLA为100kDa，并且PLGA为24kDa)所合成。基于初期的体外释放研究，PLLA和PLGA的结合使得丁哌卡因(30wt%负载)释放时间超过14天(图8)。

为了体内研究的目的，微球合成方案如下放大了100倍。使用水包油包固体乳液溶剂萃取技术合成负载蛋白质的PLLA-PLGA核-壳微球。在典型的合成中，制备两种单独的溶液，分别是100mlDCM中含有12.5gPLLA的溶液和100mlDCM中含有12.5gPLGA的溶液。随后在PLGA溶液中加入多达10g丁哌卡因形成油包固体悬浮液。该悬浮液和PLLA溶液合并、混合，并且随后使用搅拌速度为400rpm的机械搅拌器在600ml0.1wt%甲基纤维素的水溶液中将其乳化，以生成水包油包固体乳液。用5.4mlDCM部分饱和在乳化步骤中使用的甲基纤维素溶液以最小化不希望的水对油液滴中DCM的萃取，并且避免在两种聚合物能发生相分离前微球的过早硬化。在搅拌30min之后，使用蠕动泵以1-7ml/min的速率加入另外的不含有DCM的600ml0.1wt%甲基纤维素溶液，开始可控的萃取DCM并且使聚合物液滴硬化。将混合物进一步搅拌24h以确保完全萃取DCM。过滤所得到的硬化的微球，用水洗涤，并且冷冻干燥过夜。

为了在移植过程中方便处理，通过将微球倒入模具并随后将模具放入45-50℃的烘箱24h而将微球压紧成盘状。将微球保持在PLLA外壳的玻璃化转变温度下限可以使PLLA稍微软化，从而允许微球相互之间轻微粘连。去掉磨具后，微球保持所需要的模具的形状，但是通过施加适度的力或摩擦可以将其重新分离并且不遭破坏。方便地将微球紧密物植入膝关节(图9)。

体内研究表明治疗水平的丁哌卡因在膝关节中保持超过2星期(图10)。在这段时间里，血浆中的丁哌卡因水平很好地低于耐性限度，这证实局部药物递送是安全的。实验结束时膝关节的组织切片表明没有炎症(图11)。也没有关于不良反应或丧失活动性的报告。

在图11中观察残留的空PLLA壳。然而，由于PLLA为FDA批准的常用于化妆品填料的材料，所以它的存在不会导致副作用。在实施人体实验之前，我们会进行进一步研究以监测动物直至PLLA完全降解。由于PLLA和PLGA的相对降解速率的限制，使用降解更快的PLLA从而使得一旦药物已经完全释放微球就完全降解并不可行(参见以下B3部分)。

B2.将BT递送至患有青光眼的兔子的眼睛以降低眼内压(IOP)

BT是用于降低青光眼患者的IOP的药物。它通常以滴眼液的形式每天给予2-3次。然而，在这种给药方式中，大部分药物损失于眼泪等中。该研究的目的为，通过包埋在载体中的微球更加有效并且以受控、持续的方式递送BT，该载体被植入眼睛的结膜下（subconjunctiva）。可以每年将载体替换2-3次。

在该研究中，将BT负载到核-壳PLLA-PLGA微球内，该微球使用重量比为1:1的PLLA：PLGA（PLLA为100kDa，并且PLGA为7kDa和24kDa）合成，从而得到释放滞后时间不同的微球(图12)。当使用可获得的分子量最低的PLGA(3.4kDa、Lactel)时，发现BT立即释放，并且在第一天中大部分药物都释放了(图13)。

用于方便地植入诱导患有青光眼的兔子的眼结膜下，将一批次的PLGA为24kDa的核-壳PLLA-PLGA微球负载到明胶-HPV水凝胶载体上(图14)。在植入后30天到50天IOP显著下降，并且一直到第74天保持低于初始青光眼水平(图15)。这说明将BT药物封装在微球中并在体内植入后没有功能损失。

通过合并包含不同分子量的PLGA的核-壳PLLA-PLGA微球，我们可以实现BT顺序释放，使得一旦之前批次的微球结束释放BT每一新批次的微球就开始释放BT。这可以获得长期可持续释放BT。可以如A3部分中所述压紧合并的微球以减少植入体积。如A4部分中所述还可以增加药物负载。

B3.PLLA和PLGA的分子量和PLLA：PLGA的重量比

在药物释放过程中，为了保持在核-壳PLLA-PLGA微球中的壳屏障，PLLA应该降解得比PLGA慢很多。由于壳中富含PLLA，一旦PLGA降解，就会在壳中形成孔，使得药物可以通过扩散释放。降解PLGA和PLLA所需的时间取决于其分子量。因此，可以将分子量较低的PLGA与分子量较低的PLLA结合而不会影响释放特性，只要PLLA仍然降解得比PLGA慢很多。

