CN102971416B - 用于扩增和稳定天然调节性t细胞的方法和组合物 - Google Patents
用于扩增和稳定天然调节性t细胞的方法和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明针对用于扩增和稳定天然调节性T细胞的表现型的方法和组合物。具体来讲，本发明提供用于处理天然调节性T细胞，使所述细胞抵抗存在于炎症环境中的因子并且稳定所述细胞的抑制性质的方法和组合物。
Description
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本申请要求2010年4月22日提交的61/326,907的优先权的权益，在此以引用方式将其全部并入本文以达到所有目的。
有关联邦资助研究的声明
不适用。
发明背景
调节性T细胞(也称为“抑制性T细胞”或“Treg”)是起抑制免疫系统的激活的作用并且从而维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受性的T细胞的特殊群体。调节性T细胞可以是天然存在的(本文中也称为“nTreg”)或它们可以在外周淋巴组织中诱导产生(本文中也称为“iTreg”)。
天然产生、源自胸腺的调节性T细胞通过维持免疫稳态和自身耐受性在控制自身免疫疾病中发挥关键作用。已经证明nTreg的过继转移可防止许多自身免疫疾病，包括实验性自身免疫脑脊髓炎、结肠炎、糖尿病和胃炎。然而，一旦疾病确立，转移的nTreg的作用可预测性更小。例如，在狼疮中，如果转移发生在疾病确立之后，转移的nTreg的作用是适度的。类似地，在胶原诱导的关节炎中，已经证明nTreg转移可以防止但不能缓和已经确立的疾病。一旦疾病确立nTreg的作用就缺乏的一个可能原因可能是FOXP3在炎症环境中的不稳定性、nTreg向促炎症效应细胞转化或效应性T细胞对nTreg获得抗性。
对于治疗应用，用于扩增在扩增之后对效应细胞转化保持抗性的具有稳定的表现型的nTreg的方法和组合物将是有益的。
发明概述
因此，本发明提供用于扩增具有稳定的表现型的天然调节性T细胞(nTreg)的方法和组合物。
在一个方面，本发明提供稳定nTreg以抵抗促炎症转化的方法。在一个示例性方面，该方法包括用包含维生素A衍生物的调节性组合物处理包含nTreg的细胞培养物。
在又一个方面，本发明提供通过用包含全反式维甲酸(atRA)的调节性组合物处理nTreg来稳定nTreg的表现型的方法。
在又一个方面，本发明提供用于降低与nTreg中的炎症响应相关的转录因子的表达的方法。在一个示例性方面，该方法包括用包含atRA的组合物处理nTreg。
在又一个方面，本发明提供通过对患者施用处理的nTreg来治疗患者的异常免疫反应或自身免疫疾病的方法。在一个示例性方面，所述处理的nTreg通过用包含atRA的调节性组合物处理nTreg的细胞培养物来产生。
附图简述
图1示出向nTreg中添加atRA对转化成Th17细胞的影响的数据。图1A和图1B示出由用有或没有atRA的抗CD3和抗CD28和IL-6刺激的CD4+CD25+细胞引起的IL-17细胞的百分数。图1C示出用有或没有atRA的抗CD3和抗CD28和IL-6刺激的CD4+CD25+细胞的培养物中的可溶性IL-17A。图1D示出由在有或没有IL-6的atRA或DMSO存在下用抗CD3/CD28活化的nTreg处理引起的表达FOXP3的细胞的百分数。图1E示出通过抑制氚化胸腺嘧啶吸收测定的在IL-6和/或atRA存在下的nTreg的抑制活性。
图2示出atRA对nTreg中的FOXP3表达的影响的数据。图2A示出有和没有atRA的新鲜和扩增的nTreg中的FOXP3细胞的百分数。图2B示出有和没有atRA的新鲜和扩增的nTreg中的FOXP3细胞的总数。图2C示出有或没有atRA处理的nTreg的抑制活性。图2D示出用DMSO或atRA预处理的nTreg中的IL-17表达。图2E示出用atRA或DMSO处理的nTreg中的FOXP3表达的百分数。图2F示出存在或不存在IL-6的atRA或DMSO处理的nTreg的抑制活性。
图3示出显示用atRA处理的nTreg抑制确立的胶原诱导的关节炎发展的数据。图3A示出用DMSO或atRA处理的nTreg处理之后的小鼠胶原诱导的关节炎严重程度的临床评分。图3B示出用DMSO或atRA处理的nTreg处理之后第45天的血清中的IgG1和IgG2a水平。
图4示出atRA处理对nTreg表现型和功能的影响的数据。图4A示出用或不用atRA处理的nTreg中的CD126表达的数据。图4B示出在用DMSO或atRA处理的nTreg中通过流式细胞术测定的CD126、CD130、STAT-3和ROR-γt表达的百分数。
图5示出atRA处理对人nTreg中的FOXP3表达的影响的数据。图5A示出FOXP3细胞的百分数并且图5B示出用DMSO和atRA处理的FOXP3细胞的总数。
图6示出人nTreg中的atRA处理的保护作用的数据。图6A显示用人血液单核细胞注射的免疫缺陷NOD SCID IL-2Rγ链缺陷小鼠由于人T细胞诱导的移植物抗宿主病而迅速死亡。图6B显示这些小鼠体重减轻并且图6C显示这些小鼠在用所述人细胞注射一周之后在其血清中有大量的人IgG抗体。图6D显示用nTreg和被全反式维甲酸(atRA)处理的诱导的Treg注射的小鼠与用人血液单核细胞注射的小鼠相比存活率增加。图6E-G显示用被atRA处理的诱导的Treg注射的小鼠比用未处理的nTreg或人血液单核细胞注射的小鼠对炎症细胞因子IL-1和IL-6抵抗性更强。
图7示出来自从自身免疫关节炎(胶原诱导的关节炎，“CIA”)小鼠分离并且用atRA处理的nTreg的数据。图7A示出与PBS(对照)或DMSO处理的nTreg比较的处理的nTreg的抑制活性。图7B示出来自用atRA处理的nTreg、DMSO处理的nTreg或PBS(对照组)处理的nTreg注射的具有确立的CIA小鼠的数据。
发明详述
除非另外指出，否则本发明的实践可能使用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述，这都在本领域的技术范围之内。这些常规技术包括聚合物阵列合成、杂化、连接和使用标记物检测杂化。合适的技术的具体说明可以通过参考本文中的以下实施例获得。然而，当然也可以使用其它等价的常规程序。这些常规技术和描述可以在以下标准实验手册中找到：如Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (全都来自Cold Spring Harbor LaboratoryPress), Stryer, L. (1995) Biochemistry (第4版) Freeman, New York, Gait,“Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach”1984, IRL Press, London,Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 第3版, W. H.Freeman Pub., New York, N.Y.和Berg等 (2002) Biochemistry, 第5版, W. H.Freeman Pub., New York, N.Y.，所有这些都以引用方式全部并入本文以达到所有目的。
