CN103298928B - 用于激活辅助性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于激活辅助性T细胞的方法，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的步骤，其中所述WT1肽具有与以下任何MHC？II类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子等。
Description
技术领域
本发明涉及用于激活辅助性T细胞的方法及用于其的组合物，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的步骤，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；涉及用于激活细胞毒性T细胞的方法；涉及细胞毒性T细胞(CTL)的激活诱导物；涉及通过激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞来治疗和/或预防癌症的药物组合物等。
背景技术
WT1基因(Wilms’肿瘤1基因)被鉴定为Wilms’肿瘤(童年期肾癌)的致病基因，且该基因编码具有锌指结构的转录因子(非专利文献1和2)。随后的研究显示，上述基因在造血器官肿瘤或实体癌中充当癌基因(非专利文献3-6)。
已经表明，通过使用具有编码WT1蛋白的部分氨基酸序列的肽来体外刺激外周血单核细胞，诱导了对该肽特异的细胞毒性T细胞(CTL)，且这些CTL损伤内源性表达WT1的造血器官肿瘤或实体癌的癌细胞。CTL识别以与MHCI类分子结合的复合物形式的上述肽，并因此该肽根据MHCI类的亚型不同(专利文献1-4和非专利文献7)。
在另一方面，为有效诱导CTL，对癌抗原特异的辅助性T细胞的存在是重要的(非专利文献8)。通过识别抗原呈递细胞上的MHCII类分子与抗原肽的复合物来诱导和激活辅助性T细胞。激活的辅助性T细胞通过产生细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素来帮助B细胞的增殖、分化和成熟。因为所述辅助性T细胞具有通过促进B细胞和T细胞的增殖和激活来激活免疫系统的功能，所以建议在癌症免疫治疗中通过MHCII类-结合抗原肽增强辅助性T细胞的功能以增强癌症疫苗的作用是有用的(非专利文献9)。
最近显示，可与多种MHCII类分子结合并激活辅助性T细胞的非选择性(promiscuous)辅助性肽存在于具有编码WT1蛋白的部分氨基酸序列的特定肽(在本说明书中以下亦称为WT1肽)中(专利文献5和6)。然而，由于MHCII类分子的种类多，证实是否WT1肽亦对其他MHCII类分子具有作用是非常困难的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公布号WO2003/106682
专利文献2：国际公布号WO2005/095598
专利文献3：国际公布号WO2007/097358
专利文献4：国际申请号PCT/JP2007/074146
专利文献5：国际公布号WO2005/045027
专利文献6：国际公布号WO2008/105462
非专利文献
非专利文献1：DanielA.Haber等,Cell.1990年6月29日;61(7):1257-69
非专利文献2：CallKM等,Cell.1990年2月9日;60(3):509-20
非专利文献3：MenkeAL等,IntRevCytol.1998;181:151-212.综述
非专利文献4：YamagamiT等,Blood.1996年4月1日;87(7):2878-84
非专利文献5：InoueK等,Blood.1998年4月15日;91(8):2969-76
非专利文献6：TsuboiA等,LeukRes.1999年5月;23(5):499-505
非专利文献7：OkaY等,Immunogenetics.2000年2月;51(2):99-107
非专利文献8：GaoFG等,CancerRes.2002年11月15日;62(22):6438-41
非专利文献9：ZengG,JImmunother.2001年5月;24(3):195-204
发明的公开
发明所要解决的问题
因此，本发明所要实现的目的是，通过将特定的WT1肽施用给广泛的MHCII类分子-阳性受试者，提供用于激活辅助性T细胞的方法、用于激活细胞毒性T细胞的方法，提供细胞毒性T细胞的激活诱导物，提供用于治疗/预防癌症的药物组合物等。
用于解决问题的手段
在这些背景下，本发明人已仔细研究并发现，具有氨基酸序列LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis的肽与以下分子结合：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子和HLA-DPB1*0301分子，并激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞。因此，完成本发明。
本发明提供：
(1)用于激活辅助性T细胞的方法，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的步骤，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；
(2)(1)的方法，其中所述WT1肽具有与以下至少2种MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子和HLA-DPB1*0301分子；
(3)(1)或(2)的方法，其中所述WT1肽还具有与以下分子结合的能力：HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子和/或HLA-DPB1*0901分子；
(4)(1)-(3)中任一项的方法，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多肽的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的；
(5)(1)-(4)中任一项的方法，其中所述WT1肽是包含氨基酸序列LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis(SEQIDNO:2)的肽、其变体或修饰物；
(6)用于通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的包含WT1肽的组合物，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；
(7)(6)的组合物，其中所述WT1肽具有与以下至少2种MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子和HLA-DPB1*0301分子；
(8)(6)或(7)的组合物，其中所述WT1肽还具有与以下分子结合的能力：HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子和/或HLA-DPB1*0901分子；
(9)(6)-(8)中任一项的组合物，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的；
(10)(6)-(9)中任一项的组合物，其中所述WT1肽是包含氨基酸序列LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis(SEQIDNO:2)的肽、其变体或修饰物；
(11)呈递包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物的抗原呈递细胞，其中所述MHCII类分子是以下任何MHCII类分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；
(12)识别包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物的辅助性T细胞，其中所述MHCII类分子是以下任何MHCII类分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；
(13)通过(11)的辅助性T细胞激活的细胞毒性T细胞；
(14)用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含(6)-(10)中任一项的组合物、(11)的抗原呈递细胞、(12)的辅助性T细胞或(13)的细胞毒性T细胞中的任一种作为活性成分；
(15)用于激活细胞毒性T细胞的药物组合物，其包含WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞中的任一种作为活性成分，并将其给予具有以下任何MHCII分子的受试者：HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、HLA-DPB1*0301分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子或HLA-DRB4*0101分子；
