TW202430629A

TW202430629A - 利用慢病毒載體轉染之新穎大規模car-t免疫細胞製造方法

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Publication number: TW202430629A
Application number: TW112138533A
Authority: TW
Inventors: 飛利浦貝多雅; 大衛巴雷特; 維傑戈帕爾雷迪佩達雷迪加里; 納姆拉塔喬達里; 馬修凡佩爾特
Original assignee: 美商凱特製藥公司
Priority date: 2022-10-10
Filing date: 2023-10-06
Publication date: 2024-08-01

Abstract

本發明提供在不到72小時內製造免疫細胞群之新穎性且有效性方法及慢病毒載體，該免疫細胞群經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或編碼增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列；藉由該等方法產生之經工程改造之細胞、包含該等細胞之組合物及使用該等細胞治療疾病或病況之方法。

Description

利用慢病毒載體轉染之新穎大規模CAR-T免疫細胞製造方法

本發明大體上關於製造表現嵌合抗原受體(CAR)及/或經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或編碼增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列之免疫效應細胞的高效方法。

授受性免疫療法係關於將離體產生之自體抗原特異性T細胞轉移回患者中，且已被證明係一種用於治療癌症、感染及自體免疫疾病之有前景的策略。用於授受性免疫療法之T細胞為初代細胞，該等初代細胞經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)或重組T細胞受體(TCR)，且經離體擴增以再導引初代免疫細胞針對病變細胞，諸如癌細胞。CAR係由與單一融合分子中之一或多個信號傳導域相關之靶向部分體組成的合成抗體樣分子，且經設計以將抗原特異性傳遞至T細胞。CAR成功使T細胞經再導引而針對在各種惡性病，包括淋巴瘤及實體腫瘤的腫瘤細胞表面處表現的抗原。

經基因修飾之T細胞的製造當前係一個複雜的過程。需要改良表現CAR或TCR之細胞療法產物之生產、提高產物品質及使CAR T細胞免疫療法之治療功效最大化的方法及製程。本發明提供滿足此等需求之方法及組合物。

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(a)自獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(b)將淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(c)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，步驟1(a)-(c)發生在24小時內。在一些實施例中，在免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群富集之前，藉由血球分離術將血液分離成血漿組分、含單核細胞層、血小板層及紅血球以產生選自以下之血球分離術產物：紅血球分離物、血栓分離物、栓球分離物、白血球分離物、幹細胞、血漿分離物及血小板分離物。在一些實施例中，免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群藉由血球分離術、淘析或梯度離心富集。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(a)自供體白血球分離物富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(b)將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(c)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群，由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，步驟1(a)-(c)發生在24小時內。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含：(a)自個體獲得真核供體細胞群；(b)將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(c)用有效劑量之修飾劑轉染真核供體細胞群，由此產生經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，步驟1(a)-(c)發生在同一天。

在本文所描述之方法之一些實施例中，在轉染步驟(c)之前，用一或多種刺激劑刺激及/或活化免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群。

在本文所描述之方法之一些實施例中，修飾劑係選自由以下組成之群：小分子試劑、生物製劑、治療劑、蛋白質、肽、蛋白質治療劑、肽治療劑、嵌合抗原受體、異源T細胞受體、病毒載體、載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體。

在本文所描述之方法之一些實施例中，修飾劑係：(a)選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體；(b)慢病毒載體；或(c)反轉錄病毒載體。

在本文所描述之方法之一些實施例中，用有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群。

在本文所描述之方法之一些實施例中，慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)之核酸序列及/或編碼增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列，或產生治療蛋白。

在本文所描述之方法之一些實施例中，免疫細胞群或真核供體細胞群係選自由以下組成之群：單核細胞、富淋巴球細胞、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4 ⁺T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。

在本文所描述之方法之一些實施例中，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群之濃度為(a)至少約0.7×10 ⁷、至少約0.8×10 ⁷、至少約0.9×10 ⁷、至少約1×10 ⁷、至少約2×10 ⁷、至少約4×10 ⁷、至少約6×10 ⁷、至少約8×10 ⁷、至少約1×10 ⁸或至少約5×10 ⁸個細胞/毫升；(b)約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約4×10 ⁶個細胞/毫升；(c)約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升；或(d)約4.0×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。

在本文所描述之方法之一些實施例中，轉染係(a)選自由以下組成之群：病毒轉染、轉導；非病毒轉染；及病毒與非病毒轉染之混合；(b)選自由以下組成之群：電穿孔；雷射束；基因注射；聲穿孔(sonoporation)；磁轉染(magentofection)；塗有金屬之奈米粒子；磁性共軛腺相關病毒(magnetic-conjugated adeno-associated virus)；微/奈米粒子介導之轉染；脂質體轉染；基於脂質之轉染；陰離子脂質體；陽離子脂質體介導之轉染；陽離子聚合物；聚合物囊封；肽介導之轉染；磷酸鈣；樹枝狀聚合物；流動轉染(flowfection)；光穿孔(photoporation)；索魯系統穿孔(soluporation)；短暫細胞膜破壞、變形、擠壓、拉伸、夾捏、減弱、伸長、薄化；基因槍粒子遞送系統；及其組合；(c)病毒粒子之電穿孔；(d)電穿孔及病毒轉染(轉導)；(e)病毒轉染及基於脂質之轉染；或(f)病毒轉染及基於脂質體之轉染。

在本文所描述之方法之一些實施例中，(a)在轉染之後或之前，不用一或多種刺激劑活化經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群；及(b)在轉染之後，不離體擴增經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。

在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含用一或多種刺激劑刺激及活化經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，以產生經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核細胞群。

在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含在預定時間內擴增經活化修飾之淋巴球群、經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之單核細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核供體細胞群，以產生經工程改造之淋巴球群、經工程改造之免疫細胞群、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經工程改造之真核供體細胞群。在一些實施例中，擴增步驟在如下條件下進行：(a)在振盪條件或旋轉條件下；(b)在封閉系統中；(c)使用無血清培養基；及/或(d)在一或多種刺激劑存在下。

在一些實施例中，經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核供體細胞群擴增至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍或至少約25倍。

在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含收集經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群用於冷凍保存或投與。在一些實施例中，收集包含選擇及富集該等經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之供體真核細胞。在一些實施例中，收集進一步包含調配經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之供體真核細胞用於冷凍保存或向有需要之個體投與。

在一些實施例中，用於擴增本文所描述之經修飾活化之細胞(淋巴球、免疫細胞、單核細胞、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或真核供體細胞)群的預定時間為：(a)少於約24小時；少於約30小時；少於約48小時；少於約72小時；少於約96小時；或少於約120小時；(b)少於約0.5小時、少於約1小時、少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時或少於約23小時；或(c)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天。

在本文所描述之方法之一些實施例中，自富集及/或獲得淋巴球群、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群至收集經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞的時間為：(a)約72小時或更短；(b)約18小時至約72小時、約18小時至約36小時、約18小時至約24小時、約24小時至約72小時、約24小時至約36小時或約36小時至約72小時；(c)少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時或少於約23小時；(d)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天；或(e)約1天、約3天、約4天、約5天或約6天。

在本文所描述之方法之一些實施例中，電穿孔步驟、活化步驟及/或擴增步驟係在封閉系統、半封閉及/或功能封閉系統中進行。在一些實施例中，封閉系統係選自由以下組成之群：封閉袋系統、自動封閉室樣品處理系統及生物反應器。在一些實施例中，(a)一或多種刺激劑係選自由以下組成之群：促效抗體、細胞介素、重組協同刺激分子、抗CD3抗體或其片段、抗CD28抗體或片段、小藥物抑制劑及/或其組合；(b)一或多種刺激劑為選自由以下組成之群之細胞介素：介白素-2 (IL-2)、介白素-3 (IL-3)、介白素-6 (IL-6)、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-11 (IL-11)、介白素-12 (IL-12)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、介白素-21 (IL-21)；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子；α、β或γ干擾素；紅血球生成素；及其組合。在一些實施例中，一或多種刺激劑與珠粒或奈米結構結合。

在本文所描述之方法之一些實施例中，(a)一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段；(b)一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段及一或多種細胞介素；(c)奈米結構為奈米基質；(d)細胞介素係選自IL-2、IL-7、IL-6、IL-15、IL-15Ra或IL-21；(e)細胞介素係選自IL-15及IL-7；IL-7及IL-21；IL-7及IL-2；IL-15及IL-2；IL-7、IL-15及IL-21；IL-15及IL-15Ra；或IL-7、IL-15及IL-15Ra；及/或(f)一或多種刺激劑為奈米基質及一或多種細胞介素。在一些實施例中，奈米基質(a)包含可移動聚合物鏈之基質，以及抗CD3及抗CD28抗體或其片段；或(c)尺寸為1至500 nm。

在本文所述方法之一些實施例中，反轉錄病毒載體或慢病毒載體之有效劑量包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之感染倍率(MOI)。

在一些實施例中，有效劑量之反轉錄病毒載體或慢病毒載體包含：(a)在約0.08之MOI下約2 μl之慢病毒載體；(b)在約0.2之MOI下約5 μl之慢病毒載體；或(c)在約0.4之MOI下約10 μl之慢病毒載體。

在本文所述方法之一些實施例中，慢病毒載體係基於選自由以下組成之群的病毒：反轉錄病毒、α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、δ反轉錄病毒及ε反轉錄病毒。在一些實施例中，慢病毒載體係基於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、威司奈-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、VISNA病毒及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。

在一些實施例中，慢病毒載體用選自由以下組成之群的病毒之包膜糖蛋白(Env)假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株、科卡爾病毒(Cocal virus)、章地埔拉病毒(Chandipura virus)、皮里病毒(Piry virus)、鯉魚春季病毒血症病毒(SVCV)、σ形病毒、傳染性造血壞死病毒(IHNV)、莫科拉病毒(Mokola virus)、狂犬病病毒CVS病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、阿拉戈斯病毒(Alagoas virus)、卡察基病毒(Calchaqui virus)、朱羅納病毒(Jurona virus)、拉霍亞病毒(La Joya virus)、馬拉巴病毒(Maraba virus)、貓內源性反轉錄病毒(RD114)包膜蛋白、佩里內特病毒(Perinet virus)、於格布達諾病毒(Yug Bugdanovac virus)、原型泡沫病毒(prototypic foamy virus，PFV)及長臂猿白血病病毒(GaLV)。

在一些實施例中，慢病毒載體用選自由印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株及科卡爾病毒組成之群的包膜糖蛋白(Env)假模式化。

在一些實施例中，慢病毒載體包含選自由以下組成之群的異源病毒包膜蛋白(Env)：印第安納VSV-G病毒株、新澤西VSV-G病毒株、科卡爾病毒包膜蛋白、伊斯法罕病毒包膜蛋白、章地埔拉病毒包膜蛋白、皮里病毒包膜蛋白、鼠類白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白、SVCV病毒包膜蛋白及其變異體。在一些實施例中，慢病毒載體包含編碼VSV-G包膜蛋白或VSV G蛋白變異體之核苷酸序列。在本文所描述之方法之一些實施例中，慢病毒載體為慢病毒粒子。

在本文所描述之方法之一些實施例中，CAR包含抗原結合域、跨膜域、協同刺激域及胞內域，且其中抗原結合域係選自由以下組成之群：(a)全長抗體或其抗原結合片段、(b) Fab、(c)單鏈可變片段(scFv)及(d)單域抗體。

在一些實施例中，抗原結合域特異性結合選自由以下組成之群的目標抗原：CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD79b、CD79a、CD33、CD30、CD70、BCMA、GPC2、CD123、CD133、EGFR、EGFRvIII、間皮素、HER2、PSMA、PSCA、FAP、CEA、GD2、IL-13Ra2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)-3、CIAX、LI-CAM、CA 125、CTAG1B、TnMUC1、黏蛋白1及葉酸受體-α (FRa)、GFRα-4、NYESO、WT1、(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、CA-IX、CD3、CD7、CD8、CD38、CD44v6、CD80、CD86、CD117、CD147、CD276、CEA、密連蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EpCAM、EphA2、FAP、葉酸結合蛋白(FBP)、糖脂F77、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2、HLA-A2、ICAMI、IL3Ra、LAGE-I、Lewis Y、LMPI (EBV)、MAGE-Al、MAGE-A3、MAGE-A4、Melan A、MG7 (糖基化CEA)、MMP、MUCI、連結蛋白4/FAP、NKG2D配位體、MIC-A、MIC-B、ULBP I至6、NY-ESO-1、P16、PD-L1、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任何組合。

在一些實施例中，CAR跨膜域係選自由以下組成之群：人工疏水性序列；I型跨膜蛋白、T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40 (CD134)、4-1BB (CD137)、ICOS (CD278)或CD154之跨膜域；及衍生自殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之跨膜域。

在一些實施例中，協同刺激域為選自由以下組成之群的蛋白質之胞內域：TNFR超家族蛋白質、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS (CD278)、NKG2C、B7-H3 (CD276)及殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)。

在一些實施例中，胞內信號傳導域包含選自由以下之細胞質信號傳導域組成之群的胞內域：人類CD3ζ鏈(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受體之胞質尾區、攜有細胞質受體之基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。在本文所描述之方法之一些實施例中，CAR進一步包含鉸鏈區。

本發明之另一態樣提供一種用於將編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體或治療蛋白之核酸遞送至細胞的方法，該方法包含將轉移質體引入細胞中，該轉移質體包含：(a)編碼至少一種藉由本文所描述之方法工程改造的異源病毒包膜蛋白之聚核苷酸序列；(b)編碼至少一種反轉錄病毒rev蛋白質之聚核苷酸序列；(c)編碼至少一種反轉錄病毒gag蛋白質及反轉錄病毒pol蛋白質之聚核苷酸序列；及/或(d)編碼嵌合抗原受體、經工程改造之T細胞受體(TCR)或治療蛋白之聚核苷酸序列。在一些實施例中，反轉錄病毒基因體中複製所必需之一或多個區域的至少一部分發生突變。

本發明之另一態樣提供藉由本文所描述之方法產生的慢病毒載體粒子。

本發明之另一態樣提供一種將修飾引入細胞之方法，該方法包含用有效劑量之本文所描述或藉由本文所描述之方法製成的慢病毒載體粒子對細胞進行電穿孔，由此產生經修飾之細胞。在一些實施例中，使細胞與有效劑量之慢病毒載體在電穿孔之前接觸。在一些實施例中，使細胞與有效劑量之慢病毒載體在電穿孔之後接觸至多約4小時。在一些實施例中，使細胞與有效劑量之慢病毒載體：(a)在電穿孔之後接觸至少約5-30分鐘、至少約25-50分鐘、至少約5-60分鐘、至少約5-12分鐘、至少約60-120分鐘、至少約120-240分鐘；(b)在電穿孔之後接觸至少約1分鐘、至少約2分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約60分鐘、至少約75分鐘、至少約90分鐘、至少約100分鐘、至少約110分鐘、至少約120分鐘、至少約150分鐘、至少約160分鐘、至少約170分鐘、至少約180分鐘、至少約190分鐘、至少約200分鐘、至少約220分鐘或至少約240分鐘。

在一些實施例中，細胞係選自由以下組成之群：免疫細胞、真核供體細胞、單核細胞、富集之淋巴球、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4 ⁺T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、循環腫瘤特異性T細胞、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。

在一些實施例中，細胞為：(a)選自由以下組成之群的淋巴樣細胞：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T淋巴球、調節性T細胞及其任何組合；(b)選自由以下組成之群的骨髓細胞：單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其任何組合；(c)幹細胞、造血幹細胞、造血祖細胞、CD34 ⁺細胞或CD34 ⁺周邊血液幹細胞。

在一些實施例中，有效劑量之慢病毒載體粒子包含約0.5 μl、約1 μl、約1.5 μl、約2 μl、約2.5 μl、約3 μl、約3.5 μl、約4 μl、約5 μl、約6 μl、約7 μl、約8 μl、約9 μl、約10 μl、約15 μl或約20 μl之慢病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體粒子之有效劑量包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之感染倍率(MOI)。

在一些實施例中，有效劑量之慢病毒載體粒子包含：(a)在約0.08之MOI下約2 μl之慢病毒載體粒子；(b)在約0.2之MOI下約5 μl之慢病毒載體粒子；或(c)在約0.4之MOI下約10 μl之慢病毒載體粒子。

本發明之一個態樣提供經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其係藉由本文所描述之方法經工程改造。

本發明之一個態樣提供經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，其係藉由本文所描述之方法經工程改造。

本發明之一個態樣提供包含本文所描述之慢病毒載體的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞。

本發明之一個態樣提供包含本文所描述之慢病毒載體的經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。

在一些實施例中，本文所描述之經工程改造的或藉由本文所描述之方法產生的經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞用於產生所關注蛋白質。在一些實施例中，所關注蛋白質係選自由工業蛋白或治療蛋白組成之群。在一些實施例中，所關注蛋白質係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。

本發明之一個態樣提供一種組合物，其包含：(a)本文所述或藉由本文所描述之方法工程改造的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞；(b)本文所述或藉由本文所描述之方法工程改造的經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群；或(c)本文所描述之慢病毒載體。在一些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。

本發明之一個態樣提供一種治療個體之疾病或病況的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之：(a)本文所述或藉由本文所描述之方法工程改造的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞；(b)本文所述或藉由本文所描述之方法工程改造的經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群；或(c)本文所描述之組合物，由此治療個體之疾病或病況。

在一些實施例中，該疾病或病況係選自由以下組成之群：病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、癌症、惡性病、非癌性病況、自體免疫疾病、纖維化疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、蛋白質缺乏病況及因子VIII缺乏症。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、腎細胞癌、腎臟癌、間皮瘤、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、肺腺癌、膽囊癌、結腸癌、子宮頸鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、肝細胞癌、食道癌、腦癌、黑色素瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、尿道上皮癌、胃癌、血癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)、前驅體B ALL及其任何組合。在一些實施例中，經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞係：(a)對個體而言為自體的；(b)對個體而言為同種異體的；或(c)對個體而言為異種的。在一些實施例中，經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞對個體而言為同種異體的。在一些實施例中，個體為人類。

本發明之一個態樣提供一種產生治療蛋白之方法，該方法包含：(a)使用本文所描述之方法製造包含治療蛋白的經工程改造之免疫細胞群或經工程改造之真核細胞群；(b)收集治療蛋白；及(c)分離及純化治療蛋白。

在一些實施例中，治療蛋白係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。

本發明之一個態樣提供一種套組，其包含：(a)藉由本文所描述之方法工程改造之經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群；或(b)本文所描述之慢病毒載體。

前文概述以及下文圖式描述及實施方式為例示性及解釋性的。其意欲提供本發明之其他細節，但不應被解釋為限制。根據本發明之以下實施方式，其他目的、優勢及新穎特徵對於熟習此項技術者而言將顯而易見。

I. 概述 A. 典型製造製程

用T細胞，特別是用經嵌合抗原受體(CAR)轉導之T細胞的授受性細胞轉移療法已在若干血液癌試驗中展示出前景。儘管有此成功，經基因修飾之T細胞的製造仍係一個複雜、昂貴及漫長的過程。典型CAR T細胞製造製程以自新鮮或冷凍保存之白血球分離樣品富集T細胞開始。富集通常包含使用正向或負向選擇。經富集之T細胞接著使用經抗CD3/抗CD28抗體塗佈之珠粒(例如Dynabeads ^®)、經抗CD3/抗CD28抗體塗佈之聚合物、奈米粒子、奈米膠體及/或選自由刺激以下之試劑組成之群的共活化劑活化：ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、0X40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2或CD226。活化後，T細胞用編碼CAR分子或外源性TCR之核酸分子立即轉染或在活化步驟開始之後至多18小時內轉染。一般而言，T細胞用包含編碼CAR分子或外源性TCR之核酸分子的慢病毒載體轉導。在一些情況下，用活體外轉錄RNA對細胞進行電穿孔。接著將經轉染之細胞活體外培養(亦即擴增) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更多天。在培養已進行預定天數之後，收集細胞。收集細胞包括藉由旋轉或移液或以其他方式攪動以機械方式使經工程改造之細胞(例如T細胞)再懸浮；及用適當緩衝液移除模擬/活化試劑。亦將細胞洗滌以移除不必要的試劑，且在冷凍保存培養基中重新調配或立即投與個體。細胞在需要投與之前冷凍保存。

所揭示之本發明係針對此典型製造製程之重大改良，其中一或多個製造步驟被刪除或縮短。令人驚訝地發現，此縮短的更有效的免疫效應細胞製造製程產生高度合乎需要且有效的組合物。縮短製程依賴於慢病毒轉染而非習知的慢病毒轉導。 B. 改良的使用慢病毒轉染之 1 天製造製程 .

本文提供製造經工程改造以表現CAR或TCR之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)的新穎有效方法、用於使用經工程改造之細胞治療個體之疾病(例如，癌症)的方法及用於本文所描述之方法中的慢病毒載體。在一些實施例中，本文所揭示之製造製程可在少於約24小時(例如，少於約20小時、少於約15小時、少於約10小時、少於約5小時或少於約3小時，或本文所描述之少於約24小時之任何其他時間範圍)內製造經工程改造以表現CAR或TCR之免疫效應細胞。在一些實施例中，本文所揭示之製造製程可在少於約72小時(例如，少於約24小時、少於約30小時、少於約40小時、少於約48小時、少於約60小時或少於約72小時，或本文所描述之少於約24小時之任何其他時間範圍)內製造經工程改造以表現CAR或TCR之免疫效應細胞。

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自供體全血或供體白血球分離物(例如，冷凍或新鮮)富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(3)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，步驟1(a)-(c)發生在約24小時或更短時間內。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含：(1)獲得真核供體細胞群；(2)將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(3)用有效劑量之修飾劑轉染真核供體細胞群，由此產生經修飾之真核供體細胞群。

在一些實施例中，經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群在轉染之後不用一或多種刺激劑活化或擴增。

在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含用一或多種刺激劑刺激及/或活化且擴增經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，以產生經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核細胞群。在一個態樣中，本文所描述之方法進一步包含在轉染步驟之前用一或多種刺激劑刺激及/或活化淋巴球群、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群。

治療本文所描述之疾病或病症的免疫療法(例如授受性細胞轉移療法)方法採用公認且強大的系統(血球分離術及其產物)以提供臨床級CAR或TCR工程改造之細胞之快速、可靠且高效生產，該等經工程改造之細胞可現場即刻投與個體。使用由本文所揭示之方法產生之電轉CAR T細胞的免疫療法可將整個授受性細胞轉移過程減少至約一天(例如約24小時)或約3天或更短時間(例如約72小時或更短時間)。因此，製造時間自約12-15天縮短至約1天、約2天或更短時間或約3天或更短時間。因為產生CAR T細胞需要較少細胞，故本文所揭示之製造製程為高效的。舉例而言，傳統製造製程需要多達約3億個細胞，而本文中所描述之製造製程在約300萬個細胞(細胞數減少100倍)之情況下有效地起作用。此係因為來自本發明方法之細胞極其新鮮且未受損，且因此更強效(例如，較少離體/活體外處理)。

本文所揭示之製造製程改良表現CAR或TCR之細胞療法產物之生產，增強CAR T細胞產物品質，且以以下方式使CAR T細胞產物之治療功效最大化。

首先，相比於典型製造製程(例如，約12天)，本文所揭示之製造製程將轉回製造時間減少至約1天(例如，24小時)或更短(或約2天或更短，或約3天或更短)。此短暫轉回時間允許向患者及時輸注CAR T細胞(例如CD19、間皮素、PSMA、TnMUC、BCMA或GPC2 CAR-T細胞)。此外，製造製程保存推定的幹細胞記憶T (Tstem)細胞，一種與改良之抗腫瘤功效相關的細胞亞群。藉由本文所揭示之製造製程產生之大部分未經刺激之CAR T細胞在與CAR T細胞中小於10%之經刺激之CAR T細胞群相比時保持較低分化表型(例如超過50%之經轉染之CAR T細胞為原生CAR T細胞(CD45RO ^-CCR7 ⁺)。高比例的原生電轉CAR T細胞群係一項合乎需要的改良，因為此等CAR T細胞保留了未活化(亦即較低分化)表型，該未活化表型已知能促進癌症患者之CART細胞持久性及潛能。

在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製造之CART細胞可在極短的離體擴增下，例如少於約1天、少於約12小時、少於約8小時、少於約6小時、少於約4小時、少於約3小時、少於約2小時、少於約1小時，或在不離體擴增的情況下投與個體。在其他態樣中，視需要，製造可少於約5天、少於約4天、少於約3天或少於約2天。因此，本文所描述之方法提供製造改良之用於治療個體之疾病的表現CAR之細胞產物之快速製造製程。 C. 實驗結果之概述

用慢病毒載體轉導免疫細胞之新穎策略使得本文所揭示之縮短的製造製程成為可能，該慢病毒載體包含編碼CAR、TCR及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物之核酸。

首先，在一個實施例中，製造製程依賴於組合生物轉染(基於病毒之轉染或病毒轉導)及物理轉染(電穿孔)的混合轉染方法。特定言之，將慢病毒粒子電穿孔至免疫細胞中。其次，用於轉導細胞之慢病毒載體係非複製勝任型。慢病毒粒子電穿孔至細胞中加速病毒轉染/轉導，之後為標準細胞培養過程或不進行細胞培養之超速過程。將慢病毒載體電穿孔至細胞中亦顯著減少用於使用本文所揭示之方法進行最佳轉染的慢病毒載體之量。

舉例而言，電穿孔製程可包含慢病毒Nucleofection®。使用圖 7及圖 8中所示之慢病毒核轉染工作流程產生超速電轉CAR T細胞。使用此製造製程產生電轉CAR T細胞不需要細胞介素及/或離體培養過程。此外，CAR慢病毒載體之核轉染使得CAR轉殖基因被有效整合至T細胞基因體中。其他分析亦展示，電轉CAR T細胞之每個細胞載體複本數實質上類似於習知CAR T細胞之每個細胞複本數(例如約1至1.5個複本/細胞)。另外，編碼CAR轉殖基因之mRNA (WPRE序列之qRTPCR)在核轉染後約1小時內表現。一般而言，使用本文所揭示之方法電穿孔慢病毒載體顯著增加CAR T細胞製造效率。

再次，本發明首次展示，在與傳統電穿孔方法(例如在電穿孔之前添加表現載體至細胞)相比時，在添加慢病毒病毒載體至細胞之前至多4小時(例如至多2小時)將電施加至細胞使CAR表現增強約10-15%。因此，慢病毒載體用作呈粒子形狀之運載載體；且物理轉染，諸如電穿孔，用於在細胞內部遞送慢病毒粒子。

表 2 及表 3概述對藉由所揭示之方法產生之電轉CD19 CAR T細胞的流動式細胞測量分析的原始資料，且展示慢病毒載體在未經刺激及經刺激之初代人類T細胞中以極低感染倍率(MOI)電穿孔均產生大量CAR-T細胞。在與習知方法相比時，本文所揭示之轉染率極高，該等習知方法使用傳統轉導方法(僅病毒轉導)在T細胞中引起約1%至約3% CAR表現。

圖 11展示經刺激或未經刺激的慢病毒載體轉染之CD19 CAR T細胞(CART19細胞)有效殺死目標細胞。此外，與慢病毒轉導相比，在相同時段內慢病毒載體Nucleofection®使CAR ⁺T細胞(例如，CD19 CAR T細胞)之百分比增加至少10倍(39.8% CAR ⁺T細胞相對於3.5% CAR ⁺T細胞)。

由於藉由本文所揭示之方法產生的電轉CAR T細胞與習知CAR T細胞不同，至少因為電轉CAR T細胞不離體活化，而習知CART細胞在7-12天製程中產生。另外，在與經例如CD3/CD28 Dynabeads ^®刺激之電轉CAR T細胞相比時，大部分未經刺激之電轉CART細胞(超過50%)維持未活化或較低分化表型( 表 4及表 5)。因為較低分化表型增強癌症患者之CART細胞的持久性及潛能，所以高百分比之較低分化CAR T細胞(例如，原生T細胞群)高度合乎需要且得到出人意料的改良。此外，在共培養之後48小時內，電轉CAR T細胞被證明在殺死CD19 ⁺Nalm6細胞上與習知CAR T細胞一樣有效( 表 6)。在效應細胞:目標細胞比低至0.62:1或更低之情況下，電轉CAR T細胞可有效殺死目標細胞。

本文所描述之新穎製造方法提供迄今為止出於若干種原因已知之最高效CAR T細胞免疫療法。若需要擴增(例如，培養)，則電轉CAR T細胞製造製程將整個CAR T製造製程減少至一天或至多3天。因此，電轉CAR T細胞製造時間自12-15天縮短至約1天或至多3天。另外，需要較少細胞。舉例而言，傳統製造製程需要多達約3億個細胞，而本文所揭示之製造製程在約300萬個細胞之情況下有效地起作用，此係因為細胞一般極其新鮮。

最後，製造製程具成本效益，此係因為一批細胞使用習知方法每批可花費100萬美元，其足以治療約8名患者。然而，本文所揭示之方法將產生足以輸注約20名患者之CAR T細胞批料。因此，本文所揭示之方法在相同成本下使治療患者之數目增加一倍或兩倍且顯著減少每名患者之CAR T細胞成本。

因此，本文所描述之製造製程提供有效的用於立即投與的臨床級CAR或TCR工程改造之細胞在約1天或更短時間(或在其他態樣中，約3天或更短時間，或本文所描述之其他時段)內之生產，其為對此項技術中已知之製造製程的改良。 II. 生產經修飾之 T 細胞的方法

本發明提供工程改造修飾之細胞(例如免疫效應細胞、電轉CAR T細胞)的快速且高效的製造製程，該等細胞包含CAR、外源性TCR及/或改善經工程改造之免疫細胞之適應性的免疫增強因子；包含工程改造修飾之細胞的組合物；及使用工程改造修飾之細胞治療個體之疾病(諸如癌症)的方法。本文所揭示之工程改造之免疫細胞之快速且高效的製造方法在轉染之後不到24小時內提供經工程改造之CAR T細胞(亦即，電轉)。藉由至少三個因素之組合使得快速轉回成為可能：(1)使用新鮮血球分離術產物；(2)將慢病毒載體以極低MOI電穿孔至經純化之血球分離術產物(例如經純化之T細胞或經純化之免疫細胞)中；及/或(3)新經工程改造之慢病毒載體。藉由本文所揭示之方法工程改造之CAR T細胞稱為電轉CAR T細胞。藉由本文揭示之方法工程改造之CAR稱為電轉CAR，因為使用電(例如電穿孔)驅動CAR編碼載體(例如包含編碼CAR之核酸序列的慢病毒粒子)進入細胞中。具體言之，不是被動地用慢病毒載體轉導細胞，而是藉由電穿孔主動地將慢病毒載體引入細胞中。 A. 新穎電轉 CAR 製造平台

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(3)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。

在一些實施例中，在富集步驟(例如針對淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群富集或選擇)之前，藉由血球分離術將血液分離成血漿組分、含單核細胞層、血小板層及紅血球以產生選自以下之血球分離術產物：紅血球分離物、血栓分離物、栓球分離物、白血球分離物、幹細胞、血漿分離物及血小板分離物。在一些實施例中，血球分離術產物(例如淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群)藉由血球分離術、淘析或梯度離心來富集。

在一些實施例中，在本文所揭示之產生CAR T細胞(亦即，電轉CAR)之方法中，血球分離術樣品用在定點照護檢驗點。對於使用本文所揭示之方法進行最佳轉染，新鮮血球分離術樣品為較佳的，此係因為其需要/需較少免疫細胞。舉例而言，傳統製造製程需要多達約3億個細胞，而本文所揭示之製造製程用約300萬個細胞即有效地起作用。此差異可歸因於血球分離術產物之新鮮度。

在一些實施例中，自個體收集血球分離術樣品(例如白血球分離術樣品)且作為新鮮產物(例如未經冷凍之產物)運送至細胞製造設施。所需細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)係選自血球分離術樣品，例如使用細胞分選機器，諸如CliniMACS Prodigy ^®裝置。接著使用本文所描述之方法將經富集之細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)接種以用於CART製造。

在一些實施例中，血球分離術樣品(例如白血球分離術樣品)自個體收集且作為冷凍樣品(例如冷凍保存樣品)運送至細胞製造設施。隨後將冷凍血球分離術樣品解凍，且例如使用細胞分選機器，諸如CliniMACSProdigy ^®裝置，自血球分離術樣品選擇所需細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)。接著使用本文所描述之方法將經富集之細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)接種以用於CART製造。在一些實施例中，在製造製程結束時，收集CAR T細胞且冷凍保存，且隨後解凍，且投與個體。在一些實施例中，經富集之細胞(例如CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)在被接種用於製造CAR T之前經歷一或多輪解凍。

在一些實施例中，自個體收集血球分離術樣品(例如白血球分離術樣品)。所需細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)係選自血球分離術樣品，例如使用細胞分選機器，諸如CliniMACS Prodigy ^®裝置。接著將經富集之細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)作為冷凍樣品(例如冷凍保存樣品)運送至細胞製造設施。接著將經富集之細胞(例如免疫細胞、CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)解凍且使用本文所描述之方法接種以用於CART製造。

在一些實施例中，在細胞(例如T細胞)被接種之後，將一或多種細胞介素以及一或多種修飾劑(例如編碼CAR之載體)添加至細胞中。在該實施例中，一或多種細胞介素可選自由以下組成之群：IL-2、IL-7、IL-15、hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra))、IL-21或IL-6 (例如，IL-6/sIL-6R))，在培育至少約5-72小時之後，收集細胞，洗滌且調配用於儲存(例如冷凍保存)或投與。

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：自獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；培養及擴增經轉染之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；及收集經工程改造之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞；由此產生經修飾之淋巴球群體、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，在轉染之前不刺激及/或活化免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種本文所描述之刺激劑存在下培養及擴增。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自供體白血球分離術富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(3)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自供體白血球分離術富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；(3)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(4)培養及擴增經轉染之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；及(5)收集經工程改造之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種本文所描述之刺激劑存在下培養及擴增。在一些實施例中，在轉染之前不刺激及/或活化淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。

在一些實施例中，血球分離術產物(例如，淋巴球群體、免疫細胞群或真核供體細胞群)係選自由以下組成之群：單核細胞、富淋巴球細胞、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4 ⁺T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含：(1)獲得真核供體細胞群(例如，來自個體或細胞株)；(2)將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及(3)用有效劑量之修飾劑轉染真核供體細胞群，由此產生經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種刺激劑存在下培養及擴增。

本發明之另一態樣提供一種製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含：(1)自個體獲得真核供體細胞群；(2)將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；(3)用有效劑量之修飾劑轉染真核供體細胞群；(4)培養及擴增經轉染之真核供體細胞群；及(5)收集經工程改造之真核細胞，由此產生經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種刺激劑存在下培養及擴增。在一些實施例中，在轉染之前不活化及/或刺激真核供體細胞群。

在一些實施例中，本文所揭示之方法可在約不到24小時內、在約24小時中或在約24小時內製造表現修飾劑(諸如CAR)的經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，本文所揭示之方法可在約24小時內製造表現修飾劑(諸如CAR)的經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，本文所揭示之方法可在約48小時或更短時間內製造表現修飾劑(諸如CAR)的經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，本文所揭示之方法可在約72小時或更短時間內製造表現修飾劑(諸如CAR)的經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。 B. 免疫細胞源

本文所揭示之用於製造經工程改造之免疫細胞群的方法包含自個體獲得免疫細胞以用於離體操作。用於離體操作之目標細胞源亦可包括例如自體或異源供體血液、臍帶血或骨髓。舉例而言，免疫細胞源可來自待用本發明之經修飾之免疫細胞治療之個體，例如個體之血液、個體之臍帶血或個體之骨髓。個體之非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。個體較佳為人類。

目標細胞可獲自多種來源，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾臟組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞為免疫系統之細胞，諸如先天性或適應性免疫細胞(骨髓或淋巴樣細胞，包括淋巴球，通常為T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，細胞為人類細胞。提及所治療之個體時，細胞可為同種異體細胞及/或自體細胞。細胞通常為初代細胞，諸如直接自個體分離及/或自個體分離且冷凍之細胞。 1. 免疫細胞

在某些實施例中，目標細胞為免疫細胞、T細胞(例如CD8 ⁺T細胞、CD8 ⁺原生T細胞、中樞記憶T細胞或效應記憶T細胞、CD4 ⁺T細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞(NK細胞)或樹突狀細胞。在一些實施例中，細胞為單核球或顆粒球(例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性球及/或嗜鹼性球)。

在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞群，諸如全部T細胞群、CD4 ⁺細胞、CD8 ⁺細胞及其亞群，諸如根據以下定義之細胞：功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、位置及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或區室中之存在、標記或細胞介素分泌概況及/或分化程度。T細胞及/或CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞的亞型及亞群為原生T (TN)細胞、效應T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，諸如幹細胞記憶T (TSCM)、中樞記憶T (TCM)、效應記憶T (TEM)或末期分化效應記憶T細胞；腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T (MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T (Treg)細胞、輔助T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡性輔助T細胞；α/β T細胞及δ/γ T細胞。在某些實施例中，可使用此項技術中可獲得之任何數目之T細胞株。 2. 幹細胞

可使用本發明之製造製程工程改造之其他例示性細胞包括幹細胞，諸如多潛能及多能幹細胞，包括經誘導之多能幹細胞(iPSC)。在一實施例中，目標細胞係誘導多能幹細胞(iPS)或衍生自iPS細胞(例如，自個體產生之iPS細胞)的細胞。在一些實施例中，iPS細胞經操作以改變(例如誘導其中之突變)或誘導一或多個目標基因之表現。在一些實施例中，iPS細胞分化成T細胞、CD8 ⁺T細胞(例如CD8 ⁺原生T細胞、中樞記憶T細胞或效應記憶T細胞)、CD4 ⁺T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞或造血幹細胞。 3. 細胞分離

在一些實施例中，本發明之製造製程包括自個體分離目標細胞(例如免疫細胞；經富集之血球分離術產物)、製備、處理、視情況培養及/或轉染該等細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞的製備包括一或多個培養及/或製備步驟。所描述之用於工程改造之細胞可自樣品分離，諸如生物樣品，例如獲自或源自個體之樣品。在一些實施例中，經分離之細胞所來自的個體為患有疾病或病況、需要細胞療法、或細胞療法將投與之個體。在一些實施例中，個體為需要特定治療干預(諸如對細胞進行分離、處理及/或工程改造的授受性細胞療法)的人類。因此，在一些實施例中，細胞為初代細胞(例如初代人類細胞)。樣品包括組織、流體及直接獲自個體的其他樣品，以及經由一或多個處理步驟(諸如分離、離心、基因工程改造(例如經病毒載體轉導)、洗滌及/或培育)產生的樣品。生物樣品可為直接獲自生物源之樣品或經處理之樣品。生物樣品包括但不限於體液(例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液及汗液)、組織與器官樣品及來源於其之經處理樣品。

在某些態樣中，所得或經分離之免疫細胞所來自的樣品為血液、血源性樣品或血球分離術或白血球分離術產物。例示性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織活檢體、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰臟、乳房、骨骼、前列腺、子宮頸、睪丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或來源於其之細胞。在細胞療法(例如授受性細胞療法)之情形下，樣品可來自自體及同種異體來源。

在一些實施例中，細胞之分離包括一或多個製備步驟及/或基於非親和力之細胞分離步驟。在一些實施例中，對細胞進行洗滌、離心及/或在一或多種試劑存在下培育(例如以移除不需要的組分)、富集所需組分、溶解或移除對特定試劑敏感之細胞。在一些實施例中，基於一或多種特性(諸如密度、黏附特性、尺寸、敏感性及/或對特定組分之耐受性)分離細胞。

在一些實施例中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。在某些態樣中，樣品含有淋巴球，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及/或血小板，且在某些態樣中含有除紅血球及血小板之外的細胞。在一些實施例中，洗滌自個體收集之血球以移除血漿部分及/或將細胞置放於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施例中，洗滌步驟根據製造商說明書藉由切向流過濾(TFF)實現。在一些實施例中，在洗滌之後使細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中。在一些實施例中，移除血球樣品之組分，且使細胞直接再懸浮於培養基中。在一些實施例中，該等方法包括基於密度之細胞分離方法，諸如藉由使紅血球溶解而自周邊血液製備白血球及經由Percoll或Ficoll梯度離心。

在一個實施例中，免疫細胞獲自個體之循環血液，藉由血球分離術或白血球分離術來獲得。血球分離術產物通常含有淋巴球，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置放於適當緩衝液或培養基中，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子用於後續處理步驟。一般熟習此項技術者將容易瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知的方法實現，諸如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細胞保存器5)。洗滌後，可使細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中，諸如不含Ca ²⁺、不含Mg ²⁺之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有鹽水溶液之緩衝液。在一些實施例中，可移除血球分離術樣品之非所要組分且使細胞直接再懸浮於培養基中。

在本文所描述之製造製程之一些實施例中，藉由血球分離術或白血球分離術使用體外血球分離術系統自個體之循環血液獲得細胞。在一些實施例中，同一天進行細胞分離及轉染。 4. 體外血球分離術

在本文所描述之製造製程之一些實施例中，使用標準血球分離術設備，諸如Cobe® Spectra、Spectra Optia®、Fenwal™ Amicus®或等效設備收集細胞。在一些實施例中，來自個體之循環血液之細胞藉由紅血球分離術、血栓分離術、栓球分離術、白血球分離術、幹細胞收集、血漿分離術或血小板分離術獲得。白血球分離術製程通常自患者(亦即個體)中得到大致200-400 mL血球分離術產物。血球分離術產物經歷現場製造製程(例如定點照護檢驗)。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物為「白血球分離術」產物。依本文所用，術語「白血球分離術」係指血液中存在之大量單核細胞，亦即自血漿及紅血球分離及收集白細胞(WBC)。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物包含約5%至約25%之總周邊血液單核細胞組分。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物為淋巴樣細胞群或淋巴樣細胞。在此實施例中，淋巴樣細胞係選自由以下組成之群：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T淋巴球、調節性T細胞及其任何組合。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物為骨髓細胞群或骨髓細胞。在此實施例中，骨髓細胞可選自單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其任何組合。

