KR20230167063A - T-세포 활성화 방법 - Google Patents

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소이치로 오가키
히데오 아라키
에이키 마에다
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
노일 이뮨 바이오테크 가부시키가이샤
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Abstract

CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배양 배지에서 36시간 초과 48시간 미만 동안 T-세포를 활성화시키는 단계를 포함하는, T-세포 활성화 방법이 개시된다. 상기 활성화 방법에 의해 T-세포를 활성화시키는 단계; 활성화된 T-세포 내로 외래 유전자를 도입시키는 단계; 및 외래 유전자가 도입된 T-세포를 배양하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 T-세포를 생산하는 방법이 개시된다. 상기 생산 방법에 의해 수득된 유전자 변형 T-세포를 포함하는 세포 집단이 개시된다. T-세포를 36시간 초과 48시간 미만 동안 활성화 단계에 적용시키는 데 사용되는, CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제가 담지된 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 또는 비드가 개시된다.

Description

T-세포 활성화 방법
본 발명은 T 세포 활성화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 키메라 항원 수용체(본 명세서에서 "CAR"로 지칭함)를 발현하는 T 세포(본 명세서에서 "CAR-T 세포"로 지칭함)를 생산하는데 효과적인 T 세포 활성화 방법에 관한 것이다.
CAR-T 세포 요법은 암을 치료하는 방법 중 하나로 알려져 있다. CAR-T 세포는, 예를 들어 환자 자신으로부터 수집한 자가 T 세포를 사용하여 생산되지만; 높은 제조 비용 및 제조 실패의 위험은 사업 운영의 문제이다. 특히, 건강한 사람에 비해 CAR-T 세포 요법을 받는 암 환자는 항암제 등에 의한 치료로 인해 T 세포가 손상된 경우가 많기 때문에 환자 유래 T 세포로부터 CAR-T 세포의 생산 효율은 떨어지는 경향이 있다.
CAR-T 세포를 생산하기 위해서는 자극 물질(예를 들어, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체)을 사용하여 T 세포를 활성화하는 단계가 전형적으로 수행된다. 예를 들어, 특허문헌 1은 자극 물질이 부착된 이동성 중합체 사슬의 매트릭스(나노매트릭스)가 T 세포의 활성화를 위해 사용되는 것이 개시되어 있다.
일반적으로 T-세포 활성화 단계는 24시간, 48시간(2일), 또는 72시간(3일)과 같은 1일의 배수로 수행되어 왔다(비특허문헌 1 내지 7).
선행기술문헌
특허 문헌
PTL 1: WO2014/048920
비특허문헌
NPL 1: MACS(상표) GMP T Cell TransAct(상표) 매뉴얼
NPL 2: Fernandez 등, Front. Immunol. 2019, 10:2361.
NPL 3: Aleksandrova 등, Transfus Med Hemother 2019; 46:47-54
NPL 4: Vedvyas 등, Scientific Reports (2019) 9:10634
NPL 5: Mock 등, Cytotherapy, 2016; 18: 1002-1011
NPL 6: Blaeschke 등, Cancer Immunology, Immunotherapy (2018) 67:1053-1066
NPL 7: Arcangeli 등, Front. Immunol. 2020, 11:1217.
본 발명의 목적은 CAR-T 세포의 생산 효율을 향상시키기 위한 수단을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 T-세포 활성화 단계에 주목하여 다수의 공여자로부터의 T 세포를 조사했다. 그 결과, T-세포 활성화 단계에서 활성화 기간을 특정 범위(예를 들어, 36시간 초과 48시간 미만)로 설정함으로써 CAR 발현 효율이 개선된다는 것을 발견했다.
본 발명은 적어도 다음의 발명을 포함한다.
[1] CD3 작용제(agonist) 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지에서 36시간 초과 48시간 미만 동안 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는 T 세포 활성화 방법.
[2] 항목 1에 있어서, CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제가 담체에 담지되어 있는, 활성화 방법.
[3] 항목 2에 있어서, 담체가 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 또는 비드인, 활성화 방법.
[4] 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, CD3 작용제 및 CD28 작용제가 각각 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체인, 활성화 방법.
[5] 유전자 변형 T 세포의 생산 방법으로서,
항목 1의 활성화 방법에 따라 T 세포를 활성화시키는 단계,
활성화된 T 세포에 외인성 유전자를 도입시키는 단계, 및
외인성 유전자가 도입된 T 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 생산 방법.
[6] 항목 5에 따른 생산 방법에 의해 수득되는, 유전자 변형 T 세포를 포함하는 세포 집단.
[7] 항목 5에 있어서, 외인성 유전자가 키메라 항원 수용체 유전자인, 생산 방법.
[8] CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 담지하는 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 또는 비드로서, 매트릭스 또는 비드는 배지에 첨가되어 T 세포를 36시간 초과 48시간 미만 동안 활성화 단계에 적용시키는 데 사용되는, 매트릭스 또는 비드.
[9] 외인성 유전자를 도입시키기 위한 T-세포 활성화 키트로서,
담체 상에 담지된 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제, 및
36시간 초과 48시간 미만 동안 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 포함하는 배지에서 T 세포의 활성화를 설명하는 매뉴얼
을 포함하는 T-세포 활성화 키트.
본 명세서에서, 항목 1 등의 T-세포 활성화 방법, 항목 5 등의 유전자 변형 T 세포를 생산하는 방법 및 항목 6 등의 유전자 변형 T 세포를 포함하는 세포 집단은 각각 "본 발명의 활성화 방법", "본 발명의 생산 방법" 및 "본 발명의 세포 집단"이라고 지칭된다.
본 발명은 T 세포에 많은 부담을 주는 활성화 단계를 최적화할 수 있고, CAR-T 세포와 같은 유전자 변형 T 세포를 효율적으로 생산할 수 있기 때문에 생산 일수 감소로 인해 생산 비용이 감소될 수 있고, 유전자 변형 T 세포의 생산에서 생산 효율이 개선될 수 있다.
도 1은 실시예의 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 24, 48 또는 72시간)에서 "(4) 유세포분석"에 의해 CAR-발현 세포를 측정한 결과를 보여준다. 도 1a 및 1b는 2명의 공여자(공여자 A 및 공여자 B) 유래의 PBMC를 사용하여 수득한 CAR-발현 세포의 백분율(도 1a) 및 CAR-발현 세포의 수(도 1b)에 대한 결과를 보여준다. 도 1a 및 1b는 24시간 및 72시간과 비교하여 48시간째 **p <0.02의 유의미한 차이를 보여준다(t-테스트, N = 3, 도면의 값은 평균 ± 표준편차임).
도 2는 실시예의 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 40, 44 또는 48시간)에서 "(4) 유세포분석"에 의해 CAR-발현 세포를 측정한 결과를 보여준다. 도 2a 및 2b는 3명의 공여자(공여자 A, 공여자 C, 및 공여자 D) 유래의 PBMC를 사용하여 수득한 CAR-발현 세포의 백분율(도 2a) 및 CAR-발현 세포의 수(도 2b)에 대한 결과를 보여준다. 도 2a 및 2b는 44시간 및 48시간과 비교하여 40시간째 *p <0.05 또는 **p <0.02의 유의미한 차이를 보여준다(t-테스트, N = 3-6, 도면의 값은 평균 ± 표준편차임).
도 3은 실시예의 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 37 내지 44시간)에서 "(4) 유세포분석"에 의해 CAR-발현 세포를 측정한 결과를 보여준다. 도 3a 내지 3c는 단일 공여자 유래의 PBMC를 사용하여 각 활성화 기간에서의 CAR-발현 세포의 백분율에 대한 결과를 보여준다(N = 3, 도면의 값은 평균 ± 표준편차임).
