WO2022215718A1 - Ｔ細胞活性化方法 - Google Patents

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総一郎 大垣
秀夫 荒木
瑛起 前田
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武田薬品工業株式会社
ノイルイミューン・バイオテック株式会社
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for activating T cells. More specifically, the present invention relates to the generation of T cells (referred to herein as “CAR-T cells”) that express chimeric antigen receptors (referred to as “CAR” herein). It relates to a method for activating T cells useful for
  • CAR-T cell therapy is known as one of cancer treatment methods.
  • CAR-T cells are produced, for example, using autologous T cells collected from patients themselves, but the high production cost and the risk of production failure are one of the business challenges.
  • many cancer patients who receive CAR-T cell therapy have T cells that have been damaged by treatment with anticancer drugs, etc., compared to healthy subjects, so the process of producing CAR-T cells from patient-derived T cells production efficiency tends to be low.
  • Patent Literature 1 describes the use of a matrix of flexible polymer chains (nanomatrix) to which a stimulating substance is attached for the activation of T cells.
  • T cells Conventionally, the activation process of T cells was generally considered to be performed under daily conditions such as 24 hours, 48 hours (2 days), or 72 hours (3 days) (non-patent literature 1-7).
  • An object of the present invention is to provide means for improving the production efficiency of CAR-T cells.
  • the present inventors have focused on the activation process of T cells, and by studies using T cells from multiple donors, the activation time in the T cell activation process is within a specific range (e.g., longer than 36 hours, 48 hours). It was found that the expression efficiency of CAR is improved by setting the time to be shorter than the time.
  • the present invention includes at least the following inventions.
  • a method of activating T cells comprising activating T cells for greater than 36 hours and less than 48 hours in media containing a CD3 agonist and/or a CD28 agonist.
  • Item 2. The activation method according to Item 1, wherein the CD3 agonist and/or the CD28 agonist is supported on a carrier.
  • the carrier is a matrix or beads of flexible polymer chains.
  • Item 4. The activation method according to any one of Items 1 to 3, wherein the CD3 agonist and the CD28 agonist are an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, respectively.
  • Item 6. A cell population containing genetically modified T cells obtained by the production method according to Item 5.
  • Item 6. The production method according to Item 5, wherein the exogenous gene is a chimeric antigen receptor gene.
  • a T cell activation kit for introducing a foreign gene comprising: a CD3 agonist and/or a CD28 agonist supported on a carrier; instructions stating that T cells are activated with medium containing said CD3 agonist and/or CD28 agonist for more than 36 hours and less than 48 hours.
  • the method for activating T cells such as [1] above is referred to as the "activation method of the present invention”
  • the method for producing genetically modified T cells such as [5] above is referred to as the “production method of the present invention”.
  • a cell population containing the genetically modified T cells of [6] may be referred to as a "cell population of the present invention”.
  • the present invention it is possible to optimize the activation step that imposes a heavy burden on T cells and to produce genetically modified T cells such as CAR-T cells with high efficiency. It is possible to reduce manufacturing costs and improve manufacturing efficiency by shortening manufacturing days.
  • FIG. 1 shows the cell population (activation step 24, 48 or 72 hours) obtained by "(2) Small-scale production of CAR-T cells using PBMC" in the example, and "(4) Flow The results of measurement of CAR-expressing cells by cytometry are shown.
  • Figures 1A and 1B show the percentage of CAR-expressing cells (Figure 1A) and the number of CAR-expressing cells ( Figure 1B) when PBMCs derived from two donors (Donor A and Donor B) were used.
  • FIG. 1 shows the cell population (activation step 24, 48 or 72 hours) obtained by "(2) Small-scale production of CAR-T cells using PBMC” in the example, and “(4) Flow The results of measurement of CAR-expressing cells by cytometry are shown.
  • Figures 1A and 1B show the percentage of CAR-expressing cells ( Figure
  • FIG. 2 shows the cell population (activation step 40, 44 or 48 hours) obtained by “(2) Small-scale production of CAR-T cells using PBMC” in the example, “(4) Flow The results of measurement of CAR-expressing cells by cytometry are shown.
  • Figures 2A and 2B show the percentage of CAR-expressing cells (Figure 2A) and the number of CAR-expressing cells (Figure 2B) when using PBMCs derived from 3 donors (Donor A, Donor C and Donor D).
  • FIG. 3 shows the cell population (activation step 37 to 44 hours) obtained by "(2) Small-scale production of CAR-T cells using PBMC" in the example, "(4) flow cytometry ” shows the results of measuring CAR-expressing cells.
  • N 3, values in the figure represent the mean ⁇ standard deviation). show).
  • FIG. 4 shows the cell population (activation step 40, 44 or 48 hours) obtained by “(2) Small-scale production of CAR-T cells using PBMC” in the example, “(4) Flow The results of measuring activated T cells using the activation marker CD25 or CD69 as an indicator by cytometry", and the results of "(5) analysis of the remaining amount of TransACT and IL-2 used for activation” The results of analyzing the amount of TransACT used and the amount of IL-2 remaining in the medium are shown.
  • FIG. 5 shows a graph obtained by using three donor-derived human leukocyte apheresis products (Donor E, Donor F and Donor G) according to "(3) Production of CAR-T on a clinical scale using T cells" in the example. The results of measuring CAR-expressing cells by "(4) flow cytometry" in the cell population obtained (36, 40, 44 or 48 hours after activation) are shown.
  • the activation method of the present invention is a method for activating T cells, the step of activating T cells for more than 36 hours and less than 48 hours in a medium containing a CD3 agonist and/or a CD28 agonist (this specification referred to as an "activation step" in the literature).
  • T cells are not particularly limited as long as they are activated and used according to the purpose and application. , memory T cells, naive T cells, NKT cells, regulatory T cells, and the like.
  • T cells are generally used to infiltrate body fluids such as blood and bone marrow; tissues such as spleen, thymus, lymph nodes, and liver; Cells can be harvested, for example, as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and leukapheresis.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the T cells used in the present invention may be specific T cells isolated and purified from the collected immune cell population, or contained in the cell population (e.g., PBMC, etc.) without isolation. state T cells.
  • T cells are induced to differentiate into T cells by culturing induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), other stem cells, progenitor cells, etc. under appropriate conditions. It can be anything.
  • T cells may be human-derived, or may be cells derived from mammals other than humans (non-human mammals).
  • Non-human mammals include, for example, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, horses, sheep, and monkeys.
  • the T cells activated by the method of the present invention are T cells for introducing foreign genes, for example, CAR (chimeric antigen receptor) for introducing foreign genes for expressing are T cells of
  • the T cells may be, for example, CD8 + T cells or CD4 + T cells, which are obtained from blood, such as those contained in peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CAR-T cells may also be derived from humans, such as cancer patients and other humans to whom CAR-T cells are to be administered.
  • CD3 agonist and CD28 agonist refer to substances that bind to CD3 and CD28 (receptors) as agonists, respectively, and stimulate T cells for activation.
  • a typical CD3 agonist is an anti-CD3 antibody
  • a typical CD28 agonist is an anti-CD28 antibody.
  • PHA phytohemagglutin (Weng et al., J.Ethnopharmacol, 2002, 83(1-2):79-85)))
  • Anti-CD3 and anti-CD28 antibodies may be monoclonal or polyclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.
  • RetroNectin (trademark) (Recombinant Human Fibronectin Fragment, Takara Bio Inc.) may be used simultaneously with a CD3 agonist and/or a CD28 agonist in the T cell activation step.
  • the concentrations of the CD3 agonist and CD28 agonist are not particularly limited as long as they are concentrations that can stimulate surface molecules of T cells, transmit signals into T cells, and induce activation.
  • the final concentration of each antibody can be 0.1-20 ⁇ g/mL.
  • the antibody when using a matrix of flexible polymer chains carrying anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody (eg, TransACT), the antibody can be used at a final concentration of 10-300 ng/mL.
  • the molar ratio of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody can be 1:5 to 5:1, preferably 1:2 to 2:1.
  • T cells are activated by culturing them for more than 36 hours and less than 48 hours in a medium containing a CD3 agonist and/or a CD28 agonist.
  • Activation times of "more than 36 hours and less than 48 hours” are, for example, 37 hours, 38 hours, 39 hours, 40 hours, 41 hours, 42 hours, 43 hours, 44 hours, 45 hours, 46 hours, 47 hours. .
  • These numerical values (N hours) are arbitrary, and the lower limits (N hours or more, or more than N hours) and/or an upper limit (not more than N hours, or less than N hours).
  • a preferred embodiment of the activation time of the present invention is 37 to 44 hours, more preferably 39 to 44 hours, still more preferably 39 to 42 hours, and most preferably 39 to 41 hours.
  • the activation step can be terminated by replacing the medium containing the CD3 agonist and/or the CD28 agonist with a medium that does not contain the medium, or by diluting the medium containing the CD3 agonist and/or the CD28 agonist.
  • the activation time in the present invention does not include the time for culturing the T cells in the medium after such dilution.
  • the activation step using TransACT can be terminated by diluting to 70% or less (preferably 50% or less).
  • the culturing period for carrying out the activation method of the present invention is 24 hours, 48 hours or 72 hours, and is compared to the case of culturing under the same conditions otherwise (control group). This is the culture period during which the CAR expression efficiency is high.
  • the CAR expression efficiency can be indexed by (a) the ratio of CAR-expressing cells in a cell population, or (b) the number of CAR-expressing cells in a cell population.
  • Step 3 of the "Method for Producing Genetically Modified T Cells" (the production method of the present invention) described later: At a stage after the culture step, if at least one of the above indicators (a) and (b) is higher than the control group , it can be evaluated that "the CAR expression efficiency has increased.”
  • the culture time for activating T cells is set to a specific range. temperature, atmosphere, cell density, etc.) can be adjusted according to known or general methods for activating T cells, or can be appropriately adjusted to suit the present invention.
  • the cell density at the time of seeding in the activation step can be, for example, 1.0x10 5 to 1.0x10 7 cells/mL, preferably 2.0x10 5 to 6.0x10 6 cells/mL.
  • the culture vessel in the activation process is not particularly limited, and can be appropriately selected from plates, dishes, petri dishes, flasks, bags, bottles, tanks (culture tanks), etc., according to the culture scale.
  • a closed automated culture device such as the CliniMACS ProdigyTM (Miltenyi Biotec) can be used.
  • a known or common medium used for culturing T cells can be used, and the medium can be appropriately supplemented with necessary components.
