JP2012501169A - がん関連遺伝子lgn/gpsm2 - Google Patents
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Abstract
本発明は、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルの決定を含む、がんを検出および診断するための方法を提供する。さらに、本発明は、がんの治療または予防において有用な治療剤をスクリーニングする方法、および乳がんを治療するための方法を提供する。さらに、本発明は、がんの治療または予防において有用な、LGN/GPSM2遺伝子を標的化するsiRNAを提供する。
Description
本出願は、開示全体が参照により本明細書に組み入れられる2008年8月27日付で出願された米国特許仮出願第61/190,395号の恩典を主張する。
本発明は、がんを検出および診断するための方法、ならびにがんを治療および予防するための方法に関する。
乳がんは、女性において最も一般的ながんであり、2002年の世界的規模での新規症例は115万例と推定されている(非特許文献1:Parkin DM et al., 2005 CA Cancer J Clin 55:74-108)。乳がんの発生率は大多数の国で増えており、その増加率は、これまで発生率が低かった国で大幅に高い(非特許文献1:Parkin DM et al., 2005 CA Cancer J Clin 55:74-108)。乳房エックス線撮影による早期検出、ならびにタモキシフェンおよびトラスツズマブなどの分子標的薬の開発によって、死亡率は低下し、患者の生活の質は改善されている(非特許文献2:Navolanic and McCubrey, Int J Oncol. 2005 27:1341-1344, 非特許文献3:Bange et al., 2001 Nat Med. 7:548-552)。しかし、進行期の患者、特にホルモン非依存性の腫瘍を有する患者は依然として、非常に限られた治療の選択肢しか利用することができない。故に、そのような患者により良い管理を提供するための新規薬物の開発が依然として必要である。
cDNAマイクロアレイ分析により得られる遺伝子発現プロファイルは、個々のがんの詳細な特徴付けを提供しており、このような情報は新規薬物の開発および個別化治療の基礎の提供を通じ、個々の患者にさらに適した臨床戦略を選択するのに寄与すると考えられる(非特許文献4:Petricoin et al., Nat Genet. 2002 32 Suppl:474-479)。ゲノム規模での発現分析を通じて、本発明者らは、乳がん(非特許文献5:Park JH et al., Cancer Res. 2006 66:9186-9195, 非特許文献6:Shimo et al., Cancer Sci. 2007 98:174-181, 非特許文献7:Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007 9, R17)、滑膜肉腫(非特許文献8:Nagayama S, et al. (2004) Oncogene 23:5551-5557., 非特許文献9:Nagayama S, et al. (2005) Oncogene 24:6201-6212.)、および腎細胞がん(非特許文献10:Togashi et al., Cancer Res. 2005 65:4817-4826, 非特許文献11:Hirota et al., Int J Oncol. 2006 29:799-827)の発生および/または進行の一因となるがん遺伝子として機能するいくつかの遺伝子を単離した。そのような分子は、新しい治療法の開発のための標的候補であると考えられる。
乳がん治療のための新規の分子標的を同定する試みにおいて、本発明者らは、以前、レーザーマイクロビームマイクロダイセクションにより精製された乳がん細胞の詳細な遺伝子発現プロファイルを、cDNAマイクロアレイを用いて分析した(非特許文献12:Nishidate et al., Int J Oncol. 2004 25:797-819)。本発明は、酵母ツーハイブリッドシステムによりヘテロ三量体GTP−結合タンパク質のα−サブユニットGi2と相互作用するタンパク質として以前に単離された(非特許文献13:Mochizuki et al., Gene.1996 181:39-43)LGN/GPSM2(Leu−Gly−Asn反復に富むタンパク質/G−タンパク質シグナル伝達調節因子2)遺伝子の、乳がんにおける病態生理学的役割の解明に部分的に基づく。
Parkin DM et al., 2005 CA Cancer J Clin 55:74-108
Navolanic and McCubrey, Int J Oncol. 2005 27:1341-1344
Bange et al., 2001 Nat Med. 7:548-552
Petricoin et al., Nat Genet. 2002 32 Suppl:474-479
Park JH et al., Cancer Res. 2006 66:9186-9195
Shimo et al., Cancer Sci. 2007 98:174-181
Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007 9, R17
Nagayama S, et al. (2004) Oncogene 23:5551-5557
Nagayama S, et al. (2005) Oncogene 24:6201-6212
Togashi et al., Cancer Res. 2005 65:4817-4826
Hirota et al., Int J Oncol. 2006 29:799-827
Nishidate et al., Int J Oncol. 2004 25:797-819
Mochizuki et al., Gene.1996 181:39-43
本発明は、がん細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子の特異的発現パターンの発見に部分的に基づいている。
本発明を通じて、LGN/GPSM2遺伝子が、ヒト腫瘍、より具体的には乳がんにおいて、頻繁に上方制御されていることが明らかにされた。さらに、低分子干渉RNA(siRNA)によるLGN/GPSM2遺伝子の抑制が、がん細胞の増殖抑制および/または細胞死をもたらすことから、この遺伝子はヒトのがんに対する治療標的として役立つ。
本明細書において同定されるLGN/GPSM2遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、がんに対するマーカーとして、およびがん遺伝子標的として診断に有用であり、乳がんの諸症状を治療または緩和するために、これらの発現および/または活性を変化させることができる。同様に、ある化合物に起因するLGN/GPSM2遺伝子発現の変化を検出することによって、がんを治療または予防するための作用物質として様々な化合物を同定することもできる。
したがって本発明は、対象由来の生物試料、例えば組織試料におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象におけるがんに対する素因を診断または決定するための方法を提供する。生物試料の組織または細胞中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルが正常対照の組織または細胞中のLGN/GPSM2の発現レベルと比較して上昇している場合、その対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することが示唆される。正常対照レベルは、非がん組織、例えば正常乳房組織、から得た正常細胞を用いて決定することができる。
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを意味し、かつ正常対照レベルおよびがん対照レベルの両方を含む。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンまたは複数の発現パターンから算出された平均値でよい。または、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースでよい。「正常対照レベル」とは、正常な健常個体において、またはがんに罹患していないことが公知である個体集団において検出されるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを意味する。正常な個体とは、がんの臨床症状が無い個体である。「正常対照レベル」はまた、乳がんに罹患していないことが分かっている個体または集団の正常な健常組織または健常細胞において検出されるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルでもよい。一方、「がん対照レベル」とは、乳がんに罹患している個体または集団のがん組織またはがん細胞において検出されるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを意味する。
試料中で検出されるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、(その試料を得た)対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することが示唆される。
または、試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを、LGN/GPSM2遺伝子のがん対照レベルと比較することもできる。ある試料の発現レベルとがん対照レベルが類似している場合、(その試料を得た)対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することが示唆される。
本明細書において、例えば正常対照レベルと比較して、試験試料中で10%、25%、もしくは50%、または少なくとも0.1倍、少なくとも0.2倍、少なくとも0.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、もしくは少なくとも10倍、もしくはそれ以上、遺伝子発現が増加している場合、遺伝子発現レベルは「上昇している」とみなされる。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、限定されないが、例えば試料中の遺伝子転写物に対する核酸プローブのハイブリダイゼーション強度の検出、および/または試料中の遺伝子転写物の定量的増幅を含む、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。
本発明の文脈において、対象由来の組織試料は、試験対象、例えば乳がんを有することが公知であるか、または乳がんを有すると推測される患者から得られる任意の乳房組織でよい。例えば、組織は乳房上皮細胞を含んでよい。より具体的には、組織は乳がん上皮細胞でよい。
本発明はさらに、LGN/GPSM2ポリペプチド、LGN/GPSM2ポリヌクレオチド、その転写調節領域、またはLGN/GPSM2を発現する細胞を用いてがんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する少なくとも一つの検出試薬を含むキットを提供する。
本発明は、LGN/GPSM2遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防するための方法を含む。
本発明はさらに、LGN/GPSM2遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む、がんを治療または予防するための組成物を提供する。
本発明はさらに、LGN/GPSM2遺伝子の発現のみならずがん細胞の成長も阻害する、LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
当業者は、本発明の一つまたは複数の局面が特定の目的を満たすことができる一方、一つまたは複数の他の局面が他の特定の目的を満たすことができることを理解するであろう。各目的は、全ての点が、等しく本発明のすべての局面に当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の一つの局面に関して択一的に考慮することができる。本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読めば、さらに十分に明らかになるであろう。しかし、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
態様の説明
本明細書において説明した方法および材料と同様のまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の態様の実践または試験に使用されうるが、好ましい方法、装置および材料をこれから説明する。しかし、本材料および方法を説明する前に、本発明が本明細書において説明した特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコルなどに限定されないことを理解されたい。なぜなら、これらは規定どおりの実験および最適化に従って変更されうるからである。また、この説明で使用される専門用語は単に特定のバージョンまたは態様を説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲でのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されていないことも理解されたい。
本明細書において説明した方法および材料と同様のまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の態様の実践または試験に使用されうるが、好ましい方法、装置および材料をこれから説明する。しかし、本材料および方法を説明する前に、本発明が本明細書において説明した特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコルなどに限定されないことを理解されたい。なぜなら、これらは規定どおりの実験および最適化に従って変更されうるからである。また、この説明で使用される専門用語は単に特定のバージョンまたは態様を説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲でのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されていないことも理解されたい。
本明細書に記載した各刊行物、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に明確に組み入れられる。しかし、本明細書のいかなる内容も、先行発明によって、そのような開示に本発明が先行しないとの承認と解釈されるものではない。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。
定義
本明細書において使用される単語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、別段の具体的な指示が無い限り、「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書において使用される単語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、別段の具体的な指示が無い限り、「少なくとも1つ」を意味する。
ある物質(例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど)に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然の供給源においてそれ以外に含まれ得る少なくとも1種類の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体とは、タンパク質(抗体)が由来する細胞もしくは組織供給源由来の糖質、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を意味する。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、そこからポリペプチドが単離されるかまたは組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、(乾燥重量で)約30%未満、約20%未満、約10%未満、または約5%未満の異種タンパク質(本明細書においては「混入タンパク質」とも呼ばれる)を有するポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えによって作製される場合も同様に、好ましくは培地を実質的に含まず、培地がタンパク質調製物の体積の約20%未満、約10%未満、または約5%未満であるポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、好ましくは化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質が、タンパク質調製物の体積の(乾燥重量で)約30%未満、約20%未満、約10%未満、または約5%未満であるポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離または精製されたポリペプチドを含むことは、例えばそのタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色などに続く、単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明の抗体およびポリペプチドは、単離または精製される。cDNA分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、1つもしくは複数のアミノ酸残基が、修飾残基または対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体などの非天然の残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに細胞において翻訳後に修飾されたもの(例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリン)である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造(α炭素が、水素、カルボキシ基、アミノ基、およびR基に結合されている)を有するが、修飾されたR基または修飾された主鎖を有する化合物を意味する(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、通常のアミノ酸と同様の機能を有する化学化合物を意味する。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB生化学命名法委員会により推奨される、一般に公知の三文字記号または一文字記号によって示され得る。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、別段の具体的な指示が無い限り、交換可能に使用され、かつアミノ酸と同様に、一般に認められている一文字表記によって示される。アミノ酸と同様に、これらは、天然の核酸ポリマーおよび非天然の核酸ポリマーの双方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、DNA、RNA、またはその組合せから構成されてよい。
本明細書において使用される場合、「二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば、低分子干渉RNA(siRNA;例えば、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピン型RNA(shRNA))および低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA;例えば、DNAおよびRNAの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAおよびRNAの低分子ヘアピン型キメラ(shD/R−NA))が含まれる。
本明細書において使用される場合、「dsRNA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、かつ相補的配列を介して共にアニールして二本鎖RNA分子を形成した、2つのRNA分子の構築物を意味する。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列より選択される「センス」RNAまたは「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域より選択されるヌクレオチド配列を有するRNA分子も含んでよい。
「shRNA」という用語は、本明細書において使用される場合、互いに相補的な第1の領域および第2の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するsiRNAを意味する。これらの領域の相補性の程度および向きは、塩基対合がそれらの領域の間で生じるのに十分であり、第1の領域および第2の領域はループ領域によって連結され、このループは、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)の間で塩基対合が無いことに起因する。shRNAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも呼ばれ得る。
本明細書において使用される場合、「siD/R−NA」という用語は、RNAおよびDNAの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、RNAおよびDNAのハイブリッドおよびキメラを含み、標的mRNAの翻訳を妨げる。本明細書において、ハイブリッドとは、DNAから構成されるポリヌクレオチドおよびRNAから構成されるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成している分子を示すのに対し、キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がRNAおよびDNAを含み得ることを示す。細胞中にsiD/R−NAを導入する標準的技術が使用される。siD/R−NAは、センス核酸配列(「センス鎖」とも呼ばれる)、アンチセンス核酸配列(「アンチセンス鎖」とも呼ばれる)、または両方を含む。siD/R−NAは、単一の転写物が標的遺伝子に由来するセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように、例えばヘアピン型で構築され得る。siD/R−NAは、dsD/R−NAまたはshD/R−NAのいずれかでよい。
本明細書において使用される場合、「dsD/R−NA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、かつ相補的配列を介して共にアニールして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成した、2つの分子の構築物を意味する。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列より選択される「センス」ポリヌクレオチド配列または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含んでよい。dsD/R−NAを構築する2つの分子のうち一方または両方が、RNAおよびDNAの両方から構成されるか(キメラ分子)、あるいは、これらの分子のうち一方がRNAから構成され、他方がDNAから構成される(ハイブリッド二本鎖)。
「shD/R−NA」という用語は、本明細書において使用される場合、互いに相補的な第1の領域および第2の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するsiD/R−NAを意味する。これらの領域の相補性の程度および向きは、塩基対合がそれらの領域の間で生じるのに十分であり、第1の領域および第2の領域はループ領域によって連結され、このループは、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)の間で塩基対合が無いことに起因する。shD/R−NAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも呼ばれ得る。
I.ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、がん細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現上昇の発見に部分的に基づく。この遺伝子の発現は臨床がん組織において特に上昇していることが発見された。
本発明は、がん細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現上昇の発見に部分的に基づく。この遺伝子の発現は臨床がん組織において特に上昇していることが発見された。
本発明に対して列挙される遺伝子のヌクレオチド配列およびポリペプチドのアミノ酸配列は、当業者に公知であり、例えば、GenBank(商標)などのウェブサイト上の遺伝子データベースから得られる。
例えば、ヒトLGN/GPSM2遺伝子の例示的なヌクレオチド配列がSEQ ID NO:39(変異体1)、SEQ ID NO:41(変異体2)、およびSEQ ID NO:52に示されており、これらの配列はそれぞれ、GenBankアクセッション番号AB445462、NM_013296、およびU54999としても入手可能である。変異体はどちらも、同じアミノ酸配列(SEQ ID NO:40)をコードする同じORF(変異体のどちらにおいても第1位〜第2586位)を共有している。本明細書において、SEQ ID NO:39に示されるヌクレオチド配列は新規の配列である。ヒトTRIOBP/Tara(TRIOおよびF−アクチン結合タンパク質)遺伝子の例示的なヌクレオチド配列がSEQ ID NO:42に示されており、この配列はGenBankアクセッション番号NM_001039141としても入手可能である。ヒトPBK/TOPK(PDZ結合キナーゼ)遺伝子の例示的なヌクレオチド配列がSEQ ID NO:44に示されており、この配列はGenBankアクセッション番号AF237709としても入手可能である。本明細書において、LGN/GPSM2、TRIOBP/Tara、またはPBK/TOPK遺伝子は、ヒト遺伝子、ならびに限定されないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシを含む他の動物の遺伝子相同体を包含し、対立遺伝子変異体および個々の遺伝子に対応する他の動物中に存在する遺伝子を含む。いくつかの態様において、それらのLGN/GPSM2遺伝子は、当技術分野において公知の配列比較アルゴリズム、例えば、BLASTまたはALIGNを、初期設定にセットして用いて測定した場合に、SEQ ID NO:39、41、または52のヒトLGN/GPSM2遺伝子と少なくとも約90%、93%、95%、97%、99%の配列同一性を共有している。同様に、TRIOBP/Tara、PBK/TOPKはそれぞれ、SEQ ID NO:42および44のヌクレオチド配列と少なくとも約90%、93%、95%、97%、99%の配列同一性を共有している。
ヒトLGN/GPSM2遺伝子によりコードされる例示的なアミノ酸配列がSEQ ID NO:40または53(Genbankアクセッション番号AAB40385)に示されている。ヒトTRIOBP/Tar遺伝子によりコードされる例示的なアミノ酸配列がSEQ ID NO:43に示されている。ヒトPBK/TOPK遺伝子によりコードされる例示的なアミノ酸配列がSEQ ID NO:45に示されている。
本発明において、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるポリペプチドは、「LGN/GPSM2」と呼ばれ、「LGN/GPSM2ポリペプチド」または「LGN/GPSM2タンパク質」と呼ばれることもある。他のペプチドもまた、同様に呼ばれる。
本発明のある局面によれば、機能的等価物もまた、LGN/GPSM2、TRIOBP/Tara、またはPBK/TOPKポリペプチドに含まれる。本明細書において、あるタンパク質の「機能的等価物」は、そのタンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、元のタンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的等価物として使用してもよい。
このような機能的等価物には、1つまたは複数のアミノ酸が、元のタンパク質の天然のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加、または挿入されているものが含まれる。または、当該ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約80%、約90%、約93%、約95%、約97%、または約99%の相同性(配列同一性とも呼ばれる)を有するアミノ酸配列を含むものでもよい。他の態様において、当該ポリペプチドはストリンジェントな条件下で、LGN/GPSM2、TRIOBP/Tara、またはPBK/TOPK遺伝子の天然のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、pHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは50%のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。以下のような例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が可能である:50%ホルムアミド、5xSSC、および1%SDS、42℃でインキュベーション、または5xSSC、1%SDS、65℃でインキュベーションし、0.2xSSCおよび0.1%SDS中、50℃で洗浄。
一般に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、そのタンパク質の機能に影響しないことが公知である。当業者は、単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、または置換は、タンパク質の変更が同様の機能を有するタンパク質をもたらす「保存的改変」であることを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、以下の8つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む。
(1)アラニン(A)、グリシン(G);
(2)アスパラギン酸(d)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7)セリン(S)、トレオニン(T);および
(8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton,Proteins 1984を参照されたい)。
(1)アラニン(A)、グリシン(G);
(2)アスパラギン酸(d)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7)セリン(S)、トレオニン(T);および
(8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton,Proteins 1984を参照されたい)。
このような保存的に改変されたポリペプチドは、本発明のポリペプチド(例えば、LGN/GPSM2、TRIOBP/Tara、またはPBK/TOPKポリペプチド)に含まれる。しかしながら、本発明はそれらに制限されず、元のタンパク質の少なくとも1種類の生物活性を保持している限り、前記ポリペプチドは非保存的改変を含む。さらに改変タンパク質は、多形変異体、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
さらに、本発明のLGN/GPSM2遺伝子は、LGN/GPSM2タンパク質のこのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。同様に、TRIOBP/TaraおよびPBK/TOPK遺伝子は、それぞれ、TRIOBP/TaraおよびPBK/TOPKタンパク質のこのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。
II.がんの診断
II−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法
LGN/GPSM2遺伝子の発現は、がん患者において特異的に増大していることが判明した。したがって、本明細書において同定される遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、がんのマーカーとして診断に有用であり、かつ細胞試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現を測定することによって、がんを診断することができる。
II−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法
LGN/GPSM2遺伝子の発現は、がん患者において特異的に増大していることが判明した。したがって、本明細書において同定される遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、がんのマーカーとして診断に有用であり、かつ細胞試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現を測定することによって、がんを診断することができる。
具体的に本発明は、対象におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象におけるがんまたはがんを発症する素因を診断するための方法を提供する。いくつかの態様において、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは対象由来の乳房組織において決定される。
あるいは、本発明は、対象由来の乳房組織試料におけるがん細胞を検出するための方法であって、対象由来の乳房組織試料におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比べて該発現レベルの増加が組織におけるがん細胞の存在または疑いを示唆する、該方法を提供する。
そのような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が当該疾患に罹患しているかを医師、看護師、または他の従事者が診断するのを援助することができる。あるいは、本発明は、対象が当該疾患に罹患しているかを診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。例えば、本発明によれば、対象から得られた組織におけるがん細胞の存在の疑いまたは疑念が示唆される場合、医師はこの観察、および組織の病理所見、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、または対象の臨床経過などを含む別の局面を考慮して臨床的判断を下すであろう。乳がんの診断のためのいくつかの血液腫瘍マーカーの使用が周知である。例えば、糖鎖抗原125(CA125)、糖鎖抗原15−3(CA15−3)、またはがん胎児性抗原(CEA)は、乳がんに関して公知の血液腫瘍マーカーである。本発明によれば、患者におけるLGN/GPSM2タンパク質のレベルを測定することによって対象の状態を検査するための中間結果を提供することもできる。
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法であって、対象由来の生物試料におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現をがんの診断マーカーとして検出する段階を含む、該方法を提供する。本方法によって診断される好ましいがんは、乳がんを含む。
本発明の文脈において、「診断する」という用語は、予測および尤度解析を包含することが意図される。本発明の方法は、治療的介入、病期などの診断基準、ならびに疾患のモニタリングおよびがんのサーベイランスを含む治療様式に関する決断を下す際に臨床的に使用することを意図する。本発明によれば、対象の病態を検査するための中間結果もまた、提供され得る。このような中間結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患しているかを医師、看護師、または他の従事者が診断するのを援助することができる。あるいは、本発明を用いて、対象に由来する組織中のがん細胞を検出し、かつ、対象が疾患に罹患しているかを診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