도 4는 실시예의 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 40, 44 또는 48시간)에서 지표로서 활성화 마커 CD25 또는 CD69를 사용하여 "(4) 유세포분석"에 의해 활성화된 T 세포를 측정한 결과, 및 "(5) 활성화에 사용된 TransACT 및 IL-2의 잔여량 분석"에 따라 배지 중 활성화에 사용된 TransACT 및 IL-2의 잔여량을 분석한 결과를 보여준다. 도 4a 및 4b는 두 공여자(공여자 A 및 공여자 D) 유래의 PBMC를 사용하여 수득한 CD25-발현 세포의 백분율(도 4a) 및 CD69-발현 세포의 백분율(도 4b)을 보여준다(N=3, 도면의 값은 평균 ± 표준편차임). 도 4c 및 4d는 활성화 단계 직후에 배지에 남아 있는 TransACT의 양(도 4c) 및 단일 공여자 유래의 PBMC를 사용하여 수득한 각 활성화 기간(40, 44 또는 48시간)에서 활성화 단계 직후 배지에 남아 있는 IL-2의 양(도 4d)을 보여준다(N=3, 도면의 값은 평균 ± 표준편차임).
도 5는 3명의 공여자 유래의 인간 백혈구 성분채집술 산물(공여자 E, 공여자 F, 및 공여자 G)을 사용하여, 실시예의 "(3) T 세포를 사용한 임상 규모의 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 36, 40, 44, 또는 48 시간)에서 "(4) 유세포분석"으로 CAR-발현 세포를 측정한 결과를 보여준다.
T 세포 활성화 방법
본 발명의 활성화 방법은 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지에서 T 세포를 36시간 초과 48시간 미만 동안 활성화시키는 단계(이하 본 명세서에서 "활성화 단계"라고 지칭함)를 포함하는 T 세포 활성화 방법이다.
사용 시 목적과 용도에 따라 T 세포가 활성화되는 한, 임의의 "T 세포"가 사용될 수 있다. 예로는 αβ T 세포, γδ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 종양 침윤 T 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, NKT 세포 및 조절 T 세포를 포함한다.
T 세포는 일반적으로 혈액 및 골수액과 같은 체액; 비장, 흉선, 림프절 및 간과 같은 조직; 또는 원발성 종양, 전이성 종양 및 암성 복수와 같은 암성 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 백혈구 성분채집술로서 수집될 수 있다. 본 발명에 사용되는 T 세포는 수집된 면역 세포의 집단으로부터 단리 및 정제된 특정 T 세포일 수 있거나, 또는 단리 없이 세포 집단(예를 들어, PBMC)에 함유된 T 세포일 수 있다. T 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포), 배아 줄기 세포(ES 세포), 기타 줄기 또는 전구 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 T 세포로 분화 유도하여 수득된 것일 수 있다.
T 세포는 인간 또는 인간 외의 포유동물(비인간 포유동물)로부터 유래될 수 있다. 비인간 포유동물의 예로는 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양 및 원숭이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 활성화된 T 세포는 외인성 유전자를 도입시키기 위한 T 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하기 위해 외인성 유전자를 도입시키기 위한 T 세포이다. 이 실시양태에서, T 세포는 예를 들어 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있고, 혈액으로부터 채취한 것, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 함유된 것, 또는 인간, 예를 들어 암 환자 또는 CAR-T 세포가 투여되어야 하는 인간으로부터 유래된 것일 수 있다.
"CD3 작용제" 및 "CD28 작용제"는 작용제로서 CD3 및 CD28(수용체)에 각각 결합하고 활성화를 위해 T 세포를 자극할 수 있는 물질이다. 전형적인 CD3 작용제는 항-CD3 항체이고, 전형적인 CD28 작용제는 항-CD28 항체이다. 유사한 효과를 가진 항체 이외의 물질(예를 들어, T-CEP(T-세포 확장 단백질(Matus 등, JCI Insight, 2020, vol. 5, issue 22, 1-14) 및 PHA(피토헤마글루티닌(Weng 등, J. Ethnopharmacol, 2002, 83(1-2):79-85))도 CD3 및 CD28 작용제로서 사용될 수 있다. 항-CD3 및 항-CD28 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있고, 바람직하게는 단클론 항체이다. 항-CD3 및 항-CD28 항체는 단편화될 수 있다. T-세포 활성화 단계에서 RetroNectin(상표)(재조합 인간 피브로넥틴 단편, Takara Bio Inc.)은 CD3 및/또는 CD28 작용제와 함께 사용될 수 있다.
CD3 작용제 및 CD28 작용제의 농도는 T 세포의 표면 분자를 자극하여 T 세포에 신호를 전달하여 활성화를 유도하기에 충분한 농도이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체가 사용되는 경우, 각 항체의 최종 농도가 0.1 내지 20 μg/mL일 정도의 양으로 사용될 수 있다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 담지하는 이동성 중합체 사슬의 매트릭스(예를 들어, TransACT)가 사용되는 경우, 각 항체의 최종 농도는 10 내지 300 ng/mL가 되도록 사용된다. 항-CD3 항체 대 항-CD28 항체의 몰비는 1:5 내지 5:1, 바람직하게는 1:2 내지 2:1일 수 있다.
본 발명의 활성화 방법은 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지에서 T 세포를 36시간 초과 48시간 미만 동안 배양함으로써, T 세포를 활성화시킨다. "36시간 초과 48시간 미만"의 활성화 기간은, 예를 들면 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47시간이다. 이러한 값(N 시간)은 "36시간 초과 48시간 미만"에 포함되는 본 발명을 실시하기 위한 새로운 활성화 기간 범위를 결정할 때, 하한치(N 시간 이상 또는 N 시간 초과) 및/또는 상한치(N 시간 이하 또는 N 시간 미만)로서 임의로 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 활성화 기간은 37 내지 44시간, 보다 바람직하게는 39 내지 44시간, 더욱 바람직하게는 39 내지 42시간, 특히 바람직하게는 39 내지 41시간이다.
활성화 단계는 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지를 CD3 작용제 및 CD28 작용제가 없는 배지로 교체하거나, 또는 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지를 희석함으로써 종료될 수 있다. 배지를 희석함으로써 활성화 단계를 종료하는 경우, 본 발명에서의 활성화 기간은 이러한 희석 배지에서 T 세포를 배양하는 데 필요한 시간을 포함하지 않는다. 예를 들어, TransACT를 이용한 활성화 단계가 배지를 희석함으로써 종료된다면, 배지를 70% 이하(바람직하게는 50% 이하)로 희석함으로써 활성화 단계를 종료할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 활성화 방법을 수행하기 위한 배양 기간은, 24, 48, 또는 72시간으로 배양 기간을 변경한 것을 제외하고는 본 발명과 동일한 조건 하에 배양이 수행되는 대조군의 CAR 발현 효율과 비교하여, 높은 CAR 발현 효율을 달성할 수 있는 배양 기간이다. CAR 발현의 효율을 위해, (a) 세포 집단 내 CAR-발현 세포의 백분율 또는 (b) 세포 집단 내 CAR-발현 세포의 수는 지표로 사용될 수 있다. 이러한 지표 (a) 및 (b) 중 적어도 하나가 이하에 기술된 단계 3(유전자 변형 T 세포의 생산 방법; 본 발명의 생산 방법의 배양 단계) 후의 시기(stage)에서 대조군보다 높은 경우, CAR 발현 효율이 증가된 것으로 평가된다.
본 발명의 활성화 방법(활성화 단계)에서, T 세포를 활성화하기 위한 배양 시간은 특정 범위로 설정되며; 그러나, 배양 방법, 배지 및 다른 배양 조건(온도, 분위기, 세포 밀도 등)과 같은 배양의 다른 실시양태는 공지되거나 일반적인 T-세포 활성화 방법에 따르거나, 또는 공지되거나 일반적인 T-세포 활성화 방법에 기초하여 본 발명에 맞게 적절하게 조정될 수 있다. 활성화 단계에서 파종 시의 세포 밀도는, 예를 들면 1.0×105 내지 1.0×107개 세포/mL, 바람직하게는 2.0×105 내지 6.0×106개 세포/mL이다.
활성화 단계의 배양 용기는 특별히 제한되지 않으며, 배양 규모에 따라 플레이트, 디쉬, 페트리 디쉬, 플라스크, 백, 병, 탱크(배양 탱크) 등으로부터 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, CliniMACS Prodigy(상표)(Miltenyi Biotec)와 같은 폐쇄형 자동 배양 시스템이 사용될 수 있다.