(16)与WT1肽特异性结合的抗体，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子；
(17)用于测定受试者中WT1-特异性辅助性T细胞的存在或量的方法，所述受试者对于以下任何MHCII类分子阳性：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，所述方法包括以下步骤：
(a)使用WT1肽刺激获自受试者的样品，和
(b)测定细胞因子或辅助性T细胞的存在或量，其中细胞因子或辅助性T细胞的存在或量的增加显示WT1-特异性辅助性T细胞的存在或量。
发明的效果
根据本发明，通过将WT1肽施用给广泛的具有以下任何MHCII类分子的受试者：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，从而使得辅助性T细胞和细胞毒性T细胞能够在具有这样的MHCII类分子的受试者中体内和体外激活，并治疗和预防癌症等，获得了用于激活辅助性T细胞的方法，用于其的组合物，用于激活细胞毒性T细胞的方法，用于其的组合物，细胞毒性T细胞的激活诱导物，通过激活辅助性T细胞和细胞毒性T细胞来治疗和/或预防癌症的药物组合物等。
附图简述
图1显示将诱导自源自供体1(HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-和DRB4*0103-阳性)的PMBC的T细胞与源自多种供体的用WT1-332脉冲的PBMC共培养后，通过测量IFN-γ量获得的结果。在该图中，纵坐标表示共培养后上清液中的IFN-γ量(pg/mL)。在该图中，横坐标表示HLA-DRB1、3和4分子的类型，其在多种供体中为阳性。
图2显示将诱导自源自供体2(HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性)的PMBC的T细胞与源自多种供体的用WT1-332脉冲的PBMC共培养后，通过测量IFN-γ量获得的结果。在该图中，纵坐标表示共培养后上清液中的IFN-γ量(pg/mL)。横坐标表示HLA-DRB1、3和4分子的类型，其在多种供体中为阳性。
图3显示将诱导自源自供体3(HLA-DRB1*0401/0405-和DRB4*0102/0103-阳性)的PMBC的T细胞与源自多种供体的用WT1-332脉冲的PBMC共培养后，通过测量IFN-γ量获得的结果。在该图中，纵坐标表示共培养后上清液中的IFN-γ量(pg/mL)。横坐标表示HLA-DRB1和4分子的类型，其在多种阳性供体中为阳性。
图4显示将诱导自源自供体4(HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性)的PMBC的T细胞与源自多种供体的用WT1-332脉冲的PBMC共培养后，通过测量IFN-γ量获得的结果。在该图中，纵坐标表示共培养后上清液中的IFN-γ量(pg/mL)。横坐标表示HLA-DRB1、3和4分子的类型，其在多种阳性供体中为阳性。
图5显示HLAII类单体蛋白(DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1501、DRB1*1502、DRB1*0803、DRB1*0901和DRB4*0101)与多种肽特异性缔合。在该图中，纵坐标表示保留时间(分钟)的变化程度。横坐标表示HLAII类单体蛋白的类型。另外，柱状图显示所加入的肽的类型[从左起，阴性对照(□)、阳性对照(■)和WT1-332(阴影的□)]。
图6显示当诱导自来源于健康血液供体(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501和0901中至少一个的总计42个供体)的PBMC的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性Th1的比例(CD4-阳性细胞/细胞内IFN-γ-阳性细胞的比例)时间依赖性地并显著地增加。在该图中，纵坐标表示活细胞中CD4-阳性细胞的数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞的数量的比例(%)，和横坐标表示培养天数(天)。另外，符号“●”表示在通过加入WT1-332诱导的样品中的比例(WT1-332诱导组)，和符号“○”表示在通过加入溶剂诱导的样品中的比例(对照)(溶剂诱导组)。
图7显示当诱导自来源于健康血液供体(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501和0901中至少一个的总计42个供体)的PBMC的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性CTL细胞的数量(CD8-阳性细胞/IFN-γ-阳性细胞的比例)时间依赖性地并显著地增加。在该图中，纵坐标表示活细胞中CD8-阳性细胞的数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞的数量的比例(%)，和横坐标表示培养天数(天)。另外，符号“●”表示在通过加入WT1-332诱导的样品中的比例(WT1-332诱导组)，和符号“○”表示在通过加入溶剂诱导的样品中的比例(对照)(溶剂诱导组)。
图8显示在图6和图7中WT1-332-特异性Th1被诱导的17个样品(供体21-37)的HLA-DR-限制性。在各样品中，当将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，观察到WT1-332-特异性IFN-γ的产生，但当加入抗-HLA-DR抗体培养细胞时，抑制了IFN-γ的产生。这显示由WT1-332诱导的T细胞是HLA-DR-限制的。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体21-37)，和横坐标表示产生的IFN-γ量(pg/mL)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后产生的IFN-γ量，符号“阴影的□”表示WT1-332+抗-HLA-DR抗体刺激后产生的IFN-γ量，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后产生的IFN-γ量。
图9显示当在图6和图7中具有诱导的HLA-DR-限制的WT1-332-特异性Th1的17个样品(供体21-37)的每一个中，将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性Th1细胞(CD4-阳性细胞/细胞内IFN-γ-阳性细胞)数量的比例增加。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体21-37)，和横坐标表示活细胞中CD4-阳性细胞数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞数量的比例(%)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后的比例，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后的比例。
图10显示当在图6和图7中具有诱导的HLA-DR-限制的WT1-332-特异性Th1的17个样品(供体21-37)的每一个中，将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性CTL细胞(CD8-阳性细胞/细胞内IFN-γ-阳性细胞)数量的比例增加。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体21-37)，和横坐标表示活细胞中CD8-阳性细胞数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞数量的比例(%)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后的比例，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后的比例。
图11显示在图6和图7中WT1-332-特异性Th1被诱导的9个样品(供体38-46)的HLA-DP-限制性。在各样品中，当将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，观察到WT1-332-特异性IFN-γ的产生，但当加入抗-HLA-DR抗体培养细胞时，且同样当加入抗-HLA-DQ抗体培养细胞时，均未抑制IFN-γ的产生。这显示由WT1-332诱导的T细胞是HLA-DP-限制的。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体38-46)，和横坐标表示产生的IFN-γ量(pg/mL)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后产生的IFN-γ量，符号“阴影的□”表示WT1-332+抗-HLA-DR抗体刺激后产生的IFN-γ量，符号“虚线的□”表示WT1-332+抗-HLA-DQ抗体刺激后产生的IFN-γ量，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后产生的IFN-γ量。
