JPWO2012096376A1 - 制御性ｔ細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程、を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法が提供される。該製造方法により、効率良く制御性Ｔ細胞を（高比率で）含む細胞集団が提供される。
Description
本発明は、医療分野において有用な、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造する方法に関する。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）は、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制する機能を持ち、免疫寛容を担うＴ細胞と一般に定義づけられる。ヒトにおける制御性Ｔ細胞の減少ないし機能異常は、自己免疫疾患やアレルギーの発症原因となる。したがって、制御性Ｔ細胞の量的又は質的なコントロールは、自己免疫疾患やアレルギーの治療に有用であり、さらには、難治性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：Ｇｒａｆｔ Ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）の治療など、移植免疫分野における新たな細胞療法となることが期待されている。
この制御性Ｔ細胞は、内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ：Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）と誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）に便宜的に大別される。内在性制御性Ｔ細胞は、胸腺において分化し、外部からの抗原感作とは関係なく自然産生されるものと定義される。一方、誘導性制御性Ｔ細胞は、人為的な寛容誘導モデルにおいて、外来抗原刺激に応じて末梢ナイーブＴ細胞から分化誘導されるものと定義される。これらの制御性Ｔ細胞はさらに、その細胞に発現するマーカーの種類に従い細分化されている。
内在性制御性Ｔ細胞群の一つであるＣＤ４陽性（以下、「ＣＤ４＋」とも記される。）ＣＤ２５陽性（以下、「ＣＤ２５＋」とも記される。）制御性Ｔ細胞を生体より除去すると、各種の臓器特異的な自己免疫疾患が自然発症し、その際、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を移植すると、自己免疫疾患の発症が阻止されるため、内在性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、末梢での免疫自己寛容の維持に重要な働きをしていると考えられている。その後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の機能が詳細に解析され、自己免疫のみならず、外来抗原による炎症、アレルギー、移植による拒絶反応、感染免疫、腫瘍免疫等、ほとんどの免疫反応を抑制し得ることが明らかになってきた。また、現在、このＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のマスター制御因子として、転写因子Ｆｏｘｐ３が明らかにされている（例えば、非特許文献１）。
患者の末梢血から制御性Ｔ細胞を拡大培養により製造する方法として、主として次の二つの方法が考えられる。一つは、末梢血由来のＴ細胞含有画分を拡大培養に供し、その培養過程において、あるいは培養完了後に制御性Ｔ細胞を選択する方法である。もう一つは、末梢血から予め分離された制御性Ｔ細胞を出発材料として拡大培養する方法である。
しかし、前者において、生体外で制御性Ｔ細胞は他のＴ細胞に比べて増殖能が乏しく、拡大培養された多種多様の細胞群からさらに存在比が減少した制御性Ｔ細胞を選別する作業が難しいという問題がある。また、制御性Ｔ細胞に発現しているＦｏｘｐ３は細胞内分子であるので、その発現を確認するためには、細胞膜の透過処理を施して染色をする必要がある。よって、Ｆｏｘｐ３の発現は生細胞を分離する際の指標とはできない。
後者においても、生体外で制御性Ｔ細胞は増殖能が乏しく、制御性Ｔ細胞を多く得る点が問題である（例えば、非特許文献２）。
したがって、制御性Ｔ細胞を前述された様々な細胞療法に用いるために、少ない量の末梢血から制御性Ｔ細胞を効率よく拡大培養できる方法が望まれている。
ＣＤ３活性化物質である抗ＣＤ３抗体を用いた制御性Ｔ細胞の拡大培養方法（非特許文献３）、ならびに抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を併用した制御性Ｔ細胞の拡大培養方法（非特許文献４）が報告されている。しかしながらこれらの方法は、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞の製造方法としては満足いくものではない。
ネイチャー イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、第３３０〜３３６頁（２００３）
アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第５３１〜５６２頁（２００４）
ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１９３巻、第１２８５〜１２９４頁（２００１）
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０４巻、第４５３〜４６１頁（２００４）
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０８巻、第４２６０〜４２６７頁（２００６）
イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１２１巻、第１２９〜１３９頁（２００７）
ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３７巻、第２３７８〜２３８９頁（２００７）
ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１７８巻、第３２０〜３２９頁（２００７）
本発明の目的は、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法、およびその方法により製造された細胞集団、さらにその細胞集団を含む医薬を提供することにある。
本発明者らは、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、ＣＤ３活性化物質を作用させることにより、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団の細胞増殖が有意に上昇し、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出した。さらに、ＣＤ３活性化物質及びＣＤ２８リガンドを併用した制御性Ｔ細胞の拡大培養方法においても、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物を共存させることで、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団の細胞増殖が有意に上昇し、効率よくＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記工程を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法に関する：
（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び
（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程。
（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び
（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程。
本発明の第１の発明の態様において、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程が、ＣＤ２８リガンドの共存下で培養する工程を包含する方法も、本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法に包含される。また、ＣＤ２８リガンドが抗ＣＤ２８抗体であってもよい。更に、本発明の第１の態様において、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団であってもよく、ＣＤ３活性化物質が抗ＣＤ３抗体であってもよい。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団に関する。
本発明の第３の発明は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤に関する。
本発明の第１の発明の態様として、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法が挙げられる。
本発明の第２の発明の態様として、本発明の第１の発明の態様で製造されたＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に関する。
本発明の第３の発明の態様として、本発明の第１の発明の態様で製造されたＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤が挙げられる。
本発明の方法を用いれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を効率よく拡大培養できる。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
Ｔ細胞とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味し、分化したＴ細胞及び未分化なＴ細胞を含む。Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１型、Ｔｈ２型、Ｔｈ９型、Ｔｈ１７型、Ｔｈ２２型、Ｔｆｈ型）、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞、ＮＫＴ細胞などが知られている。
制御性Ｔ細胞とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、エフェクターＴ細胞の活性化（増殖、サイトカイン産生等）を阻害し得る能力（免疫抑制活性）を有するＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、通常ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞画分内に存在する。制御性Ｔ細胞自体は、Ｔ細胞受容体を介する刺激に対しては実質的な増殖反応を示さず、不応答性であり得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のマスター制御因子として、転写因子Ｆｏｘｐ３が知られている（なお、ここで「＋」とは細胞表面に当該分子を発現している（陽性である）ことを指す。以下同様）。
拡大培養されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の中で、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞が、制御性Ｔ細胞の中でも特に免疫抑制活性が強いこと、またＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ナイーブ制御性Ｔ細胞）集団を拡大培養することによりＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞の割合が増加することが報告されている［ブラッド、第１０８巻、第４２６０〜４２６７頁（２００６）］。また、拡大培養されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団において、ＣＤ２７の発現はＦｏｘｐ３の発現及び免疫抑制活性と相関することが報告されている［イムノロジー、第１２１巻、第１２９〜１３９頁（２００７）］。さらに、制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の安定的な発現には、Ｆｏｘｐ３座にある“制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域”（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されていることが重要であることが報告されている［ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー、第３７巻、第２３７８〜２３８９頁（２００７）］。さらに、制御性Ｔ細胞をラパマイシン存在下に拡大培養を行うことにより、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５を発現する細胞の割合が増加することが報告されている［ジャーナル オブ イムノロジー、第１７８巻、第３２０〜３２９頁（２００７）］。
