WO2019004415A1 - 末梢血t細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果予測方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンパニオン診断を提供することを課題とする。 悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にin vitroで接触させる工程1、前記工程1で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程2、及び前記工程2において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程3、を含む方法により、腫瘍免疫療法の効果を予測する。
Description
本発明は、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果の予測方法、予測装置及び予測用コンピュータプログラムに関する。
腫瘍免疫療法は、腫瘍患者自身の腫瘍細胞に対する免疫応答を利用した腫瘍の治療方法である。腫瘍免疫療法の一例では、T細胞上の蛋白質に結合する抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体等を使って、腫瘍患者自身の細胞傷害性T細胞を活性化し、その機能によりがん細胞を殺傷する(非特許文献1及び非特許文献2)。
また、腫瘍組織内に存在する細胞傷害性T細胞が腫瘍細胞に対して効率よく細胞傷害活性を示すことができるよう、細胞障害性T細胞を腫瘍細胞に特異的にエンゲージさせる方法も開発されている。そのエンゲージャーとして、現在、腫瘍細胞の細胞表面マーカとT細胞の表面マーカとを1分子で特異的に認識する二重特異性分子が使用されている(非特許文献2及び3)。
PD1/PD-L1 Combination Therapies, 2015, Evaluate Ltd.
ONCOIMMUNOLOGY, 2016, VOL. 5, NO. 2, e1062969
Cancer Research, 2013, 73(15) August 1, p4663-4673
一方で、例えば、非小細胞肺癌で保険適用となっている腫瘍免疫療法治療薬ペムブロリズマブ(商品名キイトルーダ)は、奏効率19%であり、多くの患者には無効であるのが現状である。このため、当該腫瘍免疫療法治療薬が有効な患者群を選別するためコンパニオン診断が行われている。現在、ペンブロリズマブにおいては、生検検体を用いたPD-L1染色がコンパニオン診断薬として用いられているが、PD-L1染色で50%以上陽性の患者群でも奏効率は45%である。このことから、PD-L1染色より優れたコンパニオン診断の開発が切望されている。
上記のような奏効率の問題や腫瘍免疫療法の効果予測の困難性は、多くのがん免疫療法に共通の課題である。このような腫瘍免疫療法の現状から、本発明は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンパニオン診断を提供することを課題とする。
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、in vitroで末梢血中の単核細胞を使用して腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を簡便に予測できることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項1.工程1:悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にin vitroで接触させる工程、
工程2:前記工程1で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程、及び
工程3:前記工程2において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程、
を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法。
項2.前記工程1が、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーを介して間接的にin vitroで接触させる工程である、項1に記載の方法。
項3.腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得する工程、及び
前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定する工程、
を含む、項1又は2に記載の方法。
項4.前記エンゲージャーが、二重特異性分子である、項2又は3に記載の方法。
項5.前記二重特異性分子が、T細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子である、項4に記載の方法。
項6.前記腫瘍細胞が、悪性腫瘍由来の培養細胞株である、項1~5のいずれか一項に記載の方法。
項7.項2~6のいずれか一項に記載の方法を実施するための、エンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬。
項8.項7に記載の検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査キット。
項9.悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得するステップと、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップ、及び前記ステップにおいて前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定するステップ、
をコンピュータに実行させるための、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム。
項10.項9に記載のコンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体。
項11.少なくとも処理部を備え、
前記処理部は、
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、
前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び
前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する、
腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置。
項1.工程1:悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にin vitroで接触させる工程、
工程2:前記工程1で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程、及び
工程3:前記工程2において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程、
を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法。
項2.前記工程1が、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーを介して間接的にin vitroで接触させる工程である、項1に記載の方法。
項3.腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得する工程、及び
前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定する工程、
を含む、項1又は2に記載の方法。
項4.前記エンゲージャーが、二重特異性分子である、項2又は3に記載の方法。
項5.前記二重特異性分子が、T細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子である、項4に記載の方法。
項6.前記腫瘍細胞が、悪性腫瘍由来の培養細胞株である、項1~5のいずれか一項に記載の方法。
項7.項2~6のいずれか一項に記載の方法を実施するための、エンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬。
項8.項7に記載の検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査キット。
項9.悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得するステップと、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップ、及び前記ステップにおいて前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定するステップ、