图12显示当在图6和图7中具有诱导的HLA-DP-限制的WT1-332-特异性Th1的9个样品(供体38-46)的每一个中，将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性Th1细胞(CD4-阳性细胞/细胞内IFN-γ-阳性细胞)数量的比例增加。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体38-46)，和横坐标表示活细胞中CD4-阳性细胞数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞数量的比例(%)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后的比例，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后的比例。
图13显示当在图6和图7中具有诱导的HLA-DP-限制的WT1-332-特异性Th1的各9个样品(供体38-46)中，将通过加入WT1-332进行诱导后第14天的T细胞用WT1-332刺激时，WT1-332-特异性CTL细胞(CD8-阳性细胞/细胞内IFN-γ-阳性细胞)数量的比例增加。在该图中，纵坐标表示供体编号(供体38-46)，和横坐标表示活细胞中CD8-阳性细胞数量/细胞内IFN-γ-阳性细胞数量的比例(%)。另外，符号“■”表示WT1-332刺激后的比例，符号“□”表示溶剂(对照)刺激后的比例。
实施发明的方式
在一个方面，本发明提供用于激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的方法，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的步骤，其中WT1肽具有与MHCII类分子结合的能力。在本发明中，可通过经过激活辅助性T细胞的步骤来进行激活细胞毒性T细胞的步骤。另外，本发明中使用的WT1肽是具有与以下任何MHCII类分子结合的能力的WT1肽：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。此外，本发明使用的WT1肽可为具有与上述MHCII类分子中的至少两种或更多种MHCII类分子结合的能力的WT1肽。同样，本发明使用的WT1肽可具有与任何MHCII类分子(例如HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子)结合的能力。
在本发明中，WT1肽可为具有SEQIDNO:1中描述的人WT1蛋白的部分氨基酸序列的肽。本发明的肽在其氨基酸序列和长度上无特别限制，只要该肽具有上述特征即可。然而，太长的肽对蛋白酶作用敏感，而太短的肽不能与肽容纳槽(peptideaccommodatinggroove)很好结合。本发明肽的长度是以下的长度：优选10-25个氨基酸、更优选15-21个氨基酸、进一步优选16-20个氨基酸，例如16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸或19个氨基酸。本发明肽的具体实例是包含以下氨基酸序列的那些肽：LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis(SEQIDNO:2)。
另外，本发明中使用的WT1肽包括上述肽的变体。变体可包含，例如选自具有以下氨基酸序列的肽：在SEQIDNO:2描述的氨基酸序列中数个氨基酸(例如1-9、优选1-5、1-4、1-3、更优选1-2个氨基酸、进一步优选1个氨基酸)被取代、缺失或添加的氨基酸序列。可在任何位置上并用任何类型的氨基酸进行肽的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例包括Glu残基取代为Asp残基、Phe残基取代为Tyr残基、Leu残基取代为Ile残基、Ala残基取代为Ser残基、His残基取代为Arg残基等。优选地，氨基酸的添加或缺失可在肽的N端和C端进行，但也可在内部序列中进行。本发明肽的优选具体实例是具有SEQIDNO:2的那些肽。在这一点上，任何上述肽必须具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，并必须激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞(本文亦称为CTL)。在本说明书中，上述WT1肽亦称为“WT1-332”。另外，人MHC分子通常称为HLA分子，并因此，MHC在本说明书中用作HLA的同义词。
此外，本发明的肽可为通过修饰上述氨基酸序列所获得的那些肽。可通过已知的方法修饰上述氨基酸序列的氨基酸残基。这样的修饰可为，例如，氨基酸残基侧链的官能团上的酯化、烷基化、卤化、磷酸化等。同样，可使多种物质与包含上述氨基酸序列的肽的N-端和/或C-端结合。例如，氨基酸、肽、其类似物等可与该肽结合。例如，可加入组氨酸标签，或者可与蛋白例如硫氧还蛋白一起形成融合蛋白。备选地，可将可检测性标签与WT1肽结合。如果这些物质与本发明的肽结合，那么可例如通过体内酶等或者通过例如细胞内加工的方法处理它们以最终产生由上述氨基酸序列组成的肽，该肽作为与MHCII类分子的复合物被呈递至细胞表面上，藉此能够获得对辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的诱导效应。这些物质可为调节本发明肽的溶解度的那些物质，改善肽的稳定性例如蛋白酶抗性的那些物质，允许本发明肽特异性递送例如至给定组织或器官的那些物质，或者具有增强抗原呈递细胞的摄取效率作用或其他作用的那些物质。这些物质还可为增加诱导CTL能力的那些物质，例如除本发明肽以外的辅助性肽。
可使用本领域通常使用的方法或者其改良方法合成本发明使用的WT1肽。这样的合成方法公开于，例如PeptideSynthesis,Interscience,NewYork,1966;TheProteins,第2卷,AcademicPressInc.,NewYork,1976;PeptideSynthesis,MaruzenCo.,Ltd.,1975;BasisandExperimentsofPeptideSynthesis,MaruzenCo.,Ltd.,1985;DevelopmentofMedicines(continuation),第14卷,PeptideSynthesis,HirokawaShotenCo.,1991等。根据编码肽的核苷酸序列的信息，本发明所用的肽还可用基因工程技术制备。这样的基因工程技术为本领域技术人员所熟知。可根据例如文献中描述的那些方法进行这样的技术(MolecularCloning,T.Maniatis等,CSHLaboratory(1983);DNACloning,DM.Glover,IRLPRESS(1985))。
本发明还涉及编码上文所述的WT1肽的多核苷酸序列。编码WT1肽的多核苷酸序列可为DNA序列或RNA序列。在本发明中，可使用这样的多核苷酸序列代替WT1肽。可通过将其整合到合适的载体中来使用这样的多核苷酸序列。载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等，例如pUC118、pUC119、pBR322、pCR3、pYES2、pYEUra3、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMV、pAcSGHisNT-A、λZAPII、λgt11等。根据需要，载体可包含，因子例如表达诱导型启动子、编码信号序列的基因、用于选择的标志物基因和终止子。将这些基因导入细胞或活体的方法、表达它们的方法等是本领域技术人员已知的。
本发明使用的抗原呈递细胞是可将包含上述WT1肽的抗原肽与MHCII类分子一起呈递给辅助性T细胞的那些细胞，并意指，例如，树突细胞、外周血单核细胞等。因此，本发明使用的抗原呈递细胞来源的受试者必须具有与加入的WT1肽所结合的MHCII类分子相同的分子(例如，以下MHCII分子中的任何一个或多个：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、HLA-DPB1*0301分子等)。