本発明において、「制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造」とは、制御性Ｔ細胞の増殖（拡大培養）を含む概念を意味する。本発明により、特に免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞を高い比率で含有する細胞集団を効率よく得ることができる。
本発明において、「フィブロネクチン」及びそのフラグメントは、天然から単離されたもの、人為的に作製されたもの、又は遺伝子工学的に調製された組換え体、すなわち非天然のもののいずれでもよい。フィブロネクチン及びそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、フィブロネクチンフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列については、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にそれぞれ開示されている。本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチン及びそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられ、そのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれている。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９及びＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５残基のアミノ酸からなる、ＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ−７、８、９、１１、１２、１３又はＣＳ−１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、更に複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメインなどを含有するフラグメントが本発明に使用される。前記組換えフラグメントとしては、例えば、ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１（配列表の配列番号１）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号２）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号３）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号４）、又はこれらの誘導体もしくは改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６は細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインを有する組換えフィブロネクチンフラグメントであり、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。
本発明において、「ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団」とは、ＣＤ２５が陽性であるＴ細胞集団を意味するが、例えば、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団もＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団に含まれる。
以下、本発明を具体的に説明する。
１．制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明の方法による制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造は、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離する第１工程、第１工程により得られたＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を、ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養する第２工程、により実施される。
１．制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明の方法による制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造は、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離する第１工程、第１工程により得られたＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を、ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養する第２工程、により実施される。
既に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による共刺激によって、ＣＤ８＋細胞よりもＣＤ４＋細胞が優先的に拡大培養されること、さらに抗ＣＤ３抗体及びフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６による共刺激によって、ＣＤ４＋細胞よりもＣＤ８＋細胞が優先的に拡大培養されることが報告されている［キャンサー ジーン セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１５巻、第５０８〜５１６頁（２００８）］。
本発明者らは、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団をＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養することにより、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の細胞増殖率が有意に上昇し、効率よくＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出した。
第１工程において、「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては特に本発明を限定するものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢リンパ球、臍帯血単核細胞などが例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）又は生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのまま使用してもよく、凍結保存した後に使用してもよい。また、例えば生体から得られた細胞集団から種々の誘導操作又は分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等から分離されたＣＤ２５＋の細胞集団も使用することができる。更に、本発明の細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血、臍帯血などの血液、又は血液から赤血球もしくは血漿などの成分を除去したもの、骨髄液などを使用することもできる。
Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離する工程は、例えばフローサイトメーターを用いる方法、もしくは免疫磁気ビーズ法などの公知の方法を用いて実施することができる。フローサイトメーターを用いる方法では、蛍光標識した抗ＣＤ２５抗体で染色することにより区分されるＣＤ２５＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離することができる。また、別のマーカー［例えば、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＩＴＲ）］を標的に区分されるＣＤ２５＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離することもできる。さらに、該工程において、蛍光標識した抗ＣＤ２５抗体及び抗ＣＤ４抗体で共染色することにより区分されるＣＤ２５＋かつＣＤ４＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を分離することができる。
免疫磁気ビーズ法は、種々の抗体を結合した磁気ビーズと磁石を併用することにより、細胞の分離を行う方法である。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するためのキットとして、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）などがあり、キットに添付の取扱説明書に従い、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離することができる。
なお、Ｔ細胞を含有する細胞集団から、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞を除去することにより、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を高含有する細胞集団を得る操作も、本発明における第１工程の一態様である。
以上に例示した方法により取得されるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団も、本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法の出発材料として使用することができる。
第２工程では、前記第１工程により得られたＣＤ２５＋Ｔ細胞集団がＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養される。
これら２つの工程からなる本発明によれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造することが可能である。更に、当該方法により得られる制御性Ｔ細胞は、免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ等の予防・治療に有用であり、細胞療法などへの利用に好適である。
本発明の方法において、第２工程は、通常、本発明の製造方法を特徴づける有効成分、すなわちＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下に、リンパ球の培養に使用される一般的な成分を含む培地中で行なわれる。
本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法において使用される培地は前記の有効成分を含有すれば特に限定はなく、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の維持、生育に適した成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば市販の培地やその改変物であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、本発明にはＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．１〜１×１０５ＩＵ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４ＩＵ／ｍＬ、さらに好適には１０〜１×１０３ＩＵ／ｍＬである。また、他のサイトカイン類（ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１等）、レクチンなどのリンパ球刺激因子又は免疫抑制剤であるラパマイシンを添加することもできる。
有効成分として本発明に使用されるＣＤ３活性化物質としては、Ｔ細胞受容体やＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３抗体、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、アロＭＨＣ分子、人工抗原提示細胞や樹状細胞により提示される抗原などが例示される。好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が本発明に使用され、例えば、ＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７〜３４９頁（１９７９）］が特に好適である。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５０μｇ／ｍＬが好適である。
また、有効成分として本発明に使用されるフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。
さらに、本発明において、必要に応じて、培地にＣＤ２８リガンドを添加してもよい。本発明に使用されるＣＤ２８リガンドとしては、ＣＤ２８に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば抗ＣＤ２８抗体が挙げられる。ＣＤ２８リガンドの培地中の濃度は、特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜２０μｇ／ｍＬが好適である。ＣＤ２８リガンド存在下での培養は、本発明において培養工程の一部のみで実施してもよく、培養全体を前記成分の存在下で実施してもよい。