をコンピュータに実行させるための、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム。
項10.項9に記載のコンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体。
項11.少なくとも処理部を備え、
前記処理部は、
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、
前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び
前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する、
腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置。
本発明によれば、in vitroで末梢血中の単核細胞(PBMC)を使用して腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を簡便に予測できる
1.腫瘍免疫療法の効果を予測する方法
本発明の第1の実施形態は、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法に関する。
はじめに、図1を用いて、本実施態様の概要を説明する。
本実施態様は、図1に示すように、in vitroにおいて、悪性腫瘍の治療対象患者より採取された末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells:PBMC)と、腫瘍細胞とを、直接又はエンゲージャー等を介して間接的に接触させて培養した後に、前記PBMCによって腫瘍細胞がどのくらい傷害されたか(腫瘍細胞傷害活性)を測定することにより、前記測定値から前記腫瘍患者における腫瘍免疫療法の効果を予測するものである。図1は、エンゲージャーを介してPBMCに含まれるT細胞と、予めシャーレに播種されて培養された腫瘍細胞とを接触させる例を示す。
本発明の第1の実施形態は、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法に関する。
はじめに、図1を用いて、本実施態様の概要を説明する。
本実施態様は、図1に示すように、in vitroにおいて、悪性腫瘍の治療対象患者より採取された末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells:PBMC)と、腫瘍細胞とを、直接又はエンゲージャー等を介して間接的に接触させて培養した後に、前記PBMCによって腫瘍細胞がどのくらい傷害されたか(腫瘍細胞傷害活性)を測定することにより、前記測定値から前記腫瘍患者における腫瘍免疫療法の効果を予測するものである。図1は、エンゲージャーを介してPBMCに含まれるT細胞と、予めシャーレに播種されて培養された腫瘍細胞とを接触させる例を示す。
より具体的には、本実施態様は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取されたPBMCと、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にin vitroで接触させる工程(工程1)と、前記工程1でPBMCと接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程(工程2)と、前記工程2において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程(工程3)と、を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法に関する。
本発明において、腫瘍免疫療法は、T細胞の腫瘍細胞に対する傷害活性を高めることにより腫瘍を治療する方法である限り制限されない。本発明における腫瘍免疫療法には、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CCR4抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体等の免疫チェックポイント阻害療法、キメラ抗原受容体-T細胞等を投与する養子免疫療法、インターロイキン2等のサイトカイン療法、腫瘍抗原由来の蛋白質又はペプチド(例えばWT-1、NY-ESO-1)等を投与する腫瘍ワクチン療法、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(登録商標)ともいう)、若しくは二重特性抗体療法等が含まれる。
本発明において、腫瘍には悪性腫瘍及び良性腫瘍が含まれるが、好ましくは悪性腫瘍である。また、腫瘍には、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍が含まれるが、好ましくは上皮性腫瘍である。本発明において、腫瘍として最も好ましくは、上皮性悪性腫瘍である。
悪性腫瘍としては、例えば、気管、気管支又は肺等から発生する呼吸器系悪性腫瘍;上咽頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、S状結腸、直腸又は肛門部等から発生する消化管系悪性腫瘍;肝臓癌;膵臓癌;膀胱、尿管又は腎臓から発生する泌尿器系悪性腫瘍;卵巣、卵管及び子宮等のから発生する女性生殖器系悪性腫瘍;乳癌:前立腺癌;皮膚癌;視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎等の内分泌系悪性腫瘍;中枢神経系悪性腫瘍;骨軟部組織から発生する悪性腫瘍等の固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性単球性白血病、急性全骨髄性白血病、急性巨核球性白血病、赤白血病、好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性好中球性白血病、成人T細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の造血系悪性腫瘍;リンパ系悪性腫瘍等の造血器腫瘍が挙げられる。より好ましくは、肺癌(扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、腺癌)等の呼吸器系上皮性悪性腫瘍;胃癌、十二指腸癌、大腸癌(S上結腸癌、直腸癌等)等の消化管系上皮性悪性腫瘍;肝臓癌;膵臓癌;膀胱癌;甲状腺癌;卵巣癌;乳癌:前立腺癌;を挙げることができる。最も好ましくは、肺癌である。
本発明において「悪性腫瘍の治療対象患者」は、腫瘍免疫療法が適用されうる者である限り制限されない。例えば、患者としては、上記に記載のいずれかの腫瘍を有し、かつ未治療である患者、又は既に何らかの腫瘍治療を受けた患者、腫瘍の治療中の患者、腫瘍が再発又は転移している患者を挙げることができる。前記、腫瘍の治療には、好ましくは、外科的腫瘍切除、化学療法(より好ましくは、腫瘍免疫療法以外の抗腫瘍剤投与による化学療法)、放射療法等を含む。
本発明において末梢血は、T細胞を含む単核細胞を取得できる限り制限されない。末梢血は、動脈血であっても静脈血であってもよいが、好ましくは静脈血である。末梢血の採血は、例えば四肢の血管から行うことができる。また、手術や生検の際に、四肢以外の血管から採血しても良い。
末梢血の採血方法は、単核細胞を取得できる限り制限されないが、抗凝固剤を使用して採血することが好ましい。抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、ヘパリン塩等を挙げることができる。好ましくはヘパリンである。
PBMCは、公知の方法に従って取得することができる。例えば、ヒトリンパ球分離用の比重液(1.077±0.001g/ml程度の密度を有する)を使って遠心分離により取得することができる。また、溶血剤を使って末梢血中の赤血球を溶血させ、得られる有核細胞をPBMCとして使用してもよい。あるいは、セルソータ、磁気細胞分離法を使って所望の細胞を取得してもよい。前記所望の細胞としては、例えば、T細胞、好ましくはCD3陽性T細胞又はCD8陽性T細胞を挙げることができる。
PBMCと接触する腫瘍細胞は、上記腫瘍に由来する細胞である限り制限されない。腫瘍細胞として好ましくは、培養細胞株を挙げることができる。培養細胞株としては特に制限されないが、例えば、U251細胞株、RERF細胞株、A549細胞株等の悪性腫瘍由来の培養細胞株を挙げることができる。前記腫瘍細胞は、患者が有する悪性腫瘍と同種の細胞である必要はないが、同種の細胞であってもよい。好ましくは、PBMCと同じ培養条件で発育できる細胞であることが好ましい。
in vitroにおけるPBMCと、腫瘍細胞との接触方法は、PBMCと腫瘍細胞が直接、又は間接的に接触する限り制限されない。
in vitroにおけるPBMCと、腫瘍細胞との接触方法は、PBMCと腫瘍細胞が直接、又は間接的に接触する限り制限されない。
