CN103379914A - 通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法 - Google Patents

通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103379914A
CN103379914A CN2011800675340A CN201180067534A CN103379914A CN 103379914 A CN103379914 A CN 103379914A CN 2011800675340 A CN2011800675340 A CN 2011800675340A CN 201180067534 A CN201180067534 A CN 201180067534A CN 103379914 A CN103379914 A CN 103379914A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
ant2shrna
expression
breast cancer
compositions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800675340A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103379914B (zh
Inventor
金哲右
张支映
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioinfra Inc
Original Assignee
Bioinfra Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioinfra Inc filed Critical Bioinfra Inc
Publication of CN103379914A publication Critical patent/CN103379914A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103379914B publication Critical patent/CN103379914B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及通过降低ANT2（腺嘌呤核苷酸转运体2）mRNA的表达治疗乳腺癌的方法。具体而言，本发明提供一种用于治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA，其特征在于能够抑制乳腺癌细胞的转移。本发明的组合物提高用于治疗乳腺癌的TRAIL（TNF相关细胞凋亡诱导配体）的作用。并且，本发明还提供一种用于治疗乳腺癌干细胞的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2（腺嘌呤核苷酸转运体2）siRNA或ANT2shRNA。因此，本发明提供一种乳腺癌疗法，所述疗法高效抑制乳腺癌细胞的转移并且克服耐药性。此外，所述疗法可适用于预防乳腺癌干细胞。

Description

通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法
技术领域
本发明涉及通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法。更加具体而言，本发明涉及通过ANT2siRNA（小干扰RNA）或ANT2shRNA（短发夹RNA）治疗乳腺癌的方法。
背景技术
肿瘤是由异常的、不受控制的且失调的细胞增殖（包括过度的异常细胞增殖）引起的。当肿瘤表现出破坏性增殖、渗透和转移时，将该肿瘤划分为恶性肿瘤。具体而言，从分子生物学的角度来说，肿瘤被认为是由基因突变引起的遗传性疾病。为了治疗恶性肿瘤，已单独实施或联合实施外科手术、放疗和化疗这三种治疗方法。具体而言，外科手术为一种根除大部分致病组织的方法，因此该方法非常有效地除去正在乳房、结肠和皮肤中生长的肿瘤，但是该方法无法同样有效地治疗脊椎中的肿瘤和弥散性肿瘤。
放疗已被用于治疗急性炎性肿瘤、良性或恶性肿瘤、内分泌失调和过敏症，并且放疗有效治疗这些由异常的快速细胞分裂引起的恶性肿瘤。然而，放疗带来严重的副作用，例如，功能失调或正常细胞缺损，在治疗区域上爆发皮肤疾病，尤其在儿童中引起发育迟缓和骨发育不全。
化疗为阻碍癌细胞复制或代谢的方法，该方法已被用于治疗乳腺癌、肺癌和睾丸癌。这种治疗方法的最大的问题在于全身化疗所带来的副作用。这种化疗的副作用是致命的，由此增加了对该治疗的焦虑和恐惧。化疗的代表性的副作用之一为剂量限制毒性（DLT）。粘膜炎为各种抗癌药剂（抗代谢剂（例如，5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤）和抗肿瘤抗生素（例如，阿霉素））的DLT实例之一。大多数副作用病例需要住院治疗或至少需要止痛药。因此，化疗和放疗带来的副作用是癌症患者的治疗中的重要问题。
同时，基因疗法是以DNA重组技术为基础的，该基因疗法为将治疗性基因插入癌症患者细胞以校正基因缺损或向失调细胞赋予新的功能以治疗或预防由突变疾病、基因感染、疾病、癌症、自体免疫性心血管疾病等引起的各种遗传性疾病的方法。更加具体而言，基因疗法为通过将治疗性基因运送至靶器官中，诱导正常蛋白或治疗性靶蛋白的细胞内表达治疗所述疾病的方法。基因疗法相对于使用药物的其他疗法而言具有非常好的选择性，并且可长期使用，对疑难疾病具有改善的治疗效果。为了提高基因疗法的疗效，基因转移技术对于在靶细胞中实现高效基因表达而言是必不可少的。
基因载体为将治疗性基因插入靶细胞中的媒介。优选的基因载体为对人体无害，可大量生产并能够有效传递治疗性基因且诱导治疗性基因稳定表达的一种基因载体。因此，基因转移技术为基因疗法中的关键因素并且迄今为止，基因疗法中最需要的代表性的基因载体以病毒载体（例如，腺病毒、腺相关病毒（AVV）以及逆转录病毒）和非病毒载体（例如，脂质体和聚乙烯亚胺）为例。
基因疗法的治疗方案中的一种为通过使用肿瘤抑制基因、肿瘤特异性杀伤病毒、自杀基因和免疫调节基因控制肿瘤细胞。具体而言，使用肿瘤抑制基因的方法为通过运送肿瘤抑制基因的原始形式（例如，p53，其在许多癌症患者体内为缺失的或突变的）治疗癌症。使用肿瘤特异性杀伤病毒的方法为通过利用转化到癌组织中的肿瘤抑制基因的活性，将病毒基因载体运送进入癌症患者体内治疗癌症，所述病毒基因载体可在肿瘤细胞中选择性增殖。上述两种方法的基本治疗方案为直接杀死肿瘤细胞。同时，使用自杀基因的方法为通过插入诸如HSK-TK之类的敏感性基因诱导肿瘤细胞自杀。使用免疫调节基因的方法为通过递送增加抗肿瘤免疫反应的基因（例如，白介素12（IL12）、白介素4（IL4）、白介素7（IL7）、γ-干扰素和肿瘤坏死因子（TNF））刺激T-细胞介导的肿瘤细胞识别或通过干扰诱导肿瘤的蛋白质诱导细胞凋亡间接治疗疾病。
对于为了治疗癌症而进行的各种尝试中的基因疗法而言，本发明的发明人选择ANT2（腺嘌呤核苷酸转运体2）作为靶基因以研发有效且安全的抗癌药剂。
ANT（腺嘌呤核苷酸转运体）为在线粒体内膜（IM）中发现的酶，其通过线粒体外膜（OM）的VDAC（电压依赖性阴离子通道）输入来自细胞质的ADP并将电子传递链系统中产生的ATP输出至细胞质中（HLA Vieira等人,Cell Death and Differentiation,7,1146-1154,2000）。
本领域还已知在细胞的能量代谢中发挥关键作用的ANT被分为ANT1、ANT2和ANT3。具体而言，ANT2在正常细胞中表现出低表达速率但在癌细胞或类似高度增殖的细胞中高表达，这看起来与厌氧条件下的糖酵解密切相关，这样，ANT2开始作为癌症治疗中的新靶标（Chevrollier,A等人，Med.Sci.,21(2),156-161,2005）。
发明内容
技术问题
本发明的发明人发现了可特异性抑制ANT2mRNA的表达的ANT2siRNA或ANT2shRNA选择性抑制乳腺癌细胞的转移并杀死乳腺癌的祖细胞。因此，本发明的目的在于提供用于治疗乳腺癌的组合物和用于治疗乳腺癌干细胞的方法。具体而言，本发明提供用于治疗乳腺癌或乳腺癌干细胞的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA。
技术问题的解决方案
本发明提供用于治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包含作为活性成分的腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）小干扰RNA（siRNA）或腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）短发夹RNA（shRNA），其特征在于能够抑制乳腺癌细胞的转移。
在本发明的一种实施方式中，ANT2siRNA或ANT2shRNA通过SEQ IDNO:3表示的反义序列与SEQ ID NO:1表示的正义序列的相互作用诱导ANT2mRNA降解。
在另一实施方式中，所述组合物抑制HER2/neu（人表皮生长因子受体2）的表达。
在另一实施方式中，所述组合物提高用于治疗乳腺癌的TNF-相关的细胞凋亡诱导配体（TRAIL）的效力。
在另一实施方式中，所述组合物提高死亡受体4（DR4）和死亡受体5（DR5）的表达并且抑制死亡诱捕受体1（DcR1）和死亡诱捕受体2（DcR2）的表达。
在另一实施方式中，所述组合物提高p53蛋白的表达和活性。
本发明还提供用于治疗乳腺癌干细胞的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA。
在一种实施方式中，所述组合物抑制ATP-结合盒亚家族G成员2（ABCG2）的表达和活性。
在另一实施方式中，当本发明的组合物与抗癌药剂联合给药时，所述组合物通过改善干细胞对抗癌药剂的反应以及减缓所述干细胞对抗癌药剂的耐受性的发展提高抗癌药剂的效力。所述抗癌药剂包括阿霉素。
本发明还提供治疗乳腺癌的方法，所述方法包括将作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA给药于有此需要的患者，其特征在于抑制乳腺癌细胞的转移。
本发明还提供用于治疗乳腺癌干细胞的方法，所述方法包括将ANT2siRNA或ANT2shRNA给药于有此需要的患者。
本发明的有益效果