なお、これらの成分のうち、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」及び「ＣＤ２８リガンド」は、培地中に溶解して共存させる以外に、適切な固相、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグなどの細胞培養用器材（開放系のもの又は閉鎖系のもののいずれも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラスなどの細胞培養用担体に固定化することにより固相化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固相化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固相化するのが好適であるが、当該成分の固相化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固相化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固相化するのが好適であるが、当該成分の固相化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。いずれの場合においても、前記成分の固相化は、公知の方法、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット及び国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載されたフィブロネクチンフラグメントの固相化方法に準じて行なうことができる。さらに、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」及び「ＣＤ２８リガンド」以外の有効成分を、細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固相化してもよい。例えば、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌなどが例示される。
前記の種々の成分や、本発明の有効成分から選択されるものを固相化しておけば、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を得る過程で該細胞集団と固相とを分離するのみで、有効成分等と該細胞集団を容易に分離することができ、該細胞集団への有効成分などの混入を防ぐことができる。
本発明の方法における第２工程は、前記の有効成分の存在下でのＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の培養に続いて実施される、有効成分を含有しない培地での培養を包含してもよい。この際には、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」のいずれか、もしくはその両方を含有しない他は同じ組成の培地を使用してもよく、異なる組成の培地を使用してもよい。
本発明の方法において前記の有効成分の存在下での培養の期間は１日以上であればよく、好ましくは２日以上であり、また、前記期間は８日以内であればよく、好ましくは６日以内である。さらに、増殖倍率を上げるために、前記の有効成分を含有しない培地での培養の後もしくはその途中で、再度有効成分を含有する培地、もしくは有効成分を固相化した細胞培養用器材又は細胞培養用担体を用いて培養を行ってもよい。
本発明には血清又は血漿を含有しない培地を使用することもできるが、培地に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はされないが、０超〜２０容量％、好適には０超〜６容量％の含有量が例示され、また、培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）又は非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよいが、安全性の観点から、自己由来のものが好適に使用される。
本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はされないが、例えば、好適には１０２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０３〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１０４〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、細胞培養に通常使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、細胞培養用器材を交換するなどの操作を行うことができる。
本発明の製造方法において使用される細胞培養用器材として、特に限定されないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクターなどを使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれにおいても実施することができるが、得られる細胞集団の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
本発明において、有効成分存在下、非存在下での培養を合わせた総培養日数は、好適には５〜４０日間であり、より好適には６〜３５日間、更に好適には７〜３０日間である。この範囲で、一般的な免疫療法に使用しうる細胞数を得ることができ、細胞増殖が良好に維持される期間を適宜選択すればよい。
本発明の製造方法で得られる細胞集団は、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であり、かつＦｏｘｐ３陽性細胞の含有率が高い。さらに、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であり、かつＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞の含有率が高い。前述したように、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が陽性の細胞は、免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞であることが知られている。
すなわち、下記の各実施例に示すように、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる細胞は、免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞である。また、本発明の製造方法は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のみを使用する従来法よりもさらに制御性Ｔ細胞の増殖が良好な点で優れた拡大培養である。
本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法により得られた細胞集団中には、通常、制御性Ｔ細胞以外の細胞も混在している。本発明の製造方法は、得られた細胞集団から制御性Ｔ細胞を分離する工程をさらに含んでもよい。すなわち、本発明において、制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団中の制御性Ｔ細胞以外の細胞と制御性Ｔ細胞との分離操作を施すことにより、制御性Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を調製し、使用することができる。制御性Ｔ細胞の分離は公知の方法に従って実施することができる。例えば、フローサイトメーターを用いて、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で共染色することにより区分されるＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞を選択的に回収することによって、免疫抑制活性が高い制御性Ｔ細胞を分離することができる。また、本発明の製造方法より得られた細胞集団から、制御性Ｔ細胞以外の細胞を除去することにより、制御性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を得ることができる。また、本発明における制御性Ｔ細胞を高含有する細胞集団には、制御性Ｔ細胞のみの細胞集団も包含され得る。
本発明によれば、上記の「制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団の製造方法」を利用した、所望の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を製造する方法が提供される。当該方法は、前述した第１工程及び第２工程に加えて、遺伝子導入の工程を包含する。
制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に所望の遺伝子を導入する遺伝子導入の工程は、第１工程の終了後に、第２工程と同時に、又は第２工程の終了後に実施することができる。前述した第１工程及び第２工程と該遺伝子導入工程を組み合わせることにより、制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団への遺伝子導入効率が向上する。すなわち、本発明の方法により製造される細胞集団は所望の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を高比率で含む細胞集団である。本発明は遺伝子治療用細胞の製造に特に有用である。
本発明において制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に導入される所望の遺伝子は特に限定はなく、自己由来の遺伝子又は外来遺伝子から前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類など）をコードするもの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子や遺伝子導入された細胞を選択的に除去するための自殺遺伝子を上記遺伝子と一緒に導入してもよい。すなわち、導入する所望の遺伝子の数に限定はなく、複数の遺伝子を導入することもできる。
導入される所望の遺伝子は天然より得られたものでも、又は遺伝子工学的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーションなどの公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
特に限定はされないが、本発明の一態様として、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子の導入が例示される。当該遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）をコードする遺伝子、又は標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位と、レセプター分子由来の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。この遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団は、所望の抗原を認識する制御性Ｔ細胞を含有している細胞集団である。当該細胞集団は、レセプターをコードする遺伝子が導入されていない細胞集団と比較して、所望の抗原に対する特異性の高い細胞集団であり、所望の抗原の刺激を受けた際に当該抗原や当該抗原を提示する細胞に特異的に反応することができることから、免疫療法への利用に有用である。
所望の遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、相同組換えにより導入対象の制御性Ｔ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置してもよい。
本発明において、遺伝子導入工程における所望の遺伝子の導入手段に特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明にて使用できる。それらの方法の詳細については、すでに多くの文献が公表されている。
前記ウイルスベクターに特に限定はなく、遺伝子導入方法に通常使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用できる。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合、プラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に感染しうることから、本発明の製造方法にて遺伝子導入を行うのに特に好適である。多数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターが文献等で発表されており、また、すでに市販されている。本発明にはこれらの公知のベクターを使用することができる。
また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞又は２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