in vitroにおいて、PBMCと腫瘍細胞とを接触させる際には、腫瘍細胞を予めin vitroでプレート、又はカルチャーボトルに播種しておくことが好ましい。腫瘍細胞が接着性の細胞である場合には、前記腫瘍細胞が、in vitroで生存可能な状態で、シャーレ、又はカルチャーボトルに接着している状態であることがより好ましい。さらには、前記腫瘍細胞が接着性の細胞である場合には、前記腫瘍細胞が発育可能な条件下(例えば、35℃~37℃、5%程度の炭酸ガス存在下)で12時間~48時間程度培養された状態であることが好ましい。前記腫瘍細胞を培養する培養培地は、腫瘍細胞が生存できる、又は発育できる培地である限り制限されない。例えば、ウシ胎児血清を8%~20%程度含む、RPMI1640培地(改変培地含む)、α-MEM培地(改変培地含む)、ダルベッコMEM培地(改変培地含む)等を挙げることができる。
PBMCと腫瘍細胞を接触させる際の細胞数は、例えば96ウェルプレート1ウェルに対して、1×103~1×105個程度、好ましくは5×103~5×104個程度の腫瘍細胞に対して、PBMCが1×103~1×105個程度、好ましくは5×103~5×104個程度となるように接触させることが好ましい。
PBMCと腫瘍細胞を直接接触させる方法としては、腫瘍細胞が播種されたプレート、又はカルチャーボトルに、PBMCを播種する方法を挙げることができる。好ましくは、播種したPBMCが浮遊している場合には、1,000から2,000 r.p.m.程度で5から10分程度遠心することができる。
PBMCと腫瘍細胞を間接的に接触させる方法としては、エンゲージャーを介して接触させる方法を挙げることができる。本実施態様においてエンゲージャーとは、PBMCを、好ましくはリンパ球を、より好ましくはT細胞を、さらに好ましくはCD8陽性T細胞(細胞障害性T細胞)を腫瘍細胞にエンゲージできる分子である限り制限されない。エンゲージとは、少なくとも細胞同士(例えば、T細胞と腫瘍細胞)を架橋することをいい、好ましくは、細胞障害性T細胞が架橋した腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことができる状態をいう。
エンゲージャーとして、好ましくは二重特異性分子、三重特異性分子等を挙げることができる。エンゲージャーとしてより好ましくは二重特異性分子である。二重特性分子及び三重特異性分子は、T細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子であることが好ましい。前記抗原結合領域は、標的とする抗原と結合する限り制限されない。前記抗原結合領域は、例えば、前記抗原に結合する免疫グロブリンの相補鎖決定領域1(CDR1)、相補鎖決定領域2(CDR2)及び相補鎖決定領域3(CDR3)よりなる群からなる少なくとも一つのCDRを含む。前記抗原結合領域は、好ましくは、CDR1、CDR2及びCDR3よりなる群からなる少なくとも二つのCDRを含み、より好ましくは、CDR1、CDR2及びCDR3を含む。前記CDRは、免疫グロブリンの重鎖由来であっても、免疫グロブリンの軽鎖由来であってもよい。さらに好ましくは、前記抗原結合領域において、各CDRは、それぞれに対応するフレームワーク領域に隣接していてもよい。また、前記抗原結合領域は、免疫グロブリンの可変領域(V領域)、sc-Fv、免疫グロブリンのFab領域等であってもよい。
表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、1つの抗原に対して、1つであっても2以上であってもよい。例えば、表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、同種のFab領域の組み合わせ、同種の可変領域の組み合わせ、同種のsc-Fvの組み合わせ、1種の抗体に由来する重鎖Fab領域と軽鎖Fab領域の組み合わせ1種の抗体に由来する重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ、1種の抗体に由来する重鎖sc-Fvの組み合わせであってもよい。
T細胞の表面抗原は、T細胞の表面に存在し、二重特異性分子又は三重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。T細胞の表面抗原として、好ましくは細胞障害性T細胞の表面抗原を挙げることができる。例えば、T細胞の表面抗原は、CD3、CD8、TCR、CTLA-4、PD1、Tim3、CD27、CD28、CD40、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)を挙げることができる。好ましくはCD3である。
腫瘍細胞の表面抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し、二重特異性分子又は三重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。腫瘍細胞の表面抗原としては、EphA1(ephrin type-A receptor 1)、EphA2、FolR1(folate receptor 1)、EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、CD19、Her1 (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 1: ErbB1)、Her2、CD20、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)、CCR4(C-C chemokine receptor type 4)、CEA(Carcinoembryonic antigen)、GD2、GD3,CD22、CD30、CD33、CD70、CD123、EGFRvIII、MUC1(Mucin1)、PSCA(Prostate stem cell antigen)、PSMA(Prostate-specific membrane antigen)、HLA-A1+NY-ESO1(HLA-A1 restricted NY-ESO1)、HLA-A2+NY-ESO1(HLA-A2 restricted NY-ESO1)、HLA-A3+NY-ESO1(HLA-A3 restricted NY-ESO1)等を挙げることができる。
二重特異性分子には、二重特異性T細胞エンゲージャー、二重特性抗体等が含まれる。二重特異性T細胞エンゲージャーとしては、CD19とCD3を標的とするエンゲージャー、EphA2とCD3を標的とするエンゲージャーを挙げることができる。また二重特異性抗体としては、EpCAMとCD3を標的とする抗体を挙げることができる。
PBMCと腫瘍細胞を接触させる際の細胞数は、例えば96ウェルプレート1ウェルに対して、1×103~1×105個程度、好ましくは5×103~5×104個程度の腫瘍細胞に対して、PBMCが1×103~1×105個程度、好ましくは5×103~5×104個程度となるように接触させることが好ましい。二重特異性分子を添加する場合には、96ウェルプレート1ウェルに対して50~200ng/mlの終濃度となるように添加することが好ましい。
PBMCと腫瘍細胞の直接又は間接的な接触は、PBMCと腫瘍細胞のそれぞれが、通常発育可能な条件で行うことが好ましい。例えば、発育可能な条件下(例えば、35℃~37℃、5%程度の炭酸ガス存在下)で16時間~72時間、好ましくは36~50時間程度行うことができる。前記PBMCと腫瘍細胞を接触させる時の培養培地は、PBMCと腫瘍細胞が生存できる、又は発育できる培地である限り制限されない。例えば、ウシ胎児血清を8%~20%程度含む、RPMI1640培地(改変培地含む)を挙げることができる。
次に細胞傷害活性を測定する。細胞傷害活性の測定方法は、PBMCがどのくらい腫瘍細胞を傷害できたかを評価できる限り制限されない。例えば、PBMCと腫瘍細胞とを直接接触させる場合には、PBMCと腫瘍細胞とを接触させた直後の生細胞数とPBMCと腫瘍細胞とを接触させてから48時間後の生細胞数の値から求めることができる。また、PBMCと腫瘍細胞とをエンゲージャーを介して、間接的に接触させる場合には、PBMCと腫瘍細胞とを接触させる際にエンゲージャーを添加するウェル(測定ウェル)と、PBMCと腫瘍細胞とを接触させる際にエンゲージャーを添加しないウェル(陰性対照ウェル)を作成し、測定ウェルの生細胞数と、陰性対照ウェルの生細胞数を比較することにより、腫瘍細胞傷害活性を反映する値として取得することができる。例えば、腫瘍細胞傷害活性を反映する値は、下式により求めることができる。
[数1]
腫瘍細胞傷害活性(%)
={([陰性対照ウェルの生細胞数]-[測定ウェルの生細胞数])/[陰性対照ウェルの生細胞数]}×100
腫瘍細胞傷害活性(%)
={([陰性対照ウェルの生細胞数]-[測定ウェルの生細胞数])/[陰性対照ウェルの生細胞数]}×100
