CN102066557A - 加速离体产生调节性t细胞的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过以调节性组合物处理包括非调节性T细胞的细胞培养物来产生调节性T细胞。本发明包括利用调节性组合物的方法，所述调节性组合物包括阻止FOXP3转录因子的基因座的甲基化的试剂、加速T细胞分化为抑制性细胞的试剂和作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的试剂。本发明还包括通过以调节性组合物培养非调节性T细胞而产生的调节性T细胞的组合物，以及这样的调节性T细胞在治疗自身免疫疾病和异常免疫反应中的用途。

Description

加速离体产生调节性T细胞的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2008年4月11日提交的美国专利申请61/044,306的优先权，其通过引用全文并入本文。
关于联邦支持研究的声明
不适用
背景技术
调节性T细胞(也称为“抑制性T细胞”或“Tregs”)是抑制免疫系统激活从而维持免疫系统动态平衡和对自身抗原耐受的专门化的T细胞群体。调节性T细胞可以天然产生(本文也称为“nTregs”)或者它们可以在外周淋巴组织中被诱导(本文也称为“iTregs”)。诱导的Tregs可以在体内或离体产生，一般是在存在调节性组合物的情况下通过刺激CD25-前体产生。已经表明在这样的调节性组合物中加入细胞因子TGF-β可有效产生iTregs。
虽然Tregs可以包括数个T细胞群体，但是表达叉头(Forkhead)转录因子(FOXP3)的那些对于防止病理性自身反应性以维持免疫系统动态平衡是至关重要的。已经表明：虽然nTregs和iTregs的表型特征是非常相似的(在很多情况下是相同的)，但是，这两种群体中的FOXP3基因的甲基化状态可以是不同的。在来源于小鼠和人的细胞上进行的研究已经表明，FOXP3基因座的特定区域在nTregs和iTregs之间具有不同的基因甲基化模式。一般地，nTregs的FOXP3基因座的区域是非甲基化的，而在iTregs中，这些区域通常是甲基化的。在基因甲基化程度和转录活性之间存在着一般性的关系，虽然不是绝对的关系。一些研究表明iTregs和nTregs之间存在的抑制活性的区别可能至少部分是由于这两种类型的Tregs的FOXP3基因座的甲基化模式的差异。FOXP3的乙酰化状态也是其转录活性的重要决定因素。
离体产生的Tregs可以分成抗原特异性细胞和多克隆细胞(多克隆Tregs具有广谱特异性)。抗原特异性和多克隆iTregs均可以通过向小鼠细胞施用IL-2和TGF-β进行离体诱导。已经表明通过使用IL-2和TGF-β产生的多克隆iTregs在全身性红斑狼疮、自身免疫性糖尿病、重症肌无力和过敏性脑脊髓炎的小鼠模型中具有长期有益效应(见综述Horwitz等人，(2008)，Trends Immunol.，29(9)：429-35)。在人类细胞中，已经通过IL-2成功产生了同种抗原iTregs，但是离体产生多克隆iTregs更加困难。一项研究已经表明：虽然在向原态CD4细胞施用IL-2和TGF-β后人类CD4+细胞可以被诱导稳定表达FOXP3，但是这些细胞不能产生抑制活性(Tran等人，(2007)，Blood，110(8)：2983-90)。但是，其它研究已经表明在反复刺激之后，这样的细胞可以变成具有与天然FOXP3+抑制性细胞相似特性的抑制性细胞(Horwitz等人，(2008)，Eur J Immunol，38(4)：912-5)。在反复刺激之后，这些细胞还显示出与膜结合的TGF-β(nTreg抑制性细胞的另一种表型特征)。因此，虽然可以产生出具有类似于nTregs的表型特征的iTregs，但是产生iTregs的常规方法通常需要反复刺激细胞以产生并维持nTreg的表型特征和功能。使用TGF-β和IL-2的常规方法不通过反复刺激不能产生稳定的抑制性细胞群，尤其是在人类细胞中，这可能至少部分归因于编码FOXP3的基因的甲基化和乙酰化状态。
为了治疗性应用，用于在短时间内产生治疗性数目的Tregs而无需反复刺激T细胞以诱导末端分化为功能性抑制性细胞的方法和组合物将是有利的。
发明概述
因此，本发明提供了用于产生在表型和/或功能上与nTregs相似的或不可区分的iTregs的方法和组合物。
在一个方面，本发明提供了产生调节性T细胞(Tregs)的方法，其包括以调节性组合物处理包括非调节性T细胞的细胞培养物的步骤。在这个方面，所述调节性组合物包括阻止编码转录因子的基因的甲基化的试剂。
在一个方面，本发明提供了治疗患者中的异常免疫反应或自身免疫疾病的方法，该方法包括给予患者调节性T细胞的步骤。在这个方面，调节性T细胞是通过以调节性组合物处理包括非调节性T细胞的细胞培养物而产生的。该调节性组合物可以包括：氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素(trichostatin)A、或氮胞苷、视黄酸和曲古柳菌素A中的两种或更多种的组合。
在一个方面，本发明提供了产生调节性T细胞(Tregs)的方法，其包括以调节性组合物处理包括非调节性T细胞的细胞培养物的步骤，所述调节性组合物包括加速T细胞分化为Tregs的试剂。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括细胞培养基、氮胞苷、视黄酸和包含至少一个原态
Figure BPA00001278179500031
CD4+细胞的T细胞群。
在一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含调节性组合物、细胞处理容器和使用试剂盒的书面说明书。在另一个方面，试剂盒中包括的调节性组合物包含氮胞苷、视黄酸或氮胞苷与视黄酸的组合。
附图说明
图1显示了在TGF-β存在或不存在的情况下以抗-CD3/抗-CD28珠子刺激的CD4+细胞中FOXP3(横坐标)和CD25(纵坐标)的表达。
图2显示了氮胞苷、TGF-β和ALK5i对FOXP3表达的影响。图2A显示了在培养基(左侧图板)、存在TGF-β(中间图板)和存在氮胞苷(右侧图板)的情况下刺激的细胞中FOXP3的表达。图2B显示了在培养基、含有ALK5i的培养基和在溶剂DMSO中刺激的培养物中表达FOXP3的细胞的百分率。
图3显示了氮胞苷和TGF-β对FOXP3表达的加成效应。图3A显示了来自流式细胞术实验的数据，其中分析了在仅有培养基、含TGF-β的培养基、含氮胞苷的培养基和含氮胞苷和TGF-β二者的培养基中以抗-CD3/抗-CD28珠子刺激的细胞中FOXP3的表达。图3B是至少三个单独的相似实验的柱形图，其显示了在存在或不存在氮胞苷、TGF-β和氮胞苷与TGF-β二者的情况下在刺激之后表达FOXP3的细胞的百分率。
图4是显示在仅有培养基中以抗-CD3/抗-CD28包被的珠子刺激的细胞和在含有氮胞苷的培养基中刺激的细胞的抑制活性的柱形图。
图5显示了视黄酸对FOXP3表达的影响。图5A是在不同浓度的全反式视黄酸中，在IL-2或IL2与TGF-β中以抗-CD3/抗-CD28包被的珠子刺激的细胞的柱形图。图5B显示了来自以下实验的细胞计数：其中在仅有培养基、存在TGF-β和存在TGF-β与视黄酸的情况下以抗-CD3/抗-CD28刺激原态CD4+CD25-细胞。
图6显示了在仅有培养基、含有TGF-β的培养基、含有氮胞苷的培养基、含有视黄酸的活性代谢物——全反式视黄酸(0.05μm/ml)(ATRA)的培养基和含有TGF-β、氮胞苷和ATRA的组合的培养基中以抗-CD3/抗-CD28包被的珠子刺激的细胞的流式细胞术数据。
图7显示了在仅有培养基、含有TGF-β的培养基、含有视黄酸(RA)的培养基、含有氮胞苷的培养基、含有视黄酸和氮胞苷的培养基、和含有视黄酸、氮胞苷和TGF-β的培养基中刺激6天之后的CD4+细胞的柱形图。显示了这些试剂对于CD127、FOXP3、CD45RO和CD103的表达的影响。
图8显示了在仅有培养基(图8A)、含有TGF-β的培养基(图8B)、和含有视黄酸、氮胞苷和TGF-β的培养基(图8C)中刺激的细胞中与膜结合的TGF-β的表达。图8D显示了在含有视黄酸、氮胞苷和TGF-β的培养基中刺激的细胞中对照IgG的表达。
图9的柱形图显示了以含有IL-2和TGF-β的调节性组合物处理的细胞中见到的抑制活性的升高和以含有IL-2和TGF-β和全反式视黄酸(ATRA)的调节性组合物处理的细胞中见到的抑制活性的进一步升高。
发明详述