应注意，除非上下文明确地另外规定，否则在本文和附加的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，对“一种聚合酶”的引用是指一种试剂或这些试剂的混合物，并且对“所述方法”的引用包括对本领域技术人员已知的等价步骤和方法的引用等等。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解的相同含义。为了描述和公开在所述公布中描述的并且可能与目前描述的本发明一起使用的装置、组合物、配方和方法，本文中提到的全部出版物均以引用的方式并入本文。
当提供数值范围时，应理解在该范围的上下限和在该规定范围内的任何其它规定或中间值之间的各个中间值(除非上下文另外明确地规定，否则至下限的单位的十分之一)涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可以独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明内，服从在规定范围中的任何特定地排除的限制。当规定范围包括界限之一或两者时，排除那些包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。
在以下描述中，提出大量的具体细节以更彻底地了解本发明。然而，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在没有一个或多个这些具体细节下实践。在其它情况下，没有描述本领域技术人员熟知的特征和程序，以免难以理解本发明。
虽然主要参考具体的实施方案来描述本发明，但是还可预见通过阅读本公开其它实施方案将对本领域技术人员来说变得显而易见，希望这些实施方案包含在本发明的方法之内。
I. 概述
本发明针对扩增天然调节性T细胞(本文中也称为“nTreg”)和稳定nTreg的表现型。
在一个方面，通过用包含本文中描述的和本领域已知的一种或多种试剂的组合物处理来扩增和稳定nTreg。已经按照本发明处理的nTreg本文中也称为“处理的nTreg”。
在一些方面，nTreg的“表现型的稳定”包括使nTreg抵抗Th17转化，甚至在炎症渗透的组分存在下维持nTreg的抑制活性，nTreg中的IL-6R和IL-6R信号传导的降调节，与Th17细胞分化相关的转录因子的降调节或其任何组合。因此，本文中使用的术语“处理的nTreg”是指已经扩增并且稳定从而使其抵抗Th17转化和/或在炎症渗透的组分存在下维持抑制活性的nTreg。
在又一个方面，用包含维生素A或维生素A衍生物的组合物处理nTreg。虽然nTreg通常不代谢维生素A，但是树突细胞可以代谢维生素A以形成全反式维甲酸。包含nTreg和树突细胞两者的培养物在一些实施方案中可以用维生素A处理以产生在本文的进一步细节中描述的处理的nTreg。
在一个特定的实施方案中，使用包含维生素A的活性代谢物如全反式维甲酸(“atRA”)的调节性组合物处理nTreg。本文中使用的术语“调节性组合物”是包含单独的或与本文中描述的用于扩增和稳定nTreg的表现型的其它试剂组合的维生素A或维生素A衍生物(本文中也称为维生素A代谢物)的组合物。这些其它试剂在一些非限制性示例性实施方案中可以包括细胞因子、T细胞激活因子、影响转录因子的试剂、影响T细胞分化的试剂、影响转录因子乙酰化和甲基化的表观遗传试剂或其任何组合。在一个优选实施方案中，将本发明的调节性组合物应用于nTreg的培养物以产生处理的nTreg的扩增群体，从而产生具有稳定的表现型的群体。如本领域中描述的，“调节性组合物”在一些实施方案中也可被用于从非调节性T细胞诱导调节性T细胞(参见例如USSN 12/421,941，2009年4月10日提交，美国专利公布号20090257988，在此将其以引用方式并入以达到所有目的，具体来讲是涉及产生调节性T细胞的所有教义)。
虽然本文中提供的描述主要讨论包含单独的或与一种或多种其它试剂组合的atRA的调节性组合物，应理解的是，本发明的调节性组合物可以包括维生素A的其它衍生物或维生素A本身，并且以下讨论也适用于这些调节性组合物。
在又一些方面，包含atRA的本发明的调节性组合物进一步包括影响FOXP3的乙酰化和甲基化状态的试剂，特别是FOXP3基因启动子，影响T细胞分化成抑制性细胞的试剂，T细胞激活因子，细胞因子或其任何组合。
在某些方面，本发明提供用于预防和治疗免疫失调或自身免疫疾病的方法和组合物。在示例性实施方案中，本发明提供其中对患者施用处理的nTreg以预防和/或治疗免疫失调的方法。本文中使用的“免疫失调”涵盖自身免疫疾病以及异常的或不希望的免疫反应(如移植排斥和移植物抗宿主病)。免疫失调还涵盖由病毒或其它传染剂或毒素引发的慢性免疫疾病。
本文中使用的术语“患者”是指任何哺乳动物受试者，包括人类。在其它实施方案中，连同试剂如atRA一起对患者施用nTreg以预防和/或治疗免疫失调。
在其它方面，本发明提供用于处理nTreg的试剂盒和用于预防和治疗免疫失调的试剂盒。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括本发明的调节性组合物，其中这些调节性组合物包含单独的或与本文中描述的其它试剂组合的维生素A或维生素A衍生物。在其它实施方案中，这些调节性组合物包括atRA。在又一些实施方案中，处理的nTreg包括在本发明的试剂盒中。
II. nTreg的扩增和表现型的稳定
在一个方面，本发明提供用于处理nTreg以扩增nTreg的群体并且稳定nTreg的表现型的方法和组合物。nTreg是源自胸腺的调节性T细胞并且通常从胸腺或外周血液样本中分离。nTreg可以自任何哺乳动物受试者(包括人)获得。可以区别nTreg与诱导的Treg(“iTreg”)，因为iTreg被严重地甲基化，而这在一些情况下导致不稳定性。对于某些应用，特别是表现型性质的稳定性特别重要的应用中，相比iTreg优先使用nTreg。
在一个实施方案中，在处理之前根据本文中描述的或本领域已知的方法将从患者分离的nTreg浓缩。在又一个实施方案中，使用本领域已知的细胞分选方法浓缩分离的nTreg。在又一个实施方案中，在一个、两个、三个、四个、五个或五个以上浓缩步骤之后，可以使用本领域熟知的技术冲洗细胞以去除血清蛋白和可溶性血液组分如自体抗体、抑制剂等。一般来讲，这些技术涉及添加生理性介质或缓冲液，随后离心。可以根据需要重复这些步骤。
一般来讲，只有少量的nTreg可以自患者获得，并且为了有供下游使用(如用本文中描述的试剂处理和使用处理的nTreg减轻和/或预防免疫失调)的足够细胞，往往需要扩增自患者获得的nTreg。用于扩增nTreg的方法在本领域是已知的。然而，用于扩增nTreg的常规方法通常使调节性T细胞表现型不稳定，特别是抑制能力。
在本发明中，“处理的nTreg”是已经通过用包含单独的或与本文中描述的一种或多种试剂组合的atRA的调节性组合物处理nTreg来扩增并且稳定的天然Treg。一般来讲，通过对nTreg的培养物应用一种或多种试剂来扩增和稳定nTreg。
