KR101885221B1 - 말초혈액단핵구 유래 조절 t 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조절 t 세포 배양방법 - Google Patents

말초혈액단핵구 유래 조절 t 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조절 t 세포 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조절 T 세포 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β, 아프젤린을 배지 조성물에 포함하는 경우 조절 T 세포의 분화 촉진 및 대량 증식 효과를 확인하였다. 또한, 본 발명의 방법으로 증식된 조절 T 세포는 타겟 면역세포의 활성 및 증식을 월등히 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명은 아프젤린 기반의 배지 조성물 및 이를 이용한 조절 T 세포의 배양방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포들은 자가면역질환 치료에 매우 유효한 약학 조성물로 사용할 수 있다.
나아가 본 발명의 배지 조성물은 그 자체로 자가면역질환 치료에 이용될 수 있다.

Description

말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조절 T 세포 배양방법{A medium compostion for regulatory T cells derived from peripheral blood mononuclear cells, and cultivation method using the same}
본 발명은 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린(Afzelin)을 소정량 포함하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법과, 이에 의해 배양된 조절 T 세포를 포함하는 자가면역질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것이다.
인간의 면역체계는 인체에 침입한 미생물 및 암세포 발생 등에 대하여 외부 항원으로 인식하고, 이를 공격하여 제거하는 방어기전을 갖고 있지만, 자기 관용성(self-tolerance)이 존재하여 자기세포에 대해서는 공격하지 않는다. 그러나 면역계의 자기 관용기전에 문제가 생길 경우, 인체는 자기 세포의 자가항원에 반응하는 자가반응 T세포가 활성화되고 자가항체 (autoantibody)가 생성되면서 지속적으로 자기세포를 공격하여 염증 및 면역반응을 일으키게 되어 정상조직을 파괴하게 되며 이러한 반응으로 인해 인체 기관이 손상을 입는 복합적인 증상인 자가면역 질환(autoimmune disease)이 발생하게 된다.
일반적으로 T세포는 골수 (bone marrow)에서부터 생성되어 흉선 (thymus)으로 이동 한 후 분화과정을 거쳐서 성숙된다. 흉선에서 성숙된 T세포로 분화하는 과정에서 자가항원에 대한 관용성이 형성되는데 이를 중심성 T세포 관용 (central T cell tolerance)이라고 한다. 이 과정에서 미성숙 T세포의 99% 이상이 자가항원에 대하여 높은 반응성을 나타내기 때문에 제거 된다. 흉선에서 성숙이 완료되고 말초로 나온 1% 이하의 T 세포는 대부분 자가항원 반응성은 약하고 외부항원에 대한 반응성이 높다. 그러나 중심성 T세포 관용은 완벽 하지 않아서 말초로 나온 T세포 중 일부는 자가항원에 대한 반응성을 어느 정도 유지하고 있다. 따라서, 이들은 말초 림프계에서 추가적인 관용을 겪게 되는데 이를 말초성 T세포 관용 (peripheral T cell tolerance)이라 한다. 대부분 중심성 T세포 관용은 T세포의 발달과정에서 일어나는 현상이고, 성인에서 발생되는 대부분의 자가면역질환은 말초성 T세포 관용에서 문제가 생겨 일어난다고 알려졌다.
인체의 흉선에서 나타나는 보조 T세포 (helper T cell, Th cell)의 분화과정은 주변 미세환경의 사이토카인 (cytokine) 조건에 따라 Th1과 Th2 세포로 분화한다고 알려져 왔었다. Th1 세포는 IFN-γ 및 TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 분비하여 세포내 감염에 대한 방어작용과 염증반응에 관여하고, Th2 세포는 IL-4, IL-5 등을 분비하여 알러지, 천식, 세포외 기생충 감염 등에 반응하여 작용한다고 알려져 왔다. 또한, 최근 흉선의 T세포 분화과정에서 나타나는 조절 T세포 (regulatory T cell; Treg)와 Th17세포가 인체의 관용 유지와 자가면역 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 자가면역을 억제하는 조절 T 세포는 자가항원에 대한 반응성이 있을 잠재성을 갖는 T세포를 억제하는데, 항염증성 사이토카인을 분비하거나 세포와의 직접적인 접촉 등에 의하여 Th1 세포에 의한 면역반응을 억제하고, 항원제시세포 (antigen presenting cell) 중 하나인 수지상세포(dendritic cell)의 기능도 억제하는 것으로 알려지고 있다.
