TW201623616A - 用於活化細胞毒性ｔ細胞的方法及組成物，及用於細胞毒性ｔ細胞之活化誘導物 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關用於活化助手T細胞的方法，該方法包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子等之任一第二類MHC分子之能力。
Description
本發明係有關用於活化助手T細胞的方法(該方法包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力)，亦有關活化細胞毒性T細胞的方法、細胞毒性T細胞(CTL)之活化誘導物、經由活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞以治療及/或預防癌症之醫藥組成物等。
WT1基因[威爾姆氏(Wilms)腫瘤1基因]被鑑定為兒童
腎臟癌威爾姆氏腫瘤之致病基因，該基因編碼具鋅指結構之轉錄因子(非專利文件1及2)。後續研究顯示，上述基因在造血器官腫瘤或實體癌上具癌症基因之作用(非專利文件3至6)。
已顯示於活體外使用具編碼WT1蛋白質的部分胺基酸序列之胜肽刺激周邊血液單核細胞，誘導對該胜肽具專一性之細胞毒性T細胞(CTLs)，且此等CTLs傷害內生性表現WT1造血器官腫瘤或實體癌之癌細胞。該CTLs辨認呈結合於第一類MHC分子之複合體形式之上述胜肽，該胜肽因而依第一類MHC分子之亞型而不同(專利文件1至4，及非專利文件7)。
另一方面，為了有效誘導CTLs，對癌抗原具專一性之助手T細胞之存在十分重要(非專利文件8)。利用辨認抗原呈現細胞上第二類MHC分子與抗原胜肽之複合體，助手T細胞被誘導及活化。經活化之助手T細胞利用產生例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等細胞介素或干擾素，幫助B細胞之增殖、分化及熟成。由於此等助手T細胞具有利用促進B細胞與T細胞之增殖及活化而活化免疫系統之功能，因此建議透過結合第二類MHC之抗原胜肽增強助手T細胞之功能，以增強癌症疫苗之功效，於癌症免疫治療上有所助益(非專利文件9)。
頃已顯示，於具編碼WT1蛋白質部的分胺基酸序列之特定胜肽(於本說明書下文亦稱為WT1胜肽)間，存在能結合多個第二類MHC分子及活化助手T細胞之混雜助手胜
肽(專利文件5及6)。然而，由於存在多種第二類MHC分子，因此很難證明該等WT1胜肽是否亦對其他第二類MHC分子具效應。
專利文件1：國際公開號WO 2003/106682
專利文件2：國際公開號WO 2005/095598
專利文件3：國際公開號WO 2007/097358
專利文件4：國際公開號PCT/JP2007/074146
專利文件5：國際公開號WO 2005/045027
專利文件6：國際公開號WO 2008/105462
非專利文件1：Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29；61(7)：1257-69
非專利文件2：Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9；60(3)：509-20
非專利文件3：Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998；181：151-212. Review
非專利文件4：Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1；87(7)：2878-84
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非專利文件7：Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb；51(2)：99-107
非專利文件8：Gao FG et al., Cancer Res. 2002 Nov 15；62(22)：6438-41
非專利文件9：Zeng G, J Immunother. 2001 May；24(3)：195-204
因此，本發明欲達成之目的在於提供用於活化助手T細胞的方法、利用施加特定WT1胜肽至廣範圍第二類MHC分子-陽性對象之用於活化細胞毒性T細胞的方法、細胞毒性T細胞之活化誘導物、用於治療/預防癌症之醫藥組成物等。
於彼等情況下，本發明人等經精深研究，發現具胺基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His之胜肽能結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*901分子、HLA-DPB1*0201分子、及HLA-DPB1*0301分子，並活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞；因而完成本發明。
本發明提供：(1)一種用於活化助手T細胞的方法，包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力；(2)根據(1)之方法，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子、及HLA-DPB1*0301分子之至少兩個第二類MHC分子之能力；(3)根據(1)或(2)之方法，其中該WT1胜肽進一步具有結合於HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子及/或HLA-DPB1*0901分子之能力；(4)根據(1)至(3)之任一項之方法，其中該WT1胜肽之添加至抗原呈現細胞，係利用添加WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多胜肽之表現載體、或含該表現載體之細胞而完成；(5)根據(1)至(4)之任一項之方法，其中該WT1胜肽係含胺
基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His(SEQ ID NO：2)之胜肽、其變異體或修飾物；(6)一種組成物，其含有利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之WT1胜肽，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力；(7)根據(6)之組成物，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子、及HLA-DPB1*0301分子之至少兩個第二類MHC分子之能力；(8)根據(6)或(7)之組成物，其中該WT1胜肽進一步具有結合於HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子及/或HLA-DPB1*0901分子之能力；(9)根據(6)至(8)之任一項之組成物，其中該WT1胜肽之添加至抗原呈現細胞，係利用添加WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之表現載體、或含該表現
載體之細胞而完成；(10)根據(6)至(9)之任一項之組成物，其中該WT1胜肽係含胺基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His(SEQ ID NO：2)之胜肽、其變異體或修飾物；(11)一種抗原呈現細胞，其呈現含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體，其中該第二類MHC分子係HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子；(12)一種助手T細胞，其辨認含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體，其中該第二類MHC分子係HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子；(13)一種細胞毒性T細胞，其被根據(11)之助手T細胞活化；(14)一種用於治療或預防癌症之醫藥組成物，其包含根據(6)至(10)之任一項之任一組成物、根據(11)之抗原呈現細胞、根據(12)之助手T細胞、或根據(13)之細胞毒性T細胞作為活性成分；
(15)一種用於活化細胞毒性T細胞之醫藥組成物，其包含WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之表現載體、或含該表現載體之細胞之任一者作為活性成分，係投與至具有HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、HLA-DPB1*0301分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子或HLA-DRB4*0101分子之任一第二類MHC分子之對象；(16)一種專一性地結合於WT1胜肽之抗體，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力；(17)一種於有關HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子為陽性之對象中，用於測定WT1專一性助手T細胞之存在或量之方法，該方法包括下述步
驟：(a)使用WT1胜肽刺激得自該患者之試樣，及(b)測定細胞介素或助手T細胞之存在或量，其中細胞介素或助手T細胞之存在或量之增加顯示WT1專一性助手T細胞之存在或量。
根據本發明，利用施用WT1胜肽至具有HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之廣範圍對象，獲得用於活化助手T細胞的方法、其組成物、用於活化細胞毒性T細胞的方法、其組成物、細胞毒性T細胞之活化誘導物、經由活化助手T細胞及細胞毒性T細胞以治療及/或預防癌症之醫藥組成物等；因此賦予具此等第二類MHC分子的對象體內及體外助手T細胞及細胞毒性T細胞活化之能力，及癌症之治療與預防等。
第1圖顯示經得自第1位捐贈者(HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-、及DRB4*0103-陽性)之PBMCs誘導之T細胞與得自以WT1-332刺激(pulsed)之不同捐贈者之
PBMCs共培養後，測定IFN-γ量所得結果。圖中，縱座標代表共培養後上澄液中之IFN-γ量(pg/mL)。圖中，橫座標代表於不同捐贈者中為陽性之HLA-DRB1、3及4分子類型。
第2圖顯示經得自第2位捐贈者(HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性)之PBMCs誘導之T細胞與得自以WT1-332刺激之不同捐贈者之PBMCs共培養後，測定IFN-γ量所得結果。圖中，縱座標代表共培養後上澄液中之IFN-γ量(pg/mL)。橫座標代表於不同捐贈者中為陽性之HLA-DRB1、3、及4分子類型。
第3圖顯示經得自第3位捐贈者(HLA-DRB1*0401/0405-、及DRB4*0102/0103-陽性)之PBMCs誘導之T細胞與得自以WT1-332刺激之不同捐贈者之PBMCs共培養後，測定IFN-γ量所得結果。圖中，縱座標代表共培養後上澄液中之IFN-γ量(pg/mL)。橫座標代表於不同捐贈者中為陽性之HLA-DRB1及4分子類型。
第4圖顯示經得自第4位捐贈者(HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性)之PBMCs誘導之T細胞與得自以WT1-332刺激之不同捐贈者之PBMCs共培養後，測定IFN-γ量所得結果。圖中，縱座標代表共培養後上澄液中之IFN-γ量(pg/mL)。橫座標代表於不同捐贈者中為陽性之HLA-DRB1、3、及4分子類型。
第5圖顯示HLA-第二類單體蛋白(DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1501、DRB1*1502、DRB1*0803、
DRB1*0901及DRB4*0101)專一性地與各種胜肽結合。圖中，縱座標代表滯留時間偏移程度(分鐘)。橫座標代表HLA-第二類單體蛋白之類型。又，條形圖顯示所添加胜肽之類型[從左起，負對照組(□)、正對照組(■)、及WT1-332(加斜線之□)]。
第6圖顯示，以WT1-332刺激經得自健康血液捐贈者(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501、及0901至少一者之捐贈者，總共42位)之PBMCs誘導之T細胞時，WT1-332-專一性Th1比率(CD4-陽性細胞/細胞內IFN-γ-陽性細胞之比率)時間相依地顯著增加。圖中，縱座標代表活細胞中CD4-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)，以及橫座標代表培養天數(天)。又，符號“●”代表經由添加WT1-332所誘導試樣中之比率(WT1-332誘導組)；符號“○”代表經由添加溶劑(對照組)所誘導試樣中之比率(溶劑誘導組)。
第7圖顯示，以WT1-332刺激經得自健康血液捐贈者(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501、及0901至少一者之捐贈者，總共42位)之PBMCs誘導之T細胞時，WT1-332-專一性CTL細胞數(CD8-陽性細胞/IFN-γ-陽性細胞之比率)時間相依地顯著增加。圖中，縱座標代表活細胞中CD8-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)，以及橫座標代表培養天數(天)。又，符號“●”代表經由添加WT1-332所誘導試樣中之比率(WT1-332誘導組)；符號“○”代表經由添加溶劑(對照組)所誘導試樣中
之比率(溶劑誘導組)。
第8圖顯示，第6圖及第7圖中所誘導WT1-332-專一性Th1之17個試樣(第21至37位捐贈者)之HLA-DR-限制性。於各試樣中，利用添加WT1-332誘導14天後，以WT1-332刺激T細胞時，確認產生WT1-332-專一性IFN-γ，當該等細胞添加抗-HLA-DR抗體培養時，IFN-γ生產受抑制。此顯示經WT1-332誘導之T細胞受HLA-DR-限制。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第21至37位捐贈者)，以及橫座標代表IFN-γ產生量(pg/mL)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之IFN-γ產生量；符號“加斜線之□”代表WT1-332+抗-HLA-DR抗體刺激後之IFN-γ產生量；符號“□”顯示溶劑(對照組)刺激後之IFN-γ產生量。
第9圖顯示，當具有第6圖及第7圖中所誘導受HLA-DR-限制之WT1-332-專一性Th1之17個試樣(第21至37位捐贈者)，各利用添加WT1-332誘導14天後，以WT1-332刺激T細胞時，WT1-332-專一性Th1細胞數之比率(CD4-陽性細胞/細胞內IFN-γ-陽性細胞)增加。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第21至37位捐贈者)，以及橫座標代表活細胞中CD4-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之比率；符號“□”代表溶劑(對照組)刺激後之比率。
第10圖顯示，當具有第6圖及第7圖中所誘導受HLA-DR-限制之WT1-332-專一性Th1之17個試樣(第21至
37位捐贈者)，各利用添加WT1-332誘導14天後，以WT1-332刺激T細胞時，WT1-332-專一性CTL細胞數之比率(CD8-陽性細胞/細胞內IFN-γ-陽性細胞)增加。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第21至37位捐贈者)，以及橫座標代表活細胞中CD8-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之比率；符號“□”代表溶劑(對照組)刺激後之比率。
第11圖顯示，第6圖及第7圖中所誘導WT1-332-專一性Th1之9個試樣(第38至46位捐贈者)之HLA-DP-限制性。於各試樣中，利用添加WT1-332誘導14天後，以WT1-332刺激T細胞時，確認產生WT1-332-專一性IFN-γ，當該等細胞添加抗-HLA-DR抗體培養，及添加抗-HLA-DQ抗體培養時，IFN-γ生產未受抑制。此顯示經WT1-332誘導之T細胞受HLA-DP-限制。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第38至46位捐贈者)，以及橫座標代表IFN-γ產生量(pg/mL)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之IFN-γ產生量；符號“加斜線之□”代表WT1-332+抗-HLA-DR抗體刺激後之IFN-γ產生量；符號“加短線之□”代表WT1-332+抗-HLA-DQ抗體刺激後之IFN-γ產生量；符號“□”顯示溶劑(對照組)刺激後之IFN-γ產生量。
第12圖顯示，當具有第6圖及第7圖中所誘導受HLA-DP-限制之WT1-332-專一性Th1之9個試樣(第38至46位捐贈者)，各利用添加WT1-332誘導14天後，以
WT1-332刺激T細胞時，WT1-332-專一性Th1細胞數之比率(CD4-陽性細胞/細胞內IFN-γ-陽性細胞)增加。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第38至46位捐贈者)，以及橫座標代表活細胞中CD4-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之比率；符號“□”代表溶劑(對照組)刺激後之比率。
第13圖顯示，當具有第6圖及第7圖中所誘導受HLA-DP-限制之WT1-332-專一性Th1之9個試樣(第38至46位捐贈者)，各利用添加WT1-332誘導14天後，以WT1-332刺激T細胞時，WT1-332-專一性CTL細胞數之比率(CD8-陽性細胞/細胞內IFN-γ-陽性細胞)增加。圖中，縱座標代表捐贈者編號(第38至46位捐贈者)，以及橫座標代表活細胞中CD8-陽性細胞數/細胞內IFN-γ-陽性細胞數之比率(%)。又，符號“■”代表WT1-332刺激後之比率；符號“□”代表溶劑(對照組)刺激後之比率。
於一態樣中，本發明提供用於活化助手T細胞或細胞毒性T細胞的方法，該方法包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞或細胞毒性T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於第二類MHC分子之能力。於本發明中，活化細胞毒性T細胞之步驟可透過活化助手T細胞之步驟進行。又，用於本發明之WT1胜肽係具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-
DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力者。此外，用於本發明之WT1胜肽可為具有結合於上述至少二或多個第二類MHC分子之能力者。又，用於本發明之WT1胜肽可具有結合於例如，HLA-DR、HLA-DQ與HLA-DP分子之任一第二類MHC分子之能力者。
於本發明中，WT1胜肽可為具有SEQ ID NO：1所述人類WT1蛋白質之部分胺基酸序列之胜肽。根據本發明之胜肽只要具有上述特徵，則其胺基酸序列和長度沒有特定限制。然而，胜肽太長易受蛋白酶作用影響，太短則不能適當地結合於胜肽可容納槽中。根據本發明胜肽之長度較佳為10至25個胺基酸，更佳為15至21個胺基酸，進一步較佳為16至20個胺基酸，例如，16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、或19個胺基酸。根據本發明胜肽之特定實例為含胺基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His(SEQ ID NO：2)者。
此外，用於本發明之WT1胜肽包括上述胜肽之變異體。變異體可含有，例如，選自包括具有於SEQ ID NO：2所述胺基酸序列中之數個胺基酸，例如，1至9個，較佳為1至5個、1至4個、1至3個，更佳為1至2個胺基酸，
進一步較佳為1個胺基酸被置換、刪除、或添加之胺基酸序列之胜肽組群之胜肽。該等胜肽中胺基酸之置換可於任何位置，以任何種類胺基酸進行；以保守性胺基酸置換較佳。保守性胺基酸置換之實例包括以Asp殘基置換Glu殘基、以Tyr殘基置換Phe殘基、以Ile殘基置換Leu殘基、以Ser殘基置換Ala殘基、以Arg殘基置換His殘基等。較佳為，胺基酸之添加或刪除可於胜肽之N端及C端進行，惟亦可於序列內側進行。根據本發明胜肽之較佳特定實例為具有SEQ ID NO：2者。有鑑於此，任何上述胜肽必須具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力，且必須活化助手T細胞或細胞毒性T細胞(本文中亦稱為CTL)。於本說明書中，上述WT1胜肽亦稱為“WT1-332”。又，人類MHC分子通常稱為HLA分子，因此，於本說明書中，MHC為HLA之同義字。
此外，根據本發明之胜肽可為修飾上述胺基酸序列獲得者。上述胺基酸序列中之胺基酸殘基可利用已知方法予以修飾。此等修飾可為，例如，於胺基酸殘基側鏈之功能基上進行酯化、烷化、鹵化、磷酸化等。又，尚可於含上
述胺基酸序列胜肽之N端及/或C端結合各種物質。例如，可使胺基酸、胜肽、其類似物等結合於該胜肽。舉例而言，可添加組胺酸標籤，或可與蛋白質例如硫氧還蛋白一起形成融合蛋白。替代地，可使可偵測標記結合於WT1胜肽。於彼等物質結合於根據本發明胜肽之情形下，彼等可以例如活體內酵素等，或以例如細胞內加工程序處理，最後產生由上述胺基酸序列組成之胜肽，其以與第二類MHC分子之複合體呈現於細胞表面，因而能獲得助手T細胞及/或細胞毒性T細胞之誘導作用。彼等物質可為調控根據本發明胜肽溶解度者、增進該胜肽穩定性(例如蛋白酶抗性)者、容許本發明胜肽之專一傳送，例如，至既定組織或器官者、或具有抗原呈現細胞攝入效率增強作用或其他作用者。又，彼等物質可為增加誘導CTL之能力者，例如，根據本發明胜肽以外之助手胜肽。
用於本發明之WT1胜肽可使用此項技藝中通常使用之方法或其修飾方法合成。此等合成方法揭示於，例如，Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol.2,Academic Press Inc.,New York,1976；Peptide Synthesis,Maruzen Co.,Ltd.,1975；Basis and Experiments of Peptide Synthesis,Maruzen Co.,Ltd.,1985；Development of Medicines(continuation),Vol.14,Peptide Synthesis,Hirokawa Shoten Co.,1991等中。又，用於本發明之胜肽可根據編碼該胜肽之核苷酸序列資訊，使用基因工程技術予以製備。此類基因工程技術為熟習此項技藝者悉知；可根
據例如文獻中(Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)；DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985))敘述之方法進行。
又，本發明有關編碼上文敘述之WT1胜肽之多核苷酸序列。編碼WT1胜肽之該多核苷酸序列可為DNA序列或RNA序列。於本發明中，可使用此等多核苷酸序列代替WT1胜肽。此等多核苷酸序列可藉由併入適當載體中予以使用。此載體包括質體、噬菌體載體、病毒載體等，例如，pUC118、pUC119、pBR322、pCR3、pYES2、pYEUra3、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMV、pAcSGHisNT-A、λ ZAPII、λ gt11等。載體可依需要含有例如可誘導表現之啟動子、訊息序列編碼基因、挑選用標記基因、及終止子等因子。將彼等基因引入細胞或活體內之方法、表現彼等之方法等為熟習此項技藝者已知。
用於本發明之抗原呈現細胞為可呈現含上述WT1胜肽以及第二類MHC分子之抗原胜肽於助手T細胞者，及意指，例如，樹狀細胞、周邊血液單核細胞等。因此，為用於本發明之抗原呈現細胞由來之患者必須具有與可和所添加之WT1胜肽結合之第二類MHC分子相同之分子(例如，HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、
HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、HLA-DPB1*0301分子等之任何一或多個第二類MHC分子)。
於本發明中，添加WT1胜肽可直接利用添加WT1胜肽、或間接利用添加編碼WT1胜肽之多核苷酸或含編碼WT1胜肽之多核苷酸之表現載體或利用添加含該表現載體之細胞至抗原呈現細胞進行。上述添加可利用此項技藝中已知之方法進行。上述編碼WT1胜肽之多核苷酸、含編碼WT1胜肽之多核苷酸之表現載體、及含該表現載體之細胞可利用熟習此項技藝者悉知之技術獲得。具體而言，用於本發明之多核苷酸可根據上述WT1胜肽之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：2所述胺基酸序列)予以確定。舉例而言，上述多核苷酸可利用DNA或RNA合成、PCR方法等予以製備。又，含上述多核苷酸之表現載體之種類，除上述多核苷酸序列外所含序列等可視引入表現載體之宿主之目的、種類等適當地選定。表現載體包括質體、噬菌體載體、病毒載體等。含表現載體之細胞舉例而言，可利用轉形宿主細胞而製備。宿主細胞包括大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞等。用於轉形宿主細胞之方法可為習知方法，且可能使用，例如，磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法、及用於基因轉移之脂質。
一般而言，當T細胞表面之TCR-CD3複合體透過抗原呈現細胞表面之第二類MHC分子辨認抗原胜肽時，助手T細胞即被活化，且T細胞表面之整合素被抗原呈現細胞表
面之整合素配體刺激。於本說明書中，助手T細胞之活化不僅包括助手T細胞之活化，亦包括助手T細胞之誘導及增殖。又，於本發明中被活化之助手T細胞可為未分化之T細胞(例如，原態T細胞)等。經活化之助手T細胞具有藉由促進B細胞及細胞毒性T細胞之誘導、增殖及活化而活化免疫系統之功能。因此，本發明方法可作為治療癌症等之輔助療法用。又，使用本發明方法活體外活化之助手T細胞可用於治療或預防癌症等，或作為其輔助劑用。助手T細胞之活化可藉由，例如，測定細胞介素例如干擾素(例如，干擾素-γ等)及介白素之產生或分泌進行評估。
於另一態樣中，本發明提供一種組成物，其係利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞或細胞毒性T細胞。於本發明中，活化細胞毒性T細胞可透過活化助手T細胞而進行。雖然WT1胜肽、編碼WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之載體、及含該載體之細胞可為本發明組成物之實例，惟任何分子只要其為能呈現WT1胜肽成為抗原呈現細胞表面上之抗原胜肽之因子，則均可使用。彼等因子可利用如上文敘述之熟習此項技藝者悉知之方法獲得。
用於本發明之WT1胜肽具有結合於如上文敘述之任一HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501
分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之能力。又，用於本發明之WT1胜肽可具有結合於上述第二類MHC分子之至少二或多個第二類MHC分子之能力。此外，用於本發明之WT1胜肽可具有結合於HLA-DR、HLA-DQ、或HLA-DP分子之任一第二類MHC分子之能力。
當本發明組成物投與至具有HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一或多個第二類MHC分子之對象時，該對象之免疫系統經由活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞而被活化。又，WT1基因於各種癌症及腫瘤，舉例而言，於惡性血液疾病例如白血病、骨髓造血不良症候群、多發性骨髓瘤與惡性淋巴瘤，以及實體癌例如胃癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌與卵巢癌中高度表現，因此，本發明組成物可作為治療或預防癌症之輔助劑用。替代地，使用本發明組成物活化之助手T細胞、細胞毒性T細胞等可作為，例如，治療上述癌症之輔助劑用。
除了上述WT1胜肽、編碼WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之載體、及含該載體之細胞外，本發明組成物可含有，例如，載劑、賦形劑、添加劑等。本發明組成物所含之上述WT1胜肽等以WT1胜肽專一方式活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞，因此，組成物可含已知之第一類MHC-限制性WT1胜肽，或可與此等胜肽一起施用。
施用本發明組成物之方法可視例如所需助手T細胞及/或細胞毒性T細胞活化程度、抗原呈現細胞狀態等情況適當地選定。施用方法包括，例如，惟不限於，經由皮內投與、皮下投與、肌內投與、靜脈內投與、經鼻投與、經口投與等投與患者，或添加至抗原呈現細胞之培養液中。本發明組成物中所含上述WT1胜肽等之量、組成物形式、組成物施用頻率等可視例如所需助手T細胞及/或細胞毒性T細胞活化程度、抗原呈現細胞狀態等情況適當地選定。
於又另一態樣中，本發明提供用於對象治療或預防癌症之方法，該方法包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞或細胞毒性T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC
分子之能力。本發明方法經由活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞而活化對象之免疫系統，從而於對象治療或預防癌症。於本發明方法中，活化細胞毒性T細胞之步驟可透過活化助手T細胞之步驟進行。添加WT1胜肽至抗原呈現細胞可直接利用添加WT1胜肽、或間接利用添加編碼WT1胜肽之多核苷酸或含編碼WT1胜肽之多核苷酸之表現載體或利用添加含該表現載體之細胞進行。上述編碼WT1胜肽之多核苷酸、含編碼WT1胜肽之多核苷酸之表現載體、及含該表現載體之細胞可利用如上文敘述之熟習此項技藝者悉知之方法獲得。可施用本發明方法之對象為有關HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子為陽性者。可施用本發明之癌症可為任何癌症，包括，例如，造血器官腫瘤例如白血病、骨髓造血不良症候群、多發性骨髓瘤與惡性淋巴瘤，以及實體癌例如胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌與卵巢癌。又，本發明方法可與使用第一類MHC分子-限制性WT1胜肽或其醫藥組成物治療或預防癌症之方法一起使用。
於又另一態樣中，本發明提供使用WT1胜肽、編碼WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之載體、及含該載體之細胞製備上述組成物之用途。
於又進一步態樣中，本發明係有關利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞之含上述WT1胜肽、編碼WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之載體、或含該載體之細胞之套組，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力。較佳為，於上述方法中使用該套組以活化助手T細胞或細胞毒性T細胞。除了WT1胜肽之外，本發明套組可含，例如，獲得抗原呈現細胞之工具(means)、評估助手T細胞及/或細胞毒性T細胞活性之工具等。通常，套組中附有使用手冊。使用本發明套組可有效地活化助手T細胞或細胞毒性T細胞。
於另一態樣中，本發明提供呈現含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體之抗原呈現細胞。於此情形下，第二類MHC分子可為HLA-DRB1**0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406
分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一分子，或可為上述第二類MHC分子之至少二或多個分子。本發明之抗原呈現細胞可使用熟習此項技藝者已知之技術製備。舉例而言，彼等可藉由自癌症病患單離具有抗原呈現能力之細胞，接著以上述WT1胜肽(例如，具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列之胜肽)或以編碼WT1胜肽之多核苷酸、或將表現含該多核苷酸之載體引入該等細胞中刺激該單離細胞而製備，從而使含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體得以呈現於細胞表面(Cancer Immunol.Immunother.46：82,1998；J.Immunol.,158：p1796,1997；Cancer Res.,59：p1184,1999；CancerRes.,56：p5672,1996；J.Immunol.,161：p5607,1998；J.Exp.Med.,184：p465,1996)。於本說明書中，具有抗原呈現能力之細胞只要表現能於細胞表面呈現WT1胜肽之第二類MHC分子，則未受限，以具有高抗原呈現能力之周邊血液單核細胞或樹狀細胞較佳。又，如實施例中所示，本發明抗原呈現細胞之存在係由細胞毒性T細胞活性增加(其由干擾素-γ量增加被證實)被證實。本發明之抗原呈現細胞有效地使用於細胞療法(例如，樹狀細胞療法)中作為醫藥組成物之活性成分。
於又另一態樣中，本發明提供辨認含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體之助手T細胞。於此情形下，第二類MHC分子可為HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一分子，或可為上述第二類MHC分子之至少二或多個分子。本發明之助手T細胞包括，例如，辨認含有由SEQ ID NO：2所述胺基酸序列組成之胜肽之抗原胜肽與HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之複合體者。本發明之助手T細胞可由熟習此項技藝者使用此項技藝中已知之技術容易地製備獲得(Iwata,M.et al.,Eur.J.Immunol,26,2081(1996))。
於又另一態樣中，本發明提供被辨認含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體之助手T細胞所活化
之細胞毒性T細胞。本發明之細胞毒性T細胞包括，例如，被辨認含有由SEQ ID NO：2所示胺基酸序列組成之胜肽之抗原胜肽與HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之複合體之助手T細胞所活化者。本發明之細胞毒性T細胞可由熟習此項技藝者使用已知技術容易地製備。舉例而言，彼等可藉由自病患單離周邊血液淋巴細胞，於活體外以胜肽(例如，具有如SEQ ID NO：2所述胺基酸序列之胜肽)、編碼該胜肽之多核苷酸、或表現含該多核苷酸之載體予以刺激而製備(Journal of Experimental Medicine 1999,190：1669)。如此製備之細胞毒性T細胞可作為用於治療或預防癌症等之醫藥組成物之活性成分用。於本說明書之實施例中，誘導細胞毒性T細胞之活性係利用於得自具有某些MHC類分子的對象之試樣中投與WT-332進行辨認。此顯示呈現由WT1胜肽組成之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體之抗原呈現細胞存在周邊血液單核細胞中，並顯示呈現該複合體之抗原呈現細胞、專一性辨認彼等之助手T細胞、及由助手T細胞誘導的細胞毒性T細胞之存在。
於又另一態樣中，本發明提供具有含WT1胜肽之上述
抗原胜肽與第二類MHC分子之HLA四聚體。該第二類MHC分子可為HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子或HLA-DPB1*0901分子之任一分子，或可為上述第二類MHC分子之至少二或多個分子。於本說明書中，HLA四聚體意指使HLA蛋白質與胜肽結合獲得之複合體(HLA單體)生物素化製得之四聚合產物，接著使生物素化產物結合於卵白素(avidin)。含有各種抗原胜肽之HLA四聚體為市售可得，本發明之該HLA四聚體可容易地予以製備(Science 279：2103-2106(1998),Science 274：94-96(1996))。本發明之四聚體較佳為以螢光標記，俾使經結合之本發明助手T細胞及細胞毒性T細胞可利用已知檢測方式例如流式細胞儀及螢光顯微鏡容易地選定或檢測。於本發明中，HLA四聚體不受限於四聚體，亦可能依需要使用多聚體例如五聚體及樹枝狀聚合物。本說明書中，多聚體意指使用已知技術使HLA蛋白質與胜肽結合獲得之二或多個複合體(HLA單體)結合製得之多聚合產物。
於另一態樣中，本發明提供用於活化助手T細胞或細胞毒性T細胞之醫藥組成物，該醫藥組成物含有上述組成物、抗原呈現細胞、助手T細胞、細胞毒性T細胞或四聚體之任一者作為活性成分。本發明醫藥組成物可含上述組
成物、抗原呈現細胞、助手T細胞、細胞毒性T細胞或四聚體之任一者或多者作為活性成分。本發明醫藥組成物可用於治療或預防癌症。本發明醫藥組成物可應用於表現WT1之各種癌症及腫瘤，例如，應用於造血器官腫瘤例如白血病、骨髓造血不良症候群、多發性骨髓瘤與惡性淋巴瘤，以及實體癌例如胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌與卵巢癌。又，本發明醫藥組成物可用以投與至具有第二類MHC分子(例如HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子)之對象。本發明醫藥組成物可與治療或預防癌症之其他方法或其醫藥組成物一起使用。此外，本發明醫藥組成物可含有助手T細胞或細胞毒性T細胞之活化劑、增殖劑、誘導劑等，或可含有已知之第一類MHC-限制性WT1胜肽。
除了活性成分外，本發明醫藥組成物可含，例如，載劑、賦形劑等。本發明醫藥組成物之投與方法可視例如疾病種類、對象狀態及標的部位等情況適當地選定。該方法包括，惟不限於，例如，皮內投與、皮下投與、肌內投與、靜脈內投與、經鼻投與、經口投與等。本發明醫藥組成物
中所含上述活性成分之量、組成物之劑量型、組成物投與次數等可視例如疾病種類、對象狀態、標的部位等情況適當地選定。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療或預防癌症之方法，該方法包括投與對象有效量之上述組成物、抗原呈現細胞、助手T細胞、細胞毒性T細胞或四聚體之任一者的步驟，其中該對象具有HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子。可利用本發明方法治療或預防之癌症為表現WT1之各種癌症與腫瘤，例如，造血器官腫瘤例如白血病、骨髓造血不良症候群、多發性骨髓瘤與惡性淋巴瘤，以及實體癌例如胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌與卵巢癌。本發明方法可與治療或預防癌症之其他方法(例如，使用已知第一類MHC分子-限制性WT1胜肽治療或預防癌症之方法)一起使用。
於又另一態樣中，本發明提供使用上述組成物、抗原呈現細胞、助手T細胞、細胞毒性T細胞或四聚體之任一者製備上述醫藥組成物之用途。
於一態樣中，本發明係有關專一性地結合於上述WT1胜肽或編碼WT1胜肽之多核苷酸之抗體(下文中，該抗體亦稱為抗WT1抗體)。本發明之抗體可為多株抗體或單株抗體。具體而言，可述及者為專一性地結合於具有如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列之胜肽等之抗體。用於製備此類抗體之方法已為業界所知，本發明抗體亦可根據此等習知方法製備(Current protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.(ed.),1987,John Wiley and Sons(pub.),Section 11.12-11.13,Antibodies；A Laboratory Manual,Lane,H.D.et al.(ed.),Cold Spring Harber Laboratory Press(pub.),New York,1989)。舉例而言，使用具有如SEQ ID NO：2所述胺基酸序列之胜肽作為免疫原針對非人類動物(例如家兔)進行免疫處理，利用習知方法可自該動物之血清獲得多株抗體。另一方面，於單株抗體之情形下，係使用用於本發明之胜肽(具有如SEQ ID NO：2所述胺基酸序列之胜肽)針對非人類動物(例如小鼠)進行免疫處理，使所得脾細胞骨髓瘤細胞融合以製備融合瘤細胞，從而可製得單株抗體(Current protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.(ed.),1987,John Wiley and Sons(pub.),Section 11.4-11.11)。又，本發明抗WT1抗體之製備視宿主而定，可藉使用各種佐劑增強免疫反應而進行。此類佐劑包括礦物凝膠[例如，弗氏(Freund)佐劑、氫氧化鋁等]、界面活性劑、人體佐劑等。本發明抗WT1抗體可用於親和層析法、免疫診斷等。用於免疫診斷之方法可自免疫轉漬、放射性免疫測定法(RIA)、
酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、螢光或發光測定法等適當選定。
於另一態樣中，本發明提供於有關HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子為陽性之對象中，用於測定WT1胜肽之存在或量之方法，該方法包括下述步驟：(a)以上述抗WT1抗體與得自該對象之試樣反應，然後(b)測定該試樣中上述抗WT1抗體之存在或量。
可使用得自具有HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101，或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之對象之試樣作為上述步驟(a)中所用試樣。上述步驟(a)中所用試樣包括，例如，體液及組織，例如血液與淋巴細胞。熟習此項技藝者可適當地獲取試樣，使用已知技術使彼等與抗體反應及進行其他程序。本發明中之步驟(b)包括，例如，上述抗WT1抗體定
位、位置、量等之測定，因此，本發明可用於癌症之診斷、預後等。上述抗WT1抗體可予以標記。標記物，可使用已知標記例如螢光標記及放射性標記。藉由標記，得以簡單又迅速地進行測定WT1胜肽之存在與量。
於又另一態樣中，本發明係有關用於測定WT1胜肽之存在或量之套組，該套組含有上述抗WT1抗體作為主要組成。除了上述抗WT1抗體之外，本發明套組可含，例如，用於獲得抗WT1抗體之工具及用於評估抗WT1抗體之工具等。通常，套組中附有使用手冊。藉由使用本發明套組，於測定WT1胜肽之存在或量之上述方法中，得以簡單又迅速地測定WT1胜肽之存在或量。
於又另一態樣中，本發明提供於有關HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、或HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子為陽性之對象中，用於測定WT1專一性助手T細胞或WT1專一性細胞毒性T細胞之存在或量之方法，該方法包括下述步驟：(a)使用WT1胜肽刺激得自該對象之試樣，及(b)測定細胞介素、助手T細胞或細胞毒性T細胞之存在或量，其中細胞介素、助手T細胞或細胞毒性T細胞存
在或量之增加顯示WT1專一性助手T細胞或WT1專一性細胞毒性T細胞之存在或量。
本發明中之試樣只要含有抗原呈現細胞，可為任何試樣，包括，例如，周邊血液單核細胞、侵入性淋巴細胞、腫瘤細胞、腹水中之細胞、胸膜滲出液中之細胞、腦脊髓液中之細胞、骨髓細胞、淋巴結細胞等。用於本發明之試樣可得自健康捐贈者或得自癌症病患。使用得自健康捐贈者之細胞，舉例而言，得以診斷該捐贈者是否罹患癌症，或該捐贈者是否具有癌症或其他症狀之傾向。使用得自癌症病患之細胞，舉例而言，得以預測WT1免疫療法於癌症或其他症狀病患中是否具有效力。於本發明方法中，所得試樣可於以WT1胜肽刺激前後進行培養，培養條件可由熟習此項技藝者適當決定。以WT1胜肽刺激彼等細胞可使用已知技術(例如電穿孔)進行，且可於活體外或活體內進行。細胞介素之產生、助手T細胞或細胞毒性T細胞反應之存在、所產生細胞介素之量、或反應助手T細胞或細胞毒性T細胞反應之量可利用已知方法測定。
於又另一態樣中，本發明係有關用於測定WT1胜肽之存在或量之套組，該套組含有上述WT1胜肽作為主要成分。除了上述WT1胜肽之外，本發明套組可含，例如，獲得試樣之工具、評估例如細胞介素之工具。通常，套組中附有使用手冊。藉由使用本發明套組，於測定WT1胜肽之存在或量之上述方法中，得以簡單又迅速地測定WT1胜肽之存在或量。
茲藉由實施例詳細且具體地說明本發明，惟彼等不擬對本發明構成侷限。
從健康血液捐贈者之周邊血液分離周邊血液單核細胞(PBMCs)(第1位捐贈者：HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-、及DRB4*0103-陽性，第2位捐贈者：HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性，第3位捐贈者：HLA-DRB1*0401/0405-、及DRB4*0102/0103-陽性，第4位捐贈者：HLA-DRB1*0901/1101-、DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性)。使分離之PBMCs(1.5×107個細胞)懸浮於由45% RPMI-1640(SIGMA)、45% AIM-V(Invitrogen)、與10% AB型人血清(MP Biomedicals)組成之培養基中，然後以每孔1.5×106個細胞接種至24孔培養盤中(第0天)。於接種PBMCs之諸孔中，添加濃度為10μg/mL之WT1-332(SEQ ID NO：2所述胺基酸序列組成之胜肽)及濃度為10ng/mL之IL-7(PeproTech)，並使細胞於37℃、5% CO2下培養一週。又，將部分分離之PBMCs冷凍保存，以備再刺激得到抗原呈現細胞。
一週後(第7天)，進行再刺激。首先，將冷凍保存之PBMCs解凍，以10μg/mL WT1-332刺激(pulsed)，以50μg/mL絲裂黴素C(Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)處理，並以1.0×106至1.6×106個細胞/孔接種至新24-孔盤。接著，回收培養一週之細胞，並以1.0×106至1.6×106個細胞/孔接種至
已接種抗原呈現細胞之孔中。最後，每孔添加濃度為10ng/mL之IL-7，並於37ºC、5% CO2下培養細胞。2天後(第9天)，緩緩移除各孔之半量培養液，替代地，添加含40U/mL IL-2(PeproTech)之培養液至孔中，繼續培養。之後，每隔一天使用含20U/mL IL-2之培養液進行半量培養液之置換步驟，適當地回收第14天與第21天間之細胞供實驗用。
從健康血液捐贈者之周邊血液分離PBMCs(第5位捐贈者：HLA-DRB1*0406/1201-、DRB3*0101-、及DRB4*0103-陽性，第6位捐贈者：HLA-DRB1*0403/1405-、DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性，第7位捐贈者：HLA-DRB1*0403/1201-、DRB3*0101-、及DRB4*0103-陽性，第8位捐贈者：HLA-DRB1*0101/0901-、及DRB4*0103-陽性，第9位捐贈者：HLA-DRB1*1401/1406-、及DRB3*0202-陽性，第10位捐贈者：HLA-DRB1*0803/0901-、及DRB4*0103-陽性，第11位捐贈者：HLA-DRB1*1101/1502-、及DRB3*0202-陽性，第12位捐贈者：HLA-DRB1*0405/1406-、及DRB3*0202-、及DRB4*0103-陽性，第13位捐贈者：HLA-DRB1*0401/0405-、及DRB4*0102/0103-陽性，第14位捐贈者：HLA-DRB1*0401/1502-、及DRB4*0102-陽性，捐贈者15：HLA-DRB1*0101/0405-、及DRB4*0103-陽性，第16位捐贈者：HLA-DRB1*0901/1501-、及DRB4*0103-陽性，第17位捐贈者：HLA-DRB1*0405/1501-、及DRB4*0103-陽性，第18位捐贈者：HLA-DRB1*1401/1502-、DRB3*0202-陽性，第19
位捐贈者：HLA-DRB1*1403/1502-、DRB3*0101-陽性，第20位捐贈者：HLA-DRB1*0803/1302-、及DRB3*0301-陽性)，於測定限制性對偶基因實驗時，作為抗原呈現細胞之用。於-80℃冷凍保存各捐贈者之PBMCs至使用時。
於WT1-332不存在下、10μg/mL WT1-332存在下、及10μg/mL WT1-332與10μg/mL抗-HLA-DR抗體(BD Co.)存在下，培養經得自第1至4位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞24小時。培養後，利用ELISA(BD Co.)定量上澄液中之IFN-γ量。結果顯示，所有經誘導之T細胞辨認WT1-332並產生IFN-γ，且該反應受HLA-DR分子限制。
使經得自第1至4位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞與經以WT1-332刺激之每一適當抗原呈現細胞反應，測定經誘導之T細胞之限制性對偶基因。