활성화 단계에서 T 세포 배양에 사용되는 공지되거나 일반적인 배지가 사용될 수 있으며, 필수적인 성분이 배지에 적절히 보충될 수 있다.
활성화 단계에서 배지의 예로는 AIM V, X-VIVO-15, NeuroBasal, EGM2, TeSR, BME, BGJb, CMRL1066, Glasgow's MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, 199 배지, Eagle's MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI-1640, Fischer 배지 및 기타 T 세포 배양용으로 시판되는 제품(예컨대, CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Basal Medium(Thermo Fisher Scientific), CTSTM OpTmizerTM Pro Serum Free Medium(Thermo Fisher Scientific), CTSTM OpTmizerTM Pro (Thermo Fisher Scientific) 및 CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Supplement(Thermo Fisher Scientific))을 포함한다. 이들 배지는 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물로 사용될 수 있다.
배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지 또는 Xenofree 배지일 수 있다. 이종 동물 유래 성분에 의한 오염 방지의 관점에서, 혈청은 배양하고자 하는 세포와 동일한 동물에서 유래할 수 있다. 무혈청 배지는 미가공 또는 미정제 무혈청 배지를 지칭하고, 따라서 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 성장인자)을 함유하는 배지를 포함할 수 있다. 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 혈청 대체물의 예로는 알부민(지질이 풍부한 알부민, 소 알부민, 재조합 알부민 및 인간화 알부민과 같은 알부민 대체물; 식물성 전분; 덱스트란; 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 기타 철 수송체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤(α-모노티오글리세롤, MTG) 또는 등가물을 적절히 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 시판되는 물질, 예컨대, 녹아웃 혈청 대체물(KSR), 화학적으로 정의된 지질 농축물(Thermo Fisher Scientific) 및 GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)가 사용될 수 있다. 배지는 무혈청 배지(SFM)일 수 있다. 예를 들어, 배지는 B-27(상표) 보충제, Xenofree B-27(상표) 보충제, NS21 보충제, GS21(상표) 보충제 또는 이들의 조합을 3D 세포 응집체로부터 T 세포를 생산하는 데 효과적인 농도로 함유할 수 있다.
배지는 비오틴; DL 알파-토코페롤 아세테이트; DL 알파-토코페롤; 비타민 A(아세테이트)와 같은 비타민; 소 혈청 알부민(BSA) 또는 인간 알부민, 무지방산 분획 V; 카탈라아제; 인간 재조합 인슐린; 인간 트랜스페린; 수퍼옥사이드 디스뮤타제와 같은 단백질; 코르티코스테론; D-갈락토스; 에탄올아민 HCl; 글루타티온(환원형); L-카르니틴 HCl; 리놀레산; 리놀렌산; 프로게스테론; 푸트레신 2HCl; 아셀렌산나트륨; 및 T3(트리요오도-L-티로닌); 및 PSG(페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 함유할 수 있다. 배지는 또한 외부로부터 첨가된 아스코르브산 또는 이의 유도체(예를 들어, 아스코르브산 2-포스페이트: PAA)를 포함할 수 있다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산(예컨대, 비필수 아미노산), 비타민, 성장인자, 사이토카인, 항생제, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충액, 및 무기 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 함유할 수 있고, 이들 각각은 외부로부터 첨가된다.
배지는 또한 외부로부터 첨가되는 사이토카인을 함유할 수 있다. 사이토카인의 예로는 FLT3 리간드(FLT3L), 인터류킨-7(IL-7), 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, TNF-알파, TGF-베타, 인터페론-감마, 인터페론-람다, TSLP, 티모펜틴, 플레오트로핀 및 미드킨을 포함한다. 이들 사이토카인은 단독으로 또는 2종 이상의 조합으로 사용될 수 있다. 바람직한 사이토카인은 IL-2이다.
본 발명의 바람직한 한 실시양태에서, CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제는 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 상에 담지된다. 실시예에 사용된 제품 MACS(상표) GMP T-Cell TransACTTM(Miltenyi Biotec)는 CD3 작용제 및 CD28 작용제가 이동성 중합체 사슬의 매트릭스에 담지된 제품으로, 본 실시양태에 상응한다.
본 발명에서 "이동성 중합체 사슬의 매트릭스"(본 명세서에서 때로는 "이동성 매트릭스"라고도 함)의 정의 및 실시양태는 특허문헌 1(WO2014/048920)에 기재된 용어의 정의 및 실시양태와 동일하고, 특허문헌 1의 설명은 본 발명(본 명세서)에 참고적으로 사용될 수 있다. "이동성 매트릭스"는 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 다당류, 글리코사미노글리칸 또는 세포외 매트릭스 조성물로 만들어질 수 있다. 다당류의 예로는 셀룰로스 에테르, 전분, 아라비아검, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 히알루론산, 펙틴, 잔탄, 구아검, 또는 알기네이트를 포함한다. 다른 중합체로는 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄 중합체, 폴리포스파젠, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 블록 공중합체 및 폴리우레탄을 포함한다. 이동성 매트릭스는 바람직하게는 덱스트란의 중합체이다.
본 발명의 바람직한 한 실시양태에서, CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제는 비드 상에 담지된다. 예로는 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific)과 같은 자기 비드를 포함한다.
CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제는 이러한 이동성 매트릭스 또는 비드에 "담지", 즉 "부착"된다. 물질(CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제)은 관련 기술분야에 알려지고 이용 가능한 다양한 방법에 의해 이동성 매트릭스에 부착되거나 커플링될 수 있다. 부착은 공유 또는 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있으며, 물질이 세포를 자극할 수 있는 화학적, 기계적, 효소적 또는 기타 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 매트릭스 또는 비드에 직접 부착될 수 있거나, 항-이소형 항체를 통해 매트릭스 또는 비드에 간접적으로 부착될 수 있다. 또 다른 예로서, 항체는 매트릭스 또는 비드에 부착된 단백질 A 또는 단백질 G, 또는 다른 비특이적 항체 결합 분자를 사용하여 부착될 수 있다. 대안적으로, 물질은 매트릭스 또는 비드에 대한 가교 결합과 같은 화학적 수단에 의해 매트릭스 또는 비드에 부착될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제는 CD3 및 CD28 항체가 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 통해 단일 가닥 DNA 스캐폴드에 접합되는 DNA-기반 T-세포 활성화제일 수 있다(Keskar 등, J Immunother, 2020, vol.43, No.8, 231-235).
유전자 변형 T 세포의 생산 방법
본 발명의 생산 방법은 다음 단계 1 내지 3을 포함하는, 유전자 변형 T 세포의 생산 방법이다:
단계 1: 본 발명의 활성화 방법에 의해 T 세포를 활성화하는 단계.
단계 2: 외인성 유전자를 활성화된 T 세포에 도입시키는 단계(본 명세서에서 "형질도입 단계"라고 함).
단계 3: 외인성 유전자가 도입된 T 세포를 배양하는 단계(본 명세서에서 "배양 단계"라 함).
단계 1: 활성화 단계.
활성화 단계는 본 발명의 활성화 방법을 수행하여 T 세포를 활성화시키는 단계이다. 본 발명의 활성화 방법을 기술하는 전술한 사항은 활성화 단계의 세부 사항을 설명한다.
단계 2: 형질도입 단계
형질도입 단계는 활성화 단계에서 수득한 T 세포에 외인성 유전자를 도입시키는 단계이다.
"외인성 유전자"는 T 세포에서 원하는 단백질을 발현시키기 위해 외부로부터 도입되어야 하는 유전자이며, 생산하고자 하는 T 세포의 용도에 따라 적절히 선택될 수 있다. 하나 이상의 외인성 유전자가 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 외인성 유전자는 CAR을 발현하는 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 외인성 유전자는 CAR을 발현하는 유전자, 사이토카인 및/또는 케모카인을 발현하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR 및 사이토카인과 케모카인의 특정 조합(바람직하게는 IL-7 및 CCL19)을 외인성 유전자를 사용하여 발현시킴으로써 T 세포의 항종양 활성은 향상될 수 있다. 다른 외인성 유전자로서, 항원 특이적 TCR(T-세포 수용체) 및 STAR 수용체(합성 TCR 및 항원 수용체)(Liu 등, Sci. Transl. Med. 2021, vol. 13, issue 586)가, 예를 들어 T 세포에 도입될 수 있다.