在一些實施例中，不管藉由血球分離術系統執行之單核細胞收集循環次數及/或用於產生經富集之血球分離術產物的預產物數量如何，經富集之血球分離術產物具有預定體積及/或預定血容比。

在一些實施例中，預定體積為約120 ml至約400 mL。在一些實施例中，預定體積為約120ml、約150 ml、約175 ml、約180 ml、約200 ml、約225 ml、約250 ml、約275 ml、約300 ml、約325 ml、約350 ml、約375 ml或約400 ml或更小。在一些實施例中，血球分離術經組態以具有特定目標產量之待收集及處理之單核細胞。可藉由血球分離術系統及/或藉由輸入個體之單核細胞預計數來評估待收集及處理之單核細胞之特定目標產量。基於目標單核細胞產量及在各單核細胞收集循環期間收集之單核細胞數，血球分離術系統之控制器可確定要執行單核細胞收集循環之次數。舉例而言，在一些實施例中，若目標單核細胞產量為約5×10 ⁹個單核細胞，則血球分離術系統將每次單核細胞收集循環收集約1×10 ⁹個單核細胞，隨後控制器將確定其適於執行五次單核收集循環。

在一些實施例中，目標單核細胞產量為至少約0.7×10 ⁷、至少約0.8×10 ⁷、至少約0.9×10 ⁷、至少約1×10 ⁷、至少約2×10 ⁷、至少約4×10 ⁷、至少約6×10 ⁷、至少約8×10 ⁷、至少約1×10 ⁸或至少約5×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，目標單核細胞產量為約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約4×10 ⁶個細胞/毫升。在一些實施例中，目標單核細胞產量為約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，目標單核細胞產量為約4.0×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。

在一些實施例中，該預定血容比為約0%至約10%。在另一實施例中，預定血容比為約2%。在一些實施例中，預定體積為大致200 mL，且預定血容比為大致2%。預定體積及/或預定血容比可在不脫離本發明之範疇的情況下變化。 5. 細胞富集

在一些實施例中，本文所揭示之製造製程包含選擇特定細胞以改良適合於CAR表現之所需免疫效應細胞的富集。出於細胞富集及純化目的使用的系統或裝置包括例如BAXTER ISOLEX 300I™及Miltenyi CLINIMACS™，其基於周邊血液祖細胞(PBPC)表面上之特異性配位體(例如CD34或CD133)富集該等細胞。

在一些實施例中，選擇包含正向選擇，例如選擇所需免疫效應細胞。在一些實施例中，選擇包含負向選擇，例如選擇不需要的細胞，例如移除不需要的細胞。在一些實施例中，本文所描述之正向或負向選擇方法在流動條件下藉由使用流通裝置或細胞處理系統進行，以進一步針對所需免疫效應細胞富集細胞製備物。利用CD19、CD14及CD26 Miltenyi珠粒與管柱技術(CliniMACS ^®System、CliniMACS ^®Plus或CliniMACS Prodigy ^®)之組合，經由移除不需要的細胞進行負向T細胞選擇。可利用CD4及CD8 Miltenyi珠粒與管柱技術(CliniMACS ^®System、CliniMACS ^®Plus或CliniMACSProdigy ^®)之組合使用正向T細胞選擇。替代地，可使用具有可釋放之CD3珠粒(GE Healthcare)的無管柱技術。另外，亦可利用諸如ThermoGenesis X系列裝置之無珠粒技術。額外例示性細胞分離及去珠粒(debeading)方法為熟習此項技術者已知的，例如WO 2017/117112中所示。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物富集有選自由以下組成之群的一或多種目標細胞類型：B淋巴球、T淋巴球、CD4及CD8 T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、NKT細胞、調節性T細胞、CD4 T輔助細胞、CD8細胞毒性T淋巴球(CTL)、NKT細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、間質幹細胞、肥大細胞、此類細胞之亞群及其組合。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物富集有一或多種目標淋巴球或骨髓細胞群。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物富集有選自由以下組成之群的淋巴樣細胞：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T淋巴球、調節性T細胞及其任何組合。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物富集有選自以下之骨髓細胞：單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其任何組合。

在一些實施例中，一或多種標記、一或多種「細胞表面決定子」或「細胞表面標記」用於富集目標細胞群。在一些實施例中，一或多個標記或細胞表面決定子係選自：針對B細胞之CD19及/或CD20；針對T細胞之CD3、CD56 ^-、CD4及/或CD8；針對活化及/或調節性T細胞之CD25及/或CD69；針對樹突狀細胞之CD1c、CD83、CD141、CD209、MHC II及/或CD11c；針對NK細胞之CD3-、CD16及/或CD56；針對造血幹細胞或祖細胞之CD34、CD90及/或CD135；針對巨噬細胞之CD11b、CD68、CD163及/或CD33；針對單核球之CD14、CD16及/或CD64；針對嗜中性球之CD15、CD16及/或CD49d ^-；針對嗜鹼性球之2D7抗原、CD117-、CD123、CD203c及/或FcεRIa；或針對嗜酸性球之CD11b、CD193、EMR1及/或Siglec-8。

經富集之血球分離術產物之富集技術為熟習此項技術者所知，且包括但不限於磁分離、過濾、免疫親和分離、重力分離、密度梯度分離、淘析及其任何組合。細胞分離模組可採用此項技術中已知之任一此等或其他方法用於進一步富集及/或獲得患者之有核血球的目標群體。舉例而言，在細胞分離之後，可使用與一或多種選擇性或親和性試劑(諸如附接至可降解漂浮珠粒或磁珠或微泡之抗體)結合來富集特定目標細胞類型或類別。

在一些實施例中，使用塗佈有針對一或多種特異性細胞表面抗原之抗體的磁珠自經富集之血球分離術產物富集目標細胞群。此使得表現目標抗原的細胞附接至磁珠。當暴露於強磁場時，附接至珠粒之細胞(表現細胞表面標記)停留在管柱或樣品管上，而其他細胞(不表現細胞表面標記)流動通過或保持在懸浮液中。就特定細胞表面標記而言，使用此方法可正向或負向選擇細胞，或使用正向選擇及負向選擇之組合。在一些實施例中，細胞在轉染期間仍與微珠粒結合抗體連接。在一些實施例中，細胞在轉染之前與微珠粒結合抗體分開。

在一些實施例中，使用此項技術中已知之一或多種方法，包括但不限於抗原捕捉富集目標細胞。在一些實施例中，抗原捕捉係選自由以下組成之群：過濾器、珠粒、磁珠、螢光活化細胞分選、微流控、固體載體親和力、聲學、生物冷光、抗體標記及酶受質。在一些實施例中，使用選自由鐵磁性及密度修改粒子組成之群的適合固體載體富集目標細胞。在一些實施例中，固體載體包含親和力分子，諸如結合給定細胞表面標記之抗體域，可自例如Miltenyi Biotec及Dynal獲得。可用於釋放所捕捉的細胞之方法包括與過量配位體競爭、酶消化、改變pH、改變離子強度、移除磁場及/或物理攪拌。

在一些實施例中，分離方法包括基於一或多種特異性分子(諸如表面標記、表面蛋白質、胞內標記或核酸)在細胞中之表現或存在來分離不同細胞類型。在一些實施例中，可使用用於基於此類標記分離之任何已知方法。在一些實施例中，分離為基於親和力或免疫親和力之分離。舉例而言，分離可包括基於細胞之一或多種標記之表現或表現量分離細胞及細胞群。細胞表面標記通常與特異性結合於標記之抗體或結合搭配物一起培育。此培育步驟之後為洗滌步驟及自未結合抗體或結合搭配物之細胞純化已結合抗體或結合搭配物之細胞。此類純化步驟可基於正向選擇，其中保留已結合試劑之細胞供進一步使用；及/或負向選擇，其中保留尚未結合於抗體或結合搭配物之細胞。在一些實例中，兩個部分均保留以供進一步使用。

在一些實施例中，負向選擇可特別適用於無法獲得特異性鑑別雜族群中之細胞類型的抗體，使得分離最佳基於細胞所表現的標記而非所需群體來進行的情況。分離無需使特定細胞群或表現特定標記之細胞100%富集或移除。舉例而言，特定類型之細胞(例如表現標記之細胞)之正向選擇或富集可增加此類細胞之數目或百分比，但無需使得不表現標記之細胞完全不存在。同樣，特定類型之細胞(例如表現標記之細胞)的負向選擇、移除或耗乏可減少此類細胞之數目或百分比，但無需使得所有此類細胞完全移除。在某些例示性實施例中，可進行多輪分離步驟，其中對來自一個步驟的經正向或負向選擇之部分進行另一分離步驟，諸如後續正向或負向選擇。在某些例示性實施例中，單個分離步驟可耗乏同時表現多種標記之細胞，諸如藉由使細胞與各自對負向選擇所靶向之標記具特異性的複數種抗體或結合搭配物一起培育。同樣，多種細胞類型可藉由使細胞與各種細胞類型上所表現之複數種抗體或結合搭配物一起培育而同時進行正向選擇。

藉由負向選擇富集T細胞群可使用針對負向選擇細胞獨特之表面標記的抗體組合來實現。一種例示性方法為經由負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術進行的細胞分選及/或選擇，其使用導引至存在於經負向選擇之細胞上之細胞表面標記的單株抗體混合物。舉例而言，為了藉由負向選擇富集CD4 ⁺細胞，單株抗體混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。

為藉由正向選擇或負向選擇分離所需細胞群，細胞濃度及表面(例如粒子，諸如珠粒)可變化。在某些實施例中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起的體積(亦即增加細胞濃度)以確保細胞與珠粒最大程度接觸。舉例而言，在一個實施例中，使用20億個細胞/毫升之濃度。在一個實施例中，使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一實施例中，使用大於約1億個細胞/毫升。在另一實施例中，使用約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500或約5000萬個細胞/毫升之細胞濃度。在另一實施例中，使用約7500、約8000、約8500、約9000、約9500萬或約1億個細胞/毫升之細胞濃度。在其他實施例中，可使用約1.25或約1.50億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可引起細胞產量、細胞活化及細胞擴增增加。

在一些實施例中，使用細胞分選機器，諸如CliniMACS Prodigy ^®富集不同細胞類型。舉例而言，可使用細胞分選機器，諸如CliniMACS Prodigy ^®裝置自血球分離術產物中選擇T細胞(例如CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)。隨後洗滌且轉染所選擇T細胞(例如CD4 ⁺T細胞及/或CD8 ⁺T細胞)以製造本文所描述之經工程改造之T細胞。

在一些實施例中，一或多個T細胞群對於以下細胞富集或耗乏：對於一或多種特定標記，諸如表面標記呈陽性(標記 ⁺)或表現高水準(標記 ^高)的細胞，或對於一或多種標記呈陰性(標記 ^-)或表現相對較低水準(標記 ^低)的細胞。舉例而言，在某些態樣中，藉由正向或負向選擇技術分離特定T細胞亞群，諸如對一或多種表面標記呈陽性或表現高水準的細胞(例如CD28 ⁺、CD62L ⁺、CCR7 ⁺、CD27 ⁺、CD127 ⁺、CD4 ⁺、CD8 ⁺、CD45RA ⁺及/或CD45RO ⁺T細胞)。在一些情況下，此類標記為在T細胞(諸如非記憶細胞)之某些群體上不存在或以相對較低程度表現但在T細胞(諸如記憶細胞)之某些其他群體上存在或以相對較高程度表現之彼等物。在一個實施例中，細胞(諸如CD8 ⁺細胞或T細胞，例如CD3 ⁺細胞)對於CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L為陽性或表現高表面水準的細胞富集(亦即，針對其陽性地選擇)及/或缺少(例如，針對其陰性地選擇)對於CD45RA為陽性或表現高表面水準的細胞。在一些實施例中，細胞對於陽性或表現高表面水準的CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra (CD127)的細胞富集或耗乏。在本文所揭示之方法之一些實施例中，血球分離術產物之富集步驟包含CD25 ⁺細胞耗乏。在本文所揭示之方法之一些實施例中，血球分離術產物之富集步驟不包含CD25 ⁺細胞耗乏。參見例如WO 2016/109410。CD25 ⁺耗乏可增強慢病毒轉導效率，其可最終改善CAR T療法之治療效果。然而，此步驟對於製造本文所描述之電轉CAR T細胞可能並不重要。

在某些例示性實施例中，CD8 ⁺T細胞對於對CD45RO呈陽性(或對CD45RA呈陰性)且對CD62L呈陽性的細胞富集。舉例而言，可使用CD3/CD28結合之磁珠(例如Dynabeads ^®M-450 CD3/CD28 T細胞擴增器)對CD3 ⁺、CD28 ⁺T細胞進行正向選擇。

在一些實施例中，T細胞藉由負向選擇在非T細胞，諸如B細胞、單核球或其他白血球上表現之標記，諸如CD14而與周邊血液單核細胞(PBMC)樣品分離。在某些態樣中，使用CD4 ⁺或CD8 ⁺選擇步驟分離CD4 ⁺輔助細胞及CD8 ⁺細胞毒性T細胞。此類CD4 ⁺及CD8 ⁺群體可藉由對一或多種原生、記憶及/或效應T細胞亞群上表現或在相對較高程度上表現的標記進行正向或負向選擇而進一步分選成亞群。在一些實施例中，CD8 ⁺細胞藉由諸如基於與各別亞群相關之表面抗原的正向或負向選擇而進一步富集或耗乏原生、中樞記憶、效應記憶及/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，進行中樞記憶T (TCM)細胞之富集以增加功效，以便改善投藥後之長期存活、擴增及/或移植，在某些態樣中，其在此類亞群中尤其穩健。

在一些實施例中，將TCM富集之CD8 ⁺T細胞與CD4 ⁺T細胞組合可進一步增強功效。在一些實施例中，記憶T細胞存在於CD8 ⁺周邊血液淋巴球之CD62L ⁺及CD62L ^-亞群中。PBMC可諸如使用抗CD8及抗CD62L抗體富集或耗乏CD62L-CD8 ⁺及/或CD62L ⁺CD8 ⁺部分。在一些實施例中，CD4 ⁺T細胞群及/或CD8 ⁺T群體富集中樞記憶(TCM)細胞。在一些實施例中，中樞記憶T (TCM)細胞之富集係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD8及/或CD127之陽性或高表面表現。在一些實施例中，富集可基於對表現或高度表現CD45RA及/或顆粒酶B之細胞的負向選擇。在一些實施例中，藉由耗乏表現CD4、CD14、CD45RA之細胞及正向選擇或富集表現CD62L之細胞來分離TCM細胞富集之CD8 ⁺群體。在一些實施例中，以基於CD4表現選擇之陰性細胞部分為起始物質進行中樞記憶T (TCM)細胞之富集，其進行基於CD14及CD45RA之表現的負向選擇及基於CD62L的正向選擇。此類選擇在某些態樣中同時進行且在其他態樣中按任一次序依序進行。在一些實施例中，用於製備CD8 ⁺細胞群或亞群之基於CD4表現之相同選擇步驟亦用於產生CD4 ⁺細胞群或亞群，使得基於CD4分離之陽性及陰性部分均在該等方法之後續步驟中保留且用於該等後續步驟中，視情況在一或多個其他正向或負向選擇步驟之後。

藉由鑑別具有細胞表面抗原的細胞群將CD4 ⁺T輔助細胞分選為原生、中樞記憶及效應細胞。CD4 ⁺淋巴球可藉由標準方法獲得。在一些實施例中，原生CD4 ⁺T淋巴球係CD45RO ^-、CD45RA ⁺、CD62L ⁺、CD4 ⁺T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4 ⁺細胞為CD62L ⁺及CD45RO ⁺。在一些實施例中，效應CD4 ⁺細胞為CD62L-及CD45RO。在一個實例中，為了藉由負向選擇富集CD4 ⁺細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CDS之抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物結合於固體載體或基質，諸如磁珠或順磁珠粒，以便分離用於正向及/或負向選擇之細胞。

在一些實施例中，在基因工程改造之前或與基因工程改造結合培育及/或培養細胞。培育(incubation)步驟可包括培養、培育(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，在刺激條件或刺激劑存在下培育組合物或細胞。此類條件包括經設計以誘導群體中之細胞增殖、擴增、活化及/或存活、模擬抗原暴露及/或激活細胞用於基因工程改造(諸如用於引入重組抗原受體)的條件。該等條件可包括以下中之一或多者：特定培養基；溫度；氧含量；二氧化碳含量；時間；試劑，例如養分、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，諸如細胞介素、趨化介素、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組可溶受體及任何其他經設計以活化細胞之試劑。在一些實施例中，刺激條件或刺激劑包括一或多種試劑。配位體可能能夠活化TCR複合物之胞內信號傳導域。在一些實施例中，試劑開啟或起始T細胞中之TCR/CD3細胞內信號傳導級聯。此類試劑可包括抗體，諸如對TCR組分具有特異性之抗體(例如抗CD3、抗CD28)；協同刺激受體；及/或一或多種細胞介素。試劑可結合至固體載體，諸如珠粒。視情況，擴增方法可進一步包含向培養基中添加抗CD3及/或抗CD28抗體(例如以至少約0.5 ng/ml之濃度)的步驟。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如至少約10個單位/毫升濃度的IL-2。在一些實施例中，刺激劑包括IL-7及/或IL-15。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2、IL-7及/或IL-15。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2、IL-15及/或IL-15Ra。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或雜二聚IL-15 (亦即包含IL-15及IL-15受體α鏈之多肽)。

在另一實施例中，藉由溶解紅血球及例如經由PERCOLL ^™梯度離心耗乏單核球而自周邊血液分離T細胞。替代地，T細胞可自臍帶分離。在任何情況下，特定T細胞亞群可藉由正向或負向選擇技術進一步分離。如此分離之臍帶血單核細胞可耗乏表現某些抗原，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19及CD56之細胞。此等細胞之耗乏可使用分離抗體、包含抗體之生物樣品(諸如腹水)、結合於實體載體之抗體及細胞結合抗體實現。 C. 轉染前活化

本文所揭示之方法的一個態樣不需要在轉染步驟之前用一或多種刺激劑刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)。然而，在一些實施例中，該方法可進一步包含在轉染步驟之前用一或多種刺激劑刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)。本文所描述之刺激劑(例如CD3、CD28、細胞介素及/或生長因子)可促進初代人類免疫細胞(例如T細胞)之高效轉導及/或電穿孔，且用選自IL-7、IL-15、IL-15Ra、IL-7及IL-15及/或雜二聚IL-15 (亦即包含IL-15及IL-15受體α鏈之多肽)之細胞介素補充培養基可顯著增強經轉染之細胞之擴增。此外，在CART製造期間轉染前及/或轉染後刺激及/或活化可保存未分化T細胞，此可延長所製造T細胞之壽命，由此改善CART療法之治療功效。

在一些實施例中，一或多種刺激劑係選自由以下組成之群：促效抗體、細胞介素、重組協同刺激分子、抗CD3抗體或其片段、抗CD28抗體或片段、小藥物抑制劑及/或其組合。在一些實施例中，一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段。在一些實施例中，一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段及一或多種細胞介素。 1. CD3/TCR 複合物

在一些實施例中，用在細胞表面上刺激CD3/TCR複合物之試劑及/或刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑來刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)。在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑為刺激CD3之試劑。在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑係選自抗體(例如單域抗體、重鏈可變域抗體、肽體(peptibody)、Fab片段或scFv)、小分子或配位體(例如天然存在的、重組或嵌合配位體)。

在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑不包含珠粒。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑不包含珠粒。在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑包含抗CD3抗體。在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑包含共價連接至膠態聚合奈米基質之抗CD3抗體。在一些實施例中，刺激CD3之試劑包含有包含熟習此項技術者已知之一或多個CDR、重鏈及/或其輕鏈的一或多個CD3或TCR抗原結合域(例如抗CD3或抗TCR抗體或抗體片段)。

在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑及刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含T Cell Trans Act™。在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑及刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含於多特異性結合分子中。在一些實施例中，多特異性結合分子包含CD3抗原結合域及CD28或CD2抗原結合域。在一些實施例中，多特異性結合分子包含一或多條重鏈及/或輕鏈。在一些實施例中，多特異性結合分子包含雙特異性抗體。在一些實施例中，複數個雙特異性抗體中之一或多者一起結合至多聚體中。 2. 協同刺激分子

在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑為刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、0X40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226或其任何組合之試劑。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑為刺激CD28之試劑。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑係選自抗體(例如單域抗體(例如重鏈可變域抗體)、肽體、Fab片段或scFv)、小分子或配位體(例如天然存在的、重組或嵌合配位體)。

在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含抗CD28抗體。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含共價連接至膠態聚合奈米基質之抗CD28抗體。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑為刺激CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB或CD2之試劑。在一些實施例中，刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RB及/或CD2抗原結合域中之一或多者。舉例而言，試劑可為抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-IBB、抗IL6RA、抗IL6RB、抗CD2抗體或包含熟習此項技術者已知之一或多個CDR、重鏈及/或其輕鏈之抗體片段。

在一些實施例中，在轉染步驟之前，活體外用在細胞表面上刺激CD3/TCR複合物之試劑(例如抗CD3抗體)及/或刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑(例如抗CD28抗體)來刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如淋巴球群、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)。在一些實施例中，可刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如淋巴球群、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)約小於或等於約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約3.5小時、約4小時、約4.5小時或約5小時。

在一些實施例中，活體外用在細胞表面上刺激CD3/TCR複合物之試劑(例如抗CD3抗體)及/或刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑(例如抗CD28抗體)來刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如，淋巴球群體、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、約26小時、約27小時或約28小時。

在一些實施例中，刺激CD3/TCR複合物之試劑及刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑包含於多特異性結合分子中。多特異性結合分子可包含刺激CD3/TCR複合物之試劑及刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑。舉例而言，多特異性結合分子可包含CD3抗原結合域及CD28、ICOS、CD27、CD25、4-IBB、IL6RA、IL6RB及/或CD2抗原結合域中之一或多者。在一些實施例中，多特異性結合分子包含CD3抗原結合域及CD28或CD2抗原結合域。 3. 細胞介素

在一些實施例中，一或多種刺激劑為選自由以下組成之群之細胞介素：介白素-2 (IL-2)、介白素-3 (IL-3)、介白素-6 (IL-6)、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-11 (IL-11)、介白素-12 (IL-12)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、雜二聚IL-15 (亦即包含IL-15及IL-15受體α鏈之多肽)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、介白素-21 (IL-21)；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子；α、β或γ干擾素；紅血球生成素；及其任何組合。

細胞介素可選自IL-2、IL-7、IL-6、IL-15、IL-15Ra、雜二聚IL15 (亦即包含IL-15及IL-15受體α鏈之多肽；hetIL-15)或IL-21。IL-2為產生用於授受性免疫療法之淋巴球之最常使用的細胞介素。IL-2促進T細胞生存及擴增，增強T細胞之腫瘤殺死能力。IL-2顯著增加CAR-T細胞之積聚及其細胞毒性能力，但IL-2暴露之CAR-T細胞在授受性轉移之後呈現較差活體內抗腫瘤免疫。IL-2暴露之CAR-T細胞亦顯示相對成熟表型，其中CD62L、CCR7、CD27及CD28之表現較低，使該等細胞在活體內之持久性較差。較低分化T細胞之授受性轉移與優異的腫瘤消退相關，此支持以下發現：IL-2暴露之CAR-T細胞不如其他組有效(Gattinoni等人, Nat Med, 2011, 17: 1290-7; 及Markley等人, Blood, 2010, 115:3508-19)。

IL-15呈現與IL-2類似的刺激CAR-T細胞擴增及腫瘤溶解功能之效能，且在動物模型中展示更佳抗腫瘤免疫性。另外，IL-15誘導較低分化表型(CD27及CD28之表現較高)。因此，IL-15可支持CAR-T細胞在活體內的持久性。活體外IL-7類似地促進CAR-T細胞擴增。

IL-7亦誘導高水平之CD62L表現，且在無抗原情形下展現最高比例之CAR-Tscm細胞。T細胞或CAR T細胞在無抗原攻擊下離體暴露於IL-7增強CAR-T細胞之抗腫瘤功效。然而，IL-7暴露之CAR-T細胞在與IL-2相比時並不產生更好的活體內抗腫瘤功效。IL-7功效亦由於在抗原攻擊下CAR-T細胞擴增較少而不如IL-15。IL-7及IL-15之組合促進Tscm之產生，此有益於產生更多「年輕的」CAR-T細胞。因此，組合IL-7及IL-15可促進CAR-T細胞擴增且誘導對治療性治療最有效的T細胞表型。

IL-21可誘導較低分化CAR-T細胞擴增，該等細胞甚至在抗原攻擊之情況下亦具有CD62L、CCR7、CD27及CD28之高表現之表型。因此，IL-21暴露之CAR-T細胞在動物模型及IL-21活體內注射中展示最佳持久性，且在促進腫瘤根除方面亦呈現優於除IL-15外之其他細胞介素組的功效。參見例如WO 2016/109410。

因此，在一些實施例中，細胞介素亦可選自IL-15及IL-7；IL-7及IL-21；IL-7及IL-2；IL-15及IL-2；IL-7、IL-15及IL-21；IL-15及IL-15Ra；或IL-7、IL-15及IL-15Ra。在一些實施例中，細胞介素為IL-2。在一些實施例中，細胞介素為IL-15 (例如hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra))。在一些實施例中，細胞介素為IL-6 (例如IL-6/sIL-6Ra)。在一些實施例中，細胞介素為IL-7。在一些實施例中，細胞介素為IL-7及IL-15。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物(例如，淋巴球群體、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290或約300 U/ml之IL-2 (或介於此等值之間的任何量)刺激及/或活化。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20 ng/ml之IL-7 (或介於此等值之間的任何量)刺激及/或活化。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20 ng/ml之IL-15 (或介於此等值之間的任何量)刺激及/或活化。在本文所揭示之CAR T (電轉CAR T細胞)製造期間細胞介素刺激保持或增加T細胞之未分化表型，且產生在投與後在個體中持續存在更長時間的CAR T細胞(電轉CAR T細胞)。用選自IL-7、IL-15、IL-15Ra、IL-7及IL-15及/或雜二聚IL-15 (亦即包含IL-15及IL-15受體α鏈之多肽)之細胞介素補充培養基經14天時段將經轉導之細胞的擴增顯著增強至少200倍。參見例如WO 2016/109410。 4. 奈米結構

在一些實施例中，一或多種刺激劑與珠粒或奈米結構結合。在一些實施例中，奈米結構為奈米基質。奈米基質可包含可移動聚合物鏈之基質及抗CD3及抗CD28抗體或其片段。奈米基質之尺寸可為約1至約500 nm (或介於此兩個值之間的任何尺寸)。在一些實施例中，一或多種刺激劑為奈米基質及一或多種本文所描述之細胞介素。

在一些實施例中，奈米基質可包含聚合、可生物降解或生物相容的惰性物質。惰性物質可對細胞無毒。在一些實施例中，奈米基質可由親水性聚合物鏈構成，該等鏈由於鏈之水合作用而在水溶液中獲得最大遷移率。在一些實施例中，可移動奈米基質可具有膠原蛋白、純化蛋白質、純化肽、多醣、醣胺聚醣或細胞外基質組合物。多醣可包括例如纖維素醚、澱粉、阿拉伯膠、瓊脂糖、聚葡萄糖、聚葡萄胺糖、玻尿酸、果膠、三仙膠、瓜爾膠或海藻酸鹽。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、多元胺、聚乙烯亞胺、聚四級銨聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯啶酮、嵌段共聚物或聚胺基甲酸酯。在一些實施例中，可移動奈米基質為聚葡萄糖聚合物。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之真核細胞群之方法，該方法包含：(1)自個體獲得真核供體細胞群；(2)將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；(3)用一或多種刺激劑刺激真核供體細胞群；(4)用有效劑量之修飾劑轉染經刺激之真核供體細胞群；(5)培養及擴增經轉染之真核供體細胞群；及(6)收集經工程改造之真核細胞，由此產生經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種刺激劑存在下培養及擴增。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自供體白血球分離術富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；(3)用一或多種刺激劑刺激真核供體細胞群；(4)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(5)培養及擴增經轉染之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；及(6)收集經工程改造之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種刺激劑存在下培養及擴增。

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：(1)自獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(2)將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；(3)用一或多種刺激劑刺激淋巴球群體、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(4)用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；(5)培養及擴增經轉染之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；及(6)收集經工程改造之淋巴球、免疫細胞或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞；由此產生經修飾之淋巴球群體、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種本文所描述之刺激劑存在下培養及擴增。

在一些實施例中，在本文所描述之細胞介素存在下用抗CD3及抗CD28抗體刺激及/或活化經富集之血球分離術產物(例如淋巴球群、免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)約12小時，隨後用修飾劑轉染(例如用編碼CAR、經工程改造之TCR或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物之載體或慢病毒載體轉導及/或電穿孔)。隨後在刺激開始之後約24小時，洗滌細胞且調配用於儲存或投與。在其他態樣中，在刺激開始之後約12小時、約22小時、約30小時、約40小時、約45小時、約50小時、約60小時或約72小時，洗滌細胞且調配用於儲存或投與。 D. 將病毒載體引入細胞中之方法

將修飾劑(例如表現載體、病毒載體、聚核苷酸或核酸)引入細胞中之方法包括物理、生物、化學方法及其組合。包括病毒載體之表現載體或本發明之表現載體可藉由熟習此項技術者已知的任何方式引入宿主細胞中。表現載體必要時可包括用於轉染之病毒序列。替代地，表現載體可藉由融合、電穿孔、基因槍法(biolistics) (例如基因槍(gene gun))、轉染、脂質體轉染(例如陽離子脂質體)、聚合物囊封或其類似方式引入。宿主細胞(例如免疫細胞)可在培養物中生長及擴增，之後引入表現載體，繼而用於引入及整合載體之適當的處理。隨後，可將宿主細胞(例如免疫細胞)擴增且可藉助於存在於載體中之標記對宿主細胞進行篩選。用於產生包括載體及/或外源性核酸之細胞之方法為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)。

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物及/或經富集之目標細胞群可使用此項技術中已知之任何方法進行修飾，諸如活化、擴增、誘導細胞凋亡、基因操作、誘導抗原特異性。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物及/或目標細胞群之富集可藉由以下進行修飾：添加細胞介素、交聯特異性受體；添加抗原；引入核酸分子(DNA、RNA及/或其經修飾型式)、蛋白質製劑；添加藥物或小分子；或其任何組合。在一些實施例中，修飾劑(例如表現載體、病毒載體、外源性核酸分子、聚核苷酸或核酸)之引入包含病毒轉染(轉導)、非病毒轉染、電穿孔、脂質體轉染、使用脂質體轉染進行的陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或諸如「基因槍」之基因槍粒子遞送系統(參見例如Nishikawa等人, Hum Gene Ther., 12(8):861- 70 (2001)。 1. 生物方法

用於將所關注修飾劑引入宿主細胞(例如免疫細胞)中之生物方法包括使用表現載體(例如病毒載體、外源性核酸分子、聚核苷酸或核酸(DNA及RNA))。病毒載體，且特別是反轉錄病毒載體(病毒轉染)，已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如人類細胞)中之方法。病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒、腺病毒及腺相關病毒及其類似病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。

在一些實施例中，可利用表現載體(病毒轉染)將編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸引入細胞中。本文提供表現載體(例如慢病毒載體或反轉錄病毒載體)，其包含編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸。適合的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、經工程改造之混合病毒、裸DNA，包括但不限於轉座子介導之載體，諸如Sleeping Beauty、Piggyback及Integrases，諸如Phi31。一些其他適合的表現載體包括單純疱疹病毒(HSV)及反轉錄病毒表現載體。

腺病毒表現載體係基於腺病毒，其具有整合至基因體DNA中之低容量，但轉染宿主細胞之高效率。腺病毒表現載體含有足以進行以下之腺病毒序列：(a)支持表現載體之包裝，及(b)最終在宿主細胞中表現個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽。在一些實施例中，腺病毒基因體為36 kb線性雙股DNA，其中為外來DNA序列。舉例而言，可將插入編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸以取代較大片段之腺病毒DNA以便製成本發明之表現載體。

其他表現載體係基於腺相關病毒，該腺相關病毒利用腺病毒偶聯系統。此AAV表現載體具有高頻率整合至宿主基因體中。其可感染非分裂細胞，因此使得適用於將基因遞送至哺乳動物細胞中，例如在組織培養物中或活體內。AAV載體具有廣泛宿主感染性。關於產生及使用AAV載體之細節描述於美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中。

反轉錄病毒表現載體能夠整合至宿主基因體中，遞送大量外源性基因物質，感染廣泛範圍之物種及細胞類型且包裝在特定細胞株中。藉由在病毒基因體的某些位置處插入核酸(例如編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸)以產生複製缺陷型病毒來構築反轉錄病毒載體。儘管反轉錄病毒載體能夠感染廣泛多種細胞類型，但個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的整合及穩定表現需要分裂宿主細胞。

慢病毒載體來源於慢病毒，慢病毒為複雜反轉錄病毒，除共同反轉錄病毒基因gag、pol及env以外，亦含有具有調節功能或結構功能之其他基因。參見例如美國專利第6,013,516號及第5,994,136號。慢病毒之一些實例包括人類免疫缺乏病毒(HTV-1，HTV-2)及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。慢病毒載體已藉由多次緩解HIV毒性基因產生，例如基因env、vif、vpr、vpu及nef缺失使得載體生物安全。慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，且可用於編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸之活體內及離體基因轉移及表現兩者。參見例如美國專利第5,994,136號。

在一些實施例中，藉由病毒轉導將編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸引入免疫細胞中。在一些實施例中，病毒轉導包含使免疫細胞與包含一或多種核酸之病毒載體接觸。在一些實施例中，病毒載體係選自由以下組成之群：反轉錄病毒載體、仙台(Sendai)病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及慢病毒載體。可使用之各種標記為此項技術中已知的，且可包括hprt、新黴素抗性、胸苷激酶、潮黴素抗性等。

本發明之經修飾富集之血球分離術產物(例如免疫細胞) (例如包含編碼個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸)可藉由用包括本發明之核酸的表現載體穩定轉染宿主細胞(例如免疫細胞)來產生。

可離體擴增本發明之表現編碼CAR、KIR、TCR、KIR、抗原結合多肽、細胞表面受體配位體、腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸的經轉染之細胞(亦即免疫細胞)。在一些實施例中，本發明之表現編碼CAR、KIR、TCR、KIR、抗原結合多肽、細胞表面受體配位體、腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸的經轉染之細胞(亦即免疫細胞)不離體擴增。

用於產生本發明之經修飾之細胞之額外方法包括但不限於化學轉型方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體及/或陽離子聚合物)、非化學轉型方法(例如，電穿孔、光學轉型、基因電轉移及/或流體動力學遞送)及/或基於粒子之方法(例如，刺穿感染、使用基因槍及/或磁轉染)。 2. 物理方法

將聚核苷酸(RNA或DNA)或表現載體引入宿主細胞中之物理方法包括脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。可使用市售方法，包括電穿孔，諸如4D-Nucleofector™技術(Lonza Bioscience, Walkersville, MD)、Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, MA))、Gene Pulser II (BioRad, Denver, CO)或Multiporator (Eppendorf, Hamburg Germany)，將表現載體或聚核苷酸引入目標細胞中。 a. 電穿孔

在一些實施例中，經富集之血球分離術產物及/或經富集之目標細胞群經轉染。在一些實施例中，經富集之血球分離術產物及/或經富集之目標細胞群經電穿孔。在一些實施例中，細胞轉染裝置包含流式電穿孔腔室。舉例而言，美國專利第5,720,921號；第6,074,605號；第7,141,425號；第7,521,224號；及第8,673,623號，以及美國專利申請公開案第2007/0128708A1號；第2008/0182251A1號；第2013/0196441號；第2017/0233716A1號，以及Kim等人, Biosens Bioelectron2008 23(9):1353-60中描述了腔室或系統。

電穿孔將電場施加至細胞以將孔(電孔)引入細胞膜，大分子或試劑可經由該細胞膜(通常帶電)流入細胞中。移除場使孔隙重新密封，且所引入之分子留在細胞內部。電穿孔成功之重要參數包括施加之最大電壓及電流脈衝之持續時間。亦應針對各細胞類型將電壓及電容設置最佳化，其中電穿孔緩衝液之電阻對於選擇初始儀器設置為重要的。最佳穩定及短暫轉型在大約相同的儀器設置下發生，因此當適應新細胞類型時，可使用短暫表現使條件最佳化。

因此，電穿孔介導之向細胞投與包括表現構築體的核酸呈現將所關注RNA遞送至目標細胞之方式。電穿孔介導之投與可利用熟習此項技術者已知之許多可用裝置及電穿孔系統中之任一者。將核酸構築體電穿孔至哺乳動物細胞中之例示性調配物及方法教示於US 2004/0014645、US 2005/0052630、US 2005/0070841、US 2004/0059285、US 2004/0092907及US 2007/0128708中。任何已知細胞類型之電穿孔所需的各種參數，包括電場強度，通常在相關研究文獻以及本領域中之大量專利及申請案中已知。參見例如美國專利第6,678,556號；第7,171,264號；及第7,173 116號。

在一些實施例中，細胞轉染裝置為用於治療性施加電穿孔之市售設備，選自(但不限於) MedPulser™ DNA電穿孔療法系統(Inovio/Genetronics, San Diego, Calif)，且在諸如美國專利第6,567,694號；第6,516,223號；第5,993,434號；第6,181,964號；第6,241,701號；及第6,233,482號之專利中有描述。

在一些實施例中，在轉染步驟之前不活化細胞。在一些實施例中，在轉染之前，可一般使用例如美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國第2006/0121005號中所描述之方法活化及擴增細胞。

在一些實施例中，慢病毒電穿孔(例如，核轉染)產生的大部分未經刺激之CAR T細胞在與經刺激之CAR T細胞群相比時可維持較低分化表型。舉例而言，至少約30%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%以上的電轉CAR T細胞可為原生CAR T細胞。在一些實施例中，CAR慢病毒載體之電穿孔可使得有效CAR轉殖基因整合至T細胞基因體中。在一些實施例中，電轉CAR T細胞之每個細胞載體複本數可實質上類似於習知(經轉導) CAR T細胞之每個細胞複本數。在一些實施例中，電穿孔CAR轉殖基因可在核轉染後約0.5小時、約0.75小時、約1小時、約1.5小時、約2.0小時、約2.5小時、約3.0小時、約3.5小時、約3.5小時或至少約5.0小時內表現。

在一些實施例中，可使用適合的電穿孔裝置對經富集之血球分離術產物及/或經富集之目標細胞群進行修飾，該裝置可例如來自4D-Nucleofector™技術(Lonza Bioscience, Walkersville, MD)、Amaxa NUCLEOFECTOR™-II、Amaxa Biosystems (Cologne, Germany))、ECM 830 (BTX; Harvard Instruments, Boston, Mass.)、Gene Pulser II或Gene Pulser MXCELL™ (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)或FLOW ELECTROPORATION ^®技術(MaxCyte)。在一些實施例中，轉染裝置為ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX)，且在2-mm光析槽(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)中對細胞進行電穿孔。

熟習此項技術者應理解，脈衝類型、脈衝持續時間、電壓及使用頻率視儀器類型及細胞類型而定；且最佳轉染效率可基於脈衝類型、脈衝持續時間、電壓、使用頻率及被電穿孔之核酸或粒子(例如DNA、RNA、表現載體、慢病毒載體或慢病毒粒子)之濃度調節。

可以兩種方式，分批電穿孔或流通電穿孔中之一者進行電穿孔。 i. 分批電穿孔

電穿孔最常以分批形式，以相對較小體積(約1 ml，且通常約1×10 ⁶個細胞)，藉由將待引入之細胞及大分子懸浮液置放於光析槽中進行，該光析槽包括兩個電極，該兩個電極被連接至脈衝發生器且經配置以輸送電流通過懸浮液。在分批型式中，將一或多個電場脈衝施加至細胞，且一般將經處理之細胞轉移至培養基以允許細胞恢復。

在一個實施例中，分批處理模式可用於本文所描述之方法及系統中。在此實施例中，藉由如下方式對細胞進行電穿孔：將經洗滌經富集之血球分離術產物或經富集之目標細胞群之懸浮液在細胞分離模組中達到目標細胞之給定濃度(例如，藉由偵測器偵測)時分流至電穿孔腔室中，且添加細胞修飾或細胞定製試劑，諸如用於產生CART細胞之試劑(例如，慢病毒載體、慢病毒粒子、表現載體、DNA、RNA或蛋白質)至電穿孔裝置腔室中，且將來自脈衝發生器之一或多個電脈衝施加至細胞懸浮液。可在對各批次細胞進行電穿孔時將經電穿孔之細胞重新引入患者中，或若利用連續電穿孔，則進行連續引入。 ii. 流通電穿孔

在一些實施例中，可使用流通或連續流式電穿孔系統。在此實施例中，經洗滌之細胞(例如經富集之血球分離術產物或經富集之目標細胞)及修飾劑(例如慢病毒粒子、表現載體、慢病毒載體、DNA或RNA)通過被連續施加電壓的電穿孔單元。在一些實施例中，流通或連續流式電穿孔系統實現每分鐘處理至多20 ml細胞懸浮液，其中轉染效率高達75%。在一些實施例中，流通或連續流式電穿孔系統實現處理至多每秒1至10 ¹⁰個細胞、每秒10 ⁴至10 ⁷個細胞、每秒10 ⁵至10 ⁸個細胞或每秒10 ⁶至10 ⁹個細胞，或在單一轉型程序中在1個細胞至10 ¹⁰個細胞範圍內之細胞批料，其中效率範圍為至多約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%或更高。

