CN110809628A - 使用外周血t细胞的肿瘤细胞毒性活性作为指标预测肿瘤免疫疗法效果的方法 - Google Patents

使用外周血t细胞的肿瘤细胞毒性活性作为指标预测肿瘤免疫疗法效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供用于预测肿瘤免疫疗法效果的伴随诊断。肿瘤免疫疗法的效果通过包括以下步骤的方法预测：步骤1：使从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞在体外直接地或间接地与肿瘤细胞接触；步骤2：确定在步骤1中与外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞是否被损伤；和步骤3：当在步骤2中确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法针对患者中的恶性肿瘤有效。

Description

使用外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性作为指标预测肿瘤免 疫疗法效果的方法
发明领域
本发明涉及使用外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性作为指标预测肿瘤免疫疗法效果的预测方法、预测装置和计算机程序。
背景技术
肿瘤免疫疗法是一种利用患者对肿瘤细胞的免疫应答的肿瘤治疗疗法。在肿瘤免疫疗法的一个实例中，肿瘤患者自身的细胞毒性T细胞使用与T细胞上的蛋白质结合的抗-CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体等得以激活，从而通过该功能杀伤癌细胞(NPL 1和NPL 2)。
另外，已经开发了使细胞毒性T细胞与肿瘤细胞特异性接合的方法，使得存在于肿瘤组织中的细胞毒性T细胞能够有效地表现出针对肿瘤细胞的细胞毒性活性。目前使用的接合剂(engager)是双特异性分子，其在单个分子的基础上特异性识别肿瘤细胞的细胞表面标志物和T细胞的表面标志物(NPL 2和NPL 3)。
引用列表
非专利文献
NPL 1:PD1/PD-L1 Combination Therapies,2015,Evaluate Ltd.
NPL 2:ONCOIMMUNOLOGY,2016,VOL.5,NO.2,e1062969
NPL 3:Cancer Research,2013,73(15)August 1,pp.4663-4673
发明内容
技术问题
然而，例如，派姆单抗(pembrolizumab)(商品名：Keytruda)是一种保险覆盖的用于非小细胞肺癌的肿瘤免疫疗法中使用的治疗剂，其应答率为19％；实际上，派姆单抗对许多患者无效。为此，已经进行了伴随诊断(companion diagnostics)，以选择肿瘤免疫疗法的治疗剂对其有效的患者组。尽管使用活检标本的PD-L1染色在目前被用作派姆单抗的伴随诊断剂，但即使是在PD-L1染色中呈阳性(50％或更高)的患者组中，其应答率仍为45％。因此，强烈需要开发优于PD-L1染色的伴随诊断。
这样的应答率和预测肿瘤免疫疗法效果中的困难是许多癌症免疫疗法中普遍的问题。鉴于目前肿瘤免疫疗法的状态，本发明的目的是提供用于预测肿瘤免疫疗法效果的伴随诊断。
问题的解决方案
本发明人进行了广泛的研究，发现可以通过在体外使用外周血中的单核细胞测量肿瘤细胞毒性活性，以简单的方式预测肿瘤免疫疗法的效果。
本发明基于该发现得以完成，并且本发明包括以下主题。
第1项
一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法，该方法包括：
步骤1：使从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞在体外直接地或间接地与肿瘤细胞接触，
步骤2：确定在步骤1中与外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞是否被损伤，和
步骤3：当在步骤2中确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对患者中的恶性肿瘤有效。
第2项
根据第1项的方法，其中在步骤1中，使从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞在体外经由接合剂间接地与肿瘤细胞接触。
第3项
根据第1或2项的方法，其中确定肿瘤细胞是否被损伤的步骤包括：
通过测量与肿瘤细胞接触过的外周血单核细胞的肿瘤细胞毒性活性来获得反映肿瘤细胞毒性活性的值的步骤，和
将反映肿瘤细胞毒性活性的值与相应的参考值进行比较、并且在该值高于相应的参考值时确定肿瘤细胞被损伤的步骤。
第4项
根据第2或3项的方法，其中接合剂是双特异性分子。
第5项
根据第4项的方法，其中双特异性分子含有与T细胞表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域和与肿瘤细胞的表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域。
第6项
根据第1-5项中任一项的方法，其中肿瘤细胞是源自恶性肿瘤的培养细胞系。
第7项
一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂，用于进行第2-6项中任一项的方法，
该测试试剂包括接合剂。
第8项
一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂盒，该测试试剂盒包括第7项的测试试剂。
第9项
一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的计算机程序，该计算机程序使计算机执行以下步骤：
从在体外直接地或间接地与从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞，获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，
基于该测量值确定肿瘤细胞是否被损伤，和