(1) CAR
일반적이거나 알려진 CAR과 마찬가지로, T 세포에 의해 발현되는 CAR은 기본적으로 (i) 암세포의 세포-표면 항원을 인식하는 표적 인식 부위(예를 들어, 단일 사슬 항체), (ii) 막관통 영역, 및 (iii) T 세포의 활성화를 유도하는 신호 전달 영역의 부위에 있는 펩타이드가 필요에 따라 스페이서를 통해 연결되도록 구성된다.
(i) 표적 인식 부위는 암세포의 세포-표면 항원을 인식하는 항체(예를 들어, 단일 사슬 항체)일 수 있다. 암세포의 세포-표면 항원을 인식하는 단일 사슬 항체 (i)는 전형적으로 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 항원 결합 부위에서 유래된 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역, 및 이러한 영역을 연결하는 링커 펩타이드로 구성된 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. (i) 표적 인식 부위는 CAR이 암세포에 대해 항종양 효과를 특이적으로 나타낼 수 있는 한, 임의의 표적을 인식할 수 있다. 예를 들어, 암세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 불변 영역을 인식하는 항체(단일-사슬 항체)일 수 있다.
CAR이 표적으로 하는 "암세포의 세포 표면 항원"은 암세포 및 이의 전구세포에서 특이적으로 발현되는 생체분자, 세포의 암화에 의해 새롭게 발현된 생체분자, 또는 정상 세포와 비교하여 암세포에서 발현량이 증가된 생체분자일 수 있다. 이러한 항원은 일반적으로 "종양 연관 항원"(TAA)으로 지칭되며, 그 예로는 BCMA, B7-H3, B7-H6, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD56, CD70, CD74, CD97, CD123, CD133, CD138, CD171, CD248, CAIX, CEA, c-Met, CS1(CD319), CSPG4, CLDN6, CLD18A2, CYP1B1, DNAM-1, GD2, GD3, GM2, GFRα4, GPC3, GPR20, GPRC5D, globoH, Gp100, GPR20, GPRC5D, EGFR, EGFR 변이체, EpCAM, EGP2, EGP40, FAP, FITC, HER2, HER3, HPV E6, HPV E7, hTERT, IgG κ 사슬, IL-11Ra, IL-13Ra2, KIT, Lewis A, Lewis Y, Legumain, LMP1, LMP2, Ly6k, LICAM, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE-A1, 흑색종-연관 항원 1, MUC1, MUC16, NA-17, NY-BR-1, NY-ESO-1, O-아세틸-GD2, h5T4, PANX3, PDGRFb, PLAC1, 폴리시알산, PSCA, PSMA, RAGE1, ROR1, sLe, SSEA-4, TARP, TAG-72, TEM7R, Tn 항원, TRAIL 수용체, TRP2, TSHR, α 태아단백, 메소텔린, 엽산 수용체 α(FRα), 엽산 수용체 β(FRβ), FBP, UPK2, VEGF-R2 및 WT-1을 포함하지만, 이들 예에 제한되지는 않는다.
막관통 영역(ii)은 CAR을 T 세포의 세포막에 고정하기 위한 영역으로서 역할을 하는 폴리펩타이드이다. 막관통 영역의 예로는 BTLA, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 4-1BB(CD137), CTLA-4, GITR, ICOS, LAG3, OX40, SLAMF4(CD244, 2B4), 또는 T 세포 수용체의 α 또는 β 사슬에서 유래된 것을 포함한다. 대안적으로, 전술한 막관통 영역의 천연 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 막관통 영역도 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 막관통 영역으로서 CD8의 막관통 영역이 바람직하다.
막관통 영역에는 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 70개의 아미노산 길이를 갖는 임의의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드)인 힌지 영역이 연결될 수 있다. 힌지 영역의 예로는 CD3, CD8, KIR2DS2 또는 IgG4, IgD 또는 기타 면역글로불린 유래의 힌지 영역을 포함한다. 대안적으로, 전술한 힌지 영역의 천연 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성이 잇는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 힌지 영역도 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 힌지 영역은 CD8의 힌지 영역인 것이 바람직하다.
T-세포 활성화를 유도하는 신호 전달 영역(iii)은 표적 인식 부위(예를 들어, 단일 사슬 항체)가 표적(예를 들어, 암 세포의 세포-표면 항원)을 인식하여 여기에 결합할 때, T 세포 내에서 신호를 전달하기 위한 영역으로서 역할을 하는 폴리펩타이드이다. 신호 전달 영역의 예로는 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 활성화된 NK 세포 수용체, 톨(Toll)-유사 수용체, B7-H3, BAFFR, BTLA, BY55(CD160), CD2, CD3ζ, CD4, CD7, CD8α, CD8β, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96(촉각성), CD103, 4-1BB(CD137), CDS, CEACAM1, CRTAM, CNAM1(CD226), DAP10, Fc 수용체-연관 γ 사슬, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICOS(CD278), IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIRDS2, Ly9(CD229), LAT, LFA-1(CD11a/CD18), LIGHT, LTBR, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PSGL1, SELPLG(CD162), SEMA4D(CD100), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAMF4(CD244, 2B4), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAMF7, SLAMF8(BLAME), SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA1 및 VLA-6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포내 영역을 포함한다. 대안적으로, 전술한 신호 전달 영역(세포내 영역)의 천연 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 신호 전달 영역(세포내 영역)도 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 신호 전달 영역은 바람직하게는 CD28 및 CD3ζ의 세포내 영역, 4-1BB 및 CD3ζ의 세포내 영역, 또는 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ의 세포내 영역을 함유한다.
신호 전달 영역이 복수의 세포내 영역을 함유하는 경우, 세포내 영역은 2 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 링커 펩타이드(올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 통해 서로 연결될 수 있다. 이러한 링커 펩타이드의 예는 글리신-세린 연속 서열로 이루어지는 펩타이드를 포함한다.
항원 인식 부위(예를 들어, 단일 사슬 항체)와 막관통 영역 사이, 및 막관통 영역과 신호 전달 영역 사이 둘 모두에는 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 50개의 아미노산 길이를 갖는 임의의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드)인 스페이서 영역이 포함될 수 있다. 스페이서 영역의 예로는 글리신-세린 연속 서열로 이루어진 펩타이드를 포함한다.
T 세포가 발현하는 전술한 CAR의 아미노산 서열은 T 세포의 용도, 전형적으로 암 치료용 의약의 활성 성분으로서의 기능에 따라 적절히 설정될 수 있다. 표적 인식 부위 (i)의 일례인 암세포의 세포 표면 항원에 대한 단일 사슬 항체의 아미노산 서열로서, 다양한 아미노산 서열이 알려져 있고, 이러한 아미노산 서열에 대한 정보는 본 발명에서도 사용될 수 있다. 대안적으로, 암세포의 원하는 세포 표면 항원에 대한 신규 항체는 통상적인 방법에 따라 생산될 수 있으며, 신규 항체(바람직하게는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 특히 CDR)의 아미노산 서열을 결정함으로써 수득되는 정보는 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 막관통 영역 (ii) 및 T-세포 활성화 신호 전달 영역(iii)의 아미노산 서열로는 인간 및 인간 이외의 포유동물 유래의 다양한 아미노산 서열이 알려져 있고, 이러한 아미노산 서열은 또한 NCBI(미국국립생물공학정보센터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 및 UniProt(The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org)와 같은 데이터베이스에도 등록되어 있다. 따라서, 이러한 정보는 본 발명에도 사용될 수 있다. 특히, 표적 인식 부위 (i)가 암세포의 표면 항원에 결합하는 항체의 불변 영역을 인식하는 항체인 경우, 통상적인 방법에 따라 수득되거나 또는 생산될 수 있다.