在一些實施例中，本文所揭示之轉染裝置併入具有恆定深度及/或在其長度上的可變寬度之流體通道，使得一些部分較窄而其他部分較寬。任一點處之電場係由通道之寬度確定，其中較窄部分的場強於較寬部分。選擇寬度及電流以使得場僅在窄點處超過允許電穿孔之跨膜電勢，且在通道之長度上交替的較窄及較寬部分提供接近脈衝場之作用，而無需脈衝場發生器。通過通道之流動速率以及較寬及較窄部分之各別長度可經調節以調節細胞暴露於電流的時間，在此期間電流強度足以對細胞進行電穿孔。連續流式電穿孔系統描述於例如Wei及Li, Methods Mol. Biol.1121: 99-110 (2014)；Geng等人, J. Controlled Release144: 91-100 (2010)；美國專利第10,253,316號；第6,617,154號；第6,673,669號；第7,029,916號；第7,771,984號；第9,546,350號；或第10,253,316號中。

在一些實施例中，轉染裝置內的流通電穿孔系統採用在玻璃基板上由聚二甲基矽氧烷(PDMS)製成之流體系統，併入具有交替較寬(10,000-5,000 μm，例如約7,500 μm)及較窄(500-700 μm，例如約500 μm)拉伸段之通道。裝置入口可連接至管道或導管，經由該管道或導管將細胞自緩衝液交換裝置遞送至轉染裝置。插入流通電穿孔系統之入口及出口中的電極絲可連接至恆壓電源供應器。在電穿孔緩衝液中懸浮且包括編碼CAR或TRC之慢病毒載體及/或核酸的細胞被泵送通過流體通道。

在一些實施例中，血球分離術產物用約0.5 µl、約1 µl、約1.5 µl、約2 µl、約2.5 µl、約3 µl、約3.5 µl、約4 µl、約5 µl、約6 µl、約7 µl、約8 µl、約9 µl、約10 µl、約15 µl或約20 µl之慢病毒載體轉染。在一些實施例中，慢病毒載體之有效劑量在約0.01至約5.0之感染倍率(MOI)下包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之MOI。在一些實施例中，血球分離術產物在約0.08之MOI下用約2 μl之慢病毒載體轉染；在約0.2之MOI下用5 μl之慢病毒載體，或在約0.4之MOI下用10 μl之慢病毒載體。

在一些實施例中，電穿孔模組包含流式電穿孔腔室。舉例而言，美國專利第5,720,921號；第6,074,605號；及第7,141,425號中描述了腔室或系統。

本發明之另一態樣提供一種對細胞進行電穿孔之新穎方式。

一般而言，在電穿孔期間，使細胞與有效劑量之慢病毒載體接觸，隨後將電施加至含有待轉染細胞之光析槽。然而，本發明人發現，電穿孔可對表現載體具有毒性，由此降低轉染效率。因此，為了增強電穿孔效率，本發明人在不存在表現載體之情況下電穿孔細胞且觀測到轉染效率增強。因此，在本發明之一些實施例中，細胞可在電穿孔之前與有效劑量之慢病毒載體接觸。在一替代實施例中，細胞可在電穿孔(例如，施加電)之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至多約4小時。舉例而言，細胞可在電穿孔之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至少約5-30分鐘，至少約25-50分鐘、至少約5-60分鐘，至少約5-12分鐘，至少約60-120分鐘，至少約120-240分鐘。替代地，細胞可在電穿孔之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至少約1分鐘、至少約2分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約60分鐘、至少約75分鐘、至少約90分鐘、至少約100分鐘、至少約110分鐘、至少約120分鐘、至少約150分鐘、至少約160分鐘、至少約170分鐘、至少約180分鐘、至少約190分鐘、至少約200分鐘、至少約220分鐘或至少約240分鐘。

在電穿孔之後至多4小時(例如1分鐘至2小時，或1分鐘至4小時)內將慢病毒載體添加至細胞中可減少由電穿孔(可對慢病毒粒子具有毒性)殺死之慢病毒粒子之量。因此，在電穿孔之後至多4小時內將慢病毒載體添加至細胞中可增強CAR轉染。舉例而言，當與傳統電穿孔製程(例如在電穿孔之前將慢病毒添加至細胞中)相比時，在電穿孔之後至多4小時內將慢病毒載體添加至細胞中可使CAR表現增強約10-15%。

因此，在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，轉染細胞包含用慢病毒載體及/或粒子對細胞進行電穿孔。在一些實施例中，電穿孔包含在將電施加至細胞之前、同時或之後將慢病毒載體添加至細胞。在一些實施例中，在添加慢病毒載體之後，將電施加至細胞。在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，在添加慢病毒載體之前將電施加至細胞。舉例而言，在添加慢病毒載體之前，將電施加至細胞持續至少約5-30分鐘，至少約25-50分鐘、至少約5-60分鐘，至少約5-12分鐘，至少約60-120分鐘，至少約120-240分鐘。替代地，在添加慢病毒載體之前，將電施加至細胞持續至少約1分鐘、至少約2分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約60分鐘、至少約75分鐘、至少約90分鐘、至少約100分鐘、至少約110分鐘、至少約120分鐘、至少約150分鐘、至少約160分鐘、至少約170分鐘、至少約180分鐘、至少約190分鐘、至少約200分鐘、至少約220分鐘或至少約240分鐘。 b. 細胞擠壓微流控

在一些實施例中，使用細胞擠壓微流控將有效劑量之慢病毒載體引入經富集之血球分離術產物中。在一些實施例中，藉由在壓力下壓迫細胞而將慢病毒載體經由直徑較小之收縮口引入單核細胞中。快速拉伸、快速壓縮或高剪切速率脈衝引起分子自周圍細胞培養基被吸收至細胞之細胞質中。此所謂的「細胞擠壓」微流控技術適用於多種細胞類型，且非常適合於將各種物質引入單核細胞中。細胞擠壓微流控技術描述於例如WO 2013/059343及US 2014/287509中。 3. 化學方法

將表現載體引入宿主細胞中之化學方法包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如，人工膜泡)。

不管用於將外源性核酸引入宿主細胞中或以其他方式使細胞暴露於本發明之抑制劑的方法，為確認核酸存在於宿主細胞中，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之分子生物分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；生物化學分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在(例如免疫方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所描述之分析以鑑別屬於本發明之範疇內的試劑。

此外，可藉由任何手段引入核酸，諸如轉導經擴增之宿主細胞(例如免疫細胞；經富集之血球分離術產物)、轉染經擴增之宿主細胞(例如免疫細胞；經富集之血球分離術產物)及對經擴增之宿主細胞(例如免疫細胞；經富集之血球分離術產物)進行電穿孔。可藉由一種方法引入一種核酸，且可藉由不同方法引入另一種核酸至宿主細胞(例如免疫細胞；經富集之血球分離術產物)中。在一些實施例中，可使用病毒轉染及化學或物理轉染引入表現系統，諸如慢病毒或反轉錄病毒粒子。舉例而言，可使用電穿孔將慢病毒或反轉錄病毒粒子轉染至細胞中。 4. 慢病毒載體轉染

在一些實施例中，本文所描述之方法包含用一或多種修飾劑轉染經刺激及/或未經刺激之血球分離術產物或血液產物或經富集之血球分離術產物或血液產物。在一些實施例中，一或多種修飾劑係選自由以下組成之群：小分子試劑、生物製劑、治療劑、蛋白質、肽、蛋白質治療劑、肽治療劑、核酸、DNA、RNA、mRNA、嵌合抗原受體、異源T細胞受體、表現載體、病毒載體、載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體。修飾劑可包括人類或真核細胞不允許之病毒(例如不能自然感染或進入人類或真核細胞之病毒)。在一些實施例中，修飾劑亦可選自反轉錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施例中，修飾劑可為反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。在一個實施例中，修飾劑為慢病毒載體或反轉錄病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體為慢病毒粒子。

在一些實施例中，轉染為病毒轉染(例如病毒轉導)，或轉染為編碼以下之核酸的電穿孔或包含編碼以下之核酸序列的慢病毒載體之電穿孔：嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物。

在一些實施例中，轉染係選自由以下組成之群：病毒轉染(例如病毒轉導)、非病毒轉染及/或病毒轉染與非病毒轉染之混合。在一些實施例中，轉染係選自由以下組成之群：電穿孔；雷射束；基因注射；旋轉接種(spinoculation)；聲穿孔；磁轉染；塗有金屬之奈米粒子；磁性共軛腺相關病毒；微/奈米粒子介導之轉染；脂質體轉染；基於脂質之轉染；陰離子脂質體；陽離子脂質體介導之轉染；陽離子聚合物；聚合物囊封；肽介導之轉染；磷酸鈣；樹枝狀聚合物；流動轉染；光穿孔；索魯系統穿孔；短暫細胞膜破壞、變形、擠壓、拉伸、夾捏、減弱、伸長、薄化；基因槍粒子遞送系統；及其組合。

在前述方法之一些實施例中，細胞藉由旋轉接種轉導。舉例而言，用病毒載體轉導血球分離術細胞產物包含使血球分離術細胞產物及病毒載體經受離心力以增強細胞對病毒粒子之攝入，由此增強轉導效率。

在一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)藉由病毒粒子之電穿孔來轉染(亦即，混合病毒及非病毒轉染)。在一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)藉由電穿孔及/或病毒轉染(轉導)來轉染。在一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)藉由病毒轉染及/或基於脂質之轉染來轉染。在一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)藉由病毒轉染及基於脂質體之轉染來轉染。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)與用上文所描述的一或多種刺激劑(例如，細胞介素、重組協同刺激分子、抗CD3抗體或其片段、抗CD28抗體或片段、小藥物抑制劑及/或其一組合)刺激及/或活化血球分離術產物之群體同時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、6.5小時、7小時、7.5小時、8小時、8.5小時、9小時、9.5小時或10小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於5小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於4小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於3小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於2小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物開始之後不遲於1小時發生。

在一些實施例中，用一或多種修飾劑(例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列)轉染血球分離術產物之群體(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)在不用上文所描述的一或多種刺激劑刺激及/或活化血球分離術產物的情況下發生。

在一些實施例中，經轉染之血球分離術產物(例如，免疫細胞群或真核供體細胞群)係選自由以下組成之群：單核細胞、富淋巴球細胞、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4+ T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。

在一些實施例中，經轉染之血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)之濃度可為至少約0.7×10 ⁷、至少約0.8×10 ⁷、至少約0.9×10 ⁷、至少約1×10 ⁷、至少約2×10 ⁷、至少約4×10 ⁷、至少約6×10 ⁷、至少約8×10 ⁷、至少約1×10 ⁸或至少約5×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)之濃度可為約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約4×10 ⁶個細胞/毫升。血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)之濃度亦可為約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，血球分離術產物之濃度亦可為約4.0×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。

在本文所揭示之方法之一些實施例中，該等方法進一步包含在細胞培養基中添加佐劑或促轉染試劑以增強轉染(例如轉導)效率。在一些實施例中，佐劑或促轉導試劑包含陽離子聚合物。在一些實施例中，佐劑或促轉導試劑係選自：LentiBOOST™ (Sirion Biotech)、vectofusin-1、F108 (泊洛沙姆(Poloxamer) 338或Pluronic® F-38)、硫酸魚精蛋白、溴化己二甲銨(凝聚胺)、PEA、Pluronic F68、Pluronic F127、Synperonic或LentiTrans™。在一些實施例中，促轉導劑為LentiBOOST™ (Sirion Biotech)。在一些實施例中，促轉導劑為F108 (泊洛沙姆338或Pluronic® F-38)。

用慢病毒載體(包含編碼CAR、TCR及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸)轉導免疫細胞之新穎策略使得本文所揭示之製造製程(例如，電轉CAR T細胞)成為可能。

CAR T細胞製造方法依賴於組合以下實例1中所描述之生物轉染(基於病毒之轉導)及物理轉染(諸如電穿孔)之混合轉染方法。特定言之，將慢病毒粒子電穿孔至免疫細胞或T細胞中。慢病毒粒子電穿孔至細胞中加速病毒轉染/轉導且允許1天製造CAR T細胞(例如，電轉CAR T細胞)而不需進行轉染後培養及/或擴增。依圖 5 至圖 8及圖 10中所示，可在數小時內收集經電穿孔之CAR T細胞。依實例3及實例4中進一步所論述及圖 11及表 4 至表 6中所示，此類CAR T細胞(例如，電轉CAR T細胞)有效殺死目標細胞。

因此，在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染。慢病毒載體或反轉錄病毒載體可包含編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列。

在一些實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含用包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5之感染倍率(MOI)的有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染經富集之血球分離術產物。在一些實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含在約10或20之MOI下用有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染經富集之血球分離術產物。在一較佳實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含在約0.08、0.2或0.4之MOI下用有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染經富集之血球分離術產物。

在一些實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含在0.01至約20.0之感染倍率(MOI)下用約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15或約20 µl之慢病毒載體轉染經富集之血球分離術產物。

在一些實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含將經富集之血球分離術產物在約0.08之MOI下用2 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染；在約0.2之MOI下用5 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體；或在約0.4之MOI下用10 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體。

慢病毒載體可基於選自由以下組成之群的病毒：反轉錄病毒、α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、δ反轉錄病毒及ε反轉錄病毒。舉例而言，慢病毒載體可基於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、威司奈-梅迪病毒(VMV)病毒、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、VISNA病毒及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在一些實施例中，慢病毒載體可用選自由以下組成之群的病毒之包膜糖蛋白(Env)假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株、科卡爾病毒、章地埔拉病毒、皮里病毒、鯉魚春季病毒血症病毒(SVCV)、σ形病毒、傳染性造血壞死病毒(IHNV)、莫科拉病毒、狂犬病病毒CVS病毒、伊斯法罕病毒、阿拉戈斯病毒、卡察基病毒、朱羅納病毒、拉霍亞病毒、馬拉巴病毒、貓內源性反轉錄病毒(RD114)包膜蛋白、佩里內特病毒、於格布達諾病毒、原型泡沫病毒(PFV)及長臂猿白血病病毒(GaLV)。在一些實施例中，慢病毒載體可用選自由印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株及科卡爾病毒組成之群的包膜糖蛋白(Env)假模式化。

. 在一些實施例中，本文中涵蓋之製造製程包含將經富集之血球分離術產物在約0.08之MOI下用2 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染；在約0.2之MOI下用5 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體；或在約0.4之MOI下用10 µl之慢病毒載體或反轉錄病毒載體。

在一些實施例中，慢病毒載體包含選自由以下組成之群的異源病毒包膜蛋白(Env)：印第安納VSV-G病毒株、新澤西VSV-G病毒株、科卡爾病毒包膜蛋白、伊斯法罕病毒包膜蛋白、章地埔拉病毒包膜蛋白、皮里病毒包膜蛋白、鼠類白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白、SVCV病毒包膜蛋白及其變異體。

在一些實施例中，慢病毒載體包含編碼VSV-G包膜蛋白或VSV G蛋白變異體之核苷酸序列。

在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用有效劑量之包含VSV G包膜蛋白之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染。 E. 轉染後離體培養：活化及刺激

在另一態樣中，本文所揭示之方法進一步包含用一或多種刺激劑刺激及活化經轉染之細胞群(例如經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)以產生經活化之細胞群(例如經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核細胞群)的步驟。

在又一態樣中，本文所揭示之方法進一步包含在預定時間內培養及/或擴增經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之單核細胞群、經活化修飾之CD4+及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核供體細胞群以產生經工程改造之細胞群或經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群的步驟。

在一些實施例中，擴增步驟係在振盪條件或旋轉條件下進行。在一些實施例中，擴增步驟在封閉系統中進行。在一些實施例中，擴增步驟使用無血清培養基及/或在本文所描述之一或多種刺激劑存在下進行。在一些實施例中，擴增步驟在本文所描述之一或多種刺激劑存在下進行。

在一些實施例中，與在轉染之前或緊接在轉染之後的細胞群相比，經活化之血球分離術產物之群體(例如經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群及/或經活化修飾之真核供體細胞群)擴增至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍或至少約25倍。

在一些實施例中，例如藉由活細胞數評估，與在轉染之前或緊接在轉染之後的細胞群相比，細胞群擴增不超過約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%或約60%。在一些實施例中，例如藉由活細胞數評估，與在轉染之前或緊接在轉染之後的細胞群相比，細胞群擴增不超過約5%、不超過約10%、不超過約15%、不超過約20%、不超過約25%、不超過約30%、不超過約35%或不超過約40%。

在一些實施例中，例如藉由活細胞數評估，細胞群擴增不超過約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約16、約20、約24、約36、約48、約55、約60、約65、約70、約72、約80、約90或約96小時。

在一些實施例中，在培養及擴增步驟期間，使經轉染之細胞群在活體外與在細胞表面上刺激CD3/TCR複合物之試劑(例如抗CD3抗體)及/或刺激協同刺激分子及/或生長因子受體之試劑(例如抗CD28抗體)接觸。在一些實施例中，在整個擴增期刺激經轉染之細胞群。在一些實施例中，刺激經轉染之細胞群至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時或至少約28小時。在一些實施例中，在包含不超過約0%、約0.5%、約1%、約1.5%、2%、約2.5%、約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、7.5%或8%血清之培養基中培養及擴增經轉染之細胞群。在一些實施例中，在包含LSD1抑制劑、MALT1抑制劑或其組合之細胞培養基中進行本文提供之細胞介素製程。

在一些實施例中，本文所揭示之方法製造之細胞群(亦即血球分離術產物)展示在表現CAR之細胞中較高百分比之原生免疫細胞。例如，相較於藉由製造CAR T細胞之其他習知方法製成的細胞，表現CAR之細胞中原生免疫細胞之百分比可高至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%。

在本文所揭示之方法之一些實施例中，經轉染之群體(例如，經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)不在轉染之後進一步培養。在一些實施例中，經轉染之細胞群(例如，經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)在轉染之後不用一或多種刺激劑活化。在該實施例中，經轉染之細胞群(例如，經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)在轉染之後亦不進行離體擴增。在該實施例中，在轉染24小時內收集經轉染之細胞群。在此實施例中，在轉染步驟(c)之前，經富集之細胞群(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)可在轉染之前用一或多種刺激劑刺激及/或活化。 F. 收集

在另一態樣中，本文所揭示之方法進一步包含收集經修飾之血球分離術產物之群體(例如經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)以用於冷凍保存或投與的步驟。

在一些實施例中，收集包含選擇及富集經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之供體真核細胞。在一些實施例中，收集進一步包含調配經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之供體真核細胞用於冷凍保存或向有需要之個體投與。

在一些實施例中，在進一步離體培養及擴增經轉染之血球分離術產物(例如經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)時，可在預定時間內培養經轉染之血球分離術產物(例如經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群)，隨後收集經工程改造之所需細胞群(例如，經工程改造之淋巴球群、經工程改造之免疫細胞群、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經工程改造之真核供體細胞群)。

在一些實施例中，擴增預定時間可為小於或等於約24小時；小於或等於約30小時；小於或等於約48小時；小於或等於約72小時；小於或等於約96小時；或小於或等於約120小時。在一些實施例中，擴增預定時間可少於約0.5小時、少於約1小時、少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時或少於約23小時。

在一些實施例中，擴增預定時間可為約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天。

在本文所揭示之用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法的一些實施例中，自富集及/或獲得血球分離術產物(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)至收集經工程改造之細胞(例如，經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞)的時間可為約12小時或更短、約18小時或更短、約20小時或更短、約22小時或更短、約24小時或更短、約26小時或更短、約28小時或更短、約30小時或更短、約32小時或更短、約36小時或更短、約40小時或更短、約45小時或更短、約48小時或更短、約50小時或更短、約55小時或更短、約60小時或更短、約65小時或更短、約70小時或更短或約72小時或更短。

在一些實施例中，富集及/或獲得血球分離術產物(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)至收集經工程改造之細胞(例如，經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞)的時間為約18小時至約72小時、約18小時至約36小時、約18小時至約24小時、約24小時至約72小時、約24小時至約36小時或約36小時至約72小時。

在一些實施例中，自富集及/或獲得血球分離術產物(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)至收集經工程改造之細胞(例如，經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞)的時間可少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時、少於約23小時、少於約24小時、少於約30小時、少於約35小時、少於約40小時、少於約45小時、少於約50小時、少於約55小時、少於約60小時、少於約65小時、少於約70小時或少於約72小時。

在一些實施例中，自富集及/或獲得血球分離術產物(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)至收集經工程改造之細胞(例如，經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞)的時間為約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天。在一些實施例中，自富集及/或獲得血球分離術產物(例如，免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)至收集經工程改造之細胞(例如，經工程改造之淋巴球、經工程改造之免疫細胞、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經工程改造之真核供體細胞)的時間可為約1天、約3天、約4天、約5天或約6天。

在一些實施例中，電穿孔步驟、活化步驟及/或擴增步驟在封閉系統、半封閉及/或功能封閉系統中進行。本文所揭示之製造製程可在封閉系統中進行，在該系統中，因人工操作有限，故污染可能性極小。因此，封閉系統可使污染(例如，環境污染)之風險降至最低。在一些實施例中，T細胞分離、活化、轉導、培育及洗滌均在封閉系統中進行。在本文所揭示之方法之一些實施例中，該等方法在獨立裝置中進行。在一些實施例中，在獨立裝置中進行T細胞分離、活化與轉導、培育及洗滌。在一些實施例中，封閉系統係選自由以下組成之群：封閉袋系統、自動封閉室樣品處理系統及生物反應器(諸如Xuri™細胞擴增系統W25 - Girgin Ltd (或任何GE Healthcare的WAVE Bioreactor™技術)。

在某些實施例中，封閉系統為封閉袋培養系統，使用任何適合之細胞培養袋(例如，Mitenyi Biotec MACS® GMP細胞分化袋、Origen Biomedical PermaLife™細胞培養袋或Origen PermaLife™ PL240袋)。在一些實施例中，封閉袋培養系統中所用之細胞培養袋在轉導步驟期間塗佈有重組人類纖維結合蛋白。在某些實施例中，封閉袋培養系統中所用之細胞培養袋在轉導步驟期間塗佈有重組人類纖維結合蛋白片段。重組人類纖維結合蛋白片段可包括三個功能域：中央細胞結合域、肝素結合域II及CS1序列。重組人類纖維結合蛋白或其片段可用於藉由輔助目標細胞與病毒載體之共定位來增加反轉錄病毒轉導免疫細胞的基因效率。在某些實施例中，重組人類纖維結合蛋白片段為RetroNectin® (Takara Bio, Japan)。在某些實施例中，細胞培養袋可用濃度為約1-60 μg/mL，較佳1-40 μg/mL之重組人類纖維結合蛋白片段塗佈。在某些實施例中，細胞培養袋可用濃度為約1-20 μg/mL、20-40 μg/mL或40-60 μg/mL之重組人類纖維結合蛋白片段塗佈。

在本文所揭示之方法之一些實施例中，在底部包含透氣膜的細胞培養基燒瓶中刺激及/或活化及轉染經富集之血球分離術產物(例如T細胞)，該透氣膜支撐大的介質體積而不實質上損害氣體交換。在一些實施例中，經由對流提供對營養物之獲取(實質上不間斷的獲取)實現細胞生長。 III. 慢病毒載體

本發明之一個態樣提供本文所描述之慢病毒載體。

本發明之另一態樣提供一種慢病毒載體，其包含編碼至少一種來源於病毒之異源病毒包膜蛋白的聚核苷酸序列；編碼至少一種病毒rev蛋白質的聚核苷酸序列；編碼至少一種病毒庫gag蛋白質及至少一種病毒pol蛋白質的聚核苷酸序列；及/或編碼嵌合抗原受體或經工程改造之T細胞受體(TCR)的聚核苷酸序列。

慢病毒載體可基於選自由以下組成之群的病毒：反轉錄病毒、α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、δ反轉錄病毒及ε反轉錄病毒。舉例而言，慢病毒載體可基於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、威司奈-梅迪病毒(VMV)病毒、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、VISNA病毒及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在一些實施例中，慢病毒載體可用選自由以下組成之群的病毒之包膜糖蛋白(Env)假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株、科卡爾病毒(Cocal virus)、章地埔拉病毒(Chandipura virus)、皮里病毒(Piry virus)、鯉魚春季病毒血症病毒(SVCV)、σ形病毒、傳染性造血壞死病毒(IHNV)、莫科拉病毒(Mokola virus)、狂犬病病毒CVS病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、阿拉戈斯病毒(Alagoas virus)、卡察基病毒(Calchaqui virus)、朱羅納病毒(Jurona virus)、拉霍亞病毒(La Joya virus)、馬拉巴病毒(Maraba virus)、貓內源性反轉錄病毒(RD114)包膜蛋白、佩里內特病毒(Perinet virus)、於格布達諾病毒(Yug Bugdanovac virus)、原型泡沫病毒(prototypic foamy virus，PFV)及長臂猿白血病病毒(GaLV)。在一些實施例中，慢病毒載體可用選自由印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株及科卡爾病毒組成之群的包膜糖蛋白(Env)假模式化。

在本文所描述之慢病毒載體之一些實施例中，病毒包膜蛋白(Env)包含選自由以下組成之群的VSV-G糖蛋白：印第安納VSV-G病毒株、新澤西VSV-G病毒株、科卡爾病毒包膜蛋白、伊斯法罕病毒包膜蛋白、章地埔拉病毒包膜蛋白、皮里病毒包膜蛋白、鼠類白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白、SVCV病毒包膜蛋白及其變異體。慢病毒載體亦可包含編碼異源VSV-G包膜蛋白之核苷酸序列。

異源VSV G包膜蛋白可經密碼子最佳化以用於人類表現。替代地，異源VSV G包膜蛋白可為VSV G蛋白變異體。

在本文所描述之慢病毒載體之一些實施例中，異源包膜蛋白可處於轉錄調節元件之控制下。轉錄調節元件可為選自真核啟動子或組成型啟動子之啟動子。

本文所描述之慢病毒載體可進一步包含轉錄調節元件，且轉錄調節元件可位於異源包膜糖蛋白上游(亦即在編碼異源包膜糖蛋白之核苷酸序列的5'方向上)。舉例而言，轉錄調節元件可控制編碼異源包膜糖蛋白之核酸的表現(亦即轉錄且因此(但視情況)轉譯)。在一些實施例中，轉錄調節元件具有組成性活性或為組成型啟動子。在例示性實施例中，組成性活性轉錄調節元件或組成型啟動子可為巨細胞病毒(CMV)啟動子，諸如CMV主要即刻早期啟動子(CMV major immediate early promoter，CMV IE1)、鼠類幹細胞病毒啟動子、延長因子-1 α啟動子(EF1 α)、病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如早期或晚期)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)、泛素C啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)或單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子。

在其他實施例中，轉錄調節元件之活性可為誘導性的或啟動子可為誘導型啟動子。在一些實施例中，轉錄調節元件可為真核啟動子，諸如磷酸甘油酸激酶啟動子。包括原核及真核、組成型及誘導型啟動子及複製起點之其他轉錄調節元件可見於例如中MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Joseph F. Sambrook及David W. Russell編; 第3版; 第1、2及3卷; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001)及MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Michael R. Green及Joseph F. Sambrook編; 第4版; 第1、2及3卷; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012)中。

在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體可經構造及配置以使得產生反轉錄病毒粒子(亦即，順式作用及反式作用基因)所必需之蛋白質、酶及病毒元件之表現處於轉錄調節元件之控制下。在一較佳實施例中，慢病毒載體可進一步包含轉錄調節元件，且轉錄調節元件在產生反轉錄病毒粒子(亦即反式作用及反式作用基因)所必需之蛋白質、酶及病毒元件上游(亦即在5'方向上)，且視情況，轉錄調節元件控制產生反轉錄病毒粒子(亦即反式作用及反式作用基因)所必需的編碼蛋白質、酶及病毒元件之核酸之表現(亦即轉錄或轉譯)。在一些實施例中，轉錄調節元件可具有組成性活性或可為組成型啟動子。

在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體及編碼異源包膜蛋白之核酸可在被引入生產細胞中之前且因此在產生病毒粒子之前擴增或產生。在一些實施例中，編碼其他產生反轉錄病毒粒子所必需之蛋白質、酶及元件之慢病毒載體及核酸可在被引入生產細胞中及相應地產生反轉錄病毒蛋白質之前擴增或產生。

在一些實施例中，編碼異源包膜蛋白之慢病毒載體及核酸可經構造及配置以使得轉錄控制元件驅動異源包膜蛋白在生產細胞中之轉錄且因此轉譯，以促進產生慢病毒粒子。在一些實施例中，編碼產生反轉錄病毒粒子所必需之蛋白質、酶、病毒元件(亦即順式及反式作用基因，包括rev及gag/pol)之慢病毒載體及核酸可經構造及配置以使得轉錄控制元件可驅動蛋白質、酶、病毒元件(亦即順式及反式作用基因，包括rev及gag/pol)在生產細胞中之轉錄且因此轉譯，以使得生產細胞產生反轉錄病毒粒子。

在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，血球分離術產物(例如免疫細胞群、CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或真核供體細胞群)用有效劑量的包含所描述之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之TCR之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染。在一些實施例中，慢病毒載體為慢病毒載體粒子。 A. 慢病毒

來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為實現長期基因轉移之適合工具，此係因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之傳播。慢病毒載體優於來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優勢在於其可轉導非增殖細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優勢。反轉錄病毒載體亦可為例如γ反轉錄病毒載體。γ反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、包裝信號(ψ)、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如兩個)長末端重複序列(LTR)及所關注轉殖基因，例如編碼CAR之基因。γ反轉錄病毒載體可能缺乏病毒結構一族，諸如gag、pol及env。例示性γ反轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)及由其衍生之載體。其他γ反轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人, 「Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application」 Viruses. 2011年6月; 3(6): 677-713中。

反轉錄病毒提供基因遞送系統之適宜平台。所選基因可插入載體中且使用此項技術中已知之技術包裝於反轉錄病毒粒子中。接著可分離重組型病毒且活體內或離體遞送至個體之細胞中。此項技術中已知許多反轉錄病毒系統。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體在此項技術中已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。

在一些實施例中，慢病毒載體係基於選自由以下組成之群的病毒：反轉錄病毒載體、α反轉錄病毒載體、β反轉錄病毒載體、γ反轉錄病毒載體、δ反轉錄病毒載體及ε反轉錄病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體係基於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、威司奈-梅迪病毒(VMV)病毒、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、VISNA病毒及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在一個實施例中，病毒載體來源於EIAV。EIAV具有慢病毒之最簡單基因體結構。

貓免疫不全病毒(FIV) RNA衣殼化決定子已被證明為離散而不連續的，包含基因體mRNA之5'端(R-U5)之一個區域及定位在gag之近端311 nt內之另一區域。

在本文所揭示之製造製程之一些實施例中，慢病毒載體包含選自由以下組成之群的異源病毒包膜蛋白(Env)：印第安納VSV-G病毒株、新澤西VSV-G病毒株、科卡爾水泡病毒( Cocal vesiculovirus)病毒包膜蛋白、伊斯法罕病毒包膜蛋白、章地埔拉病毒包膜蛋白、皮里病毒包膜蛋白、鼠類白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白、SVCV病毒包膜蛋白及其變異體。 B. 假模式化慢病毒載體

病毒包膜蛋白(env)決定最終可被由細胞株產生之重組反轉錄病毒感染及轉型之宿主細胞的範圍。就慢病毒，諸如FflV-1、FflV-2、SIV、FIV及EIV而言，env蛋白質包括gp41及gp120。較佳地，由本發明之包裝細胞表現的病毒env蛋白質係編碼於與病毒gag及pol基因分開的獨立載體上。

可用於本發明中之源自反轉錄病毒之env基因之實例包括但不限於MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、伊波拉(Ebola)、仙台、雞瘟病毒(FPV)及流感病毒包膜。在一些實施例中，源自反轉錄病毒之env基因係選自編碼RNA病毒之包膜蛋白的基因，該RNA病毒係選自小核糖核酸病毒科、杯狀病毒科、星狀病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、副黏液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科、呼腸孤病毒科、雙核糖核酸病毒科、反轉錄病毒科)。在一些實施例中，源自反轉錄病毒之env基因係選自編碼DNA病毒之包膜蛋白的基因，該DNA病毒係選自肝去氧核糖核酸病毒科、環病毒科、細小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科及虹彩病毒科。

在一些實施例中，源自反轉錄病毒之env基因係選自苜蓿花葉病病毒(AMV)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、白點症候群病毒(WDSV)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)、狂犬病、禽類白血病病毒(ALV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、牛白血病病毒(BLV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、松鼠猴反轉錄病毒(SMRV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓白血病病毒(FeLV)、山羊關節炎及腦炎病毒(CAEV)、辛諾布爾病毒(Sin Nombre virus，SNV)、人類T細胞嗜淋巴球病毒(HTLV)、猿猴T細胞白血病病毒(STLV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)、梅森-輝瑞猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus，M-PMV)、禽癌病毒MH2、鳥腦脊髓炎病毒(AEV)、V-crk肉瘤病毒CT10及呼吸道融合性病毒(RSV)。

在一些實施例中，用於假模式化本發明之慢病毒之包膜蛋白包括但不限於以下病毒中之任一者：A型流感，諸如H1N1、H1N2、H3N2及H5N 1 (禽流感)；B型流感；C型流感病毒；A型肝炎病毒；B型肝炎病毒；C型肝炎病毒；D型肝炎病毒；E型肝炎病毒；輪狀病毒；諾瓦克病毒(Norwalk virus)群中之任何病毒；腸道腺病毒；小病毒；登革熱病毒(Dengue fever virus)；猴痘；單股反鏈病毒目；狂犬病毒屬，諸如狂犬病病毒、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、歐洲蝙蝠病毒1及2以及澳大利亞蝙蝠病毒；流行熱病毒；水泡病毒；水泡性口炎病毒(VSV)；疱疹病毒，諸如1型及2型單純疱疹病毒、水痘帶狀疱疹、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類疱疹病毒(HHV)、6型及8型人類疱疹病毒；人類免疫缺乏病毒(HIV)；乳頭狀瘤病毒；鼠類γ疱疹病毒；沙狀病毒，諸如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞相關出血熱病毒(Sabia-associated hemorrhagic fever virus)、委內瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒(Lassa fever virus)、馬丘波病毒(Machupo virus)；淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)；布尼亞病毒科(Bunyaviridiae)，諸如克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒(Hantavirus)、致腎症候群出血熱病毒(hemorrhagic fever with renal syndrome causing virus)、裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus)；絲狀病毒科(絲狀病毒)，包括伊波拉出血熱及馬堡出血熱(Marburg hemorrhagic fever)；黃病毒科，包括基薩努爾森林病病毒(Kaysanur Forest disease virus)、鄂木斯克出血熱病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)、致蜱傳腦炎病毒；及副黏液病毒科，諸如亨德拉病毒(Hendra virus)及尼帕病毒(Nipah virus)；主天花及次天花(天花)；α病毒，諸如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS相關冠狀病毒(SARS-CoV)；西尼羅病毒(West Nile virus)；任何致腦炎病毒。

在一些實施例中，慢病毒載體可用任何所選分子假模式化。在一些實施例中，本發明之慢病毒載體用選自由以下組成之群的包膜糖蛋白(Env)假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、衍生自MLV之嵌合包膜糖蛋白變異體、水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)、經原型泡沫病毒(PFV)修飾之包膜及衍生自長臂猿白血病病毒(GaLV)之嵌合包膜糖蛋白變異體。

在一些實施例中，慢病毒載體用選自由以下組成之群的包膜糖蛋白(Env)病毒載體假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株、科卡爾水泡病毒、章地埔拉病毒、皮里病毒、鯉魚春季病毒血症病毒(SVCV)、σ形病毒、傳染性造血壞死病毒(IHNV)、莫科拉病毒、狂犬病病毒CVS病毒、伊斯法罕病毒、阿拉戈斯病毒、卡察基病毒、朱羅納病毒、拉霍亞病毒、馬拉巴病毒、佩里內特病毒、於格布達諾病毒、原型泡沫病毒(PFV)及長臂猿白血病病毒(GaLV)。

在一些實施例中，Env蛋白質可為經修飾之Env蛋白質，諸如突變型或經工程改造之Env蛋白質。可作出或選擇修飾以引入靶向能力或降低毒性或用於另一目的。Env蛋白質可為經修飾之Env蛋白質，諸如突變型或經工程改造之Env蛋白質。可作出或選擇修飾以引入靶向能力或降低毒性或用於另一目的。 1. VSV-G

水泡性口炎病毒(VSV) (彈狀病毒)之包膜糖蛋白(G)為已被證明能夠假模式化某些包膜病毒及病毒載體病毒體之包膜蛋白。在無任何反轉錄病毒包膜蛋白存在下VSV-G假模式化基於MoMLV之反轉錄病毒載體之能力為此項技術中已知的。任何反轉錄病毒載體均可用VSV-G成功假模式化。此等假模式化VSV-G載體可用於轉導廣泛範圍的哺乳動物細胞。無感染性反轉錄病毒粒子可藉由添加VSV-G變得有感染性。VSV-G假模式化載體已被證明不僅能感染哺乳動物細胞，而且能感染來源於魚類、爬行動物及昆蟲之細胞株。VSV-G蛋白因其胞質尾區能夠與反轉錄病毒核心相互作用而可用於假模式化某些反轉錄病毒。

提供非反轉錄病毒假模式化包膜(諸如VSV-G蛋白)提供如下優勢：可將載體粒子濃縮至較高效價而不損失感染性。相比之下，VSV糖蛋白由單一單元構成。VSV-G蛋白假模式化為在製造製程期間進行高效目標細胞感染/轉導提供潛在優勢，因為VSV糖蛋白由單一單元構成且可承受在超速離心期間之剪切力。相比之下，反轉錄病毒因為由兩個非共價連接次單元組成，且離心可破壞次單元之間的相互作用，所以其包膜蛋白明顯不能承受在超速離心期間之剪切力。WO 2000/52188描述具有水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)作為膜相關病毒包膜蛋白的假模式化反轉錄病毒載體自穩定生產細胞株產生，且提供VSV-G蛋白之基因序列。

假模式化可帶來一或多個優勢。舉例而言，在慢病毒載體情況下，基於HIV-I之載體之env基因產物將限制此等載體僅感染表現被稱為CD4之蛋白質的細胞。但若此等載體中之env基因已被其他RNA病毒之env序列取代，則其可具有更廣泛的感染範圍。 2. 科卡爾水泡病毒包膜糖蛋白

該等粒子及科卡爾水泡病毒包膜糖蛋白(科卡爾-G)對產生其之細胞(亦即，「生產細胞」)具有較低毒性且對被其感染之細胞(亦即，「目標細胞」)具有較高轉導效率。科卡爾水泡病毒包膜糖蛋白具有比包含其他病毒粒子之組合物高的粒子效價。因此，可以較高濃度產生包含科卡爾水泡病毒包膜糖蛋白之慢病毒載體。此外，當與來源於非科卡爾水泡病毒之包膜糖蛋白相比時，包含科卡爾水泡病毒包膜糖蛋白之組合物具有較高效價之成熟及不成熟粒子、較高效價之感染性粒子及較高效價之粒子內所攜帶之遺傳資訊(例如CAR)。在一些實施例中，慢病毒載體包含編碼科卡爾-G包膜蛋白之核苷酸序列。在一些實施例中，科卡爾-G包膜蛋白為科卡爾-G蛋白變異體。 3. 羅斯河病毒

羅斯河病毒(Ross River virus，RRV)係一種由蚊子傳播之α病毒，為澳大利亞之熱帶及溫帶地區的地方病及流行病。溫帶沿海地區之正常群體的抗體率往往較低(6%至15%)，但在墨累河谷系統之平原的血清陽性率達到27%至37%。1979年至1980年，RRV在太平洋島流行起來。該疾病在人類之間無傳染性且從未致命，約一半患者的第一症狀為關節疼痛，伴有疲乏及嗜睡(Fields Virology)。

羅斯河病毒包膜已用於假模式化非靈長類動物慢病毒載體(FIV)，且在全身投與之後主要轉導肝臟。據報導，用羅斯河病毒包膜假模式化之慢病毒載體之轉導效率為用VSV-G假模式化載體獲得之轉導效率的20倍。此外，藉由示意肝毒性之肝酶之血清含量量測，用羅斯河病毒包膜假模式化之慢病毒載體引起較少細胞毒性。 4. 桿狀病毒 GP64

針對用於大規模生產臨床及商業應用所需之高效價病毒的病毒載體，桿狀病毒GP64蛋白已被證明為一種有吸引力的VSVG替代物。相較於VSVG，GP64載體具有類似寬向性及類似天然效價。因為GP64表現不殺死細胞，所以可產生組成性表現GP64之基於293T之細胞株。在一些實施例中，慢病毒載體包含編碼桿狀病毒GP64蛋白之核苷酸序列。在一些實施例中，桿狀病毒GP64蛋白係變異桿狀病毒GP64蛋白。 5. 其他包膜糖蛋白

本發明之慢病毒載體可用以下中之至少一部分假模式化：狂犬病G蛋白或其突變體、變異體、同源物或片段。關於狂犬病G蛋白以及其突變體之教示內容可見於WO 1999/61639；EP 0445625中。在用於假模式化EIAV時給出合理效價之其他包膜包括莫科拉、狂犬病、伊波拉及淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)。 C. 慢病毒載體

在本文所揭示之製造製程、本發明之CAR T細胞治療方法、將修飾引入單核細胞之方法或慢病毒載體之一些實施例中，慢病毒載體為感染性慢病毒載體或慢病毒載體。

本發明之一個態樣提供一種慢病毒載體，其包含編碼至少一種來源於病毒之異源病毒包膜蛋白的聚核苷酸序列；編碼至少一種病毒rev蛋白質的聚核苷酸序列；編碼至少一種病毒庫gag蛋白質及至少一種病毒pol蛋白質的聚核苷酸序列；及編碼嵌合抗原受體或經工程改造之T細胞受體(TCR)的聚核苷酸序列。在一些實施例中，病毒基因體中複製所必需之一或多個區域的至少一部分發生突變。在一些實施例中，病毒基因體中複製所必需之一或多個區域之至少一部分係選自由以下組成之群：rev基因、gag基因、pol基因、整合酶基因、5' LTR、3' LTR及其組合。在一些實施例中，突變係選自由缺失、插入或取代組成之群。 1. 非複製載體