使經得自第1位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞，與得自第5、6、7、8與第9位捐贈者、已以10μg/mL WT1-332刺激之抗原呈現細胞共培養24小時。共培養後，利用ELISA定量上澄液中之IFN-γ量。結果示於第1圖。與HLA-DR4(DRB1*0403、0406)-陽性抗原呈現細胞共培養時，得自第1位捐贈者之T細胞產生IFN-γ，顯示限制性對偶基因為HLA-DRB1*0406。又，證實HLA-DRB1*0403可呈現WT1-332及刺激T細胞。
使經得自第2位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞，與得自第10、11、12與第9位捐贈者、經以10μg/mL WT1-332刺激之抗原呈現細胞共培養24小時。共培養後，利用ELISA定量上澄液中之IFN-γ量。結果示於第2圖。與HLA-DRB3*0202-陽性抗原呈現細胞共培養時，得自第2位捐贈者之T細胞產生IFN-γ，顯示限制性對偶基因為HLA-DRB3*0202。
使經得自第3位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞，與得自第13、14、15與第10位捐贈者、經以10μg/mL WT1-332刺激之抗原呈現細胞共培養24小時。共培養後，利用ELISA定量上澄液中之IFN-γ量。結果示於第3圖。與HLA-DR4(DRB1*0401、0405)-陽性抗原呈現細胞共培養時，得自第3位捐贈者之T細胞產生IFN-γ，顯示HLA-DRB1*0401與0405二者可呈現WT1-332及刺激T細胞。
使經得自第4位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞，與得自第16、11、17、18、19與第20位捐贈者、經以10μg/mL WT1-332刺激之抗原呈現細胞共培養24小時。共培養後，利用ELISA定量上澄液中之IFN-γ量。結果示於第4圖。與HLA-DRB1*1101-陽性抗原呈現細胞共培養時，得自第4位捐贈者之T細胞產生IFN-γ，顯示限制性對偶基因為HLA-DRB1*1101。
接著，為了評估WT1-332與第二類MHC分子之結合能力，乃使用HPLC進行7種類型HLA第二類單體蛋白(DRB1*1501、0101、0405、0803、0901、1502、或DRB4*0101)與WT1-332之摺疊試驗。簡言之，使HLA第二類單體蛋白、胜肽[結合各蛋白質之胜肽(正對照組)、不結合各蛋白質之胜肽(負對照組)、及WT1-332]、與摺疊緩衝液混合，以製備摺疊反應溶液。於37℃反應此溶液後，使用HPLC分析滯留時間。利用由於HLA第二類單體蛋白與胜肽之結合之滯留時間偏移評估與WT1-332之摺疊。此試驗所用試劑示於下文表中。
將於-80℃冷凍保存之HLA第二類單體蛋白置於冰上解凍。使用稀釋緩衝液調整解凍後之HLA第二類單體蛋白，使其於83μL中之含量為0.05mg(1×10-9mol)。
利用電動天平稱取約1mg之各胜肽，移入玻璃小瓶，使其溶於DMSO中，以得到20mg/mL之濃度。
使用下列計算式計算相對於HLA第二類單體蛋白為50-倍莫耳量之胜肽量。
所需胜肽量：1×10-9mol×50=5×10-8mol(所需胜肽量)
5×10-8×(胜肽分子量)×1,000=(所需胜肽量)(mg)
(所需胜肽量)/[胜肽純度/100]=(胜肽添加量)(mg)
[(胜肽添加量)/20mg/mL]×1,000=(胜肽溶液添加量)(μL)
添加10%量之HLA第二類單體蛋白與胜肽之混合溶液，作為折疊緩衝液。使用下列計算方程式計算摺疊緩衝液之添加量。
[83μL(HLA第二類單體蛋白量)+(50-倍莫耳量之胜肽溶液量)]×0.1=摺疊緩衝液添加量
於玻璃小瓶裝填HLA第二類單體蛋白，添加計算量之胜肽溶液及摺疊緩衝液，令混合液於37℃靜置過夜。啟動
HPLC(Waters 2695 Separation Module)，以平衡緩衝液平衡Seperdex 200管柱。於所有試樣中，添加300μL平衡緩衝液，充分混合，取混合液之100μL部分作為試樣注入量，以計算滯留時間；分析時間為50分鐘。HLA第二類單體蛋白與胜肽摺疊之判定標準為，相較於對照組(只有溶劑)，滯留時間之偏移不小於0.1分鐘。結果發現，所測試之7種類型HLA第二類單體蛋白(DRB1*1501、0101、0405、0803、0901、1502、或DRB4*0101)，其滯留時間之偏移程度增加不小於0.1分鐘(第5圖)，據此，清楚顯示WT1-332專一性地結合彼等蛋白質且可呈現作為抗原。
從健康血液捐贈者之周邊血液分離周邊血液單核細胞(PBMCs)(總共42位捐贈者，其具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501、及0901至少一者)。將分離之PBMCs分成1.2×107個細胞之部分，使其懸浮於由45% RPMI-1640(SIGMA)、45% AIM-V(Invitrogen)、與10% AB型人血清(MP Biomedicals)組成之培養基中，以每孔1.5×106個細胞接種至24孔培養盤中(第0天)。於接種PBMCs之諸孔中，添加濃度為20μg/mL之WT1-332及濃度為10ng/mL之IL-7(PeproTech)，於37℃、5% CO2下培養細胞一週。以添加最終濃度為10μM之溶劑(10mM醋酸)代替WT1-332之組別(溶劑誘導組)作為對照組。又，將部分分離之PBMCs冷凍保存，以備再刺激得到抗原呈現細胞。
一週後(第7天)，進行再刺激。首先，將冷凍保存之PBMCs解凍，以20μg/mL WT1-332或10μM醋酸溶劑刺激，以50μg/mL絲裂黴素C(Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)處理，並以1.0×106至1.6×106個細胞/孔接種至新24-孔盤。接著，回收培養一週之細胞，並以1.0×106至1.6×106個細胞/孔接種至已接種抗原呈現細胞之孔中。最後，每孔添加濃度為10ng/mL之IL-7，並於37℃、5% CO2下培養細胞。2天後(第9天)，緩緩移除各孔之半量培養液，替代地，添加含40U/mL IL-2(PeproTech)之培養液至孔中，繼續培養。之後，每隔一天使用含20U/mL IL-2之培養液進行半量培養液之置換步驟。
於第0天、第7天、及第14天回收細胞，供測定IFN-γ之實驗用。
利用接種製備後第0天之PBMCs，及自WT1-332誘導組與溶劑誘導組於第7天及第14天在96-孔U-底盤回收之活細胞，並添加含最終濃度為20μg/mL WT1-332之培養液進行抗原再刺激。又，以添加含最終濃度為10μM溶劑之培養液作為對照組。於37℃、5% CO2下培養細胞4小時後，添加Brefeldin A(BioLegend)，並進一步繼續培養。培養開始6小時後，回收細胞，並以PE-標記之抗-人類CD4抗體及FITC-標記之抗-人類CD8抗體染色。使用BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permiabilization套組(Becton Dickinson)及PerCP/Cy5.5-標記之抗-人類IFN-γ抗體進行細胞內
IFN-γ染色。使用EPICS-XL MCL(Beckman Coulter)進行分析。結果示於第6及7圖。由第6圖證實，WT1-332誘導組中，於第7天與第14天間，WT1-332-專一性Th1明顯且時間依賴性地增加。相對於溶劑誘導組，此增加具顯著性(P<0.0001)。由第7圖證實，WT1-332誘導組中，WT1-332-專一性CTL於第7天與第14天間呈時間依賴性地增加，相對於溶劑誘導組，此增加具顯著性(P<0.0001)。
於第14天，10μM溶劑存在下、20μg/mL WT1-332存在下、及20μg/mL WT1-332與10μg/mL抗-HLA-DR抗體(L243[G46-6]，BD Co.)存在下，培養經得自第21至37位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞24小時。培養後，利用ELISA(BD Co.)定量上澄液中之IFN-γ量；結果示於第8圖。得自第21至37位捐贈者之試樣顯示，經誘導之T細胞辨認WT1-332及產生IFN-γ，該反應受HLA-DR分子之限制。
又，於第14天，10μM溶劑存在下、20μg/mL WT1-332存在下、及20μg/mL WT1-332與10μg/mL抗-HLA-DR抗體(L243[G46-6]，BD Co.)或10μg/mL抗-HLA-DQ抗體(SPVL3，BC Co.)存在下，培養經得自第38至46位捐贈者之PBMCs誘導之T細胞24小時。培養後，利用ELISA(BD Co.)定量上澄液中之IFN-γ量；結果示於第11圖。於得自第38至46位捐贈者之試樣中，經誘導之T細胞辨認