当在先前步骤中确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对患者中的恶性肿瘤有效。
第10项
一种存储介质，其中存储第9项的计算机程序。
第11项
一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的预测装置，该预测装置至少包括处理单元，其中该处理单元
从在体外直接地或间接地与从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞，获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，
基于该测量值确定肿瘤细胞是否被损伤，和
当确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对患者中的恶性肿瘤有效。
发明的有益效果
本发明使得能够通过使用外周血单核细胞(PBMC)在体外测量肿瘤细胞毒性活性以简单的方式预测肿瘤免疫疗法的效果。
附图说明
图1示出本发明的概要。
图2示出预测装置的概要。
图3是示出预测装置的硬件配置的框图。
图4是由预测装置的处理单元执行的过程的流程图。
图5示出肺癌患者中的PBMC的肿瘤细胞毒性活性。
图6示出外周血中的CD8+T细胞和肺癌组织中的CD8+T细胞的组库(repertoire)分析结果。
图7中的图说明肿瘤(肺癌)组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性与PBMC经由接合剂产生的IFNγ的量之间的相关性(图7A)，或肿瘤(肺癌)组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性与外周血中T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性(图7B)。
图8中的图说明纳武单抗(Nivolumab)在肿瘤(肺癌)组织中的T细胞中的效果与外周血中T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性(图8A)，或当外周血中T细胞的肿瘤细胞毒性活性的临界值(cutoff value)为28％时纳武单抗在每组肿瘤(肺癌)组织中的T细胞中的效果(图8B)。
具体实施方式
1.预测肿瘤免疫疗法效果的方法
本发明的第一实施方式涉及一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法。首先，本实施方式的概要参照图1进行说明。如图1所示，在本实施方式中，从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞(PBMC)在体外直接地或经由接合剂间接地与肿瘤细胞接触，并培养；然后测量多少肿瘤细胞已被PBMC损伤(肿瘤细胞毒性活性)，以基于该测量值来预测肿瘤免疫疗法对肿瘤患者的效果。图1示出一实例，其中PBMC中包含的T细胞经由接合剂与已经预先接种并培养在培养皿中的肿瘤细胞接触。
更具体地，该实施方式涉及一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法，该方法包括：使从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的PBMC在体外直接地或间接地与肿瘤细胞接触的步骤(步骤1)，确定在步骤1中与PBMC接触过的肿瘤细胞是否被损伤(步骤2)，和当在步骤2中确定肿瘤细胞已被损伤时确定肿瘤免疫疗法对患者中的恶性肿瘤有效的步骤(步骤3)。
在本发明中，肿瘤免疫疗法可以是任何肿瘤免疫疗法，其是通过增加T细胞的肿瘤细胞毒性活性来治疗肿瘤的方法。根据本发明的肿瘤免疫疗法包括免疫检查点抑制剂疗法，例如抗-PD1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-CCR4抗体、抗-CTLA-4抗体、抗-Tim3抗体和抗-LAG3抗体；过继性免疫疗法，其中，例如，施用嵌合抗原受体-T细胞；细胞因子疗法，例如使用白介素2的疗法；肿瘤疫苗疗法，其中，例如，施用源自肿瘤抗原(例如，WT-1、NY-ESO-1)的蛋白质或肽；和双特异性T细胞接合剂(或BiTE(注册商标))或双特异性抗体疗法。
在本发明中，肿瘤包括恶性肿瘤和良性肿瘤，并且优选为恶性肿瘤。肿瘤还包括上皮性肿瘤和非上皮性肿瘤，并且优选为上皮性肿瘤。在本发明中，肿瘤最优选为上皮性恶性肿瘤。
恶性肿瘤的实例包括呼吸系统恶性肿瘤，其在气管、支气管、肺等中发展；胃肠道恶性肿瘤，其在上咽、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、阑尾、升结肠、横结肠、乙状结肠、直肠、肛区等中发展；肝癌；胰腺癌；泌尿系统恶性肿瘤，其在膀胱、输尿管或肾脏中发展；女性生殖系统恶性肿瘤，其在卵巢、输卵管、子宫等中发展；乳腺癌；前列腺癌；皮肤癌；内分泌系统恶性肿瘤，例如下丘脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺；中枢神经系统恶性肿瘤；实体瘤，例如在骨骼和软组织中发展的恶性肿瘤；造血系统恶性肿瘤，例如骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性巨核细胞性白血病、红白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、慢性嗜酸性粒细胞性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、成人T-细胞性白血病、毛细胞白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；和造血器官肿瘤，例如淋巴系统恶性肿瘤。恶性肿瘤的更优选的实例包括呼吸系统上皮性恶性肿瘤，例如肺癌(鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌、腺癌)；胃肠道上皮性恶性肿瘤，例如胃癌、十二指肠癌、结直肠癌(例如乙状结肠癌和直肠癌)；肝癌；胰腺癌；膀胱癌；甲状腺癌；卵巢癌；乳腺癌；和前列腺癌。最优选地，恶性肿瘤是肺癌。