前記のとおり、本発明にはウイルスのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルス、レンチウイルスも使用することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープを有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖修飾を受けたエンベロープやその他の膜タンパクをその表面に有するレトロウイルス、レンチウイルスも本発明に使用できる。
レトロウイルスベクターを使用して遺伝子導入を行う場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用して遺伝子導入効率を向上させることができる。さらに、標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用して標的細胞特異的な遺伝子導入を実施することもできる（例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット参照）。
以上説明したように、第１工程の終了後に、第２工程と同時に、又は第２工程の終了後に、遺伝子導入を行う本発明の方法により、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団への遺伝子導入を効率よく行うことが可能となる。また、本発明の方法は、特別な設備、装置を必要とせず、また、多種のレトロウイルスベクター及び標的細胞について有効である。更に、当該方法は閉鎖系での利用に適していることから、遺伝子治療などの臨床用途で非常に有用である。
本発明の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法は、遺伝子導入工程を第２工程の終了後に実施する場合、遺伝子導入工程で得られた遺伝子導入細胞を培養する工程をさらに包含してもよい。前記の培養工程は、第２工程と同様に実施することができる。
本発明の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法における総培養日数は、遺伝子導入を実施しないものと同程度とすればよい。
２．本発明の方法により製造される制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる医薬
本発明の方法により製造される細胞集団は、強い免疫抑制活性を有するので、何らかの原因により生体内で免疫反応が異常に亢進し望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫反応が起こることが将来的に予測される場合等に、患者に該細胞集団を投与すること等によって、患者の体内において異常に亢進した望ましくない免疫反応を抑制、あるいは回避することが出来る。
本発明の方法により製造される細胞集団は、強い免疫抑制活性を有するので、何らかの原因により生体内で免疫反応が異常に亢進し望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫反応が起こることが将来的に予測される場合等に、患者に該細胞集団を投与すること等によって、患者の体内において異常に亢進した望ましくない免疫反応を抑制、あるいは回避することが出来る。
本発明は、上記方法により製造され得る細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤を提供する。本発明の免疫抑制剤は、臓器移植における拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー疾患（花粉症、食品アレルギー、薬剤アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
本発明の免疫抑制剤は、常套手段に従って、有効量の上記制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を医薬として許容される担体と混合するなどして、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の免疫抑制剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫抑制剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤、免疫抑制剤（ラパマイシンなど）、抗体製剤、細胞製剤（制御性樹状細胞）などと配合してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の哺乳動物に対して投与することができる。
本発明の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、一日につき２．６×１０９細胞程度を上限とする有効量を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１ 細胞培養用プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
フィブロネクチンフラグメント［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を２５μｇ／ｍＬ、及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で３．５時間放置した。また、対照として抗ＣＤ３抗体のみを５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で３．５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液を取り除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
フィブロネクチンフラグメント［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を２５μｇ／ｍＬ、及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で３．５時間放置した。また、対照として抗ＣＤ３抗体のみを５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で３．５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液を取り除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）よりＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Т Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１．５％ 自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾン（ブリストルマイヤーズ社製）を含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）（これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、バイオレジェンド社製）を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加する群と添加しない群を作製し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、０．６ｍＬの培養用培地を追加して、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養５日目に培養用培地を２．５ｍＬ加え、細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）よりＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Т Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１．５％ 自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾン（ブリストルマイヤーズ社製）を含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）（これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、バイオレジェンド社製）を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加する群と添加しない群を作製し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、０．６ｍＬの培養用培地を追加して、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養５日目に培養用培地を２．５ｍＬ加え、細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率を図１に示す。図１において、縦軸は細胞増殖倍率（以下各図においてＦｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：拡大倍数で示す）を示す。実施例の各図において、「ＣＤ３」は抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３」はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。また、「ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体を添加した群を示し、「−」は抗ＣＤ２８抗体の添加していない群を示す。図１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞の方が、高い細胞増殖倍率を示した。抗ＣＤ２８抗体存在下においても、同様に抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
制御性Ｔ細胞のマスター制御因子であるＦｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図２に示す。図２は、培養細胞にＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔ（イーバイオサイエンス社製）を用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ミルテニーバイオテク社製）で測定した結果を示す。図２において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３に示す。図３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１の細胞増殖倍率と図２の陽性率を乗じた値を示す。図３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方がＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が増加した。抗ＣＤ２８抗体存在下においても、同様に抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例２ 表面未処理プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で４時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で４時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ 自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（以下、これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養９日目に培養用培地を１ｍＬ加えまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ 自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（以下、これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養９日目に培養用培地を１ｍＬ加えまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図４に示す。図４において、横軸は培養開始からの日数、縦軸は細胞増殖倍率を示す。実施例の各図において、「ＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に抗ＣＤ３抗体固相化表面未処理プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下にフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化表面未処理プレートで培養した細胞を示す。図４より、表面未処理プレートに固相化した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例１−（２）と同様の操作で測定した。その結果を図５に示す。