(2) 사이토카인
CAR과 함께 T 세포에 의해 발현될 수 있는 사이토카인으로는 다양한 사이토카인이 알려져 있다. 본 발명에서, 또한 공지된 사이토카인은 외인성 유전자에 의해 발현될 수 있다. 사이토카인의 예로는 IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 및 IL-27을 포함한다. 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 사이토카인은 바람직하게는 외인성 유전자가 도입되는 T 세포(T 세포 상의 사이토카인에 대한 수용체)와 동일한 동물 종(인간 또는 비인간 포유동물)으로부터 유래된다. 인간 또는 비인간 포유동물로부터 유래된 다양한 천연 사이토카인의 아미노산 서열은 알려져 있고 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 및 UniProt(The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org)와 같은 데이터베이스에 등록되어 있다. 따라서, 이러한 정보는 본 발명에서도 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "사이토카인"은 천연의 전체 길이의 단백질, 뿐만 아니라 사이토카인으로서의 기능을 유지 또는 향상시키기 위해 다양한 방식으로 변형된 단백질(폴리펩타이드)도 포함한다. 구체적으로 본 발명에서 사이토카인은 (a) 천연 아미노산 서열로 이루어지는 전체 단백질(폴리펩타이드), 또는 이의 일부(기능적 부분 폴리펩타이드), (b) 천연 아미노산 서열에 대해 하나 또는 복수의 아미노산이 결실되거나, 교체되거나 또는 첨가된 변이체, 또는 (c) 전체 길이 단백질 또는 부분 폴리펩타이드가 N- 또는 C-말단에서 다른 단백질(예를 들어, 신호 펩타이드 및 수용체 단백질의 서브유닛)과 연결된 융합 단백질이다. 변이체(b)의 예로는 전체 또는 부분 영역(도메인)으로서, 천연 사이토카인의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 것을 포함한다.
(3) 케모카인
CAR과 함께 T 세포에 의해 발현될 수 있는 케모카인으로는 다양한 케모카인이 알려져 있다. 본 발명에서도 공지된 케모카인이 외인성 유전자에 의해 발현될 수 있다. 케모카인의 예로는 CCL19를 포함한다. 하나 이상의 케모카인은 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 케모카인은 바람직하게는 외인성 유전자가 도입되는 T 세포(T 세포 상의 케모카인에 대한 수용체)와 동일한 동물 종(인간 또는 비인간 포유동물)으로부터 유래된다. 인간 및 비인간 포유동물로부터 유래된 다양한 천연 사이토카인의 아미노산 서열은 알려져 있고 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 및 UniProt(The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org)와 같은 데이터베이스에 등록되어 있다. 따라서 이러한 정보는 본 발명에서도 사용될 수 있다.
본 발명에서 "케모카인"이라는 용어는 천연의 전체 길이의 단백질, 뿐만 아니라 케모카인으로서의 기능을 유지 또는 향상시키기 위해 다양한 방식으로 변형된 단백질(폴리펩타이드)도 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 "케모카인"은 (a) 천연 아미노산 서열로 이루어진 전체 단백질(폴리펩타이드) 및 이의 일부(기능적 부분 폴리펩타이드) 또는 (b) 천연 아미노산 서열에 하나 또는 복수의 아미노산이 결실, 교체 또는 첨가된 변이체를 나타낸다. 변이체 (b)의 예로는 전체 또는 부분 영역(도메인)으로서, 천연 케모카인의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 것을 포함한다.
외인성 유전자를 T 세포에 도입시키기 위한 수단은 특별히 제한되지 않으며, 다양한 공지된 또는 일반적인 수단이 사용될 수 있다. 전형적으로, 외인성 유전자는 발현 벡터를 사용하여 T 세포에 도입되고, 발현된다. 발현 벡터는 선형 또는 환형일 수 있으며, 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존 벡터와 같은 비-바이러스성 벡터일 수 있다.
발현 벡터를 T 세포에 도입시키기 위한 수단은 실시양태에 따라 적절하게 만들어질 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 바이러스 감염법, 인산칼슘법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 또는 전기천공법과 같은 공지의 방법에 의해 T 세포 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터는 공지된 수단에 의해 또는 적절한 시판 키트를 사용하여(설명서에 따름) 각 방법에 사용하기에 적합한 형태로 생산될 수 있다. 형질도입 단계에서, 이러한 제제를 T 세포에 접촉시키고; 일반적으로 발현 벡터를 함유하는 제제가 첨가된 배지에서 T 세포를 배양할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 감염 방법에 의해 T 세포에 도입된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터의 바람직한 예로는 pMSGV 벡터(Tamada K 등, ClinCancer Res 18:6436-6445(2002)), pMSCV 벡터(Takara Bio Inc.에서 생산), 및 SFG 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터가 사용되면, 벡터에 함유된 유전자는 숙주 세포(본 발명에서는 T 세포)의 게놈에 혼입되므로, 장기간 안정적으로 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 상응하는 시판 키트를 사용하여 원하는 외인성 유전자를 함유하는 벡터 및 각 바이러스의 패키징 벡터(플라스미드)를 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 바이러스를 생산한 다음, 수득한 재조합 바이러스를 T 세포에 감염시킬 수 있다. 시판 바이러스 벡터용 키트의 예로는 Retrovirus Packaging Kit Eco(Takara Bio Inc.에서 생산)를 포함한다. 숙주 세포의 예로는 GP2-293 세포(Takara Bio Inc.에서 생산), Plat-GP 세포(Cosmo Bio Co., Ltd.에서 생산), PG13 세포(ATCC CRL-10686), 및 PA317 세포(ATCC CRL-9078)를 포함한다.
복수의 외인성 유전자가 사용되는 경우, 모든 외인성 유전자는 하나의 발현 벡터에 함유될 수 있거나, 모든 외인성 유전자는 상이한 발현 벡터에 별도로 함유될 수도 있거나, 복수 개의 외인성 유전자 중 일부가 하나의 발현 벡터에 함유될 수 있고, 다른 유전자는 다른 발현 벡터에 별도로 함유될 수 있다. 하나의 발현 벡터가 복수의 외인성 유전자를 함유하는 경우, 해당 외인성 유전자가 상류측으로부터 하류측으로 배열되는 순서는 특별히 제한되지 않는다.
외인성 유전자는 전술한 바와 같은 CAR, 사이토카인 및 케모카인과 같은 T 세포에 의해 발현되는 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖는 핵산(폴리뉴클레오타이드)으로 구성될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 T 세포에서 원하는 단백질(폴리펩타이드)을 발현할 수 있는 발현 벡터를 설계하고 생산할 수 있을 것이다. 발현 벡터에 함유된 핵산은 DNA를 화학적으로 합성하여 생산할 수도 있고, 또는 cDNA로 생산(클로닝)할 수도 있다.
발현 벡터는 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열(외인성 유전자) 외에도, 필요에 따라 각 외인성 유전자의 발현에 관여하는 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 개시 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호, 핵 국재화 신호(NLS), 다중클로닝 부위(MCS) 등의 서열을 함유할 수 있다(복수의 발현 벡터의 전술한 조합의 경우에, 발현 벡터는 각각 독립적으로 함유할 수 있음). 하나의 발현 벡터가 복수의 외인성 유전자를 함유하는 경우, 자가 절단 펩타이드(예를 들어, 2A 펩타이드) 또는 IRES(내부 리보자임 진입 부위)를 암호화하는 유전자가 외인성 유전자 사이에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 리포터 유전자(전형적으로는 각각의 색을 가진 형광 단백질을 암호화하는 유전자), 약물 선택 유전자(예컨대, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 퓨로마이신 내성 유전자), 및 자살 유전자(예컨대, 디프테리아 독소 A, 단순 헤르페스 티미딘 키나아제(HSV-TK), 카르복시펩티다제 G2(CPG2), 카르복실 에스테라제(CA), 시토신 데아미나제(CD), 사이토크롬 P450(cyt-450), 데옥시시티딘 키나아제(dCK), 니트로리덕타아제(NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(PNP), 티미딘 포스포릴라아제(TP), 수두 대상포진 바이러스 티미딘 키나아제(VZV-TK), 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(XGPRT) 또는 유도성 카스파제 9를 암호화하는 유전자)와 같은 "기능적 유전자"를 암호화하는 핵산(염기 서열)을 추가로 함유할 수 있다.
