JP2017505766A

JP2017505766A - 皮膚上でのイムノリバランス

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Publication number: JP2017505766A
Application number: JP2016546923A
Authority: JP
Inventors: モンドゥレ，リュシー; ディオセフィー，ヴァンサン; ベナム，ピエール・アンリ; デュポン，クリストフ
Original assignee: デベヴェ・テクノロジーズ
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2017-02-23
Also published as: MX2016009306A; EP3094335A1; US20160331834A1; CN106163555A; WO2015107081A1; CA2936259A1; EA201691443A1; BR112016016525A2; IL246499A0; KR20160107328A; AU2015206046A1

Abstract

本発明は、皮膚上でのイムノバランスにより、対象の状態を改善する組成物及び方法に関する。本発明は、特定のレギュラトリーＴ細胞を皮膚上での処置により対象中で誘導及び維持することにより、対象の状態を実質的に改善させることができることを示す。本発明は、対象のイムノバランスを改善し、疾患の開始又は進行を回避する予防的環境、及び、対象の回復を改善する治療的環境に使用することができる。本発明は、増殖性又は自己免疫性疾患を予防又は治療するのに特に適している。本発明は、任意のほ乳類の対象、好ましくは、小児及び成人を含むヒトの対象に使用することができる。

Description

本発明は、皮膚上でのイムノリバランス（immunorebalancing）により、対象の状態を改善する組成物及び方法に関する。本発明は、レギュラトリーＴ細胞の特定のサブセットを皮膚上で処置することで対象中で誘導及び維持することにより、対象の状態を実質的に改善させることができることを示す。本発明は、対象のイムノバランス（immunobalance）を改善し、疾患の開始又は進行を回避する予防的環境、及び、対象の回復を改善する治療的環境に使用することができる。本発明は、同種移植拒絶を含む増殖性、自己免疫性、又は炎症性疾患を予防又は治療するのに特に適している。本発明は、任意のほ乳類の対象、好ましくは、小児及び成人を含むヒトの対象に使用することができる。

皮膚上での免疫療法は、アレルギー性の対象を、アレルゲンの皮膚適用により脱感作する方法である。一定又は可変用量でアレルゲンを適用することにより、対象は、アレルゲンに対して寛容になる。この方法は、典型的には、公知のアレルゲンを繰返し適用して、対象の皮膚上で既存のアレルギーを引きこさせ、皮膚の表面層にアレルゲンを全体的に拡散させることを含む。本発明者らにより行われた実験から、皮膚上での免疫療法により生じる免疫応答の種類は、処置条件により制御することができることが示されている。例えば、本発明の譲受人に譲渡された国際公開公報第２００９／０８０９３４号（特許文献１）には、アレルゲンに対する強力な脱感作が、補助剤を使用することなく、皮膚のインタクトな領域に適用されたアレルゲンを使用する皮膚上での治療により得ることができることが開示されている。同様に、本発明の譲受人に譲渡された国際公開公報第２００９／０７１５９９号（特許文献２）には、ピーナッツに対する強力な脱感作が、皮膚上での免疫療法により得ることができることが開示されている。

免疫療法の作用機序は、十分に理解されていないが、複数の経路、例えば、（ａ）ＩｇＥの生物学的作用を阻害可能なＩｇＧ、特にＩｇＧ４画分の増大、（ｂ）よりバランスの取れたＴＨ１／ＴＨ２応答を促進する、ＴＨ１及びＴＨ２免疫応答の改変、ならびに／又は（ｃ）マスト細胞、特定のＴリンパ球、及び好酸球に対して抗アレルギー性を提示し、ＩｇＧ４の産生も促進する、インターロイキン１０産生Ｔ細胞の産生が関与すると考えられる。

研究を継続する内に、本出願人は、皮膚上での免疫療法の一部の抗アレルギー作用は、レギュラトリーＴ細胞（「Ｔｒｅｇ」）の産生により媒介することができることを見出した。特に、出願人は、ピーナッツに対してアレルギーを示す対象にピーナッツアレルゲンを皮膚上に処置することにより特定のＴｒｅｇを誘導することができること、及び、このような誘導がピーナッツ脱感作に寄与することができることを発見した（J Immunol. 2011;186(10):5629-37（非特許文献１）を参照のこと）。アレルゲンの皮膚上での適用に基づいて、アレルギーを予防する皮膚上での方法は、国際公開公報第２０１３／１１７５１９号（特許文献３）にも提案されている。

Bynoe et alにも、自己抗原ペプチドを皮膚上に適用することにより、対象におけるアレルギー応答を予防する方法が記載されている（Immunity Vol 19 (2003), 317）（非特許文献２）。この刊行物によれば、このような皮膚上での処置により、抗原特異的ＣＤ２５⁻サプレッシブＴ細胞が産生された。

上記刊行物は、アレルギー性の対象の皮膚上での媒介性アレルゲン特異的脱感作に関するが、予備的な研究が、自己免疫障害を避けるための皮膚上での免疫療法を使用する能力を調査するのに行われた。これに関して、Strid et al（PLoS ONE 2(4) 2007 p e387）（非特許文献３）には、ＩＩ型コラーゲンによる感作が提案されているが、ＣＤ２５＋Ｔ細胞レベルは、この処置により上昇しなかったと結論付けられた。

Bohle B, et al（The Journal of allergy and clinical immunology. 2007;120(3):707-13）、Francis JN, et al（Journal of allergy and clinical immunology. 2008;121(5):1120-5）、及びMobs C, et al（The e2. Epub 2008/04/01）（非特許文献４〜６）には、舌下又は皮下の免疫療法が、ＩＬ−１０産生Ｔレギュラトリー細胞（Ｔｒ１）を誘導することができることが示唆されている。Ｔｒ１についての作用機序は、ＩＬ−１０の分泌によってのみ媒介される。著者らは全て、ＴＧＦ−β又は細胞接触は免疫サプレッション作用に関与していなかったと説明している。さらに、Bohle et alには、ＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇが、ＳＬＩＴの初期段階中に誘導されたが、ＳＬＩＴの後続段階中に維持されなかったことが記載されている。

既存の非アレルギー性障害を皮膚上での治療により処置する可能性、又は、対象における長期持続性及び有意義なイムノリバランスを生じさせる可能性は、当技術分野において開示も、示唆もされていない。

国際公開公報第２００９／０８０９３４号国際公開公報第２００９／０７１５９９号国際公開公報第２０１３／１１７５１９号

J Immunol. 2011;186(10):5629-37 Immunity Vol 19 (2003), 317 PLoS ONE 2(4) 2007 p e387 The Journal of allergy and clinical immunology. 2007;120(3):707-13 Journal of allergy and clinical immunology. 2008;121(5):1120-5 The e2. Epub 2008/04/01