根据本发明的ANT2siRNA或ATN2shRNA降低了ANT2mRNA的表达，由此有效诱导细胞死亡。此外，本发明给出了TRAIL耐药性的解决方案。而且，根据本发明的ANT2siRNA或ATN2shRNA抑制乳腺癌细胞的转移并且有效治疗乳腺癌干细胞。
因此，可以预见到的是，本发明提供用于乳腺癌的疗法，所述疗法非常有效地抑制乳腺癌细胞的转移并且克服了对抗癌药剂的耐受性。而且，本发明可用于研发用于乳腺癌干细胞的治疗方法。
附图说明
图1显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的HER2/neu表达水平降低。
图2A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，引入的ANT2shRNA促进HSP90的降解，导致HSP90的表达水平降低。
图2B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的HER2表达水平降低。
图3A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的Akt活性降低。
图3B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的Akt活性降低并且通过ANT2的过表达恢复其Akt活性。
图3C显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，HSP90与Akt发生微弱的相互作用并且Akt活性降低。
图4A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，VEGF的mRNA表达水平降低。
图4B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，VEGF的细胞内水平降低。
图4C显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的VEGF mRNA表达水平降低并且通过ANT2的过表达恢复VEGF mRNA水平。
图5A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，MT1-MMP的mRNA表达水平降低。
图5B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，MT1-MMP的蛋白质表达水平降低。
图6A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的MT1-MMP的mRNA表达水平降低并且通过PI3K的过表达恢复该mRNA的表达水平。
图6B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的MT1-MMP蛋白质表达水平降低并且通过PI3K的过表达恢复该蛋白质的表达水平。
图7A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，MMP2和MMP9的mRNA的表达水平均降低。
图7B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，MMP2和MMP9的活性均降低。
图8A显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的侵袭能力降低。
图8B显示当过表达HER2/neu的乳腺癌细胞系SK-BR3被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系SK-BR3的迁移能力降低。
图9A显示MCF7对TRAIL的耐药性结果和MDA-MB-231对TRAIL的敏感性（细胞凋亡）结果。
图9B显示Western印迹的结果，其中，虽然乳腺癌细胞系MCF7对TRAIL具有耐药性，但是ANT2shRNA的引入诱导MCF7对TRAIL具有敏感性（细胞凋亡）。
图9C显示乳腺癌细胞系MCF7对TRAIL具有耐药性，但是ANT2shRNA的引入诱导细胞经历如细胞照片中所观察到的细胞凋亡。
图10A显示乳腺癌细胞系T47D和BT474对TRAIL具有耐药性，但是ANT2shRNA的引入有效诱导细胞经历细胞凋亡。
图10B显示乳腺癌细胞系MCF7对TRAIL具有耐药性，但是ANT2shRNA的引入使细胞对TRAIL具有高敏感性（细胞凋亡）并且通过ANT2表达载体的转染使ANT2过表达消除了ANT2shRNA的细胞凋亡作用。
图10C显示乳腺癌细胞系T47D和BT474对TRAIL具有耐药性，但是当所述乳腺癌细胞系T47D和BT474被ANT2shRNA转染时，它们被诱导经历TRAIL介导的细胞凋亡，同时伴随发生包括胱天蛋白酶-8/9/7的裂解、bid截短（bidtruncation）以及由于线粒体破坏而产生的细胞色素c的释放增加在内的事件。
图11A显示对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平低并且诱捕受体DcR1和DcR2的表达水平高，这干扰了TRAIL的信号转导通路，并且显示对TRAIL具有敏感性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平高并且诱捕受体DcR1和DcR2的表达水平低。
图11B显示对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平低并且诱捕受体DcR1和DcR2的表达水平高，ANT2shRNA的引入提高DR5的表达并且降低DcR2的表达。
图11C显示对TRAIL具有敏感性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平低并且诱捕受体DcR1和DcR2的表达水平高，ANT2shRNA的引入提高DR5的表达并且降低DcR2的表达。
图12A显示当对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系MCF7的p53蛋白质的表达和p53蛋白质的磷酸化作用/活化作用提高。
图12B显示当对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系MCF7的p53蛋白质的转录活性提高。
图12C显示当对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系MCF7的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平提高，这说明表达水平的提高归因于p53的活化作用。
图13显示当对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7被ANT2shRNA转染时，所述乳腺癌细胞系MCF7对TRAIL的敏感性提高，这说明敏感性的提高归因于p53的活化作用。
图14A显示在将乳腺癌细胞系MCF7移植至免疫缺陷的Balb/c裸鼠中之后，得到的肿瘤的生长受到单独的TRAIL治疗的轻度抑制，受到单独的ANT2shRNA治疗的中度抑制，受到TRAIL和ANT2shRNA的联合治疗的显著抑制。
图14B显示在将乳腺癌细胞系MCF7移植至免疫缺陷的Balb/c裸鼠中之后，得到的肿瘤的生长受到TRAIL和ANT2shRNA的联合治疗的显著抑制并且肿瘤的TRAIL受体DR4和DR5的表达水平提高。
图15A显示RT-PCR的结果，其中，发现从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分选的祖细胞（CD44+/CD24-）和未分选的细胞表达高水平的ANT2。
图15B显示实时RT-qPCR的结果，其中，发现从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分选的祖细胞（CD44+/CD24-）和未分选的细胞表达高水平的ANT2。
图16A显示当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时的形态变化。
图16B显示当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时，细胞的E-钙粘蛋白的表达水平降低并且细胞的ANT2的表达水平提高。
图17A显示当从乳腺癌细胞系MDA-MB-231中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）被ANT2shRNA转染时，所述祖细胞被有效诱导经历细胞凋亡。
图17B显示当从乳腺癌细胞系MCF7中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）被ANT2shRNA转染时，所述祖细胞被有效诱导经历细胞凋亡。
图18A显示当正常乳腺上皮细胞系MCF10A被ANT2shRNA被转染时，所述乳腺上皮细胞系不被诱导经历细胞凋亡。
图18B显示当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时，ANT2shRNA的引入可有效诱导细胞凋亡。
图19A显示具有高比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MDA-MB-231和具有低比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MCF7分别表现出较高的形成细胞团的能力和较低的形成细胞团的能力，并且形成细胞团的能力通过ANT2shRNA的转染在这两种细胞中均降低。
图19B显示具有高比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MDA-MB-231和具有低比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MCF7分别表现出较高的形成细胞团的能力和较低的形成细胞团的能力，并且形成细胞团的能力通过ANT2shRNA的转染在这两种细胞中均降低。
图20显示用ANT2shRNA处理的MDA-MB-231，其中，虽然具有高比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MDA-MB-231对阿霉素具有高耐药性，但是ANT2shRNA的引入使得细胞（无论是CD44+/CD24-分选的细胞还是未分选的细胞）对阿霉素具有敏感性。