また、例えばCellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Reagent (MTS reagent:プロメガ)等の生細胞染色試薬を用いて上記生細胞数を計数する場合には、上記生細胞数に変えて、各ウェルの吸光度を腫瘍細胞傷害活性を反映する値として使用してもよい。
腫瘍細胞が傷害されているか否かの決定は、腫瘍細胞傷害活性を反映する値を、対応する基準値と比較することにより行うことができる。例えば、上記方法により測定した腫瘍細胞傷害活性を反映する値が対応する基準値よりも高い場合には、腫瘍細胞が傷害されていると決定することができる。上記方法により測定した腫瘍細胞傷害活性が対応する基準値以下である場合には、腫瘍細胞が傷害されていないと決定することができる。腫瘍免疫療法の効果を予測する方法は、腫瘍免疫療法の効果が有効である患者を検出する方法でもある。また、腫瘍免疫療法の効果が有効でない患者を検出する方法でもある。
前記基準値は、腫瘍細胞が傷害されているか否かを判定できる値である限り制限されない。例えば、基準値は、腫瘍免疫が活性化していない陰性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値や、腫瘍免疫が活性化している陽性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値から求めることができる。陰性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値、及び陽性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値を測定する方法は、治療対象患者のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値を測定する方法と同じであることが好ましい。基準値は、陰性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値の上限値、陽性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値の下限値、陰性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値と陽性対照のPBMCの腫瘍細胞傷害活性値の中央値、平均値、最頻値等とすることができる。あるいは、基準値は、ROC曲線(Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線)、判別分析法、モード法、Kittler法、3σ法、p‐tile法等により算出してもよい。また別の態様として、前記基準値を腫瘍細胞傷害活性5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%又は40%から選択してもよい。
腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合には、腫瘍細胞傷害活性を測定したPBMCを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定することができる。また、腫瘍細胞が傷害されていないと決定された場合には、腫瘍細胞傷害活性を測定したPBMCを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法は有効でないと決定することができる。
本明細書において、特に言及しない限り、本項における用語の説明は、本明細書における他の実施態様における説明、特許請求の範囲及び図面全体において援用される。
2.腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬及びキット
本発明の第2の実施態様は、少なくとも上記1.で述べたエンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬に関する。前記検査試薬は、エンゲージャーを溶解するための緩衝液等を含んでいてもよい。また緩衝液は、エンゲージャーを安定化させるための還元剤(β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等)、界面活性剤、アルブミン等を含んでいてもよい。また、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含んでいても良い。エンゲージャーは、乾燥状態であっても、前記緩衝液に溶解されていてもよい。
本発明の第2の実施態様は、少なくとも上記1.で述べたエンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬に関する。前記検査試薬は、エンゲージャーを溶解するための緩衝液等を含んでいてもよい。また緩衝液は、エンゲージャーを安定化させるための還元剤(β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等)、界面活性剤、アルブミン等を含んでいてもよい。また、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含んでいても良い。エンゲージャーは、乾燥状態であっても、前記緩衝液に溶解されていてもよい。
本発明の第3の実施態様は、前記検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのキットに関する。本態様のキットには、少なくとも第3の実施態様に係る検査試薬と、前記検査試薬を使って行う測定方法を記載したプロトコール、又は前記プロトコールにアクセスするためのURL、Qコード等の情報を含む。
3.腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置
本発明の第4の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置に関する。
具体的には、前記予測装置は、少なくとも処理部を備え、前記処理部は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する。
本発明の第4の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置に関する。
具体的には、前記予測装置は、少なくとも処理部を備え、前記処理部は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する。
図3に、予測装置10のハードウェアの構成を示す。予測装置10は、入力部111と、出力部112と、記憶媒体113とに接続されていてもよい。また、マイクロプレートリーダ等により構成される測定部30と接続されていてもよい。すなわち、予測装置10は、測定部30と直接又はネットワーク等を介して接続された、腫瘍免疫療法の効果を予測する予測システムを構成することもある。
予測装置10において、CPU101と、主記憶部102と、ROM(read only memory)103と、補助記憶部104と、通信インタフェース(I/F)105と、入力インタフェース(I/F)106と、出力インタフェース(I/F)107と、メディアインターフェース(I/F)108は、バス109によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部102と補助記憶部104とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。
CPU101は、予測装置10の処理部である。CPU101が、補助記憶部104又はROM103に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、予測装置10が機能する。
ROM103は、マスクROM、PROM、EPROM、EEPROMなどによって構成され、CPU101により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。CPU101はMPU101としてもよい。ROM103は、予測装置10の起動時に、CPU101によって実行されるブートプログラムや予測装置10のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
主記憶部102は、SRAM又はDRAMなどのRAM(Random access memory)によって構成される。主記憶部102は、ROM103及び補助記憶部104に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部102は、CPU101がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
補助記憶部104は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部104には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、CPU101に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。