在特定的实施方案中，用包含维生素A衍生物的本发明的调节性组合物处理nTreg以扩增nTreg的数目并且稳定其表现型。在其它实施方案中，所述维生素A衍生物是atRA。本文中使用的“表现型”或“表现型性质”表示可观察到的特性。按照本文中描述的方法和组合物处理nTreg使nTreg的表现型稳定，表示nTreg群体变得抵抗降低或抑制。对于nTreg，这些表现型性质可以包括不限于：某些蛋白质(如细胞因子和转录因子)的表达、增殖和抑制活性。例如，已知nTreg表达转录因子FOXP3并且可以表达细胞因子如转化生长因子β (TGF-β)。nTreg往往只表达低水平的其它细胞因子，如白细胞介素4 (IL-4)和白细胞介素10(IL-10)。显示抑制活性的细胞也显示在其膜上表达细胞因子TGF-β。具有“抑制活性”的Treg是具有抑制其它T细胞的增殖和免疫反应的能力的细胞。
nTreg的一种主要的表现型性质是抑制活性。抑制活性可以用若干方法测量，包括T细胞细胞毒性活性的标准试验(如T细胞增殖的抑制)以及例如在美国专利号6,759,035中描述的试验，该专利在此以引用方式全部并入本文以达到所有目的，并且具体来讲是涉及抑制细胞活性的试验的所有教义。
通过按照本文中描述的方法和组合物处理来稳定的nTreg的一种表现型性质是转录因子FOXP3的表达。FOXP3是nTreg的主控制剂并且已经证明是nTreg的发育和功能所需的。具有FOXP3基因的遗传缺陷的小鼠和人都产生自身免疫症状。研究显示在细胞因子IL-2和TGF-β存在下刺激鼠非调节性T细胞引起FOXP3的表达和抑制活性的发展。虽然FOXP3表达不是抑制活性的绝对指标，但是它是可以使用本文中描述的方法稳定的一种表现型性质。在一个示例性实施方案中，用包含单独的或与一种或多种TGF-β、IL-2、抗CD3、抗CD28或其任何组合组合的atRA的调节性组合物处理通过阻断包含促炎症细胞因子如IL-1和IL-6的炎症环境的影响而稳定nTreg中的FOXP3表达。在一个特定的实施方案中，本发明的处理的nTreg在IL-1和IL-6存在下抵抗FOXP3表达的降低。相比之下，在没有atRA下扩增的nTreg在外源IL-1和IL-6存在下将显示FOXP3表达明显降低(参见图1D)以及在活体内抑制性细胞试验中抑制活性降低(参见图1E)。
nTreg的另一个表现型性质是表达膜结合TGF-β。用于检测膜结合TGF-β的方法例如在2008年8月19日提交的美国专利申请号12/194,101，公布号US2009/0075296中描述，在此以引用方式将其全部并入本文以达到所有目的，并且具体来讲是涉及用于膜结合TGF-β试验的所有教义。在示例性实施方案中本发明的方法和组合物将稳定nTreg中的膜结合TGF-β的表达–即本发明的处理的nTreg包括只具有稳定的膜结合TGF-β表达的表现型性质或与本文中描述的任何其它表现型性质(如对转化的抗性)组合的那些。
nTreg的一个其它表现型性质是活体外增殖响应差，这往往伴随着增强增殖的某些细胞因子(如IL-2)的产生降低。其它细胞因子如IL-4、IFNγ和TFN-α也与增殖有关，不过它们通常即使在增殖细胞中产生水平也低。增殖反应可以使用本领域已知方法来测量，如胸苷吸收试验和羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)稀释试验。在示例性实施方案中本发明的方法和组合物将稳定nTreg的这种表现型性质–即本发明的处理的nTreg包括具有单独的或与本文中描述的任何其它表现型性质(如对转化的抗性)组合的差的增殖反应的表现型性质的那些。
可以使用本文中描述的方法和组合物稳定的又一个表现型性质是对nTreg转化成Th17细胞的抗性。在一个示例性方面，用本文中描述的试剂(包括有或没有TGF-β、IL-2和T细胞激活因子的atRA)处理nTreg在IL-6存在下防止胞内和可溶性IL-17产生。IL-6是炎症环境的已知组分。没有按照本文中描述的方法处理的Treg (特别是没有在atRA存在下扩增的nTreg)将在IL-6存在下转化成Th17细胞(参见图1)。
如本文中讨论的，本发明的一个方面提供用于处理nTreg以扩增nTreg的群体并且稳定nTreg的表现型的方法和组合物。在又一个方面，用包含单独的或与本文中描述的一种或多种其它试剂组合的atRA的调节性组合物处理nTreg以扩增群体并且稳定表现型。用于处理nTreg的本发明的组合物可以包括若干不同的组分，这将在本文中进一步详细讨论。
用于处理nTreg的本发明的调节性组合物包括维生素A或维生素A衍生物。在某些实施方案中，使用的维生素A衍生物是维甲酸。在其它实施方案中，维甲酸是全反式维甲酸(“atRA”)。在一些实施方案中，在本发明的调节性组合物中使用维生素A的其它衍生物，如维生素A棕榈酸酯、视黄醛、合成类视黄醇(retinoid)如AM80 (Tamibarotine)、异维甲酸和依曲替酯(etretinate)。可以理解的是，可以单独使用或与一种或多种其它维生素A衍生物、维生素A、本文中描述的任何其它试剂以及本领域已知的任何其它试剂组合使用维生素A衍生物如atRA来扩增nTreg和稳定其表现型。在示例性实施方案中，本发明的调节性组合物包含约0.1至约2.0 μM单独的或与本文中描述的或本领域已知的一种或多种其它试剂组合的atRA或其它维生素A衍生物。在其它示例性实施方案中，本发明的调节性组合物包含0.5μM单独的或与本文中描述的或本领域已知的一种或多种其它试剂组合的atRA或其它维生素A衍生物。在又一些示例性实施方案中，本发明的调节性组合物包含0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7或1.9 μM单独的或与本文中描述的或本领域已知的一种或多种其它试剂组合的atRA或其它维生素A衍生物。在又一些实施方案中，本发明的调节性组合物包含约0.01至约20.0 μM单独的或与本文中描述的或本领域已知的一种或多种其它试剂组合的atRA或其它维生素A衍生物。
在其它方面并且根据本文中的任何教义，只有维生素A衍生物或除了维生素A衍生物之外，用于处理nTreg的本发明的调节性组合物可以进一步包含影响转录因子甲基化或乙酰化的试剂。在某些实施方案中，用于处理nTreg的本发明的调节性组合物进一步包含影响FOXP3的乙酰化和甲基化状态(特别是FOXP3基因启动子)的试剂。在某些实施方案中，用于处理nTreg的本发明的调节性组合物进一步包含影响TGF-β的基因的甲基化状态的试剂。对基因甲基化的影响可以通过试剂对基因的直接作用或间接通过试剂对一种或多种中介物的作用进行。在又一个实施方案中，所述试剂阻止FOXP3基因和/或TGF-β的基因的甲基化。在一个方面，用于阻止FOXP3基因甲基化的试剂是甲基转移酶抑制剂。这些甲基酶转移酶抑制剂例如可以包括不限于氮杂胞苷(“氮杂C”–也称为2’-脱氧-5-氮杂胞苷；5-氮杂-2’-脱氧胞苷)和1-b-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮。在一些实施方案中，本发明包括增强FOXP3基因启动子乙酰化的试剂(如维甲酸)和/或抑制FOXP3脱乙酰化的试剂(如曲古抑菌素A(trichostatin A))。在又一些方面，本发明的调节性组合物可以进一步包括增强组蛋白乙酰化的试剂，如曲古抑菌素A (参见Tao等，(2007) Nat Med 13:1299-1307)。可以理解的是，可以单独使用或与本文中描述的任何其它试剂以及本领域已知的试剂组合使用影响转录因子如FOXP3和TGF-β的乙酰化和甲基化状态的试剂来扩增nTreg并且稳定其表现型。