在本發明之例示性反轉錄病毒載體中，可將至少一部分複製所必需之一或多個蛋白質編碼區自病毒移除。舉例而言，gag/pol及env可不存在或不具有功能性。此使病毒載體有複製缺陷。病毒基因體之部分亦可經編碼可操作地連接於載體基因體中之調節控制區及報導基因之候選核酸結合序列的庫置換，以便產生包含候選核酸結合序列之載體，該載體能夠轉導目標非分裂細胞及/或將其基因體整合至宿主基因體中。

在複製缺陷型慢病毒載體之基因體中，gag/pol及/或env之序列可突變、不存在及/或不具有功能性。在典型慢病毒載體中，蛋白質中病毒複製所必需之一或多個編碼區的至少一部分可自載體移除。此使病毒載體有複製缺陷。病毒基因體之部分亦可由所關注核苷酸置換，以便產生包含所關注核苷酸的載體，該載體能夠轉導非分裂目標細胞及/或將其基因體整合至目標細胞基因體中。

在一些實施例中，本發明之慢病毒或反轉錄病毒載體為非整合載體及/或非複製型載體。參見例如WO 2006/010834及WO 2007/071994。在本發明之一個態樣中，本發明之慢病毒或反轉錄病毒載體可能不能在經轉導之細胞中自主複製及特異性整合。在一些實施例中，本發明之慢病毒或反轉錄病毒載體包含重組基因體，該重組基因體包含慢病毒衣殼化psi序列及RNA出核元件、轉殖基因及可能的啟動子及/或有利於RNA入核的在LTR 5'與3'慢病毒序列之間的序列。在一些實施例中，慢病毒載體包含在病毒基因體中複製所必需之一或多個區域之至少一部分中的突變。在該實施例中，一或多個區域係選自由以下組成之群：rev基因、gag基因、pol基因、整合酶基因、5' LTR、3' LTR及其組合。突變係選自由缺失、插入或取代組成之群。

在一些實施例中，慢病毒或反轉錄病毒載體包含及/或進一步包含突變整合酶，該突變整合酶阻止反轉錄病毒或慢病毒基因體整合至宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，慢病毒或反轉錄病毒載體包含產生非功能性整合酶之經修飾之pol序列。

在另一實施例中，慢病毒載體能夠遞送不含或缺乏病毒RNA之序列。在另一實施例中，位於待遞送之RNA上的異源結合域(對於gag為異源的)及Gag或Gag Pol上的同源結合域可用於確保待遞送之RNA的包裝。此等兩種載體均描述於WO 2007/072056中。在一些實施例中，重組反轉錄病毒係非複製勝任型，意謂反轉錄病毒一旦離開包裝細胞即無法複製。 2. 自失活載體

在一些實施例中，慢病毒載體為來源於人類免疫缺乏病毒(HIV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)之非複製型自失活最小慢病毒載體，其用選自由以下組成之群的env假模式化：VSV-G、伊波拉、流感-血球凝集素(Flu-HA)、仙台病毒包膜F或HN、桿狀病毒GP64、狂犬病G、科卡爾水泡病毒包膜蛋白或替代病毒包膜蛋白。

熟習此項技術者將瞭解如何修改本文所揭示之方法以與不同反轉錄病毒一起使用。舉例而言，在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區可經N端RGG盒RNA結合模體及編碼ICP27之聚核苷酸區置換。在一些實施例中，編碼HIV Rev之聚核苷酸區可經編碼腺病毒E1B 55-kDa及E4 Orf6之一或多個聚核苷酸區置換。在一些實施例中，重組反轉錄病毒可為腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、巨細胞病毒、痘病毒、禽痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或辛德比病毒(Sindbis virus)。

在一些實施例中，本文揭示之反轉錄病毒載體或慢病毒載體為自失活載體。依本文所用，術語「自失活載體」係指其中3' LTR強化子啟動子區(U3區)經修飾(例如藉由缺失或取代)之載體。自失活載體可阻止病毒轉錄超出第一輪病毒複製。因此，自失活載體能夠感染且接著整合至宿主基因體(例如哺乳動物基因體)中僅一次，且無法進一步傳代。因此，自失活載體可大大降低產生複製勝任型病毒之風險。

在一些實施例中，病毒粒子可為自失活的。自失活病毒粒子可阻止病毒轉錄超出第一輪病毒複製。因此，自失活粒子能夠感染細胞且其中之遺傳資訊能夠整合至宿主基因體(例如哺乳動物基因體)中。此整合及轉導僅可發生一次，且無法進一步傳代。因此，自失活粒子可大大降低產生複製勝任型病毒之風險。

常用慢病毒載體系統為所謂的第三代自失活系統。第三代慢病毒載體系統可包括四種質體。「轉移質體」編碼由慢病毒載體系統遞送至目標細胞的聚核苷酸序列。轉移質體一般具有一或多個側接有長末端重複序列(LTR)之所關注轉殖基因序列，其促進轉移質體序列整合至宿主基因體中。出於安全原因，轉移質體一般經設計以使所得載體不能複製。舉例而言，轉移質體缺乏在宿主細胞中產生感染性粒子所必需的基因元件。另外，轉移質體可經設計以缺失3' LTF，從而使病毒「自失活(self-inactivating)」(SIN)。

第三代系統一般亦包括兩種「包裝質體」及「包膜質體」。「包膜質體」一般編碼可操作地連接於啟動子之Env基因。在第三代系統之至少一個實施例中，Env基因為VSV-G、伊波拉env、Flu-HA、仙台病毒包膜F、HN、桿狀病毒GP64、狂犬病G、科卡爾水泡病毒包膜蛋白或其衍生物(例如本文所描述之變異體)，且啟動子為CMV啟動子。第三代系統使用兩種包裝質體作為另一安全特徵，一種編碼Gag及Pol且另一種編碼Rev，此係一項優於所謂的第二代系統之單一包裝質體的改善。雖然更安全，但由於添加額外質體，因此第三代系統使用起來可能更繁瑣且導致病毒效價較低。例示性包裝質體包括但不限於pMD2.G、pRSV-rev、pMDLG-pRRE及pRRL-GOI。

在一些實施例中，慢病毒載體為第三代自失活(SIN)載體，且不含任何病毒蛋白質且係非複製勝任型。在該實施例中，無感染性粒子係由經載體轉導及/或轉染之細胞產生。 3. 調節元件

在一些實施例中，本文所描述之反轉錄病毒或慢病毒載體包含轉錄調節元件。在一些實施例中，轉錄調節元件為選自真核啟動子或組成型啟動子之啟動子。生理學啟動子(例如，EF-1α啟動子)不大可能誘導整合介導之遺傳毒性，且可消除反轉錄病毒載體轉型幹細胞之能力。適用於反轉錄病毒或慢病毒載體之其他生理學啟動子為熟習此項技術者已知且可併入核酸載體之例示性實施例中。在一些實施例中，啟動子為延長因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。使用EF-1α啟動子可增加下游轉殖基因(例如，編碼TCR及/或CAR之核酸序列)之表現效率。

在一些實施例中，慢病毒或反轉錄病毒載體進一步包含可改善效價及基因表現的非必需順式作用序列。非必需順式作用序列之一個非限制性實例為中心聚嘌呤區及中心終止序列(cPPT/CTS)，該序列對於高效反轉錄及核輸入至關重要。其他非必需順式作用序列為熟習此項技術者已知且可併入慢病毒或反轉錄病毒載體粒子中。

在一些實施例中，本文揭示之慢病毒或反轉錄病毒載體進一步包含轉錄後調節元件。轉錄後調節元件可改善RNA轉譯，改善轉殖基因表現且使RNA轉錄物穩定。轉錄後調節元件之一個實例為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。因此，在一些實施例中，核酸載體進一步包含WPRE序列。各種轉錄後調節因子元件為熟習此項技術者已知且可併入慢病毒或反轉錄病毒載體中。

本文揭示之慢病毒或反轉錄病毒載體可進一步包含額外元件，諸如用於RNA轉運之rev反應元件(RRE)、包裝序列以及5'及3'長末端重複序列(LTR)。術語「長末端重複序列」或「LTR」係指位於包含U3、R以及U5區的反轉錄病毒DNA之末端處的鹼基對之域。LTR一般提供反轉錄病毒基因之表現(例如基因轉錄物之促進、起始及聚腺苷酸化)及病毒複製所需的功能。在一個實施例中，慢病毒或反轉錄病毒載體包含3' U3缺失LTR、無功能LTR及/或缺乏功能3'或5' LTR。因此，本文揭示之慢病毒或反轉錄病毒載體可包含本文所描述之元件之任何組合，以增強轉殖基因之功能表現效率。舉例而言，除編碼TCR或CAR之核酸以外，慢病毒或反轉錄病毒載體亦可包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3' U3缺失LTR'。 D. 慢病毒產生

本發明之一個態樣提供一種產生本文所描述之慢病毒或反轉錄病毒載體粒子的方法。本發明之另一態樣提供一種產生慢病毒或反轉錄病毒載體粒子之方法，其包含將本文揭示之慢病毒或反轉錄病毒載體粒子引入宿主細胞中。

慢病毒載體產生依賴於「包裝細胞株」之使用。一般而言，包裝細胞株為細胞能夠在轉移質體、包裝質體及包膜質體被引入細胞中時產生感染性慢病毒粒子之細胞株。可使用將質體引入細胞中之各種方法，包括轉染或電穿孔。在一些情況下，包裝細胞株適於將慢病毒載體系統高效率包裝成慢病毒粒子。在一個實施例中，本發明提供產生重組反轉錄病毒(例如慢病毒)的包裝細胞，該病毒用本文所揭示之VSV-G糖蛋白或其變異體假模式化。大規模病毒粒子生產通常為實現合理的病毒效價所必需的。藉由將轉移載體轉染至包裝細胞株中產生病毒粒子，該包裝細胞株包含病毒結構及/或輔助基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他反轉錄病毒基因。 1. 反轉錄病毒治療載體之產生

在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒載體可藉由用四種由以下組成的質體短暫轉染HEK293T細胞產生：(1)編碼所需轉殖基因及能夠與RNA結合蛋白相互作用之結合位點之重組反轉錄病毒載體基因體質體；(2)合成反轉錄病毒gag/pol表現質體；(3)包膜(env)表現質體(例如VSV-G或其變異體)；(4)RNA結合蛋白表現質體。

在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒載體為HIV。在該實施例中，反轉錄病毒載體可藉由用五種質體短暫轉染HEK293T細胞產生：(1)編碼所需轉殖基因、能夠與RNA結合蛋白相互作用之結合位點及RRE序列之重組HIV載體基因體質體；(2)合成gag/pol表現質體；(3)包膜(env)表現質體(例如VSV-G、科卡爾水泡病毒或其變異體)；(4)RNA結合蛋白表現質體；(5) REV表現質體。

在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒載體可藉由使用穩定表現以下之包裝細胞產生：(1) gag/pol；(2) env (例如，VSV-G或其變異體)；及(3) RNA結合蛋白及(對於HIV載體而言) Rev，以及編碼重組反轉錄病毒載體基因體的質體，該基因體編碼所需轉殖基因(例如，CAR)及能夠與RNA結合蛋白相互作用之結合位點；且對於HIV載體而言，包括RRE序列，其藉由短暫轉染而被引入此類細胞中。

在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒載體可在穩定表現以下之生產細胞中產生：(1) gag/pol、(2) env (例如VSV-G或其變異體)、(3) RNA結合蛋白、(4)編碼所需轉殖基因(例如CAR)及能夠與RNA結合蛋白相互作用之結合位點的重組EIAV載體基因體。

在一些實施例中，慢病毒載體為HIV慢病毒載體。在該實施例中，HIV載體可在穩定表現以下之生產細胞中產生：(1) gag/pol；(2) env (例如VSV-G或其變異體)；(3) RNA結合蛋白；(4)編碼所需轉殖基因(例如CAR)、能夠與RNA結合蛋白相互作用之結合位點及RRE序列之重組HIV載體基因體；及(5) REV。 a. 密碼子最佳化

在一些實施例中，本發明中所用的用於產生慢病毒載體之聚核苷酸中之任一者可經密碼子最佳化。不同細胞不同之處在於其對特定密碼子之使用。此密碼子偏差對應於特定tRNA在細胞類型中之相對豐度的偏差。藉由改變序列中之密碼子使得其經定製以與對應的tRNA之相對豐度匹配，有可能增加表現。同樣地，有可能藉由故意選擇滿足以下條件之密碼子來降低表現：已知與其對應的tRNA在特定細胞類型中係罕見的。因此，可實現額外轉譯控制程度。

許多病毒，包括HIV及其他慢病毒，使用許多罕見密碼子，且藉由改變此等密碼子以對應於常用哺乳動物密碼子，可實現增加所關注基因或哺乳動物生產細胞中之包裝組分之表現。對於哺乳動物細胞以及多種其他生物體，密碼子使用表在此項技術中為已知的。

病毒載體組分之密碼子最佳化具有許多其他優勢。編碼生產細胞/包裝細胞中病毒粒子組裝所需的病毒粒子之包裝組分的核苷酸序列藉助於其序列之改變，使其RNA不穩定性序列自其中除去。同時，保留包裝組分之胺基酸序列編碼序列，使得該序列所編碼之病毒組分保持相同或至少足夠類似，從而使包裝組分之功能不受損。在慢病毒載體密碼子最佳化上，亦克服Rev/RRE輸出需要，使最佳化序列與Rev無關。密碼子最佳化亦減少載體系統內不同構築體之間(例如在gag-pol及env開讀框中之重疊區之間)的同源重組。因此密碼子最佳化之總體作用為使病毒效價顯著增加及提高安全性。

在一個實施例中，僅對與不穩定性序列有關的密碼子進行密碼子最佳化。在一個較佳實施例中，對序列其全部進行密碼子最佳化。在該實施例中，序列涵蓋gag-pol之讀框轉移位點(參見下文)。gag-pol基因包含編碼gag-pol蛋白質之兩個重疊讀框。兩種蛋白質之表現取決於轉譯期間之讀框轉移。此讀框轉移係由轉譯期間之核糖體「滑移」引起。認為此滑移係至少部分地由核糖體停滯RNA二級結構引起。此類二級結構存在於gag-pol基因中之讀框轉移位點下游。可進行最佳密碼子使用之推導，例如以容納便利的限制位點，且可將保守性胺基酸變化引入Gag-Pol蛋白質中。

在一個實施例中，密碼子最佳化係基於輕微表現之哺乳動物基因。應瞭解，歸因於遺傳密碼之簡併性，熟習此項技術者可獲得許多gag-pol序列。此外，已描述多種反轉錄病毒變異體，其可用作產生經密碼子最佳化之gag-pol序列之起始點。慢病毒基因體可廣泛變化。舉例而言，存在多種仍具有功能之HIV-1之準種(quasi-species)。EIAV的情況亦如此。此等變異體可用於增強轉導過程之特定部分。HIV-1變異體之實例可見於Los Alamos National Security, LLC在hiv-web.lanl.gov上運營之HIV資料庫。EIAV純系之細節可見於ncbi.nlm.nih.gov上之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)資料庫。

密碼子最佳化gag-pol序列之策略可在與任何反轉錄病毒有關時使用。此將適用於所有慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1及HIV-2。此外，此方法可用於增加來自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV及人類內源性反轉錄病毒(HERV)、MLV及其他反轉錄病毒之基因之表現。

密碼子最佳化可使gag-pol表現與Rev無關。然而，為了使得能夠在慢病毒載體中使用抗rev或RRE因子，必需使病毒載體生產系統完全與Rev/RRE無關。因此，亦需要修飾基因體。此藉由使載體基因體組分最佳化來實現。有利地，此等修飾亦使得產生更安全的系統，該系統在生產細胞及經轉導之細胞中不存在所有額外蛋白質。 b. 病毒粒子之產生

感染性病毒粒子及病毒儲備溶液之產生可使用本文所描述之習知技術進行。可藉由已知技術產生效價為每毫升數百萬轉導單位(TU/mL)之重組病毒(例如本文所描述之反轉錄病毒或慢病毒載體或粒子)。在超速離心之後，可獲得約10 ⁸TU/mL、10 ⁹TU/mL、10 ¹⁰TU/mL、10 ¹¹TU/mL或10 TU/mL或任何中間效價之濃縮儲備液。可根據病毒效價(TU/mL)遞送重組病毒(例如本文所描述之反轉錄病毒或慢病毒載體或粒子)，病毒效價可例如藉由使用市售p24效價分析法量測，該分析法為針對p24病毒鞘蛋白之ELISA。

在一些實施例中，用慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染經富集之血球分離術產物，該載體包含每經富集之血球分離術產物(細胞)的以下之病毒轉導單位(TU)濃度：約1×10 ⁸至約1×10 ¹⁰TU/10 ⁸個細胞、約5×10 ⁸至約5×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約1×10 ⁹至約5×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約1×10 ⁹至約4×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約1×10 ⁹至約3×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約1×10 ⁹至約2×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞或其任何中間TU。

在一個實施例中，本文涵蓋之製造製程包含用慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染經富集之血球分離術產物，該載體之濃度為約1×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約5×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約6×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約7×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約8×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約9×10 ⁸TU/10 ⁸個細胞、約1×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約2×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約3×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約4×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約5×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約6×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約7×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約8×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞、約9×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞或約1×10 ¹⁰TU/10 ⁸個細胞或任何中間TU。在一特定實施例中，經富集之血球分離術產物用約1×10 ⁷至約2×10 ⁹TU/10 ⁸個細胞之慢病毒載體或反轉錄病毒載體濃度轉染。

病毒粒子及病毒儲備溶液之生產可使用習知技術進行。製備病毒儲備溶液之方法為此項技術中已知的且由例如Soneoka等人(1995) Nucl. Acids Res. 23 :628-633, 及Landau等人(1992) J. Virol. 66:5110-5113說明。藉由已知技術產生效價為每毫升數百萬轉導單位(TU/毫升)之重組病毒。在超速離心之後，可獲得約10 ⁸TU/mL、10 ⁹TU/mL、10 ¹⁰TU/mL、10 ¹¹TU/mL或10 ¹²TU/mL或任何中間效價之濃縮儲備液。 c. p24 效價分析法

可根據病毒效價(TU/mL)遞送病毒，病毒效價可例如藉由使用市售p24效價分析法量測。p24效價分析法為針對p24病毒鞘蛋白之ELISA。假設每個慢病毒物理粒子(PP)有大致2000個p24分子，則下式可用以計算p24之pg/mL：(2×10 ³)×(24×10 ³Da p24/PP)，48×10 ⁶/亞佛加厥常數(Avogadro)=(48×10 ⁶) I (6×10 ²³)=8×10 ¹⁷g p24/PP，每1×10 ¹⁶g p24有大致1 PP，每pg p24有1×10 ⁴PP。在一些實施例中，包裝相當不錯之VSV-G假模式化慢病毒載體之感染指數在每1000個物理粒子(PP)約1 TU至每100個PP (或更少)約1 TU範圍內。因此，p24之範圍為大致約10至約100 TU/pg。經由此轉化獲得TU/mL。

慢病毒效價亦可藉由分析經轉導的人類骨肉瘤(HOS)細胞來測定。簡言之，將經轉導的HOS細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)之DMEM中培養七天，其後基因體DNA藉由DNeasy (Qiagen, Venlo Netherlands，目錄號69506)提取且藉由定量PCR (qPCR)評估。qPCR方案之引子/探針組藉由測定每內源性人類核糖核酸酶P複本數之慢病毒psi-gag區複本數來量測經轉導的細胞之載體複本數(VCN)。原病毒之完整性藉由定序個別原病毒插入來評定。在一些實施例中，使用HOS細胞株分析法測定病毒效價。 d. 宿主細胞

依本文所用，「宿主細胞」係經核酸載體轉染以複製及產生更多核酸載體本身(亦即更多質體)的細胞。在一些實施例中，在HEK 293T細胞中產生包含編碼本文所揭示之CAR或TCR之慢病毒載體(LV)的上清液。為產生本發明之慢病毒載體，用4種質體短暫轉染293個細胞：編碼HIV gag-pol之質體、編碼VSV-G包膜蛋白之質體、編碼HIV rev蛋白質之質體及編碼CAR之慢病毒轉移載體。

細菌細胞、酵母細胞及動物細胞可用於擴增或產生編碼異源包膜蛋白或反轉錄病毒粒子產生所必需的蛋白質、酶、病毒元件(亦即順式及反式作用基因，包括rev及gag/pol)之核酸及載體。為了在細菌細胞中擴增，適合的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為了在真核細胞中擴增或在真核細胞中表現，適合的啟動子包括但不限於輕鏈或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及強化子元件；巨細胞病毒即刻早期啟動子；單純疱疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；存在於反轉錄病毒的長末端重複序列中之啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及各種此項技術已知的組織特異性啟動子。包括可逆誘導型啟動子之適合可逆啟動子為此項技術中已知的。此類可逆啟動子可分離自且來源於許多生物體，例如真核生物及原核生物。衍生自用於第二生物體之第一生物體(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物等)之可逆啟動子的修飾在此項技術中為熟知的。此類可逆啟動子及基於此類可逆啟動子但亦包含額外控制蛋白之系統包括但不限於醇調節啟動子(例如醇脫氫酶I (alcA)基因啟動子、對醇反式活化蛋白(A1cR)起反應之啟動子等)、四環素調節啟動子(例如包括Tet活化因子、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節啟動子(例如大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮(mifepristone)啟動子系統等)、金屬調節啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子系統等)、致病相關調節啟動子(例如柳酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等)、溫度調節啟動子(例如熱休克誘導型啟動子(例如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等)、光調節啟動子、合成誘導型啟動子及其類似啟動子。

在一些實施例中，宿主細胞及生產細胞可來自相同細胞株。在一些實施例中，宿主細胞及生產細胞為HEK293-T細胞。因此，在一些實施例中，啟動子一般可在所有細胞中表現，或選擇性地在生產細胞中表現，或特別是在生產細胞中表現。在一些實施例中，啟動子為CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性球特異性啟動子或NK特異性啟動子。舉例而言，可使用CD4基因啟動子；參見例如Salmon等人. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739；及Marodon等人(2003) Blood 101:3416。作為另一實例，可使用CD8基因啟動子。NK細胞特異性表現可藉由使用NcrI (p46)啟動子實現；參見例如Eckelhart等人. Blood(2011) 117:1565。為了在酵母宿主細胞中表現以用於擴增，適合的啟動子為組成型啟動子，諸如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子及其類似啟動子；或可調節型啟動子，諸如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1 (例如，用於畢赤酵母)。選擇適當載體及啟動子完全在一般熟習此項技術者之水平內。適用於原核宿主細胞之適合的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，例如lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc啟動子；tac啟動子及其類似啟動子；araBAD啟動子；活體內調節啟動子，諸如ssaG啟動子或相關啟動子(US 2004/0131637)、pagC啟動子、nirB啟動子及其類似啟動子(參見例如Dunstan等人, Infect. Immun.(1999) 67:5133-5141; McKelvie等人, Vaccine (2004) 22:3243-3255)；σ70啟動子，例如共同σ70啟動子(參見例如GenBank登錄號AX798980、AX798961及AX798183)；固定相啟動子，例如dps啟動子、spv啟動子及其類似啟動子；來源於致病島SPI-2之啟動子；actA啟動子；rpsM啟動子；tet啟動子；SP6啟動子；及其類似啟動子。適用於原核生物(諸如大腸桿菌)中之適合的強啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7及Pλ。

本發明之一個態樣提供一種產生慢病毒載體粒子之方法，其包含將本文所描述之慢病毒載體引入宿主細胞中。

本發明之另一態樣提供一種用於將編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體或治療蛋白之核酸遞送至細胞的方法，該方法包含將轉移質體引入細胞中，該轉移質體包含：編碼至少一種藉由本文所描述之方法工程改造的異源病毒包膜蛋白之聚核苷酸序列；編碼至少一種反轉錄病毒rev蛋白質之聚核苷酸序列；編碼至少一種反轉錄病毒gag蛋白質及反轉錄病毒pol蛋白質之聚核苷酸序列；及/或編碼嵌合抗原受體、經工程改造之T細胞受體(TCR)或治療蛋白之聚核苷酸序列。在一些實施例中，依本文所描述，反轉錄病毒基因體中複製所必需之一或多個區域的至少一部分發生突變。

本發明之另一態樣提供一種將修飾引入細胞之方法，該方法包含用有效劑量之本文所描述之慢病毒載體粒子對細胞進行電穿孔，由此產生經修飾之細胞。在一些實施例中，在電穿孔(例如施加電)之前使細胞與有效劑量之慢病毒載體接觸。替代地，細胞可在電穿孔(例如，施加電)之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至多約4小時。舉例而言，細胞可在電穿孔之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至少約5-30分鐘，至少約25-50分鐘、至少約5-60分鐘，至少約5-12分鐘，至少約60-120分鐘，至少約120-240分鐘。替代地，細胞可在電穿孔之後與有效劑量之慢病毒載體接觸至少約1分鐘、至少約2分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約60分鐘、至少約75分鐘、至少約90分鐘、至少約100分鐘、至少約110分鐘、至少約120分鐘、至少約150分鐘、至少約160分鐘、至少約170分鐘、至少約180分鐘、至少約190分鐘、至少約200分鐘、至少約220分鐘或至少約240分鐘。

在一些實施例中，細胞可為選自由以下組成之群的淋巴樣細胞：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T淋巴球、調節性T細胞及其任何組合。在一些實施例中，細胞可為選自由以下組成之群的骨髓細胞：單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其任何組合。在一些實施例中，細胞可為幹細胞、造血幹細胞、造血祖細胞、CD34 ⁺細胞或CD34 ⁺周邊血液幹細胞。

在將修飾引入細胞之方法的一些實施例中，該方法包含用有效劑量之慢病毒載體粒子對細胞進行電穿孔，且有效劑量包含約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15或約20 µl之慢病毒載體。

在一些實施例中，慢病毒載體粒子之有效劑量包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之感染倍率(MOI)。在一些實施例中，有效劑量之慢病毒載體粒子包含在約0.08之MOI下約2 µl之慢病毒載體粒子。在一些實施例中，有效劑量之慢病毒載體粒子包含在約0.2之MOI下約5 µl之慢病毒載體粒子。在一些實施例中，有效劑量之慢病毒載體粒子包含在約0.4之MOI下約10 µl之慢病毒載體粒子。 E. 產生治療蛋白之方法

本發明之一個態樣提供一種產生治療蛋白之方法，該方法包含：使用本文所描述之方法製造包含治療蛋白的經工程改造之免疫細胞群或經工程改造之真核細胞群；收集治療蛋白；及分離及純化治療蛋白。在一些實施例中，治療蛋白係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。 IV. 嵌合受體

本發明之一個態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：自獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。

本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之免疫細胞群之方法，該方法包含：自供體白血球分離術富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群。

然而，本發明之另一態樣提供一種用於製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含：自個體獲得真核供體細胞群；將真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及用有效劑量之修飾劑轉染真核供體細胞群，由此產生經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，經轉染之細胞在一或多種刺激劑存在下培養及擴增。

在一些實施例中，用一或多種選自由以下組成之群的修飾劑轉染細胞：小分子試劑、生物製劑、治療劑、蛋白質、肽、蛋白質治療劑、肽治療劑、核酸、DNA、RNA、mRNA、嵌合抗原受體、異源T細胞受體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體。

在一些實施例中，慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列；經工程改造之T細胞受體；及/或編碼增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列。

在一些實施例中，慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、抗原結合多肽、細胞表面受體配位體或腫瘤抗原之核酸。在一些實施例中，核酸編碼嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，核酸編碼抗原結合多肽。在一些實施例中，核酸編碼殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)。在其他實施例中，外源性核酸編碼細胞表面受體配位體或腫瘤抗原。

在一些實施例中，反轉錄病毒載體或慢病毒載體可用於將TCR或CAR引入免疫細胞或其前驅體(例如T細胞)中。在一些實施例中，反轉錄病毒載體或慢病毒載體粒子可包含將輔助編碼於其中之TCR或CAR之功能表現的額外元件。在一些實施例中，包含編碼TCR或CAR之核酸的表現載體進一步包含哺乳動物啟動子。 A. 嵌合抗原受體

本發明提供包含一或多個CAR之經工程改造之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)，該一或多個CAR將免疫效應細胞導引至癌症。在一些實施例中，CAR包含抗原結合域、跨膜域、協同刺激域及胞內域。CAR可包含本文所描述之任何抗原結合域、任何鉸鏈、任何跨膜域、任何協同刺激域及任何胞內信號傳導域。

抗原結合域可以可操作地連接於CAR之另一域，諸如跨膜域或胞內域(本文中均有描述)，以用於在本文所描述之任何免疫細胞中表現。在一個實施例中，編碼抗原結合域之第一核酸序列與編碼跨膜域之第二核酸可操作地連接，且進一步與編碼胞內域之第三核酸序列可操作地連接。

本文所描述之抗原結合域可與本文所描述之任何跨膜域、本文所描述之任何胞內域或細胞質域或本文所描述之任何可包括於本發明之CAR中的其他域組合。本發明之個體CAR亦可包括本文所描述之間隔域。在一些實施例中，抗原結合域、跨膜域及胞內域中之各者由連接子分隔開。 1. 抗原結合域

CAR之抗原結合域為CAR之胞外區，用於與包括蛋白質、碳水化合物及糖脂之特異性目標抗原結合。在一些實施例中，CAR包含對目標細胞(例如癌細胞)上之目標抗原(例如腫瘤相關抗原)之親和力。目標抗原可包括與目標細胞相關之任何類型之蛋白質或其抗原決定基。舉例而言，CAR可包含對目標細胞上之目標抗原之親和力，其指示目標細胞之特定狀態。

依本文所述，對目標細胞上之特異性目標抗原具有親和力之本發明CAR可包含目標特異性結合域。在一些實施例中，目標特異性結合域為鼠類目標特異性結合域，例如目標特異性結合域來源於鼠類。在一些實施例中，目標特異性結合域為人類目標特異性結合域，例如目標特異性結合域來源於人類。

抗原結合域可包括結合於抗原之任何域且可包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、非人類抗體及其任何片段。因此，在一個實施例中，抗原結合域部分包含哺乳動物抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合域包含全長抗體。在一些實施例中，抗原結合域包含抗原結合片段(Fab)，例如Fab、Fab'、F(ab')2、單特異性Fab2、雙特異性Fab2、三特異性Fab2、單鏈可變片段(scFv)、dAb、串聯scFv、VhH、V-NAR、駱駝科抗體(camelid)、雙功能抗體、微型抗體、三功能抗體或四功能抗體。在一些實施例中，抗原結合域係選自由以下組成之群：(a)全長抗體或其抗原結合片段；(b) Fab；(c)單鏈可變片段(scFv)；及(d)單域抗體。

在一些實施例中，本發明之CAR可對一或多種目標細胞上之一或多種目標抗原具有親和力。在一些實施例中，CAR可對單一目標細胞上之一或多種目標抗原具有親和力。在此類實施例中，CAR為雙特異性CAR或多特異性CAR。在一些實施例中，CAR包含一或多個賦予一或多種目標抗原親和力的目標特異性結合域。在一些實施例中，CAR包含一或多個賦予相同目標抗原親和力之目標特異性結合域。舉例而言，包含一或多個對相同目標抗原具有親和力之目標特異性結合域的CAR可結合目標抗原之不同抗原決定基。當複數個目標特異性結合域存在於CAR中時，結合域可以串聯方式排列且可藉由連接肽分隔開。舉例而言，在包含兩個目標特異性結合域之CAR中，結合域經由多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區彼此共價連接在單一多肽鏈上。

在一些情況下，抗原結合域可來源於將最終使用CAR之相同物種。舉例而言，對於用於人類，CAR之抗原結合域可包含本文中其他地方所描述之人類抗體或其片段。

因此，由本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體編碼之CAR可靶向以下癌症相關抗原(腫瘤抗原)之一：CD19；CD20；CD22 (Siglec 2)；CD37；CD 123；CD22；CD30；CD 171；CS-1 (亦稱為CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319及19A24)；C型凝集素樣分子-1 (CLL-1或CLECL1)；CD33；CD133；表皮成長因子受體(EGFR)；表皮成長因子受體變異體III (EGFRvIII)；人類表皮成長因子受體(HER1)；神經節苷脂G2 (GD2)；神經節苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l -4)bDGlcp(l- l)Cer)；TNF受體家族成員B細胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體次單元α-2 (IL- 13Ra2或CD213A2)；間皮素；介白素11種受體α (IL- l lRa)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21 (睾蛋白或PRSS21)；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；路易斯(Lewis，Y)抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-beta)；階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)；葉酸受體α；受體酪胺酸蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；細胞表面相關黏蛋白1 (MUC 1)；GalNAca1-O-Ser/Thr (Tn) MUC 1 (TnMUC1)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；突變延長因子2 (ELF2M)；蝶素(Ephrin) B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；似胰島素生長因子1受體(IGF-I受體)；碳酸酐酶IX (CAIX)；β型蛋白酶體(蛋白體(Prosome)，巨蛋白因子(Macropain))次單元9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由斷點簇集區(BCR)及阿貝爾森鼠(Abelson murine)白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl)組成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；蝶素A型受體2 (EphA2)；海藻糖基GM1；唾液酸基路易斯黏附分子(sialyl Lewis adhesion molecule，sLe)；神經節苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記1 (TEM1/CD248)；相關腫瘤內皮標記7 (TEM7R)；密連蛋白6 (CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶聯受體C類第5組成員D (GPRC5D)；X染色體開讀框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；間變性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2 (uroplakin 2，UPK2)；酪胺酸蛋白激酶Met (c-Met)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β3 (ADRB3)；泛連接蛋白3 (pannexin 3，PANX3)；G蛋白偶聯受體20 (GPR20)；淋巴球抗原6複合物基因座K 9 (LY6K)；嗅覺受體51E2 (OR51E2)；TCRγ替代讀框蛋白(TARP)；威爾姆斯氏腫瘤蛋白(Wilms tumor protein，WT1)；癌症/睪丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睪丸抗原2 (LAGE-la)；黑色素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)；位於染色體12p上之ETS易位變異基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成員1A (XAGEl)；血管生成素(angiopoietin)結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑色素瘤睪丸癌抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤睪丸癌抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；普洛斯坦(prostein)；存活素(surviving)；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1 (PCTA-1或半乳糖凝集素8)；由T細胞識別之黑色素瘤抗原1 (MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷點；黑色素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)；跨膜絲胺酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因(ERG)；N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V (NA17)；配對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；週期蛋白B l；v-myc禽類髓細胞瘤病毒致癌基因神經母細胞瘤衍生之同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白質2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B 1 (CYP1B 1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣抗原(印記位點調節物兄弟因子或BORIS)；由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)；配對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前頂體素(proacrosin)結合蛋白sp32 (OY-TES l)；淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)；晚期糖基化終產物受體(RAGE-1)；泛腎抗原1 (renal ubiquitous 1，RU1)；泛腎抗原2 (RU2)；豆莢蛋白(legumain)；人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)；腸羧基酯酶；突變熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白血球免疫球蛋白樣受體子族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣抗原2 (EGF-like module- containing mucin-like hormone receptor-like 2，EMR2)；淋巴球抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2 (Glypican-2，GPC2)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)；NKG2D；KRAS；GDNF家族受體α-4 (GFRa4)；IL13Ra2；Fc受體樣蛋白5 (FCRL5)；及免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。

在一些實施例中，CAR靶向CD19、CD20、CD22、BCMA、CD37、間皮素、PSMA、PSCA、Tn-MUC1、EGFR、EGFRvIII、c-Met、HER1、HER2、CD33、CD133、GD2、GPC2、GPC3、NKG2D、KRAS或WT1。在一些實施例中，抗原結合域特異性結合選自由以下組成之群的目標抗原：CD4、CD19、CD20、CD22、BCMA、CD123、CD133、EGFR、EGFRvIII、間皮素、Her2、PSMA、CEA、GD2、IL-13Ra2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、GPC2、TnMuc1、CIAX、LI-CAM、CA 125、CTAG1B、黏蛋白1及葉酸受體-α。 2. 跨膜域

由本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體編碼之CAR可經設計以包含將CAR之抗原結合域連接至胞內域之跨膜域。個體CAR之跨膜域為能夠跨越細胞(例如免疫細胞或其前驅體)之質膜的區域。跨膜域用於插入至細胞膜，例如真核細胞膜中。在一些實施例中，跨膜域插入CAR之抗原結合域與胞內域之間。

在一個實施例中，跨膜域天然地與CAR中之一或多個域締合。在一些情況下，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜域，以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域，從而使與受體複合物中之其他元件的相互作用降至最低。

在一些實施例中，跨膜域可來源於天然或合成來源。當來源為天然來源時，該域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在來源為合成的情況下，跨膜域可為促進CAR插入至細胞膜中之任何人工序列，例如人工疏水性序列。在一些實施例中，本發明中特定使用之跨膜域包括但不限於來源於以下之跨膜域：(T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD2、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134 (OX-40)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、鐸樣受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9及殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)。

在一些實施例中，跨膜域包含選自由以下組成之群的蛋白質之至少一個跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD2、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134 (OX-40)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、鐸樣受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9及殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)。

在一些實施例中，跨膜域可為合成的。在一些實施例中，合成性跨膜域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在某些例示性實施例中，將在合成跨膜域之各端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。

本文所描述之跨膜域可與本文所描述之任何抗原結合域、本文所描述之任何協同刺激信號傳導域、本文所描述之任何胞內信號傳導域或本文所描述之任何可包括於個體CAR中之其他域組合。

在一個實施例中，跨膜域包含CD8α跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含有包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列的CD8α跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 34中所列之核苷酸序列。

在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域。在一些實施例中，CAR包含有包含SEQ ID NO: 37中所列之胺基酸序列的CD28跨膜域。在一些實施例中，CD28跨膜域包含SEQ ID NO: 38中所列之核苷酸序列。

跨膜及/或鉸鏈域之可容許變化將為熟習此項技術者已知，同時維持其預期功能。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 33及/或37中所列之胺基酸序列中之任一者具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域由一核酸序列編碼，該核酸序列包含與SEQ ID NO: 34及/或38中所列之核苷酸序列中之任一者具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的核苷酸序列。跨膜域可與任何鉸鏈域組合及/或可包含本文所描述之一或多個跨膜域。

在一些實施例中，CAR包含：任何跨膜域，其係選自由以下之跨膜域組成之群：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD2、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134 (OX-40)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、鐸樣受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9及殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)；本文所描述之任何協同刺激信號傳導域及任何胞內域或細胞質域，或本文所描述之任何可包括於CAR中之其他域及視情況存在之鉸鏈域。

在一些實施例中，CAR在CAR之胞外域與跨膜域之間或在CAR之胞內域與跨膜域之間進一步包含間隔域。在一些實施例中，間隔域可為短寡肽或多肽連接子，例如長度在約2與約10個胺基酸之間。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸二聯體提供個體CAR之跨膜域與胞內信號傳導域之間的尤其適合之連接子。因此，本發明之CAR可包含本文所描述之跨膜域、鉸鏈域或間隔域中之任一者。 3. 鉸鏈域

在一些實施例中，由本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體編碼之CAR進一步包含鉸鏈區。CAR之鉸鏈區為位於抗原結合域與跨膜域之間的親水性區。在一些實施例中，鉸鏈域促進CAR之適當蛋白質摺疊。在一些實施例中，鉸鏈域為CAR之視情況存在之組分。在一些實施例中，鉸鏈域包含選自以下之域：抗體之Fc片段、抗體之鉸鏈區、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工鉸鏈序列或其組合。在一些實施例中，鉸鏈域係選自(但不限於) CD8a鉸鏈、由可小至三個甘胺酸(Gly)之多肽製成的人工鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈區為來源於受體之鉸鏈區多肽。在一些實施例中，鉸鏈區為CD8衍生之鉸鏈區)。在一個實施例中，鉸鏈域包含來源於人類CD8之胺基酸序列或其變異體。在一些實施例中，個體CAR包含CD8α鉸鏈域及CD8α跨膜域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含SEQ ID NO: 36中所列之核苷酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈域包含與SEQ ID NO 35中所列之胺基酸序列中之任一者具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈域由一核酸序列編碼，該核酸序列包含與SEQ ID NO: 36中所列之核苷酸序列中之任一者具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的核苷酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈域將抗原結合域連接至跨膜域，該跨膜域連接至胞內域。在例示性實施例中，鉸鏈區能夠支持抗原結合域識別目標細胞上之目標抗原且與其結合。在一些實施例中，鉸鏈區為可撓性域，因此允許抗原結合域具有最佳識別細胞(諸如腫瘤細胞)上之目標抗原之特異性結構及密度的結構。鉸鏈區的可撓性准許鉸鏈區採用許多不同構形。

在一些實施例中，鉸鏈域之長度選自約4至約50個、約4至約10個、約10至約15個、約15至約20個、約20至約25個、約25至約30個、約30至約40個或約40至約50個胺基酸。適合的鉸鏈區可容易地選擇且可具有多種適合長度中之任一者，諸如約1個胺基酸(例如甘胺酸(Gly)至約20個胺基酸、約2至約15、約3至約12個胺基酸，包括約4至約10、約5至約9、約6至約8或約7至約8個胺基酸，且可為約1、約2、約3、約4、約5、約6或約7個胺基酸。

在一些實施例中，胺基酸係甘胺酸(Gly)。可使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly及Ser均相對非結構化，且因此可充當各組分之間的中性繫鏈。可使用甘胺酸聚合物；甘胺酸甚至比丙胺酸進入明顯更多的φ-ψ空間，且所受限制遠少於具有較長側鏈之殘基。在一些實施例中，鉸鏈區包含甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物。在一些實施例中，鉸鏈區包含選自由(GS)n、(GSGGS)n及(GGGS)n組成之群的甘胺酸-絲胺酸聚合物，其中n為至少一之整數)。在一些實施例中，鉸鏈域包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG (SEQ ID NO: 24)、GGSGG (SEQ ID NO: 25)、GSGSG (SEQ ID NO: 26)、GSGGG (SEQ ID NO: 27)、GGGSG (SEQ ID NO: 28)、GSSSG (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，鉸鏈區包含甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物或此項技術中已知之其他可撓性連接子。