在本发明中，“作为恶性肿瘤治疗对象的患者”可以是任何患者，只要肿瘤免疫疗法适用于该患者即可。这样的患者的实例包括有待治疗的患有上述肿瘤的患者、已治疗过肿瘤的患者、目前正在肿瘤治疗中的患者和已经历过复发或发生过转移的患者。肿瘤的治疗优选地包括外科手术肿瘤切除、化学疗法(更优选地，施用肿瘤免疫疗法以外的抗肿瘤剂的化学疗法)和放射疗法。
在本发明中，外周血可以是任何外周血，只要可以从外周血中获得含有T细胞的单核细胞即可。外周血可以是动脉血或静脉血，并且优选是静脉血。外周血可以例如从肢体的血管中收集。外周血可以在手术或活检过程中从肢体以外的身体部位的血管收集。
收集外周血的方法可以是能够获得单核细胞的任何方法；优选使用抗凝剂收集外周血。抗凝剂包括乙二胺四乙酸盐、柠檬酸盐和肝素盐，优选肝素盐。
PBMC可以根据已知方法收集。例如，PBMC可以使用比重溶液(密度约为1.077±0.001g/ml)进行离心以分离人淋巴细胞来收集。外周血中的红细胞可以通过使用溶血剂(hemolyzing)进行溶血，获得的有核细胞可以用作PBMC。可以使用细胞分选仪或通过磁激活细胞分选收集所需的细胞。所需的细胞的实例包括T细胞，优选CD3+T细胞或CD8+T细胞。
与PBMC接触的肿瘤细胞可以是源自上述那些肿瘤的任何肿瘤细胞。肿瘤细胞优选是培养的细胞系。培养的细胞系可以是任何培养的细胞系，其包括，例如，源自恶性肿瘤的培养的细胞系，例如U251细胞系、RERF细胞系或A549细胞系。肿瘤细胞并不一定是与患者中的恶性肿瘤相同的类型，但可以是相同的类型。肿瘤细胞优选是可以在与PBMC相同的培养条件下生长的细胞。
使PBMC与肿瘤细胞在体外接触的方法可以是任何方法，只要PBMC与肿瘤细胞直接地或间接地接触即可。
当PBMC和肿瘤细胞在体外彼此接触时，优选将肿瘤细胞预先在体外接种在板或培养瓶中。当肿瘤细胞是黏着细胞时，更优选在体外在能生存的条件下将肿瘤细胞黏着于培养皿或培养瓶。此外，当肿瘤细胞是黏着细胞时，肿瘤细胞优选为在生长条件下(例如，在35℃至37℃下在约5％CO2的气体中)培养约12小时至48小时的那些。用于培养肿瘤细胞的培养基可以是任何允许肿瘤细胞保持生存或生长的培养基。培养基的实例包括RPMI1640培养基(包括其改良培养基)、α-MEM培养基(包括其改良培养基)和DMEM(Dulbecco’s MEM)培养基(包括其改良培养基)，它们均含有约8％至20％的胎牛血清。
关于使PBMC和肿瘤细胞彼此接触的细胞计数，例如，96孔板的每个孔中，优选约1×103至1×105、优选约5×103至5×104的肿瘤细胞与约1×103至1×105、优选约5×103至5×104的PBMC接触。
使PBMC和肿瘤细胞彼此直接地接触的方法包括将PBMC接种在已经接种了肿瘤细胞的板或培养瓶中的方法。优选地，当接种的PBMC漂浮时，可以以约1,000-2,000rpm离心约5-10分钟。
使PBMC和肿瘤细胞彼此间接地接触的方法包括使PBMC和肿瘤细胞经由接合剂彼此接触的方法。在该实施方式中，接合剂可以是作为能够使PBMC、优选淋巴细胞、更优选T细胞、再更优选CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)与肿瘤细胞接合的分子的任何接合剂。“接合(engage)”是指至少细胞与细胞(例如，T细胞与肿瘤细胞)交联，优选是指细胞毒性T细胞对于与细胞毒性T细胞交联的肿瘤细胞表现出细胞毒性活性的状态。
优选的接合剂包括双特异性分子和三特异性分子。更优选的接合剂包括双特异性分子。双特异性分子和三特异性分子各自优选为含有与T细胞表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域和与肿瘤细胞表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域的分子。抗原结合结构域可以是与靶抗原结合的任何抗原结合结构域。抗原结合结构域含有，例如，选自与抗原结合的免疫球蛋白的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的至少一个CDR。抗原结合结构域优选含有选自CDR1、CDR2和CDR3的至少两个CDR，并且更优选含有CDR1、CDR2和CDR3。CDR可以来源于免疫球蛋白的重链或来源于免疫球蛋白的轻链。更优选地，抗原结合结构域中的每个CDR可以与其相应的框架区相邻。抗原结合结构域可以是免疫球蛋白的可变区(V区)、sc-Fv、免疫球蛋白的Fab片段等。
每个抗原与表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域的数目可以是一个、两个或多个。例如，与表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域可以是相同类型的Fab片段的组合、相同类型的可变区的组合、相同类型的sc-Fv的组合、源自一种抗体的重链Fab片段和轻链Fab片段的组合、源自一种抗体的重链可变区和轻链可变区的组合或者是源自一种抗体的重链和sc-Fv的组合。
T细胞的表面抗原存在于T细胞的表面上；表面抗原可以是任何表面抗原，只要双特异性分子或三特异性分子中存在的至少一个抗原结合结构域可以与表面抗原之一结合即可。T细胞的表面抗原优选包括细胞毒性T细胞的表面抗原。T细胞的表面抗原的实例包括CD3、CD8、TCR、CTLA-4、PD1、Tim3、CD27、CD28、CD40、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)和CD278(ICOS)，优选CD3。
肿瘤细胞的表面抗原存在于肿瘤细胞的表面；表面抗原可以是任何表面抗原，只要双特异性分子或三特异性分子中存在的至少一个抗原结合结构域可以结合表面抗原之一即可。肿瘤细胞的表面抗原包括EphA1(肝配蛋白A型受体1)、EphA2、FolR1(叶酸受体1)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、CD19、Her1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒致癌基因同源物1：ErbB1)、Her2、CD20、EGFR(表皮生长因子受体)、CCR4(C-C趋化因子受体4型)、CEA(癌胚抗原)、GD2、GD3、CD22、CD30、CD33、CD70、CD123、EGFRvIII、MUC1(Mucin1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、HLA-A1+NY-ESO1(HLA-A1限制性NY-ESO1)、HLA-A2+NY-ESO1(HLA-A2限制性NY-ESO1)和HLA-A3+NY-ESO1(HLA-A3限制性NY-ESO1)。