図５において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図５より、表面未処理プレートで培養した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図６に示す。図６において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４の細胞増殖倍率と図５の陽性率を乗じた値を示す。図６より、表面未処理プレートで培養した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例３ 培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−（１）記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−（１）記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養３日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を２．５ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．３２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに５．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１０日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養３日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を２．５ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．３２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに５．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１０日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図７に示す。図７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例１−（２）と同様の操作で測定した。その結果を図８に示す。図８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図９に示す。図９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図７の細胞増殖倍率と図８の陽性率を乗じた値を示す。図９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞を得た。ＣＤ４陰性細胞は３０ＧｙのＸ線を照射後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ 自己血漿、０．２％ ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（以下、これを抑制活性測定用培地とする）に懸濁した。ＣＤ４陽性細胞を終濃度２μＭのＣＦＳＥ（シグマアルドリッチ社製）を含む抑制活性測定培地で懸濁し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８分間処理し、抑制活性測定用培地で細胞を４回洗浄後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように抑制活性測定用培地に懸濁した。これをレスポンダー細胞とする。Ｘ線照射したＣＤ４陰性細胞とＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞を１対１で混合（以下、Ｔｒｅｓと記載）し、さらに終濃度２００ｎｇ／ｍＬとなるように抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を添加した。この混合細胞液を細胞培養用９８ウェル丸底プレートに１００μＬ添加し、さらに本実施例（２）で得られた培養細胞を抑制活性測定用培地で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した。その後、細胞を回収しレスポンダー細胞のＣＦＳＥの蛍光強度をＭＡＣＳＱｕａｎｔで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１０に示す。図１０において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を示す。陽性対照として、培養細胞を添加せずに抑制活性測定用培地を１００μＬ添加したＴｒｅｓのみを培養したサンプル（図中「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」）と、陰性対照として、ＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞のみを培養するサンプル（図中「Ｎｅｇａｔｉｖｅ」）を作製した。その結果、Ｔｒｅｓのみのサンプル「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」に比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、レスポンダー細胞の細胞増殖倍率が５％以下に抑制されていた。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞を得た。ＣＤ４陰性細胞は３０ＧｙのＸ線を照射後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ 自己血漿、０．２％ ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ ファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（以下、これを抑制活性測定用培地とする）に懸濁した。ＣＤ４陽性細胞を終濃度２μＭのＣＦＳＥ（シグマアルドリッチ社製）を含む抑制活性測定培地で懸濁し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８分間処理し、抑制活性測定用培地で細胞を４回洗浄後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように抑制活性測定用培地に懸濁した。これをレスポンダー細胞とする。Ｘ線照射したＣＤ４陰性細胞とＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞を１対１で混合（以下、Ｔｒｅｓと記載）し、さらに終濃度２００ｎｇ／ｍＬとなるように抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を添加した。この混合細胞液を細胞培養用９８ウェル丸底プレートに１００μＬ添加し、さらに本実施例（２）で得られた培養細胞を抑制活性測定用培地で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した。その後、細胞を回収しレスポンダー細胞のＣＦＳＥの蛍光強度をＭＡＣＳＱｕａｎｔで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１０に示す。図１０において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を示す。陽性対照として、培養細胞を添加せずに抑制活性測定用培地を１００μＬ添加したＴｒｅｓのみを培養したサンプル（図中「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」）と、陰性対照として、ＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞のみを培養するサンプル（図中「Ｎｅｇａｔｉｖｅ」）を作製した。その結果、Ｔｒｅｓのみのサンプル「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」に比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、レスポンダー細胞の細胞増殖倍率が５％以下に抑制されていた。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例４ 培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４．０５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養８日目に細胞を回収し、培養用培地を１ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
実施例１−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４．０５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養８日目に細胞を回収し、培養用培地を１ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図１１に示す。図１１において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図１１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図１２に示す。図１２は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔを用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ベクトンディッキンソン社製）で測定した結果を示す。図１２において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図１２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図１３に示す。図１３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１１の細胞増殖倍率と図１２の陽性率を乗じた値を示す。図１３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率の測定
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の割合を図１４に示す。図１４は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（アールアンドディーシステムズ社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した結果を示す。図１４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図１４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の割合を図１４に示す。図１４は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（アールアンドディーシステムズ社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した結果を示す。図１４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図１４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図１５に示す。図１５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１１の細胞増殖倍率と図１４の陽性率を乗じた値を示す。図１５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（４）ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