通信I/F105は、USB、IEEE1394、RS-232Cなどのシリアルインタフェース、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインタフェース、及びD/A変換器、A/D変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ(Network interface controller:NIC)等から構成される。通信I/F105は、CPU101の制御下で、測定部30又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて予測装置10が保存又は生成する情報を、測定部30又は外部に送信又は表示する。通信I/F105は、ネットワークを介して測定部30又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
入力I/F106は、例えばUSB、IEEE1394、RS-232Cなどのシリアルインタフェース、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインタフェース、及びD/A変換器、A/D変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力I/F106は、入力部111から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部102又は補助記憶部104に記憶される。
入力部111は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、予測装置10に文字入力又は音声入力を行う。入力部111は、予測装置10の外部から接続されても、予測装置10と一体となっていてもよい。
出力I/F107は、例えば入力I/F106と同様のインタフェースから構成される。出力I/F107は、CPU101が生成した情報を出力部112に出力する。出力I/F107は、CPU101が生成し、補助記憶部104に記憶した情報を、出力部112に出力する。
出力部112は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、測定部30から送信される測定結果及び予測装置10における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。
メディアI/F108は、記憶媒体113に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部102又は補助記憶部104に記憶される。また、メディアI/F108は、CPU101が生成した情報を記憶媒体113に書き込む。メディアI/F108は、CPU101が生成し、補助記憶部104に記憶した情報を、記憶媒体113に書き込む。
記憶媒体113は、フレキシブルディスク、CD-ROM、又はDVD-ROM等で構成される。記憶媒体113は、フレキシブルディスクドライブ、CD-ROMドライブ、又はDVD-ROMドライブ等によってメディアI/F108と接続される。記憶媒体113には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
CPU101は、予測装置10の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をROM103又は補助記憶部104からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに予測装置10がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをROM103又は補助記憶部104に記憶することも可能である。
また、ROM103又は補助記憶部104には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows(登録商標)などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第2の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、予測装置10は、パーソナルコンピュータ等であり得る。
次に、図4を用いて、予測装置10の動作について説明する。予測装置10の動作は、後述する腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラムにしたがって、予測装置10の処理部101が制御する。
初めに、処理部101は、検査者によって入力部111から入力される、上記1.で述べた方法により取得された腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得する(ステップS11)。または、測定部30から腫瘍細胞傷害活性を算出するための情報を取得する。前記情報は、PBMCと接触した腫瘍細胞の生細胞数を反映する情報であり、例えば生細胞染色試薬の吸光度等である。
次に、処理部101は、ステップS11で取得された測定値を補助記憶部104に記憶されている基準値と比較する(ステップS12)。
続いて処理部101は、ステップS12の比較結果から腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する(ステップS13)。
処理部101は、ステップS13において腫瘍細胞が傷害されている(YES)場合には、ステップS14において腫瘍細胞が傷害されていると決定し、さらにステップS15で、PBMCを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する。また、ステップS13において腫瘍細胞が傷害されていない(NO)場合には、ステップS16において腫瘍細胞が傷害されていないと決定し、さらにステップS17で、PBMCを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法は有効でないと決定する。
また、図示しないが、ステップS13は、腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得するステップと、前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記測定値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定するステップとに分かれていても良い。
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得するステップと、前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記測定値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定するステップとに分かれていても良い。
腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップの各態様の説明は、上記1.で述べた腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程についての説明をここに援用する。
処理部101は、上記ステップS14、又はステップS16で得られた結果を出力部112から出力するか、記録媒体113に記録してもよい。
4.腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム及び前記コンピュータプログラムを記憶した記憶媒体
本発明の第5の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラムに関する。具体的には、上記3.で述べた腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置の動作を制御するコンピュータプログラムである。
本発明の第5の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラムに関する。具体的には、上記3.で述べた腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置の動作を制御するコンピュータプログラムである。
第5の実施態様のコンピュータプログラムが実行する各ステップは、上記3.で述べたステップS11~16である。上記3.に記載の各ステップの説明は、第5の実施態様に援用することができる。
さらに、本発明の第6の実施態様は、前記コンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体に関する。すなわち、前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示
装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定し解釈されるものではない。