尽管在本操作中使用了100kDa的PLLA，仍然认为可以使用分子量更高的PLLA(大于160kDa)，而不会影响微球的形成和释放特性。可以使用分子量高于75kDa的PLGA来产生更长的滞后时间。

通常，改变PLLA：PLGA的重量比可以导致核-壳的转化。例如，当PLLA：PLGA的重量比为1:1(本实验中使用的配方)，获得具有富含PLGA的核和富含PLLA的壳的微球。如果使用PLLA：PLGA的重量比为1:2或1:3，将发生相转化而生成具有富含PLLA的核和富含PLGA的壳的微球。用于获得具有富含PLGA的核和富含PLLA的壳的微球，最佳的PLLA：PLGA的重量比为1:1到1:1.25。

相对于PLGA增加PLLA(例如PLLA:PLGA=2:1)，仍会获得具有富含PLGA的核和富含PLLA的壳的微球。然而，这将会改变核的直径与壳的厚度的比例，导致相较于核而言更厚的壳。因此，可行的PLLA：PLGA的重量比的范围认为是2:1到1:1.25。

在一具体的实施方案中，本技术涉及用于制备微球的方法，该微球包含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚(L-乳酸)(PLLA)并且可以伴有延迟的特性释放诸如药物、蛋白质和/或活性成分的物质。该技术使得在物质释放之前有规定的滞后时间，因此通过合并具有不同滞后时间的多批次的微球，使得有可能长期持续释放。在当一个具体批次的微球中的物质已经完全(或部分地)释放的情况下，另一批次将会准备开始释放其中包封的成分。也可以将微球并入诸如水凝胶、膜或支架的载体中，以便将其方便地植入所需的释放位置。

本发明的具体实施方案包括如下重要特征：

F1)具有如下规格的含有富含聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的核和富含聚(L-乳酸)(PLLA)的壳的核-壳纳米复合微球：

a)PLLA：PLGA的重量比在1:25到2:1之间

b)PLLA的分子量大于160kDa

c)PLGA的分子量在7kDa至24kDa之间或高于75kDa

F2)受控释放的组合物，其包含在诸如水凝胶、膜和支架的载体中的包封的PLLA/PLGA微球

F3)抗青光眼药物的受控递送的方法，其包括对个体给予如F2中所述的受控释放的组合物的步骤

F4)骨科相关的治疗方法，包括体内植入PLLA/PLGA微球和/或如F2中所述的受控释放的组合物的步骤

以体外释放为例，这表明丁哌卡因(30wt%负载)释放大于14天。另外，使用聚合物比例为1:1(使用100kDaPLLA)的核-壳PLLA-PLGA微球的酒石酸溴莫尼定(brimonidine,BT)的释放特性报告4天滞后时间(使用7kDaPLGA)以及25天滞后时间(使用24kDaPLGA)。合适的载体包括诸如明胶-HPA、明胶-OEGCG的水凝胶、HA-酪胺和HA-OEGCG。

使用环氧乙烷对用于体内植入的微球压紧物(MC)进行消毒。术前山羊禁食12小时但可以自由饮水(以减少膨胀的危险)。

颈静脉导管，术前用药和麻醉：在颈静脉中放入永久性导管以便于在实验过程中抽血。使用相同的导管给予术前用药和麻醉。使用静脉注射的0.3mg/kg咪达唑仑(速眠安(Dormicum)，罗氏制药(RochePharma)，雷纳克(Reinach))和0.2mg/kg美沙酮(美沙酮特莱(MethadonStreuli)，特莱制药公司(StreuliPharmaAG)，乌兹纳赫(Uznach))进行术前用药。使用静脉注射的3mg/kg氯胺酮(Narkan100;Dr.EGreubAG，Bern)和1mg/kg丙泊酚(丙泊酚1％费森尤斯(Propofol1%Fresenius)，费森尤斯卡比(FreseniusKabi)，施坦斯(Stans))的组合诱导麻醉。气管插管后，用氧气/空气中的1MAC七氟醚(2.3％ET)维持麻醉状态。通过平衡麻醉/镇痛治疗方案来保证术前镇痛：美沙酮，氯胺酮。青霉素用于术前和术后的抗生素治疗。