在一些實施例中，鉸鏈區為免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列為此項技術中已知的。在一些實施例中，免疫球蛋白鉸鏈域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：DKTHT (SEQ ID NO: 39)；CPPC (SEQ ID NO: 40)；CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO: 41) (參見例如Glaser等人, J. Biol. Chem. (2005) 280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 42)；KSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 43)；KCCVDCP (SEQ ID NO: 44)；KYGPPCP (SEQ ID NO: 45)；EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 46) (人類IgG1鉸鏈)；ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 47) (人類IgG2鉸鏈)；ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 48) (人類IgG3鉸鏈)；SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO: 49) (人類IgG4鉸鏈)；及其類似序列。

在一些實施例中，鉸鏈區為免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈選自IgG (諸如人類IgG4)之CH1及CH3域。在一些實施例中，鉸鏈域包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈域之胺基酸序列。在一些實施例中，該鉸鏈區相比於野生型(天然存在之)鉸鏈區，可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。在一些實施例中，人類IgG1鉸鏈之位置229處之組胺酸(His229)經酪胺酸(Tyr)取代。在一些實施例中，鉸鏈域包含胺基酸序列EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO: 46)。 4. 胞內域

由本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體編碼之CAR亦包含胞內域。CAR之胞內域或者細胞質域負責表現CAR之細胞的活化。因此，術語「胞內域」意欲包括足以轉導活化信號之胞內域之任何部分。在一個實施例中，胞內域包括負責效應功能之域。術語「效應功能」係指細胞之特化功能。T細胞之效應功能例如可為溶胞活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。在一個實施例中，CAR之胞內域包括負責信號活化及/或轉導之域。胞內域可經由蛋白質-蛋白質相互作用、生物化學改變或其他反應傳輸信號活化以改變細胞代謝、形狀、基因表現或對嵌合胞內信號傳導分子活化之其他細胞反應。

用於本發明之胞內域之實例包括但不限於T細胞受體(TCR)之細胞質部分，及任何協同刺激分子，或在抗原受體接合之後與TCR協同作用以在T細胞中起始信號轉導的任何分子，以及此等元件之任何衍生物或變異體及具有相同功能性能力之任何合成序列。

在某些實施例中，胞內域包含胞內信號傳導域。胞內域的實例包括一或多個分子或受體之片段或域，該一或多個分子或受體包括但不限於TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、共同FcRγ、FcRβ (Fc ε Rib)、CD79a、CD79b、Fc γ R11a、DAP10、DAP12、T細胞受體(TCR)、CD2、CD8、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白質、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配位體、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、鐸樣受體1 (TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)；本文所描述之其他協同刺激分子、其任何衍生物、變異體或片段；協同刺激分子之具有相同功能能力的任何合成序列；及其任何組合。

在一些實施例中，胞內信號傳導域包含選自由以下之細胞質信號傳導域組成之群的胞內域：人類CD2、CD3ζ鏈(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受體之胞質尾區、攜有細胞質受體之基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d或其變異體。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導域。

胞內域之額外實例包括但不限於若干類型之各種其他免疫信號傳導受體的胞內信號傳導域，包括但不限於：第一代、第二代及第三代T細胞信號傳導蛋白，包括CD3、B7家族協同刺激及腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體。另外，胞內信號傳導域可包括NK及NKT細胞使用之信號傳導域，諸如NKp30 (B7-H6)及DAP 12、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10及CD3z之信號傳導域。

適用於本發明之CAR的胞內信號傳導域包括轉導回應於CAR活化(亦即藉由抗原及二聚合劑活化)之信號的任何所需信號傳導域。在一些實施例中，獨特且可偵測之信號例如包含細胞增產一或多種細胞介素；目標基因轉錄變化；蛋白質活性變化；細胞行為變化(例如細胞死亡)；細胞增殖；細胞分化；細胞存活；及/或調節細胞信號傳導反應。在一些實施例中，胞內信號傳導域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一些實施例中，胞內信號傳導域不共價連接至膜結合CAR，而是在細胞質中擴散。

適用於本發明之CAR的胞內信號傳導域包括含基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)的胞內信號傳導多肽。在一些實施例中，胞內信號傳導域包括至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個下文所描述之ITAM模體。在一些實施例中，ITAM模體在胞內信號傳導域中重複兩次，其中ITAM模體之第一及第二實例經6至8個胺基酸彼此分隔開。在一個實施例中，個體CAR之胞內信號傳導域包含3個ITAM模體。在一些實施例中，胞內信號傳導域包括含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)的人類免疫球蛋白受體之信號傳導域，諸如(但不限於) FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5。

適合的胞內信號傳導域可為來源於含有ITAM模體之多肽的含ITAM模體之部分。舉例而言，適合的胞內信號傳導域可為來自任何含ITAM模體之蛋白質的含ITAM之模體域。因此，適合之胞內信號傳導域無需含有衍生其之整個蛋白質之完整序列。適合的含ITAM模體之多肽之實例包括但不限於：DAP12、FCER1G (Fcε受體I γ鏈)、CD3D (CD3δ)、CD3E (CD3ε)、CD3G (CD3γ)、CD3Z (CD3ζ)及CD79A (抗原受體複合物相關蛋白α鏈)。

在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於DAP12 (亦稱為TYROBP；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX活化蛋白12；KAR相關蛋白；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白；殺手活化受體相關蛋白；殺手活化受體相關之蛋白質等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於FCER1G (亦稱為FCRG；Fcε受體I γ鏈；Fc受體γ鏈；fc-ε RI-γ；fcRγ；fceR1γ；高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ；免疫球蛋白E受體、高親和力γ鏈等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於T細胞表面糖蛋白CD3δ鏈(亦稱為CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原、δ次單元；CD3δ；CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合物)；OKT3、δ鏈；T細胞受體T3δ鏈；T細胞表面糖蛋白CD3δ鏈等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於T細胞表面糖蛋白CD3ε鏈(亦稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4ε鏈、T細胞表面糖蛋白CD3ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於T細胞表面糖蛋白CD3γ鏈(亦稱為CD3G、T細胞受體T3γ鏈、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3複合物)等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈(亦稱為CD3Z、T細胞受體T3ζ鏈、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一個實施例中，胞內信號傳導域來源於CD79A (亦稱為B細胞抗原受體複合物相關蛋白α鏈；CD79a抗原(免疫球蛋白相關α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜結合免疫球蛋白相關蛋白；表面IgM相關蛋白；等)。在一個實施例中，適用於本發明之CAR之胞內信號傳導域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一個實施例中，適用於本發明之個體CAR的胞內信號傳導域包括ZAP70多肽。在一些實施例中，胞內信號傳導域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d之細胞質信號傳導域。在一個實施例中，CAR中之胞內信號傳導域包括人類CD3ζ之細胞質信號傳導域。

雖然通常可使用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，無需使用整條鏈。至於使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，此類截短部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。胞內信號傳導域包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域之任何截短部分。

本文所描述之胞內信號傳導域可與本文所描述之任何協同刺激信號傳導域、本文所描述之任何抗原結合域、本文所描述之任何跨膜域或本文所描述之任何可包括於CAR中之其他域組合。在一些實施例中，CAR之胞內域包含雙信號傳導域。雙信號傳導域可包括來自本文所描述之任何分子的片段或域。在一些實施例中，胞內域包含4-1BB協同刺激域及CD3ζ信號傳導域；CD28協同刺激域及CD3ζ信號傳導域；CD2協同刺激域及CD3ζ信號傳導域。在一些實施例中，CAR之胞內域包括協同刺激分子之任何部分，諸如至少一個來自CD3、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、T細胞受體(TCR)、其任何衍生物或變異體、其任何具有相同功能性能力之合成序列及其任何組合的信號傳導域。

此外，適用於個體CAR之變異胞內信號傳導域為此項技術中已知的。YMFM模體見於ICOS中且為募集PI3K之p85α及p50α次單元兩者之SH2結合模體，從而引起AKT信號傳導增強。在一個實施例中，可產生CD28胞內域變異體以包含YMFM模體。

在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含CD3ζ胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含可由核酸序列編碼的SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51中所列之胺基酸序列，該核酸序列包含分別SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53中所列之核苷酸序列。

胞內域之可容許變化將為熟習此項技術者已知，同時維持比活性。在一些實施例中，胞內域包含與SEQ ID NO: 50或51中所列之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，胞內域由核酸序列編碼，該核酸序列包含與SEQ ID NO: 52或53中所列之核苷酸序列中之任一者具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之核苷酸序列。 5. 協同刺激域

在一些實施例中，胞內域包含協同刺激信號傳導域及胞內信號傳導。在某些實施例中，胞內域包含協同刺激信號傳導域。在一個實施例中，CAR之胞內域包含選自由以下之信號傳導域的一部分組成之群的協同刺激信號傳導域：TNFR超家族、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS (CD278)、NKG2C、B7-H3 (CD276)中之蛋白質，以及來源於殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之胞內域、其任何衍生物或變異體、其任何具有相同功能性能力之合成序列及其任何組合。

在一些實施例中，協同刺激域包含選自由以下組成之群的蛋白質之一或多個協同刺激域：TNFR超家族、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS (CD278)、NKG2C、B7-H3 (CD276)中之蛋白質，以及來源於殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之胞內域或其變異體。在一些實施例中，協同刺激域包含選自由以下組成之群的蛋白質之一或多個協同刺激域：CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、CD2或其組合中之蛋白質。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域包含4-1BB協同刺激域。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域包含CD2協同刺激域。在一些實施例中，協同刺激信號傳導域包含CD28協同刺激域。

在一些實施例中，協同刺激域包含與SEQ ID NO: 54、57、59、61、64、66、68或70中所列之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內域由核酸序列編碼，該核酸序列包含與SEQ ID NO: 55、56、58、60、62、63、65、67、69或71中所列之核苷酸序列中之任一者具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之核苷酸序列。

在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含ICOS協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含CD28協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含CD28 YMFM變異協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含CD27協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個實施例中，個體CAR之胞內域包含OX40協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個例示性實施例中，個體CAR之胞內域包含4-1BB協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。在一個例示性實施例中，個體CAR之胞內域包含CD2協同刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。 B. 額外抗原結合多肽

在一些實施例中，經修飾之T細胞表現抗原結合多肽、細胞表面受體配位體或結合於腫瘤抗原之多肽。在一些情況下，抗原結合域包含識別腫瘤細胞上表現之細胞表面蛋白質或受體的抗體。在一些情況下，抗原結合域包含識別腫瘤抗原之抗體。在一些情況下，抗原結合域包含全長抗體或其抗原結合片段、Fab、F(ab)2、單特異性Fab2、雙特異性Fab2、三特異性Fab2、單鏈可變片段(scFv)、雙功能抗體、三功能抗體、微型抗體、V-NAR或V hH。 C. 細胞表面受體配位體

在一些實施例中，本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體進一步包含編碼細胞表面受體配位體之核酸。在一些情況下，配位體結合於腫瘤細胞上表現之細胞表面受體。在一些情況下，配位體包含結合於細胞表面受體之野生型蛋白質或其變異體。在一些情況下，配位體包含結合於細胞表面受體之全長蛋白質或其功能片段。在一些情況下，與蛋白質之全長型式相比，功能片段長度之長度佔約90%、約80%、約70%、約60%、約50%或約40%，但保持與細胞表面受體結合。在一些情況下，配位體為與細胞表面受體結合之重新經工程改造之蛋白質。例示性配位體包括但不限於表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)或Wnt3A。 D. 腫瘤抗原

在一些實施例中，本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體進一步包含編碼結合至腫瘤抗原之多肽的核酸。在一些實施例中，腫瘤抗原與惡性血液病相關。例示性腫瘤抗原包括但不限於CD19、CD20、CD22、CD33/IL3Ra、ROR1、間皮素、c-Met、PSMA、PSCA、葉酸受體α、葉酸受體β、EGFRvIII、GPC2、Tn-MUC1、GDNF家族受體α-4 (GFRa4)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)及IL13Ra2。在一些情況下，腫瘤抗原包含CD19、CD20、CD22、BCMA、CD37、間皮素、PSMA、PSCA、Tn-MUC1、EGFR、EGFRvIII、c-Met、HER1、HER2、CD33、CD133、GD2、GPC2、GPC3、NKG2D、KRAS或WT1。在一些情況下，多肽為腫瘤抗原之配位體(例如與腫瘤抗原結合之全長蛋白質)、其功能片段或與腫瘤抗原結合之重新經工程改造之配位體。在一些情況下，多肽為結合於腫瘤抗原之抗體。 E. 經工程改造之 T 細胞受體

在一些實施例中，本文所描述之CAR之抗原結合域可移植至T細胞受體(「TCR」)鏈(例如TCR α或TCR β鏈)之一或多個恆定域，以產生嵌合TCR。嵌合TCR可在抗原結合時經由TCR複合物進行信號傳導。舉例而言，本文所揭示之scFv可接枝至TCR鏈之恆定域或至少一部分胞外恆定域、跨膜域。作為另一實例，抗體片段，例如本文所描述之VL域，可移植至TCR α鏈之恆定域。此類嵌合TCR可例如藉由此項技術中已知之方法產生(例如Aggen等人, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。 F. 開關受體及顯性負受體

在一個態樣中，本發明之慢病毒載體或反轉錄病毒載體進一步包含編碼顯性負受體、開關受體或其組合之核酸。在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含嵌合抗原受體(CAR)及/或顯性負受體。在一些實施例中，慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含CAR及/或開關受體。在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含經工程改造之TCR及開關受體。在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含經工程改造之TCR及顯性負受體。在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含KIR及開關受體。在一些實施例中，本文所描述之慢病毒載體或反轉錄病毒載體進一步包含KIR及顯性負受體。 1. 開關受體

本發明提供包含CAR或外源性TCR及/或開關受體的工程改造修飾之飾免疫細胞的快速且高效的製造製程。在一些實施例中，CAR、TCR及/或開關受體由一或多種核酸編碼。在一些實施例中，本文所揭示之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含一或多種編碼CAR、TCR及/或開關受體之核酸序列。在一些實施例中，編碼CAR之核酸序列可操作地連接於編碼開關受體之核酸序列。在一些實施例中，開關受體可增強CAR或CAR表現細胞之效率。

腫瘤細胞產生用以保護其免受免疫識別及消除之免疫抑制微環境。此免疫抑制微環境可限制免疫抑制療法，諸如CAR-T或TCR-T細胞療法之有效性。舉例而言，分泌之細胞介素轉型生長因子β (TGF β)直接抑制細胞毒性T細胞之功能且另外誘導調節性T細胞形成以進一步抑制免疫反應。在前列腺癌之情形下，由TGFβ引起之T細胞免疫抑制先前已被證實。為了減少TGF對免疫細胞之免疫抑制作用，免疫細胞可經修飾以表現經工程改造之TGFβR，該TGFβR包含融合至例如介白素-12受體(IL12R)之胞內信號傳導域的TGFβR之胞外配位體結合域(TGFβR-IL12R)。因此，包含開關受體之經修飾之免疫細胞可在經修飾之免疫細胞之微環境中結合負信號轉導分子，且將可在經修飾之免疫細胞上之抑制性分子之負信號轉導信號轉化為正信號，刺激經修飾之免疫細胞。本發明之開關受體可經設計以減少負信號轉導分子之作用，或藉助於包含與正信號相關聯之胞內域將負信號轉化為正信號。

依本文所用，術語「開關受體」係指經設計以減少負信號轉導分子對本發明之經修飾之免疫細胞之作用的分子。開關受體包含：來源於與負信號相關之第一多肽的第一域(遏制或抑制細胞或T細胞活化之信號轉導)；及來源於與正信號相關之第二多肽的第二域(刺激細胞或T細胞之信號轉導信號)。在一些實施例中，與負信號相關之蛋白質係選自由以下組成之群：CTLA4、PD-1、TGFβRII、BTLA、VSIG3、VSIG8及TIM-3。在一些實施例中，與正信號相關之蛋白質係選自由以下組成之群：CD28、4-1BB、IL12Rβ1、IL12Rβ2、CD2、ICOS及CD27。

在一個實施例中，第一域包含與負信號相關之第一多肽之胞外域的至少一部分，且第二域包含與正信號相關之第二多肽之胞內域的至少一部分。因此，開關受體包含與負信號相關之胞外域，該負信號融合至與正信號相關之胞內域。在一些實施例中，開關受體包含與負信號相關之信號傳導蛋白的胞外域、跨膜域及與正信號相關之信號傳導蛋白的胞內域。在一些實施例中，開關受體之跨膜域係選自與負信號相關之蛋白質之跨膜或與該負信號相關之蛋白質之跨膜域。在一些實施例中，開關受體之跨膜域係選自蛋白質之跨膜域，該蛋白質係選自由以下組成之群：CTLA4、PD-1、VSIG3、VSIG8、TGFβRII、BTLA、TIM-3、CD28、4-1BB、IL12Rβ1、IL12Rβ2、CD2、ICOS及CD27。

在一些實施例中，開關受體係選自由以下組成之群：PD-1-CD28、PD-1A132L-CD28、PD-1-CD27、PD-1A132L-CD27、PD-1-4-1BB、PD-1A132L-4-1BB、PD-1-ICOS、PD-1A132L-ICOS、PD-1-IL12Rβ1、PD-1A132L-IL12Rβ1、PD-1-IL12Rβ2、PD-1A132L-IL12Rβ2、VSIG3-CD28、VSIG8-CD28、VSIG3-CD27、VSIG8-CD27、VSIG3-4-1BB、VSIG8-4-1BB、VSIG3-ICOS、VSIG8-ICOS、VSIG3-IL12Rβ1、VSIG8-IL12Rβ1、VSIG3-IL12Rβ2、VSIG8-IL12Rβ2、TGFβRII-CD27、TGFβRII-CD28、TGFβRII-4-1BB、TGFβRII-ICOS、TGFβRII-IL12Rβ1及TGFβRII-IL12Rβ2。 2. 顯性負受體

本發明提供一種包含CAR或外源性TCR及顯性負受體的工程改造修飾之免疫細胞的快速且高效的製造製程。在一些實施例中，CAR、TCR及/或開關受體由一或多種核酸編碼，在一些實施例中，本文揭示之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含一或多種編碼CAR、TCR及/或顯性負受體之核酸序列。在一些實施例中，編碼CAR之核酸序列可操作地連接至編碼顯性負受體之核酸序列。在一些實施例中，顯性負受體增強CAR或CAR表現細胞之效率。

依本文所用，術語「顯性負受體」係指經設計以減少負信號轉導分子之作用(例如負信號轉導分子對本發明之經修飾之免疫細胞的作用)的分子。顯性負受體為與負信號相關之野生型蛋白質的截短變異體。在一些實施例中，與負信號相關之蛋白質係選自由以下組成之群：CTLA4、PD-1、BTLA、TGFβRII、VSIG3、VSIG8及TIM-3。

本發明之顯性負受體可藉助於與負信號相關之胞外域結合負信號轉導分子(例如，CTLA4、PD-1、BTLA、TGFβRII、VSIG3、VSIG8及TIM-3)，可減少負信號轉導分子之作用。舉例而言，包含顯性負受體之經修飾之免疫細胞可在經修飾之免疫細胞之微環境中結合負信號轉導分子，但此結合將不轉導細胞內部之此信號以改變經修飾之T細胞之活性。實際上，結合螯合負信號轉導分子且防止其與內源性受體/配位體之結合，由此減少負信號轉導分子對經修飾之免疫細胞之作用。因此，為了減少某些分子之免疫抑制作用，免疫細胞可經修飾以表現顯性負受體，其為顯性負受體。

在一些實施例中，顯性負受體包含與負信號相關的野生型蛋白質之截短變異體。在一些實施例中，顯性負受體包含與負信號相關的野生型蛋白質之變異體，該變異體包含胞外域、跨膜域且實質上不具有胞內信號傳導域。在一些實施例中，顯性負受體包含與負信號相關之信號傳導蛋白的胞外域及跨膜域。在一些實施例中，顯性負受體為PD-1、CTLA4、BTLA、TGFβRII、VSIG3、VSIG8或TIM-3顯性負受體。在一些實施例中，顯性負受體為PD-1或TGFβRII顯性負受體。顯性負受體之可容許變化將為熟習此項技術者已知，同時維持其預期生物活性(例如當在細胞中表現時阻斷負信號及/或螯合具有負信號之分子)。 G. 趨化介素及細胞介素作為免疫增強因子改善適應性

本發明提供工程改造修飾之免疫細胞的快速且高效的製造製程，該等免疫細胞包含CAR或外源性TCR及/或改善經工程改造之免疫細胞之適應性的免疫增強因子。在一些實施例中，免疫增強因子或其功能衍生物為增強免疫細胞功能之多肽。

在一些實施例中，增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物係選自趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、介白素-21 (IL-21)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、CCL21、CCL19或其組合。在一些實施例中，趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、IL-18R、C-C模體趨化介素配位體21 (CCL21)或C-C模體趨化介素配位體19 (CCL19)為免疫功能增強因子，改善所主張之經修飾之免疫細胞之適應性。不希望受理論所束縛，向本發明之經修飾之免疫細胞添加編碼趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、IL-18R、CCL21或CCL19之核酸增強了經修飾之免疫細胞之免疫誘導作用及抗腫瘤活性。 1. T 細胞浸潤

不希望受理論所束縛，介白素及趨化介素可促進實體腫瘤中之T細胞激活及/或T細胞浸潤增加。舉例而言，在具有較低T細胞浸潤之小形隨體穩定結腸直腸癌(CRC)中，IL-15促進T細胞激活。在一些實施例中，CAR與趨化介素/介白素受體複合物之組合促進T細胞激活。此外，IL-15可誘導NK細胞浸潤。在一些實施例中，對IL-15/IL-15RA複合物之反應可引起NK細胞浸潤。在某些實施例中，本文所描述之經修飾之免疫細胞進一步包含IL-15/IL-15Ra複合物。在一些實施例中，IL-15/IL-15Ra複合物係選自NIZ985 (Novartis)、ATL-803 (Altor)或CYP0150 (Cytune)。在一些實施例中，IL-15/IL-15RA複合物為NIZ985。在一些實施例中，IL-15刺激自然殺手細胞以消除(例如殺死)胰臟癌細胞。在一些實施例中，對本文所描述的進一步包含IL-15/IL-15Ra之經修飾之免疫細胞之治療反應與結腸直腸癌動物模型中之自然殺手細胞浸潤相關。在一些實施例中，IL-15/IL-15Ra複合物包含與可溶形式之人類IL-15Ra複合之人類IL-15。複合物可包含與可溶形式之IL-15Ra共價或非共價結合的IL-15。在一特定實施例中，人類IL-15與IL-15Ra之可溶形式非共價結合。

CAR T細胞療法對實體腫瘤無效部分起因於實體腫瘤中免疫細胞及CAR T細胞之有限募集及積累。一種解決此問題之方法為工程改造模擬T區纖維母細胞網狀細胞(FRC)功能之CAR T細胞。淋巴結負責偵測病原體及免疫原。T區含有三種類型之細胞：(1)先天性免疫細胞，諸如樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞及顆粒球；(2)適應性免疫細胞，諸如CD4及CD8淋巴球，及(3)基質細胞(FRC)。此等細胞協作以藉由促進CD4 T細胞之活化、分化及成熟產生對病原體之有效免疫反應。FRC尤其重要，此係因為其形成允許樹突狀細胞及T細胞在整個淋巴結中行進且吸引B細胞之網路。尤其，FRC提供以下網路：(i)藉由釋放兩種趨化介素(CCL21及CCL19)將原生T細胞、B細胞及樹突狀細胞募集至淋巴結；(ii)藉由分泌作為尤其針對原生T細胞之存活因子的IL-7使T細胞存活；及(iii) CD4 T細胞朝向生發中心(GC；淋巴結之不同部分)運輸。因此，具有外源性CCL21或CCL19及IL-7之CAR將增強T細胞、B細胞及樹突狀細胞至實體腫瘤之募集。在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法工程改造的經修飾之免疫細胞包含慢病毒載體或反轉錄病毒載體，該載體包含編碼免疫功能增強因子及CAR之核酸。在該實施例中，編碼免疫功能增強因子之核酸係編碼介白素-7之核酸及編碼CCL19或CCL21之核酸。

在一些實施例中，免疫功能增強因子(亦即趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、CCL21或CCL19)之核酸融合至CAR。在一些實施例中，趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、CCL21或CCL19經由自裂解肽，諸如P2A、T2A、E2A或F2A融合至CAR。 2. T 細胞激活 (IL-18)

本發明提供包含CAR或外源性TCR及/或增強T細胞激活之多肽(亦即T細胞激活多肽)之工程改造修飾之免疫細胞的快速且高效的製造製程。在一些實施例中，增強T細胞激活(ETP)之多肽係選自由以下組成之群：協同刺激分子、可溶細胞介素、參與抗原呈現之多肽、參與運輸及/或遷移之多肽或參與樹突狀細胞靶向之多肽，或其功能片段或變異體。在一實施例中，T細胞激活協同刺激分子係選自由以下組成之群：CD70、CD83、CD80、CD86、CD40、CD154、CD137L (4-1BBL)、CD252 (OX40L)、CD275 (ICOS-L)、CD54 (ICAM-1)、CD49a、CD43、CD48、CD112 (PVRL2)、CD150 (SLAM)、CD155 (PVR)、CD265 (RANK)、CD270 (HVEM)、TL1A、CD127、IL-4R、GITR-L、CD160、CD258、TIM-4、CD153 (CD30L)、CD200R (OX2R)、CD44、其配位體以及其功能片段及變異體。在一實施例中，可溶細胞介素係選自由以下組成之群：IL-2、IL-12、IL-6、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、GM-CSF、IL-18、IL-21、IL-27以及其功能片段及變異體。在一個實施例中，參與抗原呈現之多肽係選自由CD64、MHC I、MHC II以及其功能片段及變異體組成之群。在一個實施例中，參與運輸及/或遷移之多肽係選自由CD183、CCR2、CCR6、CD50、CD197、CD58、CD62L以及其功能片段及變異體組成之群。在一實施例中，參與DC靶向之多肽係選自由TLR配位體、抗DEC-205抗體、抗DC-SIGN抗體以及其功能片段及變異體組成之群。

在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素2 (IL-2)之胺基酸序列(例如GenBank登錄號AAB46833.1)或IL-2之核酸序列(例如Genbank登錄號S82692.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素12 (IL-12)之胺基酸序列(例如Genbank登錄號AAD16432.1)或IL-12之核酸序列(例如GenBank登錄號AF101062.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素6 (IL-6)之胺基酸序列(例如Genbank登錄號AAD13886.1或NP_000591.1)或IL-6之核酸序列(例如GenBank登錄號S56892.1或NM_000600.3)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素7 (IL-7)之胺基酸序列(例如Genbank登錄號AAH47698.1或NP_000871.1)或IL-7之核酸序列(例如GenBank登錄號BC047698.1或NM_000880.3)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素15 (IL-15)之胺基酸序列(例如Genbank登錄號AAU21241.1)或IL-15之核酸序列(例如GenBan登錄號AY720442.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素18 (IL-18)之胺基酸序列(例如GenBank登錄號AAK95950.1)或IL-18之核酸序列(例如GenBank登錄號AY044641.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含介白素21 (IL-21)之胺基酸序列(例如Genbank登錄號AAG29348.1)或IL-21之核酸序列(例如GenBank登錄號AF254069.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽包含GM-CSF之胺基酸序列(例如GenBank登錄號AAA52578.1)或GM-CSF之核酸序列(例如Genbank登錄號Ml 1220.1)。在一些實施例中，T細胞激活多肽為IL-18。

在一些實施例中，一或多個CAR之表現實質上不影響裝甲CAR T細胞(armored CAR T cell)中之T細胞激活多肽之表現量。在一些實施例中，CAR包含結合抗原之抗原結合域，且T細胞激活多肽之表現實質上不影響一或多個CAR在裝甲CAR T細胞中之表現量或細胞殺死功能。

在一些實施例中，本文所揭示之慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含且遞送超過一種T細胞激活多肽。在一個實施例中，慢病毒載體或反轉錄病毒載體包含2、3、4、5、6個或更多個編碼一或多種T細胞激活多肽之核酸；且進一步包含編碼CAR之核酸序列。在一些實施例中，同時遞送一或多種T細胞激活多肽不影響(例如實質上降低或實質上抑制)經共表現之CAR在裝甲CAR T細胞或表現CAR之裝甲免疫細胞中之表現或活性。在一些實施例中，CAR不影響(例如實質上降低或實質上抑制)經共表現之T細胞激活多肽之表現或活性。 V. CAR T 細胞

本發明之另一態樣提供經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，其係藉由本文所描述之方法經工程改造。

本發明之另一態樣提供包含本文所描述之慢病毒載體的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞。

本發明之另一態樣提供包含本文所描述之慢病毒載體的經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。在一些實施例中，本文所描述之經工程改造經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞係用於產生所關注蛋白質。在本文所描述之經工程改造經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞之一些實施例中，所關注蛋白質可選自由以下組成之群：工業蛋白或治療蛋白。在一些實施例中，所關注蛋白質係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。 VI. 組合物

本發明之一個態樣提供一種組合物，其包含藉由本文所描述之方法產生之經修飾之細胞、經修飾之淋巴球、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞。本發明之另一態樣提供一種組合物，其包含藉由本文所描述之方法產生之經修飾之淋巴球群、經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。本發明之另一態樣提供一種包含本文所描述之慢病毒載體的組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施例中，本文所描述之組合物用於藥劑中，用於治療本文所描述之疾病(例如，癌症、任何惡性病、涉及表現本文所描述之腫瘤抗原之細胞或組織的自體免疫疾病)。在一些實施例中，本文所描述之組合物用於治療方法中，治療本文所描述之疾病(例如，癌症、任何惡性病、涉及表現本文中所描述之腫瘤抗原之細胞或組織的自體免疫疾病)。在一些實施例中，本文提供包含表現CAR之細胞，例如複數個表現CAR之細胞的醫藥組合物，其藉由本文所描述之製造製程(例如本文所描述之細胞介素製程或活化製程)製成。 VII. 治療方法

在一個態樣中，本發明提供一種用於授受性細胞轉移療法之方法，其包含向有需要之個體投與藉由本文所描述之方法工程改造之經修飾之免疫細胞。在一些實施例中，本文揭示一種治療個體之疾病或病況的方法，其包含向個體投與本文所描述之經修飾之T細胞群，例如本文所描述之經修飾未經刺激之T細胞群或經修飾刺激之T細胞群。在一些實施例中，本發明包括一種治療個體之疾病或病況的方法，其包含向有需要之個體投與包含本文所描述之經修飾之免疫細胞的組合物。

本發明之一個態樣提供一種治療個體之疾病或病況的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，由此治療個體之疾病或病況。治療個體之疾病或病況之方法亦可包含向有需要之個體投與藉由本文所描述之方法製成之治療有效量之經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。治療個體之疾病或病況之方法亦可包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之組合物。

在一些實施例中，經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞對個體而言為自體的。在一些實施例中，經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞對個體而言為同種異體的；在一些實施例中，經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞對個體而言為異種的。

在一些實施例中，經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞對個體而言為同種異體的。在一些實施例中，個體為人類。 A. 疾病及病況

本發明之一個態樣提供一種疾病或病況之授受性細胞轉移療法方法。在一些實施例中，疾病或病況可選自由以下組成之群：癌症；自體免疫疾病，狼瘡；神經退化性疾病或病況，阿茲海默氏症、多發性硬化症；感染性疾病；纖維化病況，肝纖維化、肺纖維化、局部缺血後纖維化；遺傳病症，鐮狀細胞貧血、血友病及/或β-地中海貧血症。在一些實施例中，疾病或病況係選自癌症、任何惡性病、涉及表現本文中所描述之腫瘤抗原之細胞或組織的自體免疫疾病。

在一些實施例中，該疾病或病況係選自由以下組成之群：病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、癌症、惡性病、非癌性病況、自體免疫疾病、纖維化疾病、阿茲海默氏症、蛋白質缺乏病況及因子VIII缺乏症。

在一些實施例中，疾病可為選自由以下組成之群的癌症：乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、腎細胞癌、腎臟癌、間皮瘤、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、肺腺癌、膽囊癌、結腸癌、子宮頸鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、梅克爾細胞癌、肝細胞癌、食道癌、腦癌、黑色素瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、尿道上皮癌、胃癌及其任何組合。

在一些實施例中，癌症為選自由以下組成之群的實體癌症：間皮瘤、惡性胸膜間皮瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌、大細胞肺癌、胰臟癌、胰管腺癌、食道腺癌、乳癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黑色素瘤、腎癌、肝癌、腦癌、胸腺瘤、肉瘤、癌瘤、子宮癌、腎臟癌、胃腸癌、尿道上皮癌、咽癌、頭頸癌、直腸癌、食道癌或膀胱癌或其癌轉移。

在一些實施例中，癌症為血液癌，例如選自：慢性淋巴球性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴白血病(ALL)、霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitf s lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性發炎相關DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性腫瘤、濾泡性淋巴瘤、兒童濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤(結外黏膜相關淋巴組織邊緣區淋巴瘤)、邊緣區淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、華氏巨球蛋白血症、脾邊緣區淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾紅髓瀰漫性小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病變型、淋巴漿細胞淋巴瘤、重鏈病、漿細胞骨髓瘤、孤立性骨漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結內邊緣區淋巴瘤、兒童結內邊緣區淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、產生自HHV8相關多中心卡斯特萊曼病之大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓白血病(AML)或無法分類之淋巴瘤。 B. 有效負載

在一些實施例中，經轉染之細胞包含CAR、經工程改造之TCR、KIR、抗原結合多肽、細胞表面受體配位體、腫瘤抗原、開關受體、顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之多肽。在一些實施例中，增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物係選自趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、介白素-21 (IL-21)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、CCL21、CCL19或其組合。在一些實施例中，趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、IL-18R、C-C模體趨化介素配位體21 (CCL21)或C-C模體趨化介素配位體19 (CCL19)為免疫功能增強因子，改善所主張之經修飾之免疫細胞之適應性。不希望受理論所束縛，向本發明之經修飾之免疫細胞添加編碼趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、IL-18R、CCL21或CCL19之核酸增強了經修飾之免疫細胞之免疫誘導作用及抗腫瘤活性。

在一些實施例中，開關受體係選自由以下組成之群：PD-1-CD28、PD-1A132L-CD28、PD-1-CD27、PD-1A132L-CD27、PD-1-4-1BB、PD-1A132L-4-1BB、PD-1-ICOS、PD-1A132L-ICOS、PD-1-IL12Rβ1、PD-1A132L-IL12Rβ1、PD-1-IL12Rβ2、PD-1A132L-IL12Rβ2、VSIG3-CD28、VSIG8-CD28、VSIG3-CD27、VSIG8-CD27、VSIG3-4-1BB、VSIG8-4-1BB、VSIG3-ICOS、VSIG8-ICOS、VSIG3-IL12Rβ1、VSIG8-IL12Rβ1、VSIG3-IL12Rβ2、VSIG8-IL12Rβ2、TGFβRII-CD27、TGFβRII-CD28、TGFβRII-4-1BB、TGFβRII-ICOS、TGFβRII-IL12Rβ1及TGFβRII-IL12Rβ2。

在一些實施例中，顯性負受體為PD-1、CTLA4、BTLA、TGFβRII、VSIG3、VSIG8或TIM-3顯性負受體。

在一些實施例中，增強免疫功能之多肽係選自由以下組成之群：趨化介素、趨化介素受體、細胞介素、細胞介素受體、IL-7、IL-7R、IL-15、IL-15R、IL-21、IL-18、IL-18R、CCL21、CCL19或其組合。 C. 組合療法

在一些實施例中，治療疾病之方法進一步包含向個體投與額外治療劑或額外療法。在一些情況下，本文所揭示之額外治療劑包含化學治療劑、免疫治療劑、靶向療法、放射線療法或其組合。說明性額外治療劑包括但不限於烷基化劑，諸如六甲蜜胺(altretamine)、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(lomustine)、美法侖(melphalan)、奧沙利鉑(oxalaplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或噻替派(thiotepa)；抗代謝物，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉賓(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、甲胺喋呤(methotrexate)或培美曲塞(pemetrexed)；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)或艾達黴素(idarubicin)；拓樸異構酶I抑制劑，諸如拓樸替康(topotecan)或伊立替康(irinotecan) (CPT-11)；拓樸異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(etoposide) (VP-16)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；有絲分裂抑制劑，諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、伊沙匹隆(ixabepilone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)或長春瑞濱(vinorelbine)；或皮質類固醇，諸如普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)或地塞米松(dexamethasone)。在一些情況下，額外治療劑包含一線療法。依本文所用，「一線療法」包含用於具有癌症之個體之初級治療。在一些情況下，癌症為原發癌。在其他情況下，癌症為轉移性或復發性癌症。在一些情況下，一線療法包含化學療法。在其他情況下，一線治療包含放射療法。熟習此項技術者將容易理解，不同的一線治療可適用於不同類型的癌症。在一些情況下，額外治療劑包含免疫檢查點抑制劑。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑包含如下抑制劑，諸如針對PD-1、PD-L1、CTLA4、PD-L2、LAG3、B7-H3、KIR、CD137、PS、TFM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA (CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的抗體或其片段(例如單株抗體、人類、人源化或嵌合抗體)、RNAi分子或小分子。例示性檢查點抑制劑包括帕博利珠單抗(pembrolizumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、曲美單抗(tremelimumab)或伊匹單抗(ipilimumab)。在一些實施例中，額外療法包含放射線療法。

在一些實施例中，額外療法包含手術。 VIII. 套組

本發明之一個態樣提供一種套組，其包含藉由本文所描述之方法工程改造之經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群。本發明之另一態樣提供一種套組，其包含本文所描述之慢病毒載體。 IX. 定義

除非另外定義，否則所有本文所使用之技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述之方法及材料的方法及材料可用於本發明的實施或測試，但本文描述適合之方法及材料。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學及重組DNA之習知技術，該等技術屬於此項技術之範圍內。參見例如Green及Sambrook編(2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版; Ausubel等人編(2015) Current Protocols in Molecular Biology系列; Methods in Enzymology系列(Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson等人(2015) PCR 1 : A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); Lundblad及Macdonald編(2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 第4版; 及Herzenberg等人編(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 第5版。

依本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，術語「一細胞」包括複數個細胞，包括其混合物，且意謂一個細胞或多於一個細胞。

依本文所用，術語「約」係指包括被用以測定數值之裝置或方法之誤差的標準差之值。當在數值名稱(例如溫度、時間、量及濃度，包括範圍)之前使用時，術語「約」表示近似值，其可變化(+)或(-) (±) 20%、15%、10%、5%、3%、2%或1%。較佳指定值之±5%，更佳±1%，且再更佳±0.1%，因為此類變化適合於執行所揭示之方法。

依本文所用，術語「活化」係指T細胞經刺激足以誘導可偵測細胞增殖的狀態。活化亦可與誘導之細胞介素產生及可偵測效應功能相關聯。術語「活化T細胞」尤其係指經歷細胞分裂之T細胞。

依本文所用，「同種異體」係指來源於與被引入物質之個體相同的物種之不同動物的任何物質。當一或多個基因座處之基因不相同時，據稱兩個或更多個個體為彼此同種異體。在一些實施例中，來自相同物種之個體的同種異體物質基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。

依本文所用，關於多肽或聚核苷酸之術語「類似物」包括任何模擬物，亦即具有其所模擬之多肽或聚核苷酸之至少一種內源性功能中的化合物。通常，可由例如1、2或3至10個或20個取代進行胺基酸取代，其限制條件為經修飾之序列保留所需活性或能力。胺基酸取代可包括使用非天然存在之類似物。

本發明中使用之蛋白質亦可具有胺基酸殘基之缺失、插入或取代，其造成緘默變化且產生功能上等效之蛋白質。可基於殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性的類似性進行有意的胺基酸取代，只要保留內源性功能即可。舉例而言，帶負電胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電胺基酸包括離胺酸及精胺酸；且具有類似親水值之不帶電極性頭基之胺基酸包括天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。可進行保守取代。

依本文所用，術語「抗體」係指特異性結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體可為源自天然來源或源自重組來源之完整免疫球蛋白且可為完整免疫球蛋白之免疫反應性部分。抗體通常為免疫球蛋白分子之四聚體。本發明中之抗體可以多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab及F(ab)2以及單鏈抗體(scFv)及人源化抗體。在一些實施例中，抗體係指對所關注抗原(例如腫瘤相關抗原)具有顯著已知特異性免疫反應活性的此類組裝(例如完整抗體分子、免疫黏附素或其變異體)。抗體及免疫球蛋白包含輕鏈及重鏈，其間具有或不具有鏈間共價鍵。脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構為相對充分理解的。

術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分且指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、scFv抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。

依本文所用，本文所使用之術語「抗體重鏈」係指以天然存在之構形存在於所有抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者。

依本文所用，術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於所有抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。α及β輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。(例如嵌合抗原受體)之抗原結合域包括抗體變異體。依本文所用，術語「抗體變異體」包括合成及工程改造形式之抗體，該等抗體經改變，因此其不天然存在，例如包含至少兩個重鏈部分但不包含兩個完整重鏈之抗體(諸如域缺失之抗體或微型抗體)；經改變以結合於兩個或更多個不同抗原或結合於單一抗原上之不同抗原決定基的多特異性形式之抗體(例如雙特異性、三特異性等)；接合scFV分子的重鏈分子及其類似抗體。另外，術語「抗體變異體」包括多價形式之抗體(例如三價、四價等)抗體，結合於同一抗原之三個、四個或更多個複本的抗體。