I.実施例1:末梢血単核細胞を用いた腫瘍細胞傷害活性の測定
1.方法
(1)U251細胞株を、1×105個/mLとなるように10%FBSを添加したRPMI1640培地(10%FBS加RPMI1640培地)に懸濁した細胞懸濁液を調製した。前記細胞懸濁液を100μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、5%炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。
1.方法
(1)U251細胞株を、1×105個/mLとなるように10%FBSを添加したRPMI1640培地(10%FBS加RPMI1640培地)に懸濁した細胞懸濁液を調製した。前記細胞懸濁液を100μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、5%炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。
(2)肺癌患者から末梢血(ヘパリン採血)を採取し、LymphoprepTM (Alere Technologies AS)を使って、添付のプロトコールにしたがって末梢血単核細胞を含む細胞群(「PBMC」とする)を回収した。前記PBMCの回収は、後述する(3)の工程の直前に行った。
(3)(1)でインキュベーションが終わった96ウェルプレートに、1ウェルあたり、前記PBMCの細胞数が5×104個、EphA2-CD3 BiTE(登録商標)が終濃度で100 ng/mLとなるように添加した。コントロールとして、(1)でインキュベーションが終わった96ウェルプレート内に前記PBMCのみを添加し、EphA2-CD3 BiTE(登録商標)を添加しないウェルを準備した。前記PBMCとEphA2-CD3 BiTE(登録商標)を添加した後の1ウェルあたりの10%FBS加RPMI培地の量は、総量が200μLとなるようにした。PBMCとEphA2-CD3 BiTE(登録商標)を添加したあと、48時間インキュベーションした。
(4)インキュベーション終了後、10%FBS加RPMI培地で各ウェルを4回洗浄した。洗浄後培地が除去された各ウェルに、100μLの10%FBS加RPMI培地と20μLのCellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Reagent (MTS reagent:プロメガ)を添加した。その後、96ウェルマイクロプレートを5%炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、20分、37℃でインキュベーションした。
(5)(4)でインキュベーションが終了した96ウェルマイクロプレートについて、マイクロプレートリーダを使って各ウェルの490 nmにおける吸光度を測定した。続いて、下式にしたがって、腫瘍細胞傷害活性を算出した。
U251細胞株とPBMCを含むウェルの吸光度=A
U251細胞株とPBMCとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度=B
U251細胞株とPBMCを含むウェルの吸光度=A
U251細胞株とPBMCとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度=B
腫瘍細胞傷害活性 (%)=[(A-B)/A]×100
2.結果
図5に各患者のPBMCの腫瘍細胞傷害活性を示す。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、このPBMCの腫瘍細胞傷害活性は、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。図5からわかるように、肺癌患者の末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性は、患者によって異なっており、腫瘍細胞傷害活性が数%しかない患者も存在する一方で、80%以上と高い値を示す患者も存在した。このことから、各患者の末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性には、個人差があることがわかった。
図5に各患者のPBMCの腫瘍細胞傷害活性を示す。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、このPBMCの腫瘍細胞傷害活性は、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。図5からわかるように、肺癌患者の末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性は、患者によって異なっており、腫瘍細胞傷害活性が数%しかない患者も存在する一方で、80%以上と高い値を示す患者も存在した。このことから、各患者の末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性には、個人差があることがわかった。
II.実験例1:肺癌組織内のT細胞の腫瘍細胞傷害活性
肺癌組織内のT細胞の腫瘍細胞傷害活性は、以下の方法に従って肺癌組織から細胞を回収し、その細胞群の細胞傷害活性として測定した。
癌組織を6 cm Dishに移して細断した後、組織攪拌溶液(HBSS(-) + 2% FBS + 10mM HEPESにTumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec)を添加)に入れてgentleMACSTM Dissociator (Miltenyi Biotec)で攪拌後、37℃で維持したインキュベータ内で30分回転させながらインキュベーションした。その後、細胞を含む攪拌液を70 μmメッシュを通して、組織残渣を取り除き、濾液を600xg、10分遠心して沈殿物を回収した。細胞を含む沈殿物にBD Pharm lyse (BD Biosciences)を添加して2分間静置した。静置後の細胞を含む溶解液にHBSS Bufferを加えて600xg、10分遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物に30% パーコール液を加えて12000xg、30秒遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物をHBSS Bufferで洗浄し、12000xg、30秒遠心して組織内の細胞を回収した。回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、上記I.と同様の方法で測定した。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、この肺癌組織内から回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。
肺癌組織内のT細胞の腫瘍細胞傷害活性は、以下の方法に従って肺癌組織から細胞を回収し、その細胞群の細胞傷害活性として測定した。
癌組織を6 cm Dishに移して細断した後、組織攪拌溶液(HBSS(-) + 2% FBS + 10mM HEPESにTumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec)を添加)に入れてgentleMACSTM Dissociator (Miltenyi Biotec)で攪拌後、37℃で維持したインキュベータ内で30分回転させながらインキュベーションした。その後、細胞を含む攪拌液を70 μmメッシュを通して、組織残渣を取り除き、濾液を600xg、10分遠心して沈殿物を回収した。細胞を含む沈殿物にBD Pharm lyse (BD Biosciences)を添加して2分間静置した。静置後の細胞を含む溶解液にHBSS Bufferを加えて600xg、10分遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物に30% パーコール液を加えて12000xg、30秒遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物をHBSS Bufferで洗浄し、12000xg、30秒遠心して組織内の細胞を回収した。回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、上記I.と同様の方法で測定した。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、この肺癌組織内から回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。
III.実施例2:T細胞レセプターレパトア解析
同一患者において腫瘍内と末梢血に共通するT細胞クローンが存在するか否かを確認するため、T細胞レセプター(TCR)のレパトア解析を行った。