本発明は、皮膚上での治療が対象における中枢又は末梢での寛容から生じる欠乏を治療又は予防するのに使用することができるという証拠を提供する。本発明は、他の免疫療法中に観察されたＩＬ１０＋Ｔｒｅｇとは異なる優れた表現型を有する特定のレギュラトリーＴ細胞のサブセットを、皮膚上での処置により患者中で誘導及び維持することにより、対象の状態を実質的に改善させることができることを示す。本発明は、疾患の開始又は進行を回避する予防的環境、及び、対象の回復を改善する治療的環境に使用することができる。本発明は、本発明は、増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患を予防又は治療するのに特に適している。

したがって、本発明の目的は、対象の状態を改善する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含む方法を提供することである。より好ましくは、本方法は、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、遺伝子プロモータのメチル化状態のモデュレーション、特に、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化の増大を誘導するのに十分な条件下において、抗原の連続的な皮膚上での適用を含む。本方法は、増殖性、自己免疫性、もしくはアレルギー性疾患、又は、中枢もしくは末梢での寛容から生じる任意の欠乏を予防又は治療するのに特に有効である。これに関して、本発明は、Ｔｒｅｇにより媒介される安定した長期持続性寛容を生じさせること及びＧＡＴＡ−３遺伝子の後成的改変により、アレルギーを治療又は予防するのにも適している。

これに関して、本発明の特定の目的は、対象における増殖性、自己免疫性、又は炎症性疾患の開始又は進行を予防又は低下させる方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含み、前記適用が、前記疾患の予防又は低下をもたらす方法に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、転写因子ＤＮＡのＣｐＧ島メチル化をモデュレーションするのに十分な条件下において行われる。

本発明の更なる特定の目的は、対象における既存の増殖性、自己免疫性、又は炎症性疾患を治療又は緩和する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含み、前記適用が、前記疾患の治療又は緩和をもたらす方法に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、転写因子ＤＮＡのＣｐＧ島メチル化をモデュレーションするのに十分な条件下において行われる。

本発明の更なる特定の目的は、対象におけるアレルギーを予防、治療、又は緩和する方法であって、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び転写因子ＤＮＡのＣｐＧ島メチル化をモデュレーションするのに十分な条件下において、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含む方法に関する。

本発明の更なる目的は、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原又は組成物を連続的に適用することにより、対象における増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患を治療又は予防するのに使用し、前記適用が、前記疾患の予防又は治療をもたらすための抗原又は抗原を含む組成物に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、転写因子ＤＮＡのＣｐＧ島メチル化をモデュレーションするのに十分な条件下において行われる。

本発明の更なる目的は、対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用すること含む方法に関する。本発明はまた、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することにより、対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに使用するための抗原に関する。好ましい実施態様では、Ｔｒｅｇ細胞は、ナイーブな（ＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ６２Ｌ＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はエフェクター（ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ６２Ｌ−）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇである。検討されるであろうように、これらの細胞は、対象における強力かつ持続的なイムノリバランスを可能にする特定の生物学的活性を示す。

本発明の更なる目的は、対象中でＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用すること含む方法に関する。本発明はまた、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することにより、対象におけるＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに使用するための抗原に関する。検討されるであろうように、これらの細胞は、対象における強力かつ持続的なイムノリバランスを可能にする特定の生物学的活性を示す。

本発明の更なる目的は、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することにより、対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するための医薬として使用するための抗原に関する。

本発明はまた、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を製造する方法であって、（ｉ）哺乳類における（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを、哺乳類の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することにより刺激することと、（ｉｉ）（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇをそれぞれ、前記哺乳類から収集することと、（ｉｉｉ）（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇをそれぞれ、培養又は増殖又は保存又は配合することとを含む方法に関する。

本組成物又は方法に使用するための抗原は、種々の性質のもの、例えば、好ましくは、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、粒子、金属、又はそれらの組み合わせでもよい。好ましい実施態様では、抗原は、対象が自然又は誘導性の皮膚感受性を示す抗原である。