  • Examples of media in the activation step include AIM V, X-VIVO-15, NeuroBasal, EGM2, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Modified MEM Zinc Option, IMDM, 199 medium, Eagle MEM, ⁇ MEM, DMEM, Ham, RPMI-1640, Fisher's medium, and various other commercially available products for T cell culture (e.g., CTS TM OpTmizer TM T-Cell Expansion Basal Medium (Thermo Fisher Scientific), CTS TM OpTmizer TM Pro Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific), CTS TM OpTmizer TM Pro (Thermo Fisher Scientific), CTS TM OpTmizer TM T-Cell Expansion Supplement (Thermo Fisher Scientific)). Any one of these media may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • CTS TM OpTmizer TM T-Cell Expansion Basal Medium Thermo Fisher Scientific
  • the medium may be a serum-containing or serum-free medium, or a xeno-free medium. From the standpoint of preventing contamination with xenogenic components, the serum may be derived from the same animal as the cells being cultured.
  • Serum-free medium refers to a medium without unprocessed or unpurified serum, and thus may include medium with purified blood-derived or animal tissue-derived components, such as growth factors. The medium may or may not contain any substitute for serum.
  • Serum substitutes include albumin (lipid-rich albumin, bovine albumin, albumin substitutes such as recombinant or humanized albumin, plant starch, dextrans, protein hydrolysates, etc.), transferrin (or other iron transporters), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol ( ⁇ -monothioglycerol, MTG), or equivalents thereof, as appropriate. .
  • KSR knockout Serum Replacement
  • Chemically-defined Lipid concentrated Chemically-defined Lipid concentrated (Thermo Fisher Scientific)
  • GlutaMAX Thermo Fisher Scientific
  • the medium may be serum free medium (SFM).
  • the medium may contain B-27TM supplement, Xenofree B-27TM supplement, NS21 supplement, GS21TM supplement, or any of these at concentrations effective to produce T cells from 3D cell aggregates. may include a combination of
  • DL alpha tocopherol acetate DL alpha-tocopherol
  • vitamins such as vitamin A (acetate); BSA (bovine serum albumin) or human albumin, fatty acid-free fraction V; catalase; human recombinant insulin; proteins such as superoxide dismutase; corticosterone; D-galactose; ethanolamine HCl; glutathione (reduced); L-carnitine HCl; triiodo-L-thyronine); PSG (penicillin, streptomycin, and L-glutamine).
  • the medium may contain exogenously added ascorbic acid or a derivative thereof (eg, ascorbic acid 2-phosphate: PAA).
  • the medium contains externally added fatty acids or lipids, amino acids (such as non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antibiotics, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, and inorganic salts, respectively. It may contain one or more selected from the group consisting of.
  • the medium may contain externally added cytokines.
  • Cytokines include, for example, FLT3 ligand (FLT3L), interleukin 7 (IL-7), stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL- 12, IL-15, IL-18, IL-21, TNF-alpha, TGF-beta, interferon-gamma, interferon-lambda, TSLP, thymopentin, pleotrophin, and midkine. Any one of these cytokines may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • Preferred cytokines include IL-2.
  • the CD3 agonist and/or CD28 agonist is supported on a matrix of flexible polymer chains.
  • a CD3 agonist and a CD28 agonist are supported on a matrix of flexible polymer chains, and this embodiment corresponds to It is a product that
  • a “flexible matrix” may be made of collagen, purified proteins, purified peptides, polysaccharides, glycosaminoglycans, or extracellular matrix compositions.
  • Polysaccharides include, for example, cellulose ether, starch, gum arabic, agarose, dextran, chitosan, hyaluronic acid, pectin, xanthan, guar gum or alginate.
  • the flexible matrix is a polymer of dextran.
  • the CD3 agonist and/or the CD28 agonist are bead-supported.
  • Specific examples include magnetic beads such as Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific).
  • a CD3 agonist and/or a CD28 agonist is “carried” or “attached” to such a mobile matrix or bead.
  • Substances can be attached or coupled to the mobile matrix by a variety of methods known and available in the art. Attachment may be covalent or non-covalent attachment, electrostatic attachment, or hydrophobic attachment, attachment may be chemical, mechanical, e.g. This may be accomplished by various means of attachment, such as enzymatic or other means.
  • antibodies may be attached directly to the matrix or beads, or indirectly via anti-isotype antibodies. Alternatively, attachment may be via protein A or protein G, eg, attached to a matrix or beads, or other non-specific antibody binding molecules.
  • substances may be attached to matrices or beads by chemical means, such as cross-linking to matrices or beads.
  • the CD3 agonist and/or CD28 agonist is a DNA-based T-cell activator ( Keskar et al., J immunother, 2020, vol.43, no.8, 231-235).
  • the production method of the present invention is a method for producing genetically modified T cells, and includes steps 1 to 3 below.
  • Step 1 Step of activating T cells by the activation method of the present invention
  • Step 2 Step of introducing a foreign gene into the activated T cells (herein referred to as “introduction step”).
  • Step 3 Step of culturing T cells into which the exogenous gene has been introduced (herein referred to as “culturing step”)
  • Step 1 Activation step
  • the activation step is a step of activating T cells by carrying out the activation method of the present invention described above.
  • the details of the activation step reference can be made to the above-described activation method of the present invention.
  • Step 2 Introduction step The introduction step is a step of introducing a foreign gene into the T cells obtained by the activation step.
  • a “foreign gene” is a gene that is introduced from the outside in order to express a desired protein in T cells, and can be appropriately selected according to the use of the T cells to be produced. One type or multiple types of foreign genes may be used.
  • the foreign gene can contain a gene for expressing CAR.
  • foreign genes can include genes for expressing CARs and genes for expressing cytokines and/or chemokines.
  • exogenous gene expression of CAR and a combination of certain cytokines and chemokines can enhance anti-tumor activity by T cells.
  • Other foreign genes include antigen-specific TCR (T cell receptor) and STAR receptor (Synthetic TCR and antigen receptor) (Liu et al., Sci. Transl. Med. 2021, vol. 13, issue. 586) can be introduced into T cells.
  • CARs CARs expressed by T cells basically consist of (i) a target recognition site, (ii) a cell transmembrane region, and (iii) a signal transduction region that induces activation of T cells, similar to common or known CARs. , are connected via spacers as necessary.
  • the target recognition site can be, for example, an antibody (eg, single-chain antibody) that recognizes the cell surface antigen of cancer cells.
  • a single-chain antibody that recognizes a cell surface antigen of cancer cells typically comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region derived from the antigen-binding site of a monoclonal antibody that specifically binds to the antigen, and A single-chain variable region fragment (scFv) composed of a linker peptide that connects
  • the target recognition site may recognize any target as long as the CAR can specifically exhibit an antitumor effect on cancer cells. It may also be an antibody (eg, single-chain antibody) that recognizes the constant region of an antibody that specifically binds.
  • the “cell surface antigens of cancer cells” targeted by CAR are biomolecules that are specifically expressed in cancer cells and their progenitor cells, and biomolecules that are newly expressed due to canceration of cells. , or any biomolecule whose expression level is increased in cancer cells compared to normal cells.
  • antigens are commonly referred to as "tumor-associated antigens” (TAAs) and include, for example, BCMA, B7-H3, B7-H6, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30.
  • the cell transmembrane region is a polypeptide that serves as a region for fixing CAR to the cell membrane of T cells.
  • Such cell transmembrane regions include, for example, BTLA, CD3 ⁇ , CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 4-1BB (CD137), CTLA-4, GITR, ICOS, LAG3, OX40, SLAMF4 (CD244, 2B4), or transmembrane regions from the ⁇ or ⁇ chain of the T cell receptor.
  • transmembrane domain of CD8 is preferred as the transmembrane domain.
  • the transmembrane region may be linked to a hinge region, which is a peptide (oligopeptide or polypeptide) consisting of any amino acid sequence and having a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 70 amino acids.
  • hinge regions can include, for example, CD3, CD8, KIR2DS2, or hinge regions derived from IgG4, IgD or other immunoglobulins.
  • the hinge region of CD8 is preferred.
  • the signal transduction region that induces activation of T cells when the target recognition site (e.g., single-chain antibody) recognizes and binds to a target (e.g., cell surface antigen of cancer cells), T cells It is a polypeptide that serves as a region for signaling within.
  • target e.g., cell surface antigen of cancer cells
  • signaling regions include MHC class I molecules, TNF receptor proteins, immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, activated NK cell receptors, Toll-like receptors, B7-H3, BAFFR, BTLA, BY55 (CD160), CD2, CD3 ⁇ , CD4, CD7, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69 , CD84, CD96 (Tactile), CD103, 4-1BB (CD137), CDS, CEACAM1, CRTAM, CNAM1 (CD226), DAP10, Fc Receptor-associated ⁇ chain, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1 , ICOS (CD278), IL2R ⁇ , IL2R ⁇ , IL7R ⁇ , ITGA
  • the signaling domain may comprise two intracellular domains of CD28 and CD3zeta, two of 4-1BB and CD3zeta, or three intracellular domains of CD28, 4-1BB and CD3zeta. preferable.
  • the intracellular domains may be linked via linker peptides (oligopeptides or polypeptides) consisting of 2 to 10 amino acids.
  • linker peptides include peptides consisting of consecutive glycine-serine sequences.
  • the target recognition site (e.g., single-chain antibody) and the cell transmembrane region, and the cell transmembrane region and the signal transduction region each have a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 50 amino acids, consisting of an arbitrary amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the above-mentioned CAR expressed by T cells should be appropriate according to the use of T cells, typically the function as an active ingredient of a drug for treating cancer.
  • Various amino acid sequences of single-chain antibodies against cell surface antigens of cancer cells which is an example of the target recognition site (i), are known, and information on those amino acid sequences can be used in the present invention.
  • an antibody against a cell surface antigen of a desired cancer cell is newly produced, the amino acid sequence of the novel antibody (preferably heavy and light chain variable regions, especially CDRs) is determined, Information may be used in the present invention.
  • the target recognition site (i) is an antibody that recognizes the constant region of an antibody that binds to surface antigens of cancer cells, it can also be obtained or produced by conventional methods.
  • cytokines are known as cytokines that can be expressed together with CAR in T cells, and known cytokines can be expressed by exogenous genes in the present invention.
  • cytokines include, for example, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, and the like.
  • the number of cytokines expressed by T cells may be one, or two or more.
  • the cytokine is preferably derived from the same animal species (human or non-human mammal) as the T cell into which the foreign gene is to be introduced (the cytokine receptor possessed by the T cell).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/), UniProt (The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org) and other databases, so that information can be used in the present invention.
  • cytokine in the present invention includes not only natural full-length proteins but also proteins (polypeptides) that have been modified in various ways such as maintaining or enhancing the function of cytokines. That is, cytokines in the present invention are (a) whole or part of a protein (polypeptide) consisting of a natural amino acid sequence (functional partial polypeptide), (b) one or more (c) the full-length protein or partial polypeptide is modified at the N-terminus or C-terminus of another protein (e.g., signal peptide, receptor protein subunit, etc.)