手术部位准备：如外科手术般地准备手术部位(山羊的从跗骨到股骨的中部的左后肢)：用兽医理发推子AesculapFavoritaII220Volt(ProvetAG，瑞士)和其更换刀片1/20mm剪去毛发，用聚维酮碘(巴斯夫，瑞士)液体肥皂和酒精对皮肤进行清洗以及消毒。使用真空垫将动物以背卧位-仰卧位放置在手术台上，左后腿处于垂直位置且远端固定；胫骨滑车直立于股骨髁之上。手术部位盖有无菌单。粘性U型帘粘合在切口周围；第二粘性帘用于盖在山羊的其余部位上。

手术方法：用手术刀刀片内侧在髌旁的内侧皮肤上切开一个七到九厘米长的切口，从大收肌的插入点纵向到股骨内侧髁和/或髌韧带的边界，直至插入腓骨的第三肌肉的腱。该方法涉及所有解剖层(逐层地)。首先从皮肤，然后到腱膜，随后到股肌内侧的股肌内侧斜肌部分，其覆盖在膝关节内侧关节的第二层中的内侧-股骨韧带的上方，之后关节囊的髌骨韧带纤维，最终到达关节层。用剪刀近关节地拉长髌骨肌腱的内侧以避免腿弯微动脉的侧枝局部更远。用0.9%NaCl使关节保持湿润。为了得到不可接受的病理(骨关节病，滑膜炎，异物)的证据对关节和关节液进行检测。

测试物的植入：引入微球压紧物(MC)之前，通过烧灼止血。在六只羊的膝关节内植入标准剂量的负载有药物的微球并且作为对照在另外六只动物的膝关节内植入空载微球。在髌骨间隙植入MC。用0.9%的氯化钠溶液连续冲洗打开的关节和软组织表面。髌骨内脂肪垫从股骨内侧髁缩回并拉直膝盖，以缩短髌骨，从而避免软组织对新备的伤口的无意接触。

伤口缝合：髌骨下脂肪垫从股骨内侧髁缩回并拉直膝盖，以缩短髌骨，从而避免新植入MC与软组织的无意接触。通过全方位的移动使腿循环。用Vicryl2-0缝合韧带和皮下组织及关节囊，用普迪丝(PDS2-0)缝合亚皮肤层。用Monocryl2-0缝合皮肤。最后，用喷雾汽化缝合线并且施加软绷带。

术后护理：术后立即断开麻醉器与动物的连接并且在完全重建吞咽反射后拔管。将动物放回畜栏，在那里它只能保持站立的姿势。在程序的最后，当羊完全恢复后，通过肌肉注射盐酸丁丙诺菲(10μg/kg)给药。每天两次给药抗生素(盘尼西林、IlocillinPS)五天。在余下的生存期中，山羊被关在一个农场的环境中不限制其运动，直到尸体解剖。有资质的兽医针对任何严重畸形和过度不适体征为动物做了常规检查。术后14天和尸体解剖之前进行了步态分析。

本技术不限于递送亲水性/水溶性物质，因为它可以使得非水溶性(即不是亲水性的)或最低限度可溶的药物和活性成分被封装并成功地递送。例如，已递送了诸如氯酚红(CR)的染料，其不能很好地溶于水。使用本技术可以递送的另一种药物为抗纤维化药物氟尿嘧啶(5-FU)，该药物可溶于DMSO/DMF/甲醇但不溶于水。

将CR包封入微球中的目的为确定当在植入位点处受到摩擦时微球是否会破裂。在这种情况下，CR以固体形式被包封，其仅以最少量溶于水应该不会通过扩散穿过微球壁，仅当微球壁破裂后被释放。释放后，CR与周围环境反应并在中性pH的体液中将颜色从黄色变到紫色。对于5-FU，其以液体状也以粉末状并入微球中。在两种情况下的药物释放是可测量的。

在药物释放过程中，为了保持在核-壳PLLA-PLGA微球中的壳屏障，PLLA应该降解得比PLGA慢很多。由于壳中富含PLLA，一旦PLGA降解，就会在壳中形成孔，使得药物可以通过扩散释放。降解PLGA和PLLA所需的时间取决于其分子量。因此，可以将分子量较低的PLGA与分子量较低的PLLA结合而不会影响释放特性，只要PLLA降解得仍然比PLGA慢很多。

图16中显示了第一聚合物降解后本发明的颗粒的显微图像。颗粒已被打破以暴露出其内部结构。可以清楚地看见颗粒的核中有大洞而在其周围的壳中有孔，它们都是颗粒中的第一聚合物降解产生的。