双特异性分子包括双特异性T细胞接合剂和双特异性抗体。双特异性T细胞接合剂包括靶向CD19和CD3的接合剂，以及靶向EphA2和CD3的接合剂。双特异性抗体还包括靶向EpCAM和CD3的抗体。
关于使PBMC和肿瘤细胞彼此接触的细胞计数，例如，96孔板的每个孔中，优选使约1×103至1×105、优选约5×103至5×104的肿瘤细胞与约1×103至1×105、优选约5×103至5×104的PBMC接触。当添加双特异性分子时，优选地添加双特异性分子，以使96孔板的每个孔的终浓度为50-200ng/ml。
PBMC和肿瘤细胞之间的直接或间接接触优选地在使得PBMC和肿瘤细胞分别能够以正常方式生长的条件下进行。例如，接触可以在生长条件下(例如，在35℃至37℃下在约5％CO2气体中)进行约16小时至72小时、优选约36至50小时。用于使PBMC与肿瘤细胞接触的培养基可以是任何培养基，只要PBMC和肿瘤细胞可以保持生存或可以在该培养基中生长即可。这样的培养基的实例包括含有约8％至20％胎牛血清的RPMI1640培养基(包括其改良培养基)。
随后，测量细胞毒性活性。测量细胞毒性活性的方法可以是任何方法，只要该方法可以评估PBMC损伤肿瘤细胞的程度即可。例如，当PBMC和肿瘤细胞直接地彼此接触时，细胞毒性活性可以从PBMC和肿瘤细胞接触后立即进行的活细胞计数以及自PBMC和肿瘤细胞接触48小时后的活细胞计数来确定。当PBMC和肿瘤细胞经由接合剂间接地接触时，制备使PBMC和肿瘤细胞相互接触时添加接合剂的孔(测量孔)，以及使PBMC和肿瘤细胞互相接触时不添加接合剂的孔(阴性对照孔)；比较测量孔的活细胞计数和阴性对照孔的活细胞计数，获得反映肿瘤细胞毒性活性的值。例如，可以从下式确定反映肿瘤细胞毒性活性的值。
肿瘤细胞毒性活性(％)
＝{([阴性对照孔的活细胞计数]-[测量孔的活细胞计数])/[阴性对照孔的活细胞计数]}×100
例如，当使用活细胞染色试剂(例如CellTiter 96(注册商标)AQueous OneSolution Reagent(MTS试剂：Promega Corporation)确定活细胞计数时，每个孔的吸光度而不是活细胞计数可以用作反映肿瘤细胞毒性活性的值。
肿瘤细胞是否被损伤可以通过将反映肿瘤细胞毒性活性的值与相应的参考值进行比较来确定。例如，当通过上述方法测量的反映肿瘤细胞毒性活性的值高于相应的参考值时，确定肿瘤细胞已被损伤。当通过上述方法测量的肿瘤细胞毒性活性等于或低于相应的参考值时，确定肿瘤细胞未被损伤。用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法也是用于检测肿瘤免疫疗法的效果对其有益的患者的方法。用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法也是用于检测肿瘤免疫疗法效果对其不利的患者的方法。
参考值可以是任何参考值，只要可以基于该参考值确定肿瘤细胞是否被损伤即可。例如，参考值可以从其中肿瘤免疫力未被激活的阴性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值和/或其中肿瘤免疫力被激活的阳性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值来确定。用于测量阴性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值和阳性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值的方法，优选地与用于测量作为治疗对象的患者的PBMC的肿瘤细胞毒性活性值的方法相同。参考值可以是阴性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值的上限；阳性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值的下限；阴性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值和阳性对照PBMC的肿瘤细胞毒性活性值的中值、平均值或众数值(mode)；等。另外可选地，参考值可以使用ROC曲线(接受者操作特征曲线)、判别分析、众数法、基特勒(Kittler)法、3-σ方法、p-tile法等来计算。在另一实施方式中，参考值可以选自5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的肿瘤细胞毒性活性。
当确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对已从其收集PBMC的患者(其肿瘤细胞毒性活性的PBMC已经测量)中的恶性肿瘤有效。当确定肿瘤细胞未被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对已从其收集PBMC的患者(其肿瘤细胞毒性活性的PBMC已经测量)的恶性肿瘤无效。
在本说明书中，除非另有说明，否则本节中术语的解释全部并入本说明书、权利要求和附图的其它实施方式中。
2.用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂和试剂盒
本发明的第二实施方式涉及用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂，其至少包括以上第1节中所述的接合剂。测试试剂可以含有，例如，用于溶解接合剂的缓冲液。缓冲液可以含有用于稳定接合剂的还原剂(例如，β-巯基乙醇和二硫苏糖醇)、表面活性剂、白蛋白等。缓冲液还可以包括防腐剂，例如叠氮化钠。接合剂可以是干燥的形式，或者溶解在缓冲液中。