IL-17과 TNF-α를 생산하는 Th17 세포는 Th1 또는 Th2가 아닌 또 다른 Th세포로서, IL-17을 분비하여 IL-6, IL-8, IL-15, TNF-α, VEGF, CSF, MMP 등 다양한 염증성 사이토카인 생산을 유도하고 조직의 염증반응을 유도하게 된다. 특히, IL-17에 대한 수용체가 상피세포, 섬유아세포, B세포, T세포, 골수 단핵세포, 골수 기질세포, 혈관내피세포 등 매우 다양한 세포에 존재하고 있기 때문에 IL-17의 작용은 다양한 조직에서의 자가면역질환 발생에 주요한 원인 요인으로 인식되고 있다.
자기관용에 문제가 생겨 자가면역질환이 발생되는 원인은 아직 확실히 밝혀져 있지 않으나, 유전적, 환경적, 호르몬 분비 및 면역학적 인자 등이 복합적으로 연관되어 자가면역질환의 발병과 진행에 모두 중요한 요소로 작용하는 것으로 인식되고 있으며, 또한, 이러한 요소들이 스트레스와 관련이 있는 것으로 알려졌다.
자가면역질환은 크게 전신성 홍반 낭창증 (systemic lupus erythematosus)과 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis)과 같이 복합적인 기관 손상으로 나타나는 전신성 질환 (systemicdiseases)과 제1형 당뇨병 (type I diabetes mellitus) 다발성 경화증 (multiple sclerosis)과 같이 특정 하나의 기관에 국한되어 나타나는 조직특이성 (tissue specific) 혹은 국소성 질환 (localized diseases)으로 구분되기도 한다.
조절 T세포는 전체 Th 세포의 5~10%를 차지하는 소수의 세포군으로, 다른 T 세포의 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있고, 단백질 CD4, CD25 및 Foxp3을 발현하고 있어, CD4+CD25+Foxp3+ T 세포로 불리기도 한다. 조절 T 세포는 IL-10, TGF-β 및 IL-35 등의 억제성 사이토카인을 분비하며, T세포의 활성에 매우 중요 한 IL-2를 흡착함으로써 IL-2의 활성을 억제 조절하는 것으로 발혀졌다. 특히 조절 T 세포가 자가면역질환에서 주된 원인으로 인식되는 Th17 세포의 활성을 억제하고, CTLA-4와 LFA-1라는 공동자극인자의 도움으로 직접 수지상세포에 접촉하여 CD80과 CD86의 발현을 감소시켜 수지상세포의 기능을 억제하는 것으로 보고되었다.
아프젤린(Afzelin, kaempferol-3-rhamnoside, Kampferol-3-rhamnosid)은 캠페롤(kaempferol)의 단당배당체로 캠페롤 글리코시드 구조의 화합물이며, 캠페롤과 함께 항산화, 항염 등의 다양한 생리활성을 나타내는 물질로 알려져 있다. 또한, 아프젤린이 항암효능을 나타내고 신장세포 세포막을 보호기능이 알려져 있으며, 심혈관 관련 질환을 개선시키는 것으로 보고되어 있다. 하지만, 아프젤린을 첨가하여 자가면역질환에 관련된 조절 T 세포의 분화를 촉진하고 대량 증식시키는 배양법에 대해서는 보고된 바가 없다.