Claims

1.包含多个微粒的物质，所述微粒包括：

包含第一聚合物的核，和

包围在所述核周围并且包含所述第一聚合物和第二聚合物的壳，所述第二聚合物降解得比所述第一聚合物慢，其中所述第一聚合物形成多个穿过所述壳的连续通道。

2.根据权利要求1所述的物质，其中所述第二聚合物生物降解得比所述第一聚合物慢。

3.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第二聚合物为半晶质的。

4.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第二聚合物的分子量为100kDa或更大。

5.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物的分子量为1至60kDa。

6.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物的分子量大于75kDa。

7.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述微粒中所述第二聚合物与所述第一聚合物的重量比在1:1到2:1的范围内。

8.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物的降解不产生有毒产物。

9.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且所述第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

10.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物在所述壳中以少于25wt％的量存在。

11.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物和第二聚合物至少部分不互溶，任选地基本上不互溶。

12.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述第一聚合物为其降解速率取决于它的分子量。

13.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述核包含可释放材料。

14.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料为颗粒状的。

15.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料吸附在所述核中的纳米颗粒上或吸附在所述核中的纳米颗粒中，或既吸附在所述核中的纳米颗粒上又吸附在所述核中的纳米颗粒中。

16.根据权利要求15所述的物质，其中所述纳米颗粒为无机纳米颗粒。

17.根据权利要求16所述的物质，其中所述纳米颗粒包括磷灰石。

18.根据权利要求14或15所述的物质，其中所述第一聚合物和第二聚合物基本上不互溶并且其中所述纳米颗粒，如果存在，或所述可释放材料的颗粒，如果存在，小于所述通道的直径。

19.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料为治疗性物质。

20.根据权利要求19所述的物质，其中所述治疗性物质为药物。

21.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料选自蛋白质、蛋白质片段、酶、DNA、DNA片段、RNA、RNA片段、多糖、激素、生长因子、非以上任一种的药物和它们中的任何两种或更多种的混合物。

22.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料为亲水性的。

23.根据权利要求22所述的物质，其中所述可释放材料可以分散在水中或溶解在水中。

24.根据权利要求13所述的物质，其中所述可释放材料为疏水性的。

25.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述微粒分散在载体中。

26.根据权利要求25所述的物质，其中所述载体为水凝胶、膜或支架。

27.根据权利要求1或2所述的物质，其中所述微粒至少部分粘结在一起形成固体物质。

28.包含至少两种不同物质的组合物质，每种所述物质为根据权利要求1所述的物质，其中：

每种所述物质的微粒的核包含可释放材料，并且

所述不同物质的所述微粒的壳为使得它们在相同条件下经过不同的时间降解，从而在所述不同物质的微粒中的所述可释放材料能够顺序释放。

29.根据权利要求28所述的组合物质，其中至少两种所述不同物质的所述可释放材料相同。

30.根据权利要求28所述的组合物质，其中每种所述不同物质的所述可释放材料与每种其他的不同物质的所述可释放材料不相同。

31.根据权利要求28至30中的任一项所述的组合物质，其中所述不同物质的所述微粒的壳具有不同的厚度，使得它们在相同条件下经过不同的时间降解。

32.根据权利要求28所述的组合物质，其中所述不同物质的所述微粒的第二聚合物的分子量不相同，以便所述不同物质的壳在相同条件下经过不同的时间降解。

33.根据权利要求28所述的组合物质，其中每种所述不同物质的所述微粒的第一聚合物相同并且每种所述不同物质的所述微粒的第二聚合物相同。

34.根据权利要求33所述的组合物质，其中所述第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且所述第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

35.用于制备包含多个微粒的物质的方法，所述方法包括：

将包含在第一溶剂中的第一聚合物的第一溶液与包含在第二溶剂中的第二聚合物的第二溶液合并，以形成混合的聚合物溶液，所述第二聚合物降解得比所述第一聚合物慢并且所述第一聚合物和第二聚合物至少部分不互溶，任选地基本不互溶，并且所述第一溶剂和第二溶剂相互混溶；

将所述混合的聚合物溶液在水性介质中乳化以形成乳液，所述水性介质与所述第一溶剂和第二溶剂至少部分不互溶，其中所述水性介质至少部分被所述第一溶剂和/或所述第二溶剂饱和；

随后将所述乳液老化足够的时间以允许在所述乳液的液滴中所述第一聚合物与所述第二聚合物至少部分分离，以形成包含所述第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含所述第一聚合物和所述第二聚合物的壳；以及