  • a fusion protein linked to a Variants of (b) above include, for example, full-length or partial regions (domains) that have 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more identity to the amino acid sequence of a natural cytokine, Those having an amino acid sequence that is 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or
  • chemokines are known as chemokines that can be expressed together with CAR in T cells, and known chemokines can also be expressed by exogenous genes in the present invention. Such chemokines include, for example, CCL19.
  • the number of chemokines expressed by T cells may be one, or two or more.
  • the chemokine is preferably derived from the same animal species (human or non-human mammal) as the T cell into which the exogenous gene is introduced (the chemokine receptor possessed by the T cell).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/), UniProt (The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org) and other databases, so that information can be used in the present invention.
  • chemokine in the present invention includes not only natural full-length proteins, but also variously modified proteins (polypeptides) that retain or enhance their functions as chemokines. That is, the chemokine in the present invention includes (a) a whole protein (polypeptide) consisting of a natural amino acid sequence or a part thereof (a functional partial polypeptide), and (b) one or more any amino acid deletion, substitution or addition variant.
  • Variants of (b) above include, for example, full-length or partial regions (domains) that have 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more identity to the amino acid sequence of a natural chemokine, Those having an amino acid sequence that is 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the means for introducing foreign genes into T cells is not particularly limited, and various known or general means can be adopted.
  • foreign genes are introduced and expressed in T cells using expression vectors.
  • Expression vectors may be linear or circular, and may be non-viral vectors such as plasmids, viral vectors, or transposon-based vectors.
  • the method for introducing the expression vector into T cells can be appropriate according to the embodiment.
  • an expression vector can be introduced into T cells by known methods such as viral infection, calcium phosphate, lipofection, microinjection, and electroporation.
  • the expression vector can be prepared into a form suitable for use in each technique by known means and using a commercially available kit (according to the instructions).
  • the introducing step may involve contacting the T cells with such a preparation, generally culturing the T cells in medium supplemented with the preparation containing the expression vector.
  • expression vectors are introduced into T cells by viral infection methods.
  • Viral vectors include, for example, retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • Preferred retroviral vectors include, for example, pMSGV vector (Tamada k et al., ClinCancer Res 18:6436-6445 (2002)), pMSCV vector (manufactured by Takara Bio Inc.), and SFG vector.
  • pMSGV vector Temada k et al., ClinCancer Res 18:6436-6445 (2002)
  • pMSCV vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • SFG vector SFG vector
  • a recombinant virus is prepared by transfecting a vector containing a desired foreign gene and a packaging vector (plasmid) of each virus into a host cell using a corresponding commercially available kit.
  • the resulting recombinant virus may be used to infect T cells.
  • Commercially available viral vector kits include, for example, Retrovirus packaging Kit Eco (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • host cells include GP2-293 cells (manufactured by Takara Bio Inc.), Plat-GP cells (manufactured by Cosmo Bio Inc.), PG13 cells (ATCC CRL-10686), PA317 cells (ATCC CRL-9078), and the like. be done.
  • all foreign genes may be contained in one expression vector, all foreign genes may be contained in separate expression vectors, or may be contained in one expression vector and the rest in separate expression vectors.
  • one expression vector contains a plurality of exogenous genes, there is no particular limitation on the order in which the exogenous genes are arranged from the upstream side to the downstream side.
  • the foreign gene can be composed of a nucleic acid (polynucleotide) having a nucleotide sequence that encodes the desired protein or polypeptide amino acid sequence to be expressed in T cells, such as the aforementioned CAR, cytokine, or chemokine.
  • a nucleic acid contained in an expression vector may be produced by a chemical DNA synthesis reaction, or may be produced (cloned) as cDNA.
  • the expression vector contains a base sequence (foreign gene) encoding a desired protein or polypeptide, and optionally (in the case of a combination of multiple expression vectors as described above, each expression vector independently). , promoters, terminators, enhancers, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, nuclear localization signals (NLS), multiple cloning sites (MCS), etc. involved in the expression of each foreign gene. .
  • a gene encoding a self-cleavage peptide e.g., 2A peptide
  • IRES Internal Ribozyme Entry Site
  • Expression vectors may further include reporter genes (e.g., genes encoding fluorescent proteins of each color), drug selection genes (e.g., kanamycin resistance genes, ampicillin resistance genes, puromycin resistance genes), suicide genes (e.g., diphtheria A toxin, simple Herpes thymidine kinase (HSV-TK), carboxypeptidase G2 (CPG2), carboxylesterase (CA), cytosine deaminase (CD), cytochrome P450 (cyt-450), deoxycytidine kinase (dCK), nitroreductase (NR), purines Genes encoding nucleoside phosphorylase (PNP), thymidine phosphorylase (TP), varicella-zoster virus thymidine kinase (VZV-TK), xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT), inducible caspase 9, etc.) It may
  • nucleic acid may be any molecule as long as it is a polymer of nucleotides and molecules having functions equivalent to the nucleotides. Polymers in which nucleotides and deoxyribonucleotides are mixed, and nucleotide polymers containing nucleotide analogues can be mentioned, and nucleotide polymers containing nucleic acid derivatives can also be used.
  • a nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • a double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one strand hybridizes to the other strand under stringent conditions.
  • ribonuclease As a nucleotide analogue, compared with RNA or DNA, ribonuclease is used for improving or stabilizing nuclease resistance, for increasing affinity with complementary strand nucleic acid, for increasing cell permeability, or for visualization. Any molecule can be used as long as it is a molecule obtained by modifying nucleotides, deoxyribonucleotides, RNA or DNA.
  • Nucleotide analogues may be naturally occurring molecules or non-naturally occurring molecules, such as sugar moiety-modified nucleotide analogues (e.g., nucleotide analogues substituted with 2′-O-methyl ribose, 2′-O- Nucleotide analogues substituted with propyl ribose, nucleotide analogues substituted with 2'-methoxyethoxyribose, nucleotide analogues substituted with 2'-O-methoxyethylribose, 2'-O-[2-(guanidinium )ethyl]ribose-substituted nucleotide analogues, 2'-fluororibose-substituted nucleotide analogues, bridged nucleic acid (BNA), locked nucleic acid (LNA), ethylene Ethylene bridged nucleic acid (ENA), peptide nu
  • nucleic acid derivative a different chemical is added to the nucleic acid in order to improve the nuclease resistance compared to the nucleic acid, to stabilize the nucleic acid, to increase the affinity with the complementary strand nucleic acid, to increase the cell permeability, or to make the nucleic acid visible.
  • Any molecule may be used as long as it is a molecule to which a substance is added, and specific examples thereof include 5′-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, and Cy3 addition derivatives. , 6-FAM-added derivatives, biotin-added derivatives, and the like.
  • the culture vessel, medium, additive components, other culture conditions, etc. in the introduction step can be the same as those described for the activation step as the activation method of the present invention. It can be selected as appropriate. However, the culture vessel, medium, additive components, etc. in the introduction step do not necessarily have to be the same as those in the activation step, and can be changed as appropriate.
  • Step 3 Culturing step
  • the culturing step is a step of culturing the T cells into which the exogenous gene has been introduced.
  • the culture period in the culture step is not particularly limited as long as the desired protein is expressed in T cells, and is for example 20 days, preferably 3 to 7 days.
  • the expression vector contains a drug resistance gene as a functional gene
  • a drug corresponding to the drug resistance gene used is added to the medium in the culture step
  • T cells may be cultured.
  • the expression vector contains a gene encoding a fluorescent protein (reporter gene) as a functional gene
  • the T cells into which the expression vector has been introduced are observed under a fluorescence microscope during or after the culture step, or the expression vector is The introduced T cells may be sorted using a cell sorter.
  • the culture vessel, medium, additive components, other culture conditions, etc. in the culture step can be the same as those described for the activation step as the activation method of the present invention. It can be selected as appropriate. However, the culture vessel, medium, additive components, etc. in the culture step are not necessarily the same as those in the activation step, and can be changed as appropriate.
  • the use of the cell population containing genetically modified T cells obtained by the production method of the present invention is not particularly limited, and it can be used for any desired purpose. can be used for
  • the pharmaceutical contains genetically modified T cells and may further contain other components as necessary.
  • a person skilled in the art can appropriately prepare such a drug using genetically modified T cells, taking into account the use (disease to be treated, patient to be administered, etc.) and dosage form.
  • the drug is, for example, a drug (anti-cancer) that targets cancer that corresponds to the cell surface antigen (cancer-specific antigen) of cancer cells targeted by CAR expressed by genetically modified T cells (anti-cancer drug). Therefore, as long as the cancer tissue contains cancer cells that express the antigen targeted by CAR and a certain level of therapeutic effect is observed by CAR-T cells, the type of cancer targeted by the drug is not particularly limited.
  • Cancers that can be targeted by pharmaceuticals include, for example, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, undifferentiated carcinoma, large cell carcinoma, small cell carcinoma, skin cancer (e.g., melanoma, Merkel cell carcinoma), breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, head and neck cancer, uterine cancer, cervical cancer, liver cancer, kidney cancer, pancreatic cancer , spleen cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, tracheal cancer, bronchial cancer, colon cancer, rectal cancer, small bowel cancer, colorectal cancer, gastric cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, Cancers such as ovarian cancer, fallopian tube cancer, nasopharyngeal cancer; cancers of bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, vascular tissue and hematopoietic tissue; chondrosarcoma, E
  • cancer types sensitive to NK cells (melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, renal cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, Non-small cell lung cancer, head and neck cancer, small intestine cancer, prostate cancer, bladder cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer , neuroblastoma, osteosarcoma, acute myelogenous leukemia, multiple myeloma, lymphoma, leukemia, etc.). More preferred are melanoma, colon cancer, renal cancer, multiple myeloma, lymphoma, and leukemia.
  • Components other than genetically modified T cells that can be contained in the medicament include, for example, pharmaceutically acceptable additives, more specifically physiological saline, buffered physiological saline, cell culture medium, dextrose, injection Water, glycerol, ethanol, stabilizers, solubilizers, surfactants, buffers, preservatives, tonicity agents, fillers, lubricants and the like.
  • pharmaceutically acceptable additives more specifically physiological saline, buffered physiological saline, cell culture medium, dextrose, injection Water, glycerol, ethanol, stabilizers, solubilizers, surfactants, buffers, preservatives, tonicity agents, fillers, lubricants and the like.
  • the drug can be used by administering it to subjects in need of cancer treatment (cancer patients, cancer-bearing animals, etc.) in the same manner as known genetically modified T cells (e.g., CAR-T cells).
  • Administration methods include, for example, intratumoral, intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, and intraperitoneal injection.