기존 개발된 자가면역질환의 치료는 주로 인체의 면역체계를 약화시키는 방법을 이용하여 이루어지는데, 이러한 치료는 체내의 모든 면역기능을 저하시키게 되어 결국 다른 질환의 발병을 초래하는 부작용을 나타낸다.
따라서 상기 문제점을 극복하기 위해 조절 T 세포의 증식 및 활성을 증가시켜 Th17 세포 및 수지상세포 등의 자가면역반응을 억제시키는 면역세포치료법의 개발이 필수적이다.
한국 등록특허 제10-1223684호
이에, 본 발명자들은 종래 알려진 조절 T 세포 배양용 배지 조성물 보다 효과가 우수한 배양 조성물을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 세포독성이 거의 나타나지 않은 아프젤린과 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체 및 TGF-β를 소정량 세포 배양용 배지의 첨가제로 사용하는 경우, 조절 T 세포로의 분화를 월등히 촉진하고 대량 증식시킬 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 나아가, 본 발명의 방법으로 증식된 조절 T 세포는 타겟 면역세포의 활성 및 증식을 월등히 효과적으로 억제함을 확인하였다(실험예 참조).
따라서, 본 발명은 조절 T 세포를 효과적으로 증식시킬 수 있는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용한 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 배양방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포를 포함하는 자가면역질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 과제 해결을 위하여, 본 발명은 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 조절 T 세포를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서, 상기 첨가제는 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 말초혈액으로 말초혈액단핵구를 분리하는 단계; 말초혈액단핵구에서 조절 T 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 조절 T 세포를 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 배양용 배지에 넣고 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포를 포함하는 자가면역질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 배양 조성물은 아프젤린(Afzelin)을 포함함으로써, 기존 조절 T 세포 배양법에 비해 면역억제 작용을 하는 면역세포인 조절 T 세포의 분화 및 증식이 월등히 촉진시킬 수 있다. 이에 따라 자가면역질환을 유의하게 치료 가능한 조절 T 세포를 대량으로 획득할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 증식된 조절 T 세포는 타겟 면역세포의 활성 및 증식을 월등히 효과적으로 억제할 수 있다.
나아가 본 발명의 배지 조성물은 그 자체로 자가면역질환 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 종래의 배양방법(비교예 1)과 본 발명에 따른 활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 이용한 배양방법(실시예 1)을 이용하여 증식한 면역세포수를 비교한 그래프이다.
도 2는 유세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 조절 T 세포의 분화 및 활성 변화를 나타내는 그림이다.
도 3은 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포의 싸이토카인 분비를 루미넥스 검사법(Luminex assay)을 이용해 분석한 그림이다.
도 4는 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포의 증식 억제 효능을 [3H] 티민 통합 검사법(3H-Thymidine incorporation)을 이용해 확인한 그림이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 조절 T 세포를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 첨가제는 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함한다.
상기 조절 T 세포는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)라고 불리는 T세포의 아형이 자가면역질환의 억제 및 면역항상성 유지에 필수적인 것으로 알려져 있다. 조절 T 세포의 종류에는 대표적으로 Foxp3 전사인자를 발현하는 Foxp3+ Treg 세포와 Foxp3를 발현하지 않지만 IL-10을 분비하는 Tr1 세포, TGF-β를 분비하는 Th3 세포, 그리고 Qa1-restricted CD8+ Treg 세포 등이 있다. 이들 조절 T 세포들은 흉선에서 T 세포의 생성 및 발달 과정 중에 분화되거나 말초에서 naiT 세포로부터 항원 특이적 반응 과정 중에 분화됨으로써 조절 T 세포의 기능을 획득할 수 있다. 이러한 이유로 전자를 흉선 유래 조절T 세포 혹은 자연발생 조절 T 세포(thymus-derived or naturally-occurring Treg), 후자를 말초 유래 조절 T 세포 혹은 유도된 조절 T 세포(periphery-derived or induced Treg) 라고 한다. 흉선 유래 조절 T 세포로는 thymic Foxp3+ Treg 세포와 CD8+ Treg 세포가 있고, 말초 유래 조절 T 세포로는 peripheral Foxp3+ Treg 세포, Tr1 세포, Th3 세포 등이 있다.