"핵산"은 뉴클레오타이드와 이 뉴클레오타이드와 동일한 기능을 갖는 분자를 중합하여 수득되는 임의의 분자일 수 있다. 예로는 리보뉴클레오타이드의 중합체인 RNA, 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체인 DNA, 리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물인 중합체, 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 뉴클레오타이드 중합체를 포함한다. 핵산은 또한 핵산 유도체를 함유하는 뉴클레오타이드 중합체일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 이중 가닥 핵산은 한 가닥이 엄격한 조건 하에서 다른 가닥에 혼성화되는 이중 가닥 핵산을 포함한다.
뉴클레오타이드 유사체는 RNA 또는 DNA와 비교하여, 뉴클레아제 내성, 안정화, 상보적 가닥 핵산과의 친화성 증가, 세포 투과성 향상 또는 가시화를 개선하기 위해 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, RNA 또는 DNA를 변형시킴으로써 수득되는 분자라면 임의의 분자일 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 천연 발생 분자 또는 비천연 분자일 수 있다. 예로는 당-변형된 뉴클레오타이드 유사체(예를 들어, 2'-O-메틸리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 2'-O-프로필리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 2'-메톡시에톡시리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 2'-O-메톡시에틸리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 2'-O-[2-(구아니듐)에틸]리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 2'-플루오로리보스-치환된 뉴클레오타이드 유사체, 가교 핵산(BNA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 가교 핵산(ENA), 펩타이드 핵산(PNA), 옥시-펩타이드 핵산(OPNA) 및 펩타이드 리보핵산(PRNA)), 포스포디에스테르 결합-변형된 뉴클레오타이드 유사체(예를 들어, 포스포로티오에이트 결합-치환된 뉴클레오타이드 유사체 및 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합-치환된 뉴클레오타이드 유사체) 등을 포함한다.
핵산 유도체는 핵산과 비교하여, 뉴클레아제 내성, 안정화, 상보적 가닥 핵산과의 친화성 증가, 세포 투과성의 향상 또는 가시화의 개선을 위해, 핵산에 또 다른 화학물질을 첨가함으로써 수득된 분자라면 임의의 분자일 수 있다. 구체적인 예로는 5'-폴리아민-부가물 유도체, 콜레스테롤-부가물 유도체, 스테로이드-부가물 유도체, 담즙산-부가물 유도체, 비타민-부가물 유도체, Cy5-부가물 유도체, Cy3-부가물 유도체, 6-FAM 부가물 유도체, 비오틴- 부가물 유도체 등을 포함한다.
형질도입 단계에서 배양 용기, 배지, 첨가 성분 및 기타 배양 조건은 본 발명의 활성화 방법에서 활성화 단계에 대해 기술된 것과 동일할 수 있으며, 열거된 것 중에서 적절하게 선택할 수 있다. 하지만, 형질도입 단계에서의 배양 용기, 배지 및 첨가 성분은 활성화 단계에서와 반드시 동일할 필요는 없으며, 적절하게 변경될 수 있다.
단계 3: 배양 단계
배양 단계는 외인성 유전자가 도입된 T 세포를 배양하는 단계이다. 배양 단계에서의 배양 기간은 원하는 단백질이 T 세포에 의해 발현되기에 충분히 길다면 특별히 제한되지 않는다. 배양 기간은 예를 들면 20일, 바람직하게는 3 내지 7일이다.
발현 벡터가 기능성 유전자로서 약물 내성 유전자를 포함하는 경우, 발현 벡터가 도입된 T 세포를 선택하기 위해 배양 단계에서 사용된 약물 내성 유전자에 상응하는 약물이 배지에 첨가될 수 있고, 이에 따라 T 세포를 배양한다. 발현 벡터가 기능적 유전자로서 형광 단백질을 암호화하는 유전자(리포터 유전자)를 함유하는 경우, 발현 벡터가 도입된 T 세포는 배양 단계에서 또는 그 후에 형광현미경에 의해 관찰될 수 있거나, 또는 발현 벡터가 도입된 T 세포가 세포 분류기에 의해 분류될 수 있다.
배양 단계에서 배양 용기, 배지, 첨가 성분 및 기타 배양 조건은 본 발명의 활성화 방법에서 활성화 단계에 대해 기술된 것과 동일할 수 있고, 열거된 것 중에서 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 배양 단계에서 배양 용기, 배지 및 첨가 성분은 활성화 단계에서와 반드시 동일할 필요는 없으며, 적절히 변경될 수 있다.
본 발명의 생산 방법에 의해 수득되는 유전자 변형 T 세포를 함유하는 세포 집단의 적용은 특별히 제한되지 않는다. 세포 집단은 임의의 원하는 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 의약(세포 제제)을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
의약(세포 제제)은 유전자 변형 T 세포를 함유하고, 필요에 따라 다른 성분을 추가로 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자라면 적용(치료할 질병, 투여 대상체 등) 및 투여 형태를 고려하여 유전자 변형 T 세포를 사용하여 이러한 의약을 적절하게 생산할 수 있을 것이다.
의약은 유전자 변형 T 세포에 의해 발현된 CAR이 표적으로 하는 암 세포의 세포 표면 항원(암 특이적 항원)에 상응하는 암을 치료하기 위한 의약(항암제)일 수 있다. 따라서, 의약이 표적으로 하는 암의 유형으로는 CAR이 표적으로 하는 항원을 발현하는 암세포가 암 조직에 함유되어 있고, CAR-T 세포에 의해 일정 수준의 치료 효과가 관찰되는 한 특별히 제한되지 않는다. 의약에 의해 표적화될 수 있는 암의 예로는 선암종, 편평 세포 암종, 선편평 암종, 미분화 암, 대세포암, 소세포암, 피부암(예를 들어, 흑색종 및 메르켈 세포암), 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 목암, 두경부암, 자궁암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 비소세포폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 직장암, 소장암, 결장직장암, 위암, 식도암, 담낭암, 고환암, 난소암, 나팔관암 및 비인두암과 같은 암; 뼈 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암; 연골육종, 유잉 육종, 횡문근 육종, 악성 혈관내피종, 골육종 및 연조직 육종과 같은 육종; 간모세포종, 수모세포종, 신장모세포종, 신경모세포종, 췌장모세포종, 흉막폐모세포종 및 망막모세포종과 같은 모세포종; 배아 세포 종양; 림프종; 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종을 포함한다. 바람직하게는 NK세포에 민감한 암(예컨대, 흑색종, 메르켈세포암, 결장직장암, 신장암, 유방암, 난소암, 나팔관암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 비소세포폐암, 두경부암, 소장암, 전립선암, 방광암, 직장암, 췌장암, 유잉육종, 횡문근육종, 비인두암, 식도암, 담도암, 신경모세포종, 골육종, 급성골수성백혈병, 다발성 골수종, 림프종, 및 백혈병)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 예로는 흑색종, 결장직장암, 신장암, 다발성 골수종, 림프종, 및 백혈병을 포함한다.
유전자 변형 T 세포 이외에 의약에 함유될 수 있는 성분의 예로는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 보다 구체적으로는 식염수, 완충 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 안정제, 가용화제, 계면활성제, 완충액, 보존제, 등장제, 충전제 및 윤활제를 포함한다.
의약은 공지된 유전자 변형 T 세포(예컨대, CAR-T 세포)와 동일한 방법으로 암 치료를 필요로 하는 대상체(암 환자 및 암에 걸린 동물 등)에게 투여하여 사용될 수 있다. 투여 방법의 예로는 종양내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사를 포함한다.
의약에 함유된 유전자 변형 T 세포의 양은, 예를 들어 암의 유형, 위치 및 중증도, 치료할 대상체의 연령, 체중 및 병태 등을 고려하여 용도, 투여 형태, 의도된 치료 효과 등에 따라 적절하게 조정할 수 있다. 예를 들어, 의약은 CAR-T 세포가 단일 용량으로, 보통 1x104 내지 1x1010, 바람직하게는 1x105 내지 1x109, 더 바람직하게는 5x106 내지 5x108의 양으로 투여되도록 제형화될 수 있다.