在又一些方面，用于处理nTreg的本发明的组合物包括一种或多种细胞因子。在特定的实施方案中，这些细胞因子可以包括TGF-β、IL-2、IL-15、TNFα，单独地或以任何组合。可以理解的是，这些细胞因子可以单独使用或与本文中描述的任何其它试剂组合使用以扩增nTreg并且稳定其表现型。
本文中“转化生长因子–β”或“TGF-β”表示TGF-β家族(包括三个同工型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)的任一种；参见Massague, J. (1980), J. Ann. Rev. Cell Biol 6:597。淋巴细胞和单核细胞产生这种细胞因子的β1同工型(Kehrl, J.H.等(1991), Int J Cell Cloning 9: 438-450)。所述TGF-β可以是对被处理的哺乳动物细胞有活性的任何形式的TGF-β。在人类中，目前优选重组TGF-β。一般来讲，在本发明的组合物中使用的TGF-β的浓度可以在细胞悬浮液的约2 pg/ml至约50 ng/ml范围内。在其它实施方案中，在本发明的组合物中使用的TGF-β的浓度在约5 pg/ml至约40 ng/ml、约10 pg/ml至约30 ng/ml、约20pg/ml至约20 ng/ml、约30 pg/ml至约10 ng/ml、约50 pg/ml至约1ng/ml、约60 pg/ml至约500 pg/ml、约70 pg/ml至约300 pg/ml、约80 pg/ml至约200 pg/ml和约90 pg/ml至约100pg/ml范围内。在其它实施方案中，使用的TGF-β的浓度根据终点如在细胞群体中产生的FOXP3+细胞百分数和FOXP3表达的稳定性来测定。这些终点可以使用本领域已知的和本文中描述的方法测定。
IL-2可以是对被处理的哺乳动物细胞有活性的任何形式的IL-2。对于人类细胞，通常使用重组IL-2。重组人类IL-2可以购自R&D Systems (Minneapolis, MN)。一般来讲，使用的IL-2的浓度在细胞悬浮液的约1单位/ml至约300 U/ml范围内。在其它实施方案中，IL-2的浓度在约1 U/ml至约275 U/ml、约2 U/ml至约250 U/ml、约3 U/ml至约225 U/ml、约4 U/ml至约200 U/ml、约5 U/ml至约180 U/ml、约10 U/ml至约170 U/ml、约15 U/ml至约160 U/ml、约20 U/ml至约150 U/ml、约25 U/ml至约140 U/ml、约30 U/ml至约130 U/ml、约35 U/ml至约120 U/ml、约40 U/ml至约110 U/ml、约45 U/ml至约100 U/ml、约50 U/ml至约90 U/ml、约55 U/ml至约800 U/ml和约60 U/ml至约70 U/ml范围内。
在又一些方面，用于处理nTreg的本发明的组合物包括一种或多种T细胞激活因子。这些T细胞激活因子包括能够刺激T细胞的任何试剂。在某些示例性实施方案中T细胞激活因子可以包括抗CD2(包括抗CD2抗体和CD2配体)、抗CD3、抗CD28、LFA-3、刀豆素A (ConA)和葡萄球菌肠毒素B (SEB)。在一些实施方案中，使用的T细胞激活因子浓度为约0.1至约5.0 μg/ml。在其它实施方案中，T细胞激活因子的浓度在约0.2至约4.0、约0.3至约3.0、约0.4至约2.0和约0.5至约1.0 μg/ml范围内。在许多实施方案中，抗CD3和抗CD28是单独使用的或与TGF-β组合使用。在其它实施方案中，一种或多种其它细胞因子与试剂如atRA以及T细胞激活因子如抗CD3和抗CD28组合使用。一般来讲，除非另外指出，否则本文中使用的“刺激”T细胞表示用一种或多种T细胞激活因子(包括不限于抗CD3和抗CD28)接触所述细胞。抗CD3和/或抗CD28可以是可溶性的或固定在载体如微珠上。用T细胞激活因子刺激nTreg可以在包含单独的或与包括不限于曲古抑菌素A和氮杂胞苷的一种或多种其它试剂组合的维生素A衍生物如atRA的调节性组合物存在下进行，或该刺激可以在用用于扩增和稳定nTreg的表现型的调节性组合物接触所述T细胞之前或之后发生。
在一些方面，本发明的调节性组合物除了维生素A衍生物如atRA之外还包括加速T细胞分化成抑制性细胞的试剂。这些试剂可以包括不限于维甲酸的活性代谢物、合成类视黄醇和组蛋白脱乙酰酶抑制剂如曲古抑菌素A或丙戊酸或过氧物酶体增殖物受体-γ(ppAR-γ)激动剂如罗格列酮(rosiglitazone)。这些试剂可以与本发明的调节性组合物中的一种或多种其它试剂(包括不限于细胞因子、T细胞激活因子、曲古抑菌素A和影响转录因子甲基化的试剂如氮杂胞苷)一起使用。
在一些实施方案中，本发明的调节性组合物只包含维生素A衍生物如atRA。在其它实施方案中，包含维生素A衍生物如atRA的调节性组合物进一步包括只有一种其它试剂如TGF-β、氮杂胞苷、曲古抑菌素A或T细胞激活因子。在其它实施方案中，除了维生素A衍生物之外的多种试剂的组合被包括在本发明的调节性组合物中并且被用于处理nTreg以扩增nTreg的数量并且稳定其表现型。在又一些实施方案中，包含单独的或与本文中描述的一种或多种试剂组合的维生素A衍生物的调节性组合物进一步包括缓冲液、盐和/或可药用的载体以处理nTreg，从而扩增群体并且稳定表现型。
在一些实施方案中，在细胞培养的开始将用于处理nTreg的调节性组合物与细胞接触，在一些情况下，在细胞培养开始之后将调节性组合物与细胞接触至少一次。在一些情况下，在细胞培养的开始将调节性组合物与细胞接触并且开始细胞培养之后再接触至少一次。
在一些实施方案中，开始培养之后向nTreg培养物中至少一次加入调节性组合物的一种或多种组分。在其它实施方案中，在培养持续期间向细胞培养物中加入调节性组合物的一种或多种组分约2至约15次。在又一些实施方案中，在培养持续期间向细胞培养物中加入调节性组合物的一种或多种组分约3至约14次、约4至约13次、约5至约12次、约6至约11次、约7至约10次和约8至约9次。在一些实施方案中，这些培养物还可以包括除T细胞以外的细胞。在其它实施方案中，富集这些培养物中的nTreg并且从培养物中去除其它种类的细胞。在其它实施方案中，在开始培养之前或在培养物持续期间去除非nTreg细胞。在又一些实施方案中，使用本领域已知的细胞分选方法去除非nTreg细胞。