  • the amount of genetically modified T cells contained in the drug depends on the application, dosage form, and desired therapeutic effect, for example, the type, location, severity of cancer, age, weight, condition, etc. of the subject to be treated. You can adjust accordingly.
  • a single administration of the pharmaceutical contains 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 CAR-T cells, preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 cells, more preferably 5 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 9 cells. It can be formulated to be administered x108 .
  • the administration interval of the drug is not particularly limited, and can be adjusted as appropriate while considering the amount of the T cells of the present invention to be administered per dose. twice or once, every other day, every two days, every three days, every four days, every five days, once a week, every seven days, every eight days, every nine days, twice a week, once a month or It can be administered independently twice monthly.
  • Anticancer agents include, for example, alkylating agents such as cyclophosphamide, bendamustine, ifosfamide, and dacarbazine; Molecularly targeted drugs such as rituximab, cetuximab, trastuzumab; kinase inhibitors such as imatinib, gefenib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib, trametinib; proteasome inhibitors such as bortezomib; calcineurin inhibitors such as cyclosporine and tacrolimus; anticancer antibiotics such as mitomycin C; plant alkaloids such as irinotecan and etoposide; platinum agents such as cisplatin, oxaliplatin and carboplatin; hormone therapy agents such as tamoxifen and bicardamide; can be used in combination with known anticancer drugs.
  • Anticancer agents include, for example
  • the target recognition site of CAR is an antibody that recognizes the constant region of an antibody that specifically binds to a cell surface antigen of cancer cells
  • the genetically modified T cells recognize the cancer corresponding to the cell surface antigen. It can be used as a medicament for treatment.
  • a drug containing genetically modified T cells can be used in combination with a drug containing an antibody that specifically binds to the cell surface antigen.
  • iPSCs Induced pluripotent stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Yamanaka et al. Yamanaka K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676
  • human cell-derived iPSCs established by introducing the same four factors into human fibroblasts
  • Nanog-iPS cells were established by selecting Nanog expression as an indicator (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells produced by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), iPS cells established by introducing 6 factors by virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31( 3):458-66.) can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing the four factors of OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28 produced by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-307007) can also be used.
  • iPSC lines established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used as "induced pluripotent stem cells".
  • human iPSC strains include HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A, and Nips-B2 strains of RIKEN, and 253G1, 201B7, 409B2, and 454E2 strains of Kyoto University. strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, and the like.
  • clinical grade cell lines provided by Kyoto University, Cellular Dynamics International, etc., and research and clinical cell lines produced using these cell lines may be used.
  • mouse ESCs can use various mouse ESC strains established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (RIKEN), etc.
  • RIKEN RIKEN
  • human ESC strains include NIH CHB-1 to CHB-12, RUES1, RUES2, HUES1 to HUES28 strains, WisCell Research H1 and H9 strains, RIKEN KhES-1 and KhES-2 strains. strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc. can be used.
  • clinical grade cell lines and research and clinical cell lines generated using those cell lines may be used.
  • “Comprise(s) or comprising” means the inclusion of elements following the phrase, but is not limited to this. Thus, the inclusion of the elements following the phrase, but not the exclusion of any other element, is suggested. By “consisting of” is meant including and limited to any element following the phrase. Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed element is required or required and that other elements are substantially absent. “consisting essentially of or consisting essentially of” includes any element that follows the phrase and that does not affect the activity or action specified in this disclosure for that element. not be limited to other elements. Thus, the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or required but other elements are optional and that they affect the activity or action of the listed elements. indicates that it may or may not be present, depending on whether it exerts
  • a CAR gene (scFv-CD8 hinge region that recognizes and binds GPC3-CD8 transmembrane region-CD28 intracellular region-4-1BB intracellular region-CD3 ⁇ intracellular region was used as a foreign gene. ), IL-7 gene, and CCL19 gene were introduced via a self-cleavage linker 2A sequence. After washing the cells with culture medium, the total amount of cells was cultured on a culture plate with culture medium for 4-6 days.
  • Activated cells were diluted with culture medium using the LOVO Cell processing system (Fresenius Kabi) and transferred to a culture bag pre-coated with Retrorectin (Takara Bio Inc.) and Retrovirus at 6.07x10 5 cells/cm 2 . The cells were seeded below and cultured until the next day (gene transfer step).
  • a CAR gene (scFv-CD8 hinge region that recognizes and binds GPC3-CD8 transmembrane region-CD28 intracellular region-4-1BB intracellular region-CD3 ⁇ intracellular region was used as a foreign gene.
  • IL-7 gene, and CCL19 gene were introduced via a self-cleavage linker 2A sequence.
  • the cells were seeded in culture bottles (G-REX, Wilson Wolf) at 2.2 ⁇ 10 6 cells/cm 2 or less and cultured for 3 to 7 days.
  • the ratio of CAR-expressing cells and the number of CAR-expressing cells in samples after production were calculated by measuring CAR-expressing cells in CD45-expressing or CD3-expressing cells in samples using Protein-L. . Also, the percentage of cells expressing T cell activation markers (CD25, CD69) immediately after the activation step was calculated by measuring the cells expressing the markers among CD3 expressing cells or CD4 + or CD8 + expressing cells in the sample.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the number of expressing cells.
  • the percentage of CAR-expressing cells peaked at 40 hours in a donor-independent manner (Fig. 2A).
  • the number of CAR-expressing cells also tended to increase after 40 hours (Fig. 2B).
  • FIG. 4 shows the results of measuring activated T cells using as an indicator, and the results of analyzing the remaining amount of TransACT and IL-2 used for activation in the culture supernatant.
  • the percentage of CD25- or CD69-expressing cells did not differ between activation times (40, 44, 48 hours) immediately after the activation step (Figs. 4A and B).
  • Percentage of CAR-expressing cells by flow cytometry for the cell population obtained by "(3) Production of CAR-T cells on a clinical scale using T cells" is shown in FIG.
  • the percentage of CAR-expressing cells tended to increase at 40 hours in a donor-independent manner. Also, at 36 hours, the percentage of CAR-expressing cells decreased, and 36 hours of activation was insufficient to produce CAR-T cells.

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Abstract

開示されているのは、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化する工程を含む、Ｔ細胞の活性化方法、該活性化方法によりＴ細胞を活性化する工程、活性化されたＴ細胞に外来遺伝子を導入する工程、および外来遺伝子が導入されたＴ細胞を培養する工程を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法、該製造方法により得られた、遺伝子改変Ｔ細胞を含む細胞集団、ならびに培地に添加し、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満活性化工程に付すために使用される、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを担持した可動性ポリマー鎖のマトリックスまたはビーズである。

Description

Ｔ細胞活性化方法
　本発明は、Ｔ細胞の活性化方法に関する。より詳しくは、本発明は、キメラ抗原受容体（本明細書において「ＣＡＲ」と表記する。）を発現するＴ細胞（本明細書において「ＣＡＲ－Ｔ細胞」と表記する。）を作製する際に有用なＴ細胞の活性化方法に関する。
(発明の背景)
　がんの治療法の一つにＣＡＲ－Ｔ細胞療法が知られている。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例えば、患者自身から採取した自家のＴ細胞を用いて製造されるが、製造コストの高さおよび製造失敗のリスクが事業上の課題の一つとなっている。特にＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けるがん患者の多くは抗がん剤による治療等によって健常人に比べてＴ細胞がダメージを受けているため、患者由来Ｔ細胞からＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する過程では製造効率が低くなる傾向がある。
　ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する際は一般的に、刺激性物質（例えば抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）を用いたＴ細胞の活性化工程が実施される。例えば特許文献１には、Ｔ細胞の活性化のために、可動性ポリマー鎖のマトリックス（ナノマトリックス）に刺激性物質を付着させたものを利用することが記載されている。
　Ｔ細胞の活性化工程は、従来、２４時間、４８時間（２日間）、または７２時間（３日間）など１日単位の条件で実施が検討されることが一般的であった（非特許文献１～７）。
国際公開第2014/048920号
MACS（商標） GMP T Cell TransAct（商標）Manual Fernandez et al., Front. Immunol. 2019, 10:2361. Aleksandrova et al., Transfus Med Hemother 2019;46:47-54 Vedvyas et al., Scientific Reports (2019) 9:10634 Mock et al., Cytotherapy, 2016; 18: 1002-1011 Blaeschke et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2018) 67:1053-1066 Arcangeli et al., Front. Immunol. 2020, 11:1217.