의약의 투여 간격은 특별히 제한되지 않으며, 1회에 투여되는 본 발명의 T 세포의 양을 고려하여 적절히 조정할 수 있다. 의약은 독립적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 1일 4회, 3회, 2회 또는 1회, 격일, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 주 1회, 8일마다, 9일마다, 10일마다, 주 2회, 한 달에 1회 또는 한 달에 2회이다.
의약을 암 치료에 사용하는 경우, 공지의 항암제와 병용할 수 있다. 항암제의 예로는 사이클로포스파미드, 벤다무스틴, 이포스파미드 및 다카르바진과 같은 알킬화 약물; 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토퓨린 및 에노시타빈과 같은 항대사물질; 리툭시맙, 세툭시맙 및 트라스투주맙과 같은 분자 표적 약물; 이마티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 다사티닙, 수니티닙, 트라메티닙과 같은 키나제 저해제; 보르테조밉과 같은 프로테아좀 저해제; 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 칼시뉴린 저해제; 이다루비신, 독소루비신 및 미토마이신 C와 같은 항종양 항생제; 이리노테칸 및 에토포시드와 같은 식물 알칼로이드; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 제제; 타목시펜, 비칼루타미드와 같은 호르몬 치료제; 및 인터페론, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 같은 면역조절 약물을 포함한다. CAR의 표적 인식 부위가 암세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 불변 영역을 인식하는 항체인 경우, 유전자 변형 T 세포는 세포 표면 항원에 상응하는 암을 치료하기 위한 의약으로서 사용될 수 있다. 이 경우, 유전자 변형 T 세포를 함유하는 의약은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 의약과 함께 사용될 수 있다.
정의
"유도 만능 줄기 세포(iPSc)"는 특정 인자(핵 재프로그래밍 인자)를 도입하여 포유동물의 체세포 또는 미분화 줄기 세포를 재프로그래밍하여 수득한 세포를 지칭한다. 현재, 유도 만능 줄기 세포에는 많은 다른 유형이 있다. 사용 가능한 예로는 마우스 섬유아세포에 4가지 인자, 즉 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 도입시킴으로써, Yamanaka 등에 의해 확립된 iPSc(Takahashi K., Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), 뿐만 아니라 인간 섬유아세포에 동일한 4가지 인자를 도입시킴으로써 확립된 인간 세포-유래 iPSc(Takahashi K., Yamanaka S., 등 Cell, (2007) 131: 861-872), 상기 4가지 인자를 도입시킨 후, 지표로서 Nanog의 발현을 사용하여 선별함으로서 확립된 Nanog-iPS 세포(Okita K., Ichisaka T., and Yamanaka S. (2007). Nature 448, 313-317), c-Myc를 포함하지 않는 방법에 의해 생산된 iPSc(Nakagawa M., Yamanaka S., 등 Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), 무-바이러스 방법에 의해 6가지 인자를 도입시킴으로써 확립된 iPSc(Okita K. 등 Nat. Methods 2011 May;8(5): 409-12, Okita K. 등 Stem Cells. 31(3): 458-66)를 포함한다. 다른 사용 가능한 예로는 Thomson 등에 의해 생산되고 OCT3/4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 4가지 인자를 도입시킴으로써 확립된 유도 만능 줄기 세포(Yu J., Thomson J.A., 등, Science (2007) 318: 1917-1920), Daley 등에 의해 생산된 유도 만능 줄기 세포(Park I.H., Daley G.Q., 등, Nature (2007) 451: 141-146), Sakurada 등에 의해 생산된 유도 만능 줄기 세포(JP2008-307007A) 등을 포함한다.
다른 사용 가능한 예는 관련 기술분야에 공지되고 모든 공개 논문(예를 들어, Shi Y., Ding S., 등, Cell Stem Cell, (2008) Vol. 3, Issue 5, 568-574; Kim J.B., Scholer H.R. 등, Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton D.A., 등, Nature Biotechnology, (2008) 26, No.7, 795-797) 또는 특허(예를 들어, JP2008-307007A, JP2008-283972A, US2008/2336610, US2009/047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, 및 WO2009/007852)에 개시된 유도 만능 줄기 세포 중 임의의 것이다.
"유도 만능 줄기 세포"로는 NIH, RIKEN, 교토 대학 등에 의해 확립된 다양한 iPSc주(strain)가 사용될 수 있다. 인간 iPSc주의 예로는 HiPS-RIKEN-1A주, HiPS-RIKEN-2A주, HiPS-RIKEN-12A주 및 Nips-B2주(RIKEN); 253G1주, 201B7주, 409B2주, 454E2주, 606A1주, 610B1주, 648A1주(Kyoto University) 등을 포함한다. 대안적으로, 교토 대학, Cellular Dynamics International 등에서 제공하는 임상 등급 세포주 및 이러한 세포주를 사용하여 생산된 연구 및 임상용 세포주가 사용될 수 있다.
"배아 줄기 세포(ESC)"로서는, Ingenious Targeting Laboratory, RIKEN 등에 의해 확립된 다양한 마우스 ESC주가 마우스 ESC로서 사용될 수 있고, NIH, RIKEN, Kyoto University, Cellartis 등에 의해 확립된 다양한 인간 ESC주가 인간 ESC로서 사용될 수 있다. 인간 ESC주의 사용 가능한 예로는 NIH의 CHB-1 내지 CHB-12주, RUES1주, RUES2주, HUES1 내지 HUES28주 등; WisCell Research의 H1주, H9주 등; 및 RIKEN의 KhES-1주, KhES-2주, KhES-3주, KhES-4주, KhES-5주, SSES1주, SSES2주, SSES3주 등을 포함한다. 대안적으로, 임상 등급 세포주 및 이러한 세포주를 사용하여 생산된 연구 및 임상용 세포주가 사용될 수 있다.
"포함하다(comprise(s))" 또는 "포함하는(comprising)"의 용어는 이 용어 뒤에 오는 요소가 포함될지라도, 그 포함이 해당 요소에 제한되지 않음을 의미한다. 따라서, 이러한 용어는 뒤에 오는 요소의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 요소의 배제를 암시하지는 않는다. "이루어지다" 또는 "이루어지는"이라는 용어는 이 용어 뒤에 오는 모든 요소가 포함되며, 이 포함이 해당 요소에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, "이루어지다" 또는 "이루어지는"이라는 용어는 열거된 요소가 필요하거나 본질적이며 실질적으로 다른 요소가 없음을 나타낸다. "본질적으로 이루어지다" 또는 "본질적으로 이루어지는"이라는 용어는 이러한 용어 뒤에 오는 모든 요소가 포함되고, 상기 요소에 대해 본 개시내용에서 명시된 활성 또는 작용에 영향을 미치지 않는 다른 요소에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, "~로 본질적으로 이루어지다" 또는 "본질적으로 이루어지는"이라는 용어는 나열된 요소가 필수적이거나 또는 본질적임을 나타내는 반면, 다른 요소는 선택적이고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 세포, 화합물 및 기타 물질에 관하여, 단수형으로 기술된 것과 복수형으로 기술된 것은 달리 명시되지 않는 한, 상호교환 가능하다.
실시예
(I) 재료 및 방법
(1) 배지
2.6% CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Supplement(Thermo Fisher Scientific), 1% L-글루타민(Thermo Fisher Scientific), 1% 스트렙토마이신 및 2% CTSTM Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific)을 CTSTM OpTmizerTM T-Cell Expansion Basal Medium(Thermo Fisher Scientific)에 첨가하여 기본 배지를 생산했다. MACS GMP IL-2(Miltenyi Biotec)를 기본 배지에 20 IU/mL 또는 40 IU/mL의 양으로 첨가하여 배양 배지를 형성시켰다.