图21显示用ANT2shRNA处理低阿霉素耐药性乳腺癌细胞系（MCF7）的结果，其中，具有低比例的乳腺癌祖细胞（CD44+/CD24-）的MCF7对阿霉素具有敏感性（黏着细胞），而只有祖细胞（CD44+/CD24-）表现出对阿霉素具有耐药性（漂浮细胞）并且ANT2shRNA的引入使得细胞（无论是CD44+/CD24-分选的细胞还是未分选的细胞）对阿霉素具有敏感性。
图22显示从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）的涉及耐药性的ABCG2的mRNA表达水平高，这与未分选的细胞相反（左图），并且显示出当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时，得到的细胞的ABCG2的mRNA水平提高（右图）。
图23显示从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）的涉及耐药性的ABCG2的蛋白质表达水平高，这与未分选的细胞相反，并且当所述祖细胞被ANT2shRNA转染时，所述祖细胞的ABCG2的蛋白质表达水平降低，并且显示出当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时，得到的细胞的ABCG2的蛋白质水平提高。
图24显示从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）的涉及耐药性的ABCG2的活性高于未分选的细胞，并且当正常乳腺上皮细胞系MCF10A通过E-钙粘蛋白shRNA的转染以间充质的方式被转分化时，得到的细胞的ABCG2活性提高。
图25显示从乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）的涉及耐药性的ABCG2的活性高于未分选的细胞，ANT2shRNA的引入降低ABCG2的活性并且通过E-钙粘蛋白shRNA转染以间充质的方式由正常乳腺上皮细胞系MCF10A转分化的细胞表现出ABCG2活性提高但是向其中引入ANT2shRNA使ABCG2活性降低。
图26显示靶向CD44的纳米复合物选择性地将ANT2shRNA递送至表达CD44的细胞系，CD44在乳腺癌的祖细胞的表面高表达。
具体实施方式
本发明提供用于治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA，其特征在于抑制乳腺癌细胞的转移。具体而言，本发明的发明人发现ANT2siRNA或ANT2shRNA抑制乳腺癌细胞迁移并侵袭进入其他组织。
本领域技术人员已知乳腺癌细胞通过细胞受体EGFR（表皮生长因子受体）活化一些信号转导通路，以使所述乳腺癌细胞增殖、存活、迁移并且侵袭进入其他组织。具体而言，本领域技术人员已知HER2/neu（EGFR家族的成员）在多达30%的乳腺癌患者的癌细胞表面过表达。HER2/neu的过表达引起乳腺癌患者的不良预后并且在化疗中表现出多耐药性。HER2/neu介导的信号转导通路中的代表性信号转导通路为PI3K/Akt信号转导通路，该信号转导通路的活化导致乳腺癌细胞增殖、存活、迁移并侵袭进入其他组织。因此，治疗乳腺癌的关键点在于下调HER2/neu的表达或干扰HER2/neu介导的信号转导通路的活性。
本发明提供通过ANT2siRNA或ANT2shRNA抑制ANT2基因的表达的方法，其中，已知ANT2基因在乳腺癌细胞中过表达并且在乳腺癌细胞生成ATP中发挥关键作用。此外，癌细胞不仅仅被诱导经历由于其存活所必需的能量供给不足而导致的细胞死亡，而且还预防其迁移或侵袭进入其他组织，这抑制了癌症转移。
在不受任何理论限制的条件下，本领域技术人员已知HSP90（热休克蛋白90）维持HER2/neu在乳腺癌细胞表面的表达并且仅仅当HSP90与ATP结合时其发挥作用。因此，本发明预见到当乳腺癌细胞的细胞内ATP水平被ANT2siRNA或ANT2shRNA消耗时，HSP90无法与ATP充分结合，因此无法发挥其作用，从而导致HER2/neu降解。由上述预见到的内容可知，本发明的发明人构建了如下假设：HER2/neu的降解导致HER2/neu介导的PI3K/Akt信号转导通路活性降低，从而导致乳腺癌细胞的迁移和侵袭进入其他组织的能力减弱。通过向人乳腺癌细胞系SK-BR3（已知该细胞系过表达HER2/neu）中转染ANT2shRNA诱导人乳腺癌细胞系SK-BR3的ANT2的表达水平降低。在本发明中观察到细胞内ATP的缺乏使HSP90的活性降低，从而抑制HER2/neu的表达。此外，通过实验证实了HER2/neu介导的PI3K/Akt信号转导通路受到抑制，从而抑制乳腺癌细胞迁移并侵袭进入其他组织的能力。
根据本发明的另一方面，本发明提供用于治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA。所述药物组合物被设计为控制TRAIL受体的表达以提高TRAIL对乳腺癌的疗效。
TRAIL/apo2配体（肿瘤坏死因子成员）可选择性地杀死癌细胞，但是不杀死正常细胞。然而，化疗中TRAIL的使用使癌细胞对TRAIL具有耐药性。这种耐药性为目前研究的热门课题。因此，本发明的发明人尝试使用ANT2shRNA解决耐药性问题。
本发明描述了将ANT2siRNA或ANT2shRNA引入乳腺癌细胞促进TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡并且增强TRAIL在细胞培养条件下（体外）和动物体内（体内）对肿瘤生长的抑制作用。在该情况下，本发明发现对TRAIL受体表达的调节说明了ANT2siRNA或ANT2shRNA在促进TRAIL诱导的乳腺癌细胞凋亡中的作用机制。在TRAIL受体中存在DR4（TRAILR1：TRAIL受体1）和DR5（TRAILR2：TRAIL受体2）。当TRAIL结合至DR4和DR5时，细胞凋亡信号被转导进入癌细胞，从而使细胞死亡。然而，TRAIL受体DcR1（诱捕受体1：TRAILR3）和DcR2（诱捕受体2：TRAILR4）起到保护肿瘤细胞不受DR4和DR5介导的细胞凋亡信号的影响的作用。也就是说，如果TRAIL结合至DcR1和DcR2，那么，细胞凋亡信号不会转导进入肿瘤细胞。肿瘤细胞对TRAIL具有耐药性的原因是各种各样的。其中的重要原因是：当DR4和DR5被下调时，肿瘤细胞表面的DcR1和DcR2被上调。本发明的发明人已证实了ANT2siRNA或ANT2shRNA导致癌细胞的细胞内信号转导通路发生改变，从而上调DR4和DR5同时伴随DcR1和DcR2的下调，因此，使肿瘤细胞对TRAIL的敏感性增加并且克服了肿瘤细胞的耐药性。
此外，本发明提供了如下方法：通过细胞培养物实验（体外）和动物测试（体内），通过ANT2siRNA或ANT2shRNA的干扰敲低ANT2促进TRAIL对乳腺癌的疗效，并且本发明给出了TRAIL耐药性问题的解决方案，所述方案基于对TRAIL受体表达的调节。
根据本发明的另一方面，本发明提供用于治疗乳腺癌干细胞的组合物，所述组合物包含作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA。
在化疗和放疗中最困难的问题之一为治疗后新肿瘤的出现（癌症复发）。在许多病例中，目前使用的化疗或放疗可杀死大部分肿瘤细胞，但是不能杀死所有的肿瘤细胞。一些治疗后留下的细胞可为复发的来源并且可被认为是癌症干细胞（例如，乳腺癌干细胞）。因此，有效根除乳腺癌干细胞非常重要。在本发明中，ANT2shRNA被证明能够杀死乳腺癌干细胞。
为了检验作为乳腺癌干细胞的疗法的ANT2siRNA或ANT2shRNA的医学潜力和效果，将来源于乳腺癌细胞系的侧群（side population，CD44+/CD24-，其为乳腺癌细胞的祖细胞）用于试验。具体而言，使用通过E-钙粘蛋白敲低的以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞（MCF10A）。这基于如下事实：当从上皮细胞转分化（上皮间充质转化，EMT）时，间充质细胞表现出乳腺癌干细胞的特征。此外，腺病毒系统用于有效携带ANT2shRNA进入乳腺癌干细胞。在该情况下，构建表达ANT2shRNA的腺病毒并将其感染到乳腺癌干细胞中。因此，ANT2shRNA有效诱导具有乳腺癌干细胞特征的两组细胞中的细胞凋亡性细胞死亡。并且，ANT2shRNA解决了耐药性问题，由此，使两种细胞对药物均具有敏感性。
进一步地，当本发明的组合物与抗癌药剂联合给药时，所述组合物通过改善所述干细胞对抗癌药剂的反应以及减缓所述干细胞对抗癌药剂的耐药性的发展来提高抗癌药剂的疗效。所述抗癌药剂包括阿霉素。
本发明还提供用于治疗乳腺癌的方法，所述方法包括将作为活性成分的ANT2siRNA或ANT2shRNA给药于有此需要的患者，其特征在于抑制乳腺癌细胞的转移。
本发明还提供用于治疗乳腺癌干细胞的方法，所述方法包括将ANT2siRNA或ANT2shRNA给药于有此需要的患者。
对于本领域技术人员而言明显的是，给药剂量取决于患者体重、年龄、性别、健康情况和饮食、给药频率、给药路径、组合物的排泄速度以及疾病的严重程度而不同。
如下列实施例所示，本发明的实际优选的实施方式以及目前优选的实施方式是示例性的。然而，本领域技术人员应当理解的是，在考虑了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可在本发明的实质和范围内对本发明作出改变或改进。
实施例
<ANT2shRNA表达载体的构建>
ANT2mRNA序列（基因库登录号No.NM_001152）获自国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。ANT2siRNA的待用组通过将上述ANT2mRNA序列引入siRNA预测程序（http://www.ambion.com/technical,resources/siRNAtarget finder）中而获得。在若干待用组中，制备与序列5’-GCAGAUCACUGCAGAUAAG-3’结合，对应于ANT2mRNA的第二外显子的siRNA以在体外测试中检测对ANT2mRNA的沉默作用。[ANT2siRNA的合成在Bioneer（韩国）实施]。
基于这些结果，制备ANT2shRNA。具体而言，合成具有如下序列的双链寡聚体。[ANT2siRNA的合成在Bioneer（韩国）实施]。
5’GCAGATCACTGCAGATAAGTT3’5’TTCAAGAGA3’(环）5’AACTTATCTGCAGTTCAGATCTGC3’
3’CGTCTAGTGACGTCTATTCAA5’3’AAGTTCTCT5’(环)3’TTGAATAGACGTCAAGTCTAGACG5’