実施例３−（３）と同様の操作により、本実施例（２）で得られた細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１６に示す。図１６において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。図１６より、培養細胞を含まないサンプル「Ｔｒｅｓ」と比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、又は「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例３−（３）と同様の操作により、本実施例（２）で得られた細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１６に示す。図１６において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。図１６より、培養細胞を含まないサンプル「Ｔｒｅｓ」と比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、又は「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例５ 培養細胞のＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例２−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣよりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、培養７日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養８日目に細胞を回収し、８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣよりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、培養７日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養８日目に細胞を回収し、８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図１７に示す。図１７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図１７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図１８に示す。図１８は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（アールアンドディーシステムズ社製）、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図１８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図１８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
図１９において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図１９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図２０に示す。図２０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１７の細胞増殖倍率と図１８の陽性率を乗じた値を示す。図２０より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図２１に示す。図２１において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１７の細胞増殖倍率と図１９の陽性率を乗じた値を示す。図２１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ８マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ８陽性細胞とＣＤ８陰性細胞を得た。ＣＤ８陰性細胞、ＣＤ８陽性細胞をそれぞれ実施例３−（３）のＣＤ４陰性細胞、ＣＤ４陽性細胞と同様の操作に供し、ＣＤ８陽性のレスポンダー細胞を含有する混合細胞液を得た。本実施例（２）で得られた培養細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を図２２に示す。図２２において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。その結果、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ８マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ８陽性細胞とＣＤ８陰性細胞を得た。ＣＤ８陰性細胞、ＣＤ８陽性細胞をそれぞれ実施例３−（３）のＣＤ４陰性細胞、ＣＤ４陽性細胞と同様の操作に供し、ＣＤ８陽性のレスポンダー細胞を含有する混合細胞液を得た。本実施例（２）で得られた培養細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を図２２に示す。図２２において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。その結果、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例６ 培養細胞のＴＳＤＲにおけるＤＮＡメチル化度の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、上記の培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７とＣＤ２７陽性細胞率及びＴＳＤＲのＤＮＡメチル化頻度を測定した。
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、上記の培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７とＣＤ２７陽性細胞率及びＴＳＤＲのＤＮＡメチル化頻度を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図２３に示す。図２３において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図２３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図２４に示す。図２４は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２７抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔを用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図２４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図２４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
図２５において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図２５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
図２６において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞の割合を示す。図２６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かＣＤ２７陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図２７に示す。図２７において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２４の陽性率を乗じた値を示す。図２７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図２８に示す。図２８において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２５の陽性率を乗じた値を示す。図２８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＤ２７を発現する培養細胞の絶対数を図２９に示す。図２９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２６の陽性率を乗じた値を示す。図２９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＴＳＤＲのＤＮＡメチル化度の測定
本実施例（２）より得られた細胞と、対照としてＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの抽出を行い、培養細胞１×１０６細胞から５．１−５．６μｇのＤＮＡを得た。次に、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、前記ＤＮＡの２．０−２．２μｇをバイサルファイト処理し、０．５−１．０μｇのバイサルファイト処理後のＤＮＡを得た。次に、前記ＤＮＡの２０ｎｇを使用し、バイサルファイト−ＰＣＲをＴａＫａＲａ ＥｐｉＴａｑ ＨＳ （ｆｏｒ ｂｉｓｕｆｉｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ）（タカラバイオ社製）を用いて行った。プライマーはフォワード側が５’−ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ−３’、リバース側が５’−ＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡ−３’を用いた。ＰＣＲ反応液は、５０μＬ［１０ＸＥｐｉＴａｑ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ） ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ） ６μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５μＬ、ＴａＫａＲａ ＥｐｉＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／ｍＬ） ０．２５μＬ、各プライマー（１０μＭ） 各１μＬ］で、ＰＣＲ反応条件は、（９８℃ １０秒）−（５５℃ ３０秒）−（７２℃ ３０秒）（４０サイクル）、最後に（７２℃ ７分）とし、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応後の反応液より２μＬを用いてアガロース電気泳動を行った結果を図３０に示す。図３０〜３２の各図において、「Ｔｃｏｎｖ」はＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。図３０より、各サンプルのＰＣＲ産物の単一増幅及びサイズ（３３６ｂｐ）を確認した。次に、前記ＰＣＲ産物を２μＬ使用し、Ｔ−ベクター ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて、ＴＡクローニングを行った。その後、上記Ｌｉｇａｔｉｏｎ液を５μＬ使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に４２℃４５秒間反応させ、形質転換を行った。ＳＯＣ培地で３７℃１時間培養後、Ｘ−ｇａｌ（タカラバイオ社製）を塗布したアンピシリン入りＬＢ培地プレートに接種し、３７℃で一晩培養した。その後、白コロニーを各２４クローンピックアップし、ＬＢ培地で３７℃一晩培養後、グリセロールを終濃度１７％になるように添加し、グリセロールストックを作製した。シークエンス反応は、Ｍ１３−４７プライマーを用いプレート単位塩基配列解析（タカラバイオ社）を委託し、塩基配列情報を得た。
本実施例（２）より得られた細胞と、対照としてＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの抽出を行い、培養細胞１×１０６細胞から５．１−５．６μｇのＤＮＡを得た。次に、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、前記ＤＮＡの２．０−２．２μｇをバイサルファイト処理し、０．５−１．０μｇのバイサルファイト処理後のＤＮＡを得た。次に、前記ＤＮＡの２０ｎｇを使用し、バイサルファイト−ＰＣＲをＴａＫａＲａ ＥｐｉＴａｑ ＨＳ （ｆｏｒ ｂｉｓｕｆｉｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ）（タカラバイオ社製）を用いて行った。プライマーはフォワード側が５’−ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ−３’、リバース側が５’−ＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡ−３’を用いた。ＰＣＲ反応液は、５０μＬ［１０ＸＥｐｉＴａｑ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ） ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ） ６μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５μＬ、ＴａＫａＲａ ＥｐｉＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／ｍＬ） ０．２５μＬ、各プライマー（１０μＭ） 各１μＬ］で、ＰＣＲ反応条件は、（９８℃ １０秒）−（５５℃ ３０秒）−（７２℃ ３０秒）（４０サイクル）、最後に（７２℃ ７分）とし、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応後の反応液より２μＬを用いてアガロース電気泳動を行った結果を図３０に示す。図３０〜３２の各図において、「Ｔｃｏｎｖ」はＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。図３０より、各サンプルのＰＣＲ産物の単一増幅及びサイズ（３３６ｂｐ）を確認した。次に、前記ＰＣＲ産物を２μＬ使用し、Ｔ−ベクター ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて、ＴＡクローニングを行った。その後、上記Ｌｉｇａｔｉｏｎ液を５μＬ使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に４２℃４５秒間反応させ、形質転換を行った。ＳＯＣ培地で３７℃１時間培養後、Ｘ−ｇａｌ（タカラバイオ社製）を塗布したアンピシリン入りＬＢ培地プレートに接種し、３７℃で一晩培養した。その後、白コロニーを各２４クローンピックアップし、ＬＢ培地で３７℃一晩培養後、グリセロールを終濃度１７％になるように添加し、グリセロールストックを作製した。シークエンス反応は、Ｍ１３−４７プライマーを用いプレート単位塩基配列解析（タカラバイオ社）を委託し、塩基配列情報を得た。