(2) PBMC를 이용한 소규모 CAR-T 세포의 생산
인간 PBMC(4명의 공여자: 공여자 A, B, C 및 D)를 해동한 다음, 배양 배지에 1.0x106 세포/mL의 농도로 희석했다. 세포 현탁액 대 MACS GMP T-Cell TransACT(Miltenyi Biotec)의 비율이 17.5:1이도록 세포를 배양 플레이트에 파종하고, 24 내지 72시간 동안 배양했다(활성화 단계). 활성화된 세포를 원심분리하고 배지를 새로운 배양 배지로 교체한 후, Retronectin(Takara Bio Inc.) 및 레트로바이러스로 사전에 예비코팅된 배양 플레이트에 세포를 5.0x104 세포/cm2의 농도로 파종하고, 다음날까지 배양했다(유전자 도입 단계). 유전자 도입 단계에서 CAR 유전자(항-GPC3 scFv, CD8 힌지 영역, CD8 막관통 영역, CD28 세포내 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내영역 포함), IL-7 유전자, 및 CCL19 유전자를 포함하고, 이들 유전자가 각각 자가-절단 펩타이드(2A 펩타이드)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 통해 연결되어 있는 외인성 유전자를 도입시켰다. 세포는 배양 배지로 세척한 후, 모든 세포를 배양 플레이트에서 배양 배지에 4 내지 6일 동안 배양했다.
(3) T 세포를 이용한 임상 규모의 CAR-T 세포의 생산
Leukopak(인간 백혈구 성분채집술 제품, HemaCare)(3명의 공여자: 공여자 E, F, G)을 해동한 후, CliniMACS Prodigy(Milteny Biotec) 내 CliniMACS CD4 GMP Microbeads(Miltenyi Biotec) 및 CliniMACS CD8 GMP Microbeads(Miltenyi Biotec)를 사용하여 T 세포를 단리했다. 단리된 T 세포는 2.0x106개 세포/mL 이하의 농도로 배양 배지에 희석했다. 세포는 현탁액 대 MACS GMP T-Cell TransACT(Miltenyi Biotec)의 비율이 17.5:1이도록 세포를 배양 백에 파종하고 36 내지 48시간 동안 배양했다(활성화 단계). 활성화된 세포는 LOVO Cell Processing System(Fresenius Kabi)을 사용하여 배양 배지에 희석하고, Retronectin(Takara Bio Inc.) 및 레트로바이러스로 예비코팅된 배양 백에 6.07x105 세포/cm2 이하의 농도로 파종하고, 다음날까지 배양했다(유전자 형질도입 단계). 유전자 형질도입 단계에서 CAR 유전자(항-GPC3 scFv, CD8 힌지 영역, CD8 막관통 영역, CD28 세포내 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역 포함), IL-7 유전자, 및 CCL19 유전자를 포함하고 이들 유전자가 각각 자가-절단 펩타이드(2A 펩타이드)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 통해 연결되어 있는 외인성 유전자를 도입시켰다. 세포를 배양병(G-REX, Wilson Wolf)에 2.2x106 세포/cm2 이하의 농도로 파종하여 3 내지 7일간 배양했다.
(4) 유세포분석
생산 후 샘플 내 CAR-발현 세포의 백분율 또는 CAR-발현 세포의 수는 Protein-L을 사용하여 샘플 내 CD45-발현 또는 CD3-발현 세포 중 CAR-발현 세포를 측정하여 계산했다. 활성화 단계 직후 T-세포 활성화 마커(CD25 및 CD69)를 발현하는 세포의 백분율은 샘플 내 CD3-발현 세포 또는 CD4 또는 CD8 발현 세포에서 이들 마커를 발현하는 세포를 측정함으로써 계산했다.
(5) 활성화에 사용된 TransACT 및 IL-2의 잔여량 분석
활성화 단계 후 배지에 남아있는 TransACT의 잔여량은 T Cell Activation Bioassays(Promega, J1621)를 사용하여 측정했다. IL-2의 잔여량은 Human IL-2 DuoSet ELISA(R&D systems, cat # DY202)를 사용하여 측정했다.
(II) 결과
도 1은 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 24, 48, 또는 72 시간) 내 CAR-발현 세포의 백분율 및 CAR-발현 세포의 수를 유세포분석에 의해 측정한 결과를 보여준다. CAR 발현 세포의 백분율은 공여자-독립적인 방식으로 48시간째에 가장 높아졌다(도 1a). 또한 CAR-발현 세포의 수는 48시간째에 높아지는 경향이 있었다(도 1b).
도 2는 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 40, 44, 또는 48 시간) 내 CAR-발현 세포의 백분율 및 CAR-발현 세포의 수를 유세포분석에 의해 측정한 결과를 보여준다. CAR 발현 세포의 백분율은 공여자-독립적인 방식으로 40시간째에 가장 높아졌다(도 2a). 또한 CAR-발현 세포의 수는 40시간째에 높아지는 경향이 있었다(도 2b).
도 3은 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 37 내지 44 시간) 내 CAR-발현 세포의 백분율을 유세포분석에 의해 측정한 결과를 보여준다. CAR-T 세포는 37시간 이상 및 44시간 이하의 활성화 기간에 높은 효율로 생산되었다.
도 4는 "(2) PBMC를 사용한 소규모 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 40, 44, 또는 48 시간) 내 활성화된 T 세포가 지표로서 활성화 마커(CD25 또는 CD69)를 사용하여 유세포분석으로 측정한 결과, 및 배양 상청액에 남아 있는 활성화에 사용된 TrasACT 및 IL-2의 양이 분석된 결과를 보여준다. CD25-발현 또는 CD69-발현 세포의 백분율은 활성화 단계 직후 활성화 기간(40, 44, 및 48 시간) 사이에 차이가 없었다(도 4a 및 4b). 활성화 단계 직후 배양 상청액에 남아 있는 활성화에 사용된 TransACT 및 IL-2의 양은 활성화 기간(40, 44, 및 48 시간) 사이에 차이가 없었다(도 4c 및 4d). 도 1 내지 3의 결과에 제시된 CAR-T 세포의 생산 효율은 배지 내 주요 성분 및 활성화 정도 외에 다른 인자로 인해 증가한 것으로 생각된다.
도 5는 실시예의 "(3) T 세포를 사용한 임상 규모의 CAR-T 세포의 생산"에 따라 수득한 세포 집단(활성화 단계 36, 40, 44, 또는 48 시간)에서 유세포분석에 의해 CAR-발현 세포의 백분율을 측정한 결과를 보여준다. CAR-발현 세포의 백분율은 공여자-독립적 방식으로 40시간째에 높아지는 경향이 있었다. CAR-발현 세포의 백분율은 36시간째에 감소했고, 36시간 동안의 활성화는 CAR-T 세포의 생산에 불충분했다.

Claims (9)

  1. CD3 작용제(agonist) 및/또는 CD28 작용제를 함유하는 배지에서 36시간 초과 48시간 미만 동안 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는 T 세포 활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제가 담체 상에 담지되어 있는, 활성화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 담체가 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 또는 비드인, 활성화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CD3 작용제 및 CD28 작용제가 각각 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체인, 활성화 방법.
  5. 유전자 변형 T 세포의 생산 방법으로서,
    제1항의 활성화 방법에 따라 T 세포를 활성화시키는 단계,
    상기 활성화된 T 세포에 외인성 유전자를 도입시키는 단계, 및
    상기 외인성 유전자가 도입된 상기 T 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 생산 방법.
  6. 제5항에 따른 생산 방법에 의해 수득된 유전자 변형 T 세포를 포함하는 세포 집단.
  7. 제5항에 있어서, 상기 외인성 유전자가 키메라 항원 수용체 유전자인, 생산 방법.
  8. CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 담지하는 이동성 중합체 사슬의 매트릭스 또는 비드로서, 상기 매트릭스 또는 비드는 배지에 첨가되어 T 세포를 36시간 초과 48시간 미만 동안 활성화 단계에 적용시키는 데 사용되는, 매트릭스 또는 비드.
  9. 외인성 유전자를 도입시키기 위한 T-세포 활성화 키트로서,
    담체 상에 담지된 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제, 및
    36시간 초과 48시간 미만 동안 상기 CD3 작용제 및/또는 상기 CD28 작용제를포함하는 배지에서 T 세포의 활성화를 설명하는 매뉴얼
    을 포함하는 T-세포 활성화 키트.
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