在使上述两个寡聚体退火之后，将序列克隆至pSilencer3.1-H1puro质粒载体（Ambion，Austin，TX）的MCS（多克隆位点）中的BamHI和HindIII区域中。TT序列与正义序列的末端连接以改善siRNA的表达效率。
在确认ANT2shRNA作用的试验中，被打乱的shRNA（购自Ambion）用作阴性对照，其给出与目标shRNA相同的条件，但是既不阻断ANT2的表达也不影响靶mRNA的表达。
由上述载体表达的shRNA的核酸序列如下：
SEQ ID NO 1:5’-GCAGAUCACUGCAGAUAAGUU-3’(ANT2shRNA的正义序列)
SEQ ID NO2:5’-UUCAAGAGA-3’(ANT2shRNA的环序列)
SEQ ID NO3:5’-AACUUAUCUGCAGUGAUCUGC-3’(ANT2shRNA的反义序列)
实施例1：ANT2shRNA对HER2/neu表达的影响
如通过FACS（流式细胞术和细胞分选）所测量的，本发明发现ANT2shRNA的引入使乳腺癌细胞系SK-BR3表面的HER2/neu表达水平降低。
Lipo-fectamineTM2000（Invitrogen，非病毒递送系统）用于将ANT2shRNA引入乳腺癌细胞系SK-BR3中。就这点而言，LipofectamineTM2000的带正电荷的亲水性成分与带负电荷的shRNA相互作用，从而形成复合物。该复合物与细胞膜融合，从而将shRNA递送进入细胞。
对于FACS分析而言，在细胞表面表达的HER2/neu与抗体[一抗：抗人HER2/neu抗体（Santa Cruz生物技术，海德堡，德国）]结合，随后与二抗（FITC结合的抗兔-IgG（Santa Cruz生物技术，海德堡，德国））发生反应。因为二抗与荧光材料结合，所以通过FACS对荧光材料的检测允许从未表达的细胞中分选出表达HER2/neu的细胞。SK-BR3表达高水平的HER2/neu（sc shRNA），而HER2/neu的表达通过将ANT2shRNA引入细胞中而被下调（图1）。
为了监测在ANT2敲低条件下HER2/neu和HSP90之间的相互作用的变化，从被ANT2shRNA转染的人乳腺癌细胞系SK-BR3中提取蛋白质。
具体而言，首先，使用抗人HER2/neu抗体（Santa Cruz生物技术，海德堡，德国）免疫沉淀蛋白质，随后使用抗人HSP90抗体（Santa Cruz生物技术，海德堡，德国）进行Western印迹以确定蛋白质表达水平。结果在图2中给出。
当通过ANT2shRNA下调ANT2的表达时，如图2所示，检测到HER2/neu和HSP90之间发生弱相互作用，同时检测到泛素化（在降解之前泛素标记蛋白质的过程）水平提高。也就是说，通过shRNA敲低ANT2诱导HER2/neu和HSP90之间的相互作用减少，从而增加HER2/neu的泛素化，导致HER2/neu的表达水平降低。
就这点而言，HSP抑制剂/17-AAG（17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（A.G.Scientific Inc.,圣地亚哥，CA））用作阳性对照。β-肌动蛋白（一种细胞骨架蛋白）用作内参，因为其通常保持相同的总细胞蛋白比例，除了实验条件显著影响细胞骨架重排或细胞粘附的情况。抗-β-肌动蛋白抗体（Cellsignaling Tech.,Beverly,MA）用于β-肌动蛋白的定量分析。
实施例2：ANT2shRNA对Akt活性的影响
在乳腺癌细胞系SK-BR3中，高表达的HER2/neu活化Akt。本领域已知活化的Akt与乳腺癌细胞的存活机制有关并且与乳腺癌细胞迁移和侵袭进入其他组织有关。Akt的活化可通过酪氨酸残基的磷酸化作用来确定。
在ANT2shRNA转染进入人乳腺癌细胞系SK-BR3中之后，对活化的Akt（磷酸化的）进行定量分析[抗Akt抗体和抗磷酸-Akt抗体（Cell signaling Tech.,Beverly,MA）]。在乳腺癌细胞系中保持的较高Akt活性通过ANT2shRNA的引入而降低。已知的用于抑制HSP90并由此抑制HER2/neu介导的Akt信号转导通路的17-AAG用作阳性对照（图3A）。
此外，ANT2shRNA对Akt的抑制通过另一实验确定。磷酸-Akt的活性在通过ANT2shRNA敲低ANT2之后降低，但是发现在通过引入过表达ANT2的载体使磷酸-Akt的活性在ANT2过表达之后恢复。LY294002（Calbiochem,圣地亚哥，CA，诱导Akt磷酸化的PI3K的抑制剂）用作阳性对照（图3B）。
基于所报道的HSP90与Akt发生相互作用，结合ANT2shRNA下调Akt，进行实验以检测ANT2shRNA是否抑制HSP90的活性，从而导致HSP90与Akt发生较弱的相互作用。
首先，使用抗体[HSP抑制剂/17-AAG（17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素）：A.G.Scientific Inc.（圣地亚哥，CA）]对HSP90进行免疫沉淀，随后使用抗Akt抗体（Cell signaling Tech.,Beverly,MA）进行Western印迹，从而确定表达水平。发现ANT2shRNA干扰HSP90与Akt的相互作用并且使磷酸-Akt的水平降低（图3C）。数据说明通过ANT2shRNA抑制HSP90的活性导致HSP90与Akt之间发生弱相互作用并且降低Akt的活性。
实施例3：ANT2shRNA对VEGF产量的影响
在本发明中发现，将ANT2shRNA引入人乳腺癌细胞系SK-BR3中导致Akt活性降低（抑制PI3K/Akt信号转导通路），从而导致VEGF下调，VEGF涉及肿瘤细胞周围的血管生成。
具体而言，将被ANT2shRNA转染的细胞培养24小时，随后分离总RNA。由其中的mRNA，通过寡-dT逆转录合成cDNA。使用对VEGF（血管内皮生长因子）具有特异性的引物分析VEGF的表达。
如图4A所示，如通过RT-PCR所测量的，观察到在乳腺癌细胞系SK-BR3中通过shRNA敲低ANT2降低VEGF（VEGF涉及血管生成）的mRNA水平。
此外，使用FACS（流式细胞术和细胞分选）观察到细胞内VEGF蛋白质水平下降。VEGF在细胞内产生并且从细胞中释放出来。为了防止这种细胞外分泌，用BFA（布雷菲德菌素A）处理细胞。当VEGF蛋白质累积时，对其量进行比较。就这点而言，在通过用BFA处理使VEGF在细胞内累积之后，使细胞膜穿孔以形成孔，通过该孔将抗VEGF一抗（BD Pharmingen，圣地亚哥，CA）引入细胞内。随后，使二抗[FITC结合的抗-小鼠IgG抗体（BD Pharmingen，圣地亚哥，CA）]结合至与VEGF复合的一抗，随后进行FACS分析（图4B）。
此外，通过实验的方式再次确认ANT2shRNA下调VEGF的mRNA表达。过表达ANT2的载体（pcDNA3.0-ANT2表达载体）的引入提高ANT2的表达，同时伴随VEGF mRNA水平的恢复。在如下事实的基础上，将针对诱导Akt磷酸化的PI3K的抑制性药物（LY294002）（图4C）用作阳性对照，所述事实为：VEGF的mRNA表达由PI3K/Akt信号转导通路的活化诱导。
实施例4：ANT2shRNA对MMP的表达和活性的影响
在该实施例中发现，在人乳腺癌细胞系SK-BR3中通过shRNA敲低ANT2降低Akt活性（抑制PI3K/Akt信号转导通路），从而降解ECM（细胞外基质），由此下调MMP（基质金属蛋白酶），MMP涉及癌细胞的迁移和侵袭。
检测了MMP中的MT1-MMP（已知其表达受VEGF控制）和MMP2和MMP9（已知这两者的活性受MT1-MMP控制）的表达和活性。
首先，如RT-PCR所测量的（图5A），本发明发现被ANT2shRNA转染的乳腺癌细胞系SK-BR3的MT1-MMP的mRNA水平降低，所述降低引起ECM（细胞外基质）降解，并且如Western印迹所测量的（图5B），本发明还发现被ANT2shRNA转染的乳腺癌细胞系SK-BR3的MT1-MMP的蛋白质水平降低。此外，再次确认了ANT2shRNA使MT1-MMP的mRNA表达降低。就这点而言，当引入过表达PI3K的载体[野生型PI3K/p110载体（由Karin Reif博士提供）]以人工活化PI3K/Akt信号转导通路时，如RT-PCR所测量的（图6A），观察到MT1-MMP的mRNA水平恢复，并且如Western印迹所测量的（图6B），观察到MT1-MMP的蛋白质水平恢复。
此外，RT-PCR显示将ANT2shRNA引入乳腺癌细胞系SK-BR3中降低了MMP2mRNA的水平和MMP9mRNA的水平，这两者均由MTI-MMP控制（图7A）。将GAPDH mRNA用作内参以显示所使用的mRNA的量一致，因为不论在细胞内条件下还是在细胞外条件下GAPDH都保持恒定。如明胶酶谱所测量的，本发明发现将ANT2shRNA引入乳腺癌细胞系SK-BR3中使MMP2和MMP9失活，这两者均由MT1-MMP控制。在所述酶谱中，MMP2和MMP9的较高的明胶酶活性表现出更强的白色谱带（图7B），所述较高的明胶酶活性是由较大的MMP2和MMP9活性形式群产生的。
实施例5：ANT2shRNA对乳腺癌细胞系迁移并侵袭进入其他组织的影响
如实施例4所说明的，ANT2shRNA的引入使MMP（基质金属蛋白酶）的表达和活性降低，MMP的表达和活性引起肿瘤细胞的迁移和侵袭。下面的实验定量地检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的降低。
具体而言，为了证实ANT2shRNA可降低肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，进行基质胶（matrigel）侵袭实验和跨孔（transwell）迁移实验。基质胶侵袭实验通过对降解基质胶并穿过基质胶的细胞进行染色以分析肿瘤细胞的侵袭能力。
具体而言，将被ANT2shRNA转染的人乳腺癌细胞系SK-BR3孵育18小时。随后，将100μl其中含有0.1%的BSA、2×104个细胞的α-MEM放置于腔室（Becton Dickinson Labware，USA）上部，随后进行孵育。24小时后，除去腔室上部的培养基并用PBS洗涤细胞三次，用棉签获取细胞。将穿过基质胶并粘附于孔的外侧底部的细胞用10%福尔马林固定10分钟并用0.1%结晶紫染色20分钟。在显微镜下对染色后的细胞进行计数。另外，使用跨孔迁移实验检测肿瘤细胞的迁移能力。在孔径为8μm的跨孔插入物（Corning）的下部涂覆明胶（Sigma），随后将细胞悬浮液置于跨孔插入物中。同时，将含有浓度为10ng/mL的bFGF（Sigma）的无血清培养基置于外部容器中。在孵育预定的时间（18小时）之后，用棉签擦拭插入物的内部以获取未迁移的内皮细胞。迁移进入下层的细胞用Diff-Quick溶液染色并在200x的显微镜视野中计数。