在一些实施方案中，在用调节性组合物处理之前以及在用T细胞激活因子刺激之前，nTreg被一种或多种试剂“预敏化”。“预敏化”表示在与调节性组合物接触之前用一种或多种试剂接触所述非调节性T细胞。例如，在开始细胞培养之前和/或与包含单独的或与用于预敏化细胞的一种或多种试剂组合的维生素A衍生物如atRA的调节性组合物接触之前，可以用氮杂胞苷、维甲酸(包括atRA)、曲古抑菌素A、TGF-β、IL-2或其某些组合接触所述细胞。在一个示例性实施方案中，nTreg的培养物被用TGF-β和IL-2预敏化，在包含含有atRA的试剂、影响FOXP3甲基化的试剂、影响细胞分化成抑制性细胞的试剂、为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的试剂或这些和/或其它试剂的某些组合的组合物存在下用T细胞激活因子刺激。在又一些实施方案中，所述调节性组合物还包括TGF-β和/或IL-2。
在一些实施方案中，用于处理nTreg的调节性组合物的组分包括本领域已知的用于从非调节性T细胞产生诱导的调节性T细胞(iTreg)的组分。这些组分例如在美国专利号6,228,359；6,358,506；6,797,267；6,803,036；7,381,563和6,447,765和美国申请号10/772,768；11/929,254；11/400,950；11/394,761和12/421,941中描述，所有这些均在此全部并入以达到所有目的，并且具体来讲是针对用于从非调节性T细胞产生诱导的调节性T细胞的方法和组合物的所有教义(包括书面描述、附图和研究实施例)。在一些实施方案中，这些方法和组合物还可被应用于扩增和稳定nTreg的表现型。
在一个方面，本发明提供用于在约七至约十天内产生治疗数量的nTreg的方法。“治疗数量”是可以对患者施用以减轻或预防免疫失调(包括自身免疫疾病)的细胞数量。在又一个方面，用于产生治疗数量的nTreg的方法包括处理从患者中分离的nTreg。本文中的“处理”表示用包含本文中描述的扩增nTreg数量并且稳定其表现型的组分的调节性组合物接触细胞。在一个示例性实施方案中，处理细胞包括将细胞与调节性组合物(例如通过向细胞培养介质中添加调节性组合物)一起孵育足以扩增细胞并且稳定其表现型的一段时间。孵育通常在生理温度下进行。
为了本发明的目的，按照本文中描述的方法和组合物处理的nTreg的细胞培养物可以保存约2天至约3个月、约3天至约2个月、约4天至约1个月、约5天至约20天、约6天至约15天、约7天至约10天和约8天至约9天。
在某些实施方案中，将包含nTreg的样品经受流式细胞术方法以富集FOXP3+细胞的群体。这些方法可以在本文中描述的用于扩增和稳定nTreg群体的处理方法之前和/或之后应用。在其它实施方案中，这些流式细胞术方法是按照Zhou等, (2010), J. Molecular and Cell Biology, 2:164-169中描述的方法，在此以引用方式将其全部并入本文以达到所有目的。
在其它实施方案中，活的FOXP3+细胞可以根据本文中公开的正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)性质分离或富集。通过对包含细胞的流体施加具有单一波长的激光束并且随后使用多个检测器捕获从流体透射的光来进行流式细胞术分析。FSC信号是与激光束方向平行或与激光束方向成低角度的信号，而SSC信号是以与激光束方向成更大角度检测到的信号。nTreg可以在1、2、3、4、5、6、7天或7天以上的过程中通过向培养基中添加抗CD3/CD28涂布的微珠和IL-2来活体外扩增。对这些培养的细胞进行流式细胞术分析显示如Zhou等中所示的独特的点图曲线。令人惊讶的是，最高百分数的表达FOXP3+的细胞是具有相对高的FSC和低SSC的那些细胞。这些细胞称为成淋巴细胞细胞群体。所述成淋巴细胞群体是经鉴别具有高FSC的细胞的80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、20%、15%、10%。在成淋巴细胞群体中，75%、80%、85%、90%、95%、99%的这些细胞表达FOXP3。
此外，所述成淋巴细胞群体具有相对低的SSC。例如，成淋巴细胞细胞是具有最低的SSC的细胞的50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少。
因此，细胞的FSC和SSC性质可以用于鉴别和富集表达FOXP3+的那些细胞。
若干因素可能影响细胞或细胞群体的FSC曲线；这些因素包括大小差异、细胞和悬浮介质之间的折射指数的差异、细胞的内部结构和在细胞内或在细胞上存在在使用的光照波长具有强吸收的材料。然而，当使用FSC和SSC性质鉴别特定的细胞或细胞群体时，技术人员知道并且可以补偿这些限制。这些方法包括不限于在美国专利号5,084,394中公开的那些，以引用方式全部并入本文。
III.处理的nTreg的用途
本发明涵盖使用本文中描述的方法和组合物扩增和稳定的nTreg群体。这些处理的nTreg可以在治疗和研究应用中使用。如上所述，处理的nTreg是已经根据本发明扩增和稳定的nTreg，因此它们抵抗Th17转化并且在炎症渗透组分如IL-6存在下维持抑制活性。
在一个示例性方面，根据本发明的方法和组合物处理的nTreg被用于治疗患者的炎症反应。在一个具体实例中，从患有炎症反应的患者中分离nTreg。根据本文中描述的方法在培养物中处理这些分离的nTreg。在一个特定的实施方案中，用单独的或与本文中讨论的一种或多种任何其它试剂组合的atRA处理nTreg以扩增nTreg的数量并且稳定其表现型。这些处理、扩增和稳定的Treg随后被施用给患者。
在一个方面，对患有例如免疫失调(包括自身免疫疾病)的患者施用本文中描述的处理的nTreg。在又一个方面，本文中描述的处理的nTreg可被用于预防或治疗同种异体移植排斥。
可以使用通常本领域已知的方法对患者施用本发明的nTreg。这些方法包括不限于将处理的nTreg注入或引入患者中。在一些实施方案中，通过静脉施用将nTreg引入患者中。在其它实施方案中，其它试剂如缓冲液、盐或其它可药用的添加剂可以与nTreg组合施用。在又一些实施方案中，本发明的处理的nTreg与atRA组合施用。在其它实施方案中，本发明的处理的nTreg使用atRA产生，并且这些处理的nTreg随后在没有atRA的情况下被施用给患者。在又一些实施方案中，在对患者施用处理的nTreg之前将可能存在于用于扩增和表现型稳定的处理之后的nTreg培养物中的atRA去除。
将细胞引入患者之后，可以使用本领域已知方法评价治疗效果。这些估价的实例可以包括不限于：测量总Ig或特定的免疫球蛋白的效价、肾功能检测、组织损伤估价等。
使用本发明的nTreg的治疗可以按需要或要求重复。例如，治疗可以每周一次持续几周，或一周多次持续几周，例如3-5次持续两周。随时间进行，患者可能经历症状的复发，此时可以重复治疗。
在一个示例性方面，本发明提供治疗患者的异常免疫反应或自身免疫疾病的方法，这种方法包括对患者施用处理的nTreg的步骤。在这方面，所述处理的nTreg通过用包含单独的或与一种或多种其它试剂组合的维生素A衍生物如atRA的调节性组合物处理nTreg的培养物来扩增和稳定，所述一种或多种其它试剂包括不限于氮杂胞苷、曲古抑菌素A、TGF-β、IL-2、T细胞激活因子如抗CD3和抗CD28或本文中描述的和本领域已知的试剂的任何组合。
IV.包含处理的nTreg的组合物