　本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造効率を改善できる手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、Ｔ細胞の活性化工程に着目し、複数ドナーのＴ細胞を用いた検討により、Ｔ細胞の活性化工程における活性化時間を特定の範囲（例えば、３６時間より長く、４８時間より短い時間）とすることにより、ＣＡＲの発現効率が向上することを見出した。
　本発明は、少なくとも下記の発明を包含する。
［１］
　Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化する工程を含む、Ｔ細胞の活性化方法。
［２］
　前記ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストが、担体に担持されたものである、項１に記載の活性化方法。
［３］
　前記担体が、可動性ポリマー鎖のマトリックスまたはビーズである、項２に記載の活性化方法。
［４］
　前記ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストが、それぞれ抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体である、項１～３のいずれか一項に記載の活性化方法。
［５］
　項１に記載の活性化方法によりＴ細胞を活性化する工程、
　活性化されたＴ細胞に外来遺伝子を導入する工程、および
　外来遺伝子が導入されたＴ細胞を培養する工程
を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法。
［６］
　項５に記載の製造方法により得られた、遺伝子改変Ｔ細胞を含む細胞集団。
［７］
　外来遺伝子がキメラ抗原受容体の遺伝子である、項５に記載の製造方法。
［８］
　培地に添加し、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満活性化工程に付すために使用される、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを担持した可動性ポリマー鎖のマトリックスまたはビーズ。
［９］
　外来遺伝子を導入するためのＴ細胞活性化用キットであって、
　担体に担持されたＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストと、
　Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、前記ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化することが記載された説明書と、を含むキット。
　本明細書において、上記［１］等のＴ細胞の活性化方法を「本発明の活性化方法」、上記［５］等の遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法を「本発明の製造方法」、上記［６］の遺伝子改変Ｔ細胞を含む細胞集団を「本発明の細胞集団」と呼ぶことがある。
　本発明により、Ｔ細胞への負担が大きい活性化工程を最適化し、高効率にＣＡＲ－Ｔ細胞等の遺伝子改変Ｔ細胞を製造することができるようになるため、遺伝子改変Ｔ細胞の製造において、製造日数の短縮による製造コストの軽減および製造効率の改善が可能となる。
図１は、実施例の「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程２４、４８または７２時間）について、「（４）フローサイトメトリー」によりＣＡＲ発現細胞を測定した結果を示す。図１Ａおよび図１Ｂは、２ドナー（Donor AおよびDonor B）由来のＰＢＭＣを用いた場合のＣＡＲ発現細胞の割合（図１Ａ）およびＣＡＲ発現細胞数（図１Ｂ）の結果を示す。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、４８時間は２４時間、７２時間と比較して**p<0.02の有意差があることを示す（t検定、N=3, 図中の値は平均値±標準偏差を示す）。 図２は、実施例の「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程４０、４４または４８時間）について、「（４）フローサイトメトリー」によりＣＡＲ発現細胞を測定した結果を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、３ドナー（Donor A, Donor CおよびDonor D）由来のＰＢＭＣを用いた場合のＣＡＲ発現細胞の割合（図２Ａ）およびＣＡＲ発現細胞数（図２Ｂ）の結果を示す。図２Ａおよび図２Ｂにおいて、４０時間は４４時間、４８時間と比較して*p<0.05または**p<0.02の有意差があることを示す（t検定、N=3-6, 図中の値は平均値±標準偏差を示す）。 図３は、実施例の「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程３７～４４時間）について、「（４）フローサイトメトリー」によりＣＡＲ発現細胞を測定した結果を示す。図３Ａ～図３Ｃは、単一ドナー由来のＰＢＭＣを用いて、各活性化時間におけるＣＡＲ発現細胞の割合をそれぞれ試験した結果を示す（N=3, 図中の値は平均値±標準偏差を示す）。 図４は、実施例の「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程４０、４４または４８時間）について、「（４）フローサイトメトリー」により、活性化マーカーＣＤ２５またはＣＤ６９を指標に、活性化したＴ細胞を測定した結果、ならびに「（５）活性化に用いたＴｒａｎｓＡＣＴおよびＩＬ－２の残量分析」により、活性化に用いたTransACTおよびIL－2の培地中の残量を分析した結果を示す。図４Ａおよび図４Ｂは、２ドナー（Donor AおよびDonor D）由来のＰＢＭＣを用いた場合のＣＤ２５発現細胞の割合（図４Ａ）およびＣＤ６９発現細胞の割合（図４Ｂ）を示す（N=3, 図中の値は平均値±標準偏差を示す）。図４Ｃおよび図４Ｄは、単一ドナー由来のＰＢＭＣを用いて、各活性化時間（４０、４４または４８時間）での活性化工程直後の培地中のTransACTの残量（図４Ｃ）および活性化工程直後の培地中のＩＬ－２の残量（図４Ｄ）を示す（N=3, 図中の値は平均値±標準偏差を示す）。 図５は、３ドナー由来のヒト白血球アフェレーシス品（Donor E, Donor FおよびDonor G）を用いて、実施例の「（３）Ｔ細胞を用いた臨床スケールでのＣＡＲ－Ｔの製造」により得られた細胞集団（活性化工程３６、４０、４４または４８時間）について、「（４）フローサイトメトリー」によりＣＡＲ発現細胞を測定した結果を示す。
―Ｔ細胞の活性化方法―
　本発明の活性化方法は、Ｔ細胞を活性化するための方法であって、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化する工程（本明細書において「活性化工程」と呼ぶ。）を含む。
　「Ｔ細胞」は、目的および用途に応じて活性化して用いられているものであれば特に限定されず、例えば、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのいずれのＴ細胞であってもよい。
　Ｔ細胞は、一般的に、血液、骨髄液などの体液；脾臓、胸腺、リンパ節、肝臓などの組織；または原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織；に浸潤する免疫細胞から、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および白血球アフェレーシスとして採取することができる。本発明で用いるＴ細胞は、採取された免疫細胞の細胞集団から、単離および精製した特定のＴ細胞であってもよいし、単離せずに細胞集団（例えばＰＢＭＣなど）中に含まれた状態のＴ細胞であってもよい。また、Ｔ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、またはその他の幹細胞、前駆細胞などを、適切な条件下で培養することにより、Ｔ細胞へ分化誘導させたものであってもよい。
　Ｔ細胞は、ヒト由来であってもよいし、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳類）由来の細胞であってもよい。非ヒト哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルが挙げられる。
　本発明の一実施形態において、本発明の方法により活性化されるＴ細胞は、外来遺伝子を導入するためのＴ細胞、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を発現するための外来遺伝子を導入するためのＴ細胞である。そのような実施形態において、Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよく、血液から採取したもの、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に含まれるものであってもよく、ヒト、例えばがん患者その他のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与対象とするヒトに由来するものであってもよい。
　「ＣＤ３アゴニスト」および「ＣＤ２８アゴニスト」は、それぞれＣＤ３およびＣＤ２８（受容体）にアゴニストとして結合し、Ｔ細胞に活性化のための刺激を与えられる物質を指す。代表的なＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体であり、代表的なＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体であるが、同様の作用を有する抗体以外の物質（例えば、Ｔ－ＣＥＰ（T-cell expansion protein (Matus et al., JCI insight, 2020, vol.5, issue 22, 1-14)）およびPHA (phytohemagglutinin (Weng et al., J.Ethnopharmacol, 2002, 83(1-2):79-85)）)を、ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストとして用いることも可能である。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、断片化されたものであってもよい。Ｔ細胞の活性化工程では、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストと同時にRetroNectin (商標) (Recombinant Human Fibronectin Fragment, タカラバイオ株式会社)を用いてもよい。
　ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストの濃度は、Ｔ細胞の表面分子を刺激してＴ細胞内にシグナルを伝達して活性化を誘導できる濃度であれば特に制限はない。例えば、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を用いる場合、抗体の最終濃度がそれぞれ０．１～２０μｇ／ｍＬとなるように用いることができる。また、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を担持した可動性ポリマー鎖のマトリックス（例：ＴｒａｎｓＡＣＴ）を用いる場合、抗体の最終濃度が１０～３００ｎｇ／ｍＬとなるように用いることができる。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のモル比は、１：５～５：１、好ましくは１：２～２：１とすることができる。
　本発明の活性化方法では、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地中で、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満培養することで、Ｔ細胞の活性化を行う。「３６時間超４８時間未満」という活性化時間は、例えば、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間である。これらの数値（Ｎ時間）は任意で、「３６時間超４８時間未満」に含まれる、本発明を実施するための活性化時間の新たな範囲を設定する際の、下限値（Ｎ時間以上、またはＮ時間超）および／または上限値（Ｎ時間以下、またはＮ時間未満）とすることができる。本発明の活性化時間の好ましい態様は３７～４４時間であり、より好ましくは３９～４４時間、さらに好ましくは３９～４２時間、とりわけ好ましくは３９～４１時間である。
　活性化工程はＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地を含有しない培地に置換するか、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地を希釈することで終了させることができる。培地の希釈により活性化工程を終了させる場合、本発明における活性化時間にはそのような希釈後の培地中でＴ細胞を培養する時間は含まれないものとする。例えば、ＴｒａｎｓＡＣＴを用いた活性化工程を培地の希釈により終了させる場合、７０％以下（好ましくは５０％以下）に希釈することで活性化工程を終了させることができる。
　本発明の好ましい実施形態において、本発明の活性化方法を実施する培養期間は、培養期間を２４時間、４８時間または７２時間とし、それ以外は同じ条件で培養した場合（対照群）と比較して、ＣＡＲ発現効率が高くなる培養期間である。ＣＡＲ発現効率は、（ａ）細胞集団中のＣＡＲ発現細胞の割合を指標とすることも、（ｂ）細胞集団中のＣＡＲ発現細胞の数を指標とすることもできる。後記「遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法」（本発明の製造方法）の工程３：培養工程後の段階で、上記指標（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方が、対照群と比較して高ければ、「ＣＡＲ発現効率が高くなった」と評価することができる。
　本発明の活性化方法（活性化工程）では、Ｔ細胞を活性化する際の培養時間を特定の範囲とするが、それ以外の培養の実施形態、例えば培養方法、培地、その他の培養条件（温度、雰囲気、細胞密度等）は、公知または一般的なＴ細胞の活性化方法に準じたものとする、あるいはそれ基づき本発明に適合するよう適宜調節することができる。活性化工程における播種時の細胞密度は、例えば、1.0x105～1.0x107 cells/mLとすることができ、好ましくは2.0x105～6.0x106 cells/mLとすることができる。
　活性化工程における培養容器は特に限定されるものではなく、培養スケールに応じて、プレート、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、バッグ、ボトル、タンク（培養槽）などの中から適宜選択することができる。例えば、CliniMACS Prodigy (商標)（Miltenyi Biotec）のような閉鎖型自動培養装置を用いることができる。
　活性化工程では、Ｔ細胞の培養に用いられている公知または一般的な培地を用いることができ、また培地には必要な成分を適宜補充することができる。
　活性化工程における培地としては、例えば、ＡＩＭ Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ １０６６、グラスゴーＭＥＭ、改良ＭＥＭ亜鉛オプション、ＩＭＤＭ、１９９培地、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、フィッシャー培地、その他のＴ細胞培養用の市販の各種製品（例えばCTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Basal Medium (Thermo Fisher Scientific)、CTSTM OpTmizerTM Pro Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific)、CTSTM OpTmizerTM Pro (Thermo Fisher Scientific)、CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Supplement (Thermo Fisher Scientific)）が挙げられる。これらの培地は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