本发明的第三实施方式涉及用于预测肿瘤免疫疗法效果的试剂盒，其包括测试试剂。该实施方式中的试剂盒至少包括根据第三实施方式的测试试剂和信息，例如其中描述使用该测试试剂的测量方法的方案，或用于访问该方案的URL或Q代码。
3.用于预测肿瘤免疫疗法效果的预测装置
本发明的第四实施方式涉及用于预测肿瘤免疫疗法效果的预测装置。具体地，预测装置至少包括处理单元；该处理单元从在体外直接地或间接地与从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞，获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，基于该测量值确定肿瘤细胞是否被损伤，当确定肿瘤细胞已被损伤时，确定肿瘤免疫疗法对患者中的恶性肿瘤有效。
图3示出预测装置10的硬件配置。预测装置10可以连接至输入单元111、输出单元112和存储介质113。预测装置10还可以连接至包括酶标仪等的测量单元30。具体地，预测装置10可以构成用于预测肿瘤免疫疗法效果的预测系统，其中预测装置10直接地或例如经由网络连接至测量单元30。
在预测装置10中，CPU 101、主存储单元102、ROM(只读存储器)103、辅助存储单元104、通信接口(I/F)105、输入接口(I/F)106、输出接口(I/F)107和介质(media)接口(I/F)108经由总线109彼此连接，使得可以进行数据通信。主存储单元102和辅助存储单元104一起可以简称为“存储单元”。
CPU 101是预测装置10的处理单元。预测装置10因执行存储在辅助存储单元104或ROM 103中的计算机程序的CPU 101而发挥功能，以处理所获得的数据。
ROM 103包括掩模型(mask)ROM、PROM、EPROM、EEPROM等，并存储由CPU 101执行的计算机程序和用于执行该程序的数据。CPU 101可以是MPU 101。ROM 103存储启动预测装置10时由CPU 101执行的启动程序和/或用于预测装置10的硬件操作的程序和设置。
主存储单元102包括RAM(随机存取存储器)，例如SRAM或DRAM。主存储单元102用于读取保存在ROM 103中和辅助存储单元104中的计算机程序。当CPU 101执行这些计算机程序时，主存储单元102用作工作空间。
辅助存储单元104包括半导体存储装置，例如硬盘和闪存，或光盘。辅助存储单元104存储要由CPU 101执行的各种计算机程序，例如操作系统和应用程序，以及用于执行计算机程序的各种设置数据。具体地，辅助存储单元104以非易失性方式存储参考值等。
通信I/F 105包括串行接口例如USB、IEEE 1394和RS-232C，并行接口例如SCSI、IDE和IEEE 1284，由D/A转换器或A/D转换器组成的模拟接口，或网络接口控制器(NIC)等。在CPU 101的控制下，通信I/F 105接收来自测量单元30或其它外部装置的数据，并根据需要将预测装置10存储或生成的信息发送至或显示于测量单元30或外部。通信I/F 105可以经由网络与测量单元30或另一外部装置通信。
输入I/F 106包括，例如，串行接口例如USB、IEEE 1394和RS-232C，并行接口例如SCSI、IDE和IEEE 1284，或者由D/A转换器或A/D转换器组成的模拟接口。输入I/F 106接收，例如，来自输入单元111的字符输入、点击或语音输入。接收的输入内容存储在主存储单元102或辅助存储单元104中。
输入单元111包括，例如，触摸屏、键盘、鼠标、写字板和/或麦克风，并在预测装置10上执行字符输入或语音输入。输入单元111可以在外部连接至预测装置10，或者可以与预测装置10集成。
输出I/F 107包括，例如，与输入I/F 106相同的接口。输出I/F 107将由CPU 101生成的信息输出至输出单元112。输出I/F 107将已由CPU 101生成、并已存储在辅助存储单元104中的信息输出至输出单元112。
输出单元112包括，例如，显示器、打印机等，并显示从测量单元30发送的测量结果、预测装置10中的各种操作窗口、分析结果等。
例如，介质I/F 108读取存储在存储介质113中的应用软件。例如，读取应用软件存储在主存储单元102或辅助存储单元104中。介质I/F 108在存储介质113上写入由CPU 101生成的信息。介质I/F 108在存储介质113上写入已由CPU 101生成、并已存储在辅助存储单元104中的信息。
存储介质113包括，例如，软盘、CD-ROM、DVD-ROM等。存储介质113通过软盘驱动器、CD-ROM驱动器、DVD-ROM驱动器等连接至介质I/F 108。存储介质113可以存储用于计算机执行操作的应用程序等。
CPU 101可以经由网络获得控制预测装置10所必需的应用软件和各种设置，而不是从ROM 103或辅助存储单元104中读出它们。应用程序存储在网络上的服务器计算机的辅助存储单元中。预测装置10可以访问服务器计算机，下载计算机程序，并将计算机程序存储在ROM 103或辅助存储单元104中。
ROM 103或辅助存储单元104中已在其中安装有提供图形用户界面环境的操作系统，例如美国微软公司(Microsoft Corporation)制造和销售的Windows(注册商标)。设定根据第二实施方式的应用程序在该操作系统上运行。具体地，预测装置10可以是个人计算机等。
以下，参照图4说明预测装置10的操作。预测装置10的操作由预测装置10的处理单元101根据下文描述的用于预测肿瘤免疫疗法效果的计算机程序来控制。
首先，处理单元101获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，其通过以上第1节中描述的方法获得，并由测试操作者从输入单元111输入(步骤S11)。另外可选地，处理单元101从测量单元30获得用于计算肿瘤细胞毒性活性的信息。该信息是反映与PBMC接触过的肿瘤细胞的活细胞计数的信息(例如，活细胞染色试剂的吸收率)。
接着，处理单元101将步骤S11中获得的测量值与辅助存储单元104中存储的参考值进行比较(步骤S12)。
随后，基于步骤S12中的比较结果，处理单元101确定肿瘤细胞是否已被损伤(步骤S13)。