면역조절 T 세포는 자가면역질환을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 치료 또는 이식거부반응의 억제에 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들면 자가면역질환 혹은 염증성 질환은 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 자가면역성 간염, 크론병, 다발성 경화증, 피부경화증, 중증근육무력증, 자가면역성 심근염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염증후군, 다발성 근육염 및 이식거부 반응 등이 있다.
본 발명의 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함한 배양용 배지 조성물은 기존 조절 T 세포 배양액에 비해 조절 T 세포의 분화 및 증식을 월등히 향상시킨다. 또한, 본 발명의 방법으로 증식된 조절 T 세포는 타겟 면역세포의 활성 및 증식을 월등히 효과적으로 억제할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 통상적으로 세포 배양에 사용될 수 있는 세포 배양용 배지와, 첨가제로서 항-CD3 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖; 항-CD28 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖; TGF-β 1 ~ 10000 ng/㎖ 및 아프젤린 1 ~ 50 ㎍/㎖을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게 조절 T 세포 배양단계에서는 항-CD3 단클론항체의 농도 1000 ~ 30000 ng/㎖, 항-CD28 단클론 항체의 농도 1000 ~ 30000 ng/㎖, TGF-β의 농도 5 ~ 2000 ng/㎖, 아프젤린의 농도는 2 ~ 30 ㎍/㎖를 사용한다.
한편, 본 발명에서는 상기 배양 조성물을 이용한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 말초혈액으로 말초혈액단핵구를 분리하는 단계; 말초혈액단핵구에서 조절 T 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 조절 T 세포를 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 배양용 배지에 넣고 배양하는 단계를 포함하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법을 제공한다. 이를 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
(말초혈액단핵구의 분리)
본 발명에서, 말초혈액단핵구는 항암면역치료를 위하여 통상적으로 사용되는 말초혈액(Peripheral Blood)으로부터 분리된 단핵구(Mononuclear Cell)를 의미한다. 말초혈액단핵구는 비중을 이용한 원심분리를 통해 혈액에서 분리할 수 있으며, 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 면역세포의 분화도 및 구성을 확인한다. 또한 본 발명의 일 구현예로서, 상기 말초혈액단핵구는 정상인, 자가면역질환의 위험성을 갖는 환자 또는 자가면역질환 환자로부터 얻은 것일 수 있다. 또한 본 발명에서 사용되는 말초혈액단핵구는 반드시 자가 유래일 필요는 없으며, 동종 유래의 말초혈액단핵구라면 본 발명에 따른 자가면역질환 치료를 위한 조절 T 세포의 유도 및 증식을 위해 사용할 수 있다.
(조절 T 세포의 분리)
말초혈액단핵구로부터 조절 T 세포의 분리는 MACs 비드(MACs bead)를 이용해서 분리한다. 구체적으로, 먼저 anti-human CD4 biotin cocktail (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 후, 다시 anti-human CD4 biotin Microbead (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 후 세척액 (1% BSA 및 2 mM EDTA가 포함된 PBS 용액, pH 7.4)으로 세척하고 컬럼 (Milteny biotec)을 통과시켜 음성 분획으로 CD4+ T 세포를 분리한다. 분리된 CD4+ T 세포를 또 한번 세척액으로 세척한 후, anti-human CD25 microbead (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 뒤 세척액으로 세척하고 컬럼(Column)을 통과시켜 양성 분획으로 CD4+CD25+ T 세포와 음성 분획으로 CD4+CD25- T 세포를 얻은 후 각각의 세포를 PBS로 세척하고 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640 (Gibco)세포 배양액에 재부유시켜 사용할 수 있다.