　培地は、血清含有培地もしくは血清不含培地、またはゼノフリー培地であってもよい。異種動物由来構成要素による汚染を阻止する観点からは、血清は、培養する細胞と同じ動物に由来するものであってもよい。血清不含培地は、未加工または未精製の血清を有しない培地を指し、したがって、精製された血液由来構成要素または動物組織由来構成要素（成長因子など）を有する培地を含み得る。培地は、血清の任意の代替物を含有しても含有しなくてもよい。血清の代替物には、アルブミン（脂質に富んだアルブミン、ウシアルブミン、組換えアルブミンまたはヒト化アルブミンなどのアルブミン代用物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物など）、トランスフェリン（または、他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン先駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオグリセロール（α-モノチオグリセロール、ＭＴＧ）、またはそれらの同等物を適当に含有する材料が含まれ得る。ノックアウト血清代替品（knockout Serum Replacement）（KSR）、化学的に規定された脂質濃縮型（Chemically-defined Lipid concentrated）（Thermo Fisher Scientific）、およびGlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）などの、市販の材料を用いることもできる。培地は、血清不含培地（ＳＦＭ）であってもよい。例えば、培地は、３Ｄ細胞凝集体からＴ細胞を産生するのに有効な濃度で、B-27（商標）サプリメント、ゼノフリーB-27（商標）サプリメント、NS21サプリメント、GS21（商標）サプリメント、またはそれらの組み合わせを含み得る。
　培地は、ビオチン；酢酸DLアルファトコフェロール；DLアルファ-トコフェロール；ビタミンA（アセテート）などのビタミン；BSA（ウシ血清アルブミン）またはヒトアルブミン、脂肪酸不含のフラクションV；カタラーゼ；ヒト組換えインスリン；ヒトトランスフェリン；スーパーオキシドジスムターゼなどのタンパク質；コルチコステロン；D-ガラクトース；エタノールアミンHCl；グルタチオン（還元型）；L-カルニチンHCl；リノール酸；リノレン酸；プロゲステロン；プトレシン2HCl；亜セレン酸ナトリウム；およびT3（トリヨード-L-サイロニン）；PSG（ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミン）からなる群より選ばれる１種または２種以上を含んでいてもよい。培地は、外部から添加されたアスコルビン酸またはその誘導体（例えばアスコルビン酸２－リン酸：PAA）を含んでいてもよい。培地は、それぞれ外部から添加された、脂肪酸もしくは脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化物質、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩からなる群より選ばれる１種または２種以上を含んでいてもよい。
　培地は、外部から添加されたサイトカインを含んでいてもよい。サイトカインとしては、例えば、FLT3リガンド（FLT3L）、インターロイキン7（IL-7）、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF-アルファ、TGF-ベータ、インターフェロン-ガンマ、インターフェロン-ラムダ、TSLP、チモペンチン、プレオトロフィン（pleotrophin）、およびミッドカインが挙げられる。これらのサイトカインは、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。好ましいサイトカインとしてはIL-2が挙げられる。
　本発明の好ましい一実施形態において、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストは、可動性ポリマー鎖のマトリックスに担持されたものである。なお、実施例で用いている製品「MACS (商標) GMP T-Cell TransACTTM」（Miltenyi Biotec）は、ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストが可動性ポリマー鎖のマトリックスに担持されており、本実施形態において対応した製品である。
　本発明における「可動性ポリマー鎖のマトリックス」（本明細書において「可動性マトリックス」と呼ぶこともある。）の定義および実施形態は、前掲特許文献１（国際公開第2014/048920号）に記載されている当該用語の定義および実施形態と同じであり、本発明（本明細書）において当該特許文献の記載を参照することができる。「可動性マトリックス」は、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリックス組成物で作製されていてもよい。多糖類としては、例えば、セルロースエーテル、スターチ、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアールガムまたはアルギネートなどが挙げられる。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリフォスファーゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー、ポリウレタンなどが挙げられる。好ましくは、可動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。
　本発明の好ましい一実施形態において、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストは、ビーズに担持されたものである。具体例としてDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Thermo Fisher Scientific）などの磁気ビーズが挙げられる。
　ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストは、このような可動性マトリックスまたはビーズに「担持」されている、つまり「付着」している。当技術分野において公知で利用可能な様々な方法で、物質（ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニスト）を可動性マトリックスに付着またはカップリングさせることができる。付着は、共有結合または非共有結合による付着、静電気的な付着、または疎水性の付着であってもよく、付着は、例えば、物質による細胞の刺激を可能にするような化学的、機械的、酵素的、または他の手段などの様々な付着手段で達成してもよい。例えば、抗体をマトリックスまたはビーズに直接付着させてもよいし、抗アイソタイプ抗体を介して間接的に付着させてもよい。他の例としては、例えばマトリックスまたはビーズに付着したプロテインＡもしくはプロテインＧ、または他の非特異的な抗体結合分子を介して付着させてもよい。他の例としては、例えばマトリックスまたはビーズへの架橋などの化学的手段でマトリックスまたはビーズに物質を付着させてもよい。
　本発明の一実施態様として、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストは、一本鎖ＤＮＡのscafoldに相補的オリゴヌクレオチドを介してＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体がコンジュゲートされた、DNA-based T-cell activator (Keskar et al., J immunother, 2020, vol.43, no.8, 231-235)が挙げられる。
―遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法―
　本発明の製造方法は、遺伝子改変Ｔ細胞を製造するための方法であって、下記の工程１～工程３を含む。
　工程１：本発明の活性化方法によりＴ細胞を活性化する工程
　工程２：活性化されたＴ細胞に外来遺伝子を導入する工程（本明細書において「導入工程」と呼ぶ。）
　工程３：外来遺伝子が導入されたＴ細胞を培養する工程（本明細書において「培養工程」と呼ぶ。）
　工程１：活性化工程
　活性化工程は、前述した本発明の活性化方法を実施することにより、Ｔ細胞を活性化する工程である。活性化工程の詳細は、本発明の活性化方法について前述した事項を参照することができる。
　工程２：導入工程
　導入工程は、活性化工程により得られたＴ細胞に外来遺伝子を導入する工程である。
　「外来遺伝子」は、Ｔ細胞に所望のタンパク質を発現させるために、外部より導入される遺伝子であり、作製しようとするＴ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。外来遺伝子は、１種でも複数種でもよい。
　本発明の一実施形態において、外来遺伝子は、ＣＡＲを発現するための遺伝子を含むことができる。本発明の一実施形態において、外来遺伝子は、ＣＡＲを発現するための遺伝子と、サイトカインおよび／またはケモカインを発現するための遺伝子とを含むことができる。例えば、外来遺伝子により、ＣＡＲと、特定のサイトカインおよびケモカインの組み合わせ（好ましくはＩＬ－７およびＣＣＬ１９）とを発現させることにより、Ｔ細胞による抗腫瘍活性を増強することが可能である。外来遺伝子としてはその他にも、例えば抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）およびＳＴＡＲ受容体（Synthetic TCR and antigen receptor）（Liu et al., Sci. Transl. Med. 2021, vol. 13, issue. 586）をＴ細胞に導入することができる。
　（１）ＣＡＲ
　Ｔ細胞が発現するＣＡＲは基本的に、一般的ないし公知のＣＡＲと同様に、（i）標的認識部位、（ii）細胞膜貫通領域、および（iii）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域、の各部位のペプチドが、必要応じてスペーサーを介して連結することによって構成されている。
　（i）標的認識部位は、例えばがん細胞の細胞表面抗原を認識する抗体（例えば、一本鎖抗体）とすることができる。がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体は、典型的には、当該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する軽鎖可変領域および重鎖可変領域と、それらを連結するリンカーペプチドとによって構成される単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。（i）標的認識部位は、ＣＡＲががん細胞に対して特異的に抗腫瘍効果を示すことができる限りどのような標的を認識してもよく、例えば、がん細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の定常領域を認識する抗体（例えば、一本鎖抗体）としてもよい。
　ＣＡＲが標的とする「がん細胞の細胞表面抗原」は、がん細胞およびその前駆細胞に特異的に発現する生体分子、細胞のがん化によって新たに発現が認められるようになった生体分子、またはがん細胞において正常細胞に比べて発現レベルが増加している生体分子であればよい。そのような抗原は、一般的に「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）と呼ばれており、例えば、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４，ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ２４８、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＣＳＰＧ４、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤ１８Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＮＡＭ－１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＦＲα４、ＧＰＣ３、ＧＰＲ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ｇｌｏｂｏＨ、Ｇｐ１００、ＧＰＲ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖａｒｉａｎｔ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、ＦＩＴＣ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＰＶ　Ｅ６、ＨＰＶ　Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＩｇＧ　κ鎖、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＫＩＴ、Ｌｅｗｉｓ　Ａ、Ｌｅｗｉｓ　Ｙ、Ｌｅｇｕｍａｉｎ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、Ｌｙ６ｋ、ＬＩＣＡＭ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ－Ａ１、Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｏ－ａｃｅｔｙｌ－ＧＤ２、ｈ５Ｔ４、ＰＡＮＸ３、ＰＤＧＲＦｂ、ＰＬＡＣ１、Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ１、ＲＯＲ１、ｓＬｅ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＲＰ、ＴＡＧ－７２、ＴＥＭ７Ｒ、Ｔｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ２、ＴＳＨＲ、αフェトプロテイン、メソテリン、葉酸受容体α（ＦＲα）、葉酸受容体β（ＦＲβ）、ＦＢＰ、ＵＰＫ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　（ii）細胞膜貫通領域は、ＣＡＲをＴ細胞の細胞膜に固定するための領域となるポリペプチドである。そのような細胞膜貫通領域としては、例えば、ＢＴＬＡ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、またはＴ細胞受容体のαもしくはβ鎖に由来する細胞膜貫通領域を挙げることができる。あるいは、上記の細胞膜貫通領域の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有する変異型の細胞膜貫通領域を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８の細胞膜貫通領域が好ましい。
　細胞膜貫通領域には、任意のアミノ酸配列からなる、長さが１～１００アミノ酸、好ましくは１０～７０アミノ酸のペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）である、ヒンジ領域が連結していてもよい。そのようなヒンジ領域としては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＫＩＲ２ＤＳ２、またはＩｇＧ４、ＩｇＤもしくはその他の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を挙げることができる。あるいは、上記のヒンジ領域の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有する変異型のヒンジ領域を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、ヒンジ領域としては、ＣＤ８のヒンジ領域が好ましい。
　（iii）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域は、前記標的認識部位（例えば一本鎖抗体）が標的（例えばがん細胞の細胞表面抗原）を認識して結合した際に、Ｔ細胞内にシグナル伝達するための領域となるポリペプチドである。そのようなシグナル伝達領域としては、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５（ＣＤ１６０）、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１０３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＤＡＰ１０、Ｆｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　γｃｈａｉｎ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１およびＶＬＡ－６からなる群より選ばれる１種または２種以上の細胞内領域を挙げることができる。あるいは、上記のシグナル伝達領域（細胞内領域）の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有する変異型のシグナル伝達領域（細胞内領域）を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、シグナル伝達領域は、ＣＤ２８およびＣＤ３ζの２種、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζの２種、または、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＣＤ３ζの３種の細胞内領域を含むことが好ましい。