如果在步骤S13中肿瘤细胞已被损伤(是)，则处理单元101在步骤S14中确定肿瘤细胞被损伤，并进一步在步骤S15中确定肿瘤免疫疗法对于从其收集PMBC的患者中的恶性肿瘤有效。如果在步骤13中肿瘤细胞未被损伤(否)，则处理单元101在步骤S16中确定肿瘤细胞没有被损伤，并进一步在步骤17中确定肿瘤免疫疗法对于从其收集PMBC的患者中的恶性肿瘤无效。
尽管未在图中示出，在步骤S13中，确定肿瘤细胞是否被损伤的步骤可以分成通过测量与肿瘤细胞接触过的外周血单核细胞的肿瘤细胞毒性活性来获得反映肿瘤细胞毒性活性的值的步骤，以及将反映肿瘤细胞毒性活性的值与相应的参考值进行比较并且在测量值高于相应的参考值时确定肿瘤细胞被损伤的步骤。
对于确定肿瘤细胞是否被损伤的步骤的各个实施方式，将以上第1节中确定肿瘤细胞是否被损伤的步骤的说明并入此处。
处理单元101可以从输出单元112输出步骤S14或步骤S16中获得的结果，或者将结果记录在记录介质113中。
4.用于预测肿瘤免疫疗法效果的计算机程序和存储该计算机程序的存储介质
本发明的第五实施方式涉及用于预测肿瘤免疫疗法效果的计算机程序。具体地，本发明的第五实施方式涉及用于控制预测装置的操作的计算机程序，其用于预测以上第3节中描述的肿瘤免疫疗法的效果。
第五实施方式的计算机程序执行的步骤对应于以上第3节中描述的步骤S11至S16。可以将以上第3节中的各个步骤的说明并入第五实施方式中。
此外，本发明的第六实施方式涉及存储计算机程序的存储介质。具体地，计算机程序存储在存储介质中，例如半导体记忆装置，其包括硬盘和闪存，或光盘。存储介质中程序的存储格式可以是任何格式，只要上述装置可以读取程序即可。存储介质中的存储优选为非易失性的。
实施例
参照以下实施例详细描述本发明。然而，本发明在解释本发明时不限于实施例。
I.实施例1：使用外周血单核细胞测量肿瘤细胞毒性活性
1.方法
(1)将U251细胞系悬浮于含有10％FBS的RPMI1640培养基(补充有10％FBS的RPMI1640培养基)中，使得U251细胞系的细胞计数为1×105/mL，从而制备细胞悬液。将细胞悬液以100μL/孔接种在96孔板中，并在37℃在5％CO2气体的存在下在湿式孵育器中孵育24小时。
(2)从肺癌患者中收集外周血(肝素采血)，并使用LymphoprepTM(AlereTechnologies AS)根据所附方案收集含有外周血单核细胞(“PBMC”)的细胞群体。PBMC的收集在以下所述的步骤(3)之前即刻进行。
(3)将PBMC和EphA2-CD3 BiTE(注册商标)添加至在步骤(1)中进行过孵育的96孔板中，使得PBMC的细胞计数为每孔5×104，并且EphA2-CD3 BiTE(注册商标)的终浓度为每孔100ng/mL。对于对照，仅将PBMC添加至在步骤(1)中进行过孵育的96孔板中，从而制备未添加EphA2-CD3 BiTE(注册商标)的孔。添加PBMC和EphA2-CD3 BiTE(注册商标)之后每孔的补充有10％FBS的RPMI培养基的量共计为200μL。添加PBMC和EphA2-CD3 BiTE(注册商标)之后，孵育进行48小时。
(4)孵育之后，将每个孔用补充有10％FBS的RPMI培养基洗涤四次。洗涤孔之后，将培养基从孔中除去。将100μL的补充有10％FBS的RPMI培养基和20μL的CellTiter 96(注册商标)AQueous One Solution Reagent(MTS试剂：Promega Corporation)添加到每个孔中。之后，将96孔微孔板在37℃下在5％二氧化碳的存在下在湿式孵育器中孵育20分钟。
(5)步骤(4)中的孵育完成之后用酶标仪测量96孔微孔板的每个孔在490nm处的吸光度。随后，根据下式计算肿瘤细胞毒性活性。
含有U251细胞系和PBMC的孔的吸光度＝A
含有U251细胞系、PBMC和EphA2-CD3 BiTE的孔的吸光度＝B
肿瘤细胞毒性活性(％)＝[(A-B)/A]×100
2.结果
图5示出每个患者的PBMC的肿瘤细胞毒性活性。因为使用的BiTE是与CD3结合者，因此推定PBMC的肿瘤细胞毒性活性是外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性。从图5可见，肺癌患者的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性取决于个体患者而变化。虽然一些患者表现出百分之几的肿瘤细胞毒性活性，但是一些患者表现出高达80％或更高的肿瘤细胞毒性活性。这表明患者外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性因人而异。
II.实验例1：肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性
根据以下方法，通过从肺癌组织中收集细胞并测量细胞群体的细胞毒性活性，测量肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性。将癌组织转移至6-cm的皿中并切碎。然后将组织置于组织搅动溶液中(将肿瘤解离试剂盒(Tumor Dissociation Kit)(Miltenyi Biotec)添加至HBSS(-)+2％FBS+10mM HEPES中)，并与gentleMACSTM Dissociator(MiltenyiBiotec)一起搅拌，然后在保持在37℃下的孵育器中在旋转孵育器的同时孵育30分钟。之后，将经搅拌的含有细胞的溶液通过70-μm的筛网过滤，以过滤组织残余物，并将滤液以600×g离心10分钟，收集沉淀物。将BD Pharm lyse(BD Biosciences)添加至含有细胞的沉淀物中，并将混合物放置2分钟。然后，放置后将HBSS缓冲液添加至含有细胞的溶液中，并以600×g进行离心10分钟，从而再次收集沉淀物。将30％的Percoll溶液添加至再收集的沉淀物中，将混合物以12000×g离心30秒，从而再次收集沉淀物。将再次收集的沉淀物用HBSS缓冲液洗涤，并以12000×g离心30秒，从而收集组织中的细胞。通过与以上第1节相同的方法测量所收集的细胞的肿瘤细胞毒性活性。因为使用的BiTE是与CD3结合者，因此推定从该肺癌组织收集的细胞的肿瘤细胞毒性活性是肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性。