当引入ANT2shRNA时，穿过基质胶和跨孔并被染色的细胞的计数减少，这说明肿瘤细胞的侵袭和迁移能力被弱化（图8）。
实施例6：ANT2shRNA对TRAIL敏感性的影响
检测被ANT2shRNA转染的乳腺癌细胞系对TRAIL的反应性（癌细胞死亡）。
作为本实验中的乳腺癌细胞系，使用对TRAIL具有耐药性的MCF7，对TRAIL具有高度敏感性的MDA-MB-231。用不同浓度的TRAIL处理MCF7和MDA-MB-231之后，使用CCK8试剂分析细胞死亡。CCK8实验为细胞活力实验。具体而言，将100μL细胞悬浮液置于每个孔上（1×104细胞/孔）。所述孔用TRAIL的10倍连续稀释液（从1μg/mL至0）处理，随后孵育12小时。在加入10μL CCK8试剂之后，在CO2孵育器中孵育细胞持续一段合适的时间（4小时）并且测量450nm的吸光度以分析细胞死亡。
TRAIL诱导MDA-MB-231细胞经历TRAIL引起的细胞凋亡，而TRAIL介导的细胞凋亡不对MCF7细胞起效（图9A）。在该方法中，只有存活的细胞表现出随CCK8试剂的颜色改变，所述颜色改变在某一波长下检测。
当添加浓度高达100ng/mL的TRAIL时，对TRAIL具有耐药性的MCF7细胞没有被诱导经历细胞凋亡。然而，将ANT2shRNA引入MCF7细胞中诱导细胞凋亡（～25%）。如由CCK8试剂所测量的（图9B），本发明发现ANT2shRNA结合TRAIL诱导更强的细胞凋亡（～65%）。如Western印迹所测量的，还观察到ANT2shRNA的引入使ANT2的细胞内蛋白质水平降低。对于阴性对照而言，PBS为TRAIL的阴性对照，sc shRNA（被打乱的shRNA）为ANT2shRNA的阴性对照。
在仅用TRAIL处理之后，仅用ANT2shRNA处理之后，和用TRAIL结合ANT2shRNA处理之后，检测对TRAIL具有耐药性的MCF7细胞的细胞凋亡，结果在图9C中显示。如图9C所示，最强的细胞凋亡由ANT2shRNA结合TRAIL诱导。
在乳腺癌细胞系T47D和BT474中检测到与MCF7相同的结果，已知乳腺癌细胞系T47D和BT474均对TRAIL具有耐药性（图10A）。对此而言，使用CCK8实验对细胞凋亡进行定量。
再次确认对TRAIL的敏感性的提高归因于通过shRNA的ANT2的敲低。如通过CCK8实验所测量的（图10B），在该情况下，当过表达ANT2的载体（pcDNA-ANT2）用于人工过表达ANT2时，发现TRAIL介导的细胞凋亡降低。引入空载体pcDNA作为pcDNA-ANT2的阴性对照。当ANT2shRNA使对TRAIL的敏感性提高以诱导细胞凋亡时，通过Western印迹检测到细胞内蛋白质的伴随事件（PARP蛋白质的裂解、胱天蛋白酶-8/9/7的裂解和Bid蛋白质的截短）。
因为线粒体在调节细胞凋亡方面发挥重要作用，在ANT2shRNA触发的TRAIL介导的细胞凋亡之后，定量监测从线粒体中释放至细胞质的细胞色素C。线粒体蛋白COX IV用作内参以保证使用相同量的线粒体蛋白。当仅使用TRAIL时没有观察到细胞凋亡诱导的蛋白质模式发生改变。当用ANT2shRNA结合TRAIL处理细胞时观察到的蛋白质模式的变化比仅用ANT shRNA处理细胞时观察到的蛋白质模式的变化更大（图10C）。细胞内蛋白质模式的这些变化证实了ANT2shRNA促进TRAIL介导的细胞凋亡。
实施例7：ANT2shRNA对TRAIL受体的表达的影响
通过Western印迹分析乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231（这两者对TRAIL的敏感性不同）的均与TRAIL结合的受体DR4、DR5、DcR1和DcR2的表达水平。
当结合至TRAIL时，DR4和DR5将正常细胞凋亡信号递送至细胞中，而DcR1和DcR2却不是如此。因此，可通过较高的DR4和DR5表达水平和较低的DcR1和DcR2表达水平得到较高的TRAIL敏感性。
如图11A所示，观察到对TRAIL具有较低敏感性的MCF7细胞具有较低水平的DR4和DR5以及较高水平的DcR1和DcR2，而在对TRAIL具有较高的敏感性的MDA-MB-231细胞中检测到较高水平的DR4和DR5以及较低水平的DcR1和DcR2。
在引入ANT2shRNA之后，检测TRAIL受体的表达模式，结果在图11B中给出。如图26B所示，ANT2shRNA的引入上调DR4和DR5，并且下调DcR1和DcR2。在已知的对TRAIL具有耐药性的T47D和BT474细胞系中，观察到与MCF7相同的作用。也就是说，ANT2shRNA的引入提高了DR4和DR5的表达，但是降低了DcR1和DcR2的表达（图11C）。
实施例8：ANT2shRNA对p53活性的影响
进行实验以揭示ANT2shRNA上调DR4和DR5的机制。在肿瘤抑制蛋白p53诱导DR4和DR5表达的报道的基础上，检测ANT2shRNA的引入以确定ANT2shRNA是否提高p53的表达和磷酸化的p53的水平。定量测量p53和磷酸化的p53[抗-Thr81磷酸-p53和抗p53抗体（Santa Cruz生物技术，海德堡，德国）]。
如图12A所示，引入ANT2shRNA上调p53并且提高p53的活性。
报告基因实验显示通过ANT2shRNA上调p53归因于p53启动子的亲和性增加。该实验通常以如下方式设计：当某一蛋白质与DNA结合以诱导目标基因表达时，报告基因同时被表达并且通过吸光度进行定量分析。具体而言，用ANT2shRNA和pGL-p53结合位点-荧光素酶表达载体共转染细胞并且孵育一定的时间段。底物与被表达的荧光素酶发生反应，从而使用光度计（FB12光度计，Berthold Detection Systems，Pforzheim，德国）测量荧光素酶的活性。
如图12B所示，ANT2shRNA的引入诱导与p53融合的报告基因的表达显著提高。设计为对mRNA的表达没有影响的sc shRNA（被打乱的shRNA）用作ANT2shRNA的阴性对照。数据显示ANT2shRNA提高对p53的基因表达的诱导能力。
此外，进行实验以再次证实ANT2shRNA的引入诱导p53的表达和活性，由此上调TRAIL受体DR4和DR5。如图12C所示，用p53抑制剂（pifithrin-α：Biovision，Zurich，瑞士）预处理抑制ANT2shRNA对DR4和DR5的上调（Western印迹）。
而且，用p53抑制剂（pifithrin-α）处理抑制ANT2shRNA对TRAIL介导的细胞凋亡的上调，这证实了ANT2shRNA的引入诱导p53的表达和活性，导致对TRAIL的敏感性提高。使用CCK8实验对细胞死亡进行定量，并且使用PBS作为p53抑制剂的阴性对照（图13）。
如数据中所显示的，将ANT2shRNA引入乳腺癌细胞系中提高p53的活性，最终导致细胞表面的DR4和DR5上调。
实施例9：ANT2shRNA通过提高对TRAIL的敏感性抑制肿瘤生长的能力的体内实验
进行动物测试以检测ANT2shRNA是否通过活化TRAIL介导的细胞凋亡抑制肿瘤生长。
将对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF7移植到免疫缺陷Balb/c裸鼠中。当肿瘤生长至体积为100mm3时，用ANT2shRNA和TRAIL治疗所述裸鼠。就这点而言，腹膜内注射（10mg/kg）TRAIL，而将ANT2shRNA直接注射进肿瘤内（100μg：补充有200μl LipofectamineTM2000）。这时，LipofectamineTM2000用于将ANT2shRNA递送进入肿瘤细胞。在45天内治疗三次之后，监测肿瘤体积。相同体积的PBS和sc shRNA用作TRAIL和sc shRNA各自的阴性对照。
如图14A所示，如同细胞培养物测试那样，单独的TRAIL对肿瘤生长没有显著影响。观察到单独的ANT2抑制肿瘤生长。然而，当同时用ANT2shRNA和TRAIL治疗动物时，获得对肿瘤生长的最强的抑制作用。
在第45天，对动物模型实施安乐死并切除肿瘤。使用RT-PCR检测肿瘤细胞中TRAIL受体的表达模式，结果在图14B中给出。
如图14B所示，ANT2shRNA的引入上调DR4和DR5，但下调DcR2。
数据暗示通过ANT2shRNA抑制TRAIL介导的肿瘤归因于对TRAIL受体表达的控制。
<构建ANT2shRNA腺病毒>
腺病毒系统被用于与ANT2shRNA（ANT2shRNA序列和靶向ANT2的环序列与在构建ANT2shRNA表达载体中使用的序列相同）一同有效转染祖细胞。
为了构建重组腺病毒，将pSilencer-ANT2shRNA DNA亚克隆至Pca14穿梭载体的EcoRI/HindIII位点，Pca14穿梭载体被设计为有利于克隆进入腺病毒载体。阳性克隆（real-clone）通过PvuI酶切图谱分析（DNA通过酶的方式被消化并且进行电泳以检测适当尺寸位置处的DNA片段）检测。在BJ5183感受态细胞（允许腺病毒载体和穿梭载体DNA之间同源重组的大肠杆菌菌株）中，由PcaI线性化的Pca14-mANT2shRNA DNA与由BstBI线性化的腺病毒-dl324载体（E1删除的：复制缺损型载体）DNA进行同源重组。得到的重组DNA被转化至DH5α细胞中并被扩增。检测后，将阳性克隆转染至293a包装细胞（被设计为易于将DNA引入其中并且被设计为由于腺病毒复制基因E1的存在而允许在其内部大量产生克隆的腺病毒的细胞）中以诱导细胞内的腺病毒增殖。因此，使用PEG-CsCl（密度梯度层分离）法将富集的腺病毒-mANT2shRNA分离纯化，随后在实验中使用。
实施例10：ANT2shRNA对乳腺癌细胞系的祖细胞的影响
乳腺癌细胞系由祖细胞和非祖细胞构成。ANT2蛋白质在这两种细胞群中高表达。在本实施例中，检测这两种细胞群中取决于ANT2shRNA的引入的细胞凋亡。
肿瘤的祖细胞通过其表面的CD44+/CD24-表征。在乳腺癌细胞系中，MDA-MB-231主要由祖细胞（CD44+/CD24-）构成（超过80%），而MCF7含有较少比例（少于10%）的祖细胞。
