KR20120095263A

KR20120095263A - Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ２ｍＲＮＡ 발현을 감소시켜 유방암을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20120095263A
Application number: KR1020110014820A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 장지영
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2012-08-28
Also published as: CN103379914A; JP2014506888A; EP2675468A1; WO2012111900A1; EP2675468A4; CN103379914B

Abstract

본 발명은 ANT2 mRNA 발현을 감소시켜 유방암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ANT2 (adenine nucleotide translocator 2) siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물로써, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 조성물은 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)의 유방암 치료효과를 증가시키는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 줄기세포 치료용 조성물을 제공한다. 궁극적으로, 본 발명은 유방암 세포 전이 억제 효과 및 항암제 내성을 극복할 수 있는 우수한 효능을 가지는 유방암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 나아가 유방암 줄기세포 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ２ｍＲＮＡ 발현을 감소시켜 유방암을 치료하는 방법 {Method for treating breast cancer by decreasing the expression of adenine nucleotide translocator 2 mRNA}

본 발명은 adenine nucleotide translocator 2(ANT2) mRNA 발현수준을 감소시켜 유방암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 ANT2 siRNA(small interfering RNA) 또는 ANT2 shRNA(short hairpin RNA)를 이용하여 유방암을 치료하는 방법 등에 관한 것이다.

종양(tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비정상적이고 비제어적이며 무질서한 세포증식의 산물로써, 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor)으로 분류하게 된다. 특히, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 유전적 질환(genetic disease)이라고 할 수 있다.

현재까지 악성종양인 암을 치료하는 방법으로 주로 3가지 치료법 즉, 외과적인 수술, 방사선 치료 및 화학요법이 있으며, 이 중 한 가지 또는 이들의 조합을 통해 암을 치료하고 있다. 구체적으로, 외과적 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 방법으로, 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예를 들면 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데는 매우 효과적이지만, 척추와 같은 일부 부위에 있는 종양을 치료하거나 분산성 종양을 치료하기에는 부적절하다.

방사선 치료는 급성염증성 질환, 양성 또는 악성 종양, 내분비기능장애 및 알레르기성 질환 등에 사용되며, 일반적으로 급속히 분열하는 세포로 구성된 악성종양에 효과적으로 사용되고 있다. 이러한 방사선 치료의 단점으로는 방사선의 치료에 따라 정상조직의 기능 약화 또는 상실, 치료 후 치료부위에 피부질환이 발생할 우려가 있으며, 특히 장기의 발육이 진행되는 소아의 경우 지능발달 지연 또는 골 발육 장애 등 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

화학요법은 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 널리 이용되고 있는데, 이러한 방법에 있어서 가장 큰 단점은 암 치료에 이용되는 전신성 화학요법에 의하여 유도되는 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 중요한 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 불안감을 증가시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여 시 주의해야 하는 용량 제한 독성(dose limiting toxicity, DLT)이다. 예를 들면, 점막염은 여러 항암제(항대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실, 메소트렉세이트 및 항종양 항생제인 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성(DLT)이 있다. 이러한 화학 요법의 부작용 중 대부분은 심한 경우, 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위하여 진통제를 필요로 하기도 한다. 이처럼, 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 치료에 있어서 중요한 문제로 부각되고 있다.

반면에, 유전자 치료(gene therapy)는 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜서 유전자 결함을 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여 인체 세포의 유전적 변형으로 인한 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성 질병 및 자가면역질환 등을 치료하거나 예방하는 방법이다. 구체적으로는, 치료유전자(therapeutic gene)를 체내의 원하는 장기로 전달함으로써 세포 내에서 치료용 또는 정상 단백질이 발현될 수 있도록 유도하여 상기 질병들을 치료하는 방법을 유전자 치료(gene therapy)라고 한다. 이러한 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료법에 비하여 우수한 선택성을 가질 수 있으며 다른 치료법으로 조절하기 어려운 질병의 치료를 개선함으로써 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포에 전달하여 높은 효율로 발현할 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다.

유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로써, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달 및 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로써, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 대표적 유전자 전달체로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀 및 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다.

유전자 치료의 전략 중 종양세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법 및 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다. 구체적으로 종양억제 유전자를 이용하는 방법은, 상당수의 암환자에서 유전자가 결핍 또는 변형되어 있는 p53과 같은 종양억제 유전자를 원형으로 인체에 전달하여 암을 치료하는 방법이며, 종양 선택적 살상바이러스를 이용하는 방법은, 암조직에서 변형되어 있는 종양억제 유전자의 활성을 이용하여 종양세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 바이러스 유전자 전달체를 인체에 도입하여 치료하는 방법으로써 두 가지 모두 종양세포를 직접적으로 사멸시키는 전략이다. 또한, 자살 유전자를 이용하는 방법 예를 들면, HSK-TK와 같은 감수성 유전자를 도입하여 종양세포의 자살을 유도하는 방법도 이와 같은 범주에 포함된다. 반면에, 면역 조절 유전자를 도입하는 방법은 항종양 면역반응을 증가시키는 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 7(IL-7), 감마 인터페론(γ-interferon) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 유전자를 인체에 전달함으로써 T 세포를 매개로하여 종양을 인식하도록 유발하거나, 종양 유발 단백질을 차단함으로써 세포 자살을 유도하여 간접적으로 질병을 치료하는 전략이다.

상기와 같이, 암을 치료하는 다양한 방법 중 유전자 치료에 있어서 본 발명자들은 대표적 유전자로 ANT2(adenine nucleotide translocator 2)를 선택하여 효과적이며 안전한 항암 치료제 개발에 중점을 두어 왔다. 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터(ADP/ATP translocator, ANT)는 미토콘드리아 내막(inner membrane, IM)에 존재하는 효소로써 외막(outer membrane, OM)의 VDAC(voltage dependent anion channel)를 통하여 세포질로부터 미토콘드리아 내부로 ADP를 전달(import)하고 전자전달계(electron transfer chain system)를 거쳐 생성되는 ATP를 세포질로 방출(export)하는 기능을 수행하는 효소로 알려져 있다(HLA Vieira, et al., Cell Deathand Differentiation, 7, 1146-1154, 2000).

덧붙여, 세포의 에너지 대사에 필수적인 역할을 수행하는 ANT는 3개의 유사체(isoform)인 ANT1, ANT2 및 ANT3가 알려져 있으며 이 중에서 특히 ANT2는 정상세포에서는 그 발현이 낮지만 암세포 또는 증식능이 높은 세포에서는 매우 높게 발현되는 특징을 가지고 있는데 이는 혐기성 상태(anaerobic condition)에서의 해당(glycolysis)반응과 밀접한 관련이 있으며, 또한 최근에는 새로운 암 치료의 표적으로 제시된 바 있다(Chevrollier, A, et al.,Med. Sci., 21(2), 156-161, 2005).

본 발명자들은 ANT2 mRNA 발현수준을 특이적으로 감소시킬 수 있는 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA가 유방암 세포의 전이를 특이적으로 억제할 뿐만 아니라 유방암 줄기세포를 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 유방암 치료용 조성물 및 유방암 줄기세포를 치료하는 방법 등을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물, 및 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 줄기세포 치료용 조성물 등을 제공한다.

본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물로써, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스(anti-sense)서열이 서열번호 1로 기재된 센스(sense)서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로 상기 조성물은 HER2/neu(human epidermal growth factor receptor 2)의 발현을 저하시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)의 유방암 치료효과를 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 유방암 세포 표면의 DR4(death receptor 4) 및 DR5(death receptor 5)의 발현을 증가시키고 DcR1(death decoy receptor 1) 및 DcR2(death decoy receptor 2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 p53 단백질의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 줄기세포 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)의 발현 및 활성을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 항암제와 병용투여시 항암제에 대한 암세포의 반응성을 증가시키고 내성을 감소시켜 유방암 치료효과를 증진시키는 것을 특징으로 한다. 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)을 포함한다.

또한 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 유방암을 치료하는 방법으로, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 유방암 줄기세포를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 유방암 세포의 ANT2 유전자 발현을 감소시켜 효과적으로 세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 TRAIL 내성을 극복 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 특히 본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 유방암 세포의 전이를 억제하는 효과를 나타낸다. 이에 더하여 유방암 세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells)에서도 치료 효과가 확인되었으며, 이로 인해 유방암 줄기세포 치료제로서의 가능성이 기대된다. 궁극적으로, 본 발명은 유방암 세포 전이 억제 효과 및 항암제 내성을 극복할 수 있는 우수한 효능을 가지는 유방암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 나아가 유방암 줄기세포 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 HER2/neu의 발현을 감소시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 2A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 HSP90의 분해를 촉진시켜 HSP90의 발현을 감소시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 2B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 HER2의 발현을 감소시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 3A은 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 Akt의 활성을 감소시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 3B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 Akt의 활성을 감소시키며 ANT2 과발현에 의해 Akt의 활성이 회복된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 3C는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 HSP90과 Akt의 결합(interaction)이 감소되며 Akt의 활성을 감소시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 VEGF의 mRNA 발현이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 4B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 세포 내 VEGF의 단백질 발현이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 4C는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 VEGF의 mRNA 발현이 감소되며 ANT2의 과발현에 의해 VEGF의 발현이 회복된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MT1-MMP의 mRNA 발현이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 5B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MT1-MMP의 단백질 발현이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 6A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MT1-MMP의 mRNA 발현이 감소되며 PI3K의 과발현에 의해서 회복된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 6B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MT1-MMP의 단백질 발현이 감소되며 PI3K 과발현에 의해 회복된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 7A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MMP2와 MMP9의 mRNA 발현이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 7B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 MMP2와 MMP9의 활성이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 암 세포의 침습능력이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 8B는 HER2/neu를 과발현하는 유방암 세포 주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입하면 암 세포의 이동능력이 감소된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 9A는 유방암 세포 주인 MCF7은 TRAIL에 대해 내성을 나타내며 MDA-MB-231은 반응성(세포사멸)을 유도된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 9B는 유방암 세포 주인 MCF7은 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타낸다는 결과이다.
도 9C는 유방암 세포 주인 MCF7은 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타낸다는 것을 세포사진으로 제시한 결과이다.
도 10A는 유방암 세포주인 T47D와 BT474는 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타낸다는 결과이다.
도 10B는 유방암 세포 주인 MCF7은 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타내며, 여기에 ANT2발현 벡터를 도입하여 ANT2를 과 발현시키는 경우 사멸효과가 사라진다는 결과를 나타낸 것이다.
도 10C는 유방암 세포 주인 T47D와 BT474는 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타내는데, 이 때 수반되는 현상인 caspase-8/9/7의 cleavage, bid truncation, 그리고 미토콘드리아 파괴로 인한 cytochrome c의 방출이 증가한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 11A은 유방암 세포 주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 MCF7 세포주에서는 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5가 낮게 발현되고 TRAIL의 신호전달을 방해하는 decoy 수용체인 DcR1과 DcR2는 높게 발현된다는 것을 보여주며, 이와는 반대로 TRAIL에 대해 높은 반응성을 나타내는 MDA-MB-231 세포주의 경우 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5가 높게 발현되고 TRAIL의 신호전달을 방해하는 decoy 수용체인 DcR1과 DcR2는 낮게 발현된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 11B은 유방암 세포 주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 MCF7 세포주에서는 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5가 낮게 발현되고 TRAIL의 신호전달을 방해하는 decoy 수용체인 DcR1과 DcR2는 높게 발현되는데, ANT2 shRNA를 도입하면 DR5의 발현이 증가되고 DcR2의 발현이 감소된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 11C은 유방암 세포 주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 T47D와 BT474의 경우에도 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5가 낮게 발현되고 TRAIL의 신호전달을 방해하는 decoy 수용체인 DcR1과 DcR2는 높게 발현되는데, ANT2 shRNA를 도입하면 DR5의 발현이 증가되고 DcR2의 발현이 감소된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 12A는 유방암 세포주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 MCF7 세포 주에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 종양억제 유전자인 p53 단백질의 발현과 인산화/활성화가 증가된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 12B는 유방암 세포주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 MCF7 세포 주에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 종양억제 유전자인 p53 단백질의 전사조절능(transcriptional activity) 이 증가된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 12C는 유방암 세포주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 갖는 MCF7 세포 주에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 TRAIL의 수용체인 DR4와 DR5의 발현이 증가되는데, 이는 종양억제 유전자인 p53 단백질의 활성화에 의한 것임을 보여주는 결과이다.
도 13은 유방암 세포 주인 MCF7은 TRAIL에 대해 내성을 나타내지만 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 높은 반응성(세포사멸)을 나타내는데, 이는 종양억제 유전자인 p53 단백질의 활성화에 의한 것임을 보여주는 결과이다.
도 14A는 유방암 세포 주인 MCF7을 면역결핍 마우스인 Balb/c nude 마우스에 이식한 후 TRAIL과 ANT2 shRNA로 치료를 하는 경우 TRAIL 단독치료는 종양억제에 큰 영향을 미치지 못하고, ANT2 shRNA 단독 치료는 부분적인 종양억제 효과를 나타내며, TRAIL과 ANT2 shRNA를 함께 치료할 경우 가장 효과적인 종양억제효과를 나타낸다는 결과이다.
도 14B는 유방암 세포 주인 MCF7을 면역결핍 마우스인 Balb/c nude 마우스에 이식한 후 TRAIL과 ANT2 shRNA를 함께 치료할 경우 가장 효과적인 종양억제효과를 나타내는데, 이때 종양을 적출하여 TRAIL 수용체인 DR4와 DR5의 발현을 관찰한 결과 DR4와 DR5의 발현이 증가되어있음을 보여주는 결과이다.
도 15A는 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우와 분리하지 않은 경우 모두 ANT2가 높게 발현된다는 것을 역전사 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR) 실험으로 보여주는 결과이다.
도 15B는 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우와 분리하지 않은 경우 모두 ANT2가 높게 발현된다는 것을 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응법(real-time RT-PCR)으로 보여주는 결과이다.
도 16A는 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우 모양의 변화를 보여주는 결과이다.
도 16B는 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우 E-cadherin의 발현은 감소하고 ANT2의 발현이 증가함을 보여주는 결과이다.
도 17A는 유방암 세포 주인 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리하여 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 효과적으로 세포 사멸이 유도된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 17B는 유방암 세포 주인 MCF7로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리하여 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 효과적으로 세포 사멸이 유도된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 18A는 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 세포 사멸이 유도되지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.
도 18B는 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우, ANT2 shRNA를 도입하면 효과적으로 세포 사멸이 유도 된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 19A는 유방암 세포 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포가 높은 비율을 차지하는 MDA-MB-231의 경우 세포덩어리 형성능력이 높은 반면, CD44+/CD24- 세포가 낮은 비율을 차지하는 MCF7의 경우 세포덩어리 형성능력이 상대적으로 낮다는 것을 보여주며, 이에 ANT2 shRNA를 도입하게 되면 두 세포주 모두 세포덩어리 형성능이 감소된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 19B는 유방암 세포 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포가 높은 비율을 차지하는 MDA-MB-231의 경우 세포덩어리 형성능력이 높은 반면, CD44+/CD24- 세포가 낮은 비율을 차지하는 MCF7의 경우 세포덩어리 형성능력이 상대적으로 낮다는 것을 보여주며, 이에 ANT2 shRNA를 도입하게 되면 두 세포주 모두 세포덩어리 형성능이 감소된다는 것을 세포 사진으로 보여주는 결과이다.
도 20은 유방암 세포 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포가 높은 비율을 차지하는 MDA-MB-231의 경우 doxorubicin에 대해 높은 내성을 나타내며 이에 ANT2 shRNA를 도입하게 되면 CD44+/CD24- 세포만을 분리하지 않은 경우와 분리한 경우 모두 doxorubicin에 대한 반응성이 높아진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 21은 유방암 세포 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포가 낮은 비율을 차지하는 MCF7의 경우 doxorubicin에 대해 반응성을 나타내지만 (adherent cells) CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우 (floating cells) 내성을 나타내게 된다. 이에 ANT2 shRNA를 도입하게 되면 CD44+/CD24- 세포만을 분리하지 않은 경우와 분리한 경우 모두 doxorubicin에 대한 반응성이 높아진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 22는 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우에는, 분리하지 않은 경우와 달리, 약물내성에(drug resistance) 관여하는 ABCG2의 mRNA 발현이 높으며(좌), 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우, ABCG2의 mRNA 발현이 높아진다는 것을 보여주는 결과이다 (우).
도 23은 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우에는, 분리하지 않은 경우와 달리, 약물내성(drug resistance)에 관여하는 ABCG2의 단백질 발현이 높으며 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 낮아진다는 것을 보여주는 결과이다. 그리고, 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우, ABCG2의 단백질 발현이 높아지며 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 낮아진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 24는 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우에는, 분리하지 않은 경우와 달리, 약물내성(drug resistance)에 관여하는 ABCG2의 활성이 높아지고, 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우, ABCG2의 활성이 높아진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 25는 유방암 세포 주인 MCF7과 MDA-MB-231로부터 모체가 되는 세포인 CD44+/CD24- 세포만을 분리한 경우에는, 분리하지 않은 경우와 달리, 약물내성(drug resistance)에 관여하는 ABCG2의 활성이 높으며 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 낮아지는 것을 보여주며, 아울러 정상 유방 상피세포 주인 MCF10A에 E-cadherin shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도할 경우, ABCG2의 활성이 높아지며 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 낮아진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 26은 유방암세포의 모체가 되는 세포 표면에 높게 발현되어 있는 CD44 를 표적으로 하는 운반물질인 나노입자가 CD44 발현이 높은 세포주에 ANT2 shRNA를 선택적으로 전달하는 것을 보여주는 결과이다.

본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물로써, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 가 유방암 세포의 다른 조직으로의 이동 및 침윤을 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

유방암 세포는 세포 표면에 발현하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR : Epidermal growth factor receptor)를 통해서 세포 내에 특정 신호전달 체계를 활성화 시켜서 세포의 증식, 생존, 다른 조직으로의 이동과 침윤을 가능하게 한다고 알려져 있다. 특히 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 가운데 HER2/neu 의 경우 유방암 환자의 30% 정도가 암 세포 표면에 과발현 하고 있다고 보고되어 있으며, HER2/neu 가 과발현 되어 있는 경우 치료의 예후가 나쁘며 항암치료에 대한 강한 내성(multi-drug resistance)을 나타낸다고 알려져 있다. 또한 HER2/neu 를 통해서 활성화되는 대표적인 신호전달체계로는 PI3K/Akt 신호전달체계가 알려져 있으며, 이 신호전달체계의 활성이 유방암 세포의 증식, 생존, 다른 조직으로의 이동과 침윤에 관여 한다고 보고되어 있다. 따라서 HER2/neu 의 발현을 낮추거나 HER2/neu 를 통한 신호전달체계의 활성을 방해하는 방법을 이용해서 유방암을 치료하고자 하는 많은 시도들이 현재 이루어지고 있다.

본 발명자들은 유방암 세포에서 과발현하며 유방암 세포의 에너지 생산 (ATP production)에 결정적인 역할을 한다고 알려진 ANT2 유전자에 대하여 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 이용하여 발현을 억제 시켰을 경우 암 세포가 살아가는데 필요한 에너지 공급이 원활하지 아니하게 되어 암세포의 사멸을 초래할 뿐만 아니라 이에 더하여 암세포가 다른 조직으로 이동하거나 침윤하는 것을 막아서 전이를 억제시킬 수 있음을 발견하였다.

한편, 유방암 세포 표면의 HER2/neu의 발현은 HSP90(Heat shock protein 90) 이라는 단백질에 의해 유지 된다고 보고되어 있으며, HSP90 단백질은 ATP가 결합할 때 그 기능을 수행할 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 이용해서 암 세포 내의 ATP를 결핍시키게 되면, HSP90에 충분한 ATP가 결합하지 못하게 될 것이고, 즉, HSP90이 제 기능을 수행하지 못해서 HER2/neu의 분해가 촉진될 것이라 예상하였으며, HER2/neu의 분해는 HER2/neu를 통한 PI3K/Akt 신호전달체계의 활성 약화로 이어지고 결국 유방암 세포가 다른 조직으로 이동하고 침윤할 수 있는 능력이 감소될 것이라는 가설을 세웠다. 이를 검증하기 위해 인간 유방암 세포 주 가운데 HER2/neu 가 높게 발현 하고 있다고 알려진 SK-BR3라는 인간 유방암 세포 주를 대상으로 ANT2 shRNA를 도입시켜 ANT2 발현을 저하 시켰다. 그 결과 세포 내 ATP 결핍이 HSP90 단백질의 활성을 저하시켜 HER2/neu 발현을 감소시킴을 관찰하였으며, 이에 더하여 HER2/neu를 통한 PI3K/Akt 신호전달체계의 활성이 약화 되고 유방암 세포의 다른 조직으로의 이동과 침윤 능력이 억제 된다는 것을 실험적으로 확인 하였다.

본 발명의 다른 측면은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물로써, TRAIL 의 유방암 치료효과를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

종양 사멸인자인 TRAIL/apo2 ligand 는 정상세포는 죽이지 않으면서 암 세포만을 선택적으로 죽인다는 장점을 가지고 있다. 그러나, TRAIL을 항암제로 사용하는데 있어 암 세포가 이에 대해 내성을 갖는다는 한계를 가지고 있어서 이를 극복하기 위한 많은 연구들이 이루어지고 있다. 따라서 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 이용하여 TRAIL 에 대한 내성을 극복하는 방안을 모색하고자 하였다.

본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 유방암 세포에 도입 할 경우, TRAIL에 의한 암 세포의 사멸을 증가 시키며 세포배양 조건(in vitro)에서와 동물 모델에서(in vivo) TRAIL에 의한 종양성장 억제 효과를 증폭 시킨다는 것을 확인 하였다. 이 때 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 가 TRAIL에 의한 유방암 세포 사멸 효과를 증폭시키는 기작으로 TRAIL 수용체(TRAIL receptor)의 발현을 조절한다는 것을 밝혔다. TRAIL의 수용체에는 DR4(TRAILR1 : TRAIL receptor 1)와 DR5(TRAILR2 : TRAIL receptor 2)가 있으며 DR4와 DR5에 TRAIL이 결합할 경우 세포 내로 세포 사멸의 신호가 전달되어 암 세포가 죽음에 이르게 된다. 하지만 TRAIL의 수용체 가운데 DcR1(decoy receptors 1: TRAILR3)과 DcR2(decoy receptors 2: TRAILR4)의 경우 DR4와 DR5에 의한 암 세포 사멸로부터 암 세포를 보호하는 역할을 하게 된다. 즉 TRAIL이 DcR1 과 DcR2에 결합하는 경우 암세포 내부로 정상적인 세포사멸 신호가 전달되지 않는다. 즉, 암 세포가 TRAIL에 대해 내성을 나타내는 원인에는 여러 가지 이유가 있는데 암 세포 표면의 DR4와 DR5의 발현이 감소하고 DcR1과 DcR2의 발현이 증가하는 것 또한 중요한 원인으로 작용한다고 알려져 있다. 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 에 의한 암 세포 내부의 신호전달 체계의 변화가 암 세포 표면의 DR4와 DR5의 발현을 증가시키고 DcR1과 DcR2의 발현을 감소 시켜서 TRAIL에 대한 반응성을 높이고 내성을 극복할 수 있다는 것을 규명 하였다.

결론적으로 본 발명자들은 유방암 세포를 치료하는데 있어 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 가 TRAIL에 대한 치료효과를 증폭시킬 수 있고, TRAIL에 대한 내성을 극복 할 수 있다는 것을 세포배양 실험(in vitro)과 동물실험(in vivo)을 통해서 최초로 규명하였으며, 그 기작은 TRAIL 수용체의 발현 조절을 통한 것이라는 것을 최초로 실험적으로 증명하였다.

본 발명의 또 다른 측면은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 유방암 줄기세포 치료용 조성물을 제공한다.

현재 유방암 세포를 대상으로 항암치료와 방사선치료가 이루어지고 있지만, 가장 큰 문제점은 치료 이후에 새로운 종양이 생성되는 현상(암의 재발)이 나타나는 것이다. 이는 암 덩어리를 구성하는 암 세포는 효과적으로 죽일 수 있지만 암 덩어리를 구성하는 세포 중 매우 적은 숫자를 차지하는 유방암 줄기세포(breast cancer stem cells)가 살아남아 새로운 종양을 생성하게 되는 것이다. 따라서 유방암줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있는 치료법을 개발하는 것이 매우 중요하며 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA가 유방암줄기세포 치료제로서 효과를 가짐을 밝혔다.

본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 의 유방암줄기세포 치료제로서의 가능성과 효과를 확인하기 위하여 유방암 줄기세포로 유방암 세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells)에 해당하는 CD44+/CD24- 세포 집단만을 분리하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 유방 상피 세포인 MCF10A에 발현하는 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로의 분화를 유도하여 ANT2 shRNA의 치료 효과를 확인하였다. 이는 상피 세포가 간엽 세포(mesenchymal cell)로 전환이 될 때 (epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) 유방암 줄기 세포의 특성을 갖는다고 알려진 것에 기초한 것이다. 그리고, 유방암 줄기세포 내로 ANT2 shRNA를 효과적으로 전달하기 위해서 아데노바이러스 시스템을 이용하였다. 즉 ANT2 shRNA를 발현하는 아데노바이러스를 제작 생산하여 유방암 줄기세포에 감염을 시켜 사용하였다. 그 결과 유방암 줄기세포의 특징을 갖는 두 가지 세포집단에서 모두 효과적으로 ANT2 shRNA에 의하여 세포 사멸이 유도되었으며, 유방암 줄기 세포의 항암제 내성을 극복하여 항암제에 대한 효과를 증폭시킨다는 결과를 얻을 수 있었다.

또한 상기 본 발명의 조성물은 기존의 항암제 치료법(예를 들면 doxorubicin)을 병행할 경우 항암제에 대한 반응성을 높이고 내성을 감소시켜 유방암 치료효과를 증진시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 측면은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 유방암을 치료하는 방법으로, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 유방암 줄기세포를 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여횟수, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

ANT2 shRNA 의 발현벡터 제작

미국 국립생명공학정보센터(Nationanl Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수한 ANT2 mRNA 염기서열은 Genebank Accession No. NM_001152이다. 이 염기서열을 siRNA 예측 프로그램(http://www.ambion.com/technical, resources/siRNA target finder)에 대입하여 적합한 ANT2 siRNA 후보 염기서열을 확보하였고, 여러 후보 염기서열 가운데 ANT2 mRNA의 두 번째 엑손에 해당하는 염기서열인 5' GCAGAUCACUGCAGAUAAG 3'에 결합하는 siRNA를 제작하여 ANT2 siRNA에 의한 ANT2 mRNA의 감소(silencing)효과를 세포 수준(in vitro)에서 확인하였다 [이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다].

이 결과를 토대로 shRNA를 제작하기 위하여 다음과 같은 염기서열의 올리고머 두 가닥을 합성하고[이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다],

상기 두 가닥의 올리고머를 결합(annealing) 시킨 후, pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion사)의 MCS(multi-cloning site)내 BamHI과 HindIII 부위에 클로닝하여 제작하였다. 이 때 상기 센스서열에 이어 siRNA 발현유도의 효율을 증가시키도록 TT를 첨가하였다. 또한, ANT2 shRNA의 효과를 확인하기 위해 진행한 모든 실험에는 ANT2 발현을 차단하지 못하면서, 세포 내 특정 mRNA의 발현에는 영향을 끼치지 않는 스크램블(scrambled) shRNA를 음성 대조군으로 사용하였으며, 이는 동일한 조건을 제공해주는 역할을 하는 것으로 Ambion사에서 구입하여 사용하였다.

상기 벡터로 부터 발현이 되는 shRNA의 염기서열은 서열번호 1 내지 3으로 서열목록에 별도로 기재하였다.

실시예 1. HER2 / neu 의 발현에 대한 ANT2 shRNA 의 효과

본 발명자들은 간 유방암 세포주인 SK-BR3 표면에 높게 발현하는 HER2/neu가 ANT2 shRNA의 도입으로 인해 감소됨을 유세포 분석기(FACS : flow cytometry and cell sorting)를 통해 확인 하였다.

이 때 ANT2 shRNA를 유방암 세포주인 SK-BR3에 도입하기 위해 사용된 방법은 비바이러스성 전달체인 Lipofectamine^TM2000(Invitrogen 제품)이라는 물질을 사용하였으며 세포 안으로 shRNA가 들어가는 원리는 Lipofectamine^TM2000의 positive charge를 띄는 hydrophilic한 부분과 shRNA의 negative charge가 서로 interaction에 의해 complex를 만들고 Lipofectamine^TM2000이 세포막과 융합되어 shRNA가 세포 안으로 들어가게 된다.

구체적으로, 유세포 분석기를 이용한 실험은 세포 표면에 발현하는 HER2/neu 와 결합하는 항체를 붙이고 [1차 항체 : anti-human HER2/neu antibody (Santa Cruz biotechnology, Heidelberg, Germany)], 이 항체에 결합하는 항체인 2차 항체 (FITC-conjugated-anti--rabbit-IgG : Santa Cruz biotechnology, Heidelberg, Germany)를 붙였다. 2차 항체의 경우 형광 물질이 결합되어 있어 유세포 분석기가 이를 인지하게 되어 HER2/nen가 발현 되어 있는 세포와 발현되어 있지 않는 세포를 구분하게 된다. 그 결과 SK-BR3는 HER2/neu를 높게 발현하게 되는데(sc shRNA) ANT2 shRNA를 도입하는 경우 HER2/neu의 발현이 감소됨을 확인하였다 (도 1 참조).

또한 본 발명자들은 인간 유방암 세포주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입시켜 ANT2 발현을 감소시키고 세포로부터 단백질을 추출하여 HER2/neu와 HSP90의 상호작용(interaction)의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 먼저 HER2/neu와 결합하는 항체 [anti-human HER2/neu antibody : Santa Cruz biotechnology (Heidelberg, Germany)]로 면역 침강(immuno-precipitation)을 시키고 HSP90에 결합하는 항체(구체적인 기재요망) [anti-human HSP90 antibody : Santa Cruz biotechnology (Heidelberg, Germany]로 단백질 발현정도(western-blot)를 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA로 인해 ANT2 발현이 감소 된 경우 HER2/neu와 HSP90의 상호작용이 감소되어 있으며, 세포 내에서 단백질이 분해되기 전에 나타나는 현상인 유비퀴티네이션(ubiquitination)이 증가되어 있음을 확인하였다. 즉 ANT2 shRNA에 의해 HER2/neu와 HSP90과의 상호 작용이 감소하고 이로 인해 HER2/neu의 유비퀴티네이션이 증가 되어 HER2/neu의 분해가 증가되므로 결과적으로 HER2/neu 발현이 감소함을 확인 하였다. 이 때 양성대조군(positive control)으로 17-AAG라는 HSP90 억제약물 [HSP inhibitor/17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin) : A.G. Scientific Inc. (San Diego, CA)]을 사용하였으며, 실험에 사용된 단백질 양이 동일했다는 것을 보여주기 위해서 세포골격을 구성하는 단백질로써 세포 외부나 내부의 변화에 영향을 받지 않는 beta-actin 단백질 양이 동일함을 보여주었다 [anti-beta-actin antibody : Cell signaling Tech. (Beverly, MA)].

실시예 2. Akt 활성 변화에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암 세포 주인 SK-BR3에 높게 발현되어 있는 HER2/neu 는 Akt라는 단백질을 활성화시키며, 활성화된 Akt는 유방암 세포의 생존을 유지하는 기작뿐만 아니라 다른 조직으로의 이동과 침윤에 관여한다고 알려져 있으며, Akt의 활성화는 특정 아미노산의 인산화(phosphorylation) 정도를 통해 확인할 수 있다.

본 발명자들은 인간 유방암 세포주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA의 도입시켜 활성화된 Akt 단백질 양(phosphorylated Akt)을 확인하였다 [Anti-Akt and anti-phospho-Akt antibodies : Cell signaling Tech. (Beverly, MA)]. 그 결과 평소에 높은 활성도를 보이던 Akt가 ANT2 shRNA의 도입으로 감소됨을 확인 할 수 있었으며 양성 대조군으로 HSP90 억제 약물인 17-AAG를 사용하였는데 이는 HSP90을 억제 하여 HER2/neu를 통한 Akt의 활성을 억제 시킨다고 알려져 있다 (도 3A 참조).

또한 ANT2 shRNA가 Akt의 활성을 저하시킨다는 것을 재확인하는 실험을 수행하였다. ANT2 shRNA에 의해서 ANT2 발현이 감소 될 때 감소되었던 인산화 된-Akt (phospho-Akt) 양이, ANT2를 과발현 시키는 벡터를 도입하여 ANT2의 발현을 증가켰을 때 다시 회복되는 것을 확인 하였고, 양성대조군으로 Akt의 인산화를 유도하는 단백질인 PI3K의 억제약물 [LY294002 : Calbiochem (San Diego, CA)]을 사용하였다 (도 3B 참조).

이에 더하여, 본 발명자들은 ANT2 shRNA가 Akt의 활성을 저하시키는 것과 관련하여, HSP90이 Akt와도 상호작용을 하고 있다는 보고에 기초하여 ANT2 shRNA가 HSP90의 활성을 저하시키고 이로 인해서 Akt와의 상호 작용이 저하되는지 확인하는 실험을 수행하였다.

먼저 HSP90과 결합하는 항체 [HSP inhibitor/17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin) : A.G. Scientific Inc. (San Diego, CA)]로 면역 침강 (immuno-precipitation)을 시키고 Akt와 결합하는 항체 [Anti-Akt antibody : Cell signaling Tech. (Beverly, MA)]로 단백질 발현정도(western-blot)를 확인하였다. 그 결과 ANT2 shRNA로 인해 HSP90과 Akt와의 상호작용이 감소되어 있으며 활성화된 Akt (phospho-Akt)의 양도 감소하는 것을 확인 하였다 (도 3C 참조). 상기결과는 ANT2 shRNA에 의한 HSP90의 활성도 저하는 HSP90과 Akt와의 상호작용을 감소시킬 뿐만 아니라 Akt의 활성도 억제시킨다는 것을 의미한다.

실시예 3. VEGF 의 생산에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

본 발명자들은 인간 유방암 세포주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입시키면 Akt 활성이 저하되고 (PI3K/Akt 신호전달 체계의 약화) 궁극적으로 암 세포 주변의 신생혈관 형성(angiogenesis)에 관여하는 VEGF 단백질의 생산을 저하시킴을 확인하였다.

구체적으로, ANT2 shRNA를 세포에 도입한 후 일정 시간 (24h)배양하고, 전체 RNAs(total RNAs)를 추출한 뒤 mRNA만을 oligo-dT를 이용하여(mRNA 3' 말단에 poly T가 있다는 것을 이용 함) 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성한 다음 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 VEGF의 발현을 분석하였다.

도 4A에 나타낸 바와 같이, ANT2 shRNA를 유방암 세포주인 SK-BR3에 도입시키면 신생혈관 형성(angiogenesis)에 관여하는 VEGF mRNA의 발현이 감소됨을 역전사 중합효소 증폭 반응(RT-PCR)을 통해서 확인하였다.

또한 VEGF의 세포 내 단백질 양도 감소된다는 것을 유세포 분석기(FACS : flow cytometry and cell sorting)를 통해 확인 하였다. 이 때 VEGF는 세포 내에서 생산이 되고 나서 세포 바깥으로 분비가 되는 단백질이므로 이를 막기 위해서 BFA(brefeldin A)라는 약물을 처리하여 세포 내에 축적시킨 후 VEGF 단백질 양의 차이를 비교 하였다. 구체적으로, BFA를 처리하여 세포 내에 VEGF를 축적시킨 후 세포막에 구멍을 뚫어 VEGF와 결합하는 1차 항체 [anti-VEGF antibody : BD Pharmingen (San Diego, CA)]를 세포 내로 투입하여 VEGF와 결합시키고 그 다음 형광물질이 결합된 2차 항체[FITC-conjugated-anti-mouse IgG antibody : BD Pharmingen (San Diego, CA)]를 1차 항체와 결합시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다 (도 4B 참조).

이에 더하여, ANT2 shRNA가 VEGF의 mRNA 발현을 저하시킨다는 것을 재확인하는 실험을 수행하였다. ANT2를 과발현하는 벡터(pcDNA3.0-ANT2 expression vector)를 도입시켜 ANT2의 발현을 증가시키면 VEGF mRNA의 발현이 회복되는 것을 확인 하였고, 양성대조군으로 Akt의 인산화를 유도하는 단백질인 PI3K의 억제약물 (LY294002)을 사용하였다 (도 4C 참조). 이는 PI3K/Akt 신호전달 체계의 활성에 의해 VEGF mRNA 발현이 유도 된다는 사실에 근거한 것이다.

실시예 4. MMPs 발현 및 활성에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

본 발명자들은 인간 유방암 세포주인 SK-BR3에 ANT2 shRNA를 도입시키면 Akt 활성이 저하되어 (PI3K/Akt 신호전달 체계의 약화) 암 세포 주변의 조직(ECM : extracellular matrix)을 분해하여 암 세포의 이동과 침윤에 관여하는 단백질인 MMPs(Matrix metalloproteinases)의 발현과 활성을 저하 시킴을 확인하였다.

구체적으로, MMPs 가운데 VEGF에 의해 발현이 조절된다고 보고되어 있는 MT1-MMP의 발현 변화를 조사하였으며, 그 다음 MT1-MMP에 의해 발현과 활성이 조절된다고 알려져 있는 MMP2와 MMP9의 발현과 활성의 변화를 관찰 하였다.

먼저 ANT2 shRNA를 유방암 세포주인 SK-BR3에 도입시키면 암세포 주변 조직의 분해에 관여하는 MT1-MMP의 mRNA의 발현이 감소됨을 역전사 중합효소 증폭 반응(RT-PCR)을 통해 확인하였으며 (도 5A 참조), 아울러 MT1-MMP의 단백질 양이 감소됨을 확인 하였다 (Western-blot) (도 5B 참조). 또한, ANT2 shRNA가 MT1-MMP의 mRNA 발현을 저하시킨다는 것을 재확인하기 위해서, PI3K를 과 발현하는 벡터 [wild-type PI3K/p110 vectors (provided by Dr. Karin Reif)]를 도입시켜 인위적으로 PI3K/Akt 신호 절달 체계를 활성화 시키면 MT1-MMP mRNA의 발현이 회복되는 것을 역전사 중합효소 증폭 반응(RT-PCR)으로 확인 하였으며 (도 6A 참조), 아울러 MT1-MMP의 단백질 양이 회복됨을 확인 하였다 (Western-blot) (도 6B 참조).

이에 더하여, ANT2 shRNA를 유방암 세포주인 SK-BR3에 도입시키면 MT1-MMP에 의해 조절이 되는 MMP2 mRNA 및 MMP9 mRNA의 발현이 감소됨을 역전사 중합효소 증폭 반응(RT-PCR)을 통해 확인 하였다 (도 7A 참조). 이 때 실험에 사용된 mRNA 양이 동일하다는 것을 보여주기 위해서 세포 외부나 내부의 변화에 영향을 받지 않는 GAPDH 유전자의 mRNA의 양이 동일함을 보여주었다. 아울러, ANT2 shRNA를 유방암 세포주인 SK-BR3에 도입시키면 MT1-MMP에 의해 조절이 되는 MMP2와 MMP9의 단백질 활성이 감소됨을 젤라틴 자이모그래피(Gelatin Zymography)를 통해서 확인 하였으며 이 때 MMP2와 MMP9의 젤라틴 분해 능력이 클수록 흰색 밴드가 강하게 나타나고 활성화 형태(active form)의 MMP2와 MMP9의 양이 증가됨을 관찰 하였다 (도 7B 참조).

실시예 5. 유방암 세포주의 이동능력과 다른 조직으로의 침윤 능력에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

상기 실시예 4로부터, ANT2 shRNA의 도입으로 암 세포의 이동과 침윤에 관여하는 단백질인 MMPs(Matrix metalloproteinases)의 발현과 활성이 저하된다는 것을 확인하였으며, 이어 더하여 실제로 암세포의 이동 능력과 침윤 능력이 얼마나 저하 되었는지를 관찰하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

ANT2 shRNA가 암 세포의 침윤과 이동 능력을 저하 시킬 시킬 수 있다는 것을 확인하기 위하여 matrigel invasion assay 및 transwell migration assay 를 실시하였다. Matrigel invasion assay 는 matrigel을 분해하여 이동한 암세포를 염색함으로써 암세포의 침윤능력을 분석하는 방법이다. 구체적으로, ANT2 shRNA를 도입한 유방암 세포주(SK-BR3)를 18시간 배양하고, 이를 materigel invasion chamber(Becton Dickinson labware, USA) 상층에 100㎕의 0.1% BSA, α-MEM에 세포(2×10⁴cells)가 들어 있도록 하여 배양하였다. 24시간 후, 상부의 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 면봉으로 상부의 세포를 제거하였다. Matrigel을 통과하여 well의 바깥쪽 바닥에 붙어있는 세포를 10% formalin으로 10분간 고정하고 0.1% crystal violet으로 20분간 염색하였다. 염색된 세포의 수를 현미경 하에서 계측하였다. 그리고, 암 세포의 이동능력을 비교 확인하기 위하여 transwell migration assay 방법을 이용하였다. 먼저 pore size 8㎛ transwell insert(Corning)의 아래 면을 gelatin(Sigma)으로 코팅한 다음 transwell insert의 내부에 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 10 ng/㎖의 bFGF(Sigma)를 첨가한 무 혈청 배지를 넣어주었다. 일정시간 (18시간) 배양이 끝나면 insert의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였으며 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 Diff-Quick solution으로 염색하여 200배 현미경 시야에서 계측하였다.

그 결과, ANT2 shRNA를 도입한 경우 matrigel과 transwell을 통과하여 염색이 되는 세포의 수가 감소하는 것을 확인 하였으며, 이를 통해 암 세포의 침윤과 이동 능력이 감소되었음을 확인할 수 있었다 (도 8 참조).

실시예 6. TRAIL 에 대한 반응성에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암 세포주에 ANT2 shRNA를 도입할 경우 TRAIL에 대한 반응성(암 세포 사멸) 에 미치는 효과를 고찰하였다.

본 실험에서는 유방암 세포 주로 TRAIL에 대해 내성을 보이는 MCF7, 및 TRAIL에 대해 높은 반응성을 보이는 MDA-MB-231을 사용하였다. MCF7 및 MDA-MB-231을 대상으로 TRAIL을 농도 별로 처리한 후, 세포의 사멸 정도를 CCK8 시약을 이용하여 확인하였다. CCK8 분석법은 살아있는 세포를 계측하는 방법이다. 구체적으로, 세포배양액 100㎕ (1 x 10⁴ cells/well)을 각 well 에 분주하고 TRAIL을 최종 농도가 1㎍/㎖에서 0이 되게 10배씩 계단 희석하여 처리한 후 12 시간 배양하고 CCK8 시약을 10㎕ 첨가한 후 적당시간 (4시간) CO₂ incubator에서 배양하고 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 사멸 정도를 측정하였다.

그 결과 MDA-MB-231의 경우 TRAIL에 의해 효과적인 사멸이 유도되는 반면 MCF7 세포의 경우 TRAIL에 의한 세포 사멸이 거의 유도되지 않는 것을 관찰 하였다 (도 9A 참조). 이 때 사용한 실험 방법은 배양하는 세포에 CCK8 시약을 넣을 경우 살아 있는 세포만이 색깔의 변화가 나타나며 특정 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하는 방법이다.

유방암 세포 주 가운데 TRAIL에 대해 내성을 나타내는 MCF7 세포는 100 ng/㎖에서 세포 사멸이 유도되지 않는다. 하지만 MCF7 세포에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 ANT2 shRNA 단독에 의해서도 세포 사멸이 유도 되지만 (~25%) TRAIL과 동시 처리하는 경우 세포사멸이 유도되지 않았던 TRAIL 단독 효과와는 달리 세포 사멸이 강하게 유도됨을 (~65%) CCK8 시약을 통해서 확인하였다 (도 9B 참조). 이 때 ANT2 shRNA의 도입에 의해 세포 내의 ANT2 단백질 발현이 감소 되어 있음을 Western-blot으로 확인 하였다. TRAIL에 대한 음성 대조군으로는 PBS를 사용하였으며 ANT2 shRNA에 대한 음성 대조군으로는 특정 mRNA의 발현에 영향을 끼치지 않는 sc shRNA(scrambled shRNA)를 도입하였다.

이어, TRAIL에 대해 내성을 나타내는 MCF7 세포에 대해 TRAIL 단독처리시, ANT2 shRNA 단독 도입시, ANT2 shRNA와 TRAIL 을 동시처리시 세포사멸 정도를 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 9C에 나타내었다. 도 9C에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA와 TRAIL 을 동시 처리시 세포사멸이 가장 강하게 유도됨을 알 수 있다.

또한 유방암 세포 주 가운데, TRAIL에 대해 내성을 갖는다고 보고가 되어져 있는 T47D와 BT474 세포 주에서도 동일한 방법으로 상기 실험을 실시한 결과, MCF7 과 동일한 효과를 나타냄을 관찰하였다 (도 10A 참조). 이 때 CCK8 시약을 통해 세포 사멸 정도를 정량화 하였다.

이에 더하여, TRAIL에 대한 반응성이 증가한 이유는 ANT2 shRNA에 의한 ANT2 발현 감소로 인한 것이라는 것을 재확인하기 위하여, ANT2 유전자를 발현하는 벡터(pcDNA-ANT2)를 이용하여 인위적으로 ANT2를 과 발현 시켜 TRAIL에 의한 세포사멸이 억제됨을 관찰 하였고 CCK8 시약을 통해 세포 사멸 정도를 정량화 하였다 (도 10B 참조). pcDNA-ANT2에 대한 음성 대조군으로는 아무런 유전자도 발현하지 않는 빈 벡터(empty vector)인 pcDNA벡터를 도입하였고 ANT2 shRNA에 의해서 TRAIL에 대한 반응성이 증가하여 세포사멸이 유도될 때, 세포사멸에 의해 수반되는 세포 내 단백질의 변화(PARP 단백질의 cleavage, caspase-8/9/7 단백질의 cleavage, Bid 단백질의 truncation)를 Western-blot으로 확인 하였다.

또한 ANT2 shRNA와 TRAIL에 의한 세포 사멸이 미토콘드리아를 매개로 이루어지므로, 파괴 될 때 미토콘드리아에서 세포질로 유출되는 단백질인 cytochrome C 양의 변화를 관찰하였다. 동일한 양의 미토콘드리아 단백질이 실험에 사용되었음을 미토콘드리아 단백질인 COX IV 단백질 양에 변화가 없음으로 확인 하였다. 그 결과 TRAIL 단독에 의해서는 세포사멸에 의해 유도되는 단백질의 변화가 관찰되지 않았지만, ANT2 shRNA와 TRAIL을 동시에 처리 했을 때 ANT2 shRNA 단독보다 더 큰 변화가 관찰됨을 확인하였다 (도 10C 참조). 즉, 세포 내의 단백질 변화를 통해 ANT2 shRNA가 TRAIL에 의한 세포 사멸을 증가시켰다는 것을 다시 한 번 확인하였다.

실시예 7. TRAIL 수용체 발현에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암 세포주 가운데 TRAIL에 대해 서로 다른 반응성을 보이는 MCF7과 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 TRAIL과 결합하는 수용체인 DR4, DR5, DcR1, or DcR2의 발현 정도를 Western-blot으로 확인 하였다.

DR4와 DR5의 경우 TRAIL이 결합하면 정상적인 세포 사멸 신호를 세포내부로 전달하지만 DcR1과 DcR2의 경우 TRAIL이 결합해도 세포 사멸 신호를 전달하지 못한다. 즉 DR4와 DR5의 발현은 높을수록 DcR1과 DcR2의 발현은 낮을수록 TRAIL에 대한 반응성이 높아질 수 있다.

도 11A 에 나타난 바와 같이, TRAIL에 대한 반응성이 낮은 MCF7 세포인 경우 DR4와 DR5의 발현은 낮고 DcR1과 DcR2의 발현은 높게 관찰되며, TRAIL에 대한 반응성이 높은 MDA-MB-231 세포인 경우 DR4와 DR5의 발현은 높고 DcR1과 DcR2의 발현은 낮게 관찰되었다.

이어, ANT2 shRNA를 도입 시 TRAIL 수용체 발현의 변화를 조사하여 그 결과를 도 11B 에 나타내었다. 도 11B에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA의 도입이 DR4와 DR5의 발현을 증가시키고 DcR1과 DcR2의 발현을 감소시킴을 알 수 있다. 유방암 세포 주 가운데, TRAIL에 대해 내성을 갖는다고 보고가 되어져 있는 T47D와 BT474 세포 주에서도 MCF7과 동일한 효과를 관찰하였다. 즉 ANT2 shRNA의 도입이 DR4와 DR5의 발현을 증가시키고 DcR1과 DcR2의 발현을 감소시킴을 관찰 하였다 (도 11C 참조).

실시예 8. p53 의 활성에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

ANT2 shRNA의 도입이 DR4와 DR5의 발현을 증가시키는 기작을 규명하는 실험을 수행하였다. 종양억제 인자인 p53은 DR4와 DR5의 발현을 유도한다고 보고되어져 있기에 이를 근거로 ANT2 shRNA의 도입이 p53 단백질의 발현을 증가시키는지 그리고, 활성화된 p53 단백질(phosphorylated-p53)의 양이 증가하는지를 확인하기 위해서, ANT2 shRNA를 도입시켜 활성화된 p53 단백질 양(phosphorylated p53)과 p53 단백질 양을 확인하였다 [anti-Thr81 phospho-p53 및 anti-p53 antibodies : Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Germany)].

도 12A 에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA의 도입이 p53 단백질의 발현과 활성을 증가시킴을 알 수 있다.

이어 ANT2 shRNA의 도입이 p53 단백질의 활성을 증가시키는데 실제로 p53 DNA에 결합하여 유전자 발현을 유도하는 능력이 증가되었음을 리포터 유전자 분석법(reporter gene assay)을 통해서 확인 하였다. 이 분석법은 특정 단백질이 DNA에 결합하여 유전자 발현을 유도할 경우 리포터 역할을 하는 유전자 발현이 유도되며 유도된 유전자의 발현정도를 흡광도를 측정해서 정량화하는 방법이다. 구체적으로, ANT2 shRNA와 p53 단백질이 결합하는 프로모터(promoter)를 가진 luciferase를 발현하는 벡터(pGL-p53 binding site-luciferase expression vector)를 동시에 도입시켜 일정시간 세포를 배양한 후 발현 된 luciferase와 반응하는 기질을 넣어주어 luciferase의 활성도를 luminometer (FB12 luminometer; Berthold Detection Systems, Pforzheim, Germany)로 측정하였다.

도 12B에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA를 도입하는 경우 p53에 의해 리포터 유전자의 발현이 현저하게 증가됨을 알 수 있다. ANT2 shRNA에 대한 음성 대조군으로는 특정 mRNA의 발현에 영향을 끼치지 않는 sc shRNA(scrambled shRNA)를 도입하였다. 상기결과는 ANT2 shRNA 가 p53 단백질의 유전자 발현 유도 능력을 증가시킴을 의미한다.

또한, ANT2 shRNA의 도입이 p53 단백질의 발현과 활성을 유도하고 이를 통해 TRAIL 수용체인 DR4와 DR5의 발현이 증가한다는 것을 재확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 12C에 나타난 바와 같이, p53 단백질의 활성을 억제하는 p53 억제물질 [p53 inhibitor (pifithrin-alpha) : Biovision (Z, Switzerland)]을 전 처리하는 경우 ANT2 shRNA에 의한 DR4와 DR5의 발현증가가 억제됨을 확인하였다(Western-blot).

이에 더하여, ANT2 shRNA의 도입이 p53 단백질의 발현과 활성을 유도하고 이를 통해 TRAIL에 대한 반응성을 증가시킨다는 것을 재확인하기 위하여 p53 단백질의 활성을 억제하는 p53 억제물질 (p53 inhibitor : pifithrin-alpha) 을 처리했을 경우 ANT2 shRNA에 의한 TRAIL의 세포사멸 증가효과가 억제됨을 확인하였다. 이 때 CCK8 시약을 통해 세포 사멸 정도를 정량화 하였으며 p53 inhibitor에 대한 음성 대조군으로 PBS를 사용하였다 (도 13 참조).

상기결과로부터, 유방암 세포주에 ANT2 shRNA를 도입할 경우 p53의 활성을 증가시키고 이로 인해 궁극적으로 암세포 표면의 DR4와 DR5의 발현이 증가됨을 알 수 있다.

실시예 9. ANT2 shRNA 를 도입 시 동물 모델( in vivo )에서 TRAIL 에 대한 반응성 증가를 통한 종양성장 억제 효과

ANT2 shRNA가 TRAIL에 의한 세포사멸 효과를 증폭시켜 종양성장을 억제하는지를 확인하기 위하여 동물모델에서 실험을 실시하였다.

TRAIL에 대한 내성을 나타내는 MCF7 유방암 세포주를 면역기능이 결핍된 마우스인 Balb/c nude mice에 이식하고 100mm³ 정도 크기의 종양이 생성되었을 때 ANT2 shRNA와 TRAIL로 치료를 실시하였다. 이 때 TRAIL은 복강주사 (10㎎/㎏) 를 하고 ANT2 shRNA는 종양에 주사 (100㎍ : supplemented 200㎕ Lipofectamine^TM 2000)를 하였으며, 주사를 할 때 ANT2 shRNA 의 암 세포 내로의 전달을 돕기 위해 Lipofectamine^TM 2000이라는 물질과 함께 주사하였으며 3 차례에 걸쳐 처치를 한 후 45일 동안 종양의 크기를 측정하였다. 이 때 TRAIL에 대한 음성대조군으로 동일 볼륨의 PBS를 사용하였고 ANT2 shRNA의 음성 대조군으로 sc shRNA를 사용하였다.

도 14A에서 알 수 있는 바와 같이, 세포배양 실험(in vitro)에서와 동일하게 TRAIL 단독에 의해서는 종양성장에 큰 영향을 끼치지 못했고, ANT2 단독에 의해서도 종양성장을 억제 하였지만, ANT2 shRNA와 TRAIL을 동시에 처리한 경우 가장 효과적으로 종양성장을 억제하는 것으로 나타났다.

이어, 동물 모델에서 ANT2 shRNA와 TRAIL을 처리한 후 일정 기간 종양의 크기를 측정하고 45일 째 마우스를 안락사 시킨 다음, 종양을 적출하여 종양세포에서 TRAIL 수용체의 발현 변화를 역전사 중합효소 증폭 반응(RT-PCR)을 통해서 확인 하였으며, 그 결과를 도 14B에 나타내었다.

도 14B에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA의 도입이 DR4와 DR5의 발현을 증가시키고 DcR2의 발현을 감소시킴을 알 수 있다.

상기 결과는 ANT2 shRNA에 의한 TRAIL의 종양 성장 억제 효과는 TRAIL 수용체의 발현 조절를 통한 것임을 의미한다.

ANT2 shRNA adenovirus 의 제작

종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells)에 ANT2 shRNA를 효과적으로 이입하기 위해 adenovirus 시스템을 사용하였다 (ANT2를 타겟으로하는 shRNA의 염기서열 및 루프 시퀀스는 ANT2 shRNA 발현 벡터 제작 시 사용한 것과 동일함).

Recombinant adenovirus를 제작하기 위해 pSilencer-ANT2shRNA DNA에서 Pca14 shuttle vector의 EcoRI/HindIII site로 sub-cloning 을 진행하였다. 이는 adenovirus vector에 클로닝을 용이하게 하기위해 만들어진 vector로 우선 행해지는 클로닝 단계이다. PvuI Enzyme mapping (효소로 DNA를 자르고 전기 영동해 보았을 때 제대로 된 사이즈에 나타나는지 판별하는 실험법)으로 real-clone을 찾아내고 BJ5183 competent cell(adenovirus vector와 shuttle vector DNA간에 sequence-동종재조합이 가능하게 하는 E.coli strain cell) 안에서 PcaI 효소로 잘려 선형화된 Pca14-mANT2shRNA DNA와 BstBI 효소로 잘려 선형화된 adenovirus-dl324 (E1 deleted: replication-defective vectors) vector DNA를 함께 homologues recombination(동종재조합)을 수행한 후 얻은 DNA를 다시 DH5α cell 안에서 transformation(형질전환) 과정을 거쳐 DNA를 다량 확보하였다. 여기서 real-clone을 확인한 후, 이를 293a packaging cell(DNA를 세포내 유입하기 용이한 cell 이면서, Adenovirus 복제 유전자 E1이 포함되어 있어 이 세포안에서의 cloned-adenovirus를 대량 확보할 수 있게 하는 cell) 에 transfection(세포내 DNA유입)을 수행하여 세포 안에서 adenovirus증식을 유도하였다. 다량 증식된 Adenovirus-mANT2 shRNA는 PEG-CsCl(density gradient 층분리) 방법으로 순수 분리한 후 실험에 적용하였다.

실시예 10. 유방암 세포주 종양 모체 세포( progenitor cells )에 대한 ANT2 shRNA 의 효과

유방암 세포 주는 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells)와 그렇지 않은 세포(non-progenitor cells)로 구성되는데 ANT2 단백질은 이 두 세포 집단에서 모두 높게 발현되고 있다. 본 실험에서는 ANT2 shRNA를 도입할 경우 두 종류의 세포에 대한 세포사멸 효과를 관찰하였다.

종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells)는 세포 표면에 CD44 분자 양성/CD24 분자 음성(CD44+/CD24-)으로 분류되며, 유방암 세포 주 가운데 MDA-MB-231 세포 주는 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)가 차지하는 퍼센트가 높고(80% 이상), MCF7 세포 주의 경우, 낮다고(10% 미만) 보고되어져 있다.

본 실험에서는 두 세포 주를 대상으로 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분류한 경우와 분류하지 않은 경우에 ANT2 유전자의 발현 정도를 역전사 중합효소 방법(RT-PCR)로 확인하였으며, 이를 재확인하기 위해서 실시간 중합효소 증폭 방법(Real-time PCR)을 실시하였다. 두 세포주를 대상으로 CD44 단일항체[anti-PE-conjugated CD44 monoclonal antibody : BD-PharMingen, (SanDiego, California, USA)]와 anti-PE microbeads [MiltenyiBiotec. (BergischGladbach, Germany]를 처리한 후 MACS(Magnetic Activating cell sortor)를 사용하여 필요한 세포만을 분리한 뒤, 모체가 되는 세포만을 분리한 것과 분리하지 않은 세포를 대상으로 역전사 중합효소 방법(RT-PCR)과 실시간 중합효소 증폭 방법(Real-time PCR)을 실시하여 ANT2 mRNA 발현정도를 확인하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, 두 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포 (progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분류한 경우와 분류하지 않은 경우 모두 ANT2 발현이 높다는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 ANT2 shRNA를 이용하여 ANT2 발현을 감소시킬 때 종양의 모체가 되는 세포와 그렇지 않은 세포가 모두 사멸이 유도 될 수 있어 치료 가능성을 갖는다는 것을 의미한다.

이에 더하여, ANT2 shRNA를 이용하여 유방암세포를 구성하는 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)를 치료할 수 있음을 확인하는 실험을 수행하였다. 본 실험을 위한 세포 시스템으로는 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 전환 되게끔 유도하여 사용하였다. 간엽 세포(mesenchymal cell)는 유방암 줄기세포의 특성을 갖는다고 알려져 있다.

도 16A의 현미경 사진에 나타난 바와 같이, E-cadherin 유전자의 발현을 억제시키기 위해 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)에 E-cadherin shRNA를 도입한 경우, 서로 밀집되게 붙어 자라던 세포가 느슨하게 떨어져서 자라는 모양(mesenchmal 세포가 갖는 특징)을 가지는 것을 관찰함으로써 정상 상피세포가 간엽 세포(mesenchymal cell)로 전환 되었음을 알 수 있다. 이 때 E-cadherin 발현이 저하되고, ANT2 유전자 발현이 증가되었음을 역전사 중합효소 방법(RT-PCR)으로 확인하였다 (도 16B 참조).

또한 유방암 세포 주인 MDA-MB-231와 MCF7 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)만을 분류하여 ANT2 shRNA를 도입한 경우 세포 사멸이 유도되는 정도를 Annexin V-FITC와 PI로 염색(staining)하여 유세포 분석기(FACS)로 분석하였다. 이 방법은 세포가 죽게 되면 세포막의 안쪽에 위치하는 단백질이 세포막 밖으로 나오게 되는데 이 단백질에 Annexin V-FITC가 결합하게 되고 세포 안쪽의 DNA가 세포 밖으로 유출이 되면 PI와 결합을 하게 되어 Annexin V-FITC와 PI로 염색된 정도를 통해서 세포의 사멸을 정량적으로 분석하는 일반적인 방법이다. 그 결과를 도 17에 나타내었으며, 두 세포 주에서 모두 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)만을 분류한 경우에도 ANT2 shRNA에 의해 효과적으로 세포 사멸이 유도됨을 알 수 있다. 음성대조군으로는 sc shRNA를 도입하여 비교하였다.

이어, 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)에 E-cadherin shRNA를 도입하여 유방암 줄기세포의 특징을 갖는 세포를 대상으로 ANT2 shRNA를 도입했을 때도 효과적으로 세포사멸이 유도되는지를 고찰하고 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이 때 사용한 방법은 Annexin-V-FITC와 PI를 세포에 염색하여 세포의 사멸정도를 확인하는 방법인데, Annexin V는 세포가 세포자살시에는 초기단계에서 membrane구조가 망가지게 되어 세포 내부에서만 노출되어있던 phophatydyl serine과 같은 인지질이 세포바깥으로 노출되는데 이것과 결합하여 세포가 지금 세포자살의 초기단계에 있음을 보여주는 방법이다. 또한, PI(propium iodide)는 세포가 죽을 때 일어나는 nuclear blebing이나 condensation을 보기 위해 DNA사이에 끼어들어가는 propium iodide를 처리하고나서 이들자체의 fluorescence를 이용하여 세포의 죽음을 판별하는 방법이며, 이 실험의 음성 대조군으로는 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A) 를 사용하였다. 그 결과 ANT2 발현이 낮은 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)의 경우 ANT2 shRNA를 도입하여도 세포 사멸이 거의 유도되지 않는 반면 (도 18A) MCF10A에 E-cad shRNA를 도입하여 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 경우 ANT2 발현이 증가되며, 이 세포(E-cad shRNA transfected-MCF10A)에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 효과적으로 세포 사멸이 유도 되었다 (도 18B).

상기 결과는 ANT2 shRNA가 유방암 줄기세포는 효과적으로 죽이지만 정상상피세포에는 영향을 끼치지 않는다는 것을 의미한다.

실시예 11. 모체 세포( progenitor cells )의 종양성장 능력에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells)의 종양성장 능력에 대한 ANT2 shRNA 의 효과를 고찰하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, 유방암 세포 주인 MDA-MB-231와 MCF7 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)만을 분류한 후 (분류 방법은 실시예 10과 동일), MDA-MB-231와 MCF7 세포 주에 ANT2 shRNA를 도입하여 세포가 잘 부착되지 않는 배양접시(세포가 배양접시에 부착되는 것을 최소화 하여 세포 덩어리 형성을 촉진시키기 위한 방법 임)에 세포를 배양하여 세포덩어리가 형성되는 정도와 크기를 관찰 하였다.

도 19A에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA를 도입하지 않은 경우에는 많은 갯수의 세포덩어리가 생성되는 반면 ANT2 shRNA가 도입된 경우 세포덩어리가 거의 생성이 되지 않음을 알 수 있었으며, 도 19B에서 보여지는 것처럼 ANT2 shRNA가 도입 된 경우 세포덩어리 갯수 뿐만 아니라 크기 또한 매우 작음을 관찰 하였다.

상기 결과는 ANT2 shRNA 가 유방암세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells)의 종양성장 능력을 억제시킨다는 것을 의미한다.

실시예 12. 유방암 모체 세포( progenitor cells )의 항암제 내성에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)는 항암제에 대해 높은 내성을 나타내는데 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 항암제에 대한 반응성에 미치는 효과를 고찰하였다.

유방암 세포 주 가운데 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)가 차지하는 퍼센트가 높은 MDA-MB-231 세포 주를 대상으로 유방암 치료에 널리 사용되는 항암제인 doxorubicin을 10 uM에서 10배씩 계단 희석하여 처리 한 후 일정시간 (24시간) 배양한 다음 농도 별 세포 사멸 정도를 CCK8 시약을 통해 정량적으로 분석하고 그 결과를 도 20에 나타내었다. 이 때 사용한 실험 방법은 실시예 6과 동일하다.

도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분리한 세포 및 분리하지 않은 세포 모두 doxorubicin에 의해 거의 반응성을 나타내지 않는 반면 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 농도 의존적으로 세포사멸이 유도됨을 확인하였다.

또한 유방암 세포 주 가운데 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)가 차지하는 퍼센트가 낮은 MCF7 세포 주를 대상으로 유방암 치료에 널리 사용되는 항암제인 doxorubicin을 농도 별로 처리해서 CCK8 시약을 통해 세포 사멸 정도를 정량적으로 분석하고 그 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에서 알 수 있는 바와 같이, 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분리한 세포의 경우 분리하지 않은 세포에 비해 doxorubicin에 대해 더 낮은 반응성을 나타내었으며, 반면 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 두 세포 집단 모두 농도 의존적으로 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 상기 결과는 ANT2 shRNA의 도입이 항암제인 doxorubicin에 대한 반응성을 증가시키며 내성을 극복 할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 13. 유방암 모체 세포( progenitor cells )에서 항암제 내성에 관여하는 수용체 ABCG2 의 발현에 미치는 ANT2 shRNA 의 효과

유방암을 구성하는 세포 가운데 모체가 되는 세포가 항암제 약물에 대해 낮은 반응성, 즉 높은 내성을 나타내는 대표적인 원인으로 세포막에 위치 하면서 세포 안으로 들어온 약물을 세포 바깥으로 내보내는 수용체(MDR : multi-drug resistance receptor)가 과 발현되기 때문이라고 보고되어져 있으며 이러한 수용체 가운데 유방암 세포에 특히 높게 발현하고 있는 것이 ABCG2이다.

따라서 본 발명자들은 ANT2 shRNA에 의한 항암제에 대한 반응성 증가가 ABCG2의 발현과 반응성의 조절을 통한 것인지를 조사하고자 하기 실험을 수행하였다.

유방암 세포 주 가운데 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)가 차지하는 퍼센트가 높은 MDA-MB-231 세포 주 및 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)가 차지하는 퍼센트가 낮은 MCF7 세포 주를 대상으로, 종양의 모체가 되는 세포(progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분류한 경우, 분류하지 않은 세포, 및 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 세포를 대상으로 ABCG 유전자의 발현 정도를 역전사 중합효소 방법 (RT-PCR)로 확인하였으며, 이에 더하여 ABCG의 단백질 발현 정도를 anti-ABCG2 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SantaCruz,CA,USA)를 사용하여 Western-blot으로 확인하였다.

도 22에 나타난 바와 같이, 두 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포 (progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분류한 경우와 분류하지 않은 경우, 그리고, 정상 유방 상피 세포 주 (MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 경우 ABCG2의 mRNA 발현이 증가됨을 확인 하였다.

또한 도 23에 나타난 바와 같이, 두 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포 (progenitor cells : CD44+/CD24-)를 분류한 경우와 분류하지 않은 경우, 그리고, 정상 유방 상피 세포 주 (MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 경우 ABCG2 단백질 수준에서 발현이 증가되었음을 확인하였다. 또한 ANT2 shRNA 를 도입시, 증가된 ABCG2의 발현을 저하시킨다는 것을 관찰하였다. 상기 결과는 높은 ABCG2 발현을 보이는 유방암 모체가 되는 세포 및 유방암 줄기세포에 ANT2 shRNA를 도입하면 ABCG2 발현을 억제시킨다는 것을 의미한다.

이에 더하여, 본 발명자들은 유방암을 구성하는 세포 가운데 모체가 되는 세포에서 실재적으로 ABCG2의 활성이 증가되어 있는지를 측정해 보았다. 구체적으로, MDA-MB-231 세포 주 및 MCF7 세포 주에 대하여, 종양의 모체가 되는 세포를 분류한 경우, 분류하지 않은 세포, 및 정상 유방 상피 세포 주 (MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 세포를 대상으로 ABCG2 활성정도를 고찰하였다. 이 때 Hoechst 33342라는 약물을 이용해서 이 약물이 세포 내에 축적되는 정도를 통해서 ABCG2의 활성도를 정량적으로 분석하고 그 결과를 도 24에 나타내었다.

도 24에 나타난 바와 같이, 두 세포 주에서 종양의 모체가 되는 세포를 분류한 경우 및 정상 유방 상피 세포 주(MCF10A)에 E-cadherin 유전자의 발현을 억제시켜 인위적으로 간엽 세포(mesenchymal cell)로 유도한 경우 모두 ABCG2의 활성도가 증가되어 있음을 알 수 있다.

상기 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 ANT2 shRNA의 도입이 ABCG2의 활성도에 미치는 효과를 고찰하였다. ABCG2의 활성도를 측정하기 위해서 Hoechst 33342 (Sigma)라는 약물을 세포에 처리한 뒤, 형광 흥분 세포 분리 분석을 실시하여 ABCG2의 활성도를 정량적으로 분석하고 그 결과를 도 25에 나타내었다. 도 25에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA에 의해서 ABCG2의 활성도가 효과적으로 감소됨을 알 수 있다.

상기 결과는, 유방암세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells)의 경우 항암제의 내성에 관여하는 수용체인 ABCG2가 높은 발현과 높은 활성을 나타내는데 ANT2 shRNA의 도입은 ABCG2의 발현과 활성을 감소시킨다는 것을 보여준다. 즉, ANT2 shRNA가 유방암의 모체가 되는 세포의 ABCG2의 활성도를 감소시켜 항암제에 대한 내성을 극복할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 14. 유방암 모체 세포( progenitor cells )에 대한 ANT2 shRNA 의 선택적 전달 및 세포 사멸 효과

ANT2 shRNA가 유방암세포의 모체가 되는 세포를 효과적으로 치료할 수 있는 지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. ANT2 shRNA를 이용하여 암 환자를 대상으로 치료할 경우 ANT2 shRNA가 효과적으로 원하는 세포에 잘 전달되는지가 중요한 문제이기에 본 발명자들은 유방암의 모체가 되는 세포 표면에 높게 발현되어 있는 CD44 를 이용하여, 이를 표적하는 운반물질로 나노입자 [PEI/hyaluronic acid (HA) nano-complexes]를 제작하였다. 실제적으로 CD44를 높게 발현하는 유방암 세포 주인 MDA-MB-231과 낮게 발현하는 T47D를 대상으로 ANT2 shRNA 가 효과적으로 전달되는 지 여부를 확인하였다. 형광물질이 붙어 있는 나노 입자 [PEI/hyaluronic acid (HA) nano-complexes]에 ANT2 shRNA를 넣어 complex를 형성 한 후 각각의 세포에 처리한 다음 일정시간 후, 세포 내에 형광의 세기를 분석하여 나노입자에 의해 ANT2 shRNA가 세포 내로 유입된 정도를 측정하였다.

도 26에 나타난 바와 같이, CD44를 높게 발현하는 유방암 세포 주인 MDA-MB-231에 선택적으로 잘 전달됨을 확인하였다.

상기 결과는 유방암세포의 모체가 되는 세포(progenitor cells) 표면에 높게 발현되어 있는 CD44 를 표적으로 하는 운반물질인 나노입자 [PEI/hyaluronic acid (HA) nano-complexes]를 이용하여 ANT2 shRNA 를 운반할 경우, 유방암세포의 모체가 되는 세포에만 선택적으로 ANT2 shRNA를 전달시키고 치료(세포 사멸을 유도)를 할 수 있다는 것을 보여준다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> BioInfra, INC. <120> Method for treating breast cancer by decreasing the expression of adenine nucleotide translocator 2 mRNA <130> P11-08924 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence of ANT2 shRNA <400> 1 gcagaucacu gcagauaagu u 21 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of ANT2 shRNA <400> 2 uucaagaga 9 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense sequence of ANT2 shRNA <400> 3 aacuuaucug cagugaucug c 21

Claims

Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 유방암 치료용 조성물로써, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스 (anti-sense) 서열이 서열번호 1로 기재된 센스 (sense) 서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) 의 발현을 저하시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)의 유방암 치료효과를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 조성물은 유방암 세포 표면의 DR4 (death receptor 4) 및 DR5(death receptor 5)의 발현을 증가시키고, DcR1(death decoy receptor 1) 및 DcR2(death decoy receptor 2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 조성물은 p53 단백질의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 유방암 줄기세포 치료용 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 조성물은 ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2)의 발현 및 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 조성물은 항암제와 병용투여시 항암제에 대한 암세포의 반응성을 증가시키고 내성을 감소시켜 유방암 치료효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin) 인 조성물.
Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 환자에게 투여하여 유방암을 치료하는 방법으로, 유방암 세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 환자에게 투여하여 유방암 줄기세포를 치료하는 방법.