依本文所用，術語「抗原」或「Ag」定義為引起免疫反應的分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者應理解包括幾乎所有蛋白或肽之任何大分子可充當抗原。此外，抗原可來源於重組或基因體DNA。所屬技術領域中具有通常技術者應理解，包含編碼引發免疫反應之蛋白之核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此編碼本文所使用之術語「抗原」。此外，熟習此項技術者應理解抗原不必僅由基因之全長核苷酸序列編碼。顯而易見，本發明包括但不限於多於一種基因之部分核苷酸序列的用途及此等核苷酸序列以各種組合排列以引發所需免疫反應。此外，熟習此項技術者應理解，抗原根本無需由「基因」編碼。顯而易見，抗原可由生物樣品產生、合成或自其衍生。此生物樣品可包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞或生物流體。

依本文所用，術語「抗腫瘤作用」係指可體現為腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減小、癌轉移數目減小、預期壽命增加或與癌病況相關之各種生理症狀改善的生物作用。在一些實施例中，「抗腫瘤作用」亦可首先體現為本發明之肽、聚核苷酸、細胞及抗體預防腫瘤出現之能力。

依本文所用，術語「血球分離術」係指自動血液收集系統，在該系統中全血被分離成其組分，使得供血者僅給予患者所需的彼等血液組分。在一些實施例中，體外血球分離術製程為公認的製程，藉由該製程供體或患者之血液自供體或患者移出，且通過將所選特定組分分離出且使剩餘部分，例如藉由還血法(使用單一針頭)，返回至供體或患者循環的設備。因此，在「血球分離術樣品」之情形下指使用血球分離術獲得之樣品。

在一些實施例中，血球分離術裝置或系統為選自由以下組成之群的標準血球分離術裝置：COBE® Spectra、Spectra Optia、TRIMA ^®及SPECTRA OPTIA ^®系統(所有皆由Gambro BCT出售)、Fenwal AMICUS ^®、AMICUS™及CS-3000 ⁺™或任何等效裝置。在一些實施例中，分離裝置為AMICUS ^®。參見例如美國專利第6,027,657號。

在一些實施例中，血球分離術裝置為多功能自動血球分離術裝置。在一些實施例中，分離裝置可為在醫院或臨床設施中用於進行各種收集方案的多功能自動化設備，該等方案包括但不限於收集血液及其他血液組分，諸如血小板、血漿、紅血球及顆粒球及/或進行血漿/RBC交換。

依本文所用，根據本發明之術語「自體抗原」意謂由免疫系統識別為外來的任何自體抗原。在一些實施例中，自體抗原包含但不限於細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質、核酸、糖蛋白，包括細胞表面受體。

依本文所用，本文所使用之術語「自體免疫疾病」定義為由自體免疫反應產生之病症。自體免疫疾病為對自體抗原不當且過度反應之結果。自體免疫疾病之實例尤其包括但不限於愛迪生氏病(Addision's disease)、斑禿、僵直性脊椎炎、自體免疫性肝炎、自體免疫性腮腺炎、癌症、克羅恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病(I型)、營養不良性大皰性表皮鬆懈、附睪炎、絲球體腎炎、格雷夫氏病(Graves' disease)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barr syndrome)、橋本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、全身性紅斑性狼瘡症、多發性硬化症、重症肌無力、尋常天疱瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊椎關節病、甲狀腺炎、血管炎、白斑病、黏液腺瘤、惡性貧血、潰瘍性結腸炎。

依本文所用，術語「自體」意指來源於同一個體的任何物質可稍後將物質再引入其中。

依本文所用，術語「Cas」、「Cas分子」或「Cas分子」係指負責DNA裂解之細菌II型CRISPR/Cas系統之酶。Cas包括野生型蛋白質以及其功能性及非功能性突變體。

依本文所用，術語「癌症」係指特徵為異常細胞之快速且不受控的生長的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體的其他部分。依本文所用，術語「癌症」係指特徵為異常細胞之快速且不受控的生長的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體的其他部分。各種癌症之實例包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、轉移性去勢抗性前列腺癌、黑色素瘤、滑膜肉瘤、晚期TnMuc1陽性實體腫瘤、神經母細胞瘤、神經內分泌腫瘤及其類似癌症。在某些實施例中，癌症為髓質性甲狀腺癌。在某些實施例中，該癌症係前列腺癌。在某些實施例中，癌症為間皮瘤或間皮素表現癌。在一些實施例中，癌症為轉移性去勢抗性前列腺癌。術語「癌症」及「腫瘤」在本文中可互換使用，且兩種術語涵蓋實體腫瘤及液體腫瘤、瀰漫性或循環性腫瘤。在一些實施例中，癌症或腫瘤包括癌前以及惡性癌症及腫瘤。

依本文所用，術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」可互換地指完全或以片段(例如MHC/肽)形式表現於癌細胞表面上且適用於使藥理學藥劑優先靶向癌細胞的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)。在一些實施例中，腫瘤抗原為正常細胞及癌細胞表現之標記(例如譜系標記，諸如B細胞上之CD19)。在一些實施例中，腫瘤抗原為相較於正常細胞在癌細胞中過度表現之細胞表面分子，例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍或更多倍過度表現。在一些實施例中，腫瘤抗原為相較於在正常細胞上表現之分子而言在癌細胞中不適當合成之細胞表面分子，例如含有刪除、添加或突變之分子。在一些實施例中，腫瘤抗原將全部或以片段形式(例如，MHC/肽)專門表現於癌細胞之細胞表面上，且在正常細胞表面上不合成或表現。在一些實施例中，本發明之CAR包括包含結合至MHC呈現肽之抗原結合域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，來源於內源性蛋白質之肽填充主要組織相容複合體(MHC) I類分子之凹穴，且由CD8+ T淋巴球上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I級複合物由所有成核細胞組成性表現。在癌症中，病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物表示免疫療法之獨特類別之細胞表面目標。已描述在人類白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2之情形下靶向來源於病毒或腫瘤抗原之肽的TCR樣抗體。舉例而言，TCR樣抗體可自篩選庫(諸如人類scFv噬菌體呈現庫)識別。

依本文所用，術語「癌症支持抗原」或「腫瘤支持抗原」可互換地指細胞表面上表現之分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)，其本身不為癌性的，但藉由促進癌細胞生長或存活(例如對免疫細胞之抗性)而支持癌細胞。例示性此類型之細胞包括基質細胞及骨髓源性抑制細胞(MDSC)。腫瘤支持抗原本身無需在支持腫瘤細胞中起作用，只要抗原存在於支持癌細胞之細胞上即可。

依本文所用，術語「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用。在一些實施例中，宿主細胞為免疫細胞或其前驅體。在一些實施例中，經基因工程改造之細胞為經基因工程改造之T淋巴球(T細胞)、原生T細胞(TN)、記憶T細胞(例如中樞記憶T細胞(TCM)、效應記憶細胞(TEM))、自然殺手細胞(NK細胞)及能夠產生治療學上相關之後代的巨噬細胞。在一些實施例中，宿主細胞為T細胞、NK細胞或NKT細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、自然殺手T細胞、淋巴祖細胞、造血幹細胞、幹細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞。在一些實施例中，免疫細胞為CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。在一些實施例中，免疫細胞為同種異體T細胞或自體T細胞。在一些實施例中，同種異體T細胞或自體T細胞為人類。

依本文所用，「細胞表面標記」係指於細胞表面上表現之任何分子。細胞表面表現通常需要分子具有跨膜域。許多天然存在之細胞表面標記稱為「CD」或「分化簇(cluster of differentiation)」分子。細胞表面標記通常提供抗體可結合之抗原決定子。

依本文所用，術語「中樞記憶T細胞」係指在人類中呈CD45RO陽性且表現CCR7之T細胞亞群。在一些實施例中，中樞記憶T細胞表現CD95。在一些實施例中，中樞記憶T細胞表現IL-2R、IL-7R及/或IL-15R。在一些實施例中，中樞記憶T細胞表現CD45RO、CD95、IL-2受體b、CCR7及CD62L。在一些實施例中，使用流動式細胞測量術評估標記之表面表現量。術語「幹細胞記憶T細胞(stem memory T cells)」、「幹細胞記憶T細胞(stem cell memory T cells)」、「幹細胞樣記憶T細胞(stem cell-like memory T cells)」、「記憶性幹細胞T細胞(memory stem T cell)」、「T記憶幹細胞(T memory stem cells)」、「T幹細胞記憶細胞(T stem cell memory cells)」或「TSCM細胞」係指具有幹細胞樣能力，例如自我更新能力及/或重建記憶及/或效應T細胞亞群的多能能力的記憶T細胞亞群。在一些實施例中，幹細胞記憶T細胞表現CD45RA、CD95、IL-2受體b、CCR7及CD62L。在一些實施例中，使用流動式細胞測量術評估標記之表面表現量。在一些實施例中，在Gattinoni等人, Nat Med. 23(1): 18-27 (2017)中揭示例示性幹細胞記憶T細胞。

出於明晰之目的，除非另外說明，否則將細胞或細胞群分為「不表現」或「缺乏」特定標記或「對於」特定標記「呈陰性」可能未必意謂標記之絕對不存在。熟習此項技術者可容易地將細胞與陽性及/或陰性對照進行比較，及/或設定預定臨限值，且使用習知偵測方法，例如使用流動式細胞測量術，當細胞具有低於預定臨限值之表現量或細胞群具有低於預定臨限值之總體表現量時，將細胞或細胞群分為不表現標記或對於標記呈陰性。

依本文所用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指經工程改造以在免疫效應細胞或其前驅細胞上表現且特異性結合抗原之人工T細胞受體。在授受性細胞轉移下，CAR可用於授受性細胞療法中。在一些實施例中，授受性細胞轉移(或療法)包含自患者移除T細胞，及修飾T細胞以表現對特定抗原具有特異性之受體。在一些實施例中，CAR對所選目標具有特異性，例如ROR1、間皮素、c-Met、PSMA、PSCA、葉酸受體α、葉酸受體β、EGFR、EGFRvIII、GPC2、GPC2、黏蛋白1 (MUC1)、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))、TnMUC1、GDNF家族受體α-4 (GFRa4)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)或介白素-13受體次單元α-2 (IL-13Ra2或CD213A2)。在一些實施例中，CAR亦可包含胞內活化域、跨膜域及包含腫瘤相關抗原結合區之胞外域。在一些態樣中，CAR包含與CD3-ζ跨膜及胞內域融合的單鏈可變片段(scFv)衍生之單株抗體的融合物。CAR設計之特異性可來源於受體(例如，肽)之配位體。在一些實施例中，CAR可藉由再導引表現對腫瘤相關抗原具有特異性之CAR的T細胞的特異性來靶向癌症。

依本文所用，術語「保守序列修飾」意欲指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體的結合特徵的胺基酸修飾。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由此項技術中已知之標準技術將修飾引入本發明之抗體中，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。保守胺基酸取代係胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，抗體之CDR區內之一或多個胺基酸殘基可經來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且經改變之抗體可使用本文所描述之功能分析法來測試結合抗原之能力。

依本文所用，術語「協同刺激配位體」包括抗原呈現細胞(例如aAPC、樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上之分子，其特異性結合T細胞上之同源協同刺激分子，由此提供除藉由例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子之結合所提供之初級信號以外的信號，該信號亦介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化及其類似者。協同刺激配位體可包括但不限於CD2、CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD- L2、4-1BBL、OX40L、誘導性協同刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合於鐸配位體受體之促效劑或抗體及特異性結合B7-H3之配位體。協同刺激配位體尤其亦涵蓋特異性結合T細胞上存在之協同刺激分子的抗體，諸如但不限於CD27、CD28、4- 1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特異性結合CD83之配位體。

依本文所用，「協同刺激分子」係指特異性結合協同刺激配位體，由此介導T細胞之協同刺激反應，諸如(但不限於)增殖的T細胞上之同源結合搭配物。協同刺激分子為除抗原受體或其配位體之外之促成有效免疫反應的細胞表面分子。協同刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA、鐸配位體受體、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS (CD278)、NKG2C、B7-H3 (CD276)及來源於殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之胞內域。在一些實施例中，協同刺激分子包括OX40、CD27、CD2、CD28、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。此類協同刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，及特異性結合CD83之配位體。

依本文所用，術語「協同刺激信號」係指與初級信號(諸如TCR/CD3接合)組合引起T細胞增殖及/或關鍵分子之上調或下調的信號。協同刺激胞內信號傳導域可為協同刺激分子之胞內部分。協同刺激分子可呈現於以下蛋白質家族中：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-lBB (CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3及特異性結合CD83之配位體以及其類似物。

依本文所用，術語「CRISPR」係指成簇規律間隔短回文重複序列系統。術語「CRISPR系統」、「CRISPR/Cas」、「CRISPR/Cas系統」或「CRISPR」係指含有較短重複鹼基序列的DNA基因座。各次重複之後為來自先前暴露於病毒之間隔DNA之短區段。細菌及古菌已進化被稱為CRISPR-CRISPR相關(Cas)系統的適應性免疫防禦，該等系統使用短RNA來導引外源性核酸降解。在細菌中，CRISPR系統經由RNA引導之DNA裂解提供對入侵外來DNA之後天性免疫性。在II型CRISPR/Cas系統中，外來DNA之短區段(稱為「間隔子」)被整合於CRISPR基因體基因座內且轉錄並處理成短CRISPR RNA (crRNA)。此等crRNA黏接於反式活化crRNA (tracrRNA)，且引導Cas蛋白進行序列特異性裂解及病原性DNA緘默。近期研究已展示，Cas9蛋白進行之目標識別需要crRNA內之「種子」序列及crRNA結合區上游之含有二核苷酸的保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。

在一些實施例中，術語「CRISPR系統」、「CRISPR/Cas」、「CRISPR/Cas系統」或「CRISPR」係指包含RNA引導之核酸酶或其他效應分子及gRNA分子的一組分子，其共同為必需的且足以藉由RNA引導之核酸酶或其他效應分子導引並實現目標序列處核酸之修飾。在一些實施例中，CRISPR系統包含gRNA及Cas蛋白質，例如Cas3、Cas4、Cas8a、Cas8b、Cas9、Cas10、Cas10d、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13、Cas14、CasX、Cse1、Csy1、Csn2、Cpf1、C2c1、Csm2、Cmr5、Fok1、釀膿鏈球菌Cas9 (spCas9)或金黃色葡萄球菌Cas9 (saCas9)蛋白質。包含Cas或經修飾之Cas分子的此類系統在本文中稱為「Cas系統」或「CRISPR/Cas系統」。在一些實施例中，gRNA分子及Cas分子可複合形成核糖核蛋白(RNP)複合物。

為導引Cas9裂解所關注序列，可設計來自人類U6聚合酶III啟動子之crRNA-tracrRNA融合轉錄物，下文稱為「引導RNA」或「gRNA」。CRISPR/CAS介導之基因體編輯及調節突出顯示其對於基本科學、細胞工程改造及治療學之變革潛力。

依本文所用，術語「crRNA」作為術語與gRNA分子結合使用，為gRNA分子之一部分，該分子包含靶向域及與tracr相互作用以形成旗桿區之區域。

依本文所用，術語「細胞介素」(例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21或IL-6)包括全長、片段或變異體。天然存在之細胞介素之功能變異體可包括具有至少10%、30%、50%或80%之活性(例如天然存在之細胞介素之免疫調節活性)的其片段及功能變異體。在一些實施例中，細胞介素具有與天然存在之細胞介素實質上一致(例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致)的胺基酸序列或由與天然存在之編碼細胞介素之核苷酸序列實質上一致(例如至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致)之核苷酸序列編碼的胺基酸序列。在一些實施例中，依上下文理解，細胞介素進一步包含受體域，例如細胞介素受體域(例如IL-15/IL-15R；IL-18/IL-18R)。

依本文所用，術語「來源於」係指第一與第二分子之間的關係。其通常指第一分子與第二分子之間的結構類似性，且不包括對來源於第二分子之第一分子的過程或來源限制。舉例而言，在來源於CD3ζ分子之胞內信號傳導域之情況下，胞內信號傳導域保留足夠滿足以下之CD3ζ結構：具有所需功能，亦即在適當條件下產生信號之能力。其不包括對產生胞內信號傳導域之特定方法之限制，例如其並不意謂，為提供胞內信號傳導域，吾等必須以CD3ζ序列開始且刪除不要的序列，或施加突變以獲得胞內信號傳導域。

依本文所用，術語「疾病」係指動物無法維持體內恆定，且其中若不改善疾病，則動物健康狀況繼續惡化的動物健康狀態。相比之下，在動物中術語「病症」係指動物能夠維持體內恆定，但動物健康狀態不如其在無病症存在下之健康狀態有利的健康狀態。如果不進行治療，病症未必造成動物之健康狀態進一步惡化。

依本文所用，「與腫瘤抗原之表現相關之疾病」包括但不限於與腫瘤抗原之表現相關的疾病或與表現腫瘤抗原之細胞相關之病況，包括但不限於增生性疾病，諸如癌症或惡性病或癌變前病況，諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症；或與表現腫瘤抗原之細胞相關之非癌症相關適應症。在一些實施例中，與腫瘤抗原之表現相關之癌症為血液癌。在一些實施例中，與腫瘤抗原之表現相關之癌症為實體癌症。與腫瘤抗原之表現相關之其他疾病包括但不限於與腫瘤抗原之表現相關之非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌變前病況或增生性疾病。與腫瘤抗原之表現相關之非癌症相關適應症包括但不限於自體免疫疾病(例如狼瘡)、發炎性病症(過敏及哮喘)及移植。在一些實施例中，表現腫瘤抗原之細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原之mRNA。在一些實施例中，表現腫瘤抗原之細胞產生腫瘤抗原蛋白質(例如野生型或突變型)，且腫瘤抗原蛋白質可以正常水準或降低之水準存在。在一些實施例中，表現腫瘤抗原之細胞在某一時刻產生可偵測含量之腫瘤抗原蛋白質，且隨後產生實質上不可偵測之腫瘤抗原蛋白質。

依本文所用，術語「下調」係指降低或消除一或多個基因之基因表現。

依本文所用，術語「編碼」係指聚核苷酸(諸如基因、cDNA或mRNA)中之特定核苷酸序列充當用於在具有核苷酸(例如，rRNA、tRNA及mRNA)之確定序列或胺基酸之確定序列的生物過程中合成其他聚合物及大分子的模板的固有特性及由其產生之生物特性。因此，若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白，則基因、cDNA或RNA編碼該蛋白。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。除非另外指定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些形式中含有內含子之程度。

依本文所用，術語「有效量」及「治療有效量」在本文中可互換使用，指本文所描述之化合物、調配物、材料、醫藥劑或組合物可有效實現有需要之個體之所需生理、治療或預防結果的量。此類結果可包括但不限於如下量：當投與哺乳動物時，與在不存在本發明之組合物時偵測到的免疫反應相比，引起可偵測之免疫反應水準。免疫反應可容易地藉由許多此項技術中公認的方法評定。熟習此項技術者應理解，本文所投與之組合物之量各不相同且可容易地基於多種因素確定，諸如所治療之疾病或病況、所治療之哺乳動物之年齡及健康狀況及身體狀況、疾病之嚴重程度、所投與之特定化合物及其類似因素。有效量可視待治療個體之健康狀況及身體狀況、待治療個體之分類群、組合物之調配、個體醫療病況之評定及其他相關因素而在個體當中變化。

依本文所用，術語「Env」應意謂本文所描述之內源性慢病毒包膜或異源包膜。

依本文所用，術語「富集」及「經富集」可互換使用，意謂用於本文所描述之製造製程中的細胞(例如T細胞)在經富集之血球分離術產物部分上之產率(分率)增加至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或更多倍。

依本文所用，術語「內源性」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生之任何物質。

依本文所用，本文中所使用之術語「擴增」係指數目增加，如免疫細胞(例如T細胞)之數目增加。在一些實施例中，相對於培養物中最初存在之數目，離體擴增之免疫細胞(例如T細胞)數目增加。在另一實施例中，相對於培養物中之其他細胞類型，離體擴增之免疫細胞(例如T細胞)數目增加。

依本文所用，術語「表現」係指由啟動子驅動之特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。

依本文所用，術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何物質。

依本文所用，術語「表現載體」係指包含重組性聚核苷酸之載體，該重組性聚核苷酸包含可操作地連接於待表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含用於表現的足夠順式作用元件；其他用於表現之元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之全部表現載體，諸如併入重組聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如仙台病毒、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

依本文所用，術語「擴展包裝信號」或「擴展包裝序列」係指圍繞psi序列使用的進一步擴展至gag基因中的序列。納入此等額外包裝序列可增加載體RNA插入至病毒粒子中之效率。舉例而言，對於鼠類白血病病毒(MoMLV)，最小核心包裝信號係由自大致核苷酸144直至Pst I位點(核苷酸567)之序列(自5' LTR加帽位點計數)編碼。MoMLV之擴展包裝信號包括超出核苷酸567直至gag/pol基因(核苷酸621)之起始且超出核苷酸1040的序列(Bender等人(1987))。此等序列包括約三分之一之gag基因序列。

依本文所用，術語「離體」係指已自活生物體(例如人類)移除且在生物體外(例如在培養皿、試管或生物反應器中)繁殖之細胞。

依本文所用，「Fab」係指結合於抗原、但係單價且不具有Fc部分的抗體結構之片段，例如藉由番木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段及Fc片段(例如重(H)鏈恆定區；不結合於抗原的Fc區)。

依本文所用，在scFv之情形下所用之術語「可撓性多肽連接子」或「連接子」係指由單獨或組合使用以將可變重鏈及可變輕鏈區連接在一起的胺基酸(諸如甘胺酸及/或絲胺酸殘基)組成的肽連接子。在一個實施例中，可撓性多肽連接子為Gly/Ser連接子，且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=l，n=2，n=3，n=4，n=5及n=6，n=7，n=8，n=9及n=10 (SEQ ID NO: 6592)。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括但不限於(Gly4 Ser)4或(Gly4 Ser)3。在另一實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)之多個重複。

依本文所用，「片段」亦為變異體，且該術語通常指在功能上或例如在分析中受關注之多肽或聚核苷酸的所選區域。因此，「片段」係指作為全長多肽或聚核苷酸之一部分的胺基酸或核酸序列。

依本文所用，「功能變異體」係指具有與參考胺基酸序列實質上一致的胺基酸序列，或由實質上一致的核苷酸序列編碼，且能夠具有參考胺基酸序列之一或多種活性的多肽。

依本文所用，術語「引導RNA」、「引導RNA分子」、「gRNA分子」或「gRNA」可互換地使用，且指促進將RNA引導之核酸酶或其他效應分子(通常與gRNA分子複合)特異性導引至目標序列的一組核酸分子。在一些實施例中，該導引經由gRNA之一部分與DNA雜交(例如經由gRNA靶向域)及藉由gRNA分子之一部分與RNA引導之核酸酶或其他效應分子結合(例如經由至少gRNA tracr)來實現。在一些實施例中，gRNA分子由在本文中稱為「單引導RNA」或「sgRNA」及其類似者之單一連續聚核苷酸分子組成。在一些實施例中，gRNA分子由複數個(通常兩個)聚核苷酸分子組成，該等聚核苷酸分子本身能夠締合，通常經由雜交，在本文中稱為「雙引導RNA」或「dgRNA」及其類似者。gRNA分子更詳細地描述於下文中，但一般包括靶向域及tracr。在一些實施例中，靶向域及tracr安置在單一聚核苷酸上。在其他實施例中，靶向域及tracr安置於單獨聚核苷酸上。

依本文所用，術語「宿主細胞」包括活體內、離體或活體外經本發明之重組載體或聚核苷酸轉染、感染或轉導之細胞。宿主細胞可包括包裝細胞、生產細胞及經病毒載體感染之細胞。在一些實施例中，向需要療法之個體投與感染本發明之慢病毒載體的宿主細胞。在一些實施例中，術語「目標細胞」可與宿主細胞互換使用，且指經轉染、感染或轉導之所需細胞類型之細胞。在較佳實施例中，目標細胞為T細胞。

依本文所用，術語「同源」係指兩個聚合分子之間(例如兩個核酸分子之間，諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子)或兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個分子中之次單元位置由相同單體次單元佔據時，則其在該位置處同源。舉例而言，若兩個DNA分子中之各者中的位置由腺嘌呤佔據，則兩個DNA分子為同源的。兩個序列之間之同源性與匹配或同源位置之數目直接相關。舉例而言，若兩個序列中一半(例如，長度為聚合物十個次單元中之五個位置)位置同源，則兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如，9/10)匹配或同源，則兩個序列為90%同源。

依本文所用，術語「同源物」意謂與野生型胺基酸序列及野生型核苷酸序列具有一定同源性的實體。術語「同源性」可等同於「一致性」。在本發明情形下，同源序列用於包括可與主題序列至少50%、55%、65%、75%、85%或90%一致，較佳至少95%或97%或99%一致的胺基酸序列。通常，同源物將包含與主題胺基酸序列相同之活性位點等。儘管亦可根據類似性(亦即，胺基酸殘基具有類似化學特性/功能)考慮同源性，但在本發明之情形下，較佳根據序列一致性表述同源性。

同源序列用於包括可與主題序列至少50%、55%、65%、75%、85%或90%一致，較佳至少95%或97%或99%一致的核苷酸序列。儘管亦可根據類似性考慮同源性，但在本發明之情形下，較佳根據序列一致性表述同源性。同源性比較可藉由目視，或更通常藉助於易於獲得之序列比較程式來進行。此等市售電腦程式可計算兩個或更多個序列之間的同源性或一致性百分比。

同源性百分比可在連續序列上計算，亦即將一個序列與另一序列比對，且將一個序列中之各胺基酸直接與另一序列中之對應胺基酸進行比較，一次一個殘基。此稱作「無間隙(ungapped)」比對。通常，該等無間隙比對僅在相對較少的殘基上進行。

儘管此為一種極簡單且一致的方法，但其未考慮，例如在另一對相同的序列中，核苷酸序列中之一個插入或缺失可導致之後的密碼子未對準，因此在進行全域比對時可能導致同源性百分比大幅降低。因此，大多數序列比較方法經設計以產生最佳比對，其考慮可能的插入及缺失而不過度地使整體同源性得分不利。此藉由在序列比對中插入「間隙」來實現，以試圖最大化局部同源性。

然而，此等更複雜的方法將「間隙罰分(gap penalty)」分配給比對中出現之各間隙，使得對於相同數目的相同胺基酸，具有儘可能少的間隙的序列比對(反映兩個所比較序列之間的較高相關性)將獲得比具有許多間隙之序列比對更高的得分。「仿射間隙成本(Affine gap cost)」通常用於對間隙之存在收取相對較高的成本且對間隙中之各後續殘基收取較小的罰分。此為最常用的間隙評分系統。高間隙罰分當然將產生具有更少間隙之最佳化比對。大多數比對程式允許修改間隙罰分。然而，當使用此類軟體進行序列比較時，較佳使用預設值。舉例而言，當使用GCG Wisconsin Bestfit套裝時，胺基酸序列之預設間隙罰分對於間隙為-12且對於各擴展部分為-4。

因此，計算最大同源性百分比首先需要考慮間隙罰分，產生最佳比對。用於實現該比對之適合的電腦程式為GCG Wisconsin Bestfit套裝(University of Wisconsin, U.S.A.；Devereux等人(1984) Nucleic Acids Research 12:387)。可進行序列比較之其他軟體之實例包括但不限於BLAST套裝、FASTA及GENEWORKS比較工具套件。BLAST及FASTA均可供用於離線及線上搜尋。然而，對於一些應用，較佳使用GCG Bestfit程式。另一種稱為BLAST 2 Sequences之工具亦供用於比較蛋白質及核苷酸序列。

儘管可根據一致性量測最終同源性百分比，但比對過程本身通常不基於全有或全無(all-or-nothing)的成對比較。相反，通常使用經縮放類似性得分矩陣，該矩陣基於化學類似性或進化距離向各成對比較分配得分。常用之此類矩陣之實例係BLOSUM62矩陣-BLAST程式套件之預設矩陣。若供應，則GCG Wisconsin程式通常使用公開預設值或自定義符號比較表(其他細節參見使用者手冊)。對於一些應用，較佳使用GCG套裝之公開預設值，或在其他軟體之情況下，使用諸如BLOSUM62之預設矩陣。一旦軟體產生了最佳比對，即有可能計算出同源性百分比，較佳序列一致性百分比。軟體通常將此作為序列比較之部分且生成數值結果。

依本文所用，術語「雜交載體」係指含有反轉錄病毒序列(例如慢病毒)與非反轉錄病毒序列(例如慢病毒病毒序列)之載體、LTR或其他核酸。在一個實施例中，雜交載體係指包含用於反轉錄、複製、整合及/或包裝之反轉錄病毒(例如慢病毒)序列的載體或轉移質體。

此類變異體可使用標準重組DNA技術，諸如定點突變誘發製備。在要進行插入之情況下，可製成編碼插入之合成DNA以及對應於插入位點任一側的天然存在之序列的5'及3'側接區。側接區將含有與天然存在之序列中位點相對應的便利限制位點，以便可用適當的酶切割序列且將合成DNA接合至切口。隨後根據本發明表現DNA以個體CAR、個體經工程改造之TCR、個體KIR、個體抗原結合多肽、個體細胞表面受體配位體、個體腫瘤抗原、個體開關受體、個體顯性負受體及/或增強免疫功能(例如T細胞激活或T細胞浸潤)之個體多肽的核酸。編碼蛋白質。此等方法僅說明此項技術中已知的用於操作DNA序列的眾多標準技術，且亦可使用其他已知技術。

依本文所用，術語「一致性」係指兩個聚合物分子之間，尤其兩個胺基酸分子之間，諸如兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個胺基酸序列在同一位置處具有相同殘基時，則其在該位置處一致。舉例而言，若兩個多肽分子中之各者中之位置由精胺酸佔據，則兩個多肽一致。兩個胺基酸序列在比對中在相同位置具有相同殘基之一致性或程度通常表示為百分比。兩個胺基酸序列之間的一致性與匹配或一致位置之數目直接相關。舉例而言，若兩個序列中之一半位置(例如，長度為聚合物十個胺基酸中之五個位置)一致，則兩個序列具有50%一致性；若90%之位置(例如，9/10)匹配或一致，則兩個胺基酸序列具有90%一致性。

依本文所用，術語「免疫球蛋白」或「Ig」定義一類充當抗體之蛋白質。由B細胞表現之抗體有時稱作BCR (B細胞受體)或抗原受體。此類蛋白質中包括之五個成員為IgA、IgG、IgM、IgD及IgE。IgA係存在於諸如唾液、淚液、母乳、胃腸道分泌物及呼吸道及泌尿生殖道之黏液分泌物之身體分泌物中的初級抗體。IgG係最常見之循環抗體。IgM為在大部分個體中初級免疫反應中產生之主要免疫球蛋白。其係凝集、補體結合及其他抗體反應中最有效之免疫球蛋白，且對於防禦細菌及病毒具有重要意義。IgD係無已知之抗體功能的免疫球蛋白，但可充當抗原受體。IgE係藉由在暴露於過敏原時引起介體自肥大細胞及嗜鹼性球釋放來介導速發超敏反應的免疫球蛋白。

依本文所用，本文所使用之術語「免疫反應」定義為當淋巴球將抗原分子鑑別為外來物且誘導抗體形成及/或活化淋巴球以移除抗原時發生的細胞對抗原之反應。

依本文所用，術語「免疫效應細胞」係指參與免疫反應，例如促進免疫效應反應之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞(例如α/eta T細胞及γ/δ T細胞)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、肥大細胞及骨髓衍生之吞噬細胞。

依本文所用，術語「免疫效應功能或免疫效應反應」係指增強或促進免疫攻擊目標細胞的功能或反應。在一些實施例中，免疫效應功能或反應係指T或NK細胞促進目標細胞之殺死或生長或增殖抑制之特性。在T細胞之情況下，主要刺激及協同刺激為免疫效應功能或反應之實例。

依本文所用，術語「抑制性分子」係指如下分子，其在活化時引起或有助於抑制細胞存活、活化、增殖及/或功能；及編碼該分子之基因及其相關調節元件(例如啟動子)。在一些實施例中，抑制性分子為在免疫效應細胞上(例如，在T細胞上)表現之分子。抑制性分子之非限制性實例為PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、VISTA、TGFβIIR、VSIG3、VSIG 8、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7- H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGFβ。應理解，術語抑制性分子係指當與目標序列或gRNA分子結合使用時編碼抑制性分子蛋白質之基因(及其相關調節元件)。在一些實施例中，編碼抑制性分子之基因為BTLA、PD-1、TIM-3、VSIG3、VSIG8、CTLA4或TGFβIIR。在一些實施例中，編碼抑制性分子之基因為VSIG3。在一些實施例中，編碼抑制性分子之基因為PD-1。在一些實施例中，編碼抑制性分子之基因為TGFβIIR。

依本文所用，術語「經誘導之多能幹細胞」或「iPS細胞」係指由成體細胞，諸如免疫細胞(亦即T細胞)產生之多能幹細胞。成體細胞中之再程式化因子(諸如Klf4、Oct3/4及Sox2)之表現將細胞轉化為能夠繁殖及分化成多種細胞類型之多能細胞。

依本文所用，術語「經分離」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽並非「經分離」的，但自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離」的。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。

依本文所用，「活體外轉錄RNA」係指已在活體外合成之RNA。在一些實施例中，RNA為mRNA。一般而言，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。

依本文所用，術語「基因剔除」係指一或多個基因之基因表現的消融。

依本文所用，術語「慢病毒載體」係指含有主要來源於慢病毒之結構及功能性基因元件或其部分，包括LTR的病毒載體或質體。在一些實施例中，術語「慢病毒載體」及「慢病毒表現載體」可用於指慢病毒轉移質體及/或感染性慢病毒粒子。在一些實施例中，當在本文中提及諸如選殖位點、啟動子、調節元件、異源核酸等元件時，此等元件之序列以RNA形式存在於本發明之慢病毒粒子中且以DNA形式存在於本發明之DNA質體中。

依本文所用，術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染非分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。衍生自慢病毒之載體提供實現顯著水準之活體內基因轉移的手段。

慢病毒家族與反轉錄病毒之不同之處在於慢病毒具有感染分裂細胞與非分裂細胞兩者之能力。相比之下，反轉錄病毒，諸如MLV，不能感染非分裂細胞或緩慢分裂之細胞，諸如構成例如肌肉、腦、肺及肝組織之細胞。

依本文所用，慢病毒或慢病毒載體為包含至少一種可來源於慢病毒之組成部分的載體。較佳地，該組成部分涉及載體感染細胞、表現基因或進行複製之生物機制。慢病毒載體可為「非靈長類動物」載體，亦即來源於不主要感染靈長類動物，特別是人類之病毒。非靈長類動物慢病毒可為慢病毒科之任何成員，其不會自然地感染靈長類動物，且可包括貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、梅迪-威司奈病毒(Maedi visna virus，MVV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)。

依本文所用，術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染非分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。

依本文所用，術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因體之至少一部分的載體，特別是包括Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自失活慢病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括但不限於例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可獲得且將為熟習此項技術者所知。

依本文所用，術語「奈米基質」係指包含可移動聚合物鏈之基質的奈米結構。奈米基質尺寸為1至500 nm，例如10至200 nm。在一些實施例中，可移動聚合物鏈之基質連接一或多種向T細胞提供活化信號之促效劑，例如促效抗CD3及/或抗CD28抗體。在一些實施例中，奈米基質包含連接，例如共價連接含一或多個刺激分子之促效劑及/或含一或多個協同刺激分子之促效劑的膠態聚合奈米基質。在一些實施例中，一或多種刺激分子之促效劑為CD3促效劑(例如抗CD3促效抗體)。在一些實施例中，一或多種協同刺激分子之促效劑為CD28促效劑(例如抗CD28促效抗體)。在一些實施例中，奈米基質之特徵在於不存在固體表面，例如作為促效劑(諸如抗CD3及/或抗CD28抗體)之連接點。在一些實施例中，奈米基質為W02014/048920A1中所揭示或來自Miltenyi Biotcc GmbH之MACS ^®GMP T Cell Trans Act™套組中給出之奈米基質。MACS® GMP T Cell TransAct™由共價連接至針對人類CD3及CD28之人源化重組促效劑抗體的膠態聚合奈米基質組成。

依本文所用，「標記」係指細胞之特徵及/或表型。標記可用於選擇包含所關注特徵之細胞。標記可隨特異性細胞變化。標記可例如為由給定細胞類型(形態、功能或生物化學(酶促))表現或在其上表現的分子。此類標記較佳為蛋白質，且更佳為具有此項技術中可獲得之抗體或其他結合分子之抗原決定基的蛋白質。形態特徵或特點之實例包括但不限於形狀、尺寸、外觀(例如平滑、半透明)、密度、粒度及核與細胞質比率。功能特徵或特點之實例包括但不限於黏附於特定受質之能力、併入或排除特定染料之能力、在特定條件下遷移之能力及沿特定譜系分化之能力。

依本文所用，術語「最小病毒基因體」意謂病毒載體經操作以移除非必需元件且保留必需元件，以便提供感染、轉導及遞送所關注核苷酸序列至目標宿主細胞的所需功能。此策略之其他細節可見於吾等WO 98/17815中。本發明之最小病毒基因體可包含(5') R-U5-一或多個所關注序列之核苷酸序列-U3-R (3')。

在一個實施例中，最小病毒基因體包含極少至無反轉錄病毒或慢病毒序列。舉例而言，其可僅包含所關注轉殖基因(例如CAR)及包裝信號。然而，用於在宿主細胞/包裝細胞內產生病毒基因體之質體載體亦將包括可操作地連接於病毒基因體以導引基因體在宿主細胞/包裝細胞中之轉錄的轉錄調節控制序列。此等調節序列可為與經轉錄病毒序列相關之天然序列，亦即5' U3區，或其可為異源啟動子，諸如另一病毒啟動子，例如組成性轉運元件(CMV)啟動子。

一些慢病毒基因體需要額外序列來高效產生病毒。舉例而言，在HIV之情況下，較佳包括rev及RRE序列。然而，藉由密碼子最佳化可降低或消除對rev及RRE之需求。此策略之其他細節可見於吾等WO 01/79518中。執行與rev/RRE系統相同的功能的替代序列亦為已知的。舉例而言，rev/KRE系統之功能類似物發現於梅森-輝瑞猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)中。此稱為CTE且在基因體中包含咸信與受感染細胞中之因子相互作用的RRE型序列。細胞因子可被視為rev類似物。因此，CTE可用作rev/RRE系統之替代。已知或變得可用之任何其他功能等效物可與本發明相關。舉例而言，亦已知，HTLV-I之Rex蛋白質可在功能上替代HIV-I之Rev蛋白質。亦已知Rev及Rex具有與IRE-BP類似之作用。包裝序列。

依本文所用，術語「經修飾」意謂本發明之分子或細胞的經改變之狀態或結構。可以許多方式對分子進行修飾，包括在化學上、結構上及功能上進行修飾。細胞可經由引入核酸而經修飾。

依本文所用，術語「調節」意謂與不存在治療或化合物之個體中之反應水準相比及/或與其他相同但未治療之個體中之反應水準相比，調節個體中之反應水準之可偵測增加或降低。該術語涵蓋擾動及/或影響天然信號或反應，由此介導個體、較佳人類中之有益治療反應。

在本發明之情形下，使用以下通常出現之核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。

依本文所用，「原生T細胞」係指未經歷抗原之T細胞。在一些實施例中，未經歷抗原之T細胞在胸腺中而非周邊中遇到了其同源抗原。在一些實施例中，原生T細胞為記憶細胞之前驅體。在一些實施例中，原生T細胞表現CD45RA及CCR7兩者，但不表現CD45RO。在一些實施例中，原生T細胞之特徵可在於表現CD62L、CD27、CCR7、CD45RA、CD28及CD127及不存在CD95或CD45RO同功異型物。在一些實施例中，原生T細胞表現CD62L、IL-7受體-a、IL-6受體及CD132，但不表現CD25、CD44、CD69或CD45RO。在一些實施例中，原生T細胞表現CD45RA、CCR7及CD62L且不表現CD95或IL-2受體β。在一些實施例中，使用流動式細胞測量術評估標記之表面表現量。

除非另外指定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些形式中含有內含子而言，片語編碼該蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子。

依本文所用，術語「可操作地連接」係指調節序列與異源性核酸序列之間的功能鍵聯，引起異源性核酸序列表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於官能性關係時，第一核酸序列可操作地連接第二核酸序列。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為鄰接的，且必要時使兩個蛋白質編碼區在同一個讀框中連接。

依本文所用，術語「過度表現(overexpressed)」腫瘤抗原或腫瘤抗原之「過度表現(overexpression)」意欲指示來自如患者之特定組織或器官內之實體腫瘤的疾病區域的細胞中腫瘤抗原之表現量相對於來自該組織或器官之正常細胞中之表現量而言異常。患有實體腫瘤或由腫瘤抗原過度表現表徵之血液惡性病的患者可藉由此項技術中已知之標準分析確定。

依本文所用，術語「包裝信號(Packaging signal)」可互換地指「包裝序列」或「Psi」，指病毒粒子形成期間反轉錄病毒或慢病毒RNA股衣殼化所需的非編碼順式作用序列。在HIV-1中，此序列已定位至自主要剪接供體位點(SD)上游擴展至至少gag起始密碼子之基因座。

依本文所用，術語「包裝細胞」或「生產細胞」係指含有生產感染性重組病毒所必需的、在病毒基因體中缺乏或非功能性的要素的細胞。通常，此類包裝細胞含有一或多種能夠表現病毒結構蛋白(諸如經密碼子最佳化之gag-pol及env)之生產質體，但其通常不含有包裝信號。

在一個實施例中，本發明之包裝/生產細胞產生整合缺陷型反轉錄病毒或慢病毒載體粒子，其中粒子之病毒基因體無法經由反轉錄病毒或慢病毒整合機制整合至目標細胞之基因體中。在此實施例中，包裝/生產細胞在整合所必需之基因或序列上有缺陷。舉例而言，該細胞可包含失能整合酶基因、失能引子結合位點(PBS)或失能att位點。較佳地，整個整合酶基因、PBS或att位點不存在於包裝/生產細胞中。

在另一實施例中，本發明之包裝/生產細胞產生反轉錄病毒或慢病毒載體粒子，該等粒子在感染目標細胞之後不允許RNA基因體反轉錄。在此實施例中，該細胞在反轉錄所必需之基因或序列上有缺陷。舉例而言，細胞可包含失能反轉錄酶基因。較佳地，整個反轉錄酶編碼區不存在於包裝/生產細胞中。

依本文所用，術語「包裝細胞株」或「生產細胞株」係指能夠生產重組反轉錄病毒粒子之細胞株，其包含有包裝細胞株及包含包裝信號之轉移載體構築體。在一些實施例中，「包裝細胞株」係用於指不含包裝信號，但確實穩定或短暫表現病毒結構蛋白及正確包裝病毒粒子所必需的複製酶(例如，gag、pol及env)之細胞株。任何適合之細胞株均可用於製備本發明之包裝細胞。一般而言，細胞為哺乳動物細胞。

感染性病毒粒子及病毒儲備溶液之生產可使用習知技術進行。製備病毒儲備溶液之方法為此項技術中已知的。感染性病毒粒子可使用習知技術自包裝細胞收集。舉例而言，此項技術中已知，感染性粒子可藉由細胞溶解或收集細胞培養物上清液來收集。視情況，所收集之病毒粒子可視需要純化。適合純化技術為熟習此項技術者所熟知。

藉由使用生產/包裝細胞株，有可能繁殖及分離大量反轉錄病毒或慢病毒載體粒子(例如以製備適合效價的反轉錄病毒或慢病毒載體粒子)以用於後續轉導例如所關注位點(諸如成人腦組織)。對於載體粒子之大規模生產而言，生產細胞株通常較佳。

在一些實施例中，包裝細胞株為第二代包裝細胞株。在一些實施例中，包裝細胞株為第三代包裝細胞株。在第三代細胞株中，進一步減少重組可藉由改變密碼子來實現。基於遺傳密碼之冗餘，此技術旨在減少單獨構築體之間，例如gag-pol及env開讀框中之重疊區之間的同源性。

包裝細胞株適用於提供衣殼化所必需之基因產物且提供用於高效價載體粒子生產之膜蛋白。包裝細胞可為活體外培養之細胞，諸如組織培養細胞株。適合的細胞株包括但不限於哺乳動物細胞，諸如鼠類纖維母細胞源細胞株或人類細胞株。在一些實施例中，包裝細胞株為人類細胞株。

在特定實施例中，用於產生包裝細胞株之細胞為人類細胞。可使用的適合細胞株包括例如CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、希拉細胞、W163細胞、211細胞及211 A細胞。在較佳實施例中，包裝細胞為293細胞、293T細胞或A549細胞。

替代地，包裝細胞可為來源於待治療之個體的細胞。可自個體分離細胞，且離體投與包裝組分及載體組分，隨後再投與自體包裝細胞。更詳細地，包裝細胞可為待治療之個體體內之活體內包裝細胞，或其可為活體外培養之細胞，諸如組織培養細胞株。

依本文所用，術語「包裝載體」係指缺乏包裝信號且包含編碼一個、兩個、三個、四個或更多個病毒結構基因及/或輔助基因之聚核苷酸的表現載體或病毒載體。通常，包裝載體包括於包裝細胞中且經由轉染、轉導或感染來引入細胞中。轉染、轉導或感染方法為熟習此項技術者所熟知。本發明之反轉錄病毒/慢病毒轉移載體可經由轉染、轉導或感染而被引入包裝細胞株中，以產生生產細胞或細胞株。可藉由包括例如磷酸鈣轉染、脂質體轉染或電穿孔之標準方法將本發明之包裝載體引入人類細胞或細胞株中。在一些實施例中，將包裝載體與顯性可選標記(諸如新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、比拉斯汀(blastocidin)、吉歐黴素(zeocin)、胸苷激酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)、Gin合成酶或腺苷去胺酶(ADA))一起引入細胞中，接著在存在適當藥物之情況下進行選擇及分離純系。可選標記基因可例如藉由IRES或自裂解病毒肽物理連接於由包裝載體編碼之基因。

依本文所用，術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射或輸注技術。

依本文所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基構成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可構成蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數目無限制。多肽包括任何包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或大於兩個胺基酸的肽或蛋白質。依本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

依本文所用，「聚腺苷酸(poly(A))」為藉由聚腺苷酸化附接至mRNA之一連串腺苷。在用於短暫表現之構築體之一些實施例中，聚腺苷酸在50與5000之間。在一些實施例中，聚腺苷酸超過64。在一些實施例中，聚腺苷酸超過100。在一些實施例中，聚腺苷酸超過300。在一些實施例中，聚腺苷酸超過400。聚腺苷酸序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能，諸如轉譯之位置、穩定性或效率。

依本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分體或其經修飾之變異體與信使RNA分子共價鍵聯。在真核生物體中，大部分信使RNA (mRNA)分子係在3'端處經聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾為經由酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用而被添加至mRNA前驅體之腺嘌呤核苷酸(通常數百個)長序列。在高級真核生物中，聚腺苷酸尾被添加至含有特定序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。聚腺苷酸尾及與其結合的蛋白質有助於保護mRNA不被核酸外切酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦為重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄結束後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶有關之核酸內切酶複合物作用而裂解。裂解位點之特徵通常為在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA裂解之後，腺苷殘基被添加至裂解位點處的游離3'端。依本文所用，「短暫」係指表現非整合轉殖基因持續數小時、數日或數週之時段，其中該表現時段小於基因在被整合至宿主細胞中之基因體中或含於穩定質體複製子內的情況下之表現時段。

依本文所用，本文中所使用之術語「聚核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸之聚合物。因此，本文所使用之核酸及聚核苷酸為可互換的。熟習此項技術者具有核酸為聚核苷酸之常識，聚核苷酸其可水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可水解成核苷。本文中所使用之聚核苷酸包括但不限於藉由此項技術中可使用之任何方式(包括但不限於重組方式，亦即使用一般選殖技術自重組庫或細胞基因體選殖核酸序列，及PCR™以及其類似者)及藉由合成方式獲得的所有核酸序列。

依本文所用，術語「啟動子」定義為起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需的由細胞之合成機制識別或被引入合成機制之DNA序列。

依本文所用，術語「啟動子/調節序列」意謂表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所必需的其他調節元件。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物之各者。

依本文所用，術語「組成型啟動子」為當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時，引起在細胞中在細胞之大部分或所有生理學條件下產生基因產物的核苷酸序列。

依本文所用，術語「誘導型啟動子」為當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時，引起實質上僅在細胞中存在對應於啟動子之誘導因子時於細胞中產生基因產物的核苷酸序列。

依本文所用，術語「組織特異性啟動子」為當可與編碼基因或由基因指定的聚核苷酸可操作地連接時，引起實質上僅在細胞為對應於啟動子的組織類型之細胞時於細胞中產生基因產物的核苷酸序列。

依本文所用，術語「假模式化(Pseudotype)」或「假模式化(Pseudotyping)」係指病毒之病毒包膜蛋白經具有更佳特徵之另一病毒的病毒包膜蛋白取代。舉例而言，HIV可經水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假模式化，使得HIV能夠感染更寬範圍之細胞，因為HIV包膜蛋白(由env基因編碼)通常使病毒靶向CD4 ⁺呈現細胞。在本發明之一個較佳實施例中，慢病毒包膜蛋白用VSV-G假模式化。在一個實施例中，本發明提供包裝細胞，其產生經VSV-G包膜糖蛋白假模式化之重組反轉錄病毒，例如慢病毒。

依本文所用，術語「重組病毒載體」(RRV)係指具有足夠的病毒遺傳資訊以允許RNA基因體在包裝組分存在下包裝於能夠感染目標細胞之病毒粒子中的載體。RRV攜帶待由載體遞送至目標細胞之非病毒編碼序列。RRV不能進行獨立複製以在最終目標細胞內產生感染性病毒粒子。通常，RRV缺乏功能性gag-pol及/或env基因及/或其他複製所必需之基因。本發明之載體可組態為斷裂蛋白質內含子載體(split-intron vector)。較佳地，本發明之RRV載體具有最小病毒基因體。

依本文所用，術語「複製缺陷型」或「非複製勝任型」係指不能完全及有效複製使得不產生感染性病毒體(例如，複製缺陷型慢病毒後代)的病毒。術語「複製勝任型」係指能夠複製的野生型病毒或突變型病毒，使得病毒的病毒複製能夠產生感染性病毒體(例如，複製勝任型慢病毒後代)。

依本文所用，術語「非複製勝任型」係指一旦其離開包裝細胞即無法複製的重組反轉錄病毒。

依本文所用，術語「反轉錄病毒載體」係指含有主要來源於反轉錄病毒之結構及功能性基因元件或其部分的病毒載體或質體。

依本文所用，術語「自失活載體」(SIN載體)係指複製缺陷型載體，其中右側(3') LTR強化子-啟動子區(稱為U3區)經修飾(例如藉由缺失或取代)以阻止病毒轉錄超出第一輪病毒複製。此係因為右側(3') LTR U3區在病毒複製期間用作左側(5') LTR U3區之模板，且因此，病毒轉錄物無法在無U3強化子-啟動子之情況下製成。在本發明之另一實施例中，3' LTR經修飾使得U5區例如經理想聚腺苷酸序列替換。應注意，在本發明中亦涵蓋對LTR之修飾，諸如對3' LTR、5' LTR或3'及5' LTR兩者之修飾。在一些實施例中，SIN載體為反轉錄病毒或慢病毒載體。

在一些實施例中，藉由用異源啟動子置換5' LTR之U3區以在產生病毒粒子期間驅使病毒基因體之轉錄來提供額外安全性增強。異源啟動子可選自由以下組成之群：病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如早期或晚期)、巨細胞病毒(CMV) (例如即刻早期)、莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)及單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子。典型啟動子能夠以Tat非依賴性方式驅動大量轉錄。因為在病毒產生系統中不存在完整的U3序列，所以此置換減少重組產生複製勝任型病毒之可能性。在一些實施例中，異源啟動子在控制病毒基因體之轉錄方式方面具有額外優勢。舉例而言，異源啟動子可為誘導型，使得病毒基因體的全部或一部分僅當誘導因子存在時才發生轉錄。誘導因子包括但不限於培養宿主細胞之一或多種化合物或生理條件，諸如溫度或pH。

依本文所用，術語「仙台病毒」係指副黏液病毒科之屬。仙台病毒為陰性單股RNA病毒，其不整合至宿主基因體中或改變宿主細胞之遺傳資訊。仙台病毒具有格外廣泛的宿主範圍且對人類不具有致病性。仙台病毒用作重組病毒載體能夠進行短暫但較強基因表現。

依本文所用，術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一個部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠跨越細胞質膜接收信號及傳輸信號之分子及分子複合物。

依本文所用，術語「單鏈抗體」係指藉由重組DNA技術形成之抗體，其中免疫球蛋白重鏈及輕鏈片段經由經工程改造之胺基酸跨度連接至Fv區。已知多種產生單鏈抗體之方法。

依本文所用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」為共價連接形成VH::VL雜二聚體的免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)之重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區的融合蛋白。重鏈(VH)及輕鏈(VL)直接接合或藉由編碼肽之連接子或間隔子接合，該連接子或間隔子連接VH之N端與VL之C端或VH之C端與VL之N端。術語「連接子」及「間隔子」在本文中可互換地使用。在一些實施例中，抗原結合域(例如Tn-MUC1結合域、PSMA結合域或間皮素結合域)包含具有自N端至C端VH-連接子-VL之組態的scFv。在一些實施例中，抗原結合域(例如Tn-MUC1結合域、PSMA結合域或間皮素結合域)包含具有自N端至C端VL-連接子-VH之組態的scFv。熟習此項技術者將能夠選擇適用於本發明之組態。

該連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，且富含絲胺酸或蘇胺酸以具有溶解度。連接子可連接胞外抗原結合域之重鏈可變區及輕鏈可變區。連接子之非限制性實例揭示於Shen等人, Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)及WO 2014/087010中。此項技術中已知各種連接序列，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)連接子，諸如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n及(GGGGS)n，其中n表示至少1之整數。例示性連接序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG (SEQ ID NO: 24)、GGSGG (SEQ ID NO: 25)、GSGSG (SEQ ID NO: 26)、GSGGG (SEQ ID NO: 27)、GGGSG (SEQ ID NO: 28)、GSSSG (SEQ ID NO: 29)、GGGGS (SEQ ID NO: 30)或GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31)及其類似序列。熟習此項技術者將能夠選擇適用於本發明之連接序列。在一個實施例中，本發明之抗原結合域(例如Tn-MUC1結合域、PSMA結合域或間皮素結合域)包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，VH及VL藉由具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31)之連接序列分開。在一些實施例中，核酸連接序列包含核苷酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT (SEQ ID NO: 32)。

儘管移除恆定區且引入連接子，但scFv蛋白質保持原始免疫球蛋白之專一性。單鏈Fv多肽抗體可自包含編碼VH及VL之序列的核酸表現。已描述具有抑制活性之拮抗scFv。

依本文所用，術語「特異性」係指特異性結合給定目標抗原(例如人類目標抗原) (例如與之發生免疫反應)的能力。嵌合抗原受體可為單特異性的且含有一或多個特異性結合目標，或嵌合抗原受體之結合位點可為多特異性的且含有兩個或更多個特異性結合相同或不同目標之結合位點。在某些實施例中，嵌合抗原受體對同一目標之兩個不同(例如非重疊)部分具有特異性。在某些實施例中，嵌合抗原受體對超過一種目標具有特異性。

依本文所用，術語「間隔域」通常意謂用以使跨膜域連接至多肽鏈中之胞外域或胞內域的任何寡肽或多肽。間隔域可包含至多約300個胺基酸，例如約10至約100個胺基酸，或約25至約50個胺基酸。

依本文所用，術語「特異性結合」就抗體而言意謂抗體或其結合片段(例如scFv)識別特異性抗原，但實質上不識別或結合樣品中之其他分子。舉例而言，與來自一各物種之抗原特異性結合之抗體亦可與來自一或多個物種之抗原結合。但此類跨物種反應性本身並不改變抗體特異性分類。在另一實例中，與抗原特異性結合之抗體亦可與抗原之不同對偶基因形式結合。然而，此類交叉反應性本身並不改變抗體特異性之分類。在一些情況下，術語「特異性結合」或「特異性地結合」可用於指抗體、蛋白質、嵌合抗原受體或肽與第二化學物種之相互作用，意謂相互作用視化學物種上特定結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在而定；舉例而言，嵌合抗原受體識別且結合於特定蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記「A」及該抗體之反應中，含抗原決定基A (或未經標記之游離A)之分子的存在將減少結合於該抗體之經標記A的量。

依本文所用，術語「刺激」意謂藉由刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配位體之結合，由此介導信號轉導事件，諸如(但不限於)經由TCR/CD3複合物之信號轉導而誘導之初級反應。刺激可介導某些分子之經改變之表現，諸如下調TGF-β，及/或重組細胞骨架結構、純系擴增及分化成不同亞群。

依本文所用，術語「刺激分子」意謂與存在於抗原呈現細胞上之同源刺激配位體特異性結合之T細胞上的分子。

依本文所用，術語「刺激配位體」意謂當存在於抗原呈現細胞(例如aAPC、樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上時可與T細胞上之同源結合搭配物(在本文中稱為「刺激分子」)特異性結合，由此藉由T細胞介導初級反應，包括但不限於活化、起始免疫反應、增殖及其類似者的配位體。刺激配位體為此項技術中熟知的且尤其涵蓋裝載有肽、抗CD3抗體、超促效劑抗CD28抗體及超促效劑抗CD2抗體之MHC I類分子。

依本文所用，術語「個體」係指脊椎動物。脊椎動物可為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)。哺乳動物可包括但不限於人類、非人類靈長類動物、野生動物、野生家畜、農畜、運動型動物及寵物。在一些實施例中，「個體」及「患者」可互換使用。可引發免疫反應之任何活生物體可為個體或患者。在某些例示性實施例中，個體為人類。

依本文所用，術語「實質上一致」在核苷酸序列之情形下指第一核酸序列含有足夠或最小數目之核苷酸與第二核酸序列中之比對核苷酸一致，使得第一及第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性之多肽，或編碼共同結構多肽域或共同功能多肽活性，例如，核苷酸序列與參考序列，例如本文提供之序列具有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。

在一些實施例中，在胺基酸序列之情形下，術語「實質上一致」係指第一胺基酸序列含有足夠或最小數目之胺基酸殘基i)與第二胺基酸序列中之比對胺基酸殘基一致，或ii)為第二胺基酸序列中之比對胺基酸殘基之保守取代，使得第一及第二胺基酸序列可具有共同結構域及/或共同功能活性，例如，胺基酸序列含有與參考序列，例如本文提供之序列具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的共同結構域。

依本文所用，術語「實質上純化」細胞為基本上不含其他細胞類型的細胞。實質上純化細胞亦指已與在其天然存在之狀態中通常與其締合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化細胞群係指同源細胞群。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然締合之細胞分離之細胞。在一些實施例中，在活體外培養細胞。在其他實施例中，不在活體外培養細胞。

依本文所用，術語「目標位點」或「目標序列」係指在足以發生結合之條件下界定核酸中可與結合分子特異性結合之部分的基因體核酸序列。

依本文所用，與gRNA結合使用之術語「靶向域」係指gRNA分子中識別目標序列或與其互補之部分。舉例而言，細胞核酸內(例如基因內)之目標序列。

依本文所用，術語「目標序列」係指與gRNA靶向域互補，例如完全互補的核酸序列。在一些實施例中，目標序列安置於基因體DNA上。在一些實施例中，目標序列與(在同一股上或在DNA之互補股上)由具有核酸酶或其他效應活性之蛋白質識別之原間隔序列相鄰模體(PAM)序列，例如由Cas9識別之PAM序列相鄰。在一些實施例中，目標序列為同種異體T細胞目標之目標序列。在一些實施例中，目標序列為抑制分子之目標序列。在一些實施例中，目標序列為抑制分子之下游效應子之目標序列。

依本文所用，術語「T細胞受體」或「TCR」係指參與回應於抗原之呈現的T細胞活化的膜蛋白複合物。TCR負責識別結合於主要組織相容複合物分子之抗原。TCR由阿爾法(α)及貝塔(β)鏈之雜二聚體偶合至三個二聚模組CD3δ/CD3ε、CD3γ/CD3ε及CD3ζ/CD3ζ構成。在一些細胞中，TCR由γ及δ (γ/δ)鏈(CD3γ/CD3ε)組成。在一些實施例中，TCR可以α/β及γ/δ形式存在，其在結構上類似但具有不同的解剖位置及功能。各鏈由兩個胞外域(可變域及恆定域)構成。在一些實施例中，TCR可在包含TCR之任何細胞上經修飾，包括例如輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、自然殺手T細胞及γδ T細胞。

依本文所用，術語「治療」意謂治療及/或預防。藉由抑制、緩解或根除疾病病況來獲得治療效果。

依本文所用，術語「療法」係指可用於預防、管理、治療及/或改善疾病或與其相關之症狀的任何方案、方法及/或藥劑(例如CAR-T)。在一些實施例中，術語「療法(therapies)」及「療法(therapy)」係指生物療法(例如授受性細胞療法)、支持性療法(例如淋巴球耗乏療法)及/或適用於預防、管理、治療及/或改善熟習此項技術者，諸如醫療人員已知之疾病或與其相關之症狀的其他療法。

依本文所用，與gRNA分子結合使用之術語「Tracr」係指與核酸酶或其他效應分子結合之gRNA之一部分。在一些實施例中，tracr包含特異性結合於Cas9之核酸序列。在一些實施例中，tracr包含形成旗桿之一部分之核酸序列。依本文所用，術語「經轉染」或「經轉型」或「經轉導」係指外源性核酸被轉移或引入宿主細胞中之過程。「經轉染」或「經轉型」或「經轉導」細胞為經外源性核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括初代個體細胞及其後代。

依本文所用，術語「轉導」係指藉助於病毒感染而非轉染，使用反轉錄病毒或慢病毒載體遞送基因或其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之慢病毒載體經由感染及原病毒整合轉導至細胞中。在一些實施例中，若目標細胞(例如，T細胞)包含使用病毒或反轉錄病毒載體進行感染而被遞送至該細胞的基因或其他聚核苷酸序列，則該細胞「經轉導」。在特定實施例中，經轉導之細胞在其細胞基因體中包含藉由反轉錄病毒或慢病毒載體遞送之一或多個基因或其他聚核苷酸序列。

依本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指藉由投與一或多種療法(包括但不限於針對實體腫瘤治療之CAR-T療法)降低或改善疾病或與其相關之症狀的進展、嚴重程度、頻率及/或持續時間。依本文所用，術語「治療」亦可指改變所治療個體之疾病病程。治療之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之直接或間接病理結果、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病況態，及緩解或改善預後。

依本文所用，本文所使用之術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病病況來獲得治療效果。本文所使用之術語「預防」意謂疾病或疾病病況之預防或保護性治療。

依本文所用，本文中所使用之術語「在轉錄控制下」或「可操作地連接」意謂啟動子相對於聚核苷酸處於正確位置及方向以控制RNA聚合酶轉錄之起始及聚核苷酸之表現。

依本文所用，術語「任何給定序列之變異體」係如下序列，其中特定殘基(無論是胺基酸或核酸殘基)序列經修飾以使得所討論之多肽或聚核苷酸保留至少一種其內源性功能。存在於天然存在之蛋白質中之至少一個殘基之添加、缺失、取代、修飾、置換及/或變異可獲得變異序列。在一些實施例中，「變異體」係指具有與參考胺基酸序列實質上一致之胺基酸序列或由實質上一致之核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，變異體為功能變異體。依本文所用，術語「功能變異體」係指如下多肽，其具有與參考胺基酸序列實質上一致之胺基酸序列，或由實質上一致之核苷酸序列編碼，且能夠具有參考胺基酸序列之一或多種活性。

依本文所用，術語「載體」係指能夠轉移或轉運另一核酸分子之核酸分子。經轉移之核酸一般連接至載體核酸分子，例如插入載體核酸分子中。載體可包括導引細胞中之自主複製之序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA中之序列。在一些實施例中，載體為包含經分離之核酸且可用於將經分離之核酸遞送至細胞內部之物質組合物。此項技術中已知多種載體，包括但不限於線性聚核苷酸、與離子或兩親媒性化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應視為包括非質體及非病毒化合物，其促進核酸轉移至細胞中，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒載體之實例包括但不限於病毒載體、仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、質體(例如DNA質體或RNA質體)、轉座子、黏質體、細菌人工染色體及變異病毒載體。

依本文所用，術語「載體粒子生產系統」係指包含用於反轉錄病毒或慢病毒載體粒子生產所必需之組分的系統。

依本文所用，術語「病毒載體」廣泛用於指包括病毒衍生核酸元件(通常促進核酸分子轉移或整合至細胞基因體中)之核酸分子(例如轉移質體)，或指介導核酸轉移之病毒粒子。除核酸以外，病毒粒子將通常包括各種病毒組分，且有時亦包括宿主細胞組分。在一些實施例中，術語病毒載體可指能夠將核酸轉移至細胞中的病毒或病毒粒子，或指所轉移之核酸本身。病毒載體及轉移質體含有主要來源於病毒之結構及/或功能性基因元件。

依本文所用，術語「異種」係指來源於不同物種動物的移植物。實例

以下實例描述工程改造修飾之免疫細胞(例如T細胞)之新穎的製造製程，以供用於治療本文所描述之疾病或病症(例如癌症)之方法中。圖 1 至圖 10中繪示了此等製程之示意性說明。圖 1 、圖 2 、圖 4 、圖 9 及圖 10說明需要病毒轉導之製程。圖 3 及圖 5 至圖 8說明需要將病毒載體電穿孔至免疫細胞(例如，T細胞)而非被動病毒轉染之過程。此外，本文所描述之方法可以供體全血( 圖 2 、圖 4 、圖 6 及圖 8)、供體白血球分離術產物( 圖 1 、圖 3 、圖 5 及圖 7)或供體細胞( 圖 9 及圖 10)為起始物質。在轉染之前，通常可使供體全血或供體白血球分離術產物富集免疫細胞( 圖 3 、圖 4 、圖 7 及圖 8)或CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞( 圖 1 、圖 2 、圖 5 及圖 6)。實例 1 ：第 1-3 天 CAR T 細胞製造方法

T 細胞分離。在此方法中，使用習知細胞分離系統在臨床場所(例如，光泳或白血球分離術設備)將周邊T細胞或免疫細胞與供體全血分離。在一些情況下，起始產物為供體白血球分離物。此分離步驟包含使用CliniMACS Prodigy ^®機器進行免疫細胞選擇或T細胞選擇以富集CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞，隨後使用Prodigy ^®處理緩衝液進行一或多個洗滌步驟( 圖 1 至圖 6)。使用Gibco™ CTS™ Rotea逆流離心系統選擇免疫細胞( 圖 7 至圖 10)。為了特異性富集T細胞，CliniMACS Prodigy ^®機器與TS 520管狀套件及T細胞轉導(TCT)程式軟體版本1.0一起使用。將最終經富集之產物溶離於OpTmizer™完全T細胞介質中。純化T細胞或免疫細胞，且藉由流動式細胞測量術評定細胞之純度。將經純化之T細胞或免疫細胞在液氮中冷凍保存，直至需要使用。然而，較佳地，將經純化之細胞(例如T細胞或免疫細胞)在血球分離術及富集之後24小時內用編碼CAR、TCR之慢病毒載體或任何修飾劑轉染。在細胞培養開始時之最佳細胞為約1×10 ⁸個細胞。T細胞濃度及存活率藉由Cellometer Vision (Nexcelom)計數，藉由AO/PI染色測定。

培養物起始及轉導：慢病毒轉染發生於慢病毒載體系統(例如Lonza 4D-Nucleofector)之封閉T細胞轉染中。將經純化之細胞立即接種於培養容器中。在血球分離術或解凍之後24小時內，以每平方公分膜0.5×l0 ⁸個活細胞之密度在各容器接種，加上GMP級TransAct，且用OpTmizer™完全T細胞介質使最終濃度達到1.0×l0 ⁸個活細胞/毫升。

該介質可含有Dynabeads®磁珠，例如抗CD3/抗CD28珠粒，在一或多種諸如以下之細胞介素之存在下，最終珠粒與細胞比為約3:1：介白素-2 (IL-2)、介白素-3 (IL-3)、介白素-6 (IL-6)、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-11 (IL-11)、介白素-12 (IL-12)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、介白素-21 (IL-21)。然而，較佳細胞介素為IL-2、IL-7、IL-6、IL-15及/或IL-15Ra，此係因為觀測到T細胞在此等細胞介素存在下擴增顯著，T細胞增殖增加，且T細胞凋亡顯著減少(例如藉由活化Bcl-xl抗細胞凋亡路徑)。

隨後在室溫下使慢病毒載體解凍，且基於所估計之T細胞效價，在0.08、0.2、0.40、0.45或5.0之MOI下將其添加至各經轉導之培養物中。不添加慢病毒載體至對照容器中。在一些情況下，在相同MOI下將慢病毒載體電穿孔至T細胞中，而非被動轉導經富集之T細胞( 圖 3 、圖 5 至圖 8及圖 11)。接著使用交換緩衝液洗滌經轉染之細胞，且在上文所描述之一或多種細胞介素存在下，在Dynabeads®磁珠之存在下，以約3:1之最終珠粒與細胞比培養細胞。可在封閉系統T細胞擴增生物反應器，諸如Xuri™細胞擴增系統W25 - Girgin Ltd (或任何GE Healthcare之WAVE Bioreactor™技術)中接種經轉染之細胞，持續所需時間量(超過2小時且至多14天)，或達至所需擴增倍數(例如CAR T細胞或CAR免疫細胞擴增10倍) ( 圖 1 至圖 4及圖 9)。在培養開始後，在37℃及5% CO2下培育經轉染之細胞，直至準備好收集。

收集。在培養開始之後12至72小時或更長時間內收集經轉導之培養細胞。藉由旋轉容器收集細胞以平緩地使細胞自膜再懸浮，接著再懸浮全部培養體積且藉由血清移液管將其轉移至錐形管。獲取小的等分試樣用於預洗滌計數、存活率測定及流式染色。洗滌各培養物之剩餘部分兩次，呈50 mL-100 mL，使再懸浮，且進行洗滌後等分試樣以檢查計數及存活率。CliniMACS Prodigy亦可用於收集CAR T細胞。實例 2 ：電轉 CAR T 細胞製造方法

藉由用包含編碼CAR、TCR及/或增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸之慢病毒載體轉導免疫細胞之新穎策略，使得電轉CAR T細胞製造製程成為可能。

電轉CAR T細胞製造方法依賴於混合轉染方法，其組合上述實例1中所描述之生物轉染(基於病毒之轉導)及物理轉染，諸如電穿孔(例如Nucleofection ^®)。特定言之，將慢病毒粒子電穿孔至免疫細胞或T細胞中。將慢病毒粒子電穿孔至細胞中加速了病毒轉染/轉導，且允許1天製造CAR T細胞(例如，電轉CAR T細胞)而無需轉染後培養及/或擴增。依圖 5 至圖 8及圖 10中所示，在數小時內收集電穿孔細胞。依實例3及4中所論述，以及圖 11及表 4 至表 6中所示，電轉CAR T細胞有效殺死目標細胞以及習知CAR T細胞。

使用圖 7或圖 8中所示之慢病毒核轉染工作流程產生超速電轉CAR T細胞。用於製造製程之起始物質為全血或白血球分離物。使用此項技術中已知之技術自此起始物質分離T細胞(例如，對T細胞進行磁性標記，接著進行磁性分離)。接著使用Lonza 4D Nucleofactor™系統(慢病毒Nucleofection™)，用編碼CAR (例如CD19 CAR)之慢病毒載體對經分離之T細胞進行電穿孔。用全能核酸酶(benzonase)處理慢病毒。在變化的溫度下靜置經轉染之T細胞(電轉CAR T細胞)，且接著使用ThermoFisher™科學控速冷凍箱冷凍保存。接著將電轉CAR T細胞置放於冷凍儲存室中直至需要。使用此製造製程產生電轉CAR T細胞不需要細胞介素及/或離體培養過程。

首先藉由PCR，使用土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列作為擴增子(尺寸為約1.5 kb)來評定電轉CAR T細胞以確定CAR轉殖基因是否已被整合至基因體中。藉由PCR測試四組所製造之CAR T細胞：(1)經刺激(例如經CD3/CD28Dynabeads®刺激)且經CAR慢病毒載體電穿孔(例如核轉染)之CAR T細胞；(2)經刺激且包含CAR慢病毒載體但無核轉染之CAR T細胞；(3)經CAR慢病毒載體電穿孔之CAR T細胞；及(4)在無任何刺激或核轉染存在下含有CAR慢病毒載體之CAR T細胞。PCR結果展示，所有四組細胞表現WPRE核酸序列。出乎意料地，兩組經電穿孔之細胞展示強度實質上類似之較高PCR產物。此等結果展示，CAR慢病毒載體之核轉染引起CAR轉殖基因有效整合至T細胞基因體中。此外，在有或無CD3/CD28 Dynabeads®刺激下產生之電轉CAR T細胞的整合效率實質上類似。

亦評估電轉CAR T細胞以確定整合至各T細胞中之慢病毒載體複本數。此分析展示，電轉CAR T細胞中每個細胞的慢病毒載體複本數實質上類似或稍高於用習知(例如，經轉導；TDN) CAR T細胞獲得之每個細胞的載體複本數。舉例而言，電轉CD19 CAR T細胞中每個細胞的載體複本數為約1.00至約1.50個複本/細胞，而習知CD19 CAR T細胞中每個細胞的複本數為約1.00至約1.25個複本/細胞。

為測定核轉染後CAR轉殖基因表現率，使用CAR WPRE序列，在電穿孔之後1、2及4小時對電轉CD19 CAR T細胞進行定量性RTPCR。GAPDH基因用作對照。平均CAR WPRE計數(CT；qRTPCR循環臨限值)在電穿孔後1小時為約23.269 CT，在電穿孔後2小時為約23.892 CT，且在電穿孔後4小時為約22.393 CT。GAPDH CT在電穿孔後1小時為約31.687 CT，在電穿孔後2小時為約32.764 CT，且在電穿孔後4小時為約29.645 CT。經空載體(無慢病毒)電穿孔之T細胞之平均GAPDH CT在電穿孔後1小時為約33.449 CT，在電穿孔後2小時為約29.904 CT，且在電穿孔後4小時為約29.135 CT。此等結果展示，編碼CAR轉殖基因之mRNA在核轉染後約1小時內表現。實例 3 ： 將極低 MOI 慢病毒載體電穿孔至初代人類 T 細胞中產生大量電轉 CAR-T 細胞 .

此實例描述本文所揭示之混合慢病毒轉染系統在生產電轉CAR T細胞時之效率。

在第0天，藉由Ficoll提取自全血分離健康人類供體周邊血液單核細胞(PBMC)，且使用泛T細胞分離套組II (Miltenyi Biotec)藉由負向選擇自PBMC分離T細胞。在用包含編碼CD19 CAR之核酸分子的實例1中所描述之慢病毒載體電穿孔之前，對經分離之T細胞進行刺激或不進行刺激。在0.2 MOI下用5 µl慢病毒，在0.08 MOI下用2 µl慢病毒，且在0.4 MOI下用10 µl慢病毒載體對細胞進行電穿孔。所有均處於小於2.5轉染單位/細胞(Tu/細胞)之MOI下。依表 2中所示，在極低MOI下用慢病毒對經刺激之T細胞進行電穿孔產生佔顯著百分比之CD19 CAR陽性T細胞(CAR ⁺)。具體言之，當與未染色(0%)或未經轉導之T細胞(0.13%)相比時，經刺激之T細胞在0.08 MOI下用2 µl慢病毒電穿孔產生12.3% CD19 CAR ⁺T細胞。當與未染色(0%)或未經轉導之細胞(0.13%)相比時，經刺激之T細胞在0.2 MOI下用5 µl慢病毒電穿孔產生18.9% CD19 CAR ⁺T細胞。

表 2	CAR 陽性 T 細胞 %
未染色	0
未經轉導	0.13
(EP) + 2 μl LVV MOI = 0.08	12.3
EP + 5 μl LVV MOI = 0.2	18.9
EP：電穿孔；LVV：慢病毒載體；對活T細胞進行門控

表 3展示在極低MOI下用慢病毒對未經刺激之T細胞進行電穿孔在電穿孔後五天產生佔顯著百分比之CD19 CAR陽性T細胞(CAR ⁺)。具體言之，當與未染色(0%)或未經轉導之細胞(0.5%)相比時，未經刺激之T細胞在0.08 MOI下用2 µl慢病毒電穿孔產生1.7% CD19 CAR ⁺T細胞。而當與未染色(0%)或未經轉導之細胞(0.13%)相比時，未經刺激之T細胞在0.2 MOI下用5 µl慢病毒電穿孔產生3.4% CD19 CAR ⁺T細胞。當與未染色(0%)或未經轉導之細胞(0.13%)相比時，未經刺激之T細胞在0.4 MOI下用10 µl慢病毒電穿孔產生6.5% CD19 CAR ⁺T細胞。

表 3	CAR 陽性細胞
未染色	0.0
EP對照	0.5
(EP) + 2 μl LVV MOI = 0.08	1.7
EP + 5 μl LVV MOI = 0.2	3.4
EP + 10 μl LVV MOI = 0.4	6.5
EP：電穿孔；LVV：慢病毒載體；對活T細胞進行門控；在EP後第5天進行流式

另外，人類T細胞用編碼抗CD19 CAR之慢病毒載體進行核轉染。所產生之電轉CAR T細胞既不離體活化亦不擴增。核轉染後5-6天，藉由流動式細胞測量術評定CAR表現，使用特異性識別CD19-FMC63結合子之抗個體基因型抗體(CAR19-FMC63純系)，且對活T細胞進行門控以測定CAR表現。在約0.4之MOI下使用慢病毒載體。流動式細胞測量術分析展示，經CD19慢病毒載體電穿孔(NF+LVV)之T細胞具有39.8%之CD19 CAR ⁺T細胞。未接受慢病毒及電穿孔(無LVV及NF)之T細胞具有0.0% CD19 CAR陽性CAR T細胞，僅接受慢病毒載體且未經電穿孔(LVV且無NF)之T細胞具有3.5% CD19 CAR陽性CAR T細胞。

此實例證實，在極低MOI下慢病毒載體在未經刺激及經刺激之初代人類T細胞中電穿孔產生大量CAR-T細胞。當與引起T細胞中約1-3% CAR表現之習知方法相比時，本文揭示之電穿孔率極高。另外，此系統具有成本效益，此係因為一批細胞使用習知方法每批可花費100萬美元，其足以治療約8名患者。然而，本文所揭示之方法將產生足以輸注約20名患者之CAR T細胞批料。因此，本文所揭示之方法在相同成本下使患者之數目增加一倍或兩倍且顯著減少每名患者之CAR T細胞成本。實例 4 ： 大部分電轉 CAR T 細胞維持較低分化表型 .

此實例說明，使用所揭示之混合轉染系統製造之電轉CAR T細胞產生表型已知能在投與癌症患者時促進CART細胞持久性及潛能的CAR T細胞。

為進一步表徵電轉CAR T細胞之表型，依上文所述用編碼抗CD19 CAR之慢病毒載體對人類T細胞進行核轉染。接著評定趨化介素受體CCR7 (參與淋巴球再循環至淋巴結之分子)及CD45RO之表現，以測定原生T細胞(CD45RO ^-CCR7 ⁺)、中樞記憶T細胞(CD45RO ⁺CCR7 ⁺)、效應記憶T細胞(CD45RO ⁺CCR7 ⁻)及末端效應T細胞(CD45RO ^-CCR7 ^-)群。

未經電穿孔但含有慢病毒載體(僅LVV (無NF)之T細胞具有51.1%原生T細胞、18.7%中樞記憶T細胞、21%效應記憶T細胞及8.9%末端效應T細胞。藉由Nucleofection™方案1 (NF+LVV(1))產生之CD19電轉CAR T細胞具有58%原生T細胞、17%中樞記憶T細胞、19.2%效應記憶T細胞及4.88%末端效應T細胞。藉由Nucleofection™方案2 (NF+LVV(2))產生之CD19電轉CAR T細胞具有49.4%原生T細胞、29.2%中樞記憶T細胞、18.1%效應記憶T細胞及3.28%末端效應T細胞。此等細胞未經CD3/CD28 Dynabeads™刺激。

表 4及表 5展示電轉CAR T細胞之表型分析，證實當與經CD3/CD28 Dynabeeads ^®刺激11天之電轉CAR T細胞( 表 5)相比時，大部分電轉CAR T細胞維持較低分化表型(表4「原生」)。方案1及方案2代表按照製造商指示(Lonza, 4D Nucleofector)之不同核轉染編碼。其中所揭示之資料為使用正常供體T細胞之兩個獨立實驗(n=2)的代表性平均值。

依表 4中所示，大部分電轉CAR T細胞在缺乏刺激的情況下在電穿孔之後保留較低分化表型。舉例而言，在未經刺激之電轉CAR T細胞中，原生T細胞群之百分比在對照處理(僅LVV，無核轉染(無NF)及兩個實驗核轉染方案之間無變化。原生電轉CAR T細胞群之百分比為約50%。

表 4	原生	中樞記憶	效應記憶	末端效應
僅LVV (無NF)	51.1	18.7	21	8.9
NF+ LVV(1)	58	17.9	19.2	4.88
NF+ LVV(2)	49.4	29.2	18.1	3.28

相比之下，當用CD3/CD28 Dynabeads ^®刺激電轉CAR T細胞11天時，大部分電轉CAR T細胞之表型改變。未經電穿孔但含有慢病毒載體(僅LVV (無NF)之經刺激之T細胞具有2.14%原生T細胞、9.86%中樞記憶T細胞、72.9%效應記憶T細胞及15.1%末端效應T細胞。用Nucleofection™方案1 (NF+LVV(1))產生之經刺激之CD19電轉CAR T細胞具有8.18%原生T細胞、50.4%中樞記憶T細胞、37.6%效應記憶T細胞及3.84%末端效應T細胞。用Nucleofection™方案2 (NF+LVV(2))產生之經刺激之CD19電轉CAR T細胞具有1.37%原生T細胞、8.08%中樞記憶T細胞、76.2%效應記憶T細胞及14.3%末端效應T細胞。

因此，與表 4相比，大部分經刺激之電轉CAR T細胞具有較高分化表型(例如效應記憶T細胞) ( 表 5)。方案1及方案2代表按照製造商指示(Lonza, 4D Nucleofector)之不同核轉染編碼。實驗展示使用正常供體T細胞之兩個獨立實驗(n=2)的代表性平均值。

表 5	原生	中樞記憶	效應記憶	末端效應
僅LVV (無NF)	2.14	9.86	72.9	15.1
NF+ LVV(1)	8.18	50.4	37.6	3.84
NF+ LVV(2)	1.37	8.08	76.2	14.3

由於未經刺激之電轉CAR T細胞未經離體活化(例如，不同於在7-12天製程中產生之習知CART細胞)，所以藉由本文所揭示之方法產生之最終CART產物因此等CAR T細胞保留了未活化(亦即較低分化)表型而為一項合乎需要的改良。未活化表型係合乎需要的，因為已知其促進癌症患者之CART細胞持久性及潛能。實例 5 ：電轉 CD19 CAR T 細胞 (CART19 細胞 ) 具有較高細胞毒性 .

此實例說明使用本文揭示之混合轉染系統製造的電轉CAR T細胞具有較高細胞毒性。

藉由實例2中所描述之方法產生電轉CD19 CAR T細胞，且對其評估以確定經電穿孔之CD19 CART細胞活體外回應於表現CD19之目標細胞(NaLm6細胞)之殺死效率。在第0天使用新鮮或解凍的CD19 CART細胞且將其培育隔夜以回收。在第1天，將CD19 CART細胞與表現CD19之NaLm6-螢光素酶或NaLm6-S-螢光素酶目標細胞以0至20範圍內之E:T比一起培育。在第2天使用Bright-Glo受質量測由細胞殺傷引起之螢光素酶信號損失，且根據下式計算比溶解率：比溶解率(%)=100-(樣品冷光/平均最大冷光)*100。

依圖 11中所示，經慢病毒載體轉染之CD19 CAR T細胞(電轉CART19細胞)有效殺死目標細胞。經刺激及電穿孔之CD19 CAR T細胞(EP+刺激)在殺死癌細胞方面與典型經轉導之CAR T細胞(刺激)一樣高效(100%)。未經刺激且經電穿孔之CD19 CAR T細胞亦有效殺死目標細胞(例如相較於對照目標細胞，殺死超過60%之CD19表現細胞)。此外，全部經電穿孔之PBMC亦展示細胞毒活性(一般群體減少約15%)。

為了進一步測定電轉CD19 CAR T細胞之殺死能力，將目標腫瘤細胞，諸如表現GFP之Nalm6白血病細胞株(「目標細胞」)與增加之量的電轉CART細胞(亦即，「效應細胞」)共培養48小時之時段。效應細胞:目標細胞比包括10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1及0.31:1。為測定電轉CART細胞之細胞殺死百分比，將結合於死細胞之 eTox染料(紅色螢光)添加至電轉CAR T細胞-GFP NaLm6共培養物之上清液中，且測定平均螢光強度(mfi)，展示於表 6中。

表 6展示電轉CAR T細胞之腫瘤細胞殺死能力，且證實靶向CD19之電轉CART細胞以及習知T細胞在各種效應細胞:目標細胞比下有效殺死Nalm6細胞(CD19 ⁺)。將目標腫瘤細胞(表現GFP之Nalm6白血病細胞株；「目標細胞」)與增加之量的CART細胞(亦即，「效應細胞」)共培養48小時之時段。為了測定CART細胞之細胞殺死百分比，將 eTox染料添加至培養物之上清液中(紅色螢光)。未經轉導之T細胞在未添加載體之情況下為未經活化、擴增了9天之T細胞。習知 CAR T為經CAR19慢病毒轉導且擴增了9天之活化T細胞。 經核轉染且無 LVV為無慢病毒之經核轉染之T細胞。資料為展示平均值之使用正常供體T細胞之3個獨立實驗(n=3)的代表性資料。

對於未經轉導之T細胞，目標細胞殺死百分比在10:1之E:T下為約10%；在5:1之E:T下為約5%；在2.5:1之E:T下為約2%；在1.25:1之E:T下為約0%；在0.62:1之E:T下為約0%；且在0.31:1之E:T下為約0%。對於無慢病毒載體的經電穿孔之T細胞(NF，無LVV)，目標細胞殺死百分比在10:1之E:T下為約10%；在5:1之E:T下為約5%；在2.5:1之E:T下為約1%；在1.25:1之E:T下為約0%；在0.62:1之E:T下為約0%；且在0.31:1之E:T下為約0%。對於習知CAR T細胞，目標細胞殺死百分比在10:1之E:T下為約100%；在5:1之E:T下為約100%；在2.5:1之E:T下為約100%；在1.25:1之E:T下為約80%；在0.62:1之E:T下為約80%；且在0.31:1之E:T下為約60%。

表 6	在各種效應細胞 : 目標細胞比下目標細胞殺死 %
僅目標	10:1	5:1	2.5:1	1.25:1	0.62:1	0.31:1
未經轉導	0	10	5	2	0	0	0
習知 CART	0	100	100	100	80	80	60
NF ，無 LVV	0	10	5	1	0	0	0
電轉 CAR	0	100	100	80	50	20	2

對於電轉CAR T細胞，目標細胞殺死百分比在10:1之E:T下為約100%；在5:1之E:T下為約100%；在2.5:1之E:T下為約80%；在1.25:1之E:T下為約50%；在0.62:1之E:T下為約20%；且在0.31:1之E:T下為約2%。

表 6展示當與未經轉導之T細胞(0%)、習知CAR T細胞(80%)及經空載體(無LVV)核轉染之T細胞(0%)相比時，電轉CAR T細胞在低至0.62:1之E:T比下有效殺死目標細胞(殺死20%目標細胞)。顯著地，使用1天方案製造且具有較低分化表型的電轉CAR T細胞在以5:1之E:T殺死目標細胞(100%殺死)方面與需要9天製造的習知T細胞一樣有效。

最後，製造製程具成本效益，此係因為一批細胞使用習知方法每批可花費100萬美元，其足以治療約8名患者。然而，本文所揭示之方法將產生足以輸注約20名患者之CAR T細胞批料。因此，本文所揭示之方法在相同成本下使治療患者之數目增加一倍或兩倍且顯著減少每名患者之CAR T細胞成本。 * * * * * * * * * * * *

雖然已說明且描述了某些實施例，但應理解，可根據一般熟習此項技術者在不脫離如以下申請專利範圍中所界定之其較廣態樣之技術之情況下在其中進行改變及修改。

本文例示性地描述之實施例可在無本文未具體揭示之任何一或多個要素、任何一或多個限制之情況下適當地實踐。因此，舉例而言，應當廣泛地而非限制性地理解術語「包含」、「包括」、「含有」等。另外，片語「主要由……組成」應理解為包括彼等特別列舉之要素及彼等並未顯著影響所主張之技術的基本及新穎特徵之額外要素。片語「由……組成」不包含任何未規定之要素。

表 1揭示用於本文所描述之方法中之核酸及胺基酸序列。

表1
SEQ ID NO:	描述	序列
1	G [印第安納水泡性口炎病毒].登錄號QQL06413	MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGTWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNDICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISTDITFFSEDGELSSLGKGGTGFRSNHFAYETGDKACKMQYCRHWGVRLPSGVWFEMDDKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIVAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDETLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSGWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIYLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK
2	水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)跨膜域	IASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLC
3	水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)跨膜域	SSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLC
4	VSV-G TM變異體	IASFFFIIG SSIGL ALVL AGIHLC
5	VSV-G TM變異體	SSIASFFFIIG SSIGL ALVL AGIHLC
6	VSV-G TM變異體	IASFFFIIG SSIGLFLVL AGIHLC
7	VSV-G TM變異體	IASFFFIIG SSIGL ALVLRVGIHLC
8	VSV-G TM變異體	IASFFFIIG SSIGL ALVLR AGIHLC
9	VSV-G TM變異體-缺失	SSIASFFFIIFLVLRVGIHLC
10	VSV-G TM變異體	SSIASFFFII ALII ALFLVLRVGIHLC
11	VSV-G TM變異體	SSIASFFFII LLII LLFLVLRVGIHLC
12	VSV-G TM變異體	SSIASFFFII ALIIGLFLVLRVGIHLC
13	VSV-G TM變異體	SSIASFFFIIGLII ALFLVLRVGIHLC
14	VSV-G TM變異體	IASFFFIIG SSIGL ALVLR AGIHLC
15	流感血球凝集素A鏈跨膜域	ILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLW
16	VAMP 2跨膜域	MMIILGVICAIILIIIIVYFST
17	突觸蛋白跨膜域	IMIICCVILGIIIASTIGGIFG
18	流感血球凝集素A鏈 HEMA_I75A2 登錄號P43257	QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHKILDGRDCTLIDALLGDPHCDVFQDETWDLFVERGNAFSSCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSSACKRGPASGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTNLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGQSGRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCVSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNSLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIKKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNADVLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDIYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDW ILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
19	流感血球凝集素A鏈 HA 登錄號ABQ09853.1	MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSAACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQ ILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICIKFVSSDD
20	突觸蛋白1A，登錄號NM_053788	MKDRTQELRT AKDSDDDDDV TVTVDRDRFM DEFFEQVEEI RGFIDKIAEN VEEVKRKHSAILASPNPDEK TKEELEELMS DIKKTANKVR SKLKSIEQSI EQEEGLNRSS ADLRIRKTQHSTLSRKFVEV MSEYNATQSD YRERCKGRIQ RQLEITGRTT TSEELEDMLE SGNPAIFASGIIMDSSISKQ ALSEIETRHS EIIKLENSIR ELHDMFMDMA MLVESQGEMI DRIEYNVEHAVDYVERAVSD TKKAVKYQSK ARRKKIMIII CCVILGIIIA STIGGIFG
21	VAMP2，登錄號AAH55105	MSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWW KNLKMMIILG VICAIILIIIIVYFST
22	科卡爾包膜胺基酸	MNFLLLTFIVLPLCSHAKFSIVFPQSQKGNWKNVPSSYHYCPSSSDQNWHNDLLGITMKVKMPKTHKAIQADGWMCHAAKWITTCDFRWYGPKYITHSIHSIQPTSEQCKESIKQTKQGTWMSPGFPPQNCGYATVTDSVAVVVQATPHHVLVDEYTGEWIDSQFPNGKCETEECETVHNSTVWYSDYKVTGLCDATLVDTEITFFSEDGKKESIGKPNTGYRSNYFAYEKGDKVCKMNYCKHAGVRLPSGVWFEFVDQDVYAAAKLPECPVGATISAPTQTSVDVSLILDVERILDYSLCQETWSKIRSKQPVSPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRIDIDNPIISKMVGKISGSQTERELWTEWFPYEGVEIGPNGILKTPTGYKFPLFMIGHGMLDSDLHKTSQAEVFEHPHLAEAPKQLPEEETLFFGDTGISKNPVELIEGWFSSWKSTVVTFFFAIGVFILLYVVARIVIAVRYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK
23	科卡爾包膜核酸	atgaacttcctcctgctgacttttatcgtgctgcctctctgctcccacgccaagttctcgattgtgttcccccaatcccaaaaggggaactggaagaatgtgccctcctcgtaccactactgcccgtcctcctccgaccaaaactggcacaacgatctgctcggaatcaccatgaaggtcaagatgcccaagacccataaggctattcaggccgacggctggatgtgccacgccgcgaagtggatcaccacctgtgacttccggtggtacggtccgaagtacatcactcactcgattcactcaattcagccgactagcgagcagtgcaaagagagcatcaagcagacgaagcagggcacatggatgtcccccggattccctccccaaaactgcggatatgcgaccgtgaccgatagcgtggccgtggtggtgcaggccacccctcatcatgtgcttgtggatgagtacaccggagaatggatcgacagccagttcccgaacggaaaatgcgaaaccgaggagtgcgagactgtccacaactccactgtgtggtactccgactacaaggtcacgggcttgtgcgacgcgactttggtggacaccgaaatcaccttctttagcgaggatggaaagaaggagtccatcggcaaaccgaacactggttaccgctccaattacttcgcgtacgaaaagggagacaaagtctgcaagatgaattactgcaagcacgccggtgtcaggctgccatcaggagtgtggttcgaattcgtggaccaggacgtgtacgctgccgcgaagcttccggaatgtccagtcggggcaaccatttccgcaccgactcagacctctgtggatgtgtccctgatcctggacgtcgagagaatcctggactacagcctgtgtcaggagacttggtcgaagattcgctccaagcagcccgtgtcacctgtggatctgtcgtatctggccccgaagaaccctggtaccggcccagcctttaccatcataaacgggaccctgaagtacttcgaaactcggtatattcggattgacatcgacaaccccatcatctcgaaaatggtcggaaagatcagcggatcccagacagaaagggaactctggaccgaatggttcccgtacgagggcgtggaaatcggtccgaacgggatcctgaaaactcctacgggctacaagttccccctcttcatgattgggcatggcatgctggactccgatctccacaagacctcccaagctgaagtgttcgagcaccctcacctggccgaagcacccaagcagctgccagaggaagaaaccctcttcttcggggacaccggaatctcgaagaacccggtggaactgattgagggctggttctcatcatggaagtccaccgtggtcaccttcttcttcgccatcggagtgtttatcctgctttacgtggtggcccgcatcgtgattgccgtgcggtacagataccagggctccaacaacaagcgcatctacaacgatatcgagatgagccggttccgcaagtaa
24	連接子	GGSG
25	連接子	GGSGG
26	連接子	GSGSG
27	連接子	GSGGG
28	連接子	GGGSG
29	連接子	GSSSG
30	連接子	GGGGS
31	連接子	GGGGSGGGGSGGGGS
32	連接子	GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT
33	CD8阿爾法(CD8α)跨膜域胺基酸序列	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
34	CD8阿爾法(CD8α)跨膜域核酸序列	ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
35	CD8阿爾法(CD8α)鉸鏈域胺基酸序列	TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
36	CD8阿爾法(CD8α)鉸鏈域核酸序列	ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
37	CD28跨膜域胺基酸序列	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
38	CD28跨膜域核酸序列	TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
39	鉸鏈	DKTHT
40	鉸鏈	CPPC
41	鉸鏈	CPEPKSCDTPPPCPR
42	鉸鏈	ELKTPLGDTTHT
43	鉸鏈	KSCDKTHTCP
44	鉸鏈	KCCVDCP
45	鉸鏈	KYGPPCP
46	人類IgG1鉸鏈	EPKSCDKTHTCPPCP
47	人類IgG2鉸鏈	ERKCCVECPPCP
48	人類IgG3鉸鏈	ELKTPLGDTTHTCPRCP
49	人類IgG4鉸鏈	SPNMVPHAHHAQ
50	CD3ζ胞內信號傳導域胺基酸序列	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
51	CD3ζ胞內信號傳導域核酸序列	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
52	CD3ζ (Q14K)胞內信號傳導域胺基酸序列	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
53	CD3ζ (Q14K)胞內信號傳導域核酸序列	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
54	4-1BB協同刺激域胺基酸序列	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
55	4-1BB協同刺激域核酸序列#1	AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGACGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
56	4-1BB協同刺激域核酸序列#2	AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
57	CD28協同刺激域胺基酸序列	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
58	CD28協同刺激域核酸序列	AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
59	CD28(YMFM)協同刺激域胺基酸序列	RSKRSRLLHSDYMFMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
60	CD28(YMFM)協同刺激域核酸序列	AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGTTCATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
61	ICOS協同刺激域胺基酸序列	TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
62	ICOS協同刺激域核酸序列#1	ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
63	ICOS協同刺激域核酸序列#2	ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTA
64	ICOS(YMNM)協同刺激域胺基酸序列	TKKKYSSSVHDPNGEYMNMRAVNTAKKSRLTDVTL
65	ICOS(YMNM)協同刺激域核酸序列	ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGAACATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
66	CD2協同刺激域胺基酸序列	TKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN
67	CD2協同刺激域核酸序列	ACCAAAAGGAAAAAACAGAGGAGTCGGAGAAATGATGAGGAGCTGGAGACAAGAGCCCACAGAGTAGCTACTGAAGAAAGGGGCCGGAAGCCCCACCAAATTCCAGCTTCAACCCCTCAGAATCCAGCAACTTCCCAACATCCTCCTCCACCACCTGGTCATCGTTCCCAGGCACCTAGTCATCGTCCCCCGCCTCCTGGACACCGTGTTCAGCACCAGCCTCAGAAGAGGCCTCCTGCTCCGTCGGGCACACAAGTTCACCAGCAGAAAGGCCCGCCCCTCCCCAGACCTCGAGTTCAGCCAAAACCTCCCCATGGGGCAGCAGAAAACTCATTGTCCCCTTCCTCTAAT
68	CD27協同刺激域胺基酸序列	QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
69	CD27協同刺激域核酸序列	CAACGAAGGAAATATAGATCAAACAAAGGAGAAAGTCCTGTGGAGCCTGCAGAGCCTTGTCGTTACAGCTGCCCCAGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGATTACCGAAAACCGGAGCCTGCCTGCTCCCCC
70	OX40協同刺激域胺基酸序列	ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
71	OX40協同刺激域核酸序列	GCCCTGTACCTGCTCCGCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCAGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC

同等物

本發明技術就描述於本申請案中之特定實施例而言不受限，該等特定實施例預期為對本發明技術之個別態樣的單一說明。在不脫離本發明技術之精神及範疇之情況下可對其作出諸多修改及改變，此對於熟習此項技術者而言將是顯而易知的。根據前述描述，除本文中所列舉之方法及設備外，在本發明技術之範疇內之功能上等效之方法及設備對於熟習此項技術者而言將是顯而易見的。此類修改及變化意欲屬於本發明技術之範疇內。應理解，本發明技術不限於特定方法、試劑、化合物組合物或生物系統，其理所當然可有所變化。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的。

另外，在根據Markush組描述本發明之特徵或態樣時，熟習此項技術者應認識到，本發明由此亦根據Markush組成員之任何個別成員或子組進行描述。

熟習此項技術者應理解，出於任何及所有目的，尤其就提供書面說明而言，本文中所揭示之所有範圍亦涵蓋其任何及所有可能的子範圍及子範圍組合。任何列出之範圍可因充分地描述及能夠使同一範圍分解成至少相等的兩份、三份、四份、五份、十份等而容易地識別。作為非限制性實例，本文所論述的各範圍可容易地分解為下部三分之一、中間三分之一及上部三分之一等。熟習此項技術者亦應理解，所有諸如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」及其類似者之語言均包括所列舉之數字，且指可隨後分解為上文所論述之子範圍的範圍。最終，熟悉此項技術者將理解，範圍包括各個別成員。因此，舉例而言，具有1-3個單元之群組係指具有1、2或3個單元之群組。類似地，具有1-5個單元之群組係指具有1個、2個、3個、4個或5個單元之群組，諸如此類。參考文獻併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度就如同特定且個別地指示各個別公開案、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。就以引用的方式併入之公開案及專利或專利申請案與本說明書所含之揭示內容相矛盾而言，本說明書意欲替代及/或優先於任何此類矛盾之材料。

圖 1展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速T細胞工程改造平台(1A)的示意圖。此平台1A包含在第0天獲得及處理供體白血球分離物，選擇CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞，在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後在收集之前至少約1小時至約72小時進行細胞活化及離體培養與擴增(例如D0-D3培養與擴增)。收集的經工程改造之T細胞冷凍保存或投與有需要之個體。

圖 2展示說明在圖 1之D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速T細胞工程改造平台(1B)的示意圖，其中該製程以供體全血而非供體白血球分離物為起始物質。

圖 3展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速免疫細胞工程改造平台(1C)的示意圖。此平台1C包含在第0天獲得及處理供體白血球分離物，選擇免疫細胞(白血球及/或其他免疫細胞)，在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後在收集之前至少約1小時至約72小時進行細胞活化及離體培養與擴增(例如D0-D3培養與擴增)。收集的經工程改造之免疫細胞冷凍保存或投與有需要之個體。

圖 4展示說明在圖 3之D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速免疫細胞工程改造平台(1D)的示意圖，其中該製程以供體全血而非供體白血球分離物為起始物質。

圖 5展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速非離體培養T細胞工程改造平台(2A)的示意圖。此平台2A包含在第0天獲得及處理供體白血球分離物，選擇CD4 ⁺及CD8 ⁺，在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後收集細胞而不在轉染之後進行培養或擴增。收集的經工程改造之T細胞冷凍保存或投與有需要之個體。

圖 6展示說明在圖 5之D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速非離體培養T細胞工程改造平台(2B)的示意圖，其中該製程以供體全血而非供體白血球分離物為起始物質。

圖 7展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速非離體培養免疫細胞工程改造平台(3A)的示意圖。此平台3A包含在第0天獲得及處理供體白血球分離物，選擇免疫細胞(白血球及/或其他免疫細胞)，在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後收集細胞。收集的經工程改造之細胞冷凍保存或投與有需要之個體。

圖 8展示說明在圖 5之D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速非離體培養免疫細胞工程改造平台(3B)的示意圖，其中該製程以供體全血而非供體白血球分離物為起始物質。

圖 9展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速真核細胞工程改造平台(4A)的示意圖。此平台4A包含在第0天獲得及處理供體真核細胞(例如哺乳動物細胞、人類細胞)，選擇特定細胞類型(上皮細胞、間質細胞、纖維母細胞、神經細胞或幹細胞)及在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後在收集之前至少約1小時至約72小時進行細胞活化及離體培養與擴增(例如D0-D3培養與擴增)。收集的經工程改造之真核細胞冷凍保存或立即使用。

圖 10展示說明在D0使用整合慢病毒載體(LVV)轉染之快速非離體培養真核細胞工程改造平台(4B)的示意圖。此平台4B包含在第0天獲得及處理供體真核細胞，選擇特定細胞類型(上皮細胞、間質細胞、纖維母細胞、神經細胞或幹細胞)及在封閉系統中進行慢病毒載體轉染，之後收集細胞。收集的真核細胞冷凍保存或立即使用。

圖 11展示概述CD19 CART細胞-Nalm6共培養分析之結果的條形圖，其說明藉由本文揭示之利用慢病毒轉染的新穎製造製程產生之CD19 CAR T細胞(電轉CAR T細胞(Electric CAR T cell))對於目標腫瘤細胞具有較高細胞毒性，其經活體外Nalm6殺死說明。所示為兩至三個獨立實驗(n=2-3)之代表性平均值。平均值±SEM ***p＜0.005。

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Claims

一種用於製造經工程改造之免疫細胞群的方法，該方法包含： (a) 從獲自個體之血液富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群； (b) 將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及 (c) 用有效劑量之修飾劑轉染淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群；其中步驟1(a)-(c)發生在24小時內。
如請求項1之方法，其中在該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群之該富集之前，藉由選自用以產生血球分離術產物之以下血球分離術將該血液分離成血漿組分、含單核細胞層、血小板層及紅血球：紅血球分離術、血栓分離術、栓球分離術、白血球分離術、幹細胞、血漿分離術及血小板分離術。
如請求項1或2之方法，其中該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群係經以血球分離術、淘析(elutriation)或梯度離心富集。
一種用於製造經工程改造之免疫細胞群的方法，該方法包含： (a) 自供體血液進行白血球分離術富集淋巴球群、免疫細胞群或CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群； (b) 將該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及 (c) 用有效劑量之修飾劑轉染該淋巴球群、該免疫細胞群或該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群，由此產生經修飾之淋巴球群、經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群，其中步驟1(a)-(c)發生在24小時內。
一種用於製造經工程改造之真核細胞群的方法，該方法包含： (a) 自個體獲得真核供體細胞群； (b) 將該真核供體細胞群與一或多種緩衝溶液摻合；及 (c) 用有效劑量之修飾劑轉染該真核供體細胞群，由此產生經修飾之真核供體細胞群，其中步驟1(a)-(c)發生在同一天。
如請求項1至6中任一項之方法，其中在該轉染步驟(c)之前，用一或多種刺激劑刺激及/或活化該免疫細胞群、該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該真核供體細胞群。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該修飾劑係選自由以下組成之群：小分子試劑、生物製劑、治療劑、蛋白質、肽、蛋白質治療劑、肽治療劑、嵌合抗原受體、異源T細胞受體、病毒載體、載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該修飾劑係： (a) 選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體； (b) 慢病毒載體；或 (c) 反轉錄病毒載體。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該免疫細胞群、該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該真核供體細胞群係經有效劑量之慢病毒載體或反轉錄病毒載體轉染。
如請求項9之方法，其中該慢病毒載體或該反轉錄病毒載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體(TCR)的核酸序列及/或編碼增強免疫細胞功能之多肽或其功能衍生物的核酸序列，或產生治療蛋白。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該免疫細胞群或該真核供體細胞群係選自由以下組成之群：單核細胞、富淋巴球細胞、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4 ⁺T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。
如請求項1至11中任一項之方法，其中該免疫細胞群、該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該真核供體細胞群之濃度為： (a) 至少約0.7×10 ⁷、至少約0.8×10 ⁷、至少約0.9×10 ⁷、至少約1×10 ⁷、至少約2×10 ⁷、至少約4×10 ⁷、至少約6×10 ⁷、至少約8×10 ⁷、至少約1×10 ⁸或至少約5×10 ⁸個細胞/毫升； (b) 約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約4×10 ⁶個細胞/毫升； (c) 約0.5×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升；或 (d) 約4.0×10 ⁶個細胞/毫升至約1×10 ⁸個細胞/毫升。
如請求項1至12中任一項之方法，其中轉染係： (a) 選自由以下組成之群：病毒轉染、轉導、非病毒轉染，及病毒與非病毒轉染之混合； (b) 選自由以下組成之群：電穿孔、雷射束、基因注射、聲穿孔(sonoporation)、磁轉染(magentofection)、塗有金屬之奈米粒子、磁性共軛腺相關病毒(magnetic-conjugated adeno-associated virus)、微/奈米粒子介導之轉染、脂質體轉染、基於脂質之轉染、陰離子脂質體、陽離子脂質體介導之轉染、陽離子聚合物、聚合物囊封、肽介導之轉染、磷酸鈣、樹枝狀聚合物、流動轉染(flowfection)、光穿孔(photoporation)、索魯系統穿孔(soluporation)、短暫細胞膜破壞、變形、擠壓、拉伸、夾捏、減弱、伸長、薄化、基因槍粒子遞送系統；及其組合； (c) 病毒粒子之電穿孔； (d) 電穿孔及病毒轉染(轉導)； (e) 病毒轉染及基於脂質之轉染；或 (f) 病毒轉染及基於脂質體之轉染。
如請求項1至13中任一項之方法，其中： (a) 在轉染之後或之前，未以一或多種刺激劑活化該經修飾之免疫細胞群、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經修飾之真核供體細胞群；及 (b) 在轉染之後，未以離體方式擴增該經修飾之免疫細胞群、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經修飾之真核供體細胞群。
如請求項1至13中任一項之方法，其進一步包含用一或多種刺激劑刺激及活化該經修飾之免疫細胞群、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經修飾之真核供體細胞群，以產生經活化修飾之免疫細胞群、經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經活化修飾之真核細胞群。
如請求項15之方法，其進一步包含在預定時間內擴增該經活化修飾之淋巴球群、該經活化修飾之免疫細胞群、該經活化修飾之單核細胞群、該經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經活化修飾之真核供體細胞群，以產生經工程改造之淋巴球群、經工程改造之免疫細胞群、經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經工程改造之真核供體細胞群。
如請求項16之方法，其中該擴增步驟在如下條件下進行： (a) 在振盪條件或旋轉條件下； (b) 在封閉系統中； (c) 使用無血清培養基；及/或 (d) 在一或多種刺激劑存在下。
如請求項16或17之方法，其中該經活化修飾之免疫細胞群、該經活化修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經活化修飾之真核供體細胞群擴增至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍或至少約25倍。
如請求項1至18中任一項之方法，其進一步包含收集該經修飾之淋巴球群、該經修飾之免疫細胞群、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該經修飾之真核供體細胞群，以用於冷凍保存或投與。
如請求項19之方法，其中收集包含選擇及富集該等經工程改造之淋巴球、該等經工程改造之免疫細胞、該等經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或該等經工程改造之供體真核細胞。
如請求項19或20之方法，其中收集進一步包含調配該等經工程改造之淋巴球、該等經工程改造之免疫細胞、該等經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或該等經工程改造之供體真核細胞，以用於冷凍保存或向有需要之個體投與。
如請求項16至21中任一項之方法，其中該預定時間為： (a) 少於約24小時；少於約30小時；少於約48小時；少於約72小時；少於約96小時；或少於約120小時； (b) 少於約0.5小時、少於約1小時、少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時或少於約23小時；或 (c) 約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天。
如請求項1至22中任一項之方法，其中自富集及/或獲得該淋巴球群、該免疫細胞群、該CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或該真核供體細胞群至收集該等經工程改造之免疫細胞、該等經工程改造之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或該等經工程改造之真核供體細胞的時間為： (a) 約72小時或更短； (b) 約18小時至約72小時、約18小時至約36小時、約18小時至約24小時、約24小時至約72小時、約24小時至約36小時或約36小時至約72小時； (c) 少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、少於約13小時、少於約14小時、少於約15小時、少於約16小時、少於約17小時、少於約18小時、少於約19小時、少於約20小時、少於約21小時、少於約22小時或少於約23小時； (d) 約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更多天；或 (e) 約1天、約3天、約4天、約5天或約6天。
如請求項1至23中任一項之方法，其中該電穿孔步驟、該活化步驟及/或該擴增步驟係在封閉系統、半封閉及/或功能封閉系統中進行。
如請求項24之方法，其中該封閉系統係選自由以下組成之群：封閉袋系統、自動封閉室樣品處理系統及生物反應器。
如請求項6至25中任一項之方法，其中： (a)該一或多種刺激劑係選自由以下組成之群：促效抗體、細胞介素、重組協同刺激分子、抗CD3抗體或其片段、抗CD28抗體或片段、小藥物抑制劑及/或其組合； (b)該一或多種刺激劑為選自由以下組成之群之細胞介素：介白素-2 (IL-2)、介白素-3 (IL-3)、介白素-6 (IL-6)、介白素-7 (IL-7)、介白素-7受體(IL-7R)、介白素-11 (IL-11)、介白素-12 (IL-12)、介白素-15 (IL-15)、介白素-15受體(IL-15R)、介白素-18 (IL-18)、介白素-18受體(IL-18R)、介白素-21 (IL-21)；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子；α、β或γ干擾素；紅血球生成素；及其組合。
如請求項26之方法，其中該一或多種刺激劑係經結合至珠粒或奈米結構。
如請求項26或27之方法，其中： (a) 該一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段； (b) 該一或多種刺激劑為抗CD3及抗CD28抗體或其片段及一或多種細胞介素； (c) 該奈米結構為奈米基質； (d) 該細胞介素係選自IL-2、IL-7、IL-6、IL-15、IL-15Ra或IL-21； (e) 該細胞介素係選自IL-15及IL-7；IL-7及IL-21；IL-7及IL-2；IL-15及IL-2；IL-7、IL-15及IL-21；IL-15及IL-15Ra；或IL-7、IL-15及IL-15Ra；及/或 (f) 該一或多種刺激劑為奈米基質及一或多種細胞介素。
如請求項28之方法，其中該奈米基質 (a) 包含可移動聚合物鏈之基質，以及抗CD3及抗CD28抗體或其片段；或 (c)尺寸為1至500 nm。
如請求項9至29中任一項之方法，其中該反轉錄病毒載體或該慢病毒載體之該有效劑量包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之感染倍率(MOI)。
如請求項9至30中任一項之方法，其中該有效劑量之該反轉錄病毒載體或該慢病毒載體包含： (a) 在約0.08之MOI下約2 μl之該慢病毒載體； (b) 在約0.2之MOI下約5 μl之該慢病毒載體；或 (c) 在約0.4之MOI下約10 μl之該慢病毒載體。
如請求項9至31中任一項之方法，其中該慢病毒載體係基於選自由以下組成之群的病毒：反轉錄病毒、α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、δ反轉錄病毒及ε反轉錄病毒。
如請求項9至32中任一項之方法，其中該慢病毒載體係基於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、威司奈-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺乏病毒(FIV)、牛免疫缺乏病毒(BIV)、VISNA病毒及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。
如請求項9至33中任一項之方法，其中該慢病毒載體係經選自由以下組成之群的病毒之包膜糖蛋白(Env)假模式化：鼠類白血病病毒(MLV)、印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株、科卡爾病毒(Cocal virus)、章地埔拉病毒(Chandipura virus)、皮里病毒(Piry virus)、鯉魚春季病毒血症病毒(SVCV)、σ形病毒、傳染性造血壞死病毒(IHNV)、莫科拉病毒(Mokola virus)、狂犬病病毒CVS病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、阿拉戈斯病毒(Alagoas virus)、卡察基病毒(Calchaqui virus)、朱羅納病毒(Jurona virus)、拉霍亞病毒(La Joya virus)、馬拉巴病毒(Maraba virus)、貓內源性反轉錄病毒(RD114)包膜蛋白、佩里內特病毒(Perinet virus)、於格布達諾病毒(Yug Bugdanovac virus)、原型泡沫病毒(prototypic foamy virus，PFV)及長臂猿白血病病毒(GaLV)。
如請求項9至31中任一項之方法，其中該慢病毒載體係經選自由以下之群的病毒組成之包膜糖蛋白(Env)假模式化：印第安納水泡性口炎病毒(VSV)病毒株、新澤西VSV病毒株及科卡爾病毒。
如請求項9至35中任一項之方法，其中該慢病毒載體包含選自由以下組成之群的異源病毒包膜蛋白(Env)：印第安納VSV-G病毒株、新澤西VSV-G病毒株、科卡爾病毒包膜蛋白、伊斯法罕病毒包膜蛋白、章地埔拉病毒包膜蛋白、皮里病毒包膜蛋白、鼠類白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白、SVCV病毒包膜蛋白及其變異體。
如請求項9至36中任一項之方法，其中該慢病毒載體包含編碼該VSV-G包膜蛋白或VSV G蛋白變異體之核苷酸序列。
如請求項9至37中任一項之方法，其中該慢病毒載體為慢病毒粒子。
如請求項10至38中任一項之方法，其中該CAR包含抗原結合域、跨膜域、協同刺激域及胞內域，且其中該抗原結合域係選自由以下組成之群：(a)全長抗體或其抗原結合片段、(b) Fab、(c)單鏈可變片段(scFv)及(d)單域抗體。
如請求項39之方法，其中該抗原結合域特異性結合選自由以下組成之群的目標抗原：CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD79b、CD79a、CD33、CD30、CD70、BCMA、GPC2、CD123、CD133、EGFR、EGFRvIII、間皮素、HER2、PSMA、PSCA、FAP、CEA、GD2、IL-13Ra2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)-3、CIAX、LI-CAM、CA 125、CTAG1B、TnMUC1、黏蛋白1及葉酸受體-α (FRa)、GFRα-4、NYESO、WT1、(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、CA-IX、CD3、CD7、CD8、CD38、CD44v6、CD80、CD86、CD117、CD147、CD276、CEA、密連蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EpCAM、EphA2、FAP、葉酸結合蛋白(FBP)、糖脂F77、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2、HLA-A2、ICAMI、IL3Ra、LAGE-I、Lewis Y、LMPI (EBV)、MAGE-Al、MAGE-A3、MAGE-A4、Melan A、MG7 (糖基化CEA)、MMP、MUCI、連結蛋白4/FAP、NKG2D配位體、MIC-A、MIC-B、ULBP I至6、NY-ESO-1、P16、PD-L1、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任何組合。
如請求項39或40之方法，其中該CAR跨膜域係選自由以下組成之群：人工疏水性序列；I型跨膜蛋白、T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40 (CD134)、4-1BB (CD137)、ICOS (CD278)或CD154之跨膜域；及衍生自殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之跨膜域。
如請求項39至41中任一項之方法，其中該協同刺激域為選自由以下組成之群的蛋白質之胞內域：TNFR超家族蛋白質、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS (CD278)、NKG2C、B7-H3 (CD276)及殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)。
如請求項39至42中任一項之方法，其中該胞內信號傳導域包含選自由以下之細胞質信號傳導域組成之群的胞內域：人類CD3ζ鏈(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受體之胞質尾區、攜有細胞質受體之基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。
如請求項39至43中任一項之方法，其中該CAR進一步包含鉸鏈區。
一種用於將編碼嵌合抗原受體(CAR)、經工程改造之T細胞受體或治療蛋白之核酸遞送至細胞的方法，該方法包含將轉移質體引入至該細胞中，該轉移質體包含： (a) 編碼至少一種藉由如請求項32至37中任一項之方法工程改造的異源病毒包膜蛋白之聚核苷酸序列； (b) 編碼至少一種反轉錄病毒rev蛋白質之聚核苷酸序列； (c) 編碼至少一種反轉錄病毒gag蛋白質及反轉錄病毒pol蛋白質之聚核苷酸序列；及/或 (d) 編碼該嵌合抗原受體、該經工程改造之T細胞受體(TCR)或該治療蛋白之聚核苷酸序列，其中該反轉錄病毒基因體中複製所必需之一或多個區域的至少一部分發生突變。
一種慢病毒載體粒子，其係藉由如請求項45之方法產生。
一種將修飾引入至細胞之方法，該方法包含用有效劑量之如請求項46之慢病毒載體粒子對細胞進行電穿孔，由此產生經修飾之細胞。
如請求項47之方法，其中使該細胞與該有效劑量之該慢病毒載體在電穿孔之前接觸。
如請求項47之方法，其中使該細胞與該有效劑量之該慢病毒載體在電穿孔之後接觸至多約4小時。
如請求項49之方法，其中使該細胞與該有效劑量之該慢病毒載體： (a) 在電穿孔之後接觸至少約5-30分鐘、至少約25-50分鐘、至少約5-60分鐘、至少約5-12分鐘、至少約60-120分鐘、至少約120-240分鐘； (b) 在電穿孔之後接觸至少約1分鐘、至少約2分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約60分鐘、至少約75分鐘、至少約90分鐘、至少約100分鐘、至少約110分鐘、至少約120分鐘、至少約150分鐘、至少約160分鐘、至少約170分鐘、至少約180分鐘、至少約190分鐘、至少約200分鐘、至少約220分鐘或至少約240分鐘。
如請求項47至50中任一項之方法，其中該細胞係選自由以下組成之群：免疫細胞、真核供體細胞、單核細胞、富集之淋巴球、B淋巴球、T淋巴球、CD4 ⁺T淋巴球、CD8 ⁺T淋巴球、樹突狀細胞、單核球、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、調節性T細胞、CD4 ⁺T輔助細胞、CD8 ⁺細胞毒性T淋巴球(CTL)、CD62L ⁺細胞、CD27 ⁺細胞、CCR7 ⁺細胞、CD45RO ^-細胞、CD45RA ⁺細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、造血祖細胞(HPC)、CD34 ⁺細胞、CD34 ⁺周邊血液幹細胞、淋巴介質活化之殺手細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、循環腫瘤特異性T細胞、間質幹細胞、肥大細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其組合。
如請求項47至51中任一項之方法，其中該細胞為： (a) 選自由以下組成之群的淋巴樣細胞：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、細胞毒性T淋巴球、調節性T細胞及其任何組合； (b) 選自由以下組成之群的骨髓細胞：單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、巨核細胞及其任何組合； (c) 幹細胞、造血幹細胞、造血祖細胞、CD34 ⁺細胞或CD34 ⁺周邊血液幹細胞。
如請求項47至52中任一項之方法，其中該有效劑量之該慢病毒載體粒子包含約0.5 μl、約1 μl、約1.5 μl、約2 μl、約2.5 μl、約3 μl、約3.5 μl、約4 μl、約5 μl、約6 μl、約7 μl、約8 μl、約9 μl、約10 μl、約15 μl或約20 μl之該慢病毒載體。
如請求項47至53中任一項之方法，其中該慢病毒載體粒子之該有效劑量包含約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約2.0、約3.0、約4.0或約5.0之感染倍率(MOI)。
如請求項47至54中任一項之方法，其中該有效劑量之該慢病毒載體粒子包含： (a) 在約0.08之MOI下約2 μl之慢病毒載體粒子； (b) 在約0.2之MOI下約5 μl之慢病毒載體粒子；或 (c) 在約0.4之MOI下約10 μl之慢病毒載體粒子。
一種經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其係藉由如請求項1至38中任一項之方法經工程改造。
一種經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，其係藉由如請求項1至38中任一項之方法經工程改造。
一種經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其包含如請求項46之慢病毒載體。
一種經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，其包含如請求項46之慢病毒載體。
如請求項56至59中任一項之經工程改造的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其用於產生所關注蛋白質。
如請求項60之經工程改造的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其中該所關注蛋白質係選自由工業蛋白或治療蛋白組成之群。
如請求項60之經工程改造的經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞，其中該所關注蛋白質係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。
一種組合物，其包含： (a) 如請求項56或58之經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞； (b) 如請求項57或59之經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群；或 (c) 如請求項5至44中任一項之慢病毒載體。
如請求項63之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
一種治療個體中疾病或病況之方法，該方法包含向有需要個體投與治療有效量之： (a) 如請求項56或58之經修飾之細胞、經修飾之免疫細胞、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或經修飾之真核供體細胞； (b) 如請求項57或59之經修飾之細胞群、經修飾之免疫細胞群、經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群或經修飾之真核供體細胞群，或 (c) 如請求項60或63之組合物，由此治療該個體之該疾病或病況。
如請求項65之方法，其中該疾病或病況係選自由以下組成之群：病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、癌症、惡性病、非癌性病況、自體免疫疾病、纖維化疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、蛋白質缺乏病況及因子VIII缺乏症。
如請求項66之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、腎細胞癌、腎臟癌、間皮瘤、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、肺腺癌、膽囊癌、結腸癌、子宮頸鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、肝細胞癌、食道癌、腦癌、黑色素瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、尿道上皮癌、胃癌、血癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)、前驅體B ALL及其任何組合。
如請求項65至67中任一項之方法，其中該經修飾之免疫細胞、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或該經修飾之真核供體細胞係： (a) 對該個體而言為自體的； (b) 對該個體而言為同種異體的；或 (c) 對該個體而言為異種的。
如請求項66至68中任一項之方法，其中該經修飾之細胞、該經修飾之免疫細胞、該經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞或該經修飾之真核供體細胞對該個體而言為同種異體的。
如請求項66至69中任一項之方法，其中該個體為人類。
一種產生治療蛋白之方法，該方法包含： (a) 使用如請求項1至38中任一項之方法製造包含該治療蛋白的經工程改造之免疫細胞群或經工程改造之真核細胞群； (b) 收集該治療蛋白；及 (c) 分離及純化該治療蛋白。
如請求項71之方法，其中該治療蛋白係選自由以下組成之群：酶、調節蛋白、受體、肽、肽激素、細胞介素、膜或轉運蛋白、疫苗抗原、抗原結合蛋白、免疫刺激蛋白、過敏原、全長抗體或抗體片段或衍生物；單鏈抗體(scFv)、Fab片段、Fv片段、單域抗體(VH或VL片段)、域抗體、駱駝科單域抗體(VHH)、奈米抗體及其組合。
一種套組，其包含： (a) 藉由如請求項1至38中任一項之方法工程改造之經修飾之免疫細胞群或經修飾之CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞群，或經修飾之真核供體細胞群；或 (b) 如請求項46之慢病毒載體。