使用RT-PCR分析上述两种细胞系和从中分离出的祖细胞（CD44+/CD24-）的ANT2基因表达。实时PCR也用于证实RT-PCR的结果。用CD44单克隆抗体[抗-PE结合的CD44单克隆抗体（BD-PharMingen，圣地亚哥，加利福尼亚，USA）]和抗-PE微珠[MiltenyiBiotec.（BergischGladbach,德国）]处理这两种细胞系，随后在MACS（磁性活化细胞分选器）的帮助下分选必需的细胞。使用RT-PCR和实时PCR分析祖细胞的分选出的细胞和未分选的细胞的ANT2mRNA水平。
如图15所示，不论是否分选为祖细胞（CD44+/CD24-），这两种细胞系的ANT2表达水平均较高。这些结果暗示通过shRNA下调ANT2可诱导祖细胞和非祖细胞中的细胞凋亡，由此提高治疗可能性。
此外，进行实验以说明ANT2shRNA诱导乳腺癌细胞的祖细胞（CD44+/CD24-）经历细胞凋亡的能力。通过抑制E-钙粘蛋白由正常的乳腺上皮细胞系（MCF10A）人工转化的间充质细胞用作本实验的细胞体系。已知所述间充质细胞表现出乳腺癌干细胞的特点。
在通过shRNA敲低正常乳腺上皮细胞（MCF10A）中的E-钙粘蛋白之后，如图16A所示，以致密粘附的模式正常生长的细胞变为表现出松散粘附的生长模式，这说明正常上皮细胞转化为间充质细胞。同时，如RT-PCR所测量的（图16B），发现细胞的E-钙粘蛋白表达提高并且ANT2表达降低。
进一步地，ANT2shRNA仅被引入从乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中分离的祖细胞（CD44+/CD24-）中，随后使用由Annexin V-FITC和PI染色的FACS分析细胞凋亡。该实验基于如下事实：当细胞死亡时，细胞内蛋白质和DNA从细胞（CD44+/CD24-）中释放出来并分别与Annexin V-FITC和PI发生反应。结果在图17中给出。甚至观察到通过ANT2shRNA有效诱导从两种肿瘤细胞系中分离出来的祖细胞经历细胞凋亡。对于此，使用sc shRNA作为阴性对照。
而且，检测ANT2shRNA以确定其是否可诱导通过将E-钙粘蛋白shRNA引入正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）中得到的乳腺癌类干细胞中的有效的细胞凋亡。结果在图18中给出。对于分析而言，用annexin-V-FITC和PI对细胞进行染色。这是基于如下事实：程序性细胞死亡的早期阶段的细胞膜被破坏，从而从细胞中释放出诸如磷脂酰丝氨酸之类的磷脂并且Annexin V与磷脂结合，这用作程序性细胞死亡的早期阶段的证据。至于PI（碘化丙啶），其通过插入碱基之间与DNA结合并且其为可用于染色DNA的荧光分子。PI用于根据细胞凋亡之后的核芽和凝聚确定细胞死亡。正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）用作本实验的阴性对照。甚至当引入ANT2shRNA时，在具有低ANT2表达水平的正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）中几乎没有诱导细胞凋亡（图18A）。另一方面，通过将E-钙粘蛋白shRNA引入MCF10A中获得的以间充质的方式转分化的细胞的ANT2表达水平得到改提高，当将ANT2shRNA引入所述细胞中时，细胞（E-cad shRNA转染的MCF10A）被有效诱导经历细胞凋亡（图18B）。
结果说明ANT2shRNA可有效杀死乳腺癌干细胞，而不影响正常上皮细胞。
实施例11：ANT2shRNA对祖细胞的肿瘤生长活性的影响
进行实验以检测ANT2shRNA对乳腺癌祖细胞的肿瘤生长活性的影响。
具体而言，从乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中仅仅分离作为肿瘤复发来源的祖细胞（CD44+/CD24-）（以与实施例10相同的方式）并用ANT2shRNA转染所述祖细胞，随后，在非粘附性培养盘（使细胞与培养盘的粘附最小化以促进细胞团的形成）中培养以观察细胞团的形成。
如图19A所示，当不引入ANT2shRNA时，形成大量细胞团，而引入ANT2shRNA使得几乎没有细胞团形成或形成非常少的细胞团。此外，如图19B所示，虽然形成了细胞团，但是所述细胞团的体积非常小。
这些结果说明ANT2shRNA抑制在肿瘤复发中发挥重要作用的祖细胞的肿瘤生长活性。
实施例12：ANT2shRNA对乳腺癌祖细胞的耐药性的影响
乳腺癌的祖细胞（CD44+/CD24-）表现出对药物（抗癌药剂）具有高耐药性。检测了ANT2shRNA对祖细胞的药物敏感性的影响。
用阿霉素（广泛使用的抗癌药剂）的10倍连续稀释液（从10μM至0）处理祖细胞（CD44+/CD24-）占主要比例的MDA-MB-231细胞系，随后进行孵育（24小时）。使用CCK8实验对细胞凋亡进行定量分析并且在图20中给出结果。以与实施例6相同的方法进行实验。
如图20所示，祖细胞（CD44+/CD24-）和非祖细胞均对阿霉素没有敏感性。相反，当用ANT2shRNA转染这两种细胞时，这两种细胞被诱导以剂量依赖的模式经历细胞凋亡。
用各种不同浓度的阿霉素（广泛用于治疗乳腺癌）处理在祖细胞（CD44+/CD24-）占较小比例的乳腺癌细胞系MCF7，随后使用CCK8实验对细胞凋亡进行定量分析。结果在图21中给出。如图21所示，祖细胞（CD44+/CD24-）对阿霉素的敏感性低于祖细胞和非祖细胞的混合细胞群对阿霉素的敏感性。另一方面，发现ANT2shRNA的引入在两种细胞群中诱导剂量依赖方式的细胞凋亡。该结果说明ANT2shRNA的引入使细胞对阿霉素具有更高的敏感性，这给出了耐药性问题的解决方案。
实施例13：ANT2shRNA对引起乳腺癌祖细胞的耐药性的受体ABCG2的表达的影响
高耐药性（即，乳腺癌祖细胞对药物的低敏感性）的代表性原因之一为MDR（多耐药性受体）的过表达，MDR位于细胞膜中，起到将药物从细胞运送至外部的作用。受体中的代表性受体为ABCG2，该受体尤其在乳腺癌细胞中高表达。
进行下面的实验以检测通过ANT2shRNA提高药物敏感性是否归因于对ABCG2的表达和活性的控制。
乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7（分别含有高比例和低比例的祖细胞（CD44+/CD24-））用于该实验中。使用RT-PCR分析从乳腺癌细胞系中分选的祖细胞（CD44+/CD24-），未分选的细胞和通过敲低E-钙粘蛋白以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞系（MCF10A）的ABCG2mRNA的表达。此外，通过Western印迹和抗ABCG2抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA,USA）确定ABCG蛋白水平。
如图22所示，从两种肿瘤细胞系中分选出的祖细胞（CD44+/CD24-）、未分选的细胞和通过敲低E-钙粘蛋白以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞系（MCF10A）中的ABCG2mRNA的表达水平提高。
如图23所示，从两种肿瘤细胞系中分选出的祖细胞（CD44+/CD24-）、未分选的细胞和通过敲低E-钙粘蛋白以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞系（MCF10A）中的ABCG2的蛋白表达水平提高。此外，当引入ANT2shRNA时观察到提高的ABCG2水平降低。该结果说明表达高水平的ABCG2的乳腺癌祖细胞和乳腺癌干细胞均可通过将ANT2shRNA引入其中降低ABCG2的表达。
此外，检测乳腺癌的祖细胞以确定ABCG2的活性是否有实际提高。具体而言，使用Hoechst33342分析从乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中分选出的祖细胞（CD44+/CD24-）、未分选的细胞和通过敲低E-钙粘蛋白以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞系（MCF10A）的ABCG2活性。Hoechst33342的累积程度给出ABCG2活性的定量指标。结果在图24中给出。
如图24所示，从两种肿瘤细胞系中分选出的祖细胞（CD44+/CD24-）、未分选的细胞和通过敲低E-钙粘蛋白以间充质的方式转分化的乳腺上皮细胞系（MCF10A）中的ABCG2活性提高。
基于上面获得的结果，检测ANT2shRNA对ABCG2活性的影响。为此，用Hoechst33342（Sigma）处理细胞，随后分选荧光激发的细胞以定量分析ABCG2活性。结果在图25中给出。如图25所示，ABCG2的活性被ANT2shRNA有效降低。
这些结果说明当乳腺癌的祖细胞（其表现出涉及耐药性的受体ABCG2的高表达水平和高活性）被ANT2shRNA转染时，ABCG2的表达和活性降低。也就是说，ANT2shRNA使乳腺癌祖细胞中的ABCG2的活性降低，这为耐药性问题给出了解决方案。
实施例14：将ANT2shRNA选择性递送至乳腺癌祖细胞以及ANT2shRNA的细胞凋亡作用
进行实验以检测ANT2shRNA是否可有效杀死乳腺癌的祖细胞。当通过使用ANT2shRNA治疗患有乳腺癌的患者时，将ANT2shRNA有效递送至靶细胞是非常重要的。在该实验中，制备纳米复合物[PEI/透明质酸（HA）纳米复合物]用作靶向CD44的递送物质，CD44在乳腺癌祖细胞上高表达。为了检测ANT2shRNA是否可被有效递送至乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D（MDA-MB-231和T47D分别以高水平和低水平表达CD44），将荧光结合的纳米颗粒[PEI/透明质酸（HA）纳米复合物]与ANT2shRNA复合。将得到的纳米复合物施加于各细胞系并随后进行孵育，接着分析细胞内荧光强度以确定引入细胞中的ANT2shRNA的水平。
如图26所示，高效地将目标基因选择性地递送至高水平表达CD44的细胞系MDA-MB-231中。
数据说明在递送靶向在乳腺癌祖细胞表面高表达的CD44的纳米复合物[PEI/透明质酸（HA）纳米复合物]的帮助下，ANT2shRNA可被选择性地递送至祖细胞并诱导细胞经历细胞凋亡。
本领域技术人员可理解的是，对本发明的以上描述易于发生多种改变、变化和调整，并且所述改变、变化和调整意在所附的权利要求的等同范围和含义内。因此，本发明公开的实施方式和附图无意限定本发明的技术实质，只是对本发明进行描述。本发明的技术实质不限于这些实施方式和附图。
工业实用性
可预见到的是，本发明提供用于乳腺癌的疗法，该疗法高效抑制乳腺癌细胞的转移并克服对抗癌药剂的耐受性。而且，本发明可用于研发用于乳腺癌干细胞的疗法。