得られた塩基配列をＱＵＭＡ（理化学研究所）ソフトウェアを用いて解析を行った。除外条件として、バイサルファイト変換効率の下限を９５％、アライメントミスマッチの数の上限を１５として行った。ＴＳＤＲのＤＮＡメチル化の頻度を図３１に示す。図３１において、横軸はＴＳＤＲのＤＮＡメチル化部位を、縦軸はサンプル名を示す。図３１より、通常のＴ細胞を培養した細胞に比べて、制御性Ｔ細胞を分離し培養した細胞ではどのＤＮＡメチル化部位においてもメチル化されている頻度が低かった。
各クローンのＤＮＡメチル化の結果を図３２に示す。図３２において、横軸はＤＮＡのメチル化部位を、縦軸は各クローンを示し、黒丸はその部位が“メチル化”されていることを、白丸はその部位が“脱メチル化”されていることを示す。図３２より、通常のＴ細胞を培養した細胞はほぼすべてのクローンが”メチル化”されていたのに対して、制御性Ｔ細胞を分離し培養した細胞では、ＤＮＡメチル化部位がすべて“脱メチル化”されているクローンが大多数を占めていた。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養して得られた細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養して得られた細胞と同様に安定的にＦｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団であることが明らかとなった。
実施例７ フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体の固相化プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製のために、フィブロネクチンフラグメント（レトロネクチン）を２５μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬ、及び各々に抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬと抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製のために、フィブロネクチンフラグメント（レトロネクチン）を２５μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬ、及び各々に抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬと抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．８５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養するものには、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加した。細胞懸濁液をそれぞれのプレートに、０．１ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．８５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養するものには、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加した。細胞懸濁液をそれぞれのプレートに、０．１ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図３３に示す。図３３において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。また、図３３〜３５の各図において、「ＲＮｈｉＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に２５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｌｏＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｈｉＣＤ３ＣＤ２８」は２５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｌｏＣＤ３ＣＤ２８」は５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した細胞を示す。図３３より、フィブロネクチンフラグメントが低濃度（５μｇ／ｍＬ）で培養した条件は高濃度（２５μｇ／ｍＬ）で培養した条件と同様に、高い細胞増殖倍率を示した。また、抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した条件においても同様に、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図３４に示す。図３４は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図３４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図３４より、いずれの条件で培養した細胞集団においても、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３５に示す。図３５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３３の細胞増殖倍率と図３４の陽性率を乗じた値を示す。図３５より、いずれの条件においても、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例８ 再刺激による制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例６−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例６−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、培養用培地を０．５ｍＬ加え表面未処理２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、培養用培地を０．５ｍＬ加え表面未処理２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図３６に示す。図３６において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図３６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例５−（２）と同様の操作で測定した。その結果を図３７に示す。図３７において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図３７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
図３８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図３８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３９に示す。図３９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３６の細胞増殖倍率と図３７の陽性率を乗じた値を示す。図３９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図４０に示す。図４０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３６の細胞増殖倍率と図３８の陽性率を乗じた値を示す。図４０より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）再刺激培養による制御性Ｔ細胞の培養
本実施例（２）で調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で再刺激培養を開始した。再刺激培養３日目に細胞を回収し、培養液と等量の培養用培地で懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに全量をまき直した。再刺激培養４日目に培養用培地を０．２ｍＬ加え、再刺激培養５日目に培養用培地を０．５ｍＬ加えた。再刺激培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
本実施例（２）で調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で再刺激培養を開始した。再刺激培養３日目に細胞を回収し、培養液と等量の培養用培地で懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに全量をまき直した。再刺激培養４日目に培養用培地を０．２ｍＬ加え、再刺激培養５日目に培養用培地を０．５ｍＬ加えた。再刺激培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
再刺激後の細胞増殖倍率の経時的変化を図４１に示す。図４１において、横軸は再刺激培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図４１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、高い細胞増殖倍率を示した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図４２に示す。図４２において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図４２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図４３に示す。図４３は、培養細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図４３において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図４３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
図４４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図４４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図４５に示す。図４５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４２の細胞増殖倍率と図４３の陽性率を乗じた値を示す。図４５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図４６に示す。図４６において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４２の細胞増殖倍率と図４４の陽性率を乗じた値を示す。図４６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例９ ラパマイシン存在下での制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、それぞれ表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で２．５時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例１−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、それぞれ表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で２．５時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加え、培養５日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養７日目に培地を０．１ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収した。
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加え、培養５日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養７日目に培地を０．１ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収した。
（３）ラパマイシン添加による制御性Ｔ細胞の培養