本发明涵盖根据本文中描述的方法扩增和稳定的处理的nTreg的群体。这些处理的nTreg可以被包括在进一步包含可药用的载体的组合物中。
本发明还涵盖包括单独的或与其它试剂组合的维生素A衍生物的调节性组合物。在一些实施方案中本发明的调节性组合物可以进一步包括氮杂胞苷、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、ppAR-γ激动剂、曲古抑菌素A、TGF-β、IL-2、抗CD3、抗CD28和其任何组合。在一些情况下，这些调节性组合物可以与细胞培养介质混合。在其它实施方案中，本发明还涵盖与nTreg组合的本发明的调节性组合物。
以下实施例用来更充分地描述使用上述发明的方式，以及提出预期用于实现本发明的各个方面的最佳方式。应理解这些实施例决不是用来限制本发明的真实范畴，而是为了说明性目的而提供。本文中引用的所有参考文献均以全文引用方式并入本文。
实施例
实施例1：细胞纯化、活体外细胞刺激和抑制试验
通过对CD4+CD25+或CD4+GFP+细胞设门从DBA/1或Foxp3gfp敲入DBA/1小鼠的胸腺分选nTreg细胞。分选的细胞群体纯度>99%。
为了激活nTreg，用抗CD3/CD28涂布的微珠(1:5，一个微珠比五个细胞)、具有DMSO的rmIL-2 (100 U/ml) (R&D)或全反式维甲酸(atRA, 0.05 μM)刺激CD25+或GFP+ 3天。为了产生Th17细胞，将这些激活的nTreg用固定的抗CD3 (1 μg/ml)、可溶性抗-CD28 (1 μg/ml)、抗IL-4 (10 μg/ml) (BD biosciences)、抗IFN-γ和IL-6 (10 ng/ml) (BDPharmingen)刺激3天。
为了测量抑制活性，将应答T细胞用可溶性抗-CD3 (0.025μg/ml)和辐射APC (1:1)刺激，将用at-RA预处理的或无atRA的nTreg以1:4的比例(一个nTreg比四个应答细胞)加入培养物中。培养72小时之后，将三份的孔用1μCi的[3H]-TdR进行脉冲最后16小时。使用闪烁计数通过[3H]-TdR并入来测定细胞增殖。
实施例2：用atRA处理nTreg通过使nTreg抵抗Th17转化并且维持FOXP3表达而稳定
表现型
用有或没有IL-6的抗-CD3/CD28抗体刺激从DBA/1小鼠胸腺分选的自然CD4+CD25+CD62L+ nTreg。已经证明用IL-6激活的nTreg TCR变成Th17细胞。然而，图1A至图1C示出，当将atRA加入含有IL-6的培养物中时，胞内IL-17和可溶性IL-17产生都被完全阻断。因为atRA溶于DMSO中了，所以向所述培养物中加入类似体积的DMSO以排除atRA对T细胞具有非特异性毒性作用(图1A和图1B)。对于图1A和图1B中的数据，用有或没有atRA (0.05 μM)的固定的抗-CD3 (1 μg/ml)、可溶性抗CD28 (1 μg/ml)和IL-6 (10 ng/ml)刺激CD4+CD25+细胞。3天后，用PMA (0.25 μg/ml)和离子霉素(0.25 μg/ml)将这些细胞再刺激5 h并且用布雷菲德菌素A(brefeldin A)(5 μg/ml)刺激4 h，并且随后收集以便进行胞内IL-17和IFN-γ染色。数值表示四个单独实验的平均值±SEM和这些实验的代表。
添加atRA不影响nTreg的激活和增殖状态，表明atRA可能特异性地抑制Th17细胞从IL-6处理的nTreg转化。因此，atRA能够使nTreg对Th17转化有抗性。
虽然用无IL-2的抗CD3/CD28抗体刺激4天的nTreg细胞在体外轻微地降低FOXP3表达，但是添加外源IL-6显著地降低了FOXP3表达(图1D)。有趣的是，在IL-6存在下向nTreg中添加atRA几乎完全地阻止了在对照(DMSO)培养物中发现的FOXP3表达的降调节(图1D)。对于图1D中的实验，在atRA溶剂(DMSO)或有或没有IL-6 (10 ng/ml)的atRA (0.05μM)存在下用抗-CD3/CD28涂布的微珠将nTreg激活3天并且测定Foxp3表达，并且通过FACS胞内染色与刚分离的CD4+CD25+细胞比较。
IL-6还显著地降低nTreg细胞的抑制活性(图1E)。在IL-6存在下，nTreg对T应答细胞增殖的抑制活性完全被消除。相反地，向所述培养物中添加atRA阻断IL-6的这种作用并且维持nTreg的抑制活性。此外，在存在IL-6但不存在nTreg的情况下只添加atRA不抑制T细胞应答(图1E)，表明atRA不直接干扰IL-6在T应答细胞的免疫反应中的作用。一并考虑，这些数据显示atRA可以克服IL-6的促炎症作用并且维持nTreg细胞的稳定性和抑制功能。数值表示图1D和E的四个独立实验的平均值±SEM。p值通过学生检验计算并且表明有或没有atRA的培养物之间有显著差异(P<0.05)。
在图1C中，通过ELISA分析了培养物上清液中的可溶性IL-17A。水平线表示在IL-6和TGF-β存在下在自然TCR-刺激的CD4+细胞上清液中的IL-17A的水平。E(在IL-6和/或atRA存在下的nTreg的抑制活性)通过氚化胸腺嘧啶([3H]-TdR)吸收的抑制来测定。
实施例3：用atRA扩增的nTreg抵抗IL-6对nTreg的抑制作用并且阻止Th17转化
用具有IL-2的抗CD3/28涂布的微珠刺激之后的天然Treg一周内扩增十倍并且向所述培养物中添加atRA轻微地降低nTreg的扩增(八倍)。不同于只用IL-2扩增的nTreg(FOXP3表达逐渐降低)，用atRA扩增的nTreg表达的FOXP3保持稳定并且这些细胞的抑制活性甚至比没有atRA扩增的nTreg还高(图2A和B)，这与Treg细胞的抑制活性与FOXP3的表达水平密切相关的报告一致。对于图2A和B中的数据，将CD4+CD25+细胞用抗CD3/CD28涂布的微珠(1:5)、具有DMSO的rmIL-2 (100 U/ml)或atRA (0.05 μM)刺激7天并且测定FOXP3表达(A)和总Foxp3+细胞数目(B)。
如图2D所示，当没有atRA扩增的nTreg被具有IL-6的抗-CD3/28微珠再刺激时，介于20%至30%之间的nTreg转化成Th17或Th1。相比之下，用atRA扩增的nTreg对Th17和Th1转化完全抵抗(图2D)。对于图2D中的实验，如图2A激活CD4+CD25+细胞并且如上述图1A中的实验用IL-6再刺激。通过FACS染色来测定胞内IL-17和IFN-γ表达。结果为三个独立实验的代表。分泌到上清液中的IL-17和IFN-γ与胞内细胞因子表达一致(数据未示出)。此外，没有atRA扩增的nTreg的FOXP3表达在用IL-6再刺激之后显著降低，而先前用atRA处理的nTreg维持FOXP3表达(图2E)。
除维持FOXP3表达之外，用atRA处理的nTreg在IL-6存在下还保持抑制功能。图2F示出没有atRA扩增的nTreg在用IL-6再刺激之后完全丧失其抑制活性。形成鲜明对照的是，在atRA存在下扩增的nTreg的抑制功能当这些细胞被IL-6再刺激时完全无损(图2E--数值表示三个单独实验的平均值±SEM)。在收获之后彻底地冲洗这些nTreg并且通过HPLC测量的在抑制试验培养物上清液中的atRA不可检测(数据未示出)。因此，在抑制活性中没有atRA的输送。这些结果显示用atRA处理nTreg可以稳定其表现型和抑制活性，并且atRA的继续存在不是其在炎症环境中抑制活性保持稳定所需的。
在图2F中，通过如图1E中的类似方法测定了不存在或存在IL-6下的atRA或DMSO处理的nTreg的活体外抑制活性。通过学生检验计算P值并且表明atRA和对照处理的nTreg之间有显著差异(P<0.05)。
实施例4：用atRA处理的nTreg可以改善小鼠中确立的胶原诱导的关节炎的发展
因为IL-6往往是炎症渗透的组分，atRA在IL-6存在下稳定nTreg的能力提供了以下可能：atRA处理的nTreg的转移可能在确立的慢性免疫介导的疾病如胶原诱导的关节炎(CIA)中是治疗性的。先前的研究表明，CD4+CD25+ nTreg细胞的过继转移可以预防CIA的发展，但是其对确立的小鼠CIA的治疗作用不能令人满意。
为了检测atRA处理的nTreg对小鼠胶原诱导的关节炎的影响，用在完全弗氏佐剂中的牛胶原II (CII/CFA)免疫DBA/1小鼠并且当这些动物在第28天或更早发展关节炎时，将有或没有atRA先前刺激的1x106 nTreg转移至所述小鼠中。无特定的致病体的雌性DBA/1小鼠(6-8周)购自Jackson Laboratory。通过使C57BL/6背景的Foxp3gfp敲入小鼠对DBA/1小鼠回交13代开发DBA/1背景的Foxp3gfp敲入小鼠。所有动物均按照国家卫生研究院对于实验动物使用的原则进行处理，并且获得南加利福尼亚大学动物使用和护理委员会(LosAngeles, CA)的批准。
如图3A所示，atRA处理的nTreg的转移完全阻断关节炎症状的发展，并且与第28天的小鼠相比甚至可以降低临床评分。相反地，类似于只用PBS注射的小鼠，用无atRA激活的nTreg注射的小鼠出现越来越严重的关节炎(图3A)。对于图3A的实验，将nTreg在DMSO或atRA (0.05μM)存在下用抗CD3/CD28涂布的微珠(1:5)和IL-2 (100 U/ml)扩增4天。用1×106 atRA处理的nTreg、DMSO处理的nTreg或PBS (对照组) IV注射CII/CFA免疫之后第28天患有确立的关节炎的小鼠。免疫之后每隔两天对小鼠进行研究并且指出临床评分。
在另一个实验中，对用牛胶原II免疫的DBA/1小鼠施用用或或不用atRA处理的3x106 nTreg，这些细胞对CIA的作用与用1x106细胞处理的小鼠中的作用相似(数据未示出)。因此，没有用atRA处理的nTreg缺少预防作用不能通过细胞数量不足来解释。atRA处理的nTreg的转移也抑制确立的CIA中的CII特异性抗体的产生(图3B)。这表示所述临床改善与CII特异性免疫应答降低相关。对于图3B中的实验，通过ELISA测量CII/CFA免疫之后第45天血清中的CII特异性IgG1和IgG2a水平。数值表示两个独立实验的平均值±SEM(n = 8/组)。p值表示用atRA或溶剂对照处理的nTreg之间的显著差异(学生t检验，p<0.05)。
实施例5：用atRA处理的nTreg通过IL-6受体和信号传导的降调节保持表现型和功
能
已经证明atRA不仅强烈地抑制TGF-β诱导的IL-6 Rα mRNA的升调节而且还降低IL-6加TGF-β诱导的p-Stat3表达水平。atRA处理稳定nTreg的表现型(特别是抑制功能)的一个可能机理可能是通过IL-6R表达和IL-6R信号传导的降调节。为了研究这种可能的机理，用有或没有atRA的抗-CD3/CD28涂布的微珠和IL-2将CD4+CD25+细胞刺激4天。类似于自然的T细胞，刚分离的nTreg细胞表达大量的IL-6Rα-链(CD126)，TCR激活之后轻微地降低(图4A)。CD126 (IL-6Rα链)表达通过流式细胞术测定。有趣的是，添加atRA显著地降低激活的nTreg中的CD126表达(图4A)。虽然nTreg的IL-6 Rβ(CD130)表达不高，添加atRA也显著地降低其表达(图4B)。IL-6受体表达降低可能与IL-6R信号传导的降调节有关，因为添加atRA也显著地降低nTreg中的Stat-3激活(图4B)。当用IL-6再刺激atRA处理的nTreg时，IL-6信号传导的降低伴随有ROR-γt表达的降低(图4B)，这是Th17细胞分化所需的关键的转录因子。该发现与IL-2和TGF-β对在nTreg细胞上的IL-6受体表达和信号传导都有显著影响的报告一致。图4B示出通过流式细胞术测定的表面CD126、CD130 (IL-6Rβ链)、胞内磷酸化的STAT3和转录因子ROR-γt表达的平均值±SEM (n =4)。p值表示DMSO处理的和atRA处理的nTreg之间的显著差异(p<0.05，t检验)。
实施例6：atRA处理在人nTreg中的作用
除了小鼠nTreg之外，atRA还稳定人nTreg的FOXP3表达。从人外周血液中分离nTreg并且在存在或不存在atRA下用具有IL-2的抗CD3/28涂布的微珠扩增。如图5A和5B所示，一些培养物包含IL-1和/或IL-6。随着nTreg在培养物中增殖，表达FOXP3的atRA处理的nTreg的百分数比对照nTreg降低明显小得多，并且相应地atRA显著地增加FOXP3+细胞的总数(**p<0.01，***p<0.001)。培养十天时对照FOXP3+细胞增加5倍，而atRA处理的nTreg增加20倍。因此，用atRA处理人nTreg稳定FOXP3并且引起扩增的抑制性细胞的产率显著增加。
图6显示预先暴露于atRA的人Treg的预防活性显著比这些细胞暴露于细胞因子IL-1和IL-6之后的对照扩增的nTreg大。通常在炎症渗出物中发现这些细胞因子并且已经证明其降低nTreg的功能性质。用人血液单核细胞注射免疫缺陷NOD SCID IL-2Rγ链缺陷小鼠。这些小鼠迅速因人T细胞诱导的移植物抗宿主病而死亡(图6A)。这些小鼠体重也迅速减轻(图6B)并且一周后在其血清中检测到大量的人IgG抗体(图6C)。对照(未处理的)nTreg和用atRA处理的诱导的Treg都延长存活、延缓体重减轻以及防止IgG抗体产生。图6D-G显示用IL-1和IL-6接触nTreg和用atRA诱导的Treg的影响。与这些细胞因子一起用抗CD3/28微珠再刺激nTreg和用atRA诱导的Treg三天并且随后注入小鼠中。图6E-G显示与未处理的nTreg相比用atRA诱导的Treg被显著地稳定(Log Rank检验)。这些结果表明用atRA处理的nTreg相对未处理的nTreg也预期类似地显示稳定性。
实施例7：从关节炎小鼠模型分离的nTreg
如图7所示，从患有确立的自身免疫关节炎(胶原诱导的关节炎–“CIA”)的小鼠模型中分离的nTreg用atRA处理时也显示抑制活性。对于图7A中的实验，用有和没有atRA(0.05 μM)的固定的抗CD3 (1 μg/ml)和IL-6 (10 ng/ml)刺激从CIA小鼠分离的nTreg 7天。通过FOXP3表达测量表现型稳定性并且通过T应答细胞的增殖测定抑制活性。CMP表示T应答细胞的数值。图7A中的数值表示三个独立实验的平均± SEM。在图7B中的实验中，用抗CD3/CD28微珠(1:5)和IL-2 (100 U/ml)±atRA (0.05 μM)将来自CIA小鼠的nTreg扩增4天。用1×106 atRA处理的nTreg、DMSO处理的nTreg或PBS(对照组)(n = 6/组)对患有确立的CIA的小鼠静脉注射。注射之后每五天对小鼠进行研究并且指明临床评分。
在图7A和图7B中的数据显示从患有免疫失调的小鼠分离的nTreg可以用atRA处理以产生抑制活性。
本说明书在目前描述的技术的实施例方面提供方法、系统和/或结构以及其用途的完整描述。虽然该技术的多种方面已经如上在一定程度的具体性上或参考一个或多个独特的方面作了描述，但是本领域技术人员不脱离此技术的精神或范畴就能够对公开的方面做大量的改变。因为可以不脱离目前描述的技术的精神和范畴而产生许多方面，适当的范畴存在于下文附加的权利要求书中。因此涵盖其它方面。此外，应理解的是，除非另外明确地主张或主张语言本身需要特定的顺序，否则任何操作可以以任何顺序进行。希望包含于以上描述和在附图中示出的所有事物只解释为特定方面的说明性的并且不限于示出的实施方案。除非另外从上下文清晰可见或明确说明，否则本文中提供的任何浓度值通常就混合物值或百分数给出，而不考虑添加混合物的特定组分时或之后发生的任何转化。如果尚未明确地并入本文中，那么在本公开中涉及的所有公开的参考文献和专利文件均以全文引用方式并入本文以达到所有目的。如在以下权利要求书中定义，可以进行不脱离本技术的基本要素的细节或结构上的改变。
Claims (32)
1.一种扩增天然调节性T细胞(nTreg)的方法，所述方法包括用调节性的组合物处理包含纯度大于99%的CD4+CD25+nTreg的细胞培养物，其中所述调节性的组合物包含0.01至20 μM的全反式维甲酸(atRA)或其它维生素A衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述维生素A衍生物为全反式维甲酸(atRA)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述调节性的组合物包含0.1至2.0 μM的全反式维甲酸(atRA)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述维生素A衍生物为合成类视黄醇。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述合成类视黄醇为Am80。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含细胞因子。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子为TGF-β。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含IL-2。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含T细胞激活因子。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述T细胞激活因子为选自抗CD3、抗CD28或抗CD3和抗CD28的组合的成员。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含防止编码转录因子的基因甲基化的试剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂为甲基转移酶抑制剂，所述转录因子是FOXP3。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述甲基转移酶抑制剂为氮杂胞苷。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含是组蛋白脱乙酰酶抑制剂的试剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂为选自曲古抑菌素A、ppARγ激动剂和丙戊酸的成员。
16.一种稳定nTreg的表现型的方法，所述方法包括用调节性的组合物体外处理纯度大于99%的CD4+CD25+nTreg，其中所述调节性的组合物包含0.01至20 μM的atRA。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述调节性的组合物包含0.1至2.0 μM的atRA。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述稳定包括使所述nTreg抵抗Th17转化。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述稳定包括在炎症环境中保持nTreg表现型。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述nTreg表现型包括选自表达FOXP3、抑制活性及其组合的方法。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物经受流式细胞术以在所述用所述调节性的组合物处理之前和/或之后富集FOXP3+细胞。
22.一种降低与nTreg中的炎症响应相关的转录因子表达的方法，所述方法包括用包含0.01至20 μM的atRA的调节性的组合物体外处理纯度大于99%的CD4+CD25+nTreg。
23.处理的nTreg在制备用于治疗患者的异常免疫反应或自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述处理的nTreg通过用包含0.01至20 μM的atRA的调节性的组合物处理包含纯度大于99%的CD4+CD25+nTreg的细胞培养物来产生。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述调节性的组合物包含0.1至2.0 μM的atRA。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含TGF-β。
26.如权利要求22或25所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含IL-2。
27.如权利要求22或25所述的方法，其中所述调节性的组合物进一步包含T细胞激活因子。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述T细胞激活因子为抗CD3、抗CD28或抗CD3和抗CD28的组合。
29.如权利要求23所述的用途，其中所述调节性的组合物进一步包含TGF-β。
30.如权利要求23或29所述的用途，其中所述调节性的组合物进一步包含IL-2。
31.如权利要求23或29所述的用途，其中所述调节性的组合物进一步包含T细胞激活因子。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述T细胞激活因子为抗CD3、抗CD28或抗CD3和抗CD28的组合。
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