III.实施例2：T细胞受体组库分析
为了确认同一患者中是否存在肿瘤和外周血中共有的T细胞克隆，对T细胞受体(TCR)进行了组库分析。使用FACSAria(Becton Dickinson)从外周血PBMC和肺癌患者肺癌组织中的细胞中分离CD8+T细胞。从所分离的CD8+T细胞中提取RNA，并使用衔接体-连接(Adaptor-Ligation)PCR对TCR基因进行扩增，然后使用下一代测序仪确定碱基序列。TCR组库分析外包给Repertoire Genesis,Inc.(http://www.repertoire.co.jp/detailed_repertoire.html)。对于TCRα和TCRβ进行组库分析。在患者1-4之间比较PBMC和肺癌组织中T细胞中出现频率最高的30个克隆的组库。
患者1和患者2是肺癌组织中CD8+T细胞具有高肿瘤细胞毒性活性的实例。患者3是中等肿瘤细胞毒性活性的实例。患者4是低肿瘤细胞毒性活性的实例。图6示出结果。
对出现频率最高的30个克隆的组库的比较揭示，在肺癌组织中的T细胞表现出高或中等肿瘤细胞毒性活性的患者1至3，在他们的外周血和肺癌组织中具有多种类型的共有的CD8+T细胞的克隆。相反，在肺癌组织中的T细胞表现出低肿瘤细胞毒性活性的患者4，在外周血和肺癌组织中只有一个共有的CD8+T细胞的克隆。这表明，肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性越高，针对肺癌组织中的肿瘤细胞抗原特异性地增殖的细胞毒性T细胞就越多地出现在外周血中。
IV.实施例3：肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性与外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性
接着，确定肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性与源自PBMC的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性。图7示出结果。相关系数R2和p值使用统计软件JMP确定。p值表示关于是否存在相关性的测试值。
对于比较例，将EphA2-CD3 BiTE添加至从患者和U251细胞系收集的PBMC中，将混合物培养2天，制备培养上清液；测定表现出抗肿瘤活性的干扰素γ(IFNγ)的浓度。然后确定结果与肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性。IFNγ的浓度使用Bio-PlexPro人细胞因子GI 27-plex板(Bio-Rad)测量。
结果表明，肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性与外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性为R2＝0.36，p＝0.009，表明外周血T细胞的细胞毒性活性反映了肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性。在IFNγ中，R2为0.22，p＝0.048，表明IFNγ也与肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性相关。然而，这表明相比于IFNγ，外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性表现出更强的与肺癌组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性的相关性。
从这些结果推断，肿瘤组织中T细胞的肿瘤细胞毒性活性可以通过测量外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性来预测，因此肿瘤免疫疗法的效果可以通过测量外周血中PBMC的肿瘤细胞毒性活性来预测。
V.实施例4：纳武单抗的效果与外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性
1.方法
在18名患者中在根据实施例1测量的源自PBMC的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性与纳武单抗的效果之间进行比较。通过以下描述的方法评估纳武单抗的效果。根据实施例1中的方法，将U251细胞系接种在96孔板中，并在37℃下在5％CO2气体的存在下在湿式孵育器中孵育24小时。将根据实验例1中所述的方法收集的每个患者的肺癌组织中的细胞(细胞计数：5×104/孔)和1μg/ml的纳武单抗(由Ono Pharmaceutical Co.,Ltd提供)，与100ng/ml的EphA2-CD3 BiTE(注册商标)一起，添加至每孔。对于阴性对照，将1μg/ml的人IgG4(Abcam PLC)代替纳武单抗，与100ng/ml的EphA2-CD3 BiTE(注册商标)一起，添加至培养基。使用CellTiter 96(注册商标)AQueous One Solution Reagent(MTS试剂：PromegaCorporation)，根据实施例1中所述的方法测量吸光度，并使用下式计算肿瘤细胞毒性活性。
含有U251细胞系、肺癌组织中的细胞、阴性对照和EphA2-CD3BiTE的孔中的吸光度＝A
含有U251细胞系、肺癌组织中的细胞、纳武单抗和EphA2-CD3BiTE的孔中的吸光度＝B
肿瘤细胞毒性活性(％)＝[(A-B)/A]×100
相关系数R2和p值使用统计软件JMP确定。p值表示关于是否存在相关性的测试值。
2.结果
图8A示出纳武单抗的效果与外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性之间的相关性。R2为0.27，p＝0.028，表明纳武单抗的效果与PBMC的肿瘤细胞毒性活性相关。将患者分成2组：以从表现出最高的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性的患者开始的顺序，一组包括9名患者；另一组包括其余9名患者。根据ROC曲线确定的暂定截断值(tentative cutoff value)为28％。在这两组之间进行纳武单抗效果的显著性差异测试；p值为0.0005，表明在具有较高的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性的组中，纳武单抗的效果显著更高(图8B)。