序列表
SEQ ID NO1:5’-GCAGAUCACUGCAGAUAAGUU-3’(ANT2shRNA的正义序列)
SEQ ID NO2:5’-UUCAAGAGA-3’(ANT2shRNA的环序列)
SEQ ID NO3:5’-AACUUAUCUGCAGUGAUCUGC-3’(ANT2shRNA的反义序列)

Claims (12)

1.一种用于治疗乳腺癌的组合物，所述组合物包含作为活性成分的腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）小干扰RNA（siRNA）或腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）短发夹RNA（shRNA），其特征在于能够抑制乳腺癌细胞的转移。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，ANT2siRNA或ANT2shRNA通过SEQ ID NO:3所表示的反义序列与SEQ ID NO:1所表示的正义序列的相互作用诱导ANT2mRNA降解。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物抑制人表皮生长因子受体2（HER2/neu）的表达。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物提高用于治疗乳腺癌的TNF相关的细胞凋亡诱导配体（TRAIL）的作用。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物提高死亡受体4（DR4）和死亡受体5（DR5）的表达并且抑制死亡诱捕受体1（DcR1）和死亡诱捕受体2（DcR2）的表达。
6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物提高p53的表达水平和活性。
7.一种用于治疗乳腺癌干细胞的组合物，所述组合物包含作为活性成分的腺嘌呤核苷酸转运体2小干扰RNA（ANT2siRNA）或ANT2短发夹RNA（shRNA）。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物抑制ABCG2（ATP-结合盒亚家族G成员2）的表达和活性。
9.如权利要求7所述的组合物，当所述干细胞被抗癌药剂进一步治疗时，所述组合物通过改善所述干细胞对所述抗癌药剂的反应以及减缓所述干细胞对所述抗癌药剂的耐受性的发展而提高所述抗癌药剂的疗效。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述抗癌药剂为阿霉素。
11.一种用于抑制乳腺癌细胞的转移的方法，所述方法包括：
将有效量的下述组合物给药于有此需要的受治者，所述组合物包含作为活性成分的腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）小干扰RNA（siRNA）或腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）短发夹RNA（shRNA）。
12.一种用于治疗乳腺癌干细胞的方法，所述方法包括：
将有效量的下述组合物给药于有此需要的受治者，所述组合物包含作为活性成分的腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）小干扰RNA（siRNA）或腺嘌呤核苷酸转运体2（ANT2）短发夹RNA（shRNA）。
CN201180067534.0A 2011-02-18 2011-10-20 通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法 Active CN103379914B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0014820 2011-02-18
KR1020110014820A KR20120095263A (ko) 2011-02-18 2011-02-18 Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ ２ ｍＲＮＡ 발현을 감소시켜 유방암을 치료하는 방법
PCT/KR2011/007849 WO2012111900A1 (en) 2011-02-18 2011-10-20 Method for treating breast cancer by decreasing the expression of adenine nucleotide translocator 2 mrna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103379914A true CN103379914A (zh) 2013-10-30
CN103379914B CN103379914B (zh) 2016-02-17

Family

ID=46672787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180067534.0A Active CN103379914B (zh) 2011-02-18 2011-10-20 通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP2675468A4 (zh)
JP (1) JP2014506888A (zh)
KR (1) KR20120095263A (zh)
CN (1) CN103379914B (zh)
WO (1) WO2012111900A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112516317A (zh) * 2020-12-10 2021-03-19 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种预防和治疗癌症的药物组合物及其应用
CN112534068A (zh) * 2018-08-02 2021-03-19 外生私人贸易有限公司 使用液体活检多种癌基因生物标志物的乳腺癌早期诊断及治疗后监测的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103263676A (zh) * 2013-02-07 2013-08-28 魏敏杰 一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法
KR101681597B1 (ko) * 2014-01-17 2016-12-01 주식회사 바이오인프라 ANT2 siRNA를 함유하는 HER2 표적 항암제에 대한 내성 극복을 위한 조성물
KR102604882B1 (ko) 2021-07-01 2023-11-21 인천대학교 산학협력단 신규 특이적 항암 및 항염증 siRNA 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060210535A1 (en) * 2003-01-21 2006-09-21 Annie Borgne Means for regulating the expression of human isoforms of ant
US20060276527A1 (en) * 2003-01-17 2006-12-07 Thresold Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for the treatment of cancer
US20090202623A1 (en) * 2006-04-11 2009-08-13 Chul Woo Kim Gene therapy for cancer using small interfering rna specific to ant2 and a method to overcome tolerance to antitumor agent

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8399426B2 (en) * 2006-04-11 2013-03-19 Bioinfra Inc. Method for treating breast cancer using adenine nucleotide translocator 2 (ANT2) siRNA or ANT2 shRNA
US20080145313A1 (en) * 2006-08-30 2008-06-19 Genesis Research & Development Corporation Limited Compositions and Methods for the Treatment and Prevention of Neoplastic Disorders
WO2009126335A2 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ant2 inhibitor compounds and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060276527A1 (en) * 2003-01-17 2006-12-07 Thresold Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for the treatment of cancer
US20060210535A1 (en) * 2003-01-21 2006-09-21 Annie Borgne Means for regulating the expression of human isoforms of ant
US20090202623A1 (en) * 2006-04-11 2009-08-13 Chul Woo Kim Gene therapy for cancer using small interfering rna specific to ant2 and a method to overcome tolerance to antitumor agent