本発明によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシが含まれるが、これらに限定されない。
診断しようとする対象由来の生物試料を採取して、診断を実施することが好ましい。LGN/GPSM2遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、判定のための生物試料として使用することができる。生物試料には、体組織、ならびに血液、血漿、血清、唾液、痰、および尿などの体液が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、生物試料は、上皮細胞、より好ましくは乳がん上皮細胞、またはがんであると疑われる組織由来の乳房上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要または所望の場合には、得られた体組織および体液から細胞を精製し、その後生物試料として使用してもよい。
本発明によれば、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、対象由来の生物試料において決定される。発現レベルは、当技術分野において公知の任意の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルで決定することができる。例えば、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAは、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)により、プローブを用いて、または定量的核酸増幅技術を用いて、定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。アレイの使用は、本発明のLGN/GPSM2遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば、様々ながん特異的遺伝子)の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、LGN/GPSM2遺伝子(例えば、SEQ ID NO:39;GenBankアクセッション番号AB445462、またはSEQ ID NO:41;GenBankアクセッション番号NM 013296)の配列情報を用いてこのようなプローブを調製することができる。例えば、LGN/GPSM2遺伝子または断片のcDNAを、Hs.659320(SEQ ID NO:38;GenBankアクセッション番号AK000053.1)などのプローブとして使用してもよい。必要または所望の場合には、プローブは、色素および同位元素などの適した標識で標識してもよく、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。
さらに、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物は、増幅に基づく検出方法(例えばRT−PCR)により、プライマーを用いて定量することができる。このようなプライマーもまた、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、実施例において使用されるプライマー(SEQ ID NO:3および4)は、RT−PCRによる検出のために使用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
具体的には、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件下で、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAにハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的配列に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは50%のプローブが平衡状態で占有されている。典型的には、ストリンジェントな条件はpH7.0〜pH8.3で、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01M〜1.0Mのナトリウムイオン(もしくは他の塩)であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば10〜50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約60℃である条件であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。
または、翻訳産物が本発明の診断のために検出され得る。例えば、LGN/GPSM2タンパク質の量を決定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を決定するための方法には、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fvなど)も、その断片がLGN/GPSM2タンパク質への結合能力を保持している限り、検出のために使用してもよい。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり(例えば実施例1を参照されたい)、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、染色の強度を、LGN/GPSM2タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析を介して観察してもよい。すなわち、強い染色が観察された場合、当該タンパク質の存在の増加、および同時にLGN/GPSM2遺伝子の高い発現レベルが示唆される。
さらに、翻訳産物は、その生物活性に基づいて検出することもできる。キナーゼ活性またはLGN/GPSM2タンパク質のがん細胞増殖促進能力は、生物試料中に存在するLGN/GPSM2タンパク質の指標として使用され得る。
さらに、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えば乳がんにおいて差次的に発現されることが公知である遺伝子の発現レベルも決定して、診断の精度を向上させることができる。
生物試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、LGN/GPSM2遺伝子の正常対照レベルから、例えば10%、25%、もしくは50%上昇する;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合、上昇しているとみなすことができる。
対照レベルは、疾患の状態(がん性または非がん性)が公知である対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物試料と同時に決定することができる。または、疾患の状態が公知である対象由来の試料中のLGN/GPSM2遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られる結果に基づき、統計学的方法によって、対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、予め検証された細胞由来の発現パターンのデータベースでもよい。さらに、本発明のある局面によれば、生物試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物試料、例えば乳房上皮組織の組織型と同様の組織型由来の参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患の状態が公知である集団におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知である任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±2S.D.または平均値±3S.D.の範囲を、標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、がん性ではないことが公知である生物試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方では、対照レベルががん性の生物試料から決定される場合、これは「がん性対照レベル」と呼ばれる。
LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルが、正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと同様である場合、その対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料とがん性参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することを示唆する。
試験生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の差異は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化することができる。ハウスキーピング遺伝子の発現レベルは、細胞のがん性状態または非がん性状態によって異ならないことが公知である。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されない。
II−2.がん治療の有効性の評価
正常細胞とがん性細胞との間のLGN/GPSM2遺伝子の差次的発現により、がんの治療の経過をモニターすることもまた可能となり、かつがんを診断するための前述の方法は、がん治療の有効性の評価に適用することができる。具体的には、がん治療の有効性は、治療を受けている対象由来の細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定することによって評価することができる。必要に応じて、試験細胞集団は、様々な時点、治療前、治療中、および/または治療後に対象から採取される。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、例えば「I−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。本発明の文脈において、検出された発現レベルと比較される対照レベルは、関心対象の治療に曝露されていない細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子発現から決定されることが好ましい。
正常細胞とがん性細胞との間のLGN/GPSM2遺伝子の差次的発現により、がんの治療の経過をモニターすることもまた可能となり、かつがんを診断するための前述の方法は、がん治療の有効性の評価に適用することができる。具体的には、がん治療の有効性は、治療を受けている対象由来の細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定することによって評価することができる。必要に応じて、試験細胞集団は、様々な時点、治療前、治療中、および/または治療後に対象から採取される。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、例えば「I−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。本発明の文脈において、検出された発現レベルと比較される対照レベルは、関心対象の治療に曝露されていない細胞におけるLGN/GPSM2遺伝子発現から決定されることが好ましい。
LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを、正常細胞またはがん細胞を含まない細胞集団から決定される対照レベルと比較する場合、発現レベルの類似は、関心対象の治療が有効であることを示唆し、発現レベルの上昇は、その治療の臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。他方では、がん細胞またはがん細胞を含む細胞集団から決定される対照レベルに対して比較が実施される場合、発現レベルの低下が有効な治療を示唆するのに対し、発現レベルの類似は、臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。
さらに、治療前および治療後のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを、本発明の方法に従って比較して、治療の有効性を評価することもできる。具体的には、治療後の対象由来の生物試料において検出される発現レベル(すなわち、治療後レベル)が、同じ対象から治療開始前に採取された生物試料において検出される発現レベル(すなわち、治療前レベル)と比較される。治療前レベルと比較して治療後レベルが低下している場合、関心対象の治療が有効であることが示唆されるのに対し、治療前レベルと比較して治療後レベルが上昇しているか、または同様である場合、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。
本明細書において使用される場合、「有効な」という用語は、治療が、病的に上方制御されている遺伝子の発現の減少、病的に下方制御されている遺伝子の発現の増大、または対象におけるがん腫のサイズ、罹患率、もしくは転移能の低減をもたらすことを示す。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、治療が腫瘍の形成を遅延もしくは予防するか、またはがんの少なくとも1種類の臨床症状を遅延、予防、もしくは緩和することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床的プロトコールを用いて実施することができる。
さらに、治療の有効性は、がんを診断するための任意の公知の方法に関連して決定することもできる。がんは、例えば徴候となる異常、例えば体重減少、腹痛、背痛、食欲低下、悪心、嘔吐、ならびに全身倦怠感、虚弱、および黄疸を同定することによって診断することができる。がんはまた、組織構造の病理学的評価によっても診断することができる。
II−3.がんを有する対象の予後の評価
前述したがんを診断するための方法は、対象のがんの予後を評価するのに使用することもできる。したがって、本発明は、乳がんを有する対象の予後を評価するための方法も提供する。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、例えば「II−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。例えば、様々な病期の患者由来の生物試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを、対象において検出される当該遺伝子の発現レベルと比較するための対照レベルとして使用することができる。対象におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルと対照レベルを比較することによって、対象の予後を評価することができる。または、対象における発現レベルのパターンを経時的に比較することによって、対象の予後を評価することができる。
前述したがんを診断するための方法は、対象のがんの予後を評価するのに使用することもできる。したがって、本発明は、乳がんを有する対象の予後を評価するための方法も提供する。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、例えば「II−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。例えば、様々な病期の患者由来の生物試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを、対象において検出される当該遺伝子の発現レベルと比較するための対照レベルとして使用することができる。対象におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルと対照レベルを比較することによって、対象の予後を評価することができる。または、対象における発現レベルのパターンを経時的に比較することによって、対象の予後を評価することができる。
例えば、対象におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、予後があまり好ましくないことが示唆される。逆に、発現レベルが正常対照レベルと比較して類似している場合は、対象の予後がより好ましいことが示唆される。
III.キット
本発明はまた、がんを検出するための試薬、すなわち、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出するのに有用な試薬を提供する。そのような試薬の例としては、対象由来の生物試料において、
(a)LGN/GPSM2遺伝子のmRNAを検出することができるもの;
(b)LGN/GPSM2タンパク質を検出することができるもの;および/または
(c)LGN/GPSM2タンパク質の生物活性を検出することができるもの
が挙げられる。
本発明はまた、がんを検出するための試薬、すなわち、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出するのに有用な試薬を提供する。そのような試薬の例としては、対象由来の生物試料において、
(a)LGN/GPSM2遺伝子のmRNAを検出することができるもの;
(b)LGN/GPSM2タンパク質を検出することができるもの;および/または
(c)LGN/GPSM2タンパク質の生物活性を検出することができるもの
が挙げられる。
好適な試薬には、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物に特異的に結合するか、またはそれを同定する核酸が含まれる。例えば、LGN/GPSM2遺伝子の転写産物に特異的に結合するかまたはそれを同定する核酸は非限定的に、LGN/GPSM2遺伝子転写産物の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド(例えば、プローブおよびプライマー)を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは関心対象の遺伝子のmRNAに特異的なプライマーおよびプローブによって例示され、当技術分野において周知の方法に基づき調製することができる。あるいは、遺伝子の翻訳産物を検出するための例示的な試薬は抗体である。「I−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述したプローブ、プライマー、および抗体は、このような試薬の好適な例である。
生物活性に基づきLGN/GPSM2翻訳産物を検出することもできる。本発明は、乳がん細胞においてLGN/GPSM2がTRIOBP/teraまたはPBK/TOPKと相互作用することを同定する。さらに、PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化についても記述する。LGN/GPSM2翻訳産物の生物活性を検出するために当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。
本キットには乳がんの検出の用途がある。
これらの試薬をがんの上記診断に使用することができる。これらの試薬を使用するための例示的なアッセイ形式には、ノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAが含まれ、このどちらも当技術分野において周知である。
検出試薬はキットの形態で一緒に包装されてもよい。例えば、検出試薬は個別の容器に包装されてもよい。さらに、検出試薬は検出に必要な他の試薬とともに包装されてもよい。例えば、キットは、検出試薬としての核酸もしくは抗体(例えば、固体マトリックスに結合されるか、もしくはマトリックスにそれらを結合するための試薬とともにマトリックスとは別々に包装されるかのいずれかである)、対照試薬(陽性および/もしくは陰性)、および/または検出可能な標識を含むことができる。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器を含む、商業上および利用者の観点から望ましい他の材料を含むこともできる。これらの試薬などを標識とともに容器内に保持することができる。好適な容器にはボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。本アッセイ法を行うための説明書(例えば、文書、聴覚または視覚による説明書、例えば、印刷物、テープ記録、VCR、DVD、CD−ROMなど)がキットに含まれてもよい。
本キットは乳がんの検出および診断に適しているが、がんの予後の評価および/またはがん治療の有効性のモニタリングにも有用でありうる。
本発明のある局面として、がんを検出するための試薬を、例えば、多孔質ストリップまたはアレイなどの固体マトリックス上に固定して、がんを検出するための少なくとも1つの部位を形成することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが検出試薬(例えば核酸)を含む複数の部位を含んでよい。テストストリップは、陰性対照および/または陽性対照用の部位も含んでよい。または、対照部位は、テストストリップとは別のストリップ上に配置されてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定された検出試薬(例えば核酸)を含んでもよい。すなわち、第一の検出部位はより多くの量を含み、次の部位はより少ない量を含んでもよい。試験生物試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示している部位の数が、試料中のLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルの定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で形成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
IV.スクリーニング方法
LGN/GPSM2遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、この遺伝子の発現またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変更する作用物質をスクリーニングすることが可能である。このような作用物質は、がん、特に乳がんを治療または予防するための薬剤として使用され得る。したがって、本発明は、LGN/GPSM2遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
LGN/GPSM2遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、この遺伝子の発現またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変更する作用物質をスクリーニングすることが可能である。このような作用物質は、がん、特に乳がんを治療または予防するための薬剤として使用され得る。したがって、本発明は、LGN/GPSM2遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法によって単離される物質は、LGN/GPSM2遺伝子の発現またはこの遺伝子の翻訳産物の活性を阻害すると予想される物質であり、したがって、LGN/GPSM2の過剰発現に起因する疾患を治療または予防するための候補である。このような作用物質は、LGN/GPSM2の過剰発現に関連するがんの治療または予防に特に適していると予想される。すなわち、本発明の方法によってスクリーニングされる物質は、臨床的な利益を有するとみなされ、さらに動物モデルまたは試験用対象においてがん細胞増殖を防止する能力について試験することができる。本願のスクリーニング方法によって得られる物質または化合物は、LGN/GPSM2が過剰発現している任意のがんに適用し得るが、適切ながんは乳がんである。
本発明の文脈において、本発明のスクリーニング方法によって同定される物質は、任意の化合物、またはいくつかの化合物を含む組成物でよい。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の化合物、または化合物の組み合わせでよい。化合物の組み合わせがこれらの方法において使用される場合、これらの化合物は、逐次的にまたは同時に接触させてよい。
任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物(アンチセンスRNA、siRNA、リボザイムなどの核酸構築物を含む)、および天然化合物を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験物質はまた、
(1)生物ライブラリー、
(2)空間的にアドレス可能な平行な固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、
(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、
(4)「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、および
(5)アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法
を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。
(1)生物ライブラリー、
(2)空間的にアドレス可能な平行な固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、
(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、
(4)「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、および
(5)アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法
を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。
アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されているが、他の4種のアプローチは、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12:145-67)。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13;Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91:11422-6;Zuckermann et al., J Med Chem 37:2678-85, 1994;Cho et al., Science 1993, 261:1303-5;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2059;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2061;Gallop et al., J Med Chem 1994, 37:1233-51)。化合物のライブラリーは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13:412-21を参照されたい)、またはビーズ上(Lam, Nature 1991, 354:82-4)、チップ上(Fodor, Nature 1993, 364:555-6)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号、および第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89:1865-9)、もしくはファージ上(Scott and Smith, Science 1990, 249:386-90;Devlin, Science 1990, 249:404-6;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:6378-82;Felici, J Mol Biol 1991, 222:301-10;米国特許出願第2002103360号)に提示され得る。
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる作用物質に含まれる。
さらに、スクリーニングされる試験物質がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードするDNAを得るために、そのタンパク質のアミノ酸配列全体を決定し、そのタンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られるタンパク質のアミノ酸配列の一部を解析し、その配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、かつそのプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングし、そのタンパク質をコードするDNAを得てもよい。得られるDNAは、がんを治療または予防するための候補である試験物質を調製する際に使用される。
IV−1.タンパク質に基づくスクリーニング方法
本発明により、LGN/GPSM2遺伝子の発現は、がん細胞、特に乳がん細胞の増殖および/または生存に関連していることが見出された。したがって、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるLGN/GPSM2ポリペプチドの機能を抑制する物質は、乳がん細胞の増殖および/または生存を阻害し、かつ乳がんを治療または予防する際に使用されると考えられた。したがって本発明は、LGN/GPSM2ポリペプチドを用いて乳がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明により、LGN/GPSM2遺伝子の発現は、がん細胞、特に乳がん細胞の増殖および/または生存に関連していることが見出された。したがって、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるLGN/GPSM2ポリペプチドの機能を抑制する物質は、乳がん細胞の増殖および/または生存を阻害し、かつ乳がんを治療または予防する際に使用されると考えられた。したがって本発明は、LGN/GPSM2ポリペプチドを用いて乳がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
LGN/GPSM2ポリペプチドに加え、このポリペプチドの断片も、それが天然のLGN/GPSM2ポリペプチドの少なくとも1種類の生物活性を保持している限り、本発明のスクリーニングのために使用され得る。
LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドおよび断片がその生物活性の少なくとも1種類を保持している限り、他の物質にさらに連結されてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾は、付加的な機能を与えるため、またはポリペプチドおよび断片を安定化させるために実施してもよい。
本発明の方法に使用されるLGN/GPSM2ポリペプチドまたは断片は、従来の精製方法を経て天然のタンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。例えば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成方法には、以下のものが含まれる:
(1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(2)The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976;
(3)ペプチド合成、丸善出版、1975年;
(4)ペプチド合成の基礎と実験、丸善出版、1985年;
(5)医薬品の開発 続 第14巻(ペプチド合成)、広川書店、1991年;
(6)WO 99/67288;ならびに
(7)Barany G. and Merrifield R.B., Peptides Vol.2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
(1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(2)The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976;
(3)ペプチド合成、丸善出版、1975年;
(4)ペプチド合成の基礎と実験、丸善出版、1985年;
(5)医薬品の開発 続 第14巻(ペプチド合成)、広川書店、1991年;
(6)WO 99/67288;ならびに
(7)Barany G. and Merrifield R.B., Peptides Vol.2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
または、LGN/GPSM2タンパク質は、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学方法を採用することによって、得ることもできる(例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132:349-51;Clark-CurtissおよびCurtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 編)1983, 101:347-62)。例えば最初に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で(例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に)含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、次いでその宿主細胞を培養して、そのタンパク質を産生させる。より具体的には、LGN/GPSM2ポリペプチドをコードする遺伝子を、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、またはpCD8など外来遺伝子を発現させるためのベクター中に挿入することによって、その遺伝子を宿主(例えば動物)細胞などにおいて発現させる。発現のために、プロモーターを使用してもよい。一般に使用される任意のプロモーターを使用してもよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby、Williamson(編), Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141)、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 1990, 91:217-23)、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 1991, 108:193)、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704)、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466)、CMV前初期プロモーター(Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9)、SV40後期プロモーター(Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94)、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946)、およびHSV TKプロモーターなどが含まれる。LGN/GPSM2遺伝子を発現させるための宿主細胞中へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26)、リン酸カルシウム法(Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52)、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17;Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3)、およびリポフェクチン法(Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37;Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30;Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4)などに従って実施することができる。
LGN/GPSM2タンパク質はまた、インビトロの翻訳システムを採用して、インビトロで産生してもよい。