这表明使用PBMC测量的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性与肿瘤免疫疗法的效果高度相关。此外，这表明外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性可用作肿瘤免疫疗法效果的评估标志。
VI.实施例5：外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性与肿瘤免疫疗法的效果之间的相关性
接着，考察源自肺癌患者PBMC的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性与肿瘤免疫疗法的效果之间的相关性。根据实施例1测量从患者收集的PBMC的肿瘤细胞毒性活性，然后选择3名肿瘤细胞毒性活性为25％或更高的患者。观察这3名患者中因使用抗-PD-1抗体的肿瘤免疫疗法造成的肿瘤大小的减小，治疗时间超过140天；即长期治疗是可能的。肿瘤大小的减小和持续治疗表明肿瘤免疫疗法是有效的。
目前，当确定是否应该应用肿瘤免疫疗法时，使用肿瘤组织中表达PD-L1的细胞的阳性率作为指标。因此，测量3名患者的肿瘤组织中表达PD-L1的肺癌细胞的阳性率。尽管两名患者的阳性率达到50％或更高，其余一名患者表现出显著低至2％的阳性率。通过进行PD-L1蛋白质的免疫染色(免疫抗体技术)来评估表达PD-L1细胞的阳性率。对于仅具有2％表达PD-L1的细胞的患者，从PD-L1蛋白质的免疫染色无法预测肿瘤免疫疗法是否有效。
然而，通过测量源自患者PBMC的外周血T细胞的肿瘤细胞毒性活性，可以确定仅具有2％表达PD-L1的细胞的患者的外周血T细胞是否损伤肿瘤细胞。实际上，在这名患者中观察到了肿瘤免疫疗法的效果。因此，根据本公开的用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法将能够预测到，即使对于表达PD-L1的细胞阳性率低的患者，肿瘤免疫疗法是否适用。而且，比起PD-L1蛋白质的免疫染色，根据本公开的用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法将能够以更高的检测率检测到肿瘤免疫疗法对其有效的患者。
附图标记的说明
101 处理单元
10 预测装置

Claims (11)

1.一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的方法，所述方法包括：
步骤1：使从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞在体外直接地或间接地与肿瘤细胞接触，
步骤2：确定在步骤1中与所述外周血单核细胞接触过的所述肿瘤细胞是否被损伤，和
步骤3：当在步骤2中确定所述肿瘤细胞已被损伤时，确定所述肿瘤免疫疗法针对所述患者中的所述恶性肿瘤有效。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤1中，使从作为恶性肿瘤治疗对象的所述患者收集的所述外周血单核细胞在体外经由接合剂间接地与所述肿瘤细胞接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中确定所述肿瘤细胞是否被损伤的所述步骤包括：
通过测量与所述肿瘤细胞接触过的所述外周血单核细胞的肿瘤细胞毒性活性来获得反映所述肿瘤细胞毒性活性的值的步骤，和
将反映所述肿瘤细胞毒性活性的所述值与相应的参考值进行比较、并且在所述值高于所述相应的参考值时确定所述肿瘤细胞被损伤的步骤。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述接合剂是双特异性分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述双特异性分子含有与T细胞表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域和与所述肿瘤细胞的表面抗原的至少一个成员结合的抗原结合结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是源自恶性肿瘤的培养细胞系。
7.一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂，其用于进行权利要求2-6中任一项所述的方法，
所述测试试剂包括接合剂。
8.一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的测试试剂盒，所述测试试剂盒包括权利要求7所述的测试试剂。
9.一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的计算机程序，所述计算机程序使计算机执行以下步骤：
从在体外直接地或间接地与从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞，获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，
基于所述测量值确定肿瘤细胞是否被损伤，和
当在先前步骤中确定所述肿瘤细胞已被损伤时，确定所述肿瘤免疫疗法针对所述患者中的所述恶性肿瘤有效。
10.一种存储介质，其中存储权利要求9所述的计算机程序。
11.一种用于预测肿瘤免疫疗法效果的预测装置，所述预测装置至少包括处理单元，其中所述处理单元
从在体外直接地或间接地与从作为恶性肿瘤治疗对象的患者收集的外周血单核细胞接触过的肿瘤细胞，获得肿瘤细胞毒性活性的测量值，
基于所述测量值确定所述肿瘤细胞是否被损伤，和
当确定所述肿瘤细胞已被损伤时，确定所述肿瘤免疫疗法针对所述患者中的所述恶性肿瘤有效。
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