除去所述第一溶剂和第二溶剂以形成作为水性悬浮液的所述物质，其中每个所述微粒包括包含所述第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含所述第一聚合物和所述第二聚合物的壳，其中所述第一聚合物形成多个穿过所述壳的连续通道。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一溶剂和第二溶剂相同。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中除去所述溶剂的步骤包括用所述水性液体稀释作为水性悬浮液的所述颗粒状物质，所述水性液体中既不含有所述第一溶剂也不含有所述第二溶剂。

38.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述水性介质包含乳化剂。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述乳化剂为甲基纤维素。

40.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一溶液包含可释放材料，借此所述微粒的核包含所述可释放材料。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述可释放材料为颗粒状的。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述可释放材料吸附在纳米颗粒上或吸附在纳米颗粒中，或者既吸附在纳米颗粒上又吸附在纳米颗粒中。

43.根据权利要求40所述的方法，包括通过将前驱体溶液与所述可释放材料合并而制备所述第一溶液的步骤，所述前驱体溶液包含在所述第一溶剂中的所述第一聚合物。

44.根据权利要求40所述的方法，其中可释放材料与第一聚合物的重量比小于1:1。

45.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第二聚合物为半晶质的。

46.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第二聚合物的分子量为100kDa或更大。

47.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一聚合物的分子量小于40kDa。

48.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一聚合物的分子量大于75kDa。

49.根据权利要求35或36所述的方法，其中在所述混合的聚合物溶液中所述第二聚合物与所述第一聚合物的重量比为使得所述方法形成包括包含所述第一聚合物的核和包围在所述核周围并且包含所述第一聚合物和所述第二聚合物的壳的微粒。

50.根据权利要求49所述的方法，其中在所述混合的聚合物溶液中所述第二聚合物与所述第一聚合物的重量比在1:1到2:1的范围内。

51.根据权利要求35或36所述的方法，包括以下步骤：选择所述第一聚合物的分子量、所述第二聚合物的分子量和所述第一聚合物和第二聚合物的比例中的任何一种，使得可释放材料，如果存在于所述微粒的核中，可以以所需的速率或在所需的延迟时段里从所述微粒中释放。

52.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一聚合物为其降解不产生有毒产物。

53.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一聚合物为聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)并且所述第二聚合物为聚(L-乳酸)(PLLA)。

54.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述老化步骤在连续搅拌下进行。

55.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述溶剂萃取步骤与所述老化步骤至少部分同时进行，借此所述老化和溶剂去除步骤有足够的时间以允许在所述乳液的液滴中所述第一聚合物与所述第二聚合物至少部分地分离，以便形成包含所述第一聚合物的核和包围在所述核周围且包含所述第一聚合物和所述第二聚合物的壳，其中所述第一聚合物形成多个穿过所述壳的连续通道。

56.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一溶剂和第二溶剂与所述水性液体部分混溶并且除去所述溶剂的步骤包括用所述水性液体稀释作为水性悬浮液的所述颗粒状物质，所述水性液体中既不含有所述第一溶剂也不含有所述第二溶剂。

57.根据权利要求35或36所述的方法，包括从所述水性液体中分离所述颗粒状物质。

58.根据权利要求57所述的方法，包括在模具中以足够的温度加热所述分离出的颗粒状物质足够的时间，使得所述微粒粘结在一起，以便由所述颗粒状物质形成小球。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述足够的温度为所述第二聚合物的玻璃化转变温度或者高于所述温度。

60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述第一溶液包含可释放材料并且所述足够的温度低于所述可释放材料在所述足够的时间内降解的温度。

61.用于向液体递送材料的方法，所述方法包括在能降解所述第一聚合物的降解剂的存在下将根据权利要求1所述的物质暴露于所述液体，所述物质为其中所述微粒的核含有所述材料的物质。

62.权利要求61所述的方法，其中所述液体为所述降解剂或包含所述降解剂。

63.根据权利要求61或62所述的方法，其用于非治疗、非诊断的目的。

64.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述物质的微粒粘结在一起。

65.根据权利要求13所述的物质在制备用于治疗患者中的疾病状态的药物中的用途，其中所述可释放材料被指明用于治疗所述疾病状态。

66.根据权利要求65所述的用途，其中所述患者为非人类患者。

67.根据权利要求65所述的用途，其中所述疾病状态为疼痛并且所述可释放材料为止痛剂。

68.根据权利要求65所述的物质的用途，其中所述疾病状态为青光眼，其中所述可释放材料被指明用于治疗青光眼。

69.根据权利要求68所述的用途，其中所述可释放材料为酒石酸溴莫尼定。

70.根据权利要求65所述的用途，其中所述可释放材料为抗纤维化剂。

71.根据权利要求70所述的用途，其中所述抗纤维化剂为氟尿嘧啶。