(배양단계)
조절 T 세포의 분화 및 증식을 유도하는 조건 하에서 배양이 이루어지는 것으로, 상기 말초혈액단핵구로부터 분리된 조절 T 세포를 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 배양용 배지에서 배양한다.
이때 상기 세포 배양용 배지에는 항-CD3 단클론항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, 항-CD28 단클론 항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, TGF-β의 농도 1 ~ 10000 ng/㎖, 아프젤린의 농도는 1 ~ 50 ㎍/㎖ 범위 내에서 사용될 수 있다. 바람직하게 조절 T 세포 배양단계에서는 항-CD3 단클론항체의 농도 1000 ~ 30000 ng/㎖, 항-CD28 단클론 항체의 농도 1000 ~ 30000 ng/㎖, TGF-β의 농도 5 ~ 2000 ng/㎖, 아프젤린의 농도는 2 ~ 30 ㎍/㎖를 사용한다.
아울러, 배양 조건은 특별하게 한정되지 않고, 통상의 세포배양에 있어서 사용하는 조건을 사용할 수 있다. 일 구현예로서, 30 ~ 80℃의 온도와 5 ~ 10%의 CO2농도의 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 30 ~ 38℃의 온도와 5 ~ 10%의 CO2농도의 조건이다. 배양기간은 조절 T 세포가 충분히 분화 및 증식하기 위해서 7 ~ 14일 이상으로 할 수 있다. 또한 배양 중 적절히 배양액 교환을 실시할 수도 있다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1. 조절 T 세포 배양법을 이용한 조절 T 세포의 증식(대조군)
먼저, 정상인의 말초 혈액 30㎖을 채취하고, 원심분리를 통해 혈액에서 말초혈액단핵구 분리하고 이를 실험군으로 선정하였다(말초혈액단핵구 분리). 이렇게 분리된 말초혈액 단핵구를 항-CD3 단클론항체 100 ng/㎖, 항-CD28 단클론 항체 100 ng/㎖ 및 TGF-β 10 ng/㎖ 를 포함하는 배지 50 ㎖에 넣어 2주간 배양하여, 림프구 세포를 증식하여 활성화시켰다.
실시예 1. 본 발명의 배양법에 따른 조절 T 세포의 증식 및 확인
먼저, 정상인의 말초 혈액 30㎖을 채취하고, 원심분리를 통해 혈액에서 말초혈액단핵구 분리하고 이를 실험군으로 선정하였다(말초혈액단핵구 분리).
말초혈액단핵구로부터 조절 T 세포의 분리는 MACs bead를 이용해서 분리하였다. 먼저 anti-human CD4 biotin cocktail (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 후 anti-human CD4 biotin Microbead (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 후 세척액 (1% BSA 및 2 mM EDTA가 포함된 PBS 용액, pH 7.4)으로 세척하고 Column (Milteny biotec)을 통과시켜 음성 분획으로 CD4+ T 세포를 분리하였다. 분리된 CD4+ T 세포를 또 한번 세척액으로 세척한 후, anti-human CD25 microbead (Milteny biotec)와 4℃, 15분간 반응시킨 뒤 세척액으로 세척하고 Column 을 통과시켜 양성 분획으로 CD4+CD25+ T 세포와 음성 분획으로 CD4+CD25- T 세포를 얻은 후 각각의 세포를 PBS로 세척하고 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640 (Gibco)세포 배양액에 재부유시켜 실험에 사용하였다(조절 T 세포의 분리).
상기 말초혈액단핵구로부터 분리된 조절 T 세포를 항-CD3 단클론항체 100 ng/㎖, 항-CD28 단클론 항체의 100 ng/㎖, TGF-β 10 ng/㎖ 및 아프젤린 10 ㎍/㎖를 처리하여 75㎠ 플라스크 중에서 37℃, 5% CO2조건에서 세포배양기를 이용해 14일간 배양했다(배양).
위와 같은 배양 과정을 거쳐서 얻은 비교예 1과 실시예 1에서의 세포에 대해서, 조절 T 세포의 수를 비교하여 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 배양 전에는 세포수가 3.0x105~3.12x105개였으나, 종래의 조절 T 세포 배양법에 의한 경우(비교예 1) 2.1x108개 ~ 2.6x108개 이상이 였으며, 본 발명에 따른 배양법(실시예 1)에 의해 3.3x108개 ~ 3.7x108개 이상으로 증식되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포가 기존 조절 T 세포 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포에 비해 세포수가 약 30% 이상 증가되었음을 확인하였다.
실험예1 . 조절 T 세포의 분화 및 활성 확인
비교예 1 및 실시예 1에서 배양된 조절 T 세포를 유세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 각 면역세포의 표면 항원을 분석하여, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
구체적으로, 도 2의 결과를 살펴보면, 기존 조절 T 세포 배양법인 비교예 1의 경우 (a)CD25+/Foxp3+ 세포의 비율이 51.5%, (b)Foxp3+/CTLA-4+ 세포의 비율이 51.5% 및 (c)Foxp3+/PD-1+ 세포의 비율이 각각 51.5%, 59.1% 및 57.3%인데 반해, 본 발명에 따른 배양법인 실시예 1의 경우 (a)70.1%, (b)72.2% 및 (c)68.7%로 나타났다.
이는 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포가 기존 조절 T 세포 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포에 비해 분화 및 활성이 증가된 것임을 알 수 있다.
실험예2 : 조절 T 세포의 면역 억제 효능 확인
비교예 1 및 실시예 1에서 제조된 조절 T 세포 함유 조성물을, 15㎖ 원심관에 넣고, 원심분리(1400rpm, 5분)를 실시하고, 상층액을 제거하여 세포를 분리하였다. 분리된 조절 T 세포를 이용하여, 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포(responder cell)에 대한 면역 활성 억제 효능을 루미넥스 검사법(Luminex assay)을 이용한 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포의 싸이토카인 분비 분석을 통해 확인하였고, 또한 [3H] 티민 통합 검사법(3H-thymidine incorporation assay)을 이용한 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포의 증식 억제 효능을 확인하여, 그 결과를 도 3과 도 4에에 나타냈다.
도 3과 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포 (실시예 1)가 기존 조절 T 세포 배양법에 의해 제조된 조절 T 세포 (비교예 1)에 비해 조절 T 세포의 타겟이 되는 면역 세포의 활성(도 3) 및 증식(도 4) 억제 효능이 높게 나타나는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 배양 조성물은 아프젤린(Afzelin)을 포함함으로써, 기존 조절 T 세포 배양법에 비해 면역억제 작용을 하는 면역세포인 조절 T 세포의 분화 및 증식이 월등히 촉진시키며, 자가면역질환을 유의하게 치료 가능한 조절 T 세포를 대량으로 획득할 수 있다.

Claims (6)

  1. 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 조절 T 세포를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서,
    상기 첨가제는 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지는
    항-CD3 단클론항체 10 ~　100000 ng/㎖;
    항-CD28 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖;
    TGF-β 1 ~ 10000 ng/㎖; 및
    아프젤린 1 ~ 50 ㎍/㎖;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양용 배지 조성물.
  3. 말초혈액으로부터 말초혈액단핵구를 분리하는 단계;
    말초혈액단핵구로부터 조절 T 세포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 조절 T 세포를 항-CD3 단클론항체, 항-CD28 단클론항체, TGF-β 및 아프젤린을 포함하는 배양용 배지에 넣고 배양하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 배양용 배지는
    항-CD3 단클론항체 10 ~　100000 ng/㎖;
    항-CD28 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖;
    TGF-β 1 ~ 10000 ng/㎖; 및
    아프젤린 1 ~ 50 ㎍/㎖;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 30 ~ 80℃ 온도 및 5 ~ 10% CO2조건 하에서 7 ~ 14일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 조절 T 세포 배양방법.
  6. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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