WT1-332及產生IFN-γ，該反應不受抗-HLA-DR抗體與抗-HLA-DQ抗體之抑制。由彼等事實顯見，得自第38至46位捐贈者之經WT1-332-誘導之T細胞受HLA-DP分子之限制。
於第6及7圖之使用健康血液捐贈者(具有HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501、及0901至少一者之總共42位捐贈者)之結果中，有關HLA-DR-限制性及經WT1-332-專一性Th1誘導之17個試樣(第21至37位捐贈者)各者於第14天之結果示於第9及10圖。又，17個試樣(第21至37位捐贈者)各者之HLA第二類型(HLA-DRB1對偶基因與HLA-DPB1對偶基因之類型)示於下文表2。有鑑於此，DRB3*0202係與DRB1*1101、DRB1*1401及DRB1*1405呈連鎖不平衡狀態(於表中DRB1對偶基因以符號“Δ”表示)，DRB4*0101係與DRB1*0403、DRB1*0405及DRB1*0901呈連鎖不平衡狀態(於表中DRB1對偶基因以符號“▲”表示)。表中，以粗、斜體字表示之對偶基因代表新穎可相容之HLA-DRR1對偶基因。
從第9圖、第10圖及表2，於具有彼等HLA-DR對偶基因之細胞中，確認WT1-332專一性Th1與WT1-332專一性CTL之誘導。
又，於第6及7圖之使用健康血液捐贈者(具有
HLA-DRB1*1501、1502、0405、HLA-DPB1*0501、及0901至少一者之總共42位捐贈者)之結果中，有關HLA-DP-限制性及經WT1-332-專一性Th1誘導之9個試樣(第38至46位捐贈者)各者於第14天之結果示於第12及13圖。又，9個試樣(第38至46位捐贈者)各者之HLA第二類型(HLA-DRB1對偶基因與HLA-DPB1對偶基因之類型)示於下文表3。表中，符號“*”代表先前已知之可相容HLA-DPB1對偶基因。
從第12圖、第13圖及表3，於具有彼等HLA-DP對偶基因之細胞中，確認WT1-332專一性Th1與WT1-332專一性CTL之誘導。
本發明提供使用具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子、HLA-DRB1*1502分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0201分子、或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子能力之WT1胜肽活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞的方法、其組成物、經由活化助手T細胞及/或細胞毒性T細胞以治療及/或預防癌症之醫藥組成物等。因此，本發明可應用於醫藥等領域，例如，供高度表現WT1基因之各種造血器官腫瘤及實體癌之預防藥物或治療藥物之開發與生產領域。
<110> 國立大學法人大阪大學
大塚製藥股份有限公司
<120> 用於活化助手T細胞的方法
<130> 561549
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<223> 結合於第二類單體蛋白之正對照組胜肽
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 結合於第二類單體蛋白之負對照組胜肽
<400> 4
由於本案的圖為試驗數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。
Claims (13)
- 一種活體外用於活化助手T細胞的方法，該方法包括利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之步驟，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子及HLA-DPB1*0301分子之至少兩個第二類MHC分子之能力。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該WT1胜肽之添加至抗原呈現細胞，係利用添加WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多胜肽之表現載體、或含該表現載體之細胞而完成。
- 一種組成物，其含有利用添加WT1胜肽至抗原呈現細胞以活化助手T細胞之WT1胜肽，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第4項所述之組成物，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA- DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子、及HLA-DPB1*0301分子之至少兩個第二類MHC分子之能力。
- 如申請專利範圍第4或5項所述之組成物，其中該WT1胜肽之添加至抗原呈現細胞，係利用添加WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷酸之表現載體、或含該表現載體之細胞而完成。
- 一種抗原呈現細胞，其呈現含WT1胜肽之抗原胜肽與第二類MHC分子之複合體，其中該第二類MHC分子係HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 一種助手T細胞，其辨認含WT1胜肽之抗原胜肽與第 二類MHC分子之複合體，其中該第二類MHC分子係HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 一種細胞毒性T細胞，其被申請專利範圍第8項所述之助手T細胞活化。
- 一種用於治療或預防癌症之醫藥組成物，其包含申請專利範圍第4至6項中任一項所述之任一組成物、申請專利範圍第7項所述之抗原呈現細胞、申請專利範圍第8項所述之助手T細胞、或申請專利範圍第9項所述之細胞毒性T細胞作為活性成分。
- 一種用於活化細胞毒性T細胞之醫藥組成物，其包含WT1胜肽、編碼該WT1胜肽之多核苷酸、含該多核苷 酸之表現載體、或含該表現載體之細胞之任一者作為活性成分，係投與至具有HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之對象，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 一種專一性地結合於WT1胜肽之抗體，其中該WT1胜肽具有結合於HLA-DRB1*0101分子、HLA-DRB1*0401分子、HLA-DRB1*0403分子、HLA-DRB1*0406分子、HLA-DRB1*0803分子、HLA-DRB1*0901分子、HLA-DRB1*1101分子、HLA-DRB3*0202分子、HLA-DRB4*0101分子、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子之能力，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所定義之胺基酸序列。
- 一種測定WT1專一性助手T細胞之存在或量之方法，該方法係用於有關HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0403、HLA-DRB1*0406、HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB3*0202、HLA-DRB4*0101、HLA-DPB1*0201分子或HLA-DPB1*0301分子之任一第二類MHC分子為陽性之對象，該方法包括下述步驟(A)及(B)：(A)使用WT1胜肽刺激得自該對象之試樣，及(B)測定細胞介素或助手T細胞之存在或量，其中細胞介素或助手T細胞存在或量之增加顯示WT1專一性助手T細胞之存在或量，其中該WT1胜肽係胜肽(a)至(c)之任一者：(a)由SEQ ID NO：2(Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His)之胺基酸序列所組成之胜肽，其中1至5個胺基酸經置換、刪除或添加；(b)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；或(c)由25或更少個胺基酸所組成之胜肽，其含有(a)所 定義之胺基酸序列。
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