試験物質と接触させるLGN/GPSM2ポリペプチドは、例えば精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合された融合タンパク質でよい。
IV−1−1.LGN/GPSM2ポリペプチドに結合する作用物質の同定
LGN/GPSM2タンパク質に結合する作用物質は、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現または当該タンパク質の生物活性を変更すると考えられる。したがって、ある局面として、本発明は、以下の段階を含む、乳がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する:
(a)試験物質を、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)前記ポリペプチドまたはその断片と試験物質との結合を検出する段階;および
(c)前記ポリペプチドに結合する試験物質を、乳がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階。
LGN/GPSM2タンパク質に結合する作用物質は、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現または当該タンパク質の生物活性を変更すると考えられる。したがって、ある局面として、本発明は、以下の段階を含む、乳がんを治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する:
(a)試験物質を、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階;
(b)前記ポリペプチドまたはその断片と試験物質との結合を検出する段階;および
(c)前記ポリペプチドに結合する試験物質を、乳がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階。
本発明では、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片の結合レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物がLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片に結合する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物がLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片に結合しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
本発明の一つの態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドと同等の生物活性を有するLGN/GPSM2ポリペプチドの断片を、本スクリーニング方法に使用することができる。好ましい態様において、例えば、以下の活性または特性をLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性として示すことができる:
細胞増殖の促進活性、
DNA合成増強活性、
TRIOBP/taraまたはPBK/TOPKとの結合活性、および
PBK/TOPKを介したリン酸化。
細胞増殖の促進活性、
DNA合成増強活性、
TRIOBP/taraまたはPBK/TOPKとの結合活性、および
PBK/TOPKを介したリン酸化。
すなわち、それらのうち少なくとも一つの活性を有するLGN/GPSM2ポリペプチドの断片を、機能的断片と呼ぶことができる。より好ましい態様において、そのような活性を有するLGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、活性を保持または維持するためにLGN/GPSM2ポリペプチドのTPR(テトラトリコペプチド反復配列)ドメインを含むことができる。具体的には、例えば、活性を保持または維持するために、TRPドメインは、以下からなる群より選択することができる:
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号62〜95、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号102〜135、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号202〜235、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号242〜275、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号282〜315、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号322〜355。
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号62〜95、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号102〜135、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号202〜235、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号242〜275、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号282〜315、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号322〜355。
同様に、別の態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、活性を保持または維持するためにLGN/GPSM2ポリペプチドのGoLocoドメインを含むこともできる。より好ましい態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、以下からなる群より選択されるGoLocoドメインの少なくとも一つを含むことができる:
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号489〜511、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号544〜566、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号594〜616、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号628〜650。
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号489〜511、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号544〜566、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号594〜616、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号628〜650。
別の態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、LGN/GPSM2ポリペプチドのTPRドメインの少なくとも一つおよびGoLocoドメインの少なくとも一つを含むこともできる。したがって、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、以下を含むことができる:
(a)
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号62〜95、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号102〜135、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号202〜235、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号242〜275、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号282〜315、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号322〜355
からなる群より選択されるTPRドメインの少なくとも一つ;ならびに
(b)
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号489〜511、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号544〜566、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号594〜616、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号628〜650
からなる群より選択されるGoLocoドメインの少なくとも一つ。
(a)
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号62〜95、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号102〜135、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号202〜235、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号242〜275、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号282〜315、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号322〜355
からなる群より選択されるTPRドメインの少なくとも一つ;ならびに
(b)
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号489〜511、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号544〜566、
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号594〜616、および
SEQ ID NO:40のアミノ酸残基番号628〜650
からなる群より選択されるGoLocoドメインの少なくとも一つ。
本発明において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片は、SEQ ID NO:53のアミノ配列(677アミノ酸残基)から選択される約600、500、400、300、200、100、50、または30未満の連続的な残基のアミノ酸配列からなることができる。例えば、好ましい断片は、活性を保持するのに必要とされるいずれか一つのドメインを含み、かつ長さが、SEQ ID NO:53のアミノ配列から選択される25〜200または25〜100の連続的な残基からなる。
さらに、好ましい態様において、機能的断片はさらに、LGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化部位の少なくとも一つを含むこともできる。例えば、LGN/GPSM2ポリペプチドはSEQ ID NO:53のアミノ酸配列中のSer401、Thr519、および/またはSer558でリン酸化されることが明らかになった。したがって、機能的断片において、SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558から選択される位置に対応する少なくとも一つのアミノ酸残基は、LGN/GPSM2ポリペプチドの活性を保持または維持するために保存されうる。
あるいは、これらのリン酸化部位はSEQ ID NO:40のアミノ酸配列中のSer408、Thr526、および/またはSer565に対応する。したがって、機能的断片において、SEQ ID NO:40のSer408、Thr526、および/またはSer565から選択される位置に対応する少なくとも一つのアミノ酸残基は、LGN/GPSM2ポリペプチドの活性を保持または維持するために保存されうる。
治療効果には以下の効果のいずれかが含まれる:例えば、がん性乳房細胞の成長の阻害、乳房腫瘍の退縮または退行、乳がんの寛解の誘導および発生の抑制。乳がんを効果的に治療することで、乳がんを有する個体の、死亡率が低減されかつ予後が改善され、血液中の腫瘍マーカーのレベルが低減され、および乳がんに付随する検出可能な症状が軽減される。
LGN/GPSM2ポリペプチドへの試験物質の結合は、例えばLGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体を使用する免疫沈降法によって検出することができる。したがって、このような検出の目的で、スクリーニングのために使用されるLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片は、抗体認識部位を含むことが好ましい。スクリーニングのために使用される抗体は、調製方法が当技術分野において周知である、本発明のLGN/GPSM2ポリペプチドの抗原性領域(例えばエピトープ)を認識する抗体でよく、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製してもよい。
または、LGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその断片は、ポリペプチドのN末端またはC末端に対する、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)をそのN末端またはC末端に含む融合タンパク質として発現され得る。市販されている任意のエピトープ−抗体システムを使用することができる(Experimental Medicine 1995, 13:85-90)。例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されており、本発明のために使用することができる。さらに、エピトープに対する抗体を用いた免疫沈降法によって検出され得る非常に小さなエピトープを含む融合タンパク質もまた、当技術分野において公知である(Experimental Medicine 1995, 13:85-90)。LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片の性質を変えないような数個〜数十個のアミノ酸からなるそのようなエピトープもまた、本発明において使用することができる。例には、ポリヒスチジン(His−タグ)、インフルエンザ凝集体HA、ヒトc−myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7−タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSV−タグ)、E−タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)などが含まれる。
グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)もまた、免疫沈降法によって検出される融合タンパク質の対応物として周知である。GSTがLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片と融合されるタンパク質として使用され、融合タンパク質を形成する場合、この融合タンパク質は、GSTに対する抗体、またはGSTに特異的に結合する物質、すなわちグルタチオン(例えばグルタチオン−セファロース4B)などのいずれかを用いて検出することができる。
免疫沈降法において、(LGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその断片それ自体、またはそのポリペプチドもしくは断片にタグ付加されたエピトープを認識する)抗体を、LGN/GPSM2ポリペプチドおよび試験物質の反応混合物に添加することにより、免疫複合体が形成される。試験物質がポリペプチドに結合する能力を有する場合、形成される免疫複合体は、LGN/GPSM2ポリペプチド、試験物質、および抗体からなると考えられる。これに対して、試験物質がこのような能力を欠いている場合、形成される免疫複合体は、LGN/GPSM2ポリペプチドおよび抗体のみからなる。したがって、LGN/GPSM2ポリペプチドに対する試験物質の結合能力は、例えば形成された免疫複合体のサイズを測定することによって調べることができる。クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析などを含む、物質のサイズを検出するための任意の方法を使用することができる。例えば、マウスIgG抗体が検出に使用される場合、プロテインAまたはプロテインGセファロースを、形成された免疫複合体を定量するのに使用することができる。
免疫沈降法に関するより詳細な内容については、例えばHarlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52を参照されたい。
さらに、LGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその断片に結合する作用物質をスクリーニングするために使用されるLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片は、担体に結合されてもよい。当該ポリペプチドに結合するのに使用され得る担体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ、好ましくは、上記の材料から調製された、市販されているビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)が使用され得る。ビーズを使用する場合、これらはカラム中に充填されてよい。または、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより磁気を用いてビーズに結合させたポリペプチドおよび作用物質を容易に単離することが可能になる。
担体へのポリペプチドの結合は、化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してもよい。または、ポリペプチドは、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して担体に結合され得る。さらに、担体へのポリペプチドの結合は、アビジンとビオチンの組み合わせのような相互作用する分子を用いて実施することもできる。
このような担体に結合したLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を使用するスクリーニングは、例えば、担体に結合したポリペプチドに試験物質を接触させる段階、この混合物をインキュベートする段階、担体を洗浄する段階、ならびに担体に結合した作用物質を検出および/または測定する段階を含む。緩衝液が結合を阻害しない限り、緩衝液中、例えば、限定されないが、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液緩衝液中で、結合を実施してもよい。
このような担体に結合したLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片および組成物(例えば、細胞抽出物、細胞溶解物など)が試験物質として使用されるスクリーニング方法では、このような方法は一般にアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる。例えば、LGN/GPSM2ポリペプチドを、アフィニティーカラムの担体上に固定して、当該ポリペプチドに結合することができる物質を含む試験物質をカラムに添加してもよい。試験物質を添加した後、カラムを洗浄し、次いでポリペプチドに結合した物質を、適切な緩衝液を用いて溶出させる。
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した物質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーが使用される場合、LGN/GPSM2ポリペプチドと試験物質との間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてポリペプチドと試験物質との間の結合を評価することが可能である。
合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリー中の分子の中から、担体上に固定された特定のタンパク質をそれらの分子に曝露させることによって、その特定のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質だけでなく化学化合物も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットスクリーニング方法(Wrighton et al., Science 1996, 273:458-64;Verdine, Nature 1996, 384:11-3)もまた、当業者には周知である。これらの方法もまた、LGN/GPSM2タンパク質またはその断片に結合する物質(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)をスクリーニングするために使用することができる。
試験物質がタンパク質である場合、例えばウェストウェスタンブロット解析(Skolnik et al., Cell 1991, 65:83-90)を本発明の方法に使用することができる。具体的には、LGN/GPSM2ポリペプチドに結合するタンパク質は、ファージベクター(例えばZAP)を用いて、LGN/GPSM2ポリペプチドに結合する少なくとも1種類のタンパク質を発現することが予想される細胞、組織、器官、または培養細胞(例えばPC細胞株)からcDNAライブラリーを最初に調製し、そのcDNAライブラリーのベクターによってコードされるタンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識したLGN/GPSM2ポリペプチドを前述のフィルターと反応させ、かつLGN/GPSM2ポリペプチドの標識に従って、LGN/GPSM2ポリペプチドが結合したタンパク質を発現しているプラークを検出することによって、得ることができる。
放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酵素(例えば、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ)、蛍光性物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン)、およびビオチン/アビジンなどの標識物質を、本発明の方法においてLGN/GPSM2ポリペプチドの標識のために使用してもよい。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は、液体シンチレーションによって実施することができる。または、タンパク質が酵素で標識される場合、酵素の基質を添加して、発色などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、タンパク質を検出または測定することができる。さらに、蛍光物質が標識として使用される場合、蛍光光度計を用いて、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
さらに、タンパク質に結合したLGN/GPSM2ポリペプチドは、LGN/GPSM2ポリペプチド、またはLGN/GPSM2ポリペプチドに融合されているペプチドもしくはポリペプチド(例えばGST)に特異的に結合する抗体を使用することによって、検出または測定することができる。本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、抗体は、好ましくは前述の標識物質の1つで標識され、標識物質に基づいて検出または測定される。または、LGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識された二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてLGN/GPSM2ポリペプチドに結合する抗体は、プロテインGカラムまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定してもよい。
または、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を使用するツーハイブリッドシステムが使用され得る(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech);「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene);参考文献「Dalton et al., Cell 1992, 68:597-612」および「Fields et al., Trends Genet 1994, 10:286-92」)。ツーハイブリッドシステムでは、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片は、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合され、かつ酵母細胞において発現される。LGN/GPSM2ポリペプチドに結合する少なくとも1種類のタンパク質を発現することが予想される細胞から、発現された場合にそのライブラリーがVP16またはGAL4の転写活性化領域に融合されるように、cDNAライブラリーを調製する。次いで、cDNAライブラリーを前述の酵母細胞中に導入し、かつライブラリーに由来するcDNAを、検出された陽性クローンから単離する(LGN/GPSM2ポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、これら2種類の結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる)。cDNAにコードされるタンパク質は、上記で単離されたcDNAを大腸菌(E.coli)に導入し、かつタンパク質を発現させることによって、調製することができる。
レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子に加え、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを使用することができる。
このスクリーニングによって単離される作用物質は、LGN/GPSM2ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を活性化する分子を意味する。これに対して、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を阻害する分子を意味する。さらに、このスクリーニングによってアンタゴニストとして単離される作用物質は、LGN/GPSM2ポリペプチドと分子(核酸(RNAおよびDNA)ならびにタンパク質(例えばLGN/GPSM2ポリペプチドによってリン酸化した基質)を含む)とのインビボでの相互作用を阻害する候補である。
IV−1−2.LGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性の検出による薬剤の同定
本発明によれば、LGN/GPSM2遺伝子の発現はがん細胞、特に乳がん細胞の成長および/または生存と関連することが示された。それゆえ、LGN/GPSM2遺伝子の翻訳産物の生物学的機能を抑制または阻害する薬剤は、がんを治療または予防するための候補である。したがって、本発明はまた、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、がん、特に乳がんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。あるいは、本発明によって乳がんの治療および/または予防に適した候補化合物を同定することができる。そのような方法は以下の段階を含む:
(a)試験化合物とLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階;
(c)前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を、前記化合物の非存在下で検出された生物活性と比較する段階;および
(d)前記ポリペプチドの生物活性を抑制する化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階。本発明によれば、細胞成長の阻害における試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する:
(a)試験薬剤または化合物とLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片とを接触させる段階;および
(b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階、および
(c)(b)の生物活性を、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明によれば、LGN/GPSM2遺伝子の発現はがん細胞、特に乳がん細胞の成長および/または生存と関連することが示された。それゆえ、LGN/GPSM2遺伝子の翻訳産物の生物学的機能を抑制または阻害する薬剤は、がんを治療または予防するための候補である。したがって、本発明はまた、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、がん、特に乳がんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。あるいは、本発明によって乳がんの治療および/または予防に適した候補化合物を同定することができる。そのような方法は以下の段階を含む:
(a)試験化合物とLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階;
(c)前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を、前記化合物の非存在下で検出された生物活性と比較する段階;および
(d)前記ポリペプチドの生物活性を抑制する化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階。本発明によれば、細胞成長の阻害における試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する:
(a)試験薬剤または化合物とLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片とを接触させる段階;および
(b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階、および
(c)(b)の生物活性を、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明では、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
好ましい態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性は細胞増殖活性またはDNA合成増強活性である。細胞増殖活性は細胞株の増殖を観察することによって検出することができる。一方、DNA合成増強活性は、例えば、MTTならびにコロニー形成アッセイ法およびBrdUrd取り込みアッセイ法によって評価することができる。
本スクリーニング方法において指標として使用できるLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性の一つを有する限り、任意のLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片をスクリーニングに使用することができる。上記の任意の機能的断片または等価物を本スクリーニング方法に使用することができる。
本発明は、LGN/GPSM2が乳がん細胞でTRIOBP/teraまたはPBK/TOPKと相互作用して、細胞成長または増殖を促進することを開示する。したがって、本発明は、がん、特に乳がんの治療および/または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供する。あるいは、乳がんの治療および/または予防に適した候補化合物を本発明によって同定することができる。そのような方法は以下の段階を含む:
(a)試験化合物の存在下で、TRIOBP/teraポリペプチドもしくはその機能的等価物とLGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその機能的等価物とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチド間の結合を検出する段階;ならびに
(c)TRIOBP/teraポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階;
または以下の段階を含む:
(a)試験化合物の存在下で、PBK/TOPKポリペプチドもしくはその機能的等価物とLGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその機能的等価物とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチド間の結合を検出する段階;ならびに
(c)PBK/TOPKポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
(a)試験化合物の存在下で、TRIOBP/teraポリペプチドもしくはその機能的等価物とLGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその機能的等価物とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチド間の結合を検出する段階;ならびに
(c)TRIOBP/teraポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階;
または以下の段階を含む:
(a)試験化合物の存在下で、PBK/TOPKポリペプチドもしくはその機能的等価物とLGN/GPSM2ポリペプチドもしくはその機能的等価物とを接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチド間の結合を検出する段階;ならびに
(c)PBK/TOPKポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
本発明の一つの態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的等価物は、LGN/GPSM2ポリペプチドと同等の生物活性を有するポリペプチドと呼ばれる。好ましい態様において、例えば、以下の活性または特性をLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性として示すことができる:
細胞増殖の促進活性、
DNA合成増強活性、
TRIOBP/taraまたはPBK/TOPKとの結合活性、および
PBK/TOPKを介したリン酸化。
細胞増殖の促進活性、
DNA合成増強活性、
TRIOBP/taraまたはPBK/TOPKとの結合活性、および
PBK/TOPKを介したリン酸化。
したがって、上記のLGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片はまた、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的等価物でありうる。
本発明によれば、細胞成長の阻害における試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、乳がん細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、および乳がんを治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
より具体的には、この方法は以下の段階を含む:
(a)試験薬剤または化合物の存在下で、LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質とを接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との間の結合のレベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との間の結合レベルを、試験薬剤または化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階;ならびに