肺癌患者末梢血PBMCおよび肺癌組織内の細胞からFACSAria(Becton Dickinson)を用いてCD8陽性T細胞を採取した。採取したCD8陽性T細胞からRNAを抽出し、Adaptor-Ligation PCR法を用いてTCR遺伝子を増幅した後に、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定した。TCRレパトア解析はRepertoire Genesis株式会社(http://www.repertoire.co.jp/detailed_repertoire.html)に外注した。
レパトア解析は、TCRαとTCRβそれぞれについて行った。
患者1~4について、PBMCと肺癌組織内T細胞について出現頻度の高い上位30クローンのレパートリーを比較した。
同一患者において腫瘍内と末梢血に共通するT細胞クローンが存在するか否かを確認するため、T細胞レセプター(TCR)のレパトア解析を行った。
肺癌患者末梢血PBMCおよび肺癌組織内の細胞からFACSAria(Becton Dickinson)を用いてCD8陽性T細胞を採取した。採取したCD8陽性T細胞からRNAを抽出し、Adaptor-Ligation PCR法を用いてTCR遺伝子を増幅した後に、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定した。TCRレパトア解析はRepertoire Genesis株式会社(http://www.repertoire.co.jp/detailed_repertoire.html)に外注した。
レパトア解析は、TCRαとTCRβそれぞれについて行った。
患者1~4について、PBMCと肺癌組織内T細胞について出現頻度の高い上位30クローンのレパートリーを比較した。
患者1は及び患者2は、肺癌組織内CD8陽性T細胞の腫瘍細胞傷害活性が高かった例であり、患者3は、前記腫瘍細胞傷害活性が中程度であった例であり、患者4は前記腫瘍細胞傷害活性が低かった例である。
結果を図6に示す。
結果を図6に示す。
出現頻度の高い上位30クローンのレパートリーを比較した結果、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性が高かった又は中程度であった患者1~3は、末梢血と肺癌組織内CD8陽性T細胞で複数種の共通クローンが認められた。これに対して、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性が低かった患者4では、末梢血と肺癌組織内CD8陽性T細胞で共通するクローンが1クローンのみ確認された。このことから、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性が高い程、肺癌組織内で腫瘍細胞の抗原特異的に増殖した細胞障害性T細胞が末梢血にも多く出現することが示唆された。
IV.実施例3:肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性と末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関
次に、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性とPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を求めた。結果を図7に示す。相関係数R2とp値は統計ソフトJMPを用いて求めた。p値は、相関の有無の検定値を示す。
次に、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性とPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を求めた。結果を図7に示す。相関係数R2とp値は統計ソフトJMPを用いて求めた。p値は、相関の有無の検定値を示す。
また、比較例として、患者から採取したPBMCとU251細胞株にEphA2-CD3 BiTEを加えて2日間培養した培養上清について、抗腫瘍作用を示すインターフェロンγ(IFNγ)の濃度を求め、この結果と肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を求めた。IFNγの濃度は、Bio-Plex Proヒトサイトカイン GI 27-plexパネル(Bio-Rad)を使用して測定した。
その結果、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性と末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関はR2=0.36であり、p=0.009となり、末梢血T細胞の細胞傷害活性は、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性を反映すると考えられた。これに対して、IFNγは、R2=0.22であり、p=0.048となり、IFNγも肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性と相関することが示された。しかし、IFNγに比べ末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の方が、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性とより強く相関することが示された。
以上の結果から、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍組織内のT細胞の腫瘍細胞傷害活性を予測することができ、ひいては、末梢血中のPBMCの腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を予測できると考えられた。
V.実施例4:ニボルマブの効果と末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性との相関
1.方法
18人の患者について、実施例1に従って測定したPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性と、ニボルマブの効果とを比較した。ニボルマブの効果は以下の方法により評価した。実施例1に記載の方法に従って、U251細胞株を96ウェルプレートに播種し、5%炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。実験例1に記載の方法に従って回収した各患者の肺癌組織内の細胞(細胞数は5×104個/ウェル)と、1μg/mlのニボルマブ(小野薬品工業株式会社より分与を受けた)とを100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE(登録商標)ともに各ウェルに添加した。陰性コントロールとしてニボルマブに替えて1μg/mlのヒトIgG4(アブカム)を100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE(登録商標)ともに培地に添加した。実施例1に記載の方法に従って、CellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Reagent (MTS reagent:プロメガ)を用いて吸光度を測定し、下式にしたがって腫瘍細胞傷害活性を算出した。
1.方法
18人の患者について、実施例1に従って測定したPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性と、ニボルマブの効果とを比較した。ニボルマブの効果は以下の方法により評価した。実施例1に記載の方法に従って、U251細胞株を96ウェルプレートに播種し、5%炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。実験例1に記載の方法に従って回収した各患者の肺癌組織内の細胞(細胞数は5×104個/ウェル)と、1μg/mlのニボルマブ(小野薬品工業株式会社より分与を受けた)とを100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE(登録商標)ともに各ウェルに添加した。陰性コントロールとしてニボルマブに替えて1μg/mlのヒトIgG4(アブカム)を100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE(登録商標)ともに培地に添加した。実施例1に記載の方法に従って、CellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Reagent (MTS reagent:プロメガ)を用いて吸光度を測定し、下式にしたがって腫瘍細胞傷害活性を算出した。
U251細胞株と肺癌組織内の細胞と陰性コントロールとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度=A
U251細胞株と肺癌組織内の細胞とニボルマブとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度=B