本発明は、任意の哺乳類の対象、好ましくは、小児及び成人を含むヒトの対象に使用することができる。

ピーナッツに対して感作させたマウスにおける８週間のＥＰＩＴにより誘導されたＴｒｅｇの分析。ナイーブ、感作させた処置していないマウス（Ｓｈａｍ）、又は感作させたＥＰＩＴ処置マウスの脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０で染色し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１０＋、及びＣＤ４＋ＬＡＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより測定した。ピーナッツに対して感作させたマウスにおけるＥＰＩＴにより誘導されたＴｒｅｇにおけるＣＴＬＡ−４発現の誘導分析。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスを、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、及びＣＴＬＡ−４で染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣにより特定されたリンパ球の中から、細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした。ＣＴＬＡ−４を発現している細胞の割合を分析した。ＥＰＩＴに由来する脾臓細胞によるピーナッツ特異的ＴＨ２サイトカイン産生の減少は、抗ＣＴＬＡ−４により阻害されるが、抗ＩＬ−１０では阻害さない。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスの脾臓細胞を、培地単独、培地＋ピーナッツタンパク質抽出物（ＰＰＥ）、抗ＩＬ−１０阻害抗体の存在下での培地＋ＰＰＥ、又は抗ＣＴＬＡ−４阻害抗体の存在下での培地＋ＰＰＥ中において、３日間培養した。ついで、上清を収集し、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ピーナッツに対して感作させたマウスにおけるＥＰＩＴにより誘導されたＴｒｅｇのエフェクター（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ−）又はナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌ＋）の表現型の分析。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスの脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４４、及びＣＤ６２Ｌで染色した。細胞を、ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、ＣＤ４＋でゲーティングした。ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ−（エフェクターＴｒｅｇ）又はＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブのＴｒｅｇ）の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。ＥＰＩＴは、ピーナッツに対して感作させたマウスにおける自然（ＣＤ３０４＋）及び誘導性（ＣＤ３０４−）Ｔｒｅｇを両方とも増大させた。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスの脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、及びＣＤ３０４で染色した。細胞を、ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、ＣＤ４＋でゲーティングした。ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３０４＋（ｎＴｒｅｇｓ）又はＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３０４−（ｉＴｒｅｇs）の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。ＥＰＩＴは、Ｔｒｅｇについての大きなレパートリーのホーミングレセプターを誘導した。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスの脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、及びＣＣＲ４、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、又はＣＣＲ３で染色した。ＣＬＡ及びＣＣＲ９の共発現を分析した。ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした。ホーミングレセプターの発現を分析した。ＥＰＩＴは、Ｔｒｅｇについての大きなレパートリーのホーミングレセプターを誘導した。ナイーブ、Ｓｈａｍ、又はＥＰＩＴマウスの脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、及びＣＣＲ４、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、又はＣＣＲ３で染色した。ＣＬＡ及びＣＣＲ９の共発現を分析した。ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした。ホーミングレセプターの発現を分析した。ＥＰＩＴ終了後８週間でのＤＮＡ分析。メチル化感受性及び／又はメチル化依存的制限酵素による開裂後に残存する挿入ＤＮＡの検出に基づいて、市販キット（SA biosciences）を使用することによるＧＡＴＡ−３のプロモータ領域におけるメチル化レベルの測定。ＥＰＩＴ中の脾臓全体におけるＤＮＡ分析。メチル化感受性及び／又はメチル化依存的制限酵素による開裂後に残存する挿入ＤＮＡの検出に基づいて、市販キット（SA biosciences）を使用することによるＧＡＴＡ−３のプロモータ領域におけるメチル化レベルの測定。ＥＰＩＴ中の全血におけるＤＮＡ分析。メチル化感受性及び／又はメチル化依存的制限酵素による開裂後に残存する挿入ＤＮＡの検出に基づいて、市販キット（SA biosciences）を使用することによるＧＡＴＡ−３のプロモータ領域におけるメチル化レベルの測定。ＥＰＩＴ（登録商標）による第１週（１ｗ）、第２週（２ｗ）、第４週（４ｗ）、第６週（６ｗ）、第８週（８ｗ）及びＥＰＩＴ（登録商標）終了後８週（８＋８ｗ）での、（ａ）脾臓及び（ｂ）全血から単離されたＣＤ４細胞におけるＧＡＴＡ−３遺伝子のメチル化レベル分析。結果を、平均±ＳＤで表現する。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１．ＥＰＩＴ（登録商標）による第１週（１ｗ）、第２週（２ｗ）、第４週（４ｗ）、第６週（６ｗ）、第８週（８ｗ）及びＥＰＩＴ（登録商標）終了後８週（８＋８ｗ）での、（ａ）脾臓及び（ｂ）全血から単離されたＣＤ４細胞におけるＦｏｘｐ３遺伝子のメチル化レベル分析。結果を、平均±ＳＤで表現する。^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

本発明は、対象の連続的な皮膚上での処置が、他の免疫療法において観察された細胞と区別でき、対象の状態を実質的かつ長期持続的に改善させるのに適した、レギュラトリーＴ細胞の特定のサブセットを誘導することができるという、予期せぬ発見に起因している。本発明は、対象のイムノバランスを改善し、疾患の開始又は進行を回避する予防的環境、及び、対象の回復を改善する治療的環境に使用することができる。本発明は、任意のほ乳類の対象、好ましくは、ヒトの対象における、増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患を予防又は治療するのに特に適している。

本開示は、下記定義を参照して、最も良く理解されるであろう。

定義
「皮膚上での」投与は、皮膚表面との接触を可能にする条件下において、対象の皮膚上に物質（すなわち、抗原）を適用することを意味する。皮膚上での適用は、好ましくは、皮膚構造に著しい変化をもたらす皮膚穿孔又は前処置を何らすることなく行われる。皮膚への適用は、好ましくは、皮膚の表層中に、及び／又は、アレルゲンと免疫細胞との接触を可能にするのに十分な期間、アレルゲンの浸透を可能にする条件において維持される。皮膚上での投与は、好ましくは、皮膚装置、例えば、パッチにより行われる。

皮膚上での適用に関する「連続的な」という用語は、抗原と免疫系との長期持続性、好ましくは、永続的な接触をもたらす、又は、長期持続性、好ましくは、永続的な、前記抗原との接触により生じる免疫細胞の存在をもたらす適用を指す。連続的な適用は、好ましくは、３〜最大６０ヶ月である。連続的な適用は、より好ましくは、抗原と免疫系との日常的な接触を確保するものとする。

本発明の文脈内において、「予防すること」という用語は、対象を疾患の開始又は進行から保護すること、このような疾患の出現又は発生を遅延させること、又はこのような疾患のいずれかを阻害しもしくは同疾患の大きさを低下させることを含むと意味する。

本発明の文脈内において、「インタクトな皮膚」という用語は、角質層の完全性が実質的に維持されている必要があることを示す。本発明の実施について、抗原をインタクトな皮膚に、例えば、角質層の完全性が本質的に維持されている皮膚の表面又は部分に適用するのが実際に最も好ましい。この完全性を維持することにより、得られる応答は、免疫寛容の意味に非常に向けられる。したがって、皮膚表面の軽い洗浄、例えば、水分補給、水洗、又は非常に軽いストリッピング（多くても、４又は５回のテープストリッピング）を、適用部位に行って、例えば、角質細胞を除去することができるが、皮膚は、角質層の実質的な完全性を維持するために、前処置をするべきではない。特に、皮膚の強いアブレーションを行うべきでない。このような前処置は、角質層の全部又は一部を破壊又は除去してしまうためである。同様に、角質層の穿孔は避けるべきである。

「抗原」という用語は、免疫反応に関与する免疫分子を意味する。抗原は、種々の性質のもの、例えば、脂質、タンパク質、ぺプチド、ポリペプチド、核酸、金属、プラスチック等でもよい。特定の実施態様では、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドである、抗原は、天然の状態でもよく、又は、（例えば、リンコンビナント及び／又は酵素技術等により）人工的に製造されてもよい。抗原は、その安定性、免疫原性等を改善するために、構造的に変更又は改変することができる。抗原は、純粋でもよいし、又は、他の成分との混合物でもよい。抗原は、複数の分子の混合物（例えば、抽出物）であることもできる。以下にさらに検討されるであろうように、抗原は、種々の状態、例えば、液状また乾燥状で使用することができる。

特定のＣＴＬＡ−４＋Ｔｒｅｇのサブセット及び遺伝子メチル化を誘導する方法。
本発明は、抗原の皮膚上での投与が、対象中で非抗原特異的ＣＴＬＡ−４＋Ｔｒｅｇを誘導又は刺激することができるという、予期せぬ発見を開示している。このような特定の細胞は、前記対象のイムノリバランスを改善することにより対象の状態を改善する、優れた特性を示す。

Ｔｒｅｇは、免疫サプレッシブ又は免疫レギュラトリー機能を有するＴ細胞のクラスである。種々の集団のレギュラトリーＴ（Ｔｒｅｇ）細胞が、末梢での免疫ホメオスタシスの維持及び制御された免疫応答の確立において、中心的役割を果たすのが示されている。天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と、アレルゲン特異的ＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇ１型（Ｔｒ１）、ＴＧＦβ分泌Ｔｒｅｇ（Ｔｈ３）細胞の誘導性集団は両方とも、実験モデルにおいて、アレルゲン特異的エフェクター細胞を阻害する。Ｔｒ１細胞のサプレッシブ能は、ＩＬ−１０依存的である。一方、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、細胞−細胞接触によるサプレッションを媒介する。アレルゲン特異的エフェクターＴ細胞のレギュラトリー表現型への傾斜は、抗原に対する健全な免疫応答の進行及び免疫療法の成功したアウトカムにおける重要なイベントであると考えられる。

フォークヘッドボックスタンパク質３−陽性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｈ３、及びＴｒ１細胞は、複数の主要な方法において、抗原特異的免疫応答の制御に寄与する。この複数の主要な方法は、エフェクターＴ細胞の生成；エフェクターＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ７細胞のサプレッション；アレルゲン特異的ＩｇＥのサプレッション及びＩｇＧ４の誘導；マスト細胞、好塩基球、及び好酸球のサプレッション；滞留組織細胞との相互作用及びリモデリング；ならびに組織に対するエフェクターＴ細胞遊走のサプレッションを支持する樹状細胞のサプレッションとしてまとめることができる。組織、起源、及び刺激条件に応じて、種々のサブセットは、そのサイトカイン産生及び表面マーカー発現、ならびに、それらが免疫応答をどのようにサプレッションするかにおいて異なる。

サプレッションのメカニズムは、免疫性のＴｒｅｇ細胞媒介性制御を単独で説明することができることに注意することが重要である。さらに、Ｔｒｅｇ細胞により実施されるＦｏｘｐ３依存性サプレッサープログラムは、自己抗原及び病原体に対する種々の種類のエフェクター免疫応答を抑制する。過去数年において、積み上げられた実験的証拠から、区別できるサプレッサーメカニズムが、特定の組織及び炎症環境において顕著に重要な役割を果たしていることが示唆されている。例えば、Ｔｒｅｇ細胞においてＴｈ１エフェクター細胞分化における重要な転写因子であるＴｂｅｔの発現は、それらが、ＣＸＣＲ３の発現を介して、Ｔｈ１応答部位における遊走、増殖、及び蓄積するのを可能にする（Josefowicz et al, 2012, Annu. Rev. Immunol. 2012. 30:531-64, Regulatory T Cells: Mechanisms of Differentiation and Function）。

Bohle B, et al（The Journal of allergy and clinical immunology. 2007;120(3):707-13）、Francis JN, et al（Journal of allergy and clinical immunology. 2008;121(5):1120-5）、及びMobs C, et al（The e2. Epub 2008/04/01）には、舌下又は皮下の免疫療法が、ＩＬ−１０産生Ｔレギュラトリー細胞を誘導することができることが示唆されている。驚くべきことに、本発明は、皮膚上での免疫療法が、Ｔｒｅｇの特定のサブセットを誘導することができることを示している。このＴｒｅｇは、ＣＴＬＡ４＋又は他の細胞表面マーカー（例えば、ＬＡＰ）を発現するような細胞接触Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を指す。このＴｒｅｇは、サイトカイン（ＩＬ−１０）の分泌を介して作用する他の免疫療法により誘導される細胞とは区別できる。これらの細胞は、ＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇ細胞とは対照的に、細胞接触により本質的に作用し、抗原提示細胞であるＢ細胞及びマスト細胞の活性を変更する。このようなメカニズムでは、これらの細胞は、抗原特異的免疫性に影響を及ぼすだけでなく、対象における適正なイムノリバランスをより全体的に回復させるのも可能である。したがって、抗原の連続的な皮膚上での適用により、対象中でこのような細胞集団を誘導又は刺激し、種々の病理状態の処置のための予防的及び治癒的アプローチをもたらすことが可能である。さらに、本発明は、このような連続的な皮膚上での処置が、特定の遺伝子における後成的な改変の原因になることも、驚くべきことに示している。この後成的な改変は、長期持続性のイムノリバランスをさらに誘導する。より具体的には、本発明の方法が、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるという結果が示されている。ＧＡＴＡ−３遺伝子は、免疫細胞の活性に関与する転写因子である。この遺伝子のメチル化を増大させることにより、本発明の方法は、この転写因子を阻害し、Ｔｈ２転写因子の発現をモデュレーションし、持続的なイムノリバランスをもたらす。

このため、本発明の目的は、対象の状態を改善する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含む方法に属する。より好ましくは、本方法は、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件下、及び／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるのに十分な条件下において、抗原の連続的な皮膚上での適用を含む。

本発明の更なる目的は、対象における増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患の開始又は進行を予防又は低下させる方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含み、前記適用が、前記疾患の予防又は低下をもたらす方法に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるのに十分な条件下において行われる。

本発明の更なる特定の目的は、対象における既存の増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患を治療又は緩和する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含み、前記適用が、前記疾患の治療又は緩和をもたらす方法に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるのに十分な条件下において行われる。

本発明の更なる目的は、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原又は組成物を連続的に適用することにより、対象における増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性の疾患を治療又は予防するのに使用し、前記適用が、前記疾患の予防又は治療をもたらすための、抗原又は抗原を含む組成物に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及び／もしくはＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、ならびに／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるのに十分な条件、及び／もしくは、Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を減少させる条件下において行われ、より好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、及び／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させ、同時に、Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を減少させる条件下において行われる。

本発明の更なる目的は、対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する方法であって、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用すること含む方法に関する。本発明はまた、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することにより、対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに使用するための抗原に関する。

本発明の更なる目的は、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原又は組成物を連続的に適用することにより、対象における増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患（前記疾患は、寛容破壊から生じる。）を治療又は予防するのに使用し、前記適用が、寛容回復をもたらすための抗原又は抗原を含む組成物に関する。適用は、好ましくは、（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件、ならびに／又は、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を増大させるのに十分な条件、及び／もしくは、（例えば、同時に）Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣｐＧ島メチル化を減少させる条件下において行われる。

有利には、誘導されたＴｒｅｇ細胞は、ナイーブな（ＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ６２Ｌ＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はエフェクター（ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ６２Ｌ−）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの両方であることができる。さらに有利には、本方法は、ＣＤ３０４− Ｔｒｅｇ細胞も誘導し、対象における免疫系をさらに強化する。加えて、実施例に例示されているように、誘導された（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のレパートリーは多様である。これらの細胞が、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ４、及び／又はＣＸＣＲ３分子をさらに発現することができるためである。ＣＴＬＡ−４＋細胞においてこのように多様なレパートリーを誘導することにより、本発明の方法は、対象における疾患状態に対して、強力な保護及び防御を提供する。

自然なＴｒｅｇは、流入領域リンパ節においてエフェクターＴ細胞をサプレッションするのと、ターゲット臓器における組織炎症を阻害するのとに重要である。全てのｎＴｒｅｇ細胞は、転写因子であるＦｏｘｐ３を発現しているが、これらのＦｏｘｐ３Ｔｒｅｇ細胞は、さらに特定化し、所定の転写因子を発現し、エフェクターＴ細胞の区別できるサブセットをサプレッションすることが明らかである。Ｔｒｅｇが寛容を誘導し、組織炎症を防止する場合、Ｔｒｅｇが組織ニッチに特定化することもおそらく驚くべきことではない。組織特異的Ｔｒｅｇの近年特定された例は、脂肪に見出され、脂肪組織への輸送後に区別できる分子サインを獲得する脂肪組織滞在Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇである。組織特異的Ｔｒｅｇの別の例は、Ｆｏｘｐ３を発現しないが、腸内細菌により活性化され、Ｔｈ１及びＴｈ１７活性化腸内炎症をサプレッションする、粘膜ＩＬ−１０分泌Ｔｒ１細胞である。

本発明に使用される抗原は、対象が感受性である任意の抗原でもよい。特に、抗原に対する感受性が対象において観察された場合、本発明の方法は、このような抗原を使用して、連続的な適用により実施することができる。

代替的に、特に自己免疫障害を治療又は緩和するのに、自己抗原を使用することができる。

別の実施態様では、抗原に対する感受性は、まず、対象を前記抗原に曝すことにより、対象に誘導することができる。その後、前記対象において強力なイムノリバランスを、その連続的な皮膚上での適用により誘導することができる。

さらに代替的に、「ユニバーサル」抗原、例えば、任意の対象において応答を生じさせる抗原を使用することができる。このような抗原の例は、例えば、特定の金属を含む。

したがって、まず、対象における抗原性（例えば、アレルギー性反応）の検出に基づいて、本発明の連続的な皮膚上での処置を開始することができる。前記対象において検出された抗原応答は、アレルギー（例えば、食品アレルギー又は塵性ダニアレルギー）、自己免疫疾患、炎症反応等でもよい。適切な量の抗原をこれらの対象に対して皮膚上かつ連続的に投与することにより、好ましいＴｒｅｇ細胞を誘導することで対象の状態を効果的に改善することができる。

対象のおける抗原感受性の存在の検出又は確認後直ぐに処置を行うのが好ましい。実際には、早く作用させることにより、疾患の悪化及び進行を予防するのが期待される、強力で活性な免疫応答を誘導することができる。

抗原応答の検出又は確認は、それ自体は当技術分野において公知の技術を使用して行うことができる。適切な方法の例は、プリック試験の使用、ＩｇＥの投与、アトピーパッチ試験、自己免疫疾患の検出、免疫疾患の検出、アレルギー又は増殖性細胞傷害の検出を含む。抗原反応の検出は、疾患の臨床的サインが存在しない場合でも、抗原に対する感受性の検出を含む。一般的には、まず、古典的な疾患兆候（炎症、膨潤等）の出現から検出される。ついで、必要に応じて、例えば、実務者により上記技術のいずれかを使用して、再度試験し、検証することができる。抗原感受性が対象について検出又は確認されると、本発明の処置を開始することができる。処置の有効性は、処置が抗原応答の検出又は確認後直ちに（例えば、直ちに又は数週間以内、例えば、４週間未満）開始されると向上するであろう。ただし、処置は、複数の抗原反応又は進行した疾患を示す対象においても有効である。

本発明の一態様に基づいて、少なくとも１つの抗原を対象に対して皮膚上に適用することを含む保護方法が提供される。最も好ましくは、適用される少なくとも１つの抗原は、対象が自然又は誘導性の感受性を示す抗原である。

皮膚上での処置プロトコールは、実務家により調節することができる。典型的には、アレルゲンは、ＣＴＬＡ−４＋Ｔｒｅｇ及び／又はＧＡＴＡ−３のメチル化もしくはＦｏｘｐ３の脱メチル化を誘導するのに十分な期間、連続的に適用される。好ましい実施態様では、処置は、少なくとも３ヶ月、好ましくは、少なくとも６ヶ月、及びより好ましくは、６〜６０ヶ月の期間行われる。この処置期間中に、抗原は、種々の頻度、例えば、週１回、２日に１回、又は１日１回で適用することができる。各適用に使用される抗原の用量は、当業者により調節することができる。典型的には、抗原は、０．１〜１００００μg、好ましくは、２０〜１０００μgで含まれる。対象における改善は、従来の試験により任意のタイミングで確認することができる。特に、処置された対象における改善の存在は、疾患の臨床的サインの減少又は同サインの消滅もしくは不存在により確認することができる。臨床的サインの不存在が十分であれば、免疫細胞又はメディエータを対象中に投与することができる。適切な応答が生じると、処置（用量、適用頻度、適用のタイミング）を減らすことができ、又は、処置を中止することもできる。上記のように、患者の免疫系を連続的に刺激するために、処置は、種々の間隔：毎日、隔日、又は隔週での繰返し適用により、典型的には、少なくとも３ヶ月、好ましくは、少なくとも６ヶ月、及びより好ましくは、６〜３６ヶ月の期間維持されるものとする。

疾患に応じて、使用される抗原は異なってもよい。自己免疫障害については、一部の自己抗原を使用することができる

前述のように、ユニバーサル抗原も使用することができ、対象のイムノバランスを改善するために、これらの病理状態の全てに適用可能である、

好ましい実施態様では、抗原は、補助剤なしに適用される。ただし、好ましくはないが、抗原は、補助剤、すなわち、例えば、免疫系を活性化又は促進させて、向上した免疫応答を生じさせる任意の物質と組み合わせることができる。補助剤の例は、鉱物塩、例えば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウム；免疫刺激性ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド；タンパク質、例えば、抗体又はＴｏｌｌ様レセプター結合タンパク質；サポニン、例えば、ＱＳ２１；サイトカイン；ムラミルジペプチド誘導体；ＬＰＳ；ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬを含む誘導体；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）；レチノイン酸；イミキモド；コロイド粒子；完全または不完全なフロイントアジュバント；リビアジュバント又は細菌毒度、例えば、コレラ毒素もしくはエンテロトキシン（ＬＴ）を含む。

さらに好ましい実施態様では、抗原は、皮膚のインタクトな領域上に適用される。

補助剤なしに、インタクトな皮膚上に、抗原を適用するのが特に好ましい。

抗原は、抗原と対象の皮膚との間の接触を維持するのに適した、種々の技術又は装置を使用して適用することができる。このような装置は、パッチ、テープ、包帯、シート、又は、当業者に公知の任意の他の形態を含むが、これらに限定されない。好ましくは、皮膚装置は、パッチであり、さらにより好ましくは、閉塞性パッチである。好ましいパッチ装置は、皮膚の完全性を変更しない、すなわち、パッチ装置は、非穿孔性である。最も好ましい実施態様では、本発明の方法は、国際公開公報第２００２／０７１９５０号及び同第２００７／１２２２２６号に記載されている皮膚パッチ装置を使用する。このような装置は閉塞性であり、乾燥状態の抗原を使用するように構成されており、この抗原は、接着剤を加えることなく、静電力及び／又はファンデルワールス力によりパッチに維持される。このような装置（名称Viaskin（登録商標））の調整及び特徴は、上記特定した出願に詳細に開示されている。同出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の実施について、皮膚と密着する閉鎖チャンバを形成するように構成された基材を備える装置を使用するのが特に十分適している。この基材は、チャンバ内のその皮膚に面する側に、静電力及び／又はファンデルワールス力により付着させた乾燥抗原を有する。皮膚への適用に基づいて、チャンバ内の湿気が増大し、抗原の溶解と、皮膚との接触とがもたらされる。

本発明の別の好ましい実施態様では、抗原は、抗原が結合している支持体を備える閉鎖性パッチ装置を使用して、対象の皮膚上に適用される。好ましくは、抗原は、パッチの支持体に接着剤を加えることなく、静電力又はファンデルワールス力により結合している。特定の実施態様において、パッチの支持体は、ガラス又は、セルロースプラスチック（ＣＡ、ＣＰ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアクリル酸、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリエチレン、及びエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）からなる群より選択されたポリマーを含むことができる。パッチは、接着端により皮膚に貼り付けることができる。

最も好ましい実施態様では、本方法は、乾燥抗原調製物を使用して行われる。同調製物は、好ましくは、静電皮膚装置を使用して、皮膚上に適用される。これに関して、「乾燥」という用語は、抗原が実質的に粉末状、例えば、個別化又は凝集化することができる粒子状であるという事実を指す。

ほとんど好ましくはないが、抗原は、液体状であることができ、公知の装置、例えば、貯留部又は穿孔膜を有する閉鎖性装置を使用して適用することができる。

本発明は、一般的には、対象におけるイムノバランスを改善することにより、対象の状態を改善するのに適していることができる。このように処置された対象は、疾患が進行しにくいであろう。

本発明は、特定の疾患、特に、増殖性、（自己）免疫性、又は炎症性疾患を予防又は治療するのにも使用することができる。

アレルギー性疾患の例は、アレルギー、喘息を含む。

（自己）免疫疾患の例は、糖尿病、同種移植拒絶、クローン病、ＲＡ、ＭＳを含む。

増殖性疾患の例は、ガンを含む。

炎症性疾患の例は、クローン病、ＭＳを含む。

処置は、兆候、平均余命の改善、重症度もしくは疼痛の低下、疾患原因の阻害もしくは転換を特に含むものとする。処置という用語は、病理状態の原因となる又は同状態に関与する、末梢又は中枢における寛容の打破を含む。

本発明は、Ｉ型糖尿病を治療又は緩和するのに特に適している。

本発明の更なる態様及び利点は、下記実験セクションに開示されるであろう。同実験セクションは、例示であると考えられるべきである。

実施例１：皮膚上での免疫療法（ＥＰＩＴ）はＣＴＬＡ−４＋レギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する
Ａ．材料及び方法
２０匹のBALB/cマウスを、コレラ毒素と共にピーナッツタンパク質抽出物に対して、経口的に感作させた。感作後、１０匹のマウスを、ＥＰＩＴにより８週間連続的に処置し、又は、処置しなかった（Ｓｈａｍ）。１０匹のナイーブなマウスを、対照として含めた。処置期間後、マウスを殺処分し、脾臓細胞を、免疫染色及びフローサイトメトリー分析又はｉｎｖｉｔｒｏでの再刺激のために単離した。

脾臓細胞を、抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＰ抗体で染色した。細胞を、ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、ＣＤ４＋でゲーティングした。ＬＡＰ＋、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、又はＣＤ２５＋ＩＬ−１０＋の割合を分析した。ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした。ＣＴＬＡ−４を発現している細胞の割合を分析した。

脾臓細胞を、ピーナッツタンパク質抽出物単独又は抗ＩＬ１０もしくは抗ＣＴＬＡ−４阻害抗体との組み合わせにより、３日間再刺激した。刺激していない細胞を、対照として使用した。ついで、細胞上清を、ＩＬ−５又はＩＬ−１３の存在についてＥＬＩＳＡにより試験した。

実験を、２度再現した。

Ｂ．結果
ピーナッツで感作させたマウスを、ＥＰＩＴにより８週間処置した。ＥＰＩＴは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ４＋ＬＡＰ＋細胞を増大させたが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１０＋細胞を増大させなかった（図１）。さらに、表現型から、連続的なＥＰＩＴにより誘導された高い割合のＴｒｅｇ細胞がＣＴＬＡ−４＋細胞であることが示された（図２）。

従来の特定の免疫療法では、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の分泌によりそのサプレッシブ活性を媒介するＩＬ−１０＋レギュラトリー細胞の頻度が増大する。対照的に、連続的なＥＰＩＴにより誘導されたＴｒｅｇのサプレッシブ活性は、ＩＬ−１０により媒介されず、ＣＴＬＡ−４に対する。このサプレッシブ能を、Ｓｈａｍと比較して、連続的なＥＰＩＴにおけるＴｈ２サイトカインの分泌減少により分析する。このサプレッシブ活性は、ＩＬ−１０経路を阻害した場合でも観察されるが、ＣＴＬＡ−４経路を阻害した場合には阻害される（図３）。

実施例２：連続的なＥＰＩＴはナイーブのＴｒｅｇ及びエフェクターＴｒｅｇを増大させる
Ａ．材料及び方法
２０匹のBALB/cマウスを、コレラ毒素と共にピーナッツタンパク質抽出物に対して、経口的に感作させた。感作後、１０匹のマウスを、ＥＰＩＴにより８週間連続的に処置し、又は、処置しなかった（Ｓｈａｍ）。１０匹のナイーブなマウスを、対照として含めた。処置期間後、マウスを殺処分し、脾臓細胞を、免疫染色及びフローサイトメトリー分析のために単離した。

細胞を、ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、ＣＤ４＋でゲーティングした。ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ−（エフェクターＴｒｅｇ）又はＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブのＴｒｅｇ）の割合を分析した。

実験を、２度再現した。

Ｂ．結果
ＥＰＩＴにより誘導されたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、特定の表現型を示す。ＥＰＩＴ後、ナイーブ（ＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ６２Ｌ＋）及びエフェクター（ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ６２Ｌ−）Ｆｏｘｐ３Ｔｒｅｇは両方とも有意に増大した（図４）。

実施例３：連続的なＥＰＩＴは自然及び誘導性のＴｒｅｇを増大させる
Ａ．材料及び方法
２０匹のBALB/cマウスを、コレラ毒素と共にピーナッツタンパク質抽出物に対して、経口的に感作させた。感作後、１０匹のマウスを、ＥＰＩＴにより８週間連続的に処置し、又は、処置しなかった（Ｓｈａｍ）。１０匹のナイーブなマウスを、対照として含めた。処置期間後、マウスを殺処分し、脾臓細胞を、免疫染色及びフローサイトメトリー分析のために単離した。

細胞を、ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、ＣＤ４＋でゲーティングした。ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３０４＋（ｎＴｒｅｇ）又はＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３０４−（ｉＴｒｅｇ）の割合を分析した。

実験を、２度再現した。

Ｂ．結果
ＥＰＩＴ後、自然（ＣＤ３０４＋）及び誘導性（ＣＤ３０４−）Ｆｏｘｐ３Ｔｒｅｇは両方とも有意に増大した（図５）。

実施例４：連続的なＥＰＩＴは多様なＣＴＬＡ−４＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する
Ａ．材料及び方法
１６匹のBALB/cマウスを、コレラ毒素と共にピーナッツタンパク質抽出物に対して、経口的に感作させた。感作後、８匹のマウスを、ＥＰＩＴにより８週間連続的に処置し、又は、処置しなかった（Ｓｈａｍ）。８匹のナイーブなマウスを、対照として含めた。処置期間後、マウスを殺処分し、脾臓細胞を、免疫染色及びフローサイトメトリー分析のために単離した。

ＦＳＣ／ＳＣＣにより特定されたリンパ球の中から、細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした。ＣＣＲ４（肺のホーミングレセプター）、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）（皮膚のホーミングレセプター）、ＣＣＲ９（消化管のホーミングレセプター）、ＣＸＣＲ３（ＴＨ１炎症ホーミングレセプター）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７炎症ホーミングレセプター）、ＣＣＲ８（Ｔｈ２炎症ホーミングレセプター）、及びＣＣＲ３（好酸球のホーミングレセプター）の発現を分析した。

実験を、２度再現した。

Ｂ．結果
ＥＰＩＴ後、Ｆｏｘｐ３Ｔｒｅｇにおけるホーミングレセプターの発現は多様であり、多様な臓器に遊走し、ついで、種々の経路からの抗原曝露から保護する能力を示唆している。ＥＰＩＴにより誘導されたＴｒｅｇは、高レベルのＣＣＲ４（肺のホーミングレセプター）、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）（皮膚のホーミングレセプター）、ＣＣＲ９（消化管のホーミングレセプター）、ＣＸＣＲ３（ＴＨ１炎症ホーミングレセプター）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７炎症ホーミングレセプター）、ＣＣＲ８（Ｔｈ２炎症ホーミングレセプター）、及びＣＣＲ３（好酸球のホーミングレセプター）を発現した（図６）。

Ｔｒｅｇの種々のサブセットが説明されており、３つの最も関連のあるクラスは、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞、ＴＧＦ−β産生Ｔｈ３細胞（ＬＡＰ＋）、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇである。組織、起源、及び刺激条件に応じて、種々のサブセットは、そのサイトカイン産生及び表面マーカー発現、ならびに、それらが免疫応答をどのようにサプレッションすることができるかにおいて異なる。我々のモデルでは、ＥＰＩＴにより、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及びＬＡＰ＋Ｔｒｅｇの有意な増大が誘導された。ＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇのサプレッシブ活性は、ＩＬ−１０に依存しなかったが、ＣＴＬＡ−４を必要とする。

ＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇは、感作させたマウスを、ピーナッツの経口暴露による食道炎症から保護することができた。これは、ＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇによる、エオタキシンのレセプターであるＣＣＲ３の発現による可能性がある。

ＥＰＩＴ後の脾臓におけるｉＬＮにおいてだけでなく、ｍＬＮにおいても向上したレベルのＣＬＡ＋ＣＣＲ９＋Ｔｒｅｇが存在することは、ＥＰＩＴが、皮膚又は流入領域リンパ節において、ランゲルハンス細胞遊走後に、Ｔｒｅｇを誘導することを明確に示唆している。これらのＴｒｅｇの一部は、ＣＣＲ９も発現しており、ついで、ｍＬＮ及び消化管粘膜に向かって遊走可能であった。ＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇにより発現されたより広い範囲のホーミングレセプターは、ＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇがアレルゲン暴露の種々の部位に遊走可能であり、Ｔｈ２誘導炎症からの保護を誘導可能であり、アレルゲン刺激に対する局所応答をサプレッション可能であるため、局所脱感作よりむしろ全体的な寛容を誘導可能である。

実施例５：連続的なＥＰＩＴはＤＮＡメチル化を誘導する
Ａ．材料及び方法
６０匹のBALB/cマウスを、乳に対して経口的に感作させ、ついで、連続的な皮膚上での免疫療法（ＥＰＩＴ）により処置し、又は、脱感作しなかった（Ｓｈａｍ）。マウスを、処置終了後直ちに又は８週間で殺処分した。別のセットの実験において、マウスを、ピーナッツに対して感作させ、処置（ＥＰＩＴ、Ｓｈａｍ）について同じ群に分割した。１０匹のナイーブなマウスも、この試験に含めた。ＤＮＡメチル化を、各殺処分時の全てのマウスから採取した脾臓サンプルにおいて分析した。

Ｂ．結果
後成的制御は、免疫系における遺伝子レギュレーションの十分確立された手段である。ヒストン改変及びＤＮＡメチル化等のメカニズムにより、リンパ球発達における細胞運命決定は注意深く管理される。したがって、連続的なＥＰＩＴにより誘導された保護効果が後成的な改変、特に転写因子について関与することができるかを調査した。

感作させたマウスモデルにおいて、連続的なＥＰＩＴが後成的改変を誘導したかどうかを調査し、舌下での免疫療法と比較し、転写因子としてのＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔに、より焦点を当てた。

連続的なＥＰＩＴは、Ｓｈａｍに対して、ＧＡＴＡ−３のｐＣｐＧ島におけるメチル化を有意に増大させた（図７）。この改変は、免疫療法終了後２か月間維持されたため（図７）、抗原の連続的な適用の必要性を検証した。

別のセットの実験において、６０匹のBALB/cマウスを、ピーナッツに対して感作させ、その内の３０匹を、ＥＰＩＴにより処置した。ＥＰＩＴ中の種々の時点（１、２、４、６、８週）で、ＧＡＴＡ−３プロモータにおけるメチル化の増大を、脾臓細胞全体及び全血において評価した。

ＥＰＩＴによる後成的改変の実施を、細胞レベルで継続した。特異的抗体に結合させた磁性ビーズを使用して、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＢ細胞を、血液及び脾臓から（１、２、４、６、８週及び処置終了後８週で）分取した。ＤＮＡを、分取した細胞から抽出し、メチル化を、重亜硫酸塩処置、続けて、ピロシーケンスにより分析した。

図８及び９に示したように、メチル化レベルは、脾臓において、第４週からＥＰＩＴ終了まで増大した。一方、同じパラメータは、血液において、ＥＰＩＴの８週後に増大した。

脾臓及び血液のＣＤ４細胞において、ＧＡＴＡ−３のＣｐＧ島における有意な高メチル化が、ＥＰＩＴの第４週において生じ（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）、ＥＰＩＴの終了後に持続した（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。高メチル化は、３％〜２０％で変動している（図１０）。

Ｆｏｘｐ３ＣｐＧ島の有意な低メチル化は、脾臓及び血液のＣＤ４Ｔ細胞において同時に得られ（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）、ＥＰＩＴの終了後（ｐ＜０．０１）及びＥＰＩＴ（登録商標）の終了後８週（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）持続した。低メチル化は、５％〜１５％で変動している（図１１）。

ＣＤ８及びＢ細胞ではこれらの２つの転写因子について改変は観察されず、細胞及び臓器を問わず、Ｔｂｅｔ及びＲＯＲｇ転写因子について改変は観察されなかった。

まとめると、連続的なＥＰＩＴは、後成的な改変によるＴｈ２転写因子のＤＮＡ発現を改変させる、強力な免疫モデュレータとして機能する。ＥＰＩＴによるアレルゲンの長期の連続的な皮膚暴露は、Ｔｈ２（ダウンレギュレーション）のＤＮＡ発現及びＴｒｅｇ（アップレギュレーション）転写因子における持続的な後成的改変をもたらした。

実施例６：連続的なＥＰＩＴによるＩ型糖尿病の処置
２０匹のNODマウス（３ヶ月齢後に糖尿病が進行）を、ＯＶＡに対して感作させ、ついで、１０匹の感作させたマウスを、糖尿病が進行する前にＥＰＩＴ処置した（群１）。

主なエンドポイントを、血中グルコースレベルの測定による糖尿病の非進行とする。更なるマーカーを、下記表に列記する。血糖症の評価を、ＥＰＩＴ中及びＥＰＩＴ中断後に評価した。

糖尿病の発生率は、Ｓｈａｍ又はナイーブなマウスにおいてより、ＥＰＩＴ処置マウスにおいて顕著に低下した。より具体的には、ナイーブなマウス（群３）の６０％が、高血糖症を示したが、ＯＶＡ感作させたＳｈａｍ処置マウス（群２）の５０％が、高血糖症を示し、ＥＰＩＴ処置に基づいて、ＯＶＡ感作させたマウスの１２．５％のみが、高血糖症を示した（群１）。このため、ＥＰＩＴ処置は、糖尿病を予防した。

ＯＶＡに対して特異的なＥＰＩＴ誘導Ｔｒｅｇは、NODマウスにおける糖尿病の進行に影響を及ぼす可能性がある。

Claims

対象中で（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する方法であって、
対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することを含む、
方法。
Ｔｒｅｇ細胞が、ナイーブな（ＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ６２Ｌ＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はエフェクター（ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ６２Ｌ−）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇである、請求項１記載の方法。
前記適用が、さらに、ＣＤ３０４− Ｔｒｅｇ細胞を誘導する、請求項１記載の方法。
Ｔｒｅｇ細胞が、さらに、ＣＣＲ３、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＬＡ、ＣＣＲ６、ＣＣＲ４、及び／又はＣＸＣＲ３分子を発現しており、かつ、ＣＬＡ及びＣＣＲ９を共発現している、請求項１記載の方法。
抗原の皮膚上適用が、数回繰り返され、好ましくは連続的である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
対象の状態を改善する方法であって、
（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するのに十分な条件下において、対象の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を連続的に適用することを含む、
方法。
前記皮膚上の適用が、ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化及び／又はＦｏｘｐ３遺伝子の脱メチル化を増大させる、請求項６記載の方法。
ＧＡＴＡ−３遺伝子のＣｐＧ島メチル化における前記皮膚上媒介性増大が、前記対象におけるＴｈ２転写因子の発現をモデュレーションする、請求項７記載の方法。
増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患の対象における開始又は進行を予防又は低下させるのに使用するための、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
対象における既存の増殖性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性疾患を治療又は緩和するのに使用するための、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
抗原が、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、粒子、金属、又はそれらの組み合わせ、好ましくは、対象が自然又は誘導性の皮膚感受性を示す抗原である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
（ｉ）抗原に対する対象の感受性を誘導することと、（ｉｉ）（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを誘導するのに十分な条件下において、対象の皮膚領域に対して皮膚上に前記抗原を適用することとを含む、請求項１１記載の方法。
抗原が、補助剤なしに適用される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
抗原が、対象における皮膚の無穿孔領域及び未摩耗領域に適用される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
Ｉ型糖尿病を治療又は緩和するための、請求項６〜１４のいずれか一項記載の方法。
対象におけるガンを予防、治療、又は緩和するための、請求項６〜１４のいずれか一項記載の方法。
（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを製造する方法であって、
（ｉ）哺乳類における（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを、哺乳類の皮膚領域に対して皮膚上に抗原を適用することにより刺激することと、（ｉｉ）（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを、前記哺乳類から収集することと、（ｉｉｉ）（ＣＴＬＡ−４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ又はＬＡＰ＋Ｔｒｅｇを、培養又は増殖又は保存又は配合することとを含む、
方法。