(d)(c)の結合レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
(a)試験薬剤または化合物の存在下で、LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質とを接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との間の結合のレベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との間の結合レベルを、試験薬剤または化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階;ならびに
(d)(c)の結合レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明では、LGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との結合レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との結合レベルを低減する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2タンパク質とPBK/TOPKタンパク質との結合レベルを低減しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
本発明に関して、LGN/GPSM2、TRIOBP/tera、またはPBK/TOPKポリペプチドの機能的等価物は、それぞれ、LGN/GPSM2ポリペプチド(SEQ ID NO:40)、TRIOBP/teraポリペプチド(SEQ ID NO:43)、またはPBK/TOPKポリペプチド(SEQ ID NO:45)と同等の生物活性を有するポリペプチドである。
PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。例えば、スクリーニングは、細胞株などのインビトロでのアッセイ系を用いて行うことができる。本発明は、LGN/GPSM2を介したPBK/TOPKのリン酸化を調節する試験化合物の同定を伴う。したがって、本発明は、がん、特に乳がんの治療および/または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供する。あるいは、乳がんの治療および/または予防に適した候補化合物を本発明によって同定することができる。そのような方法は以下の段階を含む:
(a)PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でLGN/GPSM2およびPBK/TOPKをインキュベートする段階であって、
LGN/GPSM2が、
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ
PBK/TOPKが、
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階;
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階;ならびに
(d)対照レベルと比べてLGN/GPSM2のリン酸化レベルを低減する化合物を選択する段階。
(a)PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でLGN/GPSM2およびPBK/TOPKをインキュベートする段階であって、
LGN/GPSM2が、
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ
PBK/TOPKが、
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階;
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階;ならびに
(d)対照レベルと比べてLGN/GPSM2のリン酸化レベルを低減する化合物を選択する段階。
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはLGN/GPSM2関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する:
(a)PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でLGN/GPSM2およびPBK/TOPKをインキュベートする段階であって、
LGN/GPSM2が、
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ
PBK/TOPKが、
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階;
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階;ならびに
(d)(c)のリン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
(a)PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でLGN/GPSM2およびPBK/TOPKをインキュベートする段階であって、
LGN/GPSM2が、
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ
PBK/TOPKが、
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階;
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階;ならびに
(d)(c)のリン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明の別の態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する:
(a)リン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でタンパク質キナーゼとLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物を接触させる段階;
(b)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558に対応する一つまたは二つのセリン残基および/またはトレオニン残基でのLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)前記リン酸化レベルを、試験化合物の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)リン酸化レベルを低減する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階。
(a)リン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でタンパク質キナーゼとLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物を接触させる段階;
(b)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558に対応する一つまたは二つのセリン残基および/またはトレオニン残基でのLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)前記リン酸化レベルを、試験化合物の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)リン酸化レベルを低減する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階。
あるいは、これらのリン酸化部位はSEQ ID NO:40のSer408、Thr526、および/またはSer565に対応する。したがって、本発明はまた、(b)’SEQ ID NO:40のSer408、Thr526、および/またはSer565でのLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物のリン酸化レベルを検出する段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する。
0083
本発明のそのような態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的等価物は、LGN/GPSM2ポリペプチドと同等の生物活性を有するポリペプチドと呼ばれる。好ましい態様において、例えば、以下の活性または特性をLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性として示すことができる:
細胞増殖の促進活性、および
DNA合成増強活性。
本発明のそのような態様において、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的等価物は、LGN/GPSM2ポリペプチドと同等の生物活性を有するポリペプチドと呼ばれる。好ましい態様において、例えば、以下の活性または特性をLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性として示すことができる:
細胞増殖の促進活性、および
DNA合成増強活性。
したがって、上記のLGN/GPSM2ポリペプチドの機能的断片はまた、それらの活性が保持されている限り、LGN/GPSM2ポリペプチドの機能的等価物でありうる。
本発明では、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを抑制または阻害する場合、当該試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを抑制または阻害しない場合、当該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
本発明に関して、PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件は、リン酸供与体、例えば、ATPの存在下でのLGN/GPSM2とPBK/TOPKのインキュベーションによって提供されうる。PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件は、それらのポリペプチドを発現する細胞の培養も含む。例えば、そのような細胞は、LGN/GPSM2ポリペプチドおよび/またはPBK/TOPKポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターを内部に持つ形質転換体細胞でありうる。インキュベーションの後、LGN/GPSM2のリン酸化レベルを、リン酸化LGN/GPSM2を認識する抗体などの試薬により検出することができる。
リン酸化LGN/GPSM2の検出の前に、LGN/GPSM2を他の要素、またはLGN/GPSM2発現細胞の細胞溶解物から分離することができる。例えば、残存成分からのLGN/GPSM2の分離のためにゲル電気泳動を使用することができる。あるいは、抗LGN/GPSM2抗体を持つ担体とLGN/GPSM2とを接触させることによってLGN/GPSM2を捕捉することができる。標識されたリン酸供与体が使用される場合、標識を追跡することによってLGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出することができる。例えば放射性標識ATP(例えば、32P−ATP)がリン酸供与体として使用される場合、分離されたLGN/GPSM2の放射能はLGN/GPSM2のリン酸化レベルと相関する。あるいは、リン酸化LGN/GPSM2を非リン酸化LGN/GPSM2から特異的に認識する抗体を用いて、リン酸化LGN/GPSM2を検出することができる。
いくつかの好ましい態様において、LGN/GPSM2およびPBK/TOPKを、PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化に適した条件の下、試験薬剤とともにインキュベートすることができる。そのような条件は、それらのポリペプチドを発現する細胞の培養またはそれらの溶解物によって提供されうる。例えば、そのような細胞は、LGN/GPSM2および/またはPBK/TOPKをコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターを内部に持つ形質転換体細胞でありうる。試験薬剤とのインキュベーションの後、LGN/GPSM2リン酸化のレベルを、LGN/GPSM2のリン酸化状態を認識する抗体などの薬剤により検出することができる。例えば、本発明では、免疫アッセイ法またはウエスタンブロッティングアッセイ法をLGN/GPSM2のリン酸化状態の検出に適用することができる。
PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化を特異的に妨げる薬剤を同定するため、上記のスクリーニング方法の前にまたは後に、さらなるスクリーニングを行うことができる。例えば、スクリーニングの前にまたは後にPBK/TOPKに結合する薬剤を選択することによって、PBK/TOPKの機能を阻害する候補薬剤を同定することができる。そのような薬剤は、LGN/GPSM2およびPBK/TOPK、またはその断片と試験薬剤とを接触させ、かつLGN/GPSM2リン酸化のレベルを阻害する薬剤を同定することによって選択することができる。あるいは、PBK/TOPK転写産物またはポリペプチドの量を決定することによって試験薬剤がPBK/TOPKの発現レベルに影響を与えるかどうかを確認することもできる。
あるいは、LGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化のために他のタンパク質キナーゼを使用することができる。本発明によれば、SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、およびSer558はLGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化部位として同定されており、これらの部位でのリン酸化は細胞成長に関与することが実証された。したがって、SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、またはSer558でのLGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化を阻害する薬剤または化合物は、がん細胞の成長を阻害するために、それゆえ、がんを治療または予防するために有用でありうる。かくして、本発明はまた、以下の段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、がん細胞の成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはがんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する:
(a)リン酸化に適した条件の下、試験薬剤または化合物の存在下でLGN/GPS2ポリペプチドおよびタンパク質キナーゼをインキュベートする段階;
(b)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558でのLGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2の前記リン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;ならびに
(d)(c)のリン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
(a)リン酸化に適した条件の下、試験薬剤または化合物の存在下でLGN/GPS2ポリペプチドおよびタンパク質キナーゼをインキュベートする段階;
(b)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558でのLGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)LGN/GPSM2の前記リン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;ならびに
(d)(c)のリン酸化レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
あるいは、これらのリン酸化部位はSEQ ID NO:40のSer408、Thr526、および/またはSer565に対応する。したがって、本発明はまた、(b)’SEQ ID NO:40のSer408、Thr526、および/またはSer565でのLGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出する段階を含む、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明では、SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、またはSer558でのLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてSEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558でのLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを抑制または阻害する場合、当該試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的断片のリン酸化レベルを抑制または阻害しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
タンパク質キナーゼとして、Auroraキナーゼのようなセリン−トレオニンキナーゼを本スクリーニング方法において好ましく使用することができる。あるいは、LGN/GPSM2遺伝子を発現する、細胞溶解物または全細胞を、試験薬剤または化合物の存在下でインキュベートすることができ、次いで、該溶解物または細胞におけるリン酸化レベルを検出することができる。そのような細胞溶解物または全細胞を、乳がん細胞などのがん細胞、またはLGN/GPSM2遺伝子をトランスフェクトされた組み換え細胞から調製することができる。
Ser401、Thr519、およびSer558でのLGN/GPSM2のリン酸化レベルは、それぞれ、ホスホ−LGN/GPSM2(Ser401)、ホスホ−LGN/GPSM2(Thr519)、およびホスホ−LGN/GPSM2(Ser558)を特異的に認識する抗体で検出することができる。全細胞が本スクリーニング方法において使用される場合、リン酸化レベルの検出の前に任意の従来の方法を用いて該全細胞を溶解することができる。
本発明では、PBK/TOPKによるLGN/GPSM2のリン酸化またはLGN/GPSM2およびPBK/TOPK間の結合の抑制が、乳房がん細胞の成長を低減することが明らかである。かくして、PBK/TOPKによるLGN/GPSM2の結合またはリン酸化を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、乳がんを治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が乳がんを治療または予防する可能性は、乳がんの治療剤を同定するための第二のおよび/または追加のスクリーニングによって評価することができる。
例えば、
(a)LGN/GPSM2タンパク質に結合する化合物、
(b)ポリペプチドLGN/GPSM2の生物活性を低減する化合物、
(c)LGN/GPSM2の発現レベルを低減する化合物、
(d)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減する化合物、
(e)LGN/GPSM2ポリペプチドのPBK/TOPK結合ドメインを含むポリペプチドのリン酸化レベルを抑制する化合物、
(f)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558でのLGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化レベルを抑制する化合物
からなる群より選択される特性を有する化合物であって、
該化合物が乳がん成長を阻害する場合、そのような化合物はLGN/GPSM2特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
(a)LGN/GPSM2タンパク質に結合する化合物、
(b)ポリペプチドLGN/GPSM2の生物活性を低減する化合物、
(c)LGN/GPSM2の発現レベルを低減する化合物、
(d)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減する化合物、
(e)LGN/GPSM2ポリペプチドのPBK/TOPK結合ドメインを含むポリペプチドのリン酸化レベルを抑制する化合物、
(f)SEQ ID NO:53のSer401、Thr519、および/またはSer558でのLGN/GPSM2ポリペプチドのリン酸化レベルを抑制する化合物
からなる群より選択される特性を有する化合物であって、
該化合物が乳がん成長を阻害する場合、そのような化合物はLGN/GPSM2特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
好ましくは、LGN/GPSM2および/もしくはPBK/TOPKまたはその機能的等価物を発現する細胞は、乳がん細胞である。
本発明の別の局面において、がんの治療および/または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットも提供される。このキットは、任意で以下の構成要素を含んでもよい:
(a)
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド(LGN/GPSM2)、
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド;ならびに
(b)
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド(PBK/TOPK)、
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド;ならびに
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出するための試薬。
(a)
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド(LGN/GPSM2)、
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド;ならびに
(b)
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド(PBK/TOPK)、
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド;ならびに
(c)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出するための試薬。
さらに、本発明はまた、がんの治療および/または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。このキットは、任意で以下の構成要素を含んでもよい:
(a)
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞;および
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出するための試薬。
(a)
i.SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド(LGN/GPSM2);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞;および
(b)LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出するための試薬。
さらに、乳がんの治療および/または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットは、任意で、以下からなる群より選択されるポリペプチドをさらに発現する細胞を含んでもよい:
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
i.SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド(PBK/TOPK);
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されている、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有するポリペプチド;および
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有するという条件で、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
別の局面において、キットにおいて使用される細胞はがん細胞、特に乳がん細胞である。
本発明では、キットはさらに、リン酸供与体を含むことができる。本発明のキットはまた、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物のリン酸化部位を、LGN/GPSM2のリン酸化レベルを検出するための試薬として認識する抗体を含むことができる。
IV−2.ヌクレオチドに基づくスクリーニング方法
IV−2−1.LGN/GPSM2遺伝子を用いるスクリーニング方法
上記で詳細に論じられているように、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを制御することによって、乳がんの発症および進行を制御することができる。したがって、乳がんの治療または予防において使用できる薬剤を、指標としてLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを使用するスクリーニングを通じて同定することができる。本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含むことができる:
(a)LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞と試験薬剤を接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(c)前記発現レベルを、薬剤の非存在下で検出された発現レベルと比較する段階;および
(d)発現レベルを低減する薬剤を、がんを治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
IV−2−1.LGN/GPSM2遺伝子を用いるスクリーニング方法
上記で詳細に論じられているように、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを制御することによって、乳がんの発症および進行を制御することができる。したがって、乳がんの治療または予防において使用できる薬剤を、指標としてLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを使用するスクリーニングを通じて同定することができる。本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含むことができる:
(a)LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞と試験薬剤を接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(c)前記発現レベルを、薬剤の非存在下で検出された発現レベルと比較する段階;および
(d)発現レベルを低減する薬剤を、がんを治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、乳がん細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびLGN/GPSM2関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含むことができる:
(a)LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞と試験薬剤または化合物を接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)(b)の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
(a)LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞と試験薬剤または化合物を接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)(b)の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明では、LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを低減する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを低減しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
LGN/GPSM2遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞を試験物質と接触させ、次いでLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定することによって同定することができる。当然、同定は、単一の細胞の代わりに、この遺伝子を発現する細胞集団を用いて実施してもよい。作用物質の非存在下での発現レベルと比較して、作用物質の存在下で検出される発現レベルが低下している場合、その作用物質がLGN/GPSM2遺伝子の阻害物質であることが示されて、その作用物質が乳がんを阻害するのに有用であり、したがって、乳がんの治療または予防用に使用され得る候補物質であることが示される。
遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法によって推定することができる。LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルは、例えば「I−1.がんまたはがんを発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。
このような同定のために使用される細胞または細胞集団は、LGN/GPSM2遺伝子を発現する限り、任意の細胞または任意の細胞集団でよい。例えば、細胞または集団は、ある組織に由来する乳房上皮細胞でもよく、またはそれを含んでよい。または、細胞もしくは集団は、がん細胞由来の不死化細胞でもよく、またはそれらを含んでもよい。LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞には、例えばがんから樹立された細胞株(例えば、22Rv1、C4−2B、P13などのようなPC細胞株)が含まれる。さらに、細胞または集団は、LGN/GPSM2遺伝子をトランスフェクトした細胞でもよく、またはそれを含んでもよい。
本発明の方法は、前述の様々な作用物質のスクリーニングを可能にし、かつアンチセンスRNA、siRNAなどを含む機能的核酸分子をスクリーニングするのに特に適している。
IV−2−2.LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域を使用するスクリーニング方法
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する:
(a)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞に、試験物質を接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;
(c)該発現レベルまたは活性を、該物質の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる該物質を、乳がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階。
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する:
(a)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞に、試験物質を接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;
(c)該発現レベルまたは活性を、該物質の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる該物質を、乳がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階。
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはLGN/GPSM2関連疾患、例えば、乳がんを治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、乳がん細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびLGN/GPSM2関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する:
(a)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞に、試験薬剤または化合物を接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;ならびに
(c)(b)の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
(a)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞に、試験薬剤または化合物を接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階;ならびに
(c)(b)の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
本発明では、該レポーター遺伝子の発現または活性を治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べて該レポーター遺伝子の発現または活性を低減する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べて該レポーター遺伝子の発現または活性を低減しない場合、当該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野において周知である。遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づきゲノムライブラリーから転写調節領域を含んだヌクレオチドセグメントとして得ることができるLGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域を用いて、スクリーニングに必要なレポーター構築物を調製することができる。
転写調節領域は、例えば、LGN/GPSM2遺伝子のプロモーター配列でありうる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列をつなげることによって調製することができる。本明細書におけるLGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも500bp上流まで、好ましくは1000bp上流まで、より好ましくは5000または10000bp上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはPCRによって増やすことができる。転写調節領域を同定するための方法、およびまたアッセイプロトコルは周知である(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
LGN/GPSM2遺伝子の調節配列(例えばプロモーター配列)に機能的に連結されているレポーター遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用する場合、レポーター遺伝子産物の発現レベルを検出することにより、LGN/GPSM2遺伝子の発現を阻害または亢進するものとして作用物質を同定することができる。