　シグナル伝達領域が複数の細胞内領域を含む場合、各細胞内領域同士は、２～１０アミノ酸からなるリンカーペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）を介して連結されていてもよい。そのようなリンカーペプチドとしては、例えば、グリシン－セリン連続配列からなるペプチドを挙げることができる。
　標的認識部位（例えば、一本鎖抗体）と細胞膜貫通領域、および細胞膜貫通領域とシグナル伝達領域はそれぞれ、任意のアミノ酸配列からなる長さが１～１００アミノ酸、好ましくは１０～５０アミノ酸のペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）である、スペーサー領域を含んでもよい。スペーサー領域としては、例えば、グリシン－セリン連続配列からなるペプチドを挙げることができる。
　Ｔ細胞が発現する上述したようなＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｔ細胞の用途、典型的にはがんを治療するための医薬の有効成分としての機能に応じて、適切なものとすればよい。標的認識部位（i）の一例であるがん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体のアミノ酸配列としては様々なものが公知であり、それらのアミノ酸配列の情報を本発明でも利用することができる。あるいは、常法に従って、所望のがん細胞の細胞表面抗原に対する抗体を新たに作製し、その新規の抗体（好ましくは重鎖および軽鎖可変領域、特にＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定して、その情報を本発明において利用するようにしてもよい。また、細胞膜貫通領域（ii）およびＴ細胞活性化シグナル伝達領域（iii）それぞれのアミノ酸配列としても、ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物由来のさまざまなものが公知であり、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）、ＵｎｉＰｒｏｔ（The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org）などのデータベースにも登録されているので、それらの情報を本発明でも利用することができる。標的認識部位（i）が、がん細胞の表面抗原に結合する抗体の定常領域を認識する抗体である場合も、常法に従って入手又は作製することが可能である。
　（２）サイトカイン
　Ｔ細胞にＣＡＲと共に発現させることができるサイトカインとしては、各種のサイトカインが公知であり、本発明においても公知のサイトカインを外来遺伝子により発現させることができる。そのようなサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７などが挙げられる。Ｔ細胞が発現するサイトカインは、１種であってよいし、２種以上であってもよい。サイトカインは、外来遺伝子を導入するＴ細胞（そのＴ細胞が有するサイトカインの受容体）と同じ動物種（ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）に由来するものが好ましい。ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物由来の天然の各種のサイトカインのアミノ酸配列は公知であり、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）、ＵｎｉＰｒｏｔ（The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org）などのデータベースにも登録されているので、それらの情報を本発明でも利用することができる。
　なお、本発明における「サイトカイン」という用語は、天然の完全長のタンパク質だけでなく、サイトカインとしての機能を保持または増強するなど種々に改変したタンパク質（ポリペプチド）を包含する。すなわち、本発明におけるサイトカインは、（ａ）天然のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全体またはその一部（機能的な部分ポリペプチド）、（ｂ）天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたバリアント、（ｃ）全長のタンパク質または部分的なポリペプチドが、Ｎ末端またはＣ末端において、他のタンパク質（例えばシグナルペプチド、受容体タンパク質のサブユニット等）と連結した融合タンパク質、のいずれであってもよい。上記（ｂ）のバリアントとしては、例えば、全長としてまたは部分的な領域（ドメイン）として、天然のサイトカインのアミノ酸配列に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
　（３）ケモカイン
　Ｔ細胞にＣＡＲと共に発現させることができるケモカインとしては、各種のケモカインが公知であり、本発明においても公知のケモカインを外来遺伝子により発現させることができる。そのようなケモカインとしては、例えば、ＣＣＬ１９が挙げられる。Ｔ細胞が発現するケモカインは、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。ケモカインは、外来遺伝子を導入するＴ細胞（そのＴ細胞が有するケモカインの受容体）と同じ動物種（ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）に由来するものが好ましい。ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物由来の天然の各種のケモカインのアミノ酸配列は公知であり、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）、ＵｎｉＰｒｏｔ（The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org）などのデータベースにも登録されているので、それらの情報を本発明でも利用することができる。
　なお、本発明における「ケモカイン」という用語は、天然の完全長のタンパク質だけでなく、ケモカインとしての機能を保持または増強するなど種々に改変したタンパク質（ポリペプチド）を包含する。すなわち、本発明におけるケモカインは、（ａ）天然のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全体またはその一部（機能的な部分ポリペプチド）、（ｂ）天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたバリアント、のいずれであってもよい。上記（ｂ）のバリアントとしては、例えば、全長としてまたは部分的な領域（ドメイン）として、天然のケモカインのアミノ酸配列に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
　外来遺伝子をＴ細胞に導入するための手段は特に限定されるものではなく、公知または一般的な各種の手段を採用することができる。典型的には、外来遺伝子は、発現ベクターを用いてＴ細胞に導入し、発現させる。発現ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。
　発現ベクターをＴ細胞に導入するための手法は、実施形態に応じた適切なものとすることができる。例えば、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により、発現ベクターをＴ細胞に導入することができる。発現ベクターは、公知の手段によって、また適宜市販のキットを用いて（その指示書に従って）、各手法における使用に適した形態に調製することができる。導入工程では、そのような調製物をＴ細胞に接触させる、一般的には発現ベクターを含む調製物を添加した培地中でＴ細胞を培養するようにすればよい。
　本発明の一実施形態において、発現ベクターは、ウイルス感染法によりＴ細胞に導入される。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。好ましいレトロウイルスベクターとしては、例えば、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., ClinCancer Res 18:6436-6445(2002)）およびｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ株式会社製）、ＳＦＧベクターを挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いた場合、そのベクターに含まれる遺伝子はホスト細胞（本発明ではＴ細胞）のゲノムへ取り込まれるため、長期間、安定的に遺伝子を発現させることが可能である。これらのウイルスベクターを用いる場合は、対応する市販のキットを用いて、所望の外来遺伝子を含むベクターおよび各ウイルスのパッケージングベクター（プラスミド）を宿主細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製した後、得られた組換えウイルスをＴ細胞に感染させるようにすればよい。市販のウイルスベクター用キットとしては、例えばRetrovirus packagin Kit Eco（タカラバイオ株式会社製）が挙げられる。宿主細胞としては、例えばＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ株式会社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などが挙げられる。
　外来遺伝子が複数の場合、すべての外来遺伝子が１つの発現ベクターに含まれていてもよいし、すべての外来遺伝子がそれぞれ別個の発現ベクターに含まれていてもよいし、複数の外来遺伝子のうちの一部は１つの発現ベクターに含まれ、残りはそれぞれ別個の発現ベクターに含まれていてもよい。１つの発現ベクターに複数の外来遺伝子が含まれる場合、上流側から下流側に向けてどの順序でそれらの外来遺伝子が配置されるかは特に限定されるものではない。
　外来遺伝子は、例えば上述したＣＡＲ、サイトカイン、ケモカインなど、Ｔ細胞に発現させる所望のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列に応じて、それをコードする塩基配列を有する核酸（ポリヌクレオチド）により構成することができる。当業者であれば、所望のタンパク質（ポリペプチド）をＴ細胞において発現させることのできる発現ベクターを設計し、作製することが可能である。発現ベクターが含む核酸は、化学的なＤＮＡ合成反応により作製してもよいし、ｃＤＮＡとして作製（クローニング）してもよい。
　発現ベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする塩基配列（外来遺伝子）に加えて、必要に応じて（上述したように複数の発現ベクターの組み合わせについては、それぞれの発現ベクターが独立して）、各外来遺伝子の発現に関与する、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）等の配列を含んでいてもよい。また、１つの発現ベクターに複数の外来遺伝子が含まれている場合、各外来遺伝子の間に、自己切断型ペプチド（例えば２Ａペプチド）またはＩＲＥＳ（Internal Ribozyme Entry Site）をコードする遺伝子が挿入されていてもよい。発現ベクターはさらに、レポーター遺伝子（例えば、各色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、薬剤選択遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、自殺遺伝子（例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）、カルボキシルエステラーゼ（CA）、シトシンデアミナーゼ（CD）、チトクロームP450（cyt-450）、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）、ニトロレダクターゼ（NR）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、チミジンホスホリラーゼ（TP）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（VZV-TK）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）、誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）などをコードする遺伝子）のような“機能的遺伝子”をコードする核酸（塩基配列）を含んでいてもよい。
　「核酸」とは、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体（例：２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－[２－(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ：Bridged Nucleic Acid）、ロックド人工核酸（ＬＮＡ：Locked Nucleic Acid）、エチレン架橋構造型人工核酸（ＥＮＡ：Ethylene bridged nucleic acid）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ））、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体（例：ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体）等が挙げられる。
　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、ビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
　導入工程における培養容器、培地、添加成分、その他の培養条件等については、本発明の活性化方法としての活性化工程に関して記載した事項と同様とすることができ、例えば例示されているもののなかから適宜選択することができる。ただし、導入工程における培養容器、培地、添加成分等は、必ずしも活性化工程におけるそれらと同一である必要はなく、適宜変更することができる。
　工程３：培養工程
　培養工程は、外来遺伝子が導入されたＴ細胞を培養する工程である。培養工程における培養期間は、所望のタンパク質がＴ細胞に発現するのに十分な期間とすればよく、特に限定されるものではないが、例えば２０日間、好ましくは３～７日間である。
　また、発現ベクターが機能的遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む場合、その発現ベクターが導入されたＴ細胞を選別するために、用いた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を培養工程の培地に添加して、Ｔ細胞を培養してもよい。さらに、発現ベクターが機能的遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）を含む場合、培養工程において、またはその後に、発現ベクターが導入されたＴ細胞を蛍光顕微鏡によって観察したり、発現ベクターが導入されたＴ細胞をセルソーターで選別したりしてもよい。
　培養工程における培養容器、培地、添加成分、その他の培養条件等については、本発明の活性化方法としての活性化工程に関して記載した事項と同様とすることができ、例えば例示されているもののなかから適宜選択することができる。ただし、培養工程における培養容器、培地、添加成分等は、必ずしも活性化工程におけるそれらと同一である必要はなく、適宜変更することができる。
　本発明の製造方法により得られた遺伝子改変Ｔ細胞を含む細胞集団の用途は特に限定されるものではなく、所望の目的で使用することができるが、例えば、医薬（細胞製剤）を製造するために使用することができる。
　医薬（細胞製剤）は、遺伝子改変Ｔ細胞を含有し、必要に応じてその他の成分をさらに含有してもよい。当業者であればそのような医薬を、用途（治療対象疾患、投与対象者等）および剤型を考慮しながら、遺伝子改変Ｔ細胞を使用して適切に調製することができる。