本実施例（２）に調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、ラパマイシン（シグマアルドリッチ社製）を終濃度２ｎＭとなるようにそれぞれに添加した。なお、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞液について、ＣＤ２８抗体は添加するがラパマイシンは添加しない条件を設定した。本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でラパマイシン添加培養を開始した。ラパマイシン添加培養３日目に、ラパマイシンを添加しない群は、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシンを添加した群は、培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。ラパマイシン添加培養５日目に、ラパマイシンを添加しない群は、培養用培地を０．５ｍＬ加えた。ラパマイシンを添加した群は、細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２ｎＭ ラパマイシンを含む培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシン添加培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
本実施例（２）に調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、ラパマイシン（シグマアルドリッチ社製）を終濃度２ｎＭとなるようにそれぞれに添加した。なお、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞液について、ＣＤ２８抗体は添加するがラパマイシンは添加しない条件を設定した。本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でラパマイシン添加培養を開始した。ラパマイシン添加培養３日目に、ラパマイシンを添加しない群は、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシンを添加した群は、培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。ラパマイシン添加培養５日目に、ラパマイシンを添加しない群は、培養用培地を０．５ｍＬ加えた。ラパマイシンを添加した群は、細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２ｎＭ ラパマイシンを含む培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシン添加培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図４７に示す。図４７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を、矢印はラパマイシンを添加したタイミングを示す。また、図４７〜５１の各図において、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下にフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＣＤ３＋ＣＤ２８＋Ｒａｐａ」は抗ＣＤ２８抗体存在下にラパマイシンを添加し抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８＋Ｒａｐａ」は抗ＣＤ２８抗体存在下にラパマイシンを添加しフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。図４７より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べ高い細胞増殖倍率を示した。また、ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例５−（２）と同様の操作で測定した。その結果を図４８に示す。図４８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図４８より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養し、かつラパマイシンを添加した条件よりＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。また、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養し、かつラパマイシンを添加した条件ではＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合がさらに高かった。この結果は、ラパマイシンを添加せずとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及びレトロネクチンで刺激すると、高純度の制御性Ｔ細胞を得ることができ、この条件にラパマイシンを添加することでさらに高純度の制御性Ｔ細胞が得ることができることを示している。
図４９において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図４９より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ラパマイシンを添加した条件の細胞集団に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図５０に示す。図５０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４７の細胞増殖倍率と図４８の陽性率を乗じた値を示す。図５０より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。ラパマイシンを添加した条件間では、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図５１に示す。図５１において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４７の細胞増殖倍率と図４９の陽性率を乗じた値を示す。図５１より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例１０ ＣＤ３／２８ビーズとの比較
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例６−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例６−(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。固相化プレートで培養する群は、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。一方、増殖刺激ビーズで培養する群は、上記細胞懸濁液に洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（インビトロジェン社製）（以下、ＣＤ３／２８ビーズと記載）を細胞対ＣＤ３／２８ビーズ比が１対４になるように添加し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。また、ＣＤ３／２８ビーズで培養した群はマグネットでＣＤ３／２８ビーズを除き、細胞を回収し、８．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率とＣＤ２７陽性細胞率を測定した。
実施例５−（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。固相化プレートで培養する群は、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。一方、増殖刺激ビーズで培養する群は、上記細胞懸濁液に洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（インビトロジェン社製）（以下、ＣＤ３／２８ビーズと記載）を細胞対ＣＤ３／２８ビーズ比が１対４になるように添加し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。また、ＣＤ３／２８ビーズで培養した群はマグネットでＣＤ３／２８ビーズを除き、細胞を回収し、８．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率とＣＤ２７陽性細胞率を測定した。
細胞増殖倍率の経時的変化を図５２に示す。図５２において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図５２より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりも高い細胞増殖倍率を示した。
Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例６−（２）と同様の操作で測定した。Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図５３に示す。図５３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＦｏｘｐ３の陽性率を乗じた値を示す。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりも、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図５４に示す。図５４において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を乗じた値を示す。図５４より、に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件、及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりもＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
ＣＤ２７を発現する培養細胞の絶対数を図５５に示す。図５５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞の割合を乗じた値を示す。図５５より、に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりもＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数が顕著に増加した。
以上、本発明の方法により、免疫抑制能の強い制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団を効率よく拡大培養できる方法が提供される。
本発明の方法を用いれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を効率よく拡大培養できる。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
SEQ ID NO:1; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:2; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:3; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:4; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:5; TSDR forward primer.
SEQ ID NO:6; TSDR reverse primer.
SEQ ID NO:2; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:3; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:4; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:5; TSDR forward primer.
SEQ ID NO:6; TSDR reverse primer.
Claims (7)
- 下記工程を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法：
（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び
（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程。 - 工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程が、ＣＤ２８リガンドの共存下で培養する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
- ＣＤ２８リガンドが抗ＣＤ２８抗体である請求項２に記載の方法。
- ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団である、請求項１〜３いずれか記載の方法。
- ＣＤ３活性化物質が抗ＣＤ３抗体である請求項１〜４いずれか記載の方法。
- 請求項１〜５いずれか記載の方法により製造された細胞集団。
- 請求項６に記載の細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤。
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