レポーター遺伝子としては、例えば当技術分野において周知のAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、HIS3遺伝子などを使用することができる。これらの遺伝子の発現を検出するための方法は、当技術分野において周知である。
IV−3.個々の個体に適切な治療物質の選択
個体の遺伝子構成の差異により、様々な薬物を代謝する相対的な能力が異なる場合がある。対象中で代謝されて抗腫瘍物質として作用する物質は、がん性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非がん性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化することができる。したがって、本明細書において開示されるがん性および非がん性の乳房細胞間で差次的に発現されるLGN/GPSM2遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞集団において、乳がんの推定上の治療的阻害物質または予防的阻害物質を試験して、その作用物質が対象において乳がんの適切な阻害物質であるかどうかを判定することが可能になる。
個体の遺伝子構成の差異により、様々な薬物を代謝する相対的な能力が異なる場合がある。対象中で代謝されて抗腫瘍物質として作用する物質は、がん性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非がん性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化することができる。したがって、本明細書において開示されるがん性および非がん性の乳房細胞間で差次的に発現されるLGN/GPSM2遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞集団において、乳がんの推定上の治療的阻害物質または予防的阻害物質を試験して、その作用物質が対象において乳がんの適切な阻害物質であるかどうかを判定することが可能になる。
個々の対象にとって適切な乳がんの阻害物質を同定するために、対象由来の試験細胞集団を候補治療物質に曝露し、かつLGN/GPSM2遺伝子の発現を決定する。
本発明の方法の文脈において、試験細胞集団は、LGN/GPSM2遺伝子を発現するがん細胞を含む。好ましくは、試験細胞は乳房上皮細胞である。
具体的には、試験細胞集団は、候補治療物質の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞集団におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現を測定し、1種類または複数種類の参照プロファイル、例えばがん性の参照発現プロファイルまたは非がん性の参照発現プロファイルと比較してもよい。
がんを含む参照細胞集団と比較して試験細胞集団におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現が減少している場合、その物質が治療能力を有することが示唆される。あるいは、がんを含まない参照細胞集団と比べて試験細胞集団におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現が類似している場合、その作用物質が治療能力を有することが示唆される。
V.がんを治療または予防するための医薬組成物
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、LGN/GPSM2遺伝子のアンチセンス核酸および二本鎖分子(例えば、siRNA)、ならびにLGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体は、LGN/GPSM2遺伝子の発現またはLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性を阻害または抑制し、かつ乳がん細胞の周期の調節および乳がん細胞の増殖を阻害または混乱させる。したがって、本発明は、本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、LGN/GPSM2遺伝子のアンチセンス核酸およびsiRNA、またはLGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体を含む、乳がんを治療または予防する組成物を提供する。本発明の組成物は、乳がんを治療または予防するのに使用され得る。
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、LGN/GPSM2遺伝子のアンチセンス核酸および二本鎖分子(例えば、siRNA)、ならびにLGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体は、LGN/GPSM2遺伝子の発現またはLGN/GPSM2ポリペプチドの生物活性を阻害または抑制し、かつ乳がん細胞の周期の調節および乳がん細胞の増殖を阻害または混乱させる。したがって、本発明は、本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、LGN/GPSM2遺伝子のアンチセンス核酸およびsiRNA、またはLGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体を含む、乳がんを治療または予防する組成物を提供する。本発明の組成物は、乳がんを治療または予防するのに使用され得る。
これらの組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど他の哺乳動物に対する薬剤として使用してもよい。
本発明の文脈において、以下に詳述する本発明の活性成分(スクリーニングされた作用物質、アンチセンス核酸、二本鎖分子(例えば、siRNA)、抗体などを含む)に適した薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与(頬側および舌下を含む)、膣内投与もしくは非経口投与(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装される。
経口投与に適した薬学的製剤には、カプセル剤、マイクロカプセル剤、カシェ剤、および錠剤が含まれ、それぞれ所定量の活性成分を含む。適切な製剤には、散剤、エリキシル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤も含まれる。活性成分は、任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。または、必要に応じて、医薬組成物は、水または他の任意の薬学的に許容される液体による滅菌溶液または滅菌懸濁液の注射剤の形態で、非経口的に投与され得る。例えば、本発明の活性成分は、一般に認められている薬物製造に必要とされる単位用量形態で、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定化剤、矯味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、および結合剤などと混合することができる。このような製剤中に含まれる活性成分の量により、指定された範囲内の適切な投薬量が取得できるようになる。
錠剤およびカプセル剤中に混合することができる添加剤の例には、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムなどの結合剤;結晶セルロースのような賦形剤;トウモロコシデンプン、ゼラチン、およびアルギン酸などの膨張剤;ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤;スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤;ならびにペパーミント、アカモノ(Gaultheria adenothrix)油、およびサクランボなどの矯味剤が含まれるが、これらに限定されない。錠剤は、任意で1種類または複数種類の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、界面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、毎月服用されるべき錠剤1つを含んでよい。
さらに、単位剤形がカプセル剤である場合、前述の成分に加えて、油などの液体担体をさらに含めることができる。
経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油を含んでよい)、または保存剤など従来の添加剤を含んでよい。
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質を含んでよい、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
さらに、注射用の無菌複合体は、注射に適した蒸留水のような溶剤を用いて、通常の薬物製造に従って製剤化することができる。D−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、および塩化ナトリウムなどのアジュバントを含む、生理食塩水、グルコース、および他の等張性の液体が、注射用の水性液剤として使用され得る。これらは、アルコール、例えばエタノール;プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール;ならびにポリソルベート80(商標)およびHCO−50などの非イオン性界面活性剤など適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。
ゴマ油またはダイズ油を、油性の液体として使用することができ、これは可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて使用してもよく、かつリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩酸プロカインのような鎮痛剤、ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤、ならびに/または抗酸化剤と共に製剤化してもよい。調製した注射剤は、適切なアンプルに充填することができる。
直腸投与用の製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、1種類もしくは複数種類の分散剤、可溶化剤、または懸濁化剤を含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、決定され得る。
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
他の製剤には、治療物質を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
所望の場合には、活性成分の持続放出を与えるように適合された、前述の製剤が使用され得る。医薬組成物は、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤など他の活性成分も含んでよい。
具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の作用物質を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
好ましい投薬単位製剤は、「V.がんを治療または予防するための方法」の項目(下記)で挙げられるように、本発明の各活性成分またはその適切な分割量を有効量含むものである。
V−1.スクリーニングされた物質を含む医薬組成物
本発明は、前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された物質のいずれかを含む、がんを治療または予防するための組成物を提供する。
本発明は、前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された物質のいずれかを含む、がんを治療または予防するための組成物を提供する。
本発明の方法によってスクリーニングされた物質は、直接投与してもよく、または上記に詳述した任意の従来の薬学的製剤方法に従って製剤化して、剤形にしてもよい。
V−2.二本鎖分子を含む医薬組成物
LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子(以下「LGN/GPSM2 siRNA」とも呼ぶ」を用いて、この遺伝子の発現レベルを低下させることができる。「二本鎖分子」という表現は、「定義」の項で定義されたのと同一の意味である。
LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子(以下「LGN/GPSM2 siRNA」とも呼ぶ」を用いて、この遺伝子の発現レベルを低下させることができる。「二本鎖分子」という表現は、「定義」の項で定義されたのと同一の意味である。
本明細書において、「siRNA」という用語は、「定義」の項で定義されたように、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味する。本発明の文脈において、siRNAは、上方制御されたマーカー遺伝子LGN/GPSM2に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、標的遺伝子(すなわちLGN/GPSM2遺伝子)のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の一部分を両方含むように構築され、また、センス鎖およびアンチセンス鎖が一本鎖を介して連結されている、ヘアピン構造を呈する単一構築物でもよい。siRNAはdsRNAまたはshRNAのいずれかでよい。
LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子は、標的mRNAにハイブリダイズする、すなわち、通常は一本鎖のmRNA転写物と結合し、それによってmRNAの翻訳を妨害し、最終的に、その遺伝子がコードするポリペプチドの産生(発現)を減少させるか、または阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ストリンジェントな条件下でLGN/GPSM2遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズする能力によって定義することができる。本明細書において、標的mRNAとハイブリダイズする二本鎖分子の部分は、「標的配列」または「標的核酸」もしくは「標的ヌクレオチド」と呼ばれる。
本発明において、二本鎖分子の標的配列の長さは、好ましくは500塩基対未満、200塩基対未満、100塩基対未満、50塩基対未満、または25塩基対未満である。より好ましくは、二本鎖分子の標的配列の長さは、19〜25塩基対である。LGN/GPSM2 siRNAの例示的な標的核酸配列には、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21のヌクレオチド配列が含まれる。配列中のヌクレオチド「t」は、RNAまたはその誘導体においては「u」に置換されるはずである。したがって、例えば、本発明の医薬組成物は、ヌクレオチド配列
5’−GCAUGAGAGAAGACCAUUC−3’(SEQ ID NO:20に対して)または
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−3’(SEQ ID NO:21に対して)をセンス鎖として含む二本鎖RNA分子(siRNA)を含んでよい。
5’−GCAUGAGAGAAGACCAUUC−3’(SEQ ID NO:20に対して)または
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−3’(SEQ ID NO:21に対して)をセンス鎖として含む二本鎖RNA分子(siRNA)を含んでよい。
二本鎖分子の阻害活性を増強するために、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の標的配列の3’末端にいくつかのヌクレオチドを付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも2個、一般には2〜10個、好ましくは2〜5個である。付加されたヌクレオチドは二本鎖分子のセンスおよび/またはアンチセンス鎖の3’末端で一本鎖を形成し、これは「3’−オーバーハング」と呼ばれる。付加されるヌクレオチドの好ましい例としては「t」および「u」が挙げられるが、これらに限定されることはない。二本鎖分子が一本のポリヌクレオチドからなってヘアピンループ構造を形成する場合には、一本のポリヌクレオチドの3’末端に3’オーバーハング配列を付加することができる。二本鎖分子がsiRNAであっても、3’−オーバーハングをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。
任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンス鎖とアンチセンス鎖の間に配置して、ヘアピンループ構造物を形成させてもよい。したがって、本発明の組成物中に含まれる二本鎖分子は、下記の一般式を有してよい:
5’−[A]−[B]−[A’]−3’
式中、[A]は、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖である。本明細書において、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「センス鎖」と呼ばれ得る。好ましい態様において、[A]はセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドからなる一本鎖ポリヌクレオチドであり、かつ[A’]は、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖(すなわち、センス鎖[A]の標的配列にハイブリダイズする配列)である。本明細書において、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれ得る。領域[A]は[A’]にハイブリダイズし、次いで領域[B]からなるループが形成される。ループ配列の長さは、好ましくは、3〜23ヌクレオチドでよい。例えば、ループ配列は、以下の配列からなる群より選択することができる(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html):
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8
UUCG:Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5;Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4:457-67
「UUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)」は、特に適切なループ配列である。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列も、活性なsiRNAを提供する(Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8)。
5’−[A]−[B]−[A’]−3’
式中、[A]は、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖である。本明細書において、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「センス鎖」と呼ばれ得る。好ましい態様において、[A]はセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドからなる一本鎖ポリヌクレオチドであり、かつ[A’]は、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖(すなわち、センス鎖[A]の標的配列にハイブリダイズする配列)である。本明細書において、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれ得る。領域[A]は[A’]にハイブリダイズし、次いで領域[B]からなるループが形成される。ループ配列の長さは、好ましくは、3〜23ヌクレオチドでよい。例えば、ループ配列は、以下の配列からなる群より選択することができる(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html):
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8
UUCG:Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5;Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4:457-67
「UUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)」は、特に適切なループ配列である。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列も、活性なsiRNAを提供する(Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8)。
本発明の文脈において使用するのに適した例示的なヘアピンsiRNAには、LGN/GPSM2−siRNAの場合、
5’−GCAUGAGAGAAGACCAUUC−[b]−GAAUGGUCUUCUCUCAUGC−3’(SEQ ID NO:20の標的配列);および
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−[b]−GAUUUCCAAAGGCACGUCC−3’(SEQ ID NO:21の標的配列)が含まれる。
5’−GCAUGAGAGAAGACCAUUC−[b]−GAAUGGUCUUCUCUCAUGC−3’(SEQ ID NO:20の標的配列);および
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−[b]−GAUUUCCAAAGGCACGUCC−3’(SEQ ID NO:21の標的配列)が含まれる。
本発明における、適切なsiRNAの他のヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)から入手可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計することができる。コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
siRNA標的部位の選択:
1.対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。個々のAAの出現および潜在的なsiRNA標的部位として3’側に隣接する19ヌクレオチドを記録する。Tuschlら(Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7)は、5’および3’非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75ヌクレオチド以内)の領域は、調節タンパク質結合部位に豊富に存在する可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計することを推奨しない。UTR−結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、BLAST(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:3389-402; J Mol Biol 1990, 215:403-10.)を用いて実施することができ、これはNCBIサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。Ambionでは、好ましくは数個の標的配列を遺伝子の長さに沿って選択して評価することができる。
1.対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。個々のAAの出現および潜在的なsiRNA標的部位として3’側に隣接する19ヌクレオチドを記録する。Tuschlら(Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7)は、5’および3’非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75ヌクレオチド以内)の領域は、調節タンパク質結合部位に豊富に存在する可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計することを推奨しない。UTR−結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、BLAST(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:3389-402; J Mol Biol 1990, 215:403-10.)を用いて実施することができ、これはNCBIサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。Ambionでは、好ましくは数個の標的配列を遺伝子の長さに沿って選択して評価することができる。
細胞に二本鎖分子を導入するための標準的な技術が当業者に公知である。例えば、二本鎖分子を、mRNA転写物に結合することができる形態で、細胞中に直接導入することができる。これらの態様において、二本鎖分子は、典型的には、アンチセンス分子に関して前述したように修飾される。他の修飾もまた利用可能である。例えば、コレステロールを結合したsiRNAは、改善された薬理学的特性を示した(Song et al., Nature Med 2003, 9:347-51)。慣例的に用いられるこれらの技術を、本発明の組成物に含まれる二本鎖分子に適用してもよい。
または、二本鎖分子をコードするDNAは、ベクター中に保有されてもよく(以下「二本鎖分子ベクター」とも呼ぶ)、二本鎖分子は、インビボで二本鎖分子を発現させるベクターの形で本発明の組成物に含まれてもよい。このようなベクターは、例えば(DNA分子の転写により)両方の鎖の発現が可能になる様式でその配列に隣接している機能的に連結された調節配列(例えば、核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーター)を有する発現ベクター中に、LGN/GPSM2遺伝子のインビボでの発現を阻害するのに適した標的LGN/GPSM2遺伝子配列の部分をクローニングすることによって、作製することができる(Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5)。例えば、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAに対するアンチセンスであるRNA分子は、第一のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列3’)によって転写され、LGN/GPSM2遺伝子のmRNAに対するセンス鎖であるRNA分子は、第二のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列5’)によって転写される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボでハイブリダイズして、LGN/GPSM2遺伝子の発現をサイレンシングするためのsiRNA構築物を生じる。あるいは、センス鎖およびアンチセンス鎖は、1つのプロモーターの助けを借りて一緒に転写され得る。この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖はポリヌクレオチド配列を介して連結されて、二次構造、例えばヘアピンを有する一本鎖siRNA構築物を形成し得る。
かくして、乳がんおよび肝細胞がんを含むがんを治療または予防するための本医薬組成物は、二本鎖分子およびそれをインビボで発現するベクターの少なくともいずれか一つを含む。米国特許第7,345,156号には、LGN/GPSMのアンチセンスS−オリゴヌクレオチドがヒト肝がんSNU475細胞の成長を抑制することが開示されている。それゆえ、本発明の二本鎖分子は、乳がんおよび肝細胞がんを含むがんを治療または予防するのに有用である。
二本鎖分子またはベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。FuGENE6(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(Wako pure Chemical)はトランスフェクション促進剤として有用である。それゆえ、本医薬組成物はさらに、そのようなトランスフェクション促進剤を含むことができる。
本発明では、二本鎖分子は、送達試薬とともに裸の核酸として、または二本鎖分子を発現する組み換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして対象に投与することができる。
本二本鎖分子とともに投与するのに適した送達試薬は、Mirus Transit TKO親油性試薬;リポフェクチン;リポフェクトアミン;セルフェクチン;またはポリカチオン(例えばポリリシン)もしくはリポソームを含む。好ましい送達試薬はリポソームである。
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を補助することができ、阻害性核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明で用いるのに適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これには一般的に、中性または陰性電荷のリン脂質およびコレステロールなどのステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要因を考慮することにより、脂質の選択が左右される。例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467;ならびに米国特許第4,235,871号;同第4,501,728号;同第4,837,028号;および同第5,019,369号に記述されているように、リポソームを調製するのに種々の方法が知られており、それらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
好ましくは、本二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームをがん部位に送達できるリガンド分子を含む。腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体などの、腫瘍細胞に多く見られる受容体に結合するリガンドが好ましい。
特に好ましくは、本二本鎖分子を封入するリポソームは、単核マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように、例えば、構造表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することにより修飾される。一つの態様において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含むことができる。
本発明のリポソームの調製で用いるオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合する大きな親水性重合体である。本明細書において使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば、脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜に化学的または物理的に付着される場合、リポソーム膜に「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性重合体は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,920,016号に記述されているように、マクロファージ−単球系(「MMS」)および細網内皮系(「RES」)によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもはるかに長く循環血液中に留まる。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。かくして、そのような微小血管系の欠陥によって特徴付けられる標的組織、例えば、固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に集積すると考えられる。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。かくして、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本阻害性核酸を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、約500〜約40,000ダルトン、より好ましくは約2,000〜約20,000ダルトンの分子量を有する水溶性重合体であることが好ましい。そのような重合体はポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えば、メトキシPEGまたはPPG、およびステアリン酸PEGまたはPPG;ポリアクリルアミドまたはポリN−ビニルピロリドンのような合成重合体;直鎖状、分枝状、または樹状ポリアミドアミン;ポリアクリル酸;多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドGM1などのガングリオシドを含む。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGの共重合体、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害重合体は、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロック共重合体でありうる。オプソニン化阻害重合体はまた、アミノ酸もしくはカルボン酸、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギナンを含有する天然多糖;アミノ化多糖もしくはオリゴ糖(直鎖状もしくは分枝状);または、例えば、カルボン酸基の連結を結果的に有するカルボン酸の誘導体と反応した、カルボキシル化多糖もしくはオリゴ糖でもありうる。
好ましくは、オプソニン化阻害部分はPEG、PPG、またはその誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの周知の技術のいずれか一つによってリポソーム膜に結合されうる。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合され、次いで膜に結合されうる。同様に、デキストラン重合体は、Na(CN)BH3、ならびに30:12の比のテトラヒドロフランおよび水などの溶媒混合物を60℃で用いて還元的アミノ化によりステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することもできる。
本発明の阻害性核酸を発現するベクターが上記で論じられている。本発明の少なくとも一つの阻害性核酸を発現するそのようなベクターを、直接的にまたはMirus Transit LT1親油性試薬;リポフェクチン;リポフェクトアミン;セルフェクチン;ポリカチオン(例えば、ポリリシン)もしくはリポソームを含む好適な送達試薬とともに投与することもできる。本発明の阻害性核酸を発現する組み換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達するための方法は、当技術分野の技術の範囲内である。
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は遺伝子銃、電気穿孔法により、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路により投与することができる。
好適な腸内投与経路は経口、直腸、または鼻腔送達を含む。
好適な非経口投与経路は、血管内投与(例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴);傍組織および組織内注射(例えば、傍腫瘍および腫瘍内注射、網膜内注射、または網膜下注射);皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着(例えば、浸透圧ポンプによって);例えばカテーテルまたは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様材料を含む、網膜ペレットまたは坐剤またはインプラント)によるがん部位の領域またはその近傍の領域への直接適用;ならびに吸入を含む。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がんの部位またはその近傍で行われることが好ましい。
本発明の阻害性核酸は、単回用量または複数回用量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続用量であってよく、または複数回の注入によって送達されてもよい。組織中へ直接的に薬剤を注射するのは、選択されたがんの部位またはその近傍である。がんの部位またはその近傍の組織中へ薬剤を複数回注射することが、特に好ましい。
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所与の対象に投与するのに適した投薬計画を容易に決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えばがん部位でのまたはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約3日〜約28日、より好ましくは約7日〜約10日の間、1日1回または2回、対象に投与することができる。好ましい投薬計画では、二本鎖分子は7日間、1日1回、がんの部位またはその近傍に注射される。投薬計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投薬計画全体を通して投与される二本鎖分子の全量を含みうることが理解される。
V−3.アンチセンス核酸を含む医薬組成物
LGN/GPSM2遺伝子を標的化するアンチセンス核酸は、乳がん細胞を含むがん細胞において上方制御されている遺伝子の発現レベルを低下させるのに使用することができる。このようなアンチセンス核酸は、がん、特に乳がんの治療に有用であり、したがって本発明に包含される。アンチセンス核酸は、LGN/GPSM2遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそれに対応するmRNAに結合し、それによってその遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、作用する。
LGN/GPSM2遺伝子を標的化するアンチセンス核酸は、乳がん細胞を含むがん細胞において上方制御されている遺伝子の発現レベルを低下させるのに使用することができる。このようなアンチセンス核酸は、がん、特に乳がんの治療に有用であり、したがって本発明に包含される。アンチセンス核酸は、LGN/GPSM2遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそれに対応するmRNAに結合し、それによってその遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、作用する。
したがって、結果として、アンチセンス核酸は、LGN/GPSM2タンパク質ががん細胞において機能するのを阻害する。本明細書において、「アンチセンス核酸」という語句は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを意味し、かつ標的配列に完全に相補的なヌクレオチドだけでなく、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを含むヌクレオチドも含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、LGN/GPSM2遺伝子またはその相補的配列の少なくとも15個の連続的ヌクレオチドの範囲に渡って、少なくとも70%またはそれ以上、好ましくは少なくとも80%またはそれ以上、より好ましくは少なくとも90%またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも95%またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、このような相同性を決定することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、遺伝子のDNAまたはmRNAに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することにより、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して作用し、最終的に当該タンパク質が機能するのを阻害する。
本発明のアンチセンス核酸は、核酸に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはバップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
また、必要に応じて、本発明のアンチセンス核酸は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することもできる。アンチセンス封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために使用することができる。例には、リポソーム、ポリ−L−リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。これらは、以下の公知の方法によって調製することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、LGN/GPSM2タンパク質の発現を阻害し、かつこのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。さらに、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害物質は、LGN/GPSM2タンパク質の生物活性を阻害することができるという点で有用である。
本発明のアンチセンス核酸には、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、チオエート化オリゴヌクレオチドが使用され得る。
V−4.抗体を含む医薬組成物
がん、特に乳がんにおいて過剰発現されているLGN/GPSM2遺伝子の遺伝子産物の機能は、LGN/GPSM2遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。LGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体はこのような化合物であり、乳がんを治療または予防するための医薬組成物の活性成分として使用することができる。
がん、特に乳がんにおいて過剰発現されているLGN/GPSM2遺伝子の遺伝子産物の機能は、LGN/GPSM2遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。LGN/GPSM2ポリペプチドに対する抗体はこのような化合物であり、乳がんを治療または予防するための医薬組成物の活性成分として使用することができる。
本発明は、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはこれらの抗体の断片の使用に関する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用された抗原(すなわち、上方制御されたマーカーの遺伝子産物)またはそれに密接に関連した抗原とのみ相互作用(すなわち、結合)する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。抗体を合成するために使用された抗原を含む分子、およびこの抗体によって認識される抗原のエピトープを含む分子を、それに密接に関連した抗原として挙げることができる。
さらに、本発明の医薬組成物において使用される抗体は、LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい(例えば、抗LGN/GPSM2抗体の免疫学的活性断片)。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab’)2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている単鎖Fv(scFv)でよい(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85:5879-83)。このような抗体断片は、パパインまたはペプシンのような酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい(例えば、Co MS et al., J Immunol 1994, 152:2968-76;Better M et al., Methods Enzymol 1989, 178:476-96;Pluckthun A et al., Methods Enzymol 1989, 178:497-515;Lamoyi E, Methods Enzymol 1986, 121:652-63;Rousseaux J et al., Methods Enzymol 1986, 121:663-9;Bird RE et al., Trends Biotechnol 1991, 9:132-7を参照されたい)。
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)などの様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。本発明は、このような修飾抗体を含む。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。このような修飾方法は、当技術分野において通常である。
または、本発明のために使用される抗体は、LGN/GPSM2ポリペプチドに対する非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR)および定常領域を含むヒト化抗体でよい。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる(例えば、Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である。
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体もまた、使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む(例えば、Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227:381-8)。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、および第5,661,016号において説明されている。
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合(抗体治療)、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
前述のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用される分離および精製方法に従って実施することができる。例えば、抗体は、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適切に選択し併用することによって、分離および単離することができる(Antibodies:A Laboratory Manual. Ed HarlowおよびDavid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROS、およびセファロースF.F(Pharmacia)が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーなどが含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。クロマトグラフィーの方法は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
VI.がんを治療または予防するための方法
がん細胞において生じる特異的な分子変化を対象とするがん治療は、進行がんの治療用のトラスツズマブ(ハーセプチン)、慢性骨髄性白血病用のメシル酸イマチニブ(グリベック)、非小細胞肺がん(NSCLC)用のゲフィチニブ(イレッサ)、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫用のリツキシマブ(抗CD20mAb)などの抗腫瘍薬剤の臨床開発および規制認可を通して実証されている(Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7:2958-70, Review;Slamon DJ et al., N Engl J Med 2001, 344:783-92;Rehwald U et al., Blood 2003, 101:420-4;Fang G et al., Blood 2000, 96:2246-53)。これらの薬物は、臨床的に有効であり、かつ形質転換細胞のみを標的にするため、従来の抗腫瘍剤より耐容性が良好である。したがって、このような薬物により、がん患者の生存および生活の質が改善されるだけでなく、分子を標的とするがん治療の概念が実証される。さらに、標的化薬物は、標準的な化学療法と組み合わせて使用された場合に、その有効性を高めることができる(Gianni L, Oncology 2002, 63 Suppl 1:47-56;Klejman A et al., Oncogene 2002, 21:5868-76)。したがって、将来のがん治療は、血管形成および侵襲性など腫瘍細胞の様々な特徴を対象とする標的特異的な作用物質と、従来の薬物を組み合わせることを伴うと考えられる。
がん細胞において生じる特異的な分子変化を対象とするがん治療は、進行がんの治療用のトラスツズマブ(ハーセプチン)、慢性骨髄性白血病用のメシル酸イマチニブ(グリベック)、非小細胞肺がん(NSCLC)用のゲフィチニブ(イレッサ)、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫用のリツキシマブ(抗CD20mAb)などの抗腫瘍薬剤の臨床開発および規制認可を通して実証されている(Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7:2958-70, Review;Slamon DJ et al., N Engl J Med 2001, 344:783-92;Rehwald U et al., Blood 2003, 101:420-4;Fang G et al., Blood 2000, 96:2246-53)。これらの薬物は、臨床的に有効であり、かつ形質転換細胞のみを標的にするため、従来の抗腫瘍剤より耐容性が良好である。したがって、このような薬物により、がん患者の生存および生活の質が改善されるだけでなく、分子を標的とするがん治療の概念が実証される。さらに、標的化薬物は、標準的な化学療法と組み合わせて使用された場合に、その有効性を高めることができる(Gianni L, Oncology 2002, 63 Suppl 1:47-56;Klejman A et al., Oncogene 2002, 21:5868-76)。したがって、将来のがん治療は、血管形成および侵襲性など腫瘍細胞の様々な特徴を対象とする標的特異的な作用物質と、従来の薬物を組み合わせることを伴うと考えられる。
これらの調節的な方法は、(例えば、細胞を作用物質と共に培養することにより)エクスビボもしくはインビトロで、または別の方法として、(作用物質を対象に投与することにより)インビボで実施することができる。これらの方法は、差次的に発現される遺伝子の異常な発現またはそれらの遺伝子産物の異常な活性を打ち消すための治療法として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与することを含む。
LGN/GPSM2遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物活性が、(その疾患または障害に罹患していない対象と比較して)それぞれ上昇していることを特徴とする疾患および障害は、過剰発現された遺伝子の活性に拮抗する(すなわち、低下させるか、または阻害する)治療物質で治療することができる。活性に拮抗する治療物質は、治療的または予防的に投与することができる。
したがって、本発明の文脈において使用され得る治療物質には、例えば(i)過剰発現されたLGN/GPSM2遺伝子のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体;(ii)前記過剰発現された遺伝子もしくは遺伝子産物に対する抗体;(iii)前記過剰発現された遺伝子をコードする核酸;(iv)アンチセンス核酸もしくは「機能障害性」である核酸(すなわち、前記過剰発現された遺伝子の核酸内への異種挿入に起因する);(v)二本鎖分子(例えば、siRNA);または(vi)調節物質(すなわち、前記過剰発現されたポリペプチドとその結合相手との相互作用を変更する阻害物質、アンタゴニスト)が含まれる。機能障害性のアンチセンス分子は、相同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するのに使用される(例えば、Capecchi, Science 1989, 244:1288-92を参照されたい)。
レベルの上昇は、(例えば生検組織から)患者の組織試料を採取して、RNAまたはペプチドのレベル、発現されたペプチド(または発現が変更された遺伝子のmRNA)の構造および/または活性についてインビトロでそれを分析することにより、ペプチドおよび/またはRNAを定量することによって、容易に検出することができる。当技術分野内で周知である方法には、イムノアッセイ法(例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降法とそれに続くドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる)、および/またはmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ法(例えば、ノーザンアッセイ法、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションなど)が含まれるが、これらに限定されない。
予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に実施する。
本発明の治療方法は、LGN/GPSM2遺伝子産物の1つまたは複数の活性を調節する物質と細胞を接触させる段階を含み得る。タンパク質活性を調節する物質の例には、核酸、タンパク質、このようなタンパク質の天然の同系リガンド、ペプチド、ペプチド模倣体、および他の小分子が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本発明は、LGN/GPSM2遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を低減させることによって、対象において乳がんの症状を治療もしくは緩和するか、または乳がんを予防するための方法を提供する。本方法は、乳がん(breast carcinoma)を含む、LGN/GPSM2を発現する乳がん(breast cancer)を治療または予防するのに特に適している。本発明において、乳がんで上方制御されるLGN/GPSM遺伝子に対するsiRNAが乳がん細胞の成長を抑制することが確認された。それゆえ、LGN/GPSM遺伝子に対する二本鎖分子は乳がんを治療するのに有用である。さらに、米国特許第7,345,156号は、LGN/GPSMのアンチセンスS−オリゴヌクレオチドがヒト肝がんSNU475細胞の成長を抑制することを開示している。それゆえ、LGN/GPSM遺伝子に対するsiRNAはまた、肝細胞がんを治療するのに有用である。
適切な治療物質を、乳がんに罹患しているか、または乳がんを発症するリスクを有する(もしくは発症しやすい)対象に予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準の臨床的方法を用いることによって、またはLGN/GPSM2遺伝子の異常な発現レベル(「上方制御」もしくは「過剰発現」)もしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することによって、同定することができる。
本発明のある局面によれば、本発明の方法によってスクリーニングされた物質を、乳がんを治療または予防するために使用してもよい。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に該物質を投与してもよい。該物質がDNAによってコード可能である場合、そのDNAを遺伝子療法用のベクターに挿入し、患者にそのベクターを投与して、療法を実施することができる。
投薬量および投与方法は、治療しようとする患者の体重、年齢、性別、症状、状態、および投与方法によって異なる。しかしながら、当業者は、適切な投薬量および投与方法を規定どおりに選択することができる。
例えば、LGN/GPSM2ポリペプチドに結合し、そのポリペプチドの活性を調節する物質の用量は、前述した様々な要因に依存するが、用量は一般に、正常なヒト成人(体重60kg)に経口投与される場合、1日当たり約0.1mg〜約100mg、好ましくは1日当たり約1.0mg〜約50mg、およびより好ましくは1日当たり約1.0mg〜約20mgである。
正常なヒト成人(体重60kg)への注射の形態で作用物質を非経口的に投与する場合、患者、標的器官、症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるものの、1日当たり約0.01mg〜約30mg、好ましくは1日当たり約0.1mg〜約20mg、およびより好ましくは1日当たり約0.1mg〜約10mgの用量を静脈内注射することが好都合である。他の動物の場合、適切な投薬量は、体重60kgに変換することによって、規定どおりに算出してもよい。
同様に、本発明の医薬組成物は、乳がんを治療または予防するために使用され得る。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に組成物を投与してもよい。
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、1日当たり約0.1mg/kg〜約250mg/kgの範囲の用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約5mg/日〜約17.5g/日、好ましくは約5mg/日〜約10g/日、および最も好ましくは約100mg/日〜約3g/日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約5mg〜約500mg、通常、約100mg〜約500mgを含む。
使用される用量は、対象の年齢、体重、および性別、治療される厳密な疾患およびその重症度を含む、いくつかの要因に依存すると考えられる。同様に、投与経路も、状態およびその重症度に応じて異なってよい。任意の事象において、適切な投薬量および最適投薬量は、前述の要因を考慮して、当業者が規定どおりに算出してもよい。
具体的には、LGN/GPSM2遺伝子に対するsiRNAは、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注入することによって、患者に与えることができる。
本発明のsiRNAの投薬量は、患者の状態に応じて適宜調整し、かつ所望の量で使用することができる。例えば、0.1mg/kg〜100mg/kg、好ましくは0.1mg/kg〜50mg/kgの用量範囲を投与することができる。
VII.二本鎖分子およびそれをコードするベクター
本発明によれば、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21の配列のうちのいずれかを含むsiRNAは、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞の細胞増殖または生存力を抑制することが実証された。したがって、これらの配列のいずれかを含む二本鎖分子およびこれらの分子を発現するベクターは、LGN/GPSM2遺伝子発現細胞の増殖を伴う疾患(例えば、乳がん)を治療または予防するための好ましい薬剤として役立つとみなされる。したがって、ある局面によれば、本発明は、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21の群より選択される配列を含む二本鎖分子、ならびにそれらの分子を発現するベクターを提供する。より具体的には、本発明は、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖がSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的配列として含み、かつ該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するように該アンチセンス鎖がセンス鎖の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、二本鎖分子を提供する。
本発明によれば、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21の配列のうちのいずれかを含むsiRNAは、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞の細胞増殖または生存力を抑制することが実証された。したがって、これらの配列のいずれかを含む二本鎖分子およびこれらの分子を発現するベクターは、LGN/GPSM2遺伝子発現細胞の増殖を伴う疾患(例えば、乳がん)を治療または予防するための好ましい薬剤として役立つとみなされる。したがって、ある局面によれば、本発明は、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21の群より選択される配列を含む二本鎖分子、ならびにそれらの分子を発現するベクターを提供する。より具体的には、本発明は、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖がSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的配列として含み、かつ該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するように該アンチセンス鎖がセンス鎖の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、二本鎖分子を提供する。
センス鎖中に含まれる標的配列は、約500個未満、約400個未満、約300個未満、約200個未満、約100個未満、約75個未満、約50個未満、または約25個未満の連続したヌクレオチドである、SEQ ID NO:39または41の一部分の配列からなってよい。例えば、標的配列は、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列からの約19〜約25個の連続的なヌクレオチドでよい。
したがって、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、ここで、センス鎖は標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列のアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25塩基対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
本発明はそれに限定されないが、適切な標的配列には、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21の配列が含まれる。
本発明の二本鎖分子は、2つのポリヌクレオチド構築物、すなわち、センス鎖を含むポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドから構成されてよい。あるいは、この分子は、1つのポリヌクレオチド構築物、すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むポリヌクレオチドから構成されてもよく、その場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ヘアピン構造物を形成することによってセンス鎖およびアンチセンス鎖内の標的配列のハイブリダイゼーションを可能にする一本鎖ポリヌクレオチドを介して連結されている。本明細書において、一本鎖ポリヌクレオチドは、「ループ配列」または「一本鎖」とも呼ばれ得る。センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖ポリヌクレオチドは、3〜23個のヌクレオチドからなってよい。本発明の二本鎖分子に関するより詳細な内容については、「IV−2.二本鎖分子を含む医薬組成物」の項目を参照されたい。
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の改変ヌクレオチドおよび/または非リン酸ジエステル結合を含んでよい。当技術分野において周知の化学的改変は、二本鎖分子の安定性、有効性、および/または細胞取込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子中に組み入れることができる他のタイプの化学的改変を承知しているであろう(WO 03/070744;WO 2005/045037)。1つの態様において、改変は、分解耐性を改善するか、または取込みを改善するために使用することができる。このような改変の例には、ホスホロチオアート結合、(特に二本鎖分子のセンス鎖上の)2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、2’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5’−C−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基(abasic)残基の組込みが含まれる(US 20060122137)。
別の態様において、改変は、二本鎖分子の安定性を向上させるか、または標的効率を上昇させるために使用することができる。改変には、二本鎖分子の2つの相補鎖の間の化学的架橋、二本鎖分子の鎖の3’末端または5’末端の化学的改変、糖改変、核酸塩基改変および/または主鎖改変、2−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに2’−デオキシリボヌクレオチドが含まれる(WO 2004/029212)。別の態様において、改変は、標的mRNA中および/または相補的な二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対する親和性を増加または減少させるために使用することができる(WO 2005/044976)。例えば、未改変のピリミジンヌクレオチドは、2−チオピリミジン、5−アルキニルピリミジン、5−メチルピリミジン、または5−プロピニルピリミジンで置換することができる。さらに、未改変プリンが、7−デアザプリン、7−アルキルプリン、または7−アルケニルプリンで置換されてもよい。別の態様において、二本鎖分子が3’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、3’末端のヌクレオチドが突き出しているヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドによって置換されてよい(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。さらなる詳細については、US 20060234970などの公開された文献が利用可能である。本発明はこれらの例に限定されず、かつ結果として生じる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の公知の化学的改変を本発明の二本鎖分子に対して使用してよい。
さらに、本発明の二本鎖分子は、DNAおよびRNAの両方を含んでよく、例えば、dsD/R−NAまたはshD/R−NAである。具体的には、DNA鎖およびRNA鎖のハイブリッドポリヌクレオチドまたはDNA−RNAキメラポリヌクレオチドは、高い安定性を示す。DNAおよびRNAの混合、すなわち、DNA鎖(ポリヌクレオチド)およびRNA鎖(ポリヌクレオチド)からなるハイブリッド型の二本鎖分子、または一本鎖(ポリヌクレオチド)のいずれかもしくは両方にDNAとRNAの両方を含むキメラ型の二本鎖分子などは、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成させることができる。DNA鎖およびRNA鎖のハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有している限り、センス鎖がDNAでありかつアンチセンス鎖がRNAであるかまたはその逆の、いずれかのハイブリッドでよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドがDNAであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドがRNAである。同様に、キメラ型の二本鎖分子も、標的遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有している限り、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAから構成されているか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAおよびRNAから構成されているかのいずれかでよい。
二本鎖分子の安定性を向上させるためには、該分子は好ましくはできるだけ多くのDNAを含むことが好ましく、一方、標的遺伝子の発現の阻害を誘導するためには、該分子は、十分な発現阻害を誘導する範囲内でRNAであることが必要とされる。キメラ型の二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流の部分的な領域(すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補的配列に隣接している領域)はRNAである。好ましくは、前記上流の部分的な領域は、センス鎖の5’側(5’末端)およびアンチセンス鎖の3’側(3’末端)を示す。すなわち、好ましい態様において、アンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域の両方は、RNAからなる。例えば、本発明のキメラ型またはハイブリッド型の二本鎖分子は、以下の組合せを含む。
センス鎖:
5’−[−−−DNA−−−]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’
:アンチセンス鎖、
センス鎖:
5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’
:アンチセンス鎖、および
センス鎖:
5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(−−−RNA−−−)−5’
:アンチセンス鎖。
センス鎖:
5’−[−−−DNA−−−]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’
:アンチセンス鎖、
センス鎖:
5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’
:アンチセンス鎖、および
センス鎖:
5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(−−−RNA−−−)−5’
:アンチセンス鎖。
前記上流の部分的な領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはそれに相補的な配列の末端から数えて9〜13個のヌクレオチドからなるドメインである。さらに、このようなキメラ型の二本鎖分子の好ましい例には、ポリヌクレオチドの少なくとも上流の半分の領域(センス鎖の5’側領域およびアンチセンス鎖の3’側領域)がRNAであり、かつ残り半分がDNAである、19〜21ヌクレオチドの鎖長を有するものが含まれる。このようなキメラ型の二本鎖分子において、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖全体がRNAである場合にきわめて高い(US 20050004064)。
本発明において、二本鎖分子は、ショートヘアピンRNA(shRNA)ならびにDNAおよびRNAからなるショートヘアピン(shD/R−NA)などのヘアピンを形成してよい。shRNAまたはshD/R−NAは、RNA干渉を介して遺伝子発現を停止させるのに使用され得る密なヘアピンターンを作り出す、一続きのRNAまたはRNAとDNAとの混合物である。shRNAまたはshD/R−NAは、一本鎖上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、これらの配列はループ配列によって隔てられている。一般に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてdsRNAまたはdsD/R−NAになり、次いでこれらは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に結合される。この複合体は、dsRNAまたはdsD/R−NAの標的配列とマッチするmRNAに結合し、かつ切断する。
本発明に同様に含まれるのは、本明細書において記述される二本鎖核酸分子の一つまたは複数を含むベクター、および該ベクターを含む細胞である。本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖核酸分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合、ベクターが分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖核酸分子の発現に必要な調節要素を含む。本発明のそのようなベクターは、本二本鎖核酸分子を産生するために、またはがんを治療するための活性成分として直接的に使用することができる。
具体的には、本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方を含むベクターを提供し、ここで、センス鎖核酸はSEQ ID NO:20または21のヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖は該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物は互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ当該ベクターは、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する。
あるいは、本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含むベクターを提供し、ここで、センス鎖核酸はSEQ ID NO:20または21のヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖核酸はセンス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物は互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ当該ベクターは、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、長さが約19〜25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:39または41のヌクレオチド配列由来の隣接ヌクレオチド)である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有し、式中[A]はSEQ ID NO:20または21を含むヌクレオチド配列であり;[B]は約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。
本発明のベクターは、例えば、両鎖の発現を(DNA分子の転写によって)可能にする形でLGN/GPSM2配列に調節配列が機能的に連結されるようにLGN/GPSM2配列を発現ベクターにクローニングすることにより作出することができる(Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5)。例えば、mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子が第一のプロモーター(例えば、クローニングDNAの3’末端に隣接するプロモーター配列)により転写され、mRNAに対してセンス鎖であるRNA分子が第二のプロモーター(例えば、クローニングDNAの5’末端に隣接するプロモーター配列)により転写される。センス鎖およびアンチセンス鎖がインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖核酸分子構築物を作出する。あるいは、二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする二つのベクター構築物を利用して、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現させ、次いで、二本鎖核酸分子構築物を形成させる。さらに、クローニング配列は、二次構造(例えば、ヘアピン)を有する構築物をコードすることができる。すなわち、ベクターの単一転写産物は、標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列を両方含む。
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定な挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる(例えば、相同的組み換えカセットベクターの記述についてはThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8;米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;および国際公開公報第98/04720号を参照されたい。DNAに基づく送達技術の例としては「裸のDNA」、促進性(ブピバカイン(bupivicaine)、重合体、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が挙げられる(例えば、米国特許第5,922,687号を参照のこと)。
本発明のベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターでありうる。発現ベクターの例としては、牛痘または鶏痘のような、弱毒化ウイルス宿主が挙げられる(例えば、米国特許第4,722,848号を参照のこと)。このアプローチは、例えば、二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞へ導入すると、組み換え牛痘ウイルスは該分子を発現し、それによって該細胞の増殖を抑制する。使用可能なベクターの別の例としてはカルメットゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin;BCG)が挙げられる。BCGベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記述されている。多種多様な他のベクターが、二本鎖核酸分子の治療的投与および産生に有用である。例としてはアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなどが挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
以下において、実施例を参照して、本発明をさらに詳細に記述する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は本発明の局面を例証するにすぎず、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。したがって、本明細書において記述されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。
I.材料および方法
1.細胞株および乳がん臨床試料
ヒト乳がん細胞株HCC1937、MCF−7、MDA−MB−231、SK−BR−3、T47D、YMB−1、BT20、BT474、HBL100、HCC1395、MDA−MB−157、HCC1599、ZR−75−1、HCC1143、HCC1500、MDA−MB−453、およびOCUB−Fならびにヒト胎児腎臓HEK293細胞は米国微生物株保存機関(American Type Culture Collection;ATCC,Rockville,MD,USA)から購入した。HMECはCambrex Bio Science Walkersville Inc.(CAMBREX,Walkersville,MD,USA)から購入した。HBC4、HBC5、およびBSY−1細胞株は財団法人がん研究会がん化学療法センター分子薬理部の矢守隆夫博士から親切にも提供していただいた。細胞は全て、既報のように培養した(Park JH et al., Cancer Res. 2006, 66:9186-9195、Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9:R17、Shimo A et al., Cancer cells. 2007,98:174-181)。手術で摘出された乳がん由来の組織試料および対応するその臨床情報は、書面によるインフォームドコンセントを得た後で東京のがん研究会附属病院乳腺外科から得た。
1.細胞株および乳がん臨床試料
ヒト乳がん細胞株HCC1937、MCF−7、MDA−MB−231、SK−BR−3、T47D、YMB−1、BT20、BT474、HBL100、HCC1395、MDA−MB−157、HCC1599、ZR−75−1、HCC1143、HCC1500、MDA−MB−453、およびOCUB−Fならびにヒト胎児腎臓HEK293細胞は米国微生物株保存機関(American Type Culture Collection;ATCC,Rockville,MD,USA)から購入した。HMECはCambrex Bio Science Walkersville Inc.(CAMBREX,Walkersville,MD,USA)から購入した。HBC4、HBC5、およびBSY−1細胞株は財団法人がん研究会がん化学療法センター分子薬理部の矢守隆夫博士から親切にも提供していただいた。細胞は全て、既報のように培養した(Park JH et al., Cancer Res. 2006, 66:9186-9195、Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9:R17、Shimo A et al., Cancer cells. 2007,98:174-181)。手術で摘出された乳がん由来の組織試料および対応するその臨床情報は、書面によるインフォームドコンセントを得た後で東京のがん研究会附属病院乳腺外科から得た。
2.半定量的RT−PCR
Rneasy Miniキット(Qiagen,Valencia,CA,USA)を用いて、顕微解剖された乳がん臨床試料、顕微解剖された正常乳管細胞および乳がん細胞株のそれぞれから全RNAを抽出し、Takara Clontech(Kyoto,Japan)から購入した乳腺からポリ(A)+RNAを既述(Nishidate et al., Int J Oncol 2004, 25:797-819)のように単離した。その後、T7に基づく増幅および逆転写を既述(Nishidate et al., Int J Oncol 2004, 25:797-819)のように行った。定量対照としてβ−アクチンをモニタリングすることにより、その後のPCRのために各一本鎖cDNAの好適な希釈物を調製した。特異的なプライマー配列は以下の通りである:
Hs.659320の場合
5’−GGCACGTAAGTAACACTTCCTGG−3’(SEQ ID NO:1)および5’−GTTACAGGCACTTACGGGAACC−3’(SEQ ID NO:2)、
LGN/GPSM2の場合
5’−CCAGTTGGGCAATGCTTATT−3’(SEQ ID NO:3)および5’−CTCTTGCTTCTCCCACCTTG−3’(SEQ ID NO:4)、
β2−ミクログロブリン(β2MG)の場合
5’−TTAGCTGTGCTCGCGCTACT−3’(SEQ ID NO:5)および5’−TCACATGGTTCACACGGCAG−3’(SEQ ID NO:6)、
β−アクチンの場合
5’−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3’(SEQ ID NO:7)および5’−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3’(SEQ ID NO:8)。
Rneasy Miniキット(Qiagen,Valencia,CA,USA)を用いて、顕微解剖された乳がん臨床試料、顕微解剖された正常乳管細胞および乳がん細胞株のそれぞれから全RNAを抽出し、Takara Clontech(Kyoto,Japan)から購入した乳腺からポリ(A)+RNAを既述(Nishidate et al., Int J Oncol 2004, 25:797-819)のように単離した。その後、T7に基づく増幅および逆転写を既述(Nishidate et al., Int J Oncol 2004, 25:797-819)のように行った。定量対照としてβ−アクチンをモニタリングすることにより、その後のPCRのために各一本鎖cDNAの好適な希釈物を調製した。特異的なプライマー配列は以下の通りである:
Hs.659320の場合
5’−GGCACGTAAGTAACACTTCCTGG−3’(SEQ ID NO:1)および5’−GTTACAGGCACTTACGGGAACC−3’(SEQ ID NO:2)、
LGN/GPSM2の場合
5’−CCAGTTGGGCAATGCTTATT−3’(SEQ ID NO:3)および5’−CTCTTGCTTCTCCCACCTTG−3’(SEQ ID NO:4)、
β2−ミクログロブリン(β2MG)の場合
5’−TTAGCTGTGCTCGCGCTACT−3’(SEQ ID NO:5)および5’−TCACATGGTTCACACGGCAG−3’(SEQ ID NO:6)、
β−アクチンの場合
5’−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3’(SEQ ID NO:7)および5’−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3’(SEQ ID NO:8)。
3.cDNAの単離およびDNA配列決定
cDNAマイクロアレイにて調べた浸潤性乳がんの大部分で過剰発現されていた遺伝子のうち、一つのクローンFLJ20046(UniGeneアクセッション番号Hs.659320(SEQ ID NO:38))に焦点を合わせた。転写産物の全長cDNAを得るため、SMART RACE cDNA増幅キット(Clontech)を供給元の推奨に従って用いて5’−RACE(cDNA末端の迅速増幅)−PCRを行った。オリゴdTプライマーおよびアダプター配列SMARTIIAオリゴ
(5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG−3’(SEQ ID NO:9))
を用いて乳がん細胞株MDA−MB−231 mRNAからcDNA鋳型を合成した。ユニバーサルプライマーミックス(ロングプライマー;
5’−CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(SEQ ID NO:10)
およびショートプライマー;
5’−CTAATACGACTCACTATAGGGC−3’(SEQ ID NO:11)
)ならびに遺伝子特異的プライマー;
(5’−AACTGCAGACAGGACATCAGTCAGCA−3’(SEQ ID NO:12))
を用いて、94℃5秒間、68℃10秒間、および72℃3分間の25サイクルでRACE PCRを行った。ネスト化ユニバーサルプライマー
(5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(SEQ ID NO:13))
およびネスト化遺伝子特異的プライマー
(5’−GCAGACTTCACAGACATCAGGTGTCC−3’(SEQ ID NO:14))
を用いて、94℃5秒間、68℃10秒間、および72℃3分間の20サイクルでPCR産物をネスト化PCRに供した。ネスト化PCR産物をゲル抽出し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定した。DNA配列をDNA配列決定(ABI3700,PE Applied Biosystems,Foster,CA)によって確認した。得られた配列をクエリ配列として用いて、BLASTデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)をスクリーニングした。
cDNAマイクロアレイにて調べた浸潤性乳がんの大部分で過剰発現されていた遺伝子のうち、一つのクローンFLJ20046(UniGeneアクセッション番号Hs.659320(SEQ ID NO:38))に焦点を合わせた。転写産物の全長cDNAを得るため、SMART RACE cDNA増幅キット(Clontech)を供給元の推奨に従って用いて5’−RACE(cDNA末端の迅速増幅)−PCRを行った。オリゴdTプライマーおよびアダプター配列SMARTIIAオリゴ
(5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG−3’(SEQ ID NO:9))
を用いて乳がん細胞株MDA−MB−231 mRNAからcDNA鋳型を合成した。ユニバーサルプライマーミックス(ロングプライマー;
5’−CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(SEQ ID NO:10)
およびショートプライマー;
5’−CTAATACGACTCACTATAGGGC−3’(SEQ ID NO:11)
)ならびに遺伝子特異的プライマー;
(5’−AACTGCAGACAGGACATCAGTCAGCA−3’(SEQ ID NO:12))
を用いて、94℃5秒間、68℃10秒間、および72℃3分間の25サイクルでRACE PCRを行った。ネスト化ユニバーサルプライマー
(5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(SEQ ID NO:13))
およびネスト化遺伝子特異的プライマー
(5’−GCAGACTTCACAGACATCAGGTGTCC−3’(SEQ ID NO:14))
を用いて、94℃5秒間、68℃10秒間、および72℃3分間の20サイクルでPCR産物をネスト化PCRに供した。ネスト化PCR産物をゲル抽出し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定した。DNA配列をDNA配列決定(ABI3700,PE Applied Biosystems,Foster,CA)によって確認した。得られた配列をクエリ配列として用いて、BLASTデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)をスクリーニングした。
4.ノーザンブロット分析
乳がん細胞株に対するノーザンブロット膜を既述(Park JH et al., Cancer Res. 2006 66:9186-9195)のように調製した。RT−PCRによって調製した[α−32P]−dCTP標識された特異的プローブとヒトマルチプルティッシュノーザンブロット(Takara Clontech)をハイブリダイズさせた(下記参照)。供給元の推奨に従ってプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用い、−80℃で7日間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。以下のプライマーセットを用いてRT−PCRによりGPSM2に特異的なプローブを調製した。Hs.659320(プローブ1)の場合には
5’−GGCACGTAAGTAACACTTCCTGG−3’(SEQ ID NO:15)および5’−GTTACAGGCACTTACGGGAACC−3’(SEQ ID NO:16)
であり、LGN/GPSM2コード領域(Ex8−15)の場合には
5’−GGCCATTGATTATCATCTGAAGC−3’(SEQ ID NO:17)および5’−TCCTTACCGTGTTTGAAAGGAA−3’(SEQ ID NO:18)
であった。
乳がん細胞株に対するノーザンブロット膜を既述(Park JH et al., Cancer Res. 2006 66:9186-9195)のように調製した。RT−PCRによって調製した[α−32P]−dCTP標識された特異的プローブとヒトマルチプルティッシュノーザンブロット(Takara Clontech)をハイブリダイズさせた(下記参照)。供給元の推奨に従ってプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用い、−80℃で7日間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。以下のプライマーセットを用いてRT−PCRによりGPSM2に特異的なプローブを調製した。Hs.659320(プローブ1)の場合には
5’−GGCACGTAAGTAACACTTCCTGG−3’(SEQ ID NO:15)および5’−GTTACAGGCACTTACGGGAACC−3’(SEQ ID NO:16)
であり、LGN/GPSM2コード領域(Ex8−15)の場合には
5’−GGCCATTGATTATCATCTGAAGC−3’(SEQ ID NO:17)および5’−TCCTTACCGTGTTTGAAAGGAA−3’(SEQ ID NO:18)
であった。
5.プラスミドおよびオリゴヌクレオチドsiRNA
LGN/GPSM2に特異的なsiRNAを発現するプラスミドは、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクター(Shimokawa T et al., Cancer Res. 2003 63:6116-6120)にクローニングすることによって調製した。siRNAのためのオリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りである:
対照SCR(5Sおよび16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ(Euglena gracilis)遺伝子)の場合には
5’−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3’(SEQ ID NO:19)、
si#1の場合には
5’−GCATGAGAGAAGACCATTC−3’(SEQ ID NO:20)、
si#2の場合には
5’−GGACGTGCCTTTGGAAATC−3’(SEQ ID NO:21)、
si#1−mm(下線はミスマッチ配列を示す)の場合には
5’−TCATGCGAGCAGACCATTC−3’(SEQ ID NO:22)
ならびにsi#1−scrambleの場合には
5’− TCAACATGAGGAGACAGTC−3’(SEQ ID NO:23)。
37℃で30分間T4−ポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベーションし、その後、煮沸し、続いて室温にまで徐冷して二つのオリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、相補的オリゴヌクレオチドをそれぞれリン酸化した。各産物をpsiU6BX3.0へと連結して、LGN/GPSM2−siRNA発現ベクターを構築した。各ベクターの遺伝子サイレンシング効果を、GPSM2/LGN特異的プライマー
5’−CCAGTTGGGCAATGCTTATT−3’(SEQ ID NO:24)および5’−CTCTTGCTTCTCCCACCTTG−3’(SEQ ID NO:25)
を用いて半定量的RT−PCRにより検証した。
LGN/GPSM2に特異的なsiRNAを発現するプラスミドは、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクター(Shimokawa T et al., Cancer Res. 2003 63:6116-6120)にクローニングすることによって調製した。siRNAのためのオリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りである:
対照SCR(5Sおよび16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ(Euglena gracilis)遺伝子)の場合には
5’−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3’(SEQ ID NO:19)、
si#1の場合には
5’−GCATGAGAGAAGACCATTC−3’(SEQ ID NO:20)、
si#2の場合には
5’−GGACGTGCCTTTGGAAATC−3’(SEQ ID NO:21)、
si#1−mm(下線はミスマッチ配列を示す)の場合には
5’−TCATGCGAGCAGACCATTC−3’(SEQ ID NO:22)
ならびにsi#1−scrambleの場合には
5’− TCAACATGAGGAGACAGTC−3’(SEQ ID NO:23)。
37℃で30分間T4−ポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベーションし、その後、煮沸し、続いて室温にまで徐冷して二つのオリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、相補的オリゴヌクレオチドをそれぞれリン酸化した。各産物をpsiU6BX3.0へと連結して、LGN/GPSM2−siRNA発現ベクターを構築した。各ベクターの遺伝子サイレンシング効果を、GPSM2/LGN特異的プライマー
5’−CCAGTTGGGCAATGCTTATT−3’(SEQ ID NO:24)および5’−CTCTTGCTTCTCCCACCTTG−3’(SEQ ID NO:25)
を用いて半定量的RT−PCRにより検証した。
GPSM2発現ベクターを構築するため、GPSM2 cDNAのコード配列全体を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した;
5’−ATGCATGCCTCGAGTTATGAGAGAAGACCATTCTTTTCATG−3’(SEQ ID NO:26)および5’−ACGTACGTGACTCGAGCTAATGGTCTGCCGATTTTTTCCC−3’(SEQ ID NO:27)
(下線は制限酵素部位を示す)。PCR産物をpCAGGSnHA発現ベクターのXhoI部位にN末端HAタグとインフレームで挿入した。Tet−Off誘導系により制御されるGPSM2発現ベクターを構築するため、以下のプライマー;
5’−ATGCATGCGCTAGCAAGCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGAGGAGGAGGAAGAGAAGACCATTCTTTTCATGTT−3’(SEQ ID NO:28)、5’−ATGCATGCGATATCCTAATGGTCTGCCGATTTTTTCC−3’(SEQ ID NO:29)
および鋳型としてpCAGGSnHA−GPSM2を用いて、HAタグの付いたGPSM2をPCR増幅した。PCR産物をpTRE2ベクター(Clontech)のNheIおよびEcoRV部位に挿入した。
5’−ATGCATGCCTCGAGTTATGAGAGAAGACCATTCTTTTCATG−3’(SEQ ID NO:26)および5’−ACGTACGTGACTCGAGCTAATGGTCTGCCGATTTTTTCCC−3’(SEQ ID NO:27)
(下線は制限酵素部位を示す)。PCR産物をpCAGGSnHA発現ベクターのXhoI部位にN末端HAタグとインフレームで挿入した。Tet−Off誘導系により制御されるGPSM2発現ベクターを構築するため、以下のプライマー;
5’−ATGCATGCGCTAGCAAGCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGAGGAGGAGGAAGAGAAGACCATTCTTTTCATGTT−3’(SEQ ID NO:28)、5’−ATGCATGCGATATCCTAATGGTCTGCCGATTTTTTCC−3’(SEQ ID NO:29)
および鋳型としてpCAGGSnHA−GPSM2を用いて、HAタグの付いたGPSM2をPCR増幅した。PCR産物をpTRE2ベクター(Clontech)のNheIおよびEcoRV部位に挿入した。
大腸菌(E.coli)における全長GPSM2発現ベクターの構築のため、以下のプライマー;
5’−ATGCATGCCATATGAGAGAAGACCATTCTTTTCATGTTC−3’(SEQ ID NO:30)および5’−ACGTACGTGACTCGAGATGGTCTGCCGATTTTTTCCCTGA−3’(SEQ ID NO:31)
を用いてGPSM2のコード配列全体をPCR増幅し、pET28aベクター(Novagen)のNdeIおよびXhoI部位にPCR産物を挿入した。
5’−ATGCATGCCATATGAGAGAAGACCATTCTTTTCATGTTC−3’(SEQ ID NO:30)および5’−ACGTACGTGACTCGAGATGGTCTGCCGATTTTTTCCCTGA−3’(SEQ ID NO:31)
を用いてGPSM2のコード配列全体をPCR増幅し、pET28aベクター(Novagen)のNdeIおよびXhoI部位にPCR産物を挿入した。
TRIOBP発現ベクターの構築のため、以下のプライマー;
5’−ATGCATGCGAATTCGGCGGATGGAAGGGGCCGG−3’(SEQ ID NO:32)および5’−ATGCATGCCTCGAGCTACTCAGCCAGGCTGTTGCG−3’(SEQ ID NO:33)
を用いてTRIOBPアイソフォーム1のコード配列全体をPCR増幅し、PCR産物をpCAGGSn3FベクターにN末端3xFLAGとインフレームで挿入した。PBK/TOPK発現ベクターはJ.H.−Park博士によって作出された(Park JH et al.,Cancer Res.2006 66:9186−9195)。全ての構築物のDNA配列をDNA配列決定(ABI3700,PE Applied Biosystems,Foster,CA)によって確認した。
5’−ATGCATGCGAATTCGGCGGATGGAAGGGGCCGG−3’(SEQ ID NO:32)および5’−ATGCATGCCTCGAGCTACTCAGCCAGGCTGTTGCG−3’(SEQ ID NO:33)
を用いてTRIOBPアイソフォーム1のコード配列全体をPCR増幅し、PCR産物をpCAGGSn3FベクターにN末端3xFLAGとインフレームで挿入した。PBK/TOPK発現ベクターはJ.H.−Park博士によって作出された(Park JH et al.,Cancer Res.2006 66:9186−9195)。全ての構築物のDNA配列をDNA配列決定(ABI3700,PE Applied Biosystems,Foster,CA)によって確認した。
siRNAオリゴヌクレオチド(Sigma Aldrich Japan KK,Tokyo,Japan)を用いて、細胞周期および増殖に及ぼすLGN/GPSM2のノックダウン効果をさらに検証した。各遺伝子を標的化する配列は以下の通りであった:
siEGFP(対照)の場合には
5’−GAAGCAGCACGACUUCUUC−3’(SEQ ID NO:34)(センス)および5’−GAAGAAGUCGUGCUGCUUC−3’(SEQ ID NO:35)(アンチセンス)、
siLGN/GPSM2の場合には
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−3’(SEQ ID NO:36)(センス)および5’−GAUUUCCAAAGGCACGUCC−3’(SEQ ID NO:37)(アンチセンス)。
PBK/TOPKを標的化するsiRNAの配列は既述されている(Park JH et al.,Cancer Res.2006 66:9186−9195)。
siEGFP(対照)の場合には
5’−GAAGCAGCACGACUUCUUC−3’(SEQ ID NO:34)(センス)および5’−GAAGAAGUCGUGCUGCUUC−3’(SEQ ID NO:35)(アンチセンス)、
siLGN/GPSM2の場合には
5’−GGACGUGCCUUUGGAAAUC−3’(SEQ ID NO:36)(センス)および5’−GAUUUCCAAAGGCACGUCC−3’(SEQ ID NO:37)(アンチセンス)。
PBK/TOPKを標的化するsiRNAの配列は既述されている(Park JH et al.,Cancer Res.2006 66:9186−9195)。
6.ウエスタンブロット分析
0.1%プロテアーゼインヒビターカクテルIII(Calbiochem,San Diego,CA,USA)を含有するRIPA緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、1% Nonidet P−40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mMフッ化ナトリウム、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム,pH8.0)で細胞を溶解した。均質化の後、細胞溶解物を氷上で30分間インキュベートし、14,000rpmで15分間遠心分離して、細胞片から上清を分離した。総タンパク質の量をプロテインアッセイキット(Bio−Rad,Hercules,CA)によって推定し、次いで細胞溶解物をSDS試料用緩衝液と混合し、SDS−ポリアクリルアミドゲル(Bio−Rad)に負荷する前に3分間煮沸した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜(GE Healthcare,Buckinghamshire,United Kingdom)にブロットした。4%のBlockAceブロッキング溶液(Dainippon Pharmaceutical.Co.,Ltd,Osaka,Japan)でブロッキングした後に、膜を下記のように一次抗体とともにインキュベートした。最後に、膜をHRP結合二次抗体(10000分の1希釈;GE Healthcare)とともにインキュベートし、タンパク質をECL検出試薬(GE Healthcare)によって可視化した。β−アクチンを負荷対照として使用した。使用した一次抗体は以下の通りである;β−アクチン(30000分の1希釈;クローンAC−15,Sigma−Aldrich)、抗GPSM2ウサギポリクローナル抗体(500分の1希釈;ProteinTech,Chicago,IL,USA)。
0.1%プロテアーゼインヒビターカクテルIII(Calbiochem,San Diego,CA,USA)を含有するRIPA緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、1% Nonidet P−40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mMフッ化ナトリウム、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム,pH8.0)で細胞を溶解した。均質化の後、細胞溶解物を氷上で30分間インキュベートし、14,000rpmで15分間遠心分離して、細胞片から上清を分離した。総タンパク質の量をプロテインアッセイキット(Bio−Rad,Hercules,CA)によって推定し、次いで細胞溶解物をSDS試料用緩衝液と混合し、SDS−ポリアクリルアミドゲル(Bio−Rad)に負荷する前に3分間煮沸した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜(GE Healthcare,Buckinghamshire,United Kingdom)にブロットした。4%のBlockAceブロッキング溶液(Dainippon Pharmaceutical.Co.,Ltd,Osaka,Japan)でブロッキングした後に、膜を下記のように一次抗体とともにインキュベートした。最後に、膜をHRP結合二次抗体(10000分の1希釈;GE Healthcare)とともにインキュベートし、タンパク質をECL検出試薬(GE Healthcare)によって可視化した。β−アクチンを負荷対照として使用した。使用した一次抗体は以下の通りである;β−アクチン(30000分の1希釈;クローンAC−15,Sigma−Aldrich)、抗GPSM2ウサギポリクローナル抗体(500分の1希釈;ProteinTech,Chicago,IL,USA)。
7.蛍光活性化細胞選別分析