U251細胞株と肺癌組織内の細胞とニボルマブとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度=B
腫瘍細胞傷害活性 (%) =[(A-B)/A]×100
相関係数R2とp値は統計ソフトJMPを用いて求めた。p値は、相関の有無の検定値を示す。
相関係数R2とp値は統計ソフトJMPを用いて求めた。p値は、相関の有無の検定値を示す。
2.結果
ニボルマブの効果と末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を図8Aに示す。R2=0.27、p=0.028であり、ニボルマブの効果とPBMCの腫瘍細胞傷害活性が相関することが示された。また、患者を末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性が高い方から9名と、残りの9名との2群に分け、ROC曲線から暫定的なカットオフ値を求めたところ、28%となった。この2群間で、ニボルマブの効果について有意差検定を行ったところ、p=0.0005となり、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の高い群では有意にニボルマブの効果が高かった(図8B)。
ニボルマブの効果と末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を図8Aに示す。R2=0.27、p=0.028であり、ニボルマブの効果とPBMCの腫瘍細胞傷害活性が相関することが示された。また、患者を末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性が高い方から9名と、残りの9名との2群に分け、ROC曲線から暫定的なカットオフ値を求めたところ、28%となった。この2群間で、ニボルマブの効果について有意差検定を行ったところ、p=0.0005となり、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性の高い群では有意にニボルマブの効果が高かった(図8B)。
このことから、PBMCを用いて測定される末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性は腫瘍免疫療法の効果との相関が高いことが示された。また、末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性は腫瘍免疫療法の効果の評価マーカとして使用できることが示された。
VI.実施例5:末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性と腫瘍免疫療法の効果との相関
次に、肺癌患者のPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性と、腫瘍免疫療法の効果との相関を検討した。患者から採取したPBMCについて実施例1に従って腫瘍細胞傷害活性を測定し、腫瘍細胞傷害活性が25%以上の患者3名を抽出した。前記3名の患者において、抗PD-1抗体を用いた腫瘍免疫療法により腫瘍の縮小が認められ、その治療継続期間は140日以上であり、長期間の治療が可能であった。このように腫瘍の縮小が認められ、治療を継続できたことは、腫瘍免疫療法が有効であることを意味する。
次に、肺癌患者のPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性と、腫瘍免疫療法の効果との相関を検討した。患者から採取したPBMCについて実施例1に従って腫瘍細胞傷害活性を測定し、腫瘍細胞傷害活性が25%以上の患者3名を抽出した。前記3名の患者において、抗PD-1抗体を用いた腫瘍免疫療法により腫瘍の縮小が認められ、その治療継続期間は140日以上であり、長期間の治療が可能であった。このように腫瘍の縮小が認められ、治療を継続できたことは、腫瘍免疫療法が有効であることを意味する。
現在、腫瘍免疫療法を適用するか否かを判断するにあたり、腫瘍組織におけるPD-L1発現細胞の陽性率が1つの指標とされている。前記3名の患者について、腫瘍組織におけるPD-L1発現肺癌細胞の陽性率を計測したところ、2名の患者については、陽性率が50%以上であったが、1名の患者は陽性率が2%と非常に低値であった。PD-L1発現細胞の陽性率は、PD-L1タンパク質の免疫染色(免疫抗体法)を行うことにより評価されている。PD-L1発現細胞が2%しかない患者はPD-L1タンパク質の免疫染色では、腫瘍免疫療法が有効な患者であるとは予測することができない。
一方で、前記PD-L1発現細胞が2%しかない患者のPBMCに由来する末梢血T細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、前記患者の末梢血T細胞が腫瘍細胞を傷害すると決定することができ、実際にそのような患者において腫瘍免疫療法の効果が認められた。従って、本開示における腫瘍免疫療法の効果を予測する方法によれば、PD-L1発現細胞の陽性率が低い患者についても、腫瘍免疫療法の適用できるか否かの予測があると考えられた。さらには、腫瘍免疫療法が有効な患者をPD-L1タンパク質の免疫染色よりも高い検出率で検出できると考えられた。
101 処理部
10 予測装置
10 予測装置
Claims (11)
- 工程1:悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にin vitroで接触させる工程、
工程2:前記工程1で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程、及び
工程3:前記工程2において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程、
を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法。 - 前記工程1が、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーを介して間接的にin vitroで接触させる工程である、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得する工程、及び
前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定する工程、
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記エンゲージャーが、二重特異性分子である、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記二重特異性分子が、T細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子である、請求項4に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が、悪性腫瘍由来の培養細胞株である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を実施するための、エンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬。
- 請求項7に記載の検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査キット。
- 悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得するステップと、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップ、及び前記ステップにおいて前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定するステップ、
をコンピュータに実行させるための、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム。 - 請求項9に記載のコンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体。
- 少なくとも処理部を備え、
前記処理部は、
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にin vitroで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、
前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び
前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する、
腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置。
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