在本发明中，将WT1肽加入抗原呈递细胞可直接通过加入WT1肽进行，或者间接通过加入编码WT1肽的多核苷酸或加入包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或通过加入包含该表达载体的细胞进行。可通过本领域已知的方法进行上述加入。可通过本领域技术人员公知的技术获得上述编码WT1肽的多核苷酸、包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的细胞。具体地，基于上述WT1肽的氨基酸序列(例如，SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列)，可确定本发明中使用的多核苷酸。可例如通过DNA或RNA合成、PCR法等制备上述多核苷酸。同样，可根据表达载体导入到其中的宿主的目的、类型等，合适地选择包含上述多核苷酸的表达载体的类型、除上述多核苷酸序列外所包含的序列等。表达载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等。可例如通过转化宿主细胞来制备包含表达载体的细胞。宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞等。用于转化宿主细胞的方法可为常规方法，并可使用，例如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法和用于基因转移的脂质。
通常，当T细胞表面上的TCR-CD3复合物通过抗原呈递细胞表面上的MHCII类分子识别抗原肽时，激活辅助性T细胞，并通过抗原呈递细胞表面上的整联蛋白配体刺激T细胞表面上的整联蛋白。本说明书中辅助性T细胞的激活不仅包括辅助性T细胞的激活，还包括辅助性T细胞的诱导和增殖。本发明的激活的辅助性T细胞还可为未分化的T细胞(例如，幼稚T细胞)等。激活的辅助性T细胞具有通过促进B细胞和细胞毒性T细胞的诱导、增殖和激活来激活免疫系统的功能。因此，本发明的方法可用作用于治疗癌症等的辅助治疗。使用本发明的方法体外激活的辅助性T细胞还可用于治疗或预防癌症等，或者作为其中的辅助剂。可例如通过测量细胞因子例如干扰素(例如干扰素-γ等)和白细胞介素的产生或分泌来评价辅助性T细胞的激活。
在另一方面，本发明通过将WT1肽加入抗原呈递细胞提供用于激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的组合物。在本发明中，可通过经过辅助性T细胞的激活来进行细胞毒性T细胞的激活。虽然在本发明的组合物中可例示WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该核苷酸的载体和包含该载体的细胞，但是可使用任何分子，只要它们是能够在抗原呈递细胞表面上呈递作为抗原肽的WT1肽的因子即可。可如上文所述通过本领域技术人员公知的方法获得这些因子。
如上文所述，本发明使用的WT1肽具有与任何以下分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明使用的WT1肽还可具有与上述MHCII类分子中的至少两种或更多种MHCII类分子结合的能力。此外，本发明使用的WT1肽可具有与HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子中的任何MHCII类分子结合的能力。
当将本发明的组合物给予具有以下任何一种或多种MHCII分子的受试者时：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，通过激活受试者的辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞来激活免疫系统。此外，WT1基因在多种癌症和肿瘤中是高度表达的，例如，在血液恶性肿瘤(例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤)以及实体癌(例如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌)中，并因此，本发明的组合物可用作用于治疗或预防癌症的辅助剂。备选地，可使用使用本发明的组合物激活的辅助性T细胞、细胞毒性T细胞等，例如作为用于治疗上述癌症的辅助剂。
除了上述WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和包含该载体的细胞外，本发明的组合物还可包含，例如载体、赋形剂、添加剂等。本发明组合物中包含的上述WT1肽等以WT1肽特异性方式激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞，并因此，该组合物可包含已知的MHCI类限制性WT1肽，或者可与这样的肽一起施用。
可根据条件(例如所需的辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞激活程度以及抗原呈递细胞的状态)，合适地选择用于施用本发明组合物的方法。施用方法包括，例如，通过皮内给药、皮下给药、肌内给药、静脉内给药、经鼻给药、口服给药等给予受试者，或者加入到抗原呈递细胞的培养液，但不限于此。可根据条件(例如所需的辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞激活程度以及抗原呈递细胞的状态)，合适地选择本发明组合物中包含的上述WT1肽等的量、组合物的形式、组合物的施用频率等。
在另一方面，本发明提供用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的步骤，其中该WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明的方法通过激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞来激活受试者的免疫系统，藉此治疗或预防受试者的癌症。在本发明的方法中，可通过经过激活辅助性T细胞的步骤来进行激活细胞毒性T细胞的步骤。将WT1肽加入抗原呈递细胞可直接通过加入WT1肽进行，或者间接通过加入编码WT1肽的多核苷酸或加入包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或通过加入包含该表达载体的细胞进行。如上所述，可通过本领域技术人员公知的方法获得上述编码WT1肽的多核苷酸、包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的细胞。可对其施用本发明方法的受试者是相对于以下任何MHCII类分子为阳性的那些受试者：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明可应用的癌症可为任何癌症，并包括，例如造血器官肿瘤(例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤)以及实体癌(例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌)。本发明的方法还可与使用MHCI类分子-限制性WT1肽或其药物组合物治疗或预防癌症的方法一起使用。
在另一方面，本发明提供WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和包含该载体的细胞用于制备上述组合物的用途。
在又一方面，本发明涉及含有上述WT1肽、编码WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体或包含该载体的细胞的试剂盒，所述试剂盒通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞，其中WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。优选地，该试剂盒用于在上述方法中激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。本发明的试剂盒除了WT1肽外，还可包括例如抗原呈递细胞的获得工具、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞活性的评价工具等。通常，试剂盒带有说明书。可使用本发明的试剂盒有效激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。
在另一方面，本发明提供抗原呈递细胞，其呈递包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物。在这种情况下，MHCII类分子可为以下任何分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，或者可为上述MHCII类分子中的至少两种或更多种分子。可使用本领域技术人员已知的技术制备本发明的抗原呈递细胞。例如，它们可通过以下进行制备：分离来自癌症患者的具有抗原呈递能力的细胞，然后用上述WT1肽(例如，具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的肽)或用编码WT1肽的多核苷酸脉冲分离的细胞，或者将包含该多核苷酸的表达载体导入细胞，藉此使得包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物能够在细胞表面上呈递(CancerImmunol.Immunother.46:82,1998;J.Immunol.,158:第1796页,1997;CancerRes.,59:第1184页,1999;CancerRes.,56:第5672页,1996;J.Immunol.,161:第5607页,1998;J.Exp.Med.,184:第465页,1996)。在本说明书中，具有抗原呈递能力的细胞不受限制，只要它们表达能够在细胞表面上呈递WT1肽的MHCII类分子即可，并优选具有高的抗原呈递能力的外周血单核细胞或树突细胞。另外，本发明抗原呈递细胞的存在是通过细胞毒性T细胞活性的增加所确定的，细胞毒性T细胞活性的增加是通过干扰素-γ量的增加所确定的，如实施例中所示。本发明的抗原呈递细胞作为药物组合物的活性成分有效用于细胞治疗(例如，树突细胞治疗)。