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEVROLLIER A ET AL.: "What is the specific role of ANT2 in cancer cells?", 《MED SCI》 *
JANG JY ET AL.: "degradation of HER2/neu by ANT2 shRNA suppresses migration and invasiveness of breast cancer cells", 《BMC CANCER》 *
JANG JY ET AL.: "Short-hairpin RNA-induced suppression of adenine nucleotide translocase-2 in breast cancer cells restores their susceptibility to TRAIL-induced apoptosis by activating JNK and modulating TRAIL receptor expression", 《MOL CANCER》 *
JANG JY ET AL.: "Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo", 《BREAST CANCER RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112534068A (zh) * 2018-08-02 2021-03-19 外生私人贸易有限公司 使用液体活检多种癌基因生物标志物的乳腺癌早期诊断及治疗后监测的方法
CN112516317A (zh) * 2020-12-10 2021-03-19 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种预防和治疗癌症的药物组合物及其应用
CN112516317B (zh) * 2020-12-10 2021-12-17 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种预防和治疗癌症的药物组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2675468A4 (en) 2014-10-22
KR20120095263A (ko) 2012-08-28
EP2675468A1 (en) 2013-12-25
CN103379914B (zh) 2016-02-17
JP2014506888A (ja) 2014-03-20
WO2012111900A1 (en) 2012-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. ZEB1 enhances Warburg effect to facilitate tumorigenesis and metastasis of HCC by transcriptionally activating PFKM
Gao et al. Down-regulation of signal transducer and activator of transcription 3 expression using vector-based small interfering RNAs suppresses growth of human prostate tumor in vivo
EP1189611B1 (en) Cancer therapy
Wang et al. MicroRNA-873 (miRNA-873) inhibits glioblastoma tumorigenesis and metastasis by suppressing the expression of IGF2BP1
Ren et al. MicroRNA-21 inhibitor sensitizes human glioblastoma cells U251 (PTEN-mutant) and LN229 (PTEN-wild type) to taxol
Tseng et al. Notch2‐induced COX‐2 expression enhancing gastric cancer progression
Li et al. Polyethylenimine-complexed plasmid particles targeting focal adhesion kinase function as melanoma tumor therapeutics
JP2019172696A (ja) セロトニン放出ホルモン、アドレナリン放出ホルモン、ノルアドレナリン放出ホルモン、グルタミン酸放出ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのマイクロｒｎａおよび該マイクロｒｎａを含む組成物
Xu et al. The developmental transcription factor IRF6 attenuates ABCG2 gene expression and distinctively reverses stemness phenotype in nasopharyngeal carcinoma
Oh et al. siRNA targeting Livin decreases tumor in a xenograft model for colon cancer
Lee et al. CD44-shRNA recombinant adenovirus inhibits cell proliferation, invasion, and migration, and promotes apoptosis in HCT116 colon cancer cells
CN103379914B (zh) 通过降低腺嘌呤核苷酸转运体2mRNA的表达治疗乳腺癌的方法
Guoan et al. Adenovirus-mediated siRNA targeting Mcl-1 gene increases radiosensitivity of pancreatic carcinoma cells in vitro and in vivo
Kanwar et al. Vascular attack by 5, 6-dimethylxanthenone-4-acetic acid combined with B7. 1 (CD80)-mediated immunotherapy overcomes immune resistance and leads to the eradication of large tumors and multiple tumor foci
Bixel et al. Targeting STAT3 by HO3867 induces apoptosis in ovarian clear cell carcinoma
Li et al. Overexpression and involvement of special AT‐rich sequence binding protein 1 in multidrug resistance in human breast carcinoma cells
Wang et al. Downregulation of miR-222-3p reverses doxorubicin-resistance in LoVo cells through upregulating forkhead box protein P2 (FOXP2) protein
Song et al. Mechanosensitive channel Piezo1 induces cell apoptosis in pancreatic cancer by ultrasound with microbubbles
Cao et al. Silencing of long noncoding RNA growth arrest–specific 5 alleviates neuronal cell apoptosis and inflammatory responses through sponging microRNA-93 to repress PTEN expression in spinal cord injury
Zhang et al. Long noncoding RNA Gas5 induces cell apoptosis and inhibits tumor growth via activating the CHOP‐dependent endoplasmic reticulum stress pathway in human hepatoblastoma HepG2 cells
Zhang et al. Cathepsin B contributes to radioresistance by enhancing homologous recombination in glioblastoma
Xu et al. Inhibition of autophagy enhances the cytotoxic effect of PA-MSHA in breast cancer
Syed et al. Progesterone induces apoptosis in TRAIL‐resistant ovarian cancer cells by circumventing c‐FLIPL overexpression
Xing et al. CD9 knockdown suppresses cell proliferation, adhesion, migration and invasion, while promoting apoptosis and the efficacy of chemotherapeutic drugs and imatinib in Ph+ ALL SUP‑B15 cells
Kim et al. The C-terminal region of Bfl-1 sensitizes non-small cell lung cancer to gemcitabine-induced apoptosis by suppressing NF-κB activity and down-regulating Bfl-1

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant