CN103852407A - 通过检测hla-dr表达量评估cd14阳性细胞抗原呈递能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及临床检测领域，旨在提供一种通过检测HLA-DR表达量评估CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法。该方法包括：从感染甲型H7N9的患者外周静脉血中筛选出CD14和HLA-DR这一组特征性细胞表面分子标记；通过流式细胞术检测CD14和HLA-DR在外周血中的表达量；当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例为63.16%～95.32%时，表示CD14阳性细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例低于63.16%时，表示CD14阳性细胞呈递能力弱。本发明通过检测感染甲型H7N9患者的外周静内的CD14和HLA-DR的表达量来指示患者血液CD14阳性细胞的抗原提呈能力，能够更精准地提示患者感染的严重程度，为后期的诊治工作提供数据支持。

Description

通过检测HLA-DR表达量评估CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法

技术领域

本发明涉及临床检测领域，具体为通过检测外周血液内CD14阳性细胞表面的HLA-DR表达量来评估CD14阳性细胞抗原呈递能力。

背景技术

CD14是一种主要存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原，是外周血单个核细胞重要的表面分子标记。人类编码CD14的基因位于人5号常染色体的长臂端5q23-q31，约含有1338个核苷酸残基。从核苷酸的第76位到1200位，编码一段有375个氨基酸残基的多肽链。根据结构和性质，CD14糖蛋白可分为两类：膜表面的CD14(mCD14)与可溶性的CD14（sCD14）。mCD14分子量为55kDa，其蛋白质部分由包括356个氨基酸残基组成的多肽链和一个由19个氨基酸残基组成的末端多肽链构成，其末端强疏水性多肽链通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固于细胞膜。sCD14蛋白质结构与mCD14基本相同，但sCD14不含有PI结构，故分子量较mCD14小，约为48kDa。在体外单核细胞培养中，糖皮质激素能够抑制单核细胞表达和释放CD14；。在体内，急性炎症患者接受糖皮质激素治疗时，血清sCD14浓度和外周血单核细胞表面mCD14的表达都被显著抑制。临床上给予病人类固醇激素治疗时，因其抑制mCD14的表达和sCD14的释放，可能会增加感染的危险性。CD14生物学功能主要是识别、结合外来抗原分子（特别是细菌抗原），介导单核细胞活化，在炎症、内毒素血症等病理反应中起重要作用。已应用于临床检测内毒素血症、内毒素休克等。

HLA-DR是MHC-II类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基（α亚基和β亚基），该分子主要表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化NK淋巴细胞和人祖细胞上。HLA-DR用于外周血B淋巴细胞及单核细胞的计数；鉴定淋巴瘤及白血病；活化T淋巴细胞上HLA-DR抗原的表达及外周血、淋巴组织中树突状细胞亚群的研究。

据世界卫生组织数据显示，从2013年4月1日我国卫生和计划生育委员会向世界卫生组织首次通报发生了三起人感染甲型H7N9禽流感到2014年2月7日截止，我国一共发生298起人感染H7N9禽流感病例，其中死亡57例。

甲型H7N9禽流感病毒由H7的HA基因和N9的NA基因以及甲型H9N2病毒的6个内部基因片段组成的重配病毒。到目前为止，所有来自人、禽和环境中的H7N9病毒具有较高的同源性，对金刚烷类抗病毒药物耐药，部分患者病毒体外研究表明，病毒对奥司他韦和扎那米韦敏感，且多数来自患者的病毒的相关突变（PB2基因的E627K）使其更加适应对于哺乳动物的感染。感染患者的最常见的首发症状和体征为流感伴随的典型表现但不包括鼻塞和流涕，对于临床和实验室确诊的患者，目前采取神经氨酸酶抑制剂和支持治疗以外，没有有效可靠的治疗方法。在实验室确证H7N9患者的过程中，患者外周血中白细胞和淋巴细胞均减少，免疫功能受到影响。此外，在脓毒血症等重度感染患者的外周血中HLA-DR随感染严重程度急剧下降。在感染和病原体清除过程中，抗原提呈是免疫应答激活的中心环节。抗原呈递过程包括吞噬、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给效应细胞。因此，找到与患者重度感染时抗原提呈能力相关的中心点，将会为临床治疗重度感染提供帮助。

现有技术中，对CD14阳性细胞抗原呈递能力的检测主要是通过普通流式细胞术实现的，多用于脓毒血症等细菌引起的感染性疾病。但该方法尚未得到确切的量化，在病毒感染的疾病中的应用也尚未明确提出，检测方法的准确性尚待进一步加强。因此，寻找一套替代方案是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种通过检测HLA-DR表达量评估CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法。

为解决技术问题，本发明提供以下技术方案：

提供一种通过检测HLA-DR表达量评估CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法，包括以下步骤：

（1）从感染甲型H7N9的患者外周血中筛选出CD14和HLA-DR这一组特征性细胞表面分子标记；

（2）通过流式细胞术检测CD14和HLA-DR在外周血中的表达量；

（3）当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例为63.16%～95.32%（是指平均值79.24%的95%可信区间）时，表示CD14阳性细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例低于63.16%时，表示CD14阳性细胞呈递能力弱。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明通过检测感染甲型H7N9患者的外周静内的CD14和HLA-DR的表达量来指示患者血液CD14阳性细胞的抗原提呈能力，能够更精准地提示患者感染的严重程度，为后期的诊治工作提供数据支持。

附图说明

图1为流式细胞术检测患者外周血中，CD14阳性细胞中HLA-DR的表达水平图。

图2为吞噬细菌后外周血分离的单个核细胞中CD14阳性细胞的HLA-DR的表达水平图。

具体实施方式

下面结合具体实施进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

统计学方法：采用SPSS19.0统计分析软件分析，各样本均数的比较采用Student ttest分析。

全血样本采集管，流式上样管和人红细胞裂解液均购自BD公司，anti-CD14-PE抗体和anti-HLA-DR-FITC抗体，细菌培养的LB培养基粉末购自生工生化，人淋巴细胞分离液、多聚甲醛购自上海盛兆生物科技有限公司，DAPI染料购自碧云天生物；细菌培养箱购自上海福玛，抗体孵育冰箱购于青岛海尔公司，离心机购自Thermo公司，流式细胞仪购自Beckman coulter公司。有关血样均由供血机构采集并提供，本发明不涉及采血行为本身。

本发明中，通过检测HLA-DR表达量评估外周血CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法，包括以下步骤：

（1）从感染甲型H7N9的患者外周血中筛选出CD14和HLA-DR这一组特征性细胞表面分子标记；

该步骤的具体实施过程如下：

A、H7N9患者血的收集：

收集重症H7N9患者的外周血全血样本至少10例、轻症H7N9患者的外周血全血样本至少10例；（患者已通过年龄，体温等指标及根据临床表现评估的APACHEⅡ和PMEWS评分明确诊断患有重症或轻症H7N9病毒感染）；另外收集国际健康保健中心健康体检对照者全血。

B、检测指标的抗体染色：

将H7N9患者的外周血全血样本50微升加入流式管，随后加入流式抗体anti-CD14-PE，10微升，anti-HLA-DR-FITC，10微升，待血液和抗体充分混匀后置于4度环境静置孵育30分钟。

（2）通过流式细胞术检测CD14和HLA-DR在外周血中的表达量；

A、白细胞悬液的制备：

将已经孵育制备的样本取出，加入人红细胞裂解液（HLA）1毫升，充分混匀并不间断轻微震荡至液体澄清，加入PBS约3毫升，终止裂解反应。离心1200rpm，5分钟后，弃掉上清液体，打散底部细胞，再加入500微升制备成白细胞悬液。

B、流式检测外周相应指标：将制备好的白细胞悬液样本置于流式细胞仪上样架，选择FL1和FL2通道上机检测HLA-DR和CD14指标的表达量。

（3）当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例为63.16%～95.32%（是指平均值79.24%的95%可信区间）时，表示CD14阳性细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例低于63.16%时，表示CD14阳性细胞呈递能力弱。并且，该比例数据与患者的感染严重程度呈负相关。

该步骤中，据以判断的数据来源是：丛2013年4月到2014年2月共收集健康人、感染科病人（包括除患有甲型H7N9禽流感的病人）共148例，两组群体年龄呈正态分布，比较，两组间特异性指标后归纳总结得出具有正常呈递能力CD14阳性细胞的HLA-DR表达量：平均79.24%（95%可信区间：63.16%～95.32%），低于范围最低值的视为呈递能力弱。

应用实施例1：

一、H7N9患者血的收集：收集浙江大学医学院附属第一医院感染科就诊的重症H7N9患者10例、轻症H7N9患者10例的全血样本（患者已通过年龄，体温等指标及根据临床表现评估的APACHEⅡ和PMEWS评分明确诊断患有重症或轻症H7N9病毒感染）；另外收集国际健康保健中心健康体检对照者全血。

二、检测指标的抗体染色：抽取的外周血50微升加入流式管，随后加入流式抗体anti-CD14-PE，10微升，anti-HLA-DR-FITC，10微升，待血液和抗体充分混匀后置于4度环境静置孵育30分钟。

三、白细胞悬液的制备：将已经孵育制备的样本取出，加入人红细胞裂解液（HLA）1毫升，充分混匀并不间断轻微震荡至液体澄清，加入PBS约3毫升，终止裂解反应。离心1200rpm，5分钟后，弃掉上清液体，打散底部细胞，再加入500微升制备成白细胞悬液。

四、流式检测外周相应指标：将制备好的白细胞悬液样本置于流式细胞仪上样架，选择FL1和FL2通道上机检测CD14和HLA-DR指标的表达量。

经检测，感染甲型H7N9病毒的重症病人的CD14阳性细胞中HLA-DR表达量在12.99%～36.15%之间，其数据显著低于感染甲型H7N9病毒的轻症患者的36.48%～50.55%这一数据（结果如图1所示）。

应用实例2：

利用检测HLA-DR表达量评估外周血单个核细胞吞噬细菌后其中CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法，包括以下步骤：

（1）H7N9患者血的收集；

该步骤与具体实施例1的内容相同。

（2）从感染甲型H7N9的患者外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；

将收集到的全血样本，置于离心机中3000rpm离心5分钟。吸出血浆后，将剩余血细胞液加入到已放入等体积PBS的15毫升离心管中充分混匀。将混匀后的液体沿离心管壁缓慢加入到已放入与PBS等体积的人淋巴细胞分离液，注意不要与淋巴细胞分离液混合。上述操作完成后，将离心管置入离心机2000rpm离心20分钟，取出后，吸取中间“白毛”层到已放入PBS的离心管中，洗去多余杂质。

（3）通过流式细胞检测HLA-DR的表达量；

该步骤具体包括：

A、细菌悬液的制备和细菌核的染色：将大肠杆菌菌株接种至LB培养板，于37摄氏度孵箱培养24小时后收集细菌，洗去杂质和死菌，弃去上清液体，加入配置好的4%多聚甲醛固定20min，洗去固定液后配置成109/ml细菌悬液，每毫升细菌悬液中加3微升DAPI染色液染色10min，随后待PBS洗净染色液后，制备成浓度为109/ml的细胞悬液。

B、单核细胞对细菌抗原的吞噬作用：将上述分离的PBMC以106/ml的浓度与细菌以1：10的比例按需加入培养板中，共分成两孔，置于37摄氏度培养3小时。

C、单核细胞吞噬细菌后的抗原呈递能力的流式检测：将前一步骤中培养的PBMC和细菌混合液取出，PBS洗去多余杂质，加入流式抗体anti-CD14-PE，10微升，anti-HLA-DR-FITC，10微升，待血液和抗体充分混匀后置于4度环境静置孵育30分钟。洗去抗体后，定容成500微升加入流式管置于流式细胞仪上样架，选择相应通道上机检测CD14、HLA-DR和大肠杆菌指标的表达量。

经检测，感染甲型H7N9病毒的重症病人的单个核细胞吞噬细菌后，CD14阳性细胞中HLA-DR表达量均为17%，其数据显著低于感染甲型H7N9病毒的轻症患者的84.2%均值这一数据（结果如图2所示）。

基于上述检验及数据比对，医生可以对病人抗原呈递能力进行分析。基于该分析结论，可以对病人感染严重程度加以判断，为后续采取相应减轻病人感染的措施提供量化依据。

Claims (3)

1.通过检测HLA-DR表达量评估CD14阳性细胞抗原呈递能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从感染甲型H7N9的患者外周静脉血中筛选出CD14和HLA-DR这一组特征性细胞表面分子标记；

（2）通过流式细胞术检测CD14和HLA-DR在外周血中的表达量；

（3）当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例为63.16%～95.32%时，表示CD14阳性细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占CD14阳性细胞的比例低于63.16%时，表示CD14阳性细胞呈递能力弱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体实施过程如下：

A、H7N9患者血的收集：

收集重症H7N9患者的外周静脉血全血样本至少10例、轻症H7N9患者的外周静脉血全血样本至少10例；患者已通过年龄、体温指标及根据临床表现评估的APACHEⅡ和PMEWS评分明确诊断患有重症或轻症H7N9病毒感染；另外收集健康体检对照者全血；

B、检测指标的抗体染色：

将H7N9患者的外周静脉血全血样本50微升加入流式管，随后加入流式抗体anti-CD14-PE10微升和anti-HLA-DR-FITC10微升；待血液和抗体充分混匀后置于4度环境静置孵育30分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体实施过程如下：

A、白细胞悬液的制备：

将已经孵育制备的样本取出，加入人红细胞裂解液HLA1毫升，充分混匀并不间断轻微震荡至液体澄清，加入PBS约3毫升，终止裂解反应；离心1200rpm，5分钟后，弃掉上清液体，打散底部细胞，再加入500微升制备成白细胞悬液；

B、流式检测外周相应指标：

将制备好的白细胞悬液样本置于流式细胞仪上样架，选择FL1和FL2通道上机检测CD14和HLA-DR指标的表达量。

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