在另一方面，本发明提供辅助性T细胞，其识别包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物。在这种情况下，MHCII类分子可为以下任何分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，或者可为上述MHCII类分子中的至少两种或更多种分子。本发明的辅助性T细胞包括，例如，识别包含由SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列组成的肽的抗原肽与以下任何MHCII类分子的复合物的那些辅助性T细胞：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明的辅助性T细胞可由本领域技术人员使用本领域已知的技术容易地制备和获得(Iwata,M.等,Eur.J.Immunol,26,2081(1996))。
在另一方面，本发明提供细胞毒性T细胞，其由识别包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物的辅助性T细胞激活。本发明的细胞毒性T细胞包括，例如，由识别包含由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的肽的抗原肽与以下任何MHCII类分子的复合物的辅助性T细胞激活的那些细胞毒性T细胞：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明的细胞毒性T细胞可由本领域技术人员使用已知的技术容易地制备。例如，它们通过以下进行制备：分离来自患者的外周血淋巴细胞，并在体外用肽(例如，具有SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列的肽)、编码该肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体刺激它们(JournalofExperimentalMedicine1999,190:1669)。如此制备的细胞毒性T细胞可用作用于治疗或预防癌症等的药物组合物的活性成分。在本说明书的实施例中，通过给予WT-332，在来源于具有特定MHC类分子的受试者的样品中观察到诱导细胞毒性T细胞的活性。这显示呈递由WT1肽组成的抗原肽与MHCII类分子的复合物的抗原呈递细胞存在于外周血单核细胞中，并显示呈递该复合物的抗原呈递细胞、特异性识别它们的辅助性T细胞和由该辅助性T细胞诱导的细胞毒性T细胞的存在。
在另一方面，本发明提供具有包含WT1肽的上述抗原肽和MHCII类分子的HLA四聚体。MHCII类分子可为以下任何分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子或HLA-DPB1*0901分子，或者可为上述MHCII类分子中的至少两种或更多种分子。在本说明书中，HLA四聚体意指四聚化产物，其通过将由HLA蛋白与肽缔合所获得的复合物(HLA单体)生物素化，然后将生物素化产物与抗生物素蛋白结合而获得。包含多种抗原肽的HLA四聚体是市售可得的，并可容易制备本发明的HLA四聚体(Science279:2103-2106(1998),Science274:94-96(1996))。本发明的四聚体优选用荧光标记，以便可通过已知的检测手段(例如流式细胞术和荧光显微镜)容易地选择或检测本发明的结合的辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。本发明的HLA四聚体不限于四聚体，并视需要可使用多聚体例如五聚体和树状聚体。在本说明书中，多聚体意指多聚化产物，其是通过使用已知的技术将两个或更多个复合物(HLA单体)结合获得的，该复合物由HLA蛋白与肽结合获得。
在另一方面，本发明提供用于激活辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的药物组合物，所述药物组合物包含上述组合物、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或四聚体中的任一种作为活性成分。本发明的药物组合物可包含上述组合物、抗原呈递细胞、辅助性细胞、细胞毒性T细胞或四聚体中的任何一种或多种作为活性成分。本发明的药物组合物可用于治疗或预防癌症。可将本发明的药物组合物施用于表达WT1的多种癌症和肿瘤，例如施用于造血器官肿瘤(例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤)以及实体癌(例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌)。本发明的药物组合物还可用于给予具有MHCII类分子的受试者，MHCII类分子例如HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。本发明的药物组合物可与用于治疗或预防癌症的其他方法或者组合物一起使用。此外，本发明的药物组合物可包含辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的激活剂、增殖剂、诱导剂等，或者可包含已知的MHCI类-限制性WT1肽。
除了活性成分外，本发明的药物组合物还可包含，例如载体、赋形剂等。可根据条件(例如疾病类型、受试者的状态和靶位点)合适地选择本发明药物组合物的给药方法。该方法包括，例如皮内给药、皮下给药、肌内给药、静脉内给药、经鼻给药、口服给药等，但不限于此。可根据条件(例如疾病类型、受试者的状态和靶位点等)合适地选择本发明药物组合物中所包含的上述活性成分量、组合物的剂型、组合物的给药频率等。
在另一方面，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将上述组合物、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或四聚体中的任一种以有效量给予受试者的步骤，其中该受试者具有以下任何MHCII类分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。通过本发明的方法可治疗或预防的癌症是表达WT1的多种癌症和肿瘤，例如，造血器官肿瘤(例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤)以及实体癌(例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌)。本发明的方法可与治疗或预防癌症的其他方法一起使用，例如使用已知的MHCI类分子-限制性WT1肽治疗或预防癌症的方法。
在另一方面，本发明提供上述组合物、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或四聚体中的任一种用于制备上述药物组合物的用途。
在一个方面，本发明涉及与上述WT1肽或编码WT1肽的多核苷酸特异性结合的抗体(在下文中，该抗体亦被称为抗-WT1抗体)。本发明的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。具体地，可提及与具有SEQIDNO:2等中所示的氨基酸序列的肽特异性结合的抗体等。用于制备这样的抗体的方法是已知的，并亦可根据这样的常规方法制备本发明的抗体(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等(主编),1987,JohnWileyandSons(出版),第11.12-11.13章,Antibodies;ALaboratoryManual,Lane,H.D.等(主编),ColdSpringHarberLaboratoryPress(出版),NewYork,1989)。例如，使用具有SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列的肽作为免疫原来免疫非人动物(例如家兔)，并可通过常规方法从动物的血清中获得多克隆抗体。另一方面，在单克隆抗体的情况下，使用本发明所使用的肽(具有SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列的肽)来免疫非人动物(例如小鼠)，并将得到的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤细胞，可由此获得单克隆抗体(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等(主编),1987,JohnWileyandSons(出版),第11.4-11.11章)。还可根据宿主，通过使用多种佐剂加强免疫反应来制备本发明的抗-WT1抗体。这样的佐剂包括矿物质凝胶(例如，弗氏佐剂、氢氧化铝等)、表面活性剂、人佐剂等。本发明的抗-WT1抗体可用于亲和层析、免疫学诊断等。用于免疫学诊断的方法可合适地选自免疫印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测量等。
在另一方面，本发明提供用于测定受试者中WT1肽的存在或量的方法，所述受试者对于以下任何MHCII类分子阳性：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，该方法包括以下步骤：
(a)使获自受试者的样品与上述抗-WT1抗体反应，然后
(b)测定样品中包含的上述抗-WT1抗体的存在或量。
可将获自具有以下任何MHCII类分子的受试者的样品用作上述步骤(a)中使用的样品：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子。上述步骤(a)中使用的样品包括，例如体液和组织(例如血液和淋巴细胞)。本领域技术人员使用已知的技术可合适地获得样品，使其与抗体反应并进行其他步骤。本发明的步骤(b)包括，例如测定上述抗-WT1抗体的定位、位点、量等，并因此本发明可用于癌症的诊断、预后等。上述抗-WT1抗体可被标记。作为标签，可使用已知标签，例如荧光标签和放射性标签。通过标记，可简单和快速地进行WT1肽的存在或量的测定。
在另一方面，本发明涉及用于测定WT1肽的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的上述抗-WT1抗体。本发明的试剂盒除了上述抗-WT1抗体外，还可包含例如获得抗-WT1抗体的工具和评价抗-WT1抗体的工具等。通常，试剂盒带有说明书。通过使用本发明的试剂盒，可在上述测定WT1肽的存在或量的方法中简单和快速地测定WT1肽的存在或量。
在另一方面，本发明提供一种用于测定受试者中WT1-特异性辅助性T细胞或WT1-特异性细胞毒性T细胞的存在或量的方法，所述受试者对于以下任何MHCII类分子阳性：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，该方法包括以下步骤：
(a)使用WT1肽刺激获自受试者的样品，和
(b)测定细胞因子、辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的存在或量，其中细胞因子、辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的存在或量的增加显示WT1-特异性辅助性T细胞或WT1-特异性细胞毒性T细胞的存在或量。
本发明的样品可为任何样品，只要其包含抗原呈递细胞即可，并包括例如，外周血单核细胞、侵袭性淋巴细胞、肿瘤细胞、腹水的细胞、胸腔积液的细胞、脑脊液的细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞等。本发明使用的样品可来源于健康供体或癌症患者。通过使用来源于健康供体的那些细胞，例如可诊断是否供体受癌症影响、是否供体具有癌症的倾向等。通过使用来源于癌症患者的那些细胞，例如可预测是否WT1免疫治疗在癌症患者中有效果等。在本发明的方法中，可在用WT1肽刺激之前和之后培养获得的样品，培养条件可由本领域技术人员合适地确定。可使用已知技术例如电穿孔进行WT1肽对这些细胞的刺激，并可在体外或体内进行。可通过已知方法测定细胞因子的产生、辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的反应的存在、所产生的细胞因子的量或者反应的辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的量。
在另一方面，本发明涉及用于测定WT1肽的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的上述WT1肽。除了上述WT1肽外，本发明的试剂盒还可包含例如获得样品的工具和评价工具例如细胞因子。通常，试剂盒附有说明书。通过使用本发明的试剂盒，可在上述用于测定WT1肽的存在或量的方法中简单和快速地测定WT1肽的存在或量。
将通过实施例的方式详细和具体地描述本发明，但其不应被理解为限制本发明。
实施例1
1.WT1-332-特异性I型辅助性T细胞的诱导
从健康血液供体(供体1：HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-和DRB4*0103-阳性，供体2：HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性，供体3：HLA-DRB1*0401/0405-和DRB4*0102/0103-阳性，供体4：HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性)的外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC(1.5×107细胞)在由45%RPMI-1640(SIGMA)、45%AIM-V(Invitrogen)和10%AB型人血清(MPBiomedicals)组成的培养基中悬浮，并以1.5×106细胞/孔接种于24孔板(第0天)。以10μg/mL浓度将WT1-332(由SEQIDNO:2中描述的氨基酸序列组成的肽)和以10ng/mL浓度将IL-7(PeproTech)加入用PBMC接种的孔中，并于37℃将细胞在5%CO2下培养一周。另外，将分离的PBMC的一部分冷冻保存用于再刺激情况下的抗原呈递细胞。
一周后(在第7天)，进行再刺激。首先，将冷冻保存的PBMC解冻，用10μg/mLWT1-332脉冲，用50μg/mL丝裂霉素C(KyowaHakkoKirinCo.,Ltd.)处理，并以1.0×106-1.6×106细胞/孔接种于新的24孔板。接着，回收培养了一周的细胞，并以1.0×106-1.6×106细胞/孔接种于用抗原呈递细胞接种过的孔中。最后，将IL-7以10ng/mL的浓度加入各孔中，并于37℃在5%CO2下培养细胞。2天后(在第9天)，将各孔中的半量培养液轻轻移除，并将包含40U/mLIL-2(PeproTech)的培养基代替加入到各孔中，继续培养。此后，每隔一天使用包含20U/mLIL-2的培养基进行半量培养液的置换步骤，合适地回收第14天与第21天之间的细胞并将其用于实验。
2.用于限制性等位基因的测定实验的抗原呈递细胞的制备
从健康血液供体(供体5：HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-和DRB4*0103-阳性，供体6：HLA-DRB1*0403/1405-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性，供体7：HLA-DRB1*0403/1201-、DRB3*0101-和DRB4*0103-阳性，供体8：HLA-DRB1*0101/0901-和DRB4*0103-阳性，供体9：HLA-DRB1*1401/1406-和DRB3*0202-阳性，供体10：HLA-DRB1*0803/0901-和DRB4*0103-阳性，供体11：HLA-DRB1*1101/1502-和DRB3*0202-阳性，供体12：HLA-DRB1*0405/1406-、DRB3*0202-和DRB4*0103-阳性，供体13：HLA-DRB1*0401/0405-和DRB4*0102/0103-阳性，供体14：HLA-DRB1*0401/1502-和DRB4*0102-阳性，供体15：HLA-DRB1*0101/0405-和DRB4*0103-阳性，供体16：HLA-DRB1*0901/1501-和DRB4*0103-阳性，供体17：HLA-DRB1*0405/1501-和DRB4*0103-阳性，供体18：HLA-DRB1*1401/1502-和DRB3*0202-阳性，供体19：HLA-DRB1*1403/1502-和DRB3*0101-阳性，供体20：HLA-DRB1*0803/1302-和DRB3*0301-阳性)的外周血中分离PBMC，并用作测定限制性等位基因的实验中所使用的抗原呈递细胞。将各供体的PBMC在-80℃冷冻保存直至使用。
3.IFN-γ的测量(在抗-HLA-DR抗体存在下反应的抑制)
在WT1-332不存在下、在10μg/mLWT1-332存在下、在10μg/mLWT1-332和10μg/mL抗-HLA-DR抗体(BDCo.)存在下，将从供体1-4的PBMC诱导的T细胞培养24小时。培养后，通过ELISA(BDCo.)来定量上清液中的IFN-γ量。结果显示，所有诱导的T细胞识别WT1-332并产生IFN-γ，且该反应是HLA-DR分子-限制的。
4.IFN-γ的测量(限制性等位基因的测定)
使从供体1-4的PBMC诱导的T细胞与用WT1-332脉冲的各适当的抗原呈递细胞反应，并测定所诱导的T细胞的限制性等位基因。
(4-1.来源于供体1的T细胞)
将从供体1的PBMC诱导的T细胞与用10μg/mLWT1-332脉冲的来源于供体5、6、7、8和9的抗原呈递细胞共培养24小时。共培养后，通过ELISA来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图1所示。当与HLA-DR4(DRB1*0403,0406)-阳性抗原呈递细胞共培养时，来源于供体1的T细胞产生IFN-γ，其揭示限制性等位基因是HLA-DRB1*0406。还显示HLA-DRB1*0403可呈递WT1-332并刺激T细胞。
(4-2.来源于供体2的T细胞)
将从供体2的PBMC诱导的T细胞与用10μg/mLWT1-332脉冲的来源于供体10、11、12和9的抗原呈递细胞共培养24小时。共培养后，通过ELISA来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图2所示。当与HLA-DRB3*0202-阳性抗原呈递细胞共培养时，来源于供体2的T细胞产生IFN-γ，其揭示限制性等位基因是HLA-DRB3*0202。
(4-3.来源于供体3的T细胞)
将从供体3的PBMC诱导的T细胞与用10μg/mLWT1-332脉冲的来源于供体13、14、15和10的抗原呈递细胞共培养24小时。共培养后，通过ELISA来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图3所示。当与HLA-DR4(DRB1*0401,0405)-阳性抗原呈递细胞共培养时，来源于供体3的T细胞产生IFN-γ，其揭示HLA-DRB1*0401和0405两者可呈递WT1-332并刺激T细胞。
(4-4.来源于供体4的T细胞)
将从供体4的PBMC诱导的T细胞与用10μg/mLWT1-332脉冲的来源于供体16、11、17、18、19和20的抗原呈递细胞共培养24小时。共培养后，通过ELISA来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图4所示。当与HLA-DRB1*1101-阳性抗原呈递细胞共培养时，来源于供体4的T细胞产生IFN-γ，其揭示限制性等位基因是HLA-DRB1*1101。
实施例2
接着，为了评价WT1-332与MHCII类分子的结合能力，使用HPLC进行7种HLAII类单体蛋白(DRB1*1501、0101、0405、0803、0901、1502或DRB4*0101)与WT1-332的折叠测试。简言之，通过将HLAII类单体蛋白、肽[与各蛋白结合的肽(阳性对照)、不与各蛋白结合的肽(阴性对照)和WT1-332]与折叠缓冲液混合来制备折叠反应溶液。使该溶液在37℃反应后，使用HPLC分析保留时间。通过利用HLAII类单体蛋白与肽的结合所引起的保留时间的变化来评价与WT1-332的折叠。该测试使用的试剂在下表中示出。
(表1：测试中使用的试剂)
表1
HLAII类单体蛋白的制备
在冰上解冻于-80℃冷冻保存的HLAII类单体蛋白。使用稀释缓冲液调整解冻的HLAII类单体蛋白使得它们以0.05mg(1×10-9mol)的量包含在83μL中。
肽溶液的制备
通过电子天平称量约1mg的各肽，将其转移到玻璃管中，并溶解于DMSO中以得到20mg/mL的浓度。
50倍摩尔量的肽溶液的量的计算
使用下述计算公式计算相对于HLAII类单体蛋白为50倍摩尔量的肽的量。
所需要的肽的量：1×10-9mol×50=5×10-8mol(所需要的肽的量)
5×10-8×(肽的分子量)×1,000=(所需要的肽的量)(mg)
(所需要的肽的量)/[肽的纯度/100]=(所加入的肽的量)(mg)
[(所加入的肽的量)/20mg/mL]×1,000=(所加入的肽溶液的量)(μL)。
加入的折叠缓冲液的量的计算
作为折叠缓冲液，加入10%量的HLAII类单体蛋白与肽的混合溶液。使用下述计算公式计算所加入的折叠缓冲液的量。
[83μL(HLAII类单体蛋白的量)+(50-倍摩尔量的肽溶液的量)]×0.1=所加入的折叠缓冲液的量。
使用HPLC分析折叠
以计算的量将肽溶液和折叠缓冲液加入装有HLAII类单体蛋白的玻璃管中，并使混合物在37℃静置过夜。开始HPLC(Waters2695SeparationModule)，并用平衡缓冲液平衡Seperdex200柱。将300μL的平衡缓冲液加入所有样品中并充分混合，将100μL部分的混合物用作样品注射体积以计算保留时间。分析时间为50分钟。HLAII类单体蛋白与肽的折叠的标准是，与对照(仅溶剂)相比，保留时间变化不小于0.1分钟。结果发现，在所测试的7种HLAII类单体蛋白(DRB1*1501、0101、0405、0803、0901、1502或DRB4*0101)中保留时间的变化程度增加不小于0.1分钟(图5)，藉此很明显WT1-332与这些蛋白特异性结合并可作为抗原被呈递。
实施例3
WT1-332-特异性T细胞的诱导
从健康血液供体(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501和0901中至少一个的总计42个供体)的外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC分为每份1.2×107个细胞，将其在由45%RPMI-1640(SIGMA)、45%AIM-V(Invitrogen)和10%AB型人血清(MPBiomedicals)组成的培养基中悬浮，并以1.5×106细胞/孔接种于24孔板(在第0天)。以20μg/mL浓度将WT1-332和以10ng/mL浓度将IL-7(PeproTech)加入用PBMC接种的孔中，并将细胞于37℃在5%CO2下培养一周。将以10μM的终浓度的溶剂(10mM醋酸)代替WT1-332加入的组(溶剂诱导组)设为对照组。另外，将分离的PBMC的一部分冷冻保存用于再刺激时的抗原呈递细胞。
一周后(在第7天)，进行再刺激。首先，将冷冻保存的PBMC解冻，用20μg/mLWT1-332或10μM醋酸溶剂脉冲，用50μg/mL丝裂霉素C(KyowaHakkoKirinCo.,Ltd.)处理，并以1.0×106-1.6×106细胞/孔接种于新的24孔板。接着，回收培养了一周的细胞，并以1.0×106-1.6×106细胞/孔接种于用抗原呈递细胞接种过的孔中。最后，将IL-7以10ng/mL的浓度加入各孔中，并于37℃在5%CO2下培养细胞。2天后(在第9天)，将各孔中的半量培养液轻轻移除，并将包含40U/mLIL-2(PeproTech)的培养基代替加入到各孔中，继续培养。此后，每隔一天使用包含20U/mLIL-2的培养基进行半量培养液的置换步骤。
在第0天、第7天和第14天回收细胞并将其用于测量IFN-γ的实验。
IFN-γ的测量[细胞内细胞因子染色(ICS)]
通过第0天将制备后的PBMC以及第7天和第14天将从WT1-332诱导组和溶剂诱导组回收的活细胞接种于96孔U底板，并加入终浓度为20μg/mL的包含WT1-332的培养基，进行抗原再刺激。另外，加入终浓度为10μM的包含溶剂的培养基作为对照。于37℃在5%CO2下培养细胞4小时后，加入布雷菲德菌素A(BioLegend)，并进一步继续培养。培养开始6小时后，回收细胞并用PE-标记的抗-人CD4抗体和FITC-标记的抗-人CD8抗体染色。使用BDCytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒(BectonDickinson)和PerCP/Cy5.5-标记的抗-人IFN-γ抗体进行细胞内IFN-γ染色。将EPICS-XLMCL(BeckmanCoulter)用于分析。结果如图6和7所示。从图6中，证实在WT1-332诱导组中，WT1-332-特异性Th1在第7天与第14天之间显著并时间依赖性地增加。该增加相对于溶剂诱导组是显著的(P<0.0001)。从图7中，证实在WT1-332诱导组中，WT1-332-特异性CTL在第7天与第14天之间时间依赖性地增加，且该增加相对于溶剂诱导组是显著的(P<0.0001)。
IFN-γ的测量(在抗-HLA-DR抗体和抗-HLA-DQ抗体的存在下反应的抑制)
在第14天，在10μM的溶剂存在下、在20μg/mL的WT1-332存在下以及在20μg/mL的WT1-332和10μg/mL的抗-HLA-DR抗体(L243[G46-6],BDCo.)存在下，将从供体21-37的PBMC诱导的T细胞培养24小时。培养后，通过ELISA(BDCo.)来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图8所示。在来自供体21-37的样品中，显示诱导的T细胞识别WT1-332并产生IFN-γ，且该反应是HLA-DR分子-限制的。
同样，在第14天，在10μM的溶剂存在下、在20μg/mL的WT1-332存在下以及在20μg/mL的WT1-332和10μg/mL的抗-HLA-DR抗体(L243[G46-6],BDCo.)或10μg/mL的抗-HLA-DQ抗体(SPVL3,BCCo.)存在下，将从供体38-46的PBMC诱导的T细胞培养24小时。培养后，通过ELISA(BDCo.)来定量上清液中的IFN-γ量。结果如图11所示。在来自供体38-46的样品中，诱导的T细胞识别WT1-332并产生IFN-γ，且该反应不被抗-HLA-DR抗体和抗-HLA-DQ抗体所抑制。从这些事实很明显看出，来源于供体38-46的WT1-332-诱导的T细胞是HLA-DP分子-限制的。
WT1-332-特异性T细胞的诱导(与新的等位基因的关系)
关于在使用图6和7的健康血液供体(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501和0901中至少一个的总计42个供体)的结果中为HLA-DR-限制的并具有诱导的WT1-332-特异性Th1的17个样品(供体21-37)的每一个，第14天的结果如图9和10所示。另外，17个样品(供体21-37)中每一个的HLAII类类型(HLA-DRB1等位基因和HLA-DPB1等位基因的类型)在下述表2中示出。在这一点上，DRB3*0202与DRB1*1101、DRB1*1401和DRB1*1405是连锁不平衡的(在该表中DRB1等位基因通过符号“Δ”表示)，DRB4*0101与DRB1*0403、DRB1*0405和DRB1*0901是连锁不平衡的(在该表中DRB1等位基因通过符号“▲”表示)。在该表中，等位基因通过粗体表示，斜体字母代表新的相容性HLA-DRB1等位基因。
表2
从图9、图10和表2中，在具有这些HLA-DR等位基因的细胞中观察到WT1-332-特异性Th1和WT1-332-特异性CTL的诱导。
另外，关于在使用图6和7的健康血液供体(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501和0901中至少一个的总计42个供体)的结果中为HLA-DP-限制的并具有诱导的WT1-332-特异性Th1的9个样品(供体38-46)的每一个，第14天的结果如图12和13所示。另外，9个样品(供体38-46)中每一个的HLAII类类型(HLA-DRB1等位基因和HLA-DPB1等位基因的类型)在下述表3中示出。在该表中，符号“*”表示之前已知的相容性HLA-DPB1等位基因。
表3
从图12、图13和表3中，在具有这些HLA-DP等位基因的细胞中观察到WT1-332-特异性Th1和WT1-332-特异性CTL的诱导。
工业应用性
本发明提供用于激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的方法及用于其的组合物，所述方法使用具有与以下任何MHCII类分子结合的能力的WT1肽：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，提供用于通过激活辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞来治疗和/或预防癌症的药物组合物等。因此，本发明可应用于药物领域等，例如多种高度表达WT1基因的造血器官肿瘤和实体癌的预防或治疗的开发和生产领域。
Claims (17)
1.WT1肽在制备用于激活辅助性T细胞的方法中的试剂盒中的用途，所述方法包括通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的步骤，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
2.权利要求1的用途，其中所述WT1肽具有与以下至少2种MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子和HLA-DPB1*0301分子。
3.权利要求1或2的用途，其中所述WT1肽还具有与以下分子结合的能力：HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子和/或HLA-DPB1*0901分子。
4.权利要求1或2的用途，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码所述WT1肽的多核苷酸、包含该多肽的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的。
5.权利要求3的用途，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码所述WT1肽的多核苷酸、包含该多肽的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的。
6.用于通过将WT1肽加入抗原呈递细胞来激活辅助性T细胞的包含WT1肽的组合物，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
7.权利要求6的组合物，其中所述WT1肽具有与以下至少2种MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子和HLA-DPB1*0301分子。
8.权利要求6或7的组合物，其中所述WT1肽还具有与以下分子结合的能力：HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子和/或HLA-DPB1*0901分子。
9.权利要求6或7的组合物，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码所述WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的。
10.权利要求8的组合物，其中将WT1肽加入抗原呈递细胞是通过加入WT1肽、编码所述WT1肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体或者包含该表达载体的细胞进行的。
11.呈递包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物的抗原呈递细胞，其中所述MHCII类分子是以下任何MHCII类分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
12.识别包含WT1肽的抗原肽与MHCII类分子的复合物的辅助性T细胞，其中所述MHCII类分子是以下任何MHCII类分子：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
13.通过权利要求12的辅助性T细胞激活的细胞毒性T细胞。
14.用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求6-10中任一项的组合物、权利要求11的抗原呈递细胞、权利要求12的辅助性T细胞或权利要求13的细胞毒性T细胞中的任一种作为活性成分。
15.用于激活细胞毒性T细胞的药物组合物，所述药物组合物包含WT1肽、编码所述WT1肽的多核苷酸、包含多该核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞中的任一种作为活性成分，并所述药物组合物被给予具有以下任何MHCII类分子的受试者：HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、HLA-DPB1*0301分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子或HLA-DRB4*0101分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
16.与WT1肽特异性结合的抗体，其中所述WT1肽具有与以下任何MHCII类分子结合的能力：HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
17.WT1肽在制备用于测定受试者中WT1-特异性辅助性T细胞的存在或量的方法中的试剂盒中的用途，所述受试者对于以下任何MHCII类分子阳性：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子，所述方法包括以下步骤：
(a)使用所述WT1肽刺激获自受试者的样品，和
(b)测定细胞因子或辅助性T细胞的存在或量，其中细胞因子或辅助性T细胞的存在或量的增加显示WT1-特异性辅助性T细胞的存在或量，
其中所述WT1肽是由SEQIDNO:2的氨基酸序列（LysArgTyrPheLysLeuSerHisLeuGlnMetHisSerArgLysHis）组成的肽。
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