　医薬は、例えば、遺伝子改変Ｔ細胞が発現しているＣＡＲが標的としている、がん細胞の細胞表面抗原（がん特異抗原）に対応しているがんを治療の対象とする医薬（抗がん剤）とすることができる。したがって、ＣＡＲが標的とする抗原を発現しているがん細胞をがん組織内に含んでおり、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって一定水準の治療効果が認められる限り、医薬が対象とするがんの種類は特に限定されるものではない。医薬が対象とし得るがんとしては、例えば、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん（例、メラノーマ、メルケル細胞がん）、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頚部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、直腸がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん、卵管がん、上咽頭がんなどのがん；骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織および造血組織のがん；軟骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、悪性血管内皮腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫；肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫；胚細胞腫瘍；リンパ腫；白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、を挙げることができる。好ましくは、ＮＫ細胞に感受性があるがん種（メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病等）が挙げられる。より好ましくは、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病が挙げられる。
　医薬が含有することができる遺伝子改変Ｔ細胞以外の成分としては、例えば、薬学的に許容される添加剤、より具体的には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、潤滑剤などが挙げられる。
　医薬は、公知の遺伝子改変Ｔ細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）と同様の手法で、がんの治療を必要とする対象（がん患者、担癌動物等）に投与して使用することができる。投与方法としては、例えば、腫瘍内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などへの注射が挙げられる。
　医薬に含まれる遺伝子改変Ｔ細胞の量は、用途、剤型および目的とする治療効果などに応じて、例えばがんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重、状態などを考慮しながら、適切に調節することができる。例えば、医薬は、１回の投与において、ＣＡＲ－Ｔ細胞が通常１×１０４～１×１０１０個、好ましくは１×１０５～１×１０９個、より好ましくは５×１０６～５×１０８個投与されるよう、製剤化することができる。
　医薬の投与間隔は特に限定されるものではなく、１回あたりに投与される本発明のＴ細胞の量などを考慮しながら適宜調整することができるが、例えば、１日４回、３回、２回もしくは１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回または月２回、独立して投与することができる。
　医薬ががん治療用途のものである場合は、公知の抗がん剤と併用することができる。抗がん剤としては、例えば、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イホスファミド、ダカルバジンなどのアルキル化薬；ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビンなどの代謝拮抗薬；リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどの分子標的薬；イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブなどのキナーゼ阻害剤；ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤；シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害薬；イダルビジン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣなどの抗がん性抗生物質；イリノテカン、エトポシドなどの植物アルカロイド；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤；タモキシフェン、ビカルダミドなどのホルモン療法薬；インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどの免疫制御薬；を挙げることができる。ＣＡＲの標的認識部位が、がん細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の定常領域を認識する抗体である場合、遺伝子改変Ｔ細胞は、当該細胞表面抗原に対応しているがんを治療の対象とする医薬として用いることができる。この場合、遺伝子改変Ｔ細胞を含有する医薬は、当該細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を含有する医薬と併用することができる。
―定義―
　「人工多能性幹細胞（iPSC）」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（日本国特開2008-307007号）等も用いることができる。このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、日本国特開2008-307007号公報、日本国特開2008-283972号公報、米国特許出願公開第2008/2336610号明細書、米国特許出願公開第2009/047263号明細書、国際公開第2007/069666号、国際公開第2008/118220号、国際公開第2008/124133号、国際公開第2008/151058号、国際公開第2009/006930号、国際公開第2009/006997号、国際公開第2009/007852号）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　「人工多能性幹細胞」としては、NIH、理研（理化学研究所）、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。あるいは、京都大学、Cellular Dynamics International等から提供される臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　「胚性幹細胞（ESC）」としては、マウスESCであれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスESC株が利用可能であり、ヒトESCであれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社等が樹立した各種ヒトESC株が利用可能である。例えば、ヒトESC株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。あるいは、臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　「～を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。「～からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる（consist(s) essentially of又はconsisting essentially of）」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
　本明細書において、細胞、化合物、その他の物質について、それらが単数形で記載されている事項と複数形で記載されている事項は、別途明記されていない限り、相互に変換して解釈可能であるものとする。
　（Ｉ）材料および方法
　（１）培地
　CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Basal Medium (Thermo Fisher Scientific)に2.6% CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Supplement (Thermo Fisher Scientific)、1% L-Glutamine (Thermo Fisher Scientific)、1% Streptomycinおよび2% CTSTM Immune Cell SR（Thermo Fisher Scientific）を添加し、基礎培地を作製した。その基礎培地に20 IU/mLもしくは40IU/mLになるようにMACS GMP IL-2 (Miltenyi Biotec)を添加し、培養培地とした。
　（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
　Human PBMC（４ドナー：それぞれDonor A, B, CおよびDとする）を解凍後に、培養培地で1.0x106 cells/mLになるように希釈した。細胞懸濁液: MACS GMP T-Cell TransACT（Miltenyi Biotec）=17.5:1になるように培養プレートに播種し、24-72時間培養した（活性化工程）。活性化後の細胞を遠心し、新しい培養培地に置換後にRetronectin (タカラバイオ株式会社)とRetrovirusで事前にコートしておいた培養プレートに5.0x104 cells/cm2で播種し、翌日まで培養した（遺伝子導入工程）。前記遺伝子導入工程において、外来遺伝子として、CAR遺伝子（GPC3を認識および結合するscFv-CD8ヒンジ領域-CD8膜貫通領域-CD28の細胞内領域-4-1BBの細胞内領域-CD3ζの細胞内領域を含む）、IL-7遺伝子、CCL19遺伝子が自己切断型リンカーである2A配列を介して結合した構造の遺伝子を導入した。細胞を培養培地で洗浄後に、全量を培養培地で培養プレートにて4-6日間培養した。
　（３）Ｔ細胞を用いた臨床スケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
　Leukopak (ヒトの白血球アフェレーシス品、HemaCare)（３ドナー：それぞれDonor E, FおよびGとする）を解凍後に、CliniMACS Prodigy（Miltenyi Biotec）でCliniMACS CD4 GMP Microbeads（Miltenyi Biotec）およびCliniMACS CD8 GMP Microbeads（Miltenyi Biotec）を用いてT細胞を分離した。分離後のT細胞を2.0x106 cells/mL以下になるように培養培地で希釈した。細胞懸濁液: MACS GMP T-Cell TransACT（Miltenyi Biotec）=17.5:1になるように培養バッグに播種し、36-48時間培養した（活性化工程）。活性化後の細胞をLOVO Cell processing system (Fresenius Kabi)を用いて培養培地で希釈し、Retronectin (タカラバイオ株式会社)とRetrovirusで事前にコートしておいた培養バッグに6.07x105 cells/cm2以下で播種し、 翌日まで培養した（遺伝子導入工程）。前記遺伝子導入工程において、外来遺伝子として、CAR遺伝子（GPC3を認識および結合するscFv-CD8ヒンジ領域-CD8膜貫通領域-CD28の細胞内領域-4-1BBの細胞内領域-CD3ζの細胞内領域を含む）、IL-7遺伝子、CCL19遺伝子が自己切断型リンカーである2A配列を介して結合した構造の遺伝子を導入した。2.2x106 cells/cm2以下で培養ボトル（G-REX, Wilson Wolf）に播種し、3-7日間培養した。
　（４）フローサイトメトリー
　製造後のサンプルにおけるＣＡＲ発現細胞の割合およびＣＡＲ発現細胞数は、サンプル中のCD45発現またはCD3発現細胞中のCAR発現細胞をProtein-Lを用いて測定することで算出した。また活性化工程直後のＴ細胞活性化マーカー（CD25, CD69）発現細胞の割合は、サンプル中のCD3発現細胞またはCD4+またはCD8+発現細胞中の当該マーカー発現細胞を測定することで算出した。
　（５）活性化に用いたＴｒａｎｓＡＣＴおよびＩＬ－２の残量分析
　活性化工程後の培地におけるＴｒａｎｓＡＣＴの残量はT Cell Activation Bioassays (Promega,J1621)を用いて測定した。ＩＬ－２の残量はHuman IL-2 DuoSet ELISA（R&D systems, cat#DY202）を用いて測定した。
　（ＩＩ）結果
　「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程２４、４８または７２時間）について、フローサイトメトリーにてＣＡＲ発現細胞の割合およびＣＡＲ発現細胞数を測定した結果を図１に示す。ＣＡＲ発現細胞の割合は、ドナー非依存的に４８時間で最大となった（図１Ａ）。またＣＡＲ発現細胞数も同様に４８時間で多くなる傾向が見られた（図１Ｂ）。
　「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程４０、４４または４８時間）について、フローサイトメトリーにてＣＡＲ発現細胞の割合およびＣＡＲ発現細胞数を測定した結果を図２に示す。ＣＡＲ発現細胞の割合は、ドナー非依存的に４０時間で最大となった（図２Ａ）。またＣＡＲ発現細胞数も同様に４０時間で多くなる傾向が見られた（図２Ｂ）。
　「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程３７～４４時間）について、フローサイトメトリーによりＣＡＲ発現細胞の割合を測定した結果を図３に示す。３７時間以上４４時間以下の活性化時間では、高い効率でＣＡＲ－Ｔ細胞が製造できた。
　「（２）ＰＢＭＣを用いたスモールスケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程４０、４４または４８時間）について、フローサイトメトリーにより活性化マーカー（ＣＤ２５またはＣＤ６９）を指標に活性化したＴ細胞を測定した結果、ならびに、活性化に用いたＴｒａｎｓＡＣＴおよびＩＬ－２の培養上清中の残量を分析した結果を図４に示す。ＣＤ２５またはＣＤ６９発現細胞の割合は、活性化工程直後では各活性化時間（４０、４４、４８時間）の間で差が無かった（図４ＡおよびＢ）。また、活性化に用いたＴｒａｎｓＡＣＴとＩＬ－２の活性化工程直後の培養上清中の残量に関しても各活性化時間（４０、４４、４８時間）の間で差が無かった（図４ＣおよびＤ）。図１～３の結果に示されているＣＡＲ－Ｔ細胞の製造効率の向上には、活性化の程度および培地中の主要成分以外の影響があるものと考えられる。
　「（３）Ｔ細胞を用いた臨床スケールでのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造」により得られた細胞集団（活性化工程３６、４０、４４または４８時間）について、フローサイトメトリーによりＣＡＲ発現細胞の割合を測定した結果を図５に示す。ＣＡＲ発現細胞の割合は、ドナー非依存的に４０時間で高くなる傾向となった。また３６時間ではＣＡＲ発現細胞の割合が低下し、３６時間の活性化はＣＡＲ－Ｔ細胞の製造には不十分であった。

Claims (9)

  1. 　Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化する工程を含む、Ｔ細胞の活性化方法。
  2. 　前記ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストが、担体に担持されたものである、請求項１に記載の活性化方法。
  3. 　前記担体が、可動性ポリマー鎖のマトリックスまたはビーズである、請求項２に記載の活性化方法。
  4. 　前記ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストが、それぞれ抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体である、請求項１に記載の活性化方法。
  5. 　請求項１に記載の活性化方法によりＴ細胞を活性化する工程、
    　活性化されたＴ細胞に外来遺伝子を導入する工程、および
    　外来遺伝子が導入されたＴ細胞を培養する工程
    を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法。
  6. 　請求項５に記載の製造方法により得られた、遺伝子改変Ｔ細胞を含む細胞集団。
  7. 　外来遺伝子がキメラ抗原受容体の遺伝子である、請求項５に記載の製造方法。
  8. 　培地に添加し、Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満活性化工程に付すために使用される、ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを担持した可動性ポリマー鎖のマトリックスまたはビーズ。
  9. 　外来遺伝子を導入するためのＴ細胞活性化用キットであって、
    　担体に担持されたＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストと、
    　Ｔ細胞を３６時間超４８時間未満、前記ＣＤ３アゴニストおよび／またはＣＤ２８アゴニストを含有する培地で活性化することが記載された説明書と、を含むキット。
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