T47D細胞の細胞周期を、以下の二通りの異なる処理方法によって同調させた;細胞周期をG1期に同調させるため、細胞を1mcg/mlのアフィジコリン(Sigma−Aldrich)で16時間処理した。その後、細胞を3時間ごとに24時間まで回収した。細胞周期を分裂期に同調させるため、細胞を0.3mcg/mlのノコダゾール(Sigma−Aldrich)とともに18時間インキュベートした後に、穏やかに振盪して、比較的付着していない有糸分裂細胞を切り離した。収集された細胞をプレートに再播種し、各時点(0、0.5、1、1.5、2、4、および6時間)で回収した。細胞を−20℃で終夜70%エタノールにより固定した。次いで、細胞を37℃で30分間1mg/mlのRNase Aとともにインキュベートし、50mcg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。各時点での細胞のDNA含量をFACSCalibur(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)によって分析した。
T47D細胞の細胞周期を、以下の二通りの異なる処理方法によって同調させた;細胞周期をG1期に同調させるため、細胞を1mcg/mlのアフィジコリン(Sigma−Aldrich)で16時間処理した。その後、細胞を3時間ごとに24時間まで回収した。細胞周期を分裂期に同調させるため、細胞を0.3mcg/mlのノコダゾール(Sigma−Aldrich)とともに18時間インキュベートした後に、穏やかに振盪して、比較的付着していない有糸分裂細胞を切り離した。収集された細胞をプレートに再播種し、各時点(0、0.5、1、1.5、2、4、および6時間)で回収した。細胞を−20℃で終夜70%エタノールにより固定した。次いで、細胞を37℃で30分間1mg/mlのRNase Aとともにインキュベートし、50mcg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。各時点での細胞のDNA含量をFACSCalibur(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)によって分析した。
8.λタンパク質ホスファターゼアッセイ法
細胞を溶解用緩衝液(50mM Tris−HCl、0.5% Igepal、0.5% TritonX−100、2%グリセロール、150mM NaCl、0.2%プロテアーゼインヒビターカクテルセットIII(Calbiochem)、pH7.4)で溶解した。タンパク質10mcgのアリコートに2mM MnCl2を加え、これを800単位のλタンパク質ホスファターゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)または25mMのフッ化ナトリウムとともに30℃で60分間インキュベートした。SDS試料用緩衝液の添加によってインキュベーションを終結し、試料を3分間煮沸し、ウエスタンブロット分析の項で記述した方法に従ってウエスタンブロット分析に供した。
細胞を溶解用緩衝液(50mM Tris−HCl、0.5% Igepal、0.5% TritonX−100、2%グリセロール、150mM NaCl、0.2%プロテアーゼインヒビターカクテルセットIII(Calbiochem)、pH7.4)で溶解した。タンパク質10mcgのアリコートに2mM MnCl2を加え、これを800単位のλタンパク質ホスファターゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)または25mMのフッ化ナトリウムとともに30℃で60分間インキュベートした。SDS試料用緩衝液の添加によってインキュベーションを終結し、試料を3分間煮沸し、ウエスタンブロット分析の項で記述した方法に従ってウエスタンブロット分析に供した。
9.細胞のトランスフェクションおよび処理
FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を製造元の推奨に従って用いて、T47D細胞およびHEK293細胞に発現ベクター構築物をトランスフェクトした。リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いてBT20細胞に発現ベクターをトランスフェクトした。リポフェクトアミンRNAiMAX試薬(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、T47D細胞にsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。Tet−Off系の制御下でHA−LGN/GPSM2を安定的に過剰発現する細胞株の樹立のため、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて、MCF7 Tet−Off細胞(Invitrogen)にpTRE2−HA−LGN/GPSM2をトランスフェクトした。0.4mg/mlのハイグロマイシン(Sigma)および1mcg/mlのドキシサイクリン(Doxycuclin)を含有する培地中でトランスフェクト細胞をインキュベートした。3週間後、個々のコロニー120個を限界希釈によって選択し、HA−LGN/GPSM2を安定的に過剰発現するクローンについてスクリーニングした。ドキシサイクリン不含培地中での5日間のインキュベーションによってHA−LGN/GPSM2の発現を誘導し、抗HAモノクローナル抗体(Roche)を用いたウエスタンブロットおよび免疫細胞化学的染色分析によって各クローンにおけるHA−LGN/GPSM2の発現レベルを調べた。
FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を製造元の推奨に従って用いて、T47D細胞およびHEK293細胞に発現ベクター構築物をトランスフェクトした。リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いてBT20細胞に発現ベクターをトランスフェクトした。リポフェクトアミンRNAiMAX試薬(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、T47D細胞にsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。Tet−Off系の制御下でHA−LGN/GPSM2を安定的に過剰発現する細胞株の樹立のため、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて、MCF7 Tet−Off細胞(Invitrogen)にpTRE2−HA−LGN/GPSM2をトランスフェクトした。0.4mg/mlのハイグロマイシン(Sigma)および1mcg/mlのドキシサイクリン(Doxycuclin)を含有する培地中でトランスフェクト細胞をインキュベートした。3週間後、個々のコロニー120個を限界希釈によって選択し、HA−LGN/GPSM2を安定的に過剰発現するクローンについてスクリーニングした。ドキシサイクリン不含培地中での5日間のインキュベーションによってHA−LGN/GPSM2の発現を誘導し、抗HAモノクローナル抗体(Roche)を用いたウエスタンブロットおよび免疫細胞化学的染色分析によって各クローンにおけるHA−LGN/GPSM2の発現レベルを調べた。
10.細胞成長アッセイ法
psiU6プラスミドをトランスフェクトしたT47D細胞およびBT20細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含有する培地中で維持した。10日後にCell−counting kit8(Dojindo)を用いて、MTTアッセイ法により細胞生存性を測定した。コロニー形成アッセイ法のため、細胞をジェネティシン選択から14日後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、ギムザ溶液で染色した。pCAGGSnHA−LGN/GPSM2ベクターをトランスフェクトしたCOS−7細胞の細胞成長をトランスフェクションから4〜5日後にMTTアッセイ法によって測定した。
psiU6プラスミドをトランスフェクトしたT47D細胞およびBT20細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含有する培地中で維持した。10日後にCell−counting kit8(Dojindo)を用いて、MTTアッセイ法により細胞生存性を測定した。コロニー形成アッセイ法のため、細胞をジェネティシン選択から14日後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、ギムザ溶液で染色した。pCAGGSnHA−LGN/GPSM2ベクターをトランスフェクトしたCOS−7細胞の細胞成長をトランスフェクションから4〜5日後にMTTアッセイ法によって測定した。
11.免疫細胞化学的染色
T47D細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(−)で室温にて15分間固定し、0.1% TritonX−100を含有するPBS(−)で室温にて2分間透過させた。その後、細胞をPBS(−)中3%のウシ血清アルブミンで室温にて1時間覆って非特異的なハイブリダイゼーションをブロッキングし、その後、100分の1希釈の抗GPSM2ウサギポリクローナル抗体(Proteintech)および100分の1希釈の抗α−チューブリンマウスモノクローナル抗体(T6199:Sigma)と室温で1時間インキュベーションした。PBS(−)で洗浄した後、細胞を1000分の1希釈のAlexa594結合抗ウサギ二次抗体およびAlexa488結合抗マウス二次抗体(molecular Probe,Eugene,OR,USA)により室温で1時間染色した。F−アクチンを100分の1希釈のAlexa488結合ファロイジンで室温で1時間染色した。核を4’,6’−ジアミジン−2’−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で対比染色した。TCS SP2 AOBS顕微鏡(Leica,Tokyo,Japan)下で蛍光像を得た。
T47D細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(−)で室温にて15分間固定し、0.1% TritonX−100を含有するPBS(−)で室温にて2分間透過させた。その後、細胞をPBS(−)中3%のウシ血清アルブミンで室温にて1時間覆って非特異的なハイブリダイゼーションをブロッキングし、その後、100分の1希釈の抗GPSM2ウサギポリクローナル抗体(Proteintech)および100分の1希釈の抗α−チューブリンマウスモノクローナル抗体(T6199:Sigma)と室温で1時間インキュベーションした。PBS(−)で洗浄した後、細胞を1000分の1希釈のAlexa594結合抗ウサギ二次抗体およびAlexa488結合抗マウス二次抗体(molecular Probe,Eugene,OR,USA)により室温で1時間染色した。F−アクチンを100分の1希釈のAlexa488結合ファロイジンで室温で1時間染色した。核を4’,6’−ジアミジン−2’−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で対比染色した。TCS SP2 AOBS顕微鏡(Leica,Tokyo,Japan)下で蛍光像を得た。
12.ブロモデオキシウリジン取り込みアッセイ法
LGN/GPSM2を発現するように設計されたプラスミドまたはモックプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞を、10μmol/Lのブロモデオキシウリジン(BrdUrd)とともに10% FCSを含有するDMEM中で培養した。これらの細胞を24時間インキュベートし、固定した;市販のキット(Cell Proliferation ELISA,BrdUrd;Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)を製造元の推奨に従って用いて、取り込まれたBrdUrdを測定した。
LGN/GPSM2を発現するように設計されたプラスミドまたはモックプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞を、10μmol/Lのブロモデオキシウリジン(BrdUrd)とともに10% FCSを含有するDMEM中で培養した。これらの細胞を24時間インキュベートし、固定した;市販のキット(Cell Proliferation ELISA,BrdUrd;Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)を製造元の推奨に従って用いて、取り込まれたBrdUrdを測定した。
13.免疫沈降
MCF7/Tet−OFF−HA−LGN/GPSM2細胞をドキシサイクリン不含培地中で5日間インキュベートして、HA−LGN/GPSM2のタンパク質発現を誘導した。対照として、同一の細胞をドキシサイクリン含有培地中で維持して、発現を抑制した。続いて、細胞を1mcg/mlのアフィジコリンで16時間同調させ、その後、10時間アフィジコリン不含培地中で解放してG2/M期細胞を濃縮した。細胞を免疫沈降用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1% NP−40、1mM Na3VO4、1mM NaF、0.1%プロテアーゼインヒビターカクテルIII,pH7.5)中で溶解し、続いて抗HA抗体アガロース結合体(Sigma)とのインキュベーションを行った。結合したタンパク質をHA−ペプチドで溶出し、SDS−PAGEに供し、銀染色DAIICHI(Daiichi Pure Chemicals,Tokyo,Japan)で染色した。HA−LGN/GPSM2誘導細胞からの免疫沈降産物で見られたおよそ55 kDaのバンドを抽出した。そのペプチド配列をMALDI−TOF質量分析(Shimazu)によって決定した。共免疫沈降分析のため、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を用いてHEK293細胞にpCAGGSnHA−GPSM2ベクター、pCAGGSn3F−TRIOBPベクター、pCAGGSn3F−PBK/TOPKベクターまたは空ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、免疫沈降用緩衝液中で溶解し、上記のように抗HAアガロース結合体を用いて免疫沈降した。結合したタンパク質をHA−ペプチドで溶出し、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによって分析した。
MCF7/Tet−OFF−HA−LGN/GPSM2細胞をドキシサイクリン不含培地中で5日間インキュベートして、HA−LGN/GPSM2のタンパク質発現を誘導した。対照として、同一の細胞をドキシサイクリン含有培地中で維持して、発現を抑制した。続いて、細胞を1mcg/mlのアフィジコリンで16時間同調させ、その後、10時間アフィジコリン不含培地中で解放してG2/M期細胞を濃縮した。細胞を免疫沈降用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1% NP−40、1mM Na3VO4、1mM NaF、0.1%プロテアーゼインヒビターカクテルIII,pH7.5)中で溶解し、続いて抗HA抗体アガロース結合体(Sigma)とのインキュベーションを行った。結合したタンパク質をHA−ペプチドで溶出し、SDS−PAGEに供し、銀染色DAIICHI(Daiichi Pure Chemicals,Tokyo,Japan)で染色した。HA−LGN/GPSM2誘導細胞からの免疫沈降産物で見られたおよそ55 kDaのバンドを抽出した。そのペプチド配列をMALDI−TOF質量分析(Shimazu)によって決定した。共免疫沈降分析のため、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を用いてHEK293細胞にpCAGGSnHA−GPSM2ベクター、pCAGGSn3F−TRIOBPベクター、pCAGGSn3F−PBK/TOPKベクターまたは空ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、免疫沈降用緩衝液中で溶解し、上記のように抗HAアガロース結合体を用いて免疫沈降した。結合したタンパク質をHA−ペプチドで溶出し、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによって分析した。
14.Hisタグの付いた組み換えLGN/GPSM2の作出および精製
大腸菌(Escherichia coli)株BL21 codon−plus(DE3)RILコンピテント細胞(Stratagene)をpET28a−LGN/GPSM2で形質転換し、LB培地中で培養した。0.5mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)と25℃で2時間インキュベーションすることでタンパク質発現を誘導した。細菌ペレットを溶解用緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、1% Tween20、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド,pH8.0)中で溶解し、続いてNi−NTA superflow(QIAGEN)を供給元の説明書に従って用いてアフィニティ精製を行った。
大腸菌(Escherichia coli)株BL21 codon−plus(DE3)RILコンピテント細胞(Stratagene)をpET28a−LGN/GPSM2で形質転換し、LB培地中で培養した。0.5mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)と25℃で2時間インキュベーションすることでタンパク質発現を誘導した。細菌ペレットを溶解用緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、1% Tween20、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド,pH8.0)中で溶解し、続いてNi−NTA superflow(QIAGEN)を供給元の説明書に従って用いてアフィニティ精製を行った。
15.GSTタグの付いたLGN/GPSM2の作出および精製
GSTタグの付いたLGN/GPSM2組み換えタンパク質を作出するため、大腸菌株BL21 codon−plus(DE3)RILコンピテント細胞(Stratagene)をpGEX 6P−2−LGN/GPSM2で形質転換し、LB培地中で培養した。1.0mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)と27℃で2時間インキュベーションすることでタンパク質発現を誘導した。細菌ペレットを溶解用緩衝液(適切なプロテアーゼ阻害剤を加えた40mM Tris−HCl、5mM EDTA、0.5% TritonX−100,pH8.0)中で溶解し、続いてGlutathione Sepharose(商標)4B(GE Healthcare)を用いてアフィニティ精製を行った。GST−LGN/GPSM2タンパク質を4℃で1時間Glutathione Sepharose(商標)4Bに結合させ、溶解用緩衝液で5回洗浄した。結合したタンパク質を溶出用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM DTT、5%グリセロール(v/v)、50mMグルタチオン(pH7.5))で溶出し、その後、透析用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM DTT、5%グリセロール(v/v)(pH7.5))に対して透析した。
GSTタグの付いたLGN/GPSM2組み換えタンパク質を作出するため、大腸菌株BL21 codon−plus(DE3)RILコンピテント細胞(Stratagene)をpGEX 6P−2−LGN/GPSM2で形質転換し、LB培地中で培養した。1.0mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)と27℃で2時間インキュベーションすることでタンパク質発現を誘導した。細菌ペレットを溶解用緩衝液(適切なプロテアーゼ阻害剤を加えた40mM Tris−HCl、5mM EDTA、0.5% TritonX−100,pH8.0)中で溶解し、続いてGlutathione Sepharose(商標)4B(GE Healthcare)を用いてアフィニティ精製を行った。GST−LGN/GPSM2タンパク質を4℃で1時間Glutathione Sepharose(商標)4Bに結合させ、溶解用緩衝液で5回洗浄した。結合したタンパク質を溶出用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM DTT、5%グリセロール(v/v)、50mMグルタチオン(pH7.5))で溶出し、その後、透析用緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM DTT、5%グリセロール(v/v)(pH7.5))に対して透析した。
16.インビトロキナーゼアッセイ法
PBK/TOPKアッセイ法については、組み換えPBK/TOPK(Invitrogen)0.4mcgをキナーゼアッセイ用緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、2mMジチオスレイトール、1mM EGTA、0.01% Brij−35、100mcM ATP,pH7.5)15mcl中でインキュベートした。Auroraキナーゼアッセイ法については、組み換えAuroraキナーゼAまたはB(SignalChem)0.05mcgをAuroraキナーゼアッセイ用緩衝液(25mM MOPS、12.5mM β−グリセロール−リン酸、25mM MgCl2、5mM EGTA、2mM EDTA、0.25mMジチオスレイトール、および100mcM ATP,pH7.2)12mcl中でインキュベートした。どちらのアッセイ法でも、試料に5mcCiの[γ−32P]−ATP(Perkin Elmer)を加えた。基質に対し、全長のLGN/GPSM2組み換えタンパク質0.2mcgを反応溶液中に添加した。30℃で60〜120分間のインキュベーションの後、SDS試料用緩衝液の添加によって反応を停止し、抗リン酸化トレオニン抗体(Cell Signaling)を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。あるいは、基質として、GSTタグの付いたLGN/GPSM2組み換えタンパク質1.0mcgを反応溶液中に添加した。30℃で15〜30分間のインキュベーションの後、SDS試料用緩衝液の添加によって反応を停止し、オートラジオグラフィーに供した。
PBK/TOPKアッセイ法については、組み換えPBK/TOPK(Invitrogen)0.4mcgをキナーゼアッセイ用緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、2mMジチオスレイトール、1mM EGTA、0.01% Brij−35、100mcM ATP,pH7.5)15mcl中でインキュベートした。Auroraキナーゼアッセイ法については、組み換えAuroraキナーゼAまたはB(SignalChem)0.05mcgをAuroraキナーゼアッセイ用緩衝液(25mM MOPS、12.5mM β−グリセロール−リン酸、25mM MgCl2、5mM EGTA、2mM EDTA、0.25mMジチオスレイトール、および100mcM ATP,pH7.2)12mcl中でインキュベートした。どちらのアッセイ法でも、試料に5mcCiの[γ−32P]−ATP(Perkin Elmer)を加えた。基質に対し、全長のLGN/GPSM2組み換えタンパク質0.2mcgを反応溶液中に添加した。30℃で60〜120分間のインキュベーションの後、SDS試料用緩衝液の添加によって反応を停止し、抗リン酸化トレオニン抗体(Cell Signaling)を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。あるいは、基質として、GSTタグの付いたLGN/GPSM2組み換えタンパク質1.0mcgを反応溶液中に添加した。30℃で15〜30分間のインキュベーションの後、SDS試料用緩衝液の添加によって反応を停止し、オートラジオグラフィーに供した。
17.ゲル内消化、質量分析
上記のように0.3mcg/mlのノコダゾールを18時間用いて有糸分裂期に同調されたMCF7 Tet−Off細胞からHA−LGN/GPSM2を免疫沈降した。免疫沈降した試料をSDS−PAGEに供し、その後、SimplyBlue(商標)SafeStain(Invitrogen)を用いたクマシー染色に供した。切り出したタンパク質のバンドを50mM重炭酸アンモニウム(Sigma)とともに10mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(Sigma)中で37℃で30分間還元し、50mM重炭酸アンモニウムとともに50mMヨードアセトアミド(Sigma)中で暗所中25℃で45分間アルキル化した。最終酵素用に1:20のタンパク質比までブタトリプシン(Promega)を加えた。37℃で16時間消化を行った。消化物を、HPLC−Chip Cube(Agilent Technologies)を備えた1200 Series Rapid Resolution LC System(Agilent Technologies)に連結したHCTultra−ETD II質量分析計(Bruker Daltonics)で分析した。300nl/分で0.1%ギ酸中アセトニトリル5.4%〜29.2%の35分間の直線勾配を用いてProtein IDチップ#2(40nl濃縮カラムを備えた75m 150mm分析カラム)中で液体クロマトグラフィー分離を行った。MS/MSピークリストをCompassソフトウェア(Bruker Daltonics)によって作出し、タンパク質データベース検索のためローカルのMASCOT検索エンジン2.2.03版(Matrix Science)に出力した。
上記のように0.3mcg/mlのノコダゾールを18時間用いて有糸分裂期に同調されたMCF7 Tet−Off細胞からHA−LGN/GPSM2を免疫沈降した。免疫沈降した試料をSDS−PAGEに供し、その後、SimplyBlue(商標)SafeStain(Invitrogen)を用いたクマシー染色に供した。切り出したタンパク質のバンドを50mM重炭酸アンモニウム(Sigma)とともに10mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(Sigma)中で37℃で30分間還元し、50mM重炭酸アンモニウムとともに50mMヨードアセトアミド(Sigma)中で暗所中25℃で45分間アルキル化した。最終酵素用に1:20のタンパク質比までブタトリプシン(Promega)を加えた。37℃で16時間消化を行った。消化物を、HPLC−Chip Cube(Agilent Technologies)を備えた1200 Series Rapid Resolution LC System(Agilent Technologies)に連結したHCTultra−ETD II質量分析計(Bruker Daltonics)で分析した。300nl/分で0.1%ギ酸中アセトニトリル5.4%〜29.2%の35分間の直線勾配を用いてProtein IDチップ#2(40nl濃縮カラムを備えた75m 150mm分析カラム)中で液体クロマトグラフィー分離を行った。MS/MSピークリストをCompassソフトウェア(Bruker Daltonics)によって作出し、タンパク質データベース検索のためローカルのMASCOT検索エンジン2.2.03版(Matrix Science)に出力した。
18.cDNA突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を二段階突然変異誘発PCRにより行った。本発明者らは以下の突然変異をpCAGGS−nHA−LGN/GPSM2およびpGEX6P−2−LGN/GPSM2において作出した:S401A、T519A、およびS558A。LGN/GPSM2 cDNAにおいて点突然変異を作出するために使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった:
S401Aの場合には
5’−CGCCGGCATGCTATGGAAAATATGG−3’(SEQ ID NO:46)および5’−CCATATTTTCCATAGCATGCCGGCG−3’(SEQ ID NO:47)、
T519Aの場合には
5’−ACTTCTTCCGCTCCCCCTAAAATG−3’(SEQ ID NO:48)および5’−CATTTTAGGGGGAGCGGAAGAAGT−3’(SEQ ID NO:49)、
S558Aの場合には
5’−CAGAGGGCTGCTTTCAGTAATTTG−3’(SEQ ID NO:50)および5’−CAAATTACTGAAAGCAGCCCTCTG−3’(SEQ ID NO:51)
(下線は野生型から置き換えられたヌクレオチドを示す)。
部位特異的突然変異誘発を二段階突然変異誘発PCRにより行った。本発明者らは以下の突然変異をpCAGGS−nHA−LGN/GPSM2およびpGEX6P−2−LGN/GPSM2において作出した:S401A、T519A、およびS558A。LGN/GPSM2 cDNAにおいて点突然変異を作出するために使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった:
S401Aの場合には
5’−CGCCGGCATGCTATGGAAAATATGG−3’(SEQ ID NO:46)および5’−CCATATTTTCCATAGCATGCCGGCG−3’(SEQ ID NO:47)、
T519Aの場合には
5’−ACTTCTTCCGCTCCCCCTAAAATG−3’(SEQ ID NO:48)および5’−CATTTTAGGGGGAGCGGAAGAAGT−3’(SEQ ID NO:49)、
S558Aの場合には
5’−CAGAGGGCTGCTTTCAGTAATTTG−3’(SEQ ID NO:50)および5’−CAAATTACTGAAAGCAGCCCTCTG−3’(SEQ ID NO:51)
(下線は野生型から置き換えられたヌクレオチドを示す)。
実施例を通じて、Genbankアクセッション番号U54999(SEQ ID NO:53)により定義されるアミノ酸配列に従ってLGN/GPSM2のアミノ酸残基の位置を示した。
II.結果
1.乳がん細胞におけるLGN/GPSM2の過剰発現
臨床乳がん15症例中8例で、LGN/GPSM2遺伝子の発現上昇が半定量的RT−PCR分析(図1A)およびcDNAマイクロアレイデータにより確認された(Nishidate T et al., Int J Oncol. 2004 25:797-819)。続くLGN/GPSM2 cDNA断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析から、乳がん細胞株においてLGN/GPSM2のおよそ8kbの転写産物の過剰発現が確認された(図1B)。その一方、cDNAマイクロアレイ分析の結果と一致して、重要臓器のいずれにおいてもLGN/GPSM2発現はほとんど検出することができなかった(図1C)。
1.乳がん細胞におけるLGN/GPSM2の過剰発現
臨床乳がん15症例中8例で、LGN/GPSM2遺伝子の発現上昇が半定量的RT−PCR分析(図1A)およびcDNAマイクロアレイデータにより確認された(Nishidate T et al., Int J Oncol. 2004 25:797-819)。続くLGN/GPSM2 cDNA断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析から、乳がん細胞株においてLGN/GPSM2のおよそ8kbの転写産物の過剰発現が確認された(図1B)。その一方、cDNAマイクロアレイ分析の結果と一致して、重要臓器のいずれにおいてもLGN/GPSM2発現はほとんど検出することができなかった(図1C)。
構築されたLGN/GPSM2のcDNA配列(FLJ20046 fis;AK000053.1;1855bp(SEQ ID NO:38))はノーザンブロット分析によって示された8kbの転写産物よりもはるかに小さかったため、本発明者らは、エキソン連結および5’RACE実験を行い、684アミノ酸のタンパク質をコードする完全なオープンリーディングフレームの配列を含んだ5611ヌクレオチドからなるLGN/GPSM2の部分的cDNA配列(Genebankアクセッション;AB445462(SEQ ID NO:39))を得た(図1D;長い転写産物)。LGN/GPSM2の発現パターンを確認するため、本発明者らは、コード領域に位置付けられるプローブを用いてノーザンブロット分析を行ったところ、乳がん細胞株においておよそ4.0kbの転写産物の過剰発現を見出したことから、この転写産物は、3039ヌクレオチドからなるLGN/GPSM2遺伝子のスプライシング変種(Genebankアクセッション番号NM_013296(SEQ ID NO:41))であることが示された。これらの二つの変種は同じORF配列を共有し、それぞれ、15および16個のエキソンからなっており、V2変種にはエキソン16がなかった。
2.LGN/GPSM2の免疫細胞化学的染色分析
乳がん細胞におけるLGN/GPSM2タンパク質の生物学的役割を特徴付けるため、本発明者らは初めに、T47D細胞を用いて免疫細胞化学的染色分析により内在性LGN/GPSM2の細胞内局在について調べた。図2Aに示されるように、LGN/GPSM2タンパク質は間期細胞中の核および細胞質においてわずかに見られた。核膜の消失後、LGN/GPSM2は染色体の近くに集まった。分裂中期から分裂後期まで、LGN/GPSM2は紡錘体極で微小管と共局在した(図2B)。その後、LGN/GPSM2は分裂後期細胞において中間帯の位置で濃縮され、細胞質分裂細胞の中央体の位置で、微小管との部分的な共局在およびF−アクチンとの完全な共局在を示した(図2C)。T47D細胞と同様に、MDA−MB−231細胞においてもLGN/GPSM2タンパク質の類似の細胞内局在が確認された(データ不掲載)。
乳がん細胞におけるLGN/GPSM2タンパク質の生物学的役割を特徴付けるため、本発明者らは初めに、T47D細胞を用いて免疫細胞化学的染色分析により内在性LGN/GPSM2の細胞内局在について調べた。図2Aに示されるように、LGN/GPSM2タンパク質は間期細胞中の核および細胞質においてわずかに見られた。核膜の消失後、LGN/GPSM2は染色体の近くに集まった。分裂中期から分裂後期まで、LGN/GPSM2は紡錘体極で微小管と共局在した(図2B)。その後、LGN/GPSM2は分裂後期細胞において中間帯の位置で濃縮され、細胞質分裂細胞の中央体の位置で、微小管との部分的な共局在およびF−アクチンとの完全な共局在を示した(図2C)。T47D細胞と同様に、MDA−MB−231細胞においてもLGN/GPSM2タンパク質の類似の細胞内局在が確認された(データ不掲載)。
3.LGN/GPSM2の細胞周期依存的な発現およびリン酸化
LGN/GPSM2は有糸分裂中にさまざまな局在状態にあることが認められたので、内在性LGN/GPSM2タンパク質の細胞周期依存的な変化について詳しく調べた。本発明者らは、アフィジコリン処理によりT47D細胞をG1期で同調し、ウエスタンブロットおよび半定量的RT−PCR分析を行った。これらの結果から、転写レベルおよびタンパク質レベルの両方においてG2/M期(9〜12時間)でLGN/GPSM2タンパク質が最も高い発現を示すことが示された(図3AおよびB)。その後、LGN/GPSM2の発現は、次のG1期の移行直後に、転写レベルでもタンパク質レベルでも減少した。さらに、本発明者らは、LGN/GPSM2がG2/M期中に緩徐に移動するバンドシフトを示すことを見出し、このことは、その翻訳後修飾の可能性を示唆するものであった。より詳細に分裂期中のその発現をさらに調べるため、T47D細胞をノコダゾールで同調し、穏やかに振盪して切り離すことで有糸分裂細胞を収集した。同調された有糸分裂細胞において0から1.5時間にかけて、LGN/GPSM2タンパク質が高い発現および有意なバンドシフトを示すことも確認された(図3CおよびD)。この仮説を明らかにするため、ノコダゾール処理したT47D細胞抽出物を用いてλタンパク質ホスファターゼ分析を行い(材料および方法を参照のこと)、そのシフトバンドがλタンパク質ホスファターゼ処理後に消失することを見出し(図3E)、有糸分裂細胞中でのLGN/GPSM2のリン酸化が示唆された。
LGN/GPSM2は有糸分裂中にさまざまな局在状態にあることが認められたので、内在性LGN/GPSM2タンパク質の細胞周期依存的な変化について詳しく調べた。本発明者らは、アフィジコリン処理によりT47D細胞をG1期で同調し、ウエスタンブロットおよび半定量的RT−PCR分析を行った。これらの結果から、転写レベルおよびタンパク質レベルの両方においてG2/M期(9〜12時間)でLGN/GPSM2タンパク質が最も高い発現を示すことが示された(図3AおよびB)。その後、LGN/GPSM2の発現は、次のG1期の移行直後に、転写レベルでもタンパク質レベルでも減少した。さらに、本発明者らは、LGN/GPSM2がG2/M期中に緩徐に移動するバンドシフトを示すことを見出し、このことは、その翻訳後修飾の可能性