除非另有指明，否则本发明的实施可以应用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学中的常规技术和描述，这些都是本领域掌握的技术。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标志物进行检测杂交。可以通过参照下文的实施例获得合适技术的具体说明。但是，当然也可以使用其它等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，例如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cells：A Laboratory Manual，PCR Primer：ALaboratory Manual，and Molecular Cloning：A Laboratory Manual(均来自ColdSpring Harbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman，New York，Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach”1984，IRL Press，London，Nelson and Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第3版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.和Berg等人(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，为了全部目的将以上文献全部通过引用全文并入本文。
注意到，除非上下文另有明确指明，否则在本文和随附的权利要求书中，单数形式″a″、″an″和″the″包括复数指代。因此，例如，提及“聚合酶”是指一个试剂或这样的试剂的混合物，提及“方法”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文提到的所有公开物通过引用并入本文，目的是为了描述和公开在那些公开物中描述并可能用于目前描述的发明的装置、组合物、制剂和方法学。
当提供数值的范围时，理解为介于其中的数值，直至下限的单位的十分之一(除非上下文另有明确指明)、处于该范围上限和下限内的和任何指明的或介于该指明范围内的数值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，其也可以包括在本发明内，服从指明范围内特别排除的界点。当指明范围包括一个或两个界点时，排除那些所包括的界点中的任一个或二者的范围也包括在本发明内。
在以下描述中，给出了很多具体细节以提供本发明的更加详细的理解。但是，本领域技术人员显而易见的是可以无需一个或多个这些具体细节而实施本发明。在其它情况下，为了避免遮蔽本发明，没有描述本领域技术人员熟知的特征和程序。
虽然主要通过参照具体实施方式描述了本发明，但是也应该预想到，在阅读了本公开内容之后，其它实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的，这样实施方式旨在包含在本发明的方法内。
I.概述
本发明涉及使用调节性组合物产生诱导的Tregs(iTregs)的方法和组合物。本发明的调节性组合物可以包括多种不同成分，如本文将进一步详细讨论。一般地，调节性组合物将包括影响转录因子的甲基化或乙酰化的试剂、影响T细胞分化成为抑制性细胞的试剂、或这样的试剂与其它成分例如细胞因子(包括细胞因子TGF-β和IL-2)的组合。
已知细胞因子TGF-β和IL-2足以在小鼠细胞中产生iTregs，但是在人类细胞中仅使用这些细胞因子可能不足以产生稳定的多克隆iTregs群体(虽然可以使用IL-2和TGF-β在人类细胞中产生抗原特异性iTregs)。不被理论束缚，一个可能性是这些细胞因子诱导人类CD4+细胞表达FOXP3并使其乙酰化，但是甲基化和乙酰化状态可能需要进一步的修饰以完成向功能性抑制性细胞的完全成熟。因此，本发明包括可以影响FOXP3，尤其是FOXP3基因启动子的乙酰化和甲基化的调节性组合物。在一个实施方式中，本发明包括增强FOXP3基因启动子的乙酰化的试剂(例如视黄酸)和/或影响FOXP3脱乙酰化的试剂(例如曲古柳菌素A)。如本文所讨论，视黄酸还加速T细胞向抑制性细胞的成熟。
在一些情况下，用于产生iTregs的调节性组合物将包括影响转录因子FOXP3的甲基化的试剂。这样的试剂可以是甲基转移酶抑制剂，例如氮胞苷。在一些情况下，本发明的调节性组合物可以包括加速T细胞分化的试剂。这样的试剂可以是视黄酸。视黄酸还可以诱导FOXP3基因启动子的乙酰化(Kang等人，(2007)J.Immunol.179：3724-33)。本发明的调节性组合物还可以同时包括影响转录因子的甲基化的试剂以及加速T细胞分化的试剂——即，本发明的调节性组合物可以同时包括氮胞苷和视黄酸。其它增强组蛋白乙酰化的试剂(例如曲古柳菌素A——见Tao等人，(2007)Nat Med 13：1299-1307)也可以包括在本发明的调节性组合物中。本发明的调节性组合物还可以包括细胞因子，例如TGF-β和IL-2。不被理论束缚，可能的是这样的调节性组合物中包括的任何乙酰化和脱乙酰化试剂可以加速被诱导成为Tregs的T细胞的分化和成熟。
一般地，根据本发明通过以调节性组合物处理非调节性T细胞产生iTregs。非调节性T细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)。“处理”意思是将调节性组合物与非调节性T细胞接触，通常是通过将调节性组合物施用到包括非调节性T细胞的培养物中。将认识到的是，虽然本文中通常是以非调节性T细胞的培养物来讨论细胞培养物，但是这样的细胞培养物也可以包括其它类型的细胞。在一些情况下，在细胞培养的起始之时将调节性组合物与细胞接触，在一些情况下，在细胞培养起始之后将调节性组合物与细胞至少接触一次。在一些情况下，在细胞培养的起始之时将调节性组合物与细胞接触，然后在细胞培养起始之后再接触至少一次。
根据本发明产生的调节性T细胞可用于治疗异常和不希望的免疫反应和自身免疫疾病。一般地，使用本领域已知的方法将这样的调节性T细胞导入患者内。
本发明还包括通过本文描述的方法产生的iTregs群体。本发明还包括调节性组合物，其可以包含氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、TGF-β、IL-2和其任意组合。在一些情况下，这些调节性组合物可以与细胞培养基混合。在一些情况下，本发明还包括与T细胞组合的调节性组合物。
本发明还包括试剂盒。这样的试剂盒可以包括至少一种试剂，包括本文描述的用于产生iTregs的调节性组合物。本发明的试剂盒还可以包括用于产生本发明的iTregs的容器。这样的容器可以包括多个口，其允许将试剂输送至容器中的细胞。本发明还包括用于包装和将iTregs输送至患者的试剂盒。本发明的试剂盒还可以包括用于从患者中分离细胞的容器。在一些情况下，本发明的试剂盒包括可以用于本发明的方法的多个方面的容器。例如，这样的容器可以适用于从患者分离细胞、以调节性组合物处理分离的细胞以产生iTregs，和/或将新产生的iTregs施用至患者。
II.天然Tregs(nTregs)和诱导的Tregs(iTregs)的表型特征
在一个方面，本发明提供了产生具有nTregs的表型特征的iTregs的方法和组合物。本文使用的“表型”或“表型特征”意思是可观察到的特征。对于调节性T细胞而言，这样的表型特征可以包括但不限于：一些蛋白的表达(例如细胞因子和转录因子)、增殖和抑制活性。例如，已知nTregs表达转录因子FOXP3并且能够表达细胞因子例如转化生长因子β(TGF-β)。nTregs倾向于仅表达低水平的其它细胞因子，例如白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素(IL-10)。也已经表明显示出抑制活性的细胞在其表面表达细胞因子TGF-β。具有“抑制活性”的Tregs是具有抑制其它T细胞的增殖和免疫反应的能力的细胞。
nTregs的首要表型特征是抑制活性，产生具有类似的抑制活性的iTregs是本发明的一个方面。抑制活性可以通过多种方式测定，包括T细胞毒活性的标准检验，例如T细胞增殖的抑制，以及在例如美国专利号6,759,035中描述的检验，为了所有目的，尤其是为了与抑制性细胞的活性检验相关的所有教导，将该文献通过引用全文并入本文。还可以检测和测定其它的表型特征以确定iTregs是否是抑制性细胞并具有nTregs的表型特征。
nTregs的一个表型特征是表达转录因子FOXP3。FOXP3是nTregs的主要控制者，已经表明其对于nTregs的发育和功能是必需的。具有FOXP3基因的遗传缺陷的小鼠和人类均产生自身免疫症状。已有研究表明在存在细胞因子IL-2和TGF-β的情况下刺激小鼠非调节性T细胞导致FOXP3的表达和抑制活性的产生。虽然FOXP3表达不是抑制活性的绝对指征，但其是可用于鉴别iTreg为抑制性细胞的表型特征，与nTreg的类似。
nTregs的另一个表型特征是表达与膜结合的TGF-β。因此，检测iTregs中的与膜结合的TGF-β是这样的iTregs是抑制性细胞的指征。检测与膜结合的TGF-β的方法在例如申请日为2008年8月19日的美国专利申请号12/194,101中有描述，为了所有目的，尤其是为了与检测与膜结合的TGF-β相关的所有教导，将该文献通过引用全文并入本文。
nTregs的另一个表型特征是增殖反应性较差，其通常伴随一些促增殖细胞因子例如IL-2的生产降低。其它细胞因子，例如IL-4、IFNγ和TFN-α也与增殖相关，虽然它们即使在正在增殖的细胞中也是一般以低水平产生。可以使用本领域已知的方法测定增殖反应，例如胸苷摄取检验和羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释检验。
III.产生诱导的Tregs(iTregs)
存在多个诱导调节性T细胞形成的方法，例如美国专利号6,228,359、6,358,506、6,797,267、6,803,036、7,381,563和6,447,765，以及美国申请号10/772,768、11/929,254、11/400,950和11/394,761中的描述；为了所有目的，尤其是为了与产生调节性T细胞(Tregs)相关的所有教导，将以上文献全部通过引用全文并入本文。虽然这样的常规方法可以在小鼠中非常容易地产生iTregs，但是这些方法中的很多方法在人类细胞中存在以下缺点：它们需要延长的时间段，其中必须反复刺激Treg前体的培养物以产生具有持续抑制活性的人类iTregs。本发明提供了能够迅速产生抑制性细胞的方法和组合物，在产生iTregs的过程中对于反复刺激的需求极小甚至不需要。一般地，除非另有指明，否则本文使用的“刺激”非调节性T细胞的意思是将细胞与一种或多种T细胞激活剂接触，包括但不限于抗-CD3和抗-CD28。这样的刺激可以在调节性组合物存在的情况下进行，或者这样的刺激可以在非调节性T细胞与调节性组合物接触之前或之后发生。
调节性组合物
本发明提供了用于产生显示出类似于nTregs的表型特征的iTregs的调节性组合物。本文中的“调节性组合物”意思是能够引起从非调节性T细胞形成调节性T细胞的组合物。如下文所详细讨论，调节性组合物可用于诱导具有与nTregs的表型特征类似或相同的表型特征的Tregs。一般地，向非调节性T细胞的培养物中加入本发明的调节性组合物。这样的调节性组合物可以包括刺激非调节性T细胞分化为抑制性细胞的试剂以及增强分化和nTreg表型特征形成的试剂。本文描述的调节性组合物的任何成分也被称为“添加剂”。
一般地，本发明的调节性组合物包括影响FOXP3基因和/或TGF-β的基因的甲基化的试剂。对基因甲基化的影响可以通过该试剂对于基因的直接作用或通过该试剂对于一种或多种中间体的作用间接进行。在进一步的实施方式中，所述试剂阻止FOXP3基因和/或TGF-β的基因的甲基化。在一个方面，用于阻止FOXP3基因的甲基化的试剂是甲基转移酶抑制剂。这样的甲基转移酶抑制剂可以是例如包括但不限于氮胞苷(“azaC”——也称为2’-脱氧-5-氮胞苷；5-氮杂-2-脱氧胞苷)和1-b-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶。
在一些方面，本发明的调节性组合物包括加速T细胞分化为抑制性细胞的试剂。这样的试剂可以包括但不限于视黄酸(特别是视黄酸的活性代谢物)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂例如曲古柳菌素A。这样的试剂可以与本发明的调节性组合物中的其它添加物例如细胞因子和/或任选的T细胞激活剂一起使用。诸如视黄酸和曲古柳菌素A的试剂还可以与影响转录因子的甲基化的试剂例如氮胞苷联合使用。
除了诸如氮胞苷的试剂之外，本发明的调节性组合物还可以包括细胞因子，例如TGF-β、IL-2、IL-7、IL-15和TNFα，单独的或以任意组合。
本文的“转化生长因子-β”或“TGF-β”意思是TGF-β家族的任意一个成员，包括三种同种型，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；参见Massague，J.(1980)，J.Ann.Rev.CellBiol 6：597。淋巴细胞和单核细胞产生该细胞因子的β1同种型(Kehrl，J.H.等人(1991)，Int J Cell Cloning 9：438-450)。TFG-β可以是对于被处理的哺乳动物细胞有活性的任何形式的TFG-β。在人类中，目前优选的是重组TFG-β。一般地，用于本发明的调节性组合物中的TGF-β的浓度可以介于细胞悬浮液的大约2pg/ml至大约50ng/ml。在进一步的实施方式中，用于本发明的调节性组合物中的TGF-β的浓度介于大约5pg/ml至大约40ng/ml、大约10pg/ml至大约30ng/ml、大约20pg/ml至大约20ng/ml、大约30pg/ml至大约10ng/ml、大约50pg/ml至大约1ng/ml、大约60pg/ml至大约500pg/ml、大约70pg/ml至大约300pg/ml、大约80pg/ml至大约200pg/ml、和大约90pg/ml至大约100pg/ml。在进一步的实施方式中，所用的TGF-β的浓度基于端点测定，例如细胞群体中产生的FOXP3+细胞的百分率和FOXP3表达的稳定性。这样的端点可以使用本领域已知的和本文描述的方法测定。
IL-2可以是对于被处理的哺乳动物细胞有活性的任何形式的IL-2。对于人类细胞而言，一般使用重组IL-2。重组人IL-2可以从R & D Systems(Minneapolis，MN)购买。一般地，使用的IL2的浓度介于细胞悬浮液的大约1单位/ml至大约200U/ml。在进一步的实施方式中，IL-2的浓度介于大约1U/ml至大约175U/ml、大约2U/ml至大约150U/ml、大约3U/ml至大约125U/ml、大约4U/ml至大约100U/ml、大约5U/ml至大约80U/ml、大约10U/ml至大约70U/ml、大约15U/ml至大约60U/ml、大约20U/ml至大约40U/ml、和大约25U/ml至大约30U/ml。
本发明的调节性组合物还可以包括T细胞激活剂，例如抗-CD2，包括抗-CD2抗体和CD2配体，抗-CD3、抗CD28、LFA-3、刀豆球蛋白A(Con A)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)。在一些实施方式中，以大约0.1至大约5.0μg/ml的浓度使用T细胞激活剂。在进一步的实施方式中，T细胞激活剂的浓度介于大约0.2至大约4.0、大约0.3至大约3.0、大约0.4至大约2.0、和大约0.5至大约1.0μg/ml。在很多实施方式中，抗-CD3和抗-CD28单独使用或者与TGF-β联合使用。在进一步的实施方式中，一种或多种其它细胞因子与诸如氮胞苷和视黄酸的试剂以及诸如抗-CD3和抗-CD28的T细胞激活剂联合使用。
在一些实施方式中，本发明的调节性组合物包含如上讨论的试剂中的仅单一物质。例如，调节性组合物可以包含仅TGF-β、仅视黄酸、仅氮胞苷、仅曲古柳菌素A或仅T细胞激活剂。
在进一步的实施方式中，本发明的调节性组合物包含一种或多种以上的试剂。将认识到的是，以上讨论的试剂的任何组合皆可包括在本发明的调节性组合物中。
在一个示例性实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷、视黄酸、或氮胞苷与视黄酸的组合。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物可以包括一种或多种细胞因子。例如，这样的调节性组合物可以进一步包括TGF-β、IL-2或TGF-β和IL-2二者。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物还可以包括一种或多种T细胞激活剂，例如抗-CD3和抗-CD28。
在一个示例性实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷、曲古柳菌素A或氮胞苷与曲古柳菌素A的组合。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物可以包括一种或多种细胞因子。例如，这样的调节性组合物可以进一步包括TGF-β、IL-2或TGF-β和IL-2二者。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物还可以包括一种或多种T细胞激活剂，例如抗-CD3和抗-CD28。
在一个示例性实施方式中，调节性组合物包括氮胞苷和TGF-β。在进一步的实施方式中，调节性组合物还包括氮胞苷、视黄酸和TGF-β。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物还包括IL-2。在另一个实施方式中，这样的调节性组合物还包括至少一种T细胞激活剂，例如抗-CD3和/或抗-CD28。在一个实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A和IL-2。
在一个示例性实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷和视黄酸。在进一步的实施方式中，调节性组合物还包括T细胞激活剂，例如抗-CD3和抗-CD28。在一些实施方式中，T细胞激活剂以处于珠子上的形式提供在调节性组合物中，而氮胞苷和视黄酸存在于溶液中。在另一个实施方式中，调节性组合物还包括TGF-β。
在一个示例性实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷、视黄酸、IL-2和TGF-β。在进一步的实施方式中，调节性组合物的这些物质包含在细胞培养基中。
在一个示例性实施方式中，本发明的调节性组合物包括氮胞苷、曲古柳菌素A、IL-2和TGF-β。在进一步的实施方式中，调节性组合物的这些物质包含在细胞培养基中。
在一个示例性实施方式中，调节性组合物包括IL-2和TGF-β。在进一步的实施方式中，这样的调节性组合物还包括加速T细胞分化为抑制性T细胞的试剂——这样的试剂可以包括例如视黄酸。在另一个实施方式中，这样的调节性组合物还包括促进去甲基化的试剂，例如氮胞苷。在另一个实施方式中，这样的调节性组合物还包括增强组蛋白乙酰化的试剂，例如曲古柳菌素A和/或视黄酸。
在示例性实施方式中，本发明的调节性组合物中包括的试剂具有加成或协同效应。例如，用于调节性组合物中的曲古柳菌素A和视黄酸可以具有加成或协同效应，导致产生的iTregs的数目比单独使用任何一种所见到的更多。这样的协同/加成效应可能部分归因于这样的试剂具有单独的作用于组蛋白乙酰化的机制，从而一起导致iTregs数目的增加。在进一步的示例性实施方式中，本文描述的试剂包括TGF-β、IL-2、氮胞苷、视黄酸和曲古柳菌素A的任意组合可以对于iTregs的产生具有协同或加成效应。
处理非调节性T细胞的培养物
在一个方面，本发明提供了在大约7至大约10天内产生治疗性数目的iTregs的方法。这种产生iTregs的相对短的时间提供了相对于本领域中用于扩展天然产生的Tregs(nTregs)的方法的优势。nTregs的扩展通常需要至少3周以将分离的nTregs的群体扩展至治疗性数目。这个时间长度是必要的，部分原因是通常只可能分离nTregs的小群体，所以群体中的每个细胞必须经过大量的细胞分裂以产生治疗性数目的细胞。如此多的细胞分裂会影响产生的细胞群体的总体抑制活性和其它表型特征。如此多的细胞分裂还会改变这些细胞在转移至患者体内后(例如，用于治疗不想要的或异常的免疫反应或自身免疫疾病)的增殖能力并减少其体内存活。由于根据本发明的用于产生iTregs的细胞群体通常比可以从nTregs的分离获得的要大，所以能够产生治疗性数目的细胞，而无需每个细胞都像扩展较小细胞群体时所需的那么多次的分裂。
在一个方面，本发明提供了以调节性组合物处理非调节性T细胞以诱导调节性T细胞(iTregs)的方法。本文使用的非调节性T细胞包括可以被诱导为具有调节活性的T细胞。这样的细胞包括外周血单核细胞(PBMC)，其可以包括初级原态CD-4+、CD-8+细胞，还可以包括自然杀伤细胞(NK)细胞和自然杀伤T(NKT)细胞。
使用本发明的方法和组合物产生的iTregs将通常具有类似于或相同于天然产生的Tregs(nTregs)的抑制活性和表型特征。本文的“处理”意思是将细胞与调节性组合物接触。在示例性实施方式中，处理细胞包括以调节性组合物孵育细胞(例如，通过将调节性组合物加入到细胞培养基中)足以使细胞产生nTregs的表型特征和功能的时间段。通常在生理温度进行孵育。
一般地，使用本发明的方法和组合物产生的iTregs涉及通过一种或多种T细胞激活剂刺激T细胞受体。这样的T细胞激活剂可以包括抗-CD3、抗-CD28、抗-CD2，及其组合。这样的T细胞激活剂可以包括在调节性组合物内，或者可以单独地、在本发明的调节性组合物之前、或与本发明的调节性组合物同时将它们施用至非调节性T细胞。在一些实施方式中，非调节性T细胞可以被“激发”，即在以T细胞激活剂刺激之前与调节性组合物的一种或多种成分接触。
在一个方面，以本文描述的任意调节性组合物处理非调节性T细胞的培养物的时间比使用本领域中已知的其它方法处理的时间短得多。在一个方面，本发明的方法和组合物在1周内从非调节性T细胞培养物产生iTregs。在另一个方面，本发明的方法和组合物在大约5天至大约15天、大约6天至大约12天、大约7天至大约10天的时间内从非调节性T细胞培养物产生iTregs。在另一个方面，iTregs的产生不需要以T细胞激活剂例如抗-CD3和抗-CD28进行反复刺激。将认识到的是，可以使用反复刺激，其包含在本发明内，但本文描述的调节性组合物并不一定总是需要反复刺激。
虽然本发明的一个方面是在比使用本领域中已知的常规方法短的时间段内产生iTregs，但是本发明还包括在较长时间段内产生iTregs的方法。在示例性方面，本发明的方法和组合物在大约3天至大约4周的时间段内从调节性T细胞培养物产生iTregs。在另一个方面，本发明的方法和组合物在大约5天至大约3周、大约7天至大约15天、大约10天至大约12天的时间段内从调节性T细胞培养物产生iTregs。将认识到的是，多种培养时间和条件都包括在本发明内。可以在添加本文描述的调节性组合物之前和之后，为了本发明的目的将细胞培养物维持大约2天至大约3个月、大约3天至大约2个月、大约4天至大约1个月、大约5天至大约20天、大约6天至大约15天、大约7天至大约10天、大约8天至大约9天。
在本发明的一个实施方式中，在细胞培养起始之时将本发明的调节性组合物与非调节性T细胞接触。在另一个实施方式中，在培养起始之后的随后时间点将调节性组合物与细胞接触。在另一个实施方式中，在培养起始之时和随后的时间点将调节性组合物与细胞接触。调节性组合物的第一次或后续接触的随后时间点可以介于培养起始之后的0.5小时至5天。在另一个实施方式中，第一次或后续添加调节性组合物的随后时间点可以介于培养起始之后的大约1小时至大约3天、大约2小时至大约2天、大约3小时至大约36小时、大约4小时至大约24小时、大约5小时至大约20小时、大约6小时至大约15小时、大约7小时至大约10小时。如本文所讨论，这样的调节性组合物可以包括单独的氮胞苷或其与一种或多种细胞因子(包括但不限于TGF-β和IL-2)以及诸如视黄酸和/或曲古柳菌素A的试剂的组合。
在一个方面，通过应用氮胞苷而上调的内源性TGF-β用于产生Tregs。在另一个方面，外源性TGF-β与氮胞苷一起加入到培养物中以诱导FOXP3的表达。在一个实施方式中，同时向培养物中加入TGF-β和氮胞苷。在另一个实施方式中，依次向培养物中加入TGF-β和氮胞苷——TGF-β或氮胞苷先加哪个都可以。在另一个实施方式中，在不同的时间点向培养物中加入TGF-β和氮胞苷。在另一个实施方式中，不论是同时、依次、还是在不同的时间点加入TGF-β和氮胞苷，在细胞培养的全过程中，向培养物中加入两次或更多次TGF-β和氮胞苷。在进一步的实施方式中，可以与本文描述的其它试剂(包括但不限于氮胞苷和TGF-β)同时或依次加入影响T细胞分化的试剂，例如视黄酸。
在进一步的实施方式中，在培养过程中的不同时间点将不同的调节性组合物和/或调节性组合物的成分与细胞接触。在一个示例性实施方式中，在培养起始之时并且在培养全过程中至少一次再将调节性组合物与细胞接触。在进一步的实施方式中，在培养起始之时将调节性组合物与细胞接触，并且在培养全过程中至少一次再将调节性组合物的一种或多种成分再次与细胞接触。例如，在培养起始之时将包含氮胞苷、TGF-β和视黄酸的调节性组合物与非调节性T细胞接触，然后在培养全过程中至少一次再加入氮胞苷、TGF-β或视黄酸。在进一步的示例性实施方式中，在培养全过程中至少一次再加入氮胞苷、TGF-β和/或视黄酸的一些组合。类似地，对于包含TGF-β、IL-2和一种或多种去甲基化试剂和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的示例性的调节性组合物，可以在一个时间点加入完整的调节性组合物并且在后续时间点再将一种或多种成分单独与培养物接触，或将一种或多种成分与调节性组合物的其它成分或与其它添加剂(包括细胞因子、T细胞激活剂、以及新鲜的细胞培养基和/或其它已知影响细胞培养物健康和稳定性的试剂)的组合与培养物接触。将认识到的是，可以在细胞培养的全过程中的一个或多个时间点加入调节性组合物的成分的任意组合。
在一些实施方式中，在培养起始之后向细胞培养物中至少加入一次调节性组合物的一种或多种成分。在进一步的实施方式中，在培养的全过程中向细胞培养物中加入大约2至大约15次调节性组合物的一种或多种成分。在进一步的实施方式中，在培养的全过程中向细胞培养物中加入大约3至大约14次、大约4至大约13次、大约5至大约12次、大约6至大约11次、大约7至大约10次、大约8至大约9次调节性组合物的一种或多种成分。在这些实施方式中，细胞培养物可以包含非调节性T细胞、调节性T细胞和非调节性和调节性T细胞二者。调节性T细胞可以是nTregs和/或iTregs。这些培养物还可以包括除了T细胞之外的细胞。
在进一步的示例性实施方式中，一种或多种试剂依次或同时与非调节性T细胞的培养物接触。例如，在使用氮胞苷和视黄酸产生iTregs的实施方式中，可以将氮胞苷和视黄酸同时与细胞接触，或以任意顺序依次与细胞接触。类似地，在使用氮胞苷、视黄酸和TGF-β产生iTregs的实施方式中，可以将这些试剂同时或按顺序依次与非调节性细胞接触。将认识到的是，可以将包括在调节性组合物中的本文描述的试剂的任意组合同时或按任何顺序依次与细胞接触。
在一个方面，本发明提供了产生调节性T细胞(Tregs)的方法，其包括以调节性组合物处理非调节性T细胞的培养物的步骤。在这个方面，调节性组合物包括阻止编码转录因子的基因甲基化的试剂。在示例性实施方式中，阻止编码转录因子的基因甲基化的试剂是阻止FOXP3基因甲基化的甲基转移酶抑制剂。在进一步的示例性实施方式中，甲基转移酶抑制剂是氮胞苷。在另一个实施方式中，调节性组合物还包括细胞因子，例如TGF-β。在另一个实施方式中，调节性组合物还包括加速T细胞分化的试剂，例如视黄酸。在另一个实施方式中，调节性组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古柳菌素A。将认识到的是，该实施例的调节性组合物的这些成分的子集的任意组合可用于产生iTregs。
在一个实施方式中，处理非调节性T细胞的培养物包括在培养起始之时加入调节性组合物。在一个实施方式中，处理非调节性T细胞的培养物包括在培养起始之后加入调节性组合物。在一些实施方式中，在以调节性组合物处理之后将非调节性T细胞的培养物维持至少1周，不论所述处理发生在培养起始之时或培养起始之后。
在进一步的实施方式中，在培养起始之时加入调节性组合物之后的第二个时间点向非调节性T细胞的培养物中加入试剂。在另一个实施方式中，在培养全过程中多次加入试剂。在这样的实施方式中，在培养起始之后加入一次或多次的试剂可以是氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、TGF-β、IL-2、抗-CD3、抗-CD28、或这些的组合或本文描述的调节性组合物的任何其它成分。
在一些实施方式中，以调节性组合物处理之前和以T细胞激活剂刺激之前，以一种或多种试剂“激发”非调节性T细胞。“激发”的意思是在与调节性组合物接触之前将非调节性T细胞与一种或多种试剂接触。例如，可以在细胞培养起始之前和/或与包含一种或多种用于激发细胞的试剂的调节性组合物接触之前将细胞与氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、TGF-β、IL-2、或其一些组合接触。在示例性实施方式中，非调节性T细胞的培养物以TGF-β和IL-2进行激发，并且在存在调节性组合物的情况下以T细胞激活剂进行刺激，所述调节性组合物包含影响FOXP3甲基化的试剂、影响细胞分化成抑制性细胞的试剂、作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的试剂或这三种试剂的一些组合。在进一步的示例性实施方式中，调节性组合物包含氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、或这三者的一些组合。在另一个实施方式中，调节性组合物还包括TGF-β和/或IL-2。
在一些实施方式中，在以调节性组合物处理之前，可以将非调节性T细胞进行一个或多个预处理程序。例如，收集之后，可以使用本领域中的标准技术将细胞进行另外的浓缩，所述技术包括但不限于使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心。
在进一步的实施方式中，在一个或多个浓缩步骤之后，可以使用本领域中熟知的技术洗涤细胞以除掉血清蛋白和可溶性血液成分，例如自身抗体、抑制剂等。一般地，这样的技术包括加入生理介质或缓冲剂，然后离心。如果必要的话这样的步骤可以重复多次。
在进一步的实施方式中，在一轮或多轮浓缩和/或纯化之后，可以将细胞重悬在生理介质中，例如AIM-V无血清培养基(Life Technologies)，或缓冲剂，例如Hanks平衡的盐溶液(HBBS)，或者可以使用生理缓冲盐水(PBS)。如果使用生理介质，则优选为无血清介质，因为血清会含有作为iTreg产生的抑制剂的蛋白。
在一个实施方式中，在以调节性组合物处理之前可以将细胞富集为一种或多种细胞类型。例如，可以使用本领域中熟知的技术，如Gray等人(1998)，J.Immunol.160：2248中描述的技术将细胞富集为CD8+T细胞或CD4+T细胞，为了所有目的，尤其是为了与将细胞群体富集为一种或多种细胞类型相关的所有教导，将该文献通过引用全文并入本文。
在另一个实施方式中，在自动化封闭系统例如Nexell Isolex 300i Magnetic Cell Selection System、Miltenyi“AutoMACS system”或流式细胞仪中分离PBMC。一般地，这样的分离使用本领域中已知的方法和设备进行以保持无菌并确保用于细胞分离、激活和产生抑制性细胞功能的方法学的标准化。在很多实施方式中，在细胞经过任何必要的预处理后，以调节性组合物处理细胞。
在一个实施方式中，使用白细胞去除术(leukopheresis)收集法收集非调节性T细胞，得到无菌leukopak中的浓缩细胞样品。在另一个实施方式中，可以修改leukopak以加入试剂和/或作为试剂盒的多剂调节性组合物，从而处理细胞以产生iTregs可以发生在与收集样品相同的leukopak中。下文将更详细地讨论这样的试剂盒。
在一些方面，本文描述的调节性组合物和方法用于扩展天然产生的Tregs(nTregs)以及从非调节性T细胞诱导调节性T细胞。在一些实施方式中，扩展nTregs将使用本文描述的包括IL-2的调节性组合物。在进一步的实施方式中，使用本文描述的方法扩展nTregs包括以调节性组合物处理分离的nTregs的群体。在进一步的实施方式中，这种调节性组合物包括IL-2。在另一个进一步的实施方式中，以IL-2和一种或多种另外的试剂和/或细胞因子(包括TGF-β)、氮胞苷、视黄酸和曲古柳菌素A处理nTregs。以上描述的任何处理非调节性T细胞以产生iTregs的方法还适用于扩展nTregs的群体。
将认识到的是，在一个方面本发明包括根据本文描述的方法产生的iTregs的组合物。
此外，本发明还包括组合物，其包含细胞培养基、影响转录因子的甲基化的试剂(例如氮胞苷)、影响T细胞分化为抑制性细胞的试剂(例如视黄酸)、和包含至少一个原态CD4+细胞的T细胞群体。这样的组合物还可以包含至少一个诱导的调节性T细胞。在进一步的实施方式中，所述至少一个诱导的调节性T细胞是抑制性T细胞。在另一个实施方式中，所述组合物还包含组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古柳菌素A。在一些实施方式中，可以向本发明的这种组合物中加入T细胞激活剂以进一步诱导iTregs。
在一个方面，本发明包括组合物，其包含细胞培养基、影响转录因子的甲基化的试剂(例如氮胞苷)、影响T细胞分化为抑制性细胞的试剂(例如视黄酸)、和包含至少一个天然Treg的T细胞群体。还可以进一步以一种或多种T细胞激活剂以及其它添加剂(例如组蛋白脱乙酰酶抑制剂或诸如IL-2的细胞因子)处理这样的组合物以扩展nTregs。将认识到的是，这种nTregs的扩展群体也包括在本发明内。
就nTregs的表型特征检测iTregs
在一个方面，本发明的方法和组合物包括以包含氮胞苷的调节性组合物处理非调节性T细胞的培养物以刺激iTregs并扩大培养物中FOXP3阳性细胞的百分率。图2显示了在不存在外源性TGF-β的情况下，以氮胞苷刺激非调节性T细胞的培养物显著扩大了FOXP3阳性细胞的百分率(图2A中的箭头标明了由于TGF-β(中间的图板)或氮胞苷(最右侧图板)产生的扩大)。如图2A所示，FOXP3+细胞百分率的这种扩大可能至少部分依赖于涉及内源性TGF-β的机制，即使当该扩大仅由氮胞苷诱导时；因为ALK5i抑制氮胞苷诱导的FOXP3的表达，其抑制程度与对TGF-β诱导的FOXP3的表达的抑制相同(见标记为“ALK5i”的箭头指示的趋势线)。图2A中的图中的阴影区域表示背景染色。
本发明的“氮胞苷产生的iTregs”包括仅使用氮胞苷产生的那些以及使用氮胞苷与其它试剂，包括但不限于细胞因子(例如TGF-β和IL-2)和促进T细胞分化为抑制性细胞的试剂(例如视黄酸)的组合产生的那些。
如上文所讨论，nTregs的一个表型特征是增殖反应性差。以IL-2和TGF-β刺激的人类原态CD4+细胞变成FOXP3+，但其仅为部分分化的抑制性细胞。图5A显示：当受到刺激时，这样的iTregs将分化。相反，以氮胞苷培养的CD4+细胞在培养6天之后变成非反应性的，在重新刺激之后不能增殖。由于促增殖细胞因子的唯一来源是iTregs本身，所以“氮胞苷处理的细胞缺乏增殖”与“细胞因子产生量少”是一致的，这是nTregs的独特特征。加入氮胞苷与TGF-β的组合也降低这些细胞的增殖活性。
在一个方面，测定了根据本发明产生的iTregs的抑制活性。当测试抑制活性时，在存在氮胞苷的情况下培养的人类细胞的抑制性显著高于不存在氮胞苷的情况下培养的细胞(图4)。因此，根据本发明的在氮胞苷存在的情况下的培养物与促进具有与nTreg相同或相似的表型和功能特征的iTregs产生的能力是一致的。
在一个方面，将氮胞苷与TGF-β一起加入非调节性T细胞的培养物中以诱导FOXP3的表达。图3A显示氮胞苷和TGF-β的组合具有加成效应并比单独添加其中一种试剂时诱导的FOXP3+细胞的百分率高。
如上文所讨论，在一个实施方式中，同时向培养物中加入TGF-β和氮胞苷。在另一个实施方式中，依次向培养物中加入TGF-β和氮胞苷——TGF-β或氮胞苷先加谁都可以。在另一个实施方式中，在不同的时间点向培养物中加入TGF-β和氮胞苷。在另一个实施方式中，在细胞培养物的全过程中向培养物中加入两次或更多次TGF-β和氮胞苷，无论是同时、依次或分别在不同时间点加入它们。
已经发现维生素A的代谢物视黄酸能够使抗原呈递细胞在胃肠道中通过TGF-β依赖性机制诱导CD4+细胞变成FOXP3+iTregs(参见，例如Kang等人，(2007)J.Immunol.，179：3724-3733)。由于视黄酸的一个主要效应是加速细胞成熟，所以本发明人推论视黄酸自己或与氮胞苷联合也可能增强人类iTregs的分化。因此，本发明包括使用包含仅有视黄酸或其与本文描述的任意试剂和组合物(包括诸如IL-2和TGF-β的细胞因子、T细胞激活剂和影响转录因子的甲基化的试剂，例如氮胞苷)的组合的调节性组合物的方法和组合物。
图6证明IL-2、TGF-β、ATRA(全反式视黄酸，其为视黄酸的活性代谢物)和氮胞苷的组合诱导的变成FOXP3+细胞的原态CD4+细胞的百分率高于使用任意这些试剂自身见到的百分率。图6中通过箭头标明的趋势线是以抗-CD3/抗-CD28珠子刺激之后的细胞计数。
如上文所讨论，在一个示例性实施方式中，通过以视黄酸、氮胞苷、IL-2和TGF-β的组合处理非调节性T细胞产生iTregs。可以就nTreg的表型特征，例如作为成熟的FOXP3+nTregs的特征的特定细胞表面标志物来检测这样的iTregs。原态T细胞显示CD45RA+标志物而缺少CD45RO。激活之后，当它们显示出记忆性表型时，这些细胞变成CD45RA-CD45RO+(图7)。以TGF-β刺激6天后，只有50％获得了CD45RO标志物(图7)。但是，当培养物中包括氮胞苷和视黄酸时，几乎所有的细胞变成CD45RO+。与nTregs一样，原态CD4+细胞显示出显著减少的IL-7受体(CD127)的表达并变成CD127dim。最后，nTregs特征性地表达TGF-β诱导的αEβ7整合素(CD103)。向TGF-β中加入氮胞苷和视黄酸显著增加了表达CD103的CD4+细胞的百分率。TGF-β、氮胞苷和视黄酸的组合也诱导原态人类CD4+细胞表达与膜结合的TGF-β。虽然一些以TGF-β激发的T细胞现在在重刺激之后在其细胞表面表达该细胞因子，但是，如果它们也以氮胞苷和视黄酸激发的话则该数目加倍。
IV.使用本发明的iTregs
本发明包括使用本文描述的方法和组合物产生的iTregs的群体。这样的iTregs的群体可用于治疗和研究应用。
在一个方面，向患有例如异常免疫反应和/或自身免疫疾病的患者给予使用本文描述的方法和组合物诱导的Tregs。在另一个方面，使用本文描述的方法和组合物诱导的Tregs可用于预防或治疗同种异体移植排斥。
可以使用本领域通常已知的方法向患者给予使用本文描述的方法和组合物诱导的Tregs。这样的方法包括但不限于注射或将iTregs导入患者。在一些实施方式中，通过静脉内给药将iTregs导入患者。在进一步的实施方式中，另外的试剂例如缓冲剂、盐或其它药学上可接受的添加剂可以与iTregs联合给药。
将细胞导入患者之后，可以使用本领域已知的方法评估治疗效果。这样的评估的例子可以包括但不限于：测定总Ig或特定免疫球蛋白的效价、肾功能测试、组织损伤评估，等等。
如果需要或有需求，使用本发明的Tregs进行的治疗可以重复。例如，治疗可以每周进行一次，持续数周；或每周进行多次，持续一段时间，例如在2周的时间内进行3-5次。随着时间的进行，患者可能经历症状的反复，在该点可以重复治疗。
在一个示例性方面，本发明提供了治疗患者中的异常免疫反应或自身免疫疾病的方法，该方法包括向患者给予调节性T细胞的步骤。在这个方面，调节性T细胞是通过以调节性组合物处理非调节性T细胞的培养物产生的。这种调节性组合物可以包括：氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、或氮胞苷、视黄酸和曲古柳菌素A中的两种或更多种的组合。
在一个实施方式中，向患者给予的调节性T细胞通过使用包含氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A中的一种或多种的调节性组合物产生。在进一步的实施方式中，调节性组合物可以包括TGF-β和/或IL-2。在另一个实施方式中，调节性组合物还可以包括T细胞激活剂，包括但不限于抗-CD3、抗CD-28或抗-CD3和抗-CD28的组合。
在另一个示例性实施方式中，向患者给予的为了治疗异常免疫反应的调节性T细胞是从非调节性T细胞的培养物产生的，其中在以调节性组合物处理之前、与之同时、或之后以T细胞激活剂刺激所述非调节性T细胞的培养物。
V.试剂盒
在一个方面，本发明提供了用于产生iTregs的试剂盒。一般地，这样的试剂盒包括无菌封闭系统，其允许以本文描述的调节性组合物处理非调节性细胞而无需使用特定化的细胞处理设施。
在示例性实施方式中，本发明的试剂盒包括细胞处理容器。在很多实施方式中，该细胞处理容器是封闭的无菌系统，其中可以使用调节性组合物处理非调节性T细胞而不存在污染的风险。如本领域技术人员认识到的，细胞处理容器的形式和成分可以变化。一般地，容器可以是多种不同的形式，包括类似于IV袋的软袋，或类似于细胞培养容器的刚性容器。一般地，容器的成分可以是任何适宜的生物学惰性材料，例如玻璃或塑料，包括聚丙烯、聚乙烯等。
在进一步的实施方式中，细胞处理容器包括一个或多个口，从而可以在细胞处理容器内将用于产生Tregs的试剂导入细胞而无需打乱维持培养物中细胞生长所需的反应条件。例如，本发明的细胞处理容器可以包括一个用于导入新鲜细胞培养基的口，而另一个口用于导入本文描述的调节性组合物的成分，例如氮胞苷、视黄酸和一种或多种细胞因子(包括但不限于TGF-β和IL-2)。将认识到，本领域已知在这样的细胞处理容器中的口的多种设计并包括在本发明内。
在另一个实施方式中，本发明的细胞处理容器将包括可用于细胞分离的成分，从而只有T细胞保留在容器中以进行调节性组合物的处理。例如，可以通过专用口或通过也用于向系统中导入其它试剂和分子的口向容器中导入抗体。这样的抗体可以是非T细胞特异性的，从而可以鉴别那些非T细胞并从容器中将其除掉，只留下T细胞以进行试剂盒中包括的其它成分的处理。在一个示例性实施方式中，向细胞处理容器中加入免疫磁性珠子以结合抗体标记的非T细胞，然后可以使用本领域已知的方法从容器中除掉那些免疫磁性珠子。
在一个方面，本发明提供了用于向患者给予iTregs的试剂盒。在进一步的方面，用于向患者给予iTregs的试剂盒与试剂盒的用于产生iTregs的一些或所有成分组合。在一些示例性实施方式中这样的试剂盒可以包括细胞处理容器，例如上文描述的那些，其包括多个用于向非调节性T细胞中加入调节性组合物以产生iTregs的口。这样的细胞处理容器可以进一步包括另外的室和/或口，从而可以使用本领域已知的方法例如通过静脉内(I.V.)输注向患者给予iTregs。例如，以上描述的细胞处理容器可以进一步包括适配为连接至I.V.袋的口，以向患者给予iTregs。
在进一步的方面，本发明的试剂盒可以包括也可以在从患者收集细胞的过程中使用的细胞处理容器。在一个示例性实施方式中，本发明的试剂盒包括适配为使用接入口连接至白细胞去除术仪器的细胞处理容器，从而相同的容器既可用于收集细胞又可用于随后处理细胞以产生iTregs。在另一个示例性实施方式中，容器可以包括另外的允许其用于向患者给予所产生的iTregs的适配装置，例如通过适配器与I.V.装置连接，如上文所讨论。
在进一步的实施方式中，本发明的试剂盒包括单独的细胞收集容器，其可用于从患者收集细胞，然后那些细胞被导入细胞处理容器，所述细胞处理容器也是该试剂盒的一部分。该细胞处理容器还可包括允许调节性组合物被导入容器中的细胞以产生iTregs的适配装置，并且可以从细胞处理容器将产生的iTregs给予患者，或者iTregs可以被转移到单独的细胞给药容器，所述细胞给药容器也可以包括在试剂盒中。然后可以从细胞给药容器向患者给予iTregs。
在进一步的实施方式中，本发明的试剂盒包括包含用于细胞分离和纯化的物质的细胞收集容器，从而可以在进行调节性组合物处理的相同容器中进行非调节性T细胞的分离和/或纯化。在另一个实施方式中，从细胞收集容器中除去细胞以进行分离和/或纯化，在这样的分离和/或纯化之后，将细胞导入细胞处理容器。处于细胞收集容器之外的用于这样的分离和/或纯化的容器和试剂也可以包括在同一试剂盒中。
本发明的试剂盒还包括至少一剂调节性组合物。本上下文中的“剂(dose)”意思是足以引起效应的调节性组合物的量。在进一步的实施方式中，本发明的试剂盒中可以包括多剂调节性组合物。在另一个实施方式中，可以使用口向细胞处理容器中加入调节性组合物的剂量；或者，在一些实施方式中，所述剂量已经存在于细胞处理容器中。在另一个实施方式中，调节性组合物的剂量是冻干的形式，可以使用本领域已知的细胞培养基或其它试剂将其复原。
在进一步的实施方式中，本发明的试剂盒可以包括缓冲剂、盐、介质、蛋白质、药物和其它本领域已知的可与本文描述的调节性组合物联合用于产生iTregs的成分。这样的成分还可以用作用于向患者给予iTregs的试剂盒的一部分。
在进一步的实施方式中，本发明的试剂盒中组装的材料或成分可以提供给从业者并以任何保持其可操作性和应用性的方便的和适宜的方式储存。例如，成分可以是溶解、脱水或冻干的形式；可以在室内、冰箱或冷冻温度提供它们。成分通常包含于合适的包装材料中。本文使用的术语“包装材料”是指用于盛放试剂盒成分例如本发明的成分等的一个或多个物理结构。包装材料通过熟知的方法构建，优选为提供无菌的无污染的环境。用于试剂盒的包装材料是实验室试剂盒中通常使用的那些。本文使用的术语“包装”是指能够擎住各个试剂盒成分的合适的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于盛放合适数量的调节性组合物的玻璃管。包装材料一般具有外标签，其标明试剂盒的内容物和/或其目的和/或其成分。
在另一个实施方式中，本发明的试剂盒另外还包括用于使用该试剂盒的书面说明书。
在试剂盒包括用于细胞分离的物质的本发明的一些示例性实施方式中，所述试剂盒包含GMP质量的生物素化抗体。这样的抗体可以包括但不限于：用于除掉单核细胞的抗-CD14、用于除掉NK细胞的抗-CD11b或CD56，和用于除掉CD8细胞的CD8。这样的试剂盒还可以包含用于除掉染色的单核细胞、B细胞和NK细胞的具有亲和素结合的抗-小鼠IgG的磁性珠子。在另一个实施方式中，这样的试剂盒还可以包括调节性组合物，包括含有氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、TGF-β、IL-2的调节性组合物以及含有这些成分中的两个或更多个的组合的调节性组合物。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒将包括细胞处理容器和调节性组合物。在示例性实施方式中，调节性组合物将包括氮胞苷、视黄酸和TGF-β。在另一个示例性实施方式中，调节性组合物还将包括IL-2。在另一个示例性实施方式中，这样的试剂盒将包括一种或多种T细胞激活剂和细胞因子，可以处于单独的容器中或作为调节性组合物的一部分。在另一个实施方式中，这样的试剂盒还将包括缓冲液、药物和细胞培养基。在一些实施方式中，这样的试剂盒另外还包括用于使用该试剂盒的书面说明书。
在一个示例性实施方式中，本发明提供了包括调节性组合物、细胞处理容器和用于使用试剂盒的书面说明书的试剂盒。在另一个方面，试剂盒中包括的调节性组合物包括氮胞苷、视黄酸或氮胞苷与视黄酸的组合。在一个实施方式中，调节性组合物还可以包括TGF-β、IL-2或TGF-β与IL-2的组合。在进一步的实施方式中，调节性组合物还包括曲古柳菌素A。在另一个实施方式中，该示例性试剂盒的细胞处理容器包括适配为与白细胞去除术仪器连接的口。
以下实施例是为了更完整地描述使用上述发明的方式，以及为了给出实施本发明的各个方面的最佳方式。应该理解的是这些实施例绝不是为了限制本发明的真实范围，其呈现是为了示例性目的。本文引用的所有参考文献皆通过引用全文并入本文。
实施例
实施例1：刺激的CD4+细胞中FOXP3的表达
图1是培养非调节性T细胞的第6天FOXP3表达的典型例子。在该图形代表的实验中，以含有(右侧图板)或不含有(左侧图板)TGF-β的3/28珠子刺激原态CD4+细胞6天(每10个T细胞1个珠子)。数据显示TGF-β增强了FOXP3的表达(在每个图形中标明了表达FOXP3的细胞的百分率)。虽然在两种培养物中细胞都表达FOXP3，但是在加入了TGF-β的培养物中表达FOXP3的细胞为两倍。
实施例2：氮胞苷和TGF-β对FOXP3表达的影响的比较
图2A显示了活化素受体样激酶5抑制剂(ALK5i)对FOXP3表达的影响。该抑制剂阻断TGF-βI型受体信号传导。图2A中的图形提供了来自于刺激的CD4+细胞的流式细胞术分析的数据。在仅有培养基(最左侧图板)、存在5ng/mlTGF-β(中间图板)或1μM氮胞苷(最右侧图板)中以抗-CD3/CD28珠子刺激原态CD4+细胞5或6天。图形还显示了来自于经过ALK5i(10μM)刺激或未经其刺激的细胞的数据。阴影区域显示了仅以对照IgG染色的细胞。图2A显示氮胞苷增强了FOXP3的表达，其增强程度类似于以TGF-β看到的增强效果。图2A中的数据还表明氮胞苷对FOXP3表达的增强至少部分依赖于TGF-β，因为ALK5i对氮胞苷诱导的FOXP3表达的抑制程度与对TGF-β诱导的FOXP3表达的抑制程度相同。
图2B显示了测定在培养基、含有ALK5i抑制剂的培养基和仅有溶剂(DMSO)中刺激之后FOXP3表达的百分率的5个实验的平均值±SEM。图形显示：即使是经刺激的CD4+细胞的背景FOXP3表达也可能是部分依赖于TGF-β，因为向在培养基中刺激的细胞加入ALK5i能够减少FOXP3的表达。
实施例3：TGF-β和氮胞苷对FOXP3表达的加成效应的测定
分析了TGF-β和氮胞苷对FOXP3表达的加成效应。图3显示的数据证明了TGF-β和氮胞苷对FOXP3表达的加成效应。图3A提供了来自于在(由左至右的图板)仅有培养基、含有TGF-β的培养基、含有氮胞苷的培养基、含有氮胞苷和TGF-β的培养基中以抗-CD3/CD28珠子刺激原态CD4细胞5或6天的流式细胞术数据。箭头标示以抗-CD3/抗-CD28刺激之后的细胞计数。图3B显示了5个实验的平均值±SEM，并且显示了在仅有培养基、含有氮胞苷的培养基(1μM)、含有TGF-β的培养基(5ng/ml)、含有氮胞苷和TGF-β二者的培养基中刺激之后的FOXP3表达的百分率。这些数据表明氮胞苷和TGF-β对FOXP3表达的增强具有加成效应。
实施例4：在存在氮胞苷的情况下刺激的细胞的抑制活性的测定
图4证明以氮胞苷刺激的CD4+细胞产生抑制活性。图形显示了4个实验的平均值±SEM，其中在仅有培养基和含有氮胞苷的培养基中以抗-CD3/CD28珠子刺激原态CD4+细胞。通过以1∶10的比例培养细胞和以羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的反应T细胞来分析刺激细胞的每个群体的抑制活性。以可溶性抗-CD3刺激细胞3天，通过稀释CFSE测定反应细胞的增殖。这些数据表明在存在氮胞苷的情况下刺激的细胞群体中见到的FOXP3表达的增强(见图3)伴随着这些细胞的抑制活性的增强。
实施例5：视黄酸对FOXP3+表达的影响的测定
向TGF-β和氮胞苷中加入视黄酸增强了经刺激的CD4+细胞中FOXP3的表达。如上所述以抗-CD3/28珠子刺激原态CD4+细胞。图5显示了来自于在存在IL-2(20μ/ml)±TGF-β(2ng/ml)±全反式视黄酸(ATRA)(0.1-0.5μM)或DMSO的情况下刺激细胞4天的数据。通过流式细胞术确定CD4+CD25+细胞中FOXP3的表达。图5A的柱形图显示了5个独立实验的标示的平均值±SEM。图5B是在0.1μM ATRA中进行的代表性实验。
图6显示了在仅有培养基、含有TGF-β的培养基、含有氮胞苷的培养基、含有视黄酸的活性代谢物——全反式视黄酸(0.05μm/ml)(ATRA)的培养基、含有TGF-β、氮胞苷和ATRA的组合的培养基中刺激的细胞的流式细胞术数据。以箭头鉴别的趋势线表明了刺激之后表达FOXP3的细胞的数据，在每个图形中标明了表达FOXP3的细胞的百分率。显然，TGF-β、氮胞苷和ATRA的组合对于FOXP3表达的增强的影响最为显著。
实施例6：视黄酸对Tregs的表型的影响的测定
TGF-β、氮胞苷和视黄酸的组合增加具有成熟FOXP3+Treg细胞的表型的CD4+细胞。在基线水平，原态CD4+细胞不表达FOXP3、CD103或CD45RO。这样的细胞还对CD127强烈染色。以亚优化数目的抗-CD3/28珠子刺激之后，70-85％的原态CD4+细胞表达FOXP3、CD45RO和CD103，还显示对于CD127染色暗淡(图7)。这些都是成熟的FOXP3CD4+Treg细胞的标志物。
TGF-β、氮胞苷和视黄酸的组合可以诱导原态CD4+细胞以表达与膜结合的TGF-β。以标示的试剂刺激原态CD4+细胞6天，并以抗-CD3/28珠子重刺激并以荧光素偶联的抗-TGF-β对与膜结合的TGF-β进行染色。图8显示在刺激之前与TGF-β接触的一些T细胞现在在其细胞表面表达该细胞因子(图8B)，如果细胞与氮胞苷和视黄酸接触，则该数目加倍(图8C)。图8D中的数据显示了IgG表达的对照数据。
图9显示了在存在IL-2(20U/ml)、TGF-β(2ng/ml)和全反式视黄酸(0.1μM)在组合的情况下刺激4天的原态CD4+CD25-细胞显示出比在仅存在TGF-β或仅在IL-2中(CD4-con)刺激的细胞增加的抑制。将诱导的Tregs加入到T反应细胞中(1∶4比例)并计算抑制活性。
实施例7：在存在和不存在氮胞苷的情况下记忆性CD4+细胞的刺激
除了原态CD4+细胞(也称为CD45RA+细胞)之外，还刺激了记忆性CD4+细胞(CD45RO+)并测定了氮胞苷和氮胞苷+视黄酸对其表型特征的影响。这些记忆性CD4+细胞代表了静止态但是以前被激活的群体。以含有或不含有氮胞苷(1μM)、氮胞苷与全反式视黄酸的组合，以及含有或不含有TGF-β(5ng/ml)的抗-CD3/抗-CD28珠子(10个中有1个)刺激细胞。6天之后，从细胞中除掉刺激性珠子并分析FOXP3表达、抑制活性和增殖活性。50％以上的经刺激的细胞表达FOXP3。在仅有培养基中培养的细胞中FOXP3表达的增强可能是由于培养物中非T细胞提供的TGF-β。以TGF-β处理的细胞为高增殖性的并对T细胞刺激物反应性差，但是这些细胞的FOXP3表达和抑制活性显著高于不以氮胞苷刺激的总T细胞。
以含有或不含有新鲜的氮胞苷和/或氮胞苷+视黄酸的抗-CD3/抗-CD28(10个中有1个)重新刺激剩余的细胞，从而在每个CD4+子集中有一组初次暴露于氮胞苷/氮胞苷+视黄酸。再经过6天之后，再次测定这些细胞的FOXP3表达、抑制活性和增殖活性。
CD4+细胞和CD8+细胞都表达FOXP3并显示出抑制活性。在该实施例中，制备了适合于T细胞治疗的Tregs而无需纯化特定的T细胞群体。
实施例8：细胞因子产生的测定
在无血清培养基中在没有任何抗原呈递细胞的情况下刺激来自初级和次级培养物的细胞。以固定的抗-CD3或抗-CD3/抗-CD28珠子刺激细胞。使用测定IL-2、IFN、TNF、IL-6、IL-10和IL-4的细胞因子珠子阵列试剂盒确定在培养的第1和3天收集的上清液中的细胞因子的量。此外，使用ELISA试剂盒测定激活的和潜伏的TGF-β。使用测定细胞因子的细胞因子珠子阵列试剂盒和ELISA试剂盒测定在第1和3天为了测定IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)而收集的和在第4至6天为了测定IL-10以及激活的和潜伏的TGF-β而收集的上清液中细胞因子的量。
实施例9：甲基化状态的检测
最初通过使用被称为COBRA(组合的亚硫酸氢盐限制性分析法)的方法确定甲基化状态。该方法组合了亚硫酸氢盐处理和目标基因的特定位点的PCR扩增。对于人类研究，聚焦在扩增子5上。进行平行研究以测定包含氮胞苷的调节性组合物从小鼠原态CD4+脾细胞产生具有nTreg特性的iTregs的能力。
实施例10：氮胞苷产生的iTregs的稳定性和动态平衡特征的测定
该测试使用工程化改造为表达GFP-FOXP3融合蛋白的小鼠。在存在或不存在含有氮胞苷的调节性组合物和含有氮胞苷和视黄酸的调节性组合物的情况下刺激通过细胞分选分离的CD4+GFP-细胞。还测试了以含有或不含TGF-β的这样的调节性组合物进行的刺激。在存在调节性组合物或TGF-β的情况下进行的刺激诱导了FOXP3的表达。通过细胞分选分离FOXP3+细胞的纯化的群体。作为阳性对照，还从新鲜的脾脏和淋巴结中分选出nTregs。将iTregs和nTregs细胞(5x106)注射进入同类系CD45.1-小鼠。对于氮胞苷产生的iTreg，有足够的细胞可以使每组有3至4只小鼠。对于nTregs而言，每组至少有2只小鼠。在一些实验中，在培养物中扩展nTregs以获得足量的细胞。在注射之前，分析各个群体的趋化因子/归巢受体例如CD103(皮肤和肠)、CD62L(淋巴结)和CXCR4(骨髓)的表达。
在相对早(第7天)和晚(第21天)的时间点进行测定。杀死小鼠并确定各个器官(血液、淋巴结、脾脏和骨髓)中的表现为FOXP3+和FOXP3-细胞的CD45.1+细胞的数目。确定以含有氮胞苷和/或视黄酸的调节性组合物(含有或不含TGF-β)产生的细胞的行为是否类似于nTregs，nTregs通常维持其FOXP3表达。
实施例11：测定以氮胞苷产生的iTreg有益地影响自身免疫疾病的能力
使用关节炎K/BxN小鼠模型。第一个步骤是从组织相容性、非转基因C57B1/6xNOD(BxN)小鼠产生iTregs。将浓度介于1x106至10x106的原态CD4+细胞静脉内注射进入3周至5周龄的K/BxN小鼠。以3周龄小鼠进行的实验显示出iTregs对疾病发生的影响，而以5周龄小鼠进行的实验显示出iTregs对已经发生的疾病的影响。疾病的临床严重度按照如下评分：0为正常；1为轻微红斑和限于中足(跗骨)或踝关节的轻度肿胀；2为红斑和从踝延伸至中足的轻度肿胀；3为红斑和从踝延伸至跖骨关节的中度肿胀；4为深度红斑和包括踝、足和足趾的严重肿胀。对所有的后爪进行评分，得到每只小鼠最高为8的临床评分，表示为指定日期的平均关节炎指数。如果一只以上的爪的得分＞2，则该小鼠被评定为关节炎。以卡钳测定每只后爪的踝的周长。
将在这样的小鼠模型中根据常规方法(即使用含有TGF-β和任选一种或多种其它细胞因子例如IL-2的调节性组合物)产生的iTregs的效应与使用本文描述的的调节性组合物(包括包含氮胞苷和任选的视黄酸和/或一种或多种细胞因子包括TGF-β和IL-2的调节性组合物)产生的iTregs的效应进行比较。
一旦来自BxN小鼠的由氮胞苷产生的iTregs显示出治疗性功效，则确定来自K/BxN小鼠的细胞是否能够类似地发挥作用。测定从产生关节炎之前和之后的小鼠分离的细胞的缓解疾病的能力。通过从已经患病的小鼠中分离原态CD4+细胞，可以模拟那些如果该程序用于临床环境时将存在的情形。
除了以氮胞苷产生的iTregs处理小鼠之外，本研究还包括以新鲜的原态CD4+细胞注射的小鼠和以不存在氮胞苷和视黄酸的情况下产生的iTregs注射的小鼠。该对比的原因是为了将真实的调节效应与归因于抑制动态平衡增殖的那些效应区分开来。
以上程序还可用于研究包含氮胞苷、TGF-β、IL-2、视黄酸、曲古柳菌素A以及这些试剂中的两种或更多种的组合的调节性组合物在胶原诱导的关节炎动物模型中的效应。
本说明书提供了方法学、系统和/或结构的完整描述及其在本文描述的技术的实例方面的应用。虽然上文已经以一定程度的特殊性或参照一个或多个单独方面描述了该技术的各个方面，但是本领域技术人员可以不脱离其技术的精髓或范围对公开的方面做出各种改变。由于可以不脱离本文描述的技术的精髓和范围做出很多方面，但是合适的范围在于下文随附的权利要求书。因此考虑到其它方面。此外应该理解，除非另有明确要求或者某个特定顺序由于权利要求的语言所限而成为内在的必要，否则可以以任意顺序进行任意操作。意图在于，以上描述中包含的和附图中显示的所有内容应该被解释为仅仅是特定方面的示例，不是限定至所示的实施方式。除非上下文明确可见或明确指明，否则本文提供的任何浓度数值一般以混合物数值或百分率给出，不考虑加入混合物的特定成分之时或之后发生的任何转化。为了所有的目的，将本公开中引用的所有的公开的参考文献和专利文献通过引用全文并入本文，达到尚未明文并入本文的程度。可以不脱离以下权利要求中定义的本技术的基本元素对细节或结构做出改变。

Claims (35)

1.一种产生调节性T细胞(Tregs)的方法，所述方法包括以调节性组合物处理包含非调节性T细胞的细胞培养物，所述调节性组合物包含阻止编码转录因子的基因甲基化的试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述试剂是甲基转移酶抑制剂。
3.权利要求2的方法，其中所述甲基转移酶抑制剂是氮胞苷。
4.权利要求2的方法，其中所述调节性组合物还包含细胞因子。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞因子是TGF-β。
6.权利要求2的方法，其中所述调节性组合物还包含加速T细胞分化的试剂。
7.权利要求6的方法，其中所述加速T细胞分化的试剂是视黄酸。
8.权利要求2的方法，其中所述调节性组合物还包含作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的试剂。
9.权利要求8的方法，其中所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂是曲古柳菌素A。
10.权利要求1的方法，其中所述的处理细胞培养物包括在培养起始之时加入调节性组合物。
11.权利要求10的方法，还包括在培养起始之时加入调节性组合物之后的第二个时间点向细胞培养物中加入试剂。
12.权利要求11的方法，其中所述试剂是选自下列的成员：氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A、TGF-β、IL-2、抗-CD3、抗-CD28、及其组合。
13.权利要求1的方法，其中所述的处理细胞培养物包括在培养起始之后加入调节性组合物。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞培养物在以调节性组合物处理之后维持大约1周。
15.一种治疗患者中的异常免疫反应或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向患者给予调节性T细胞，其中所述调节性T细胞通过以调节性组合物处理包含非调节性T细胞的细胞培养物而产生，其中所述调节性组合物包含选自下列的成员：氮胞苷、视黄酸、曲古柳菌素A及其组合。
16.权利要求15的方法，其中所述调节性组合物还包含TGF-β。
17.权利要求16的方法，其中所述调节性组合物还包含IL-2。
18.权利要求17的方法，其中所述调节性组合物还包含T细胞激活剂。
19.权利要求15的方法，其中在以调节性组合物处理之前、与之同时、或之后以T细胞激活剂刺激所述细胞培养物。
20.权利要求19的方法，其中所述T细胞激活剂是抗-CD3、抗-CD28、或抗-CD3和抗-CD28的组合。
21.一种产生调节性T细胞(Tregs)的方法，所述方法包括以调节性组合物处理包含非调节性T细胞的细胞培养物，所述调节性组合物包含加速T细胞向Tregs分化的试剂。
22.权利要求21的方法，其中所述加速T细胞分化的试剂包括视黄酸。
23.权利要求22的方法，其中调节性组合物还包含选自IL-2、TGF-β和IL-2与TGF-β的组合的成员。
24.权利要求23的方法，其中所述调节性组合物还包含甲基转移酶抑制剂。
25.权利要求24的方法，其中所述调节性组合物还包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述甲基转移酶抑制剂是氮胞苷，并且所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂是选自曲古柳菌素A和视黄酸的成员。
27.权利要求18的方法，其中所述调节性组合物还包含至少一种T细胞激活剂。
28.一种组合物，其包含：
a.细胞培养基；
b.氮胞苷；
c.视黄酸；
d.T细胞群体，其中所述T细胞群体包含至少一个原态CD4+细胞。
29.权利要求20的组合物，其中所述T细胞群体还包含至少一个诱导的调节性T细胞。
30.权利要求21的组合物，其中至少一个诱导的调节性T细胞是抑制性T细胞。
31.权利要求28的组合物，还包含曲古柳菌素A。
32.一种试剂盒，其包含：
a.调节性组合物，其包含选自以下的成员：氮胞苷、视黄酸和氮胞苷与视黄酸的组合；
b.细胞处理容器；
c.用于使用该试剂盒的书面说明书。
33.权利要求32的试剂盒，其中所述调节性组合物还包含TGF-β、IL-2或TGF-β与IL-2的组合。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述调节性组合物还包含曲古柳菌素A。
35.权利要求32的试剂盒，其中所述细胞处理容器包括适配为与白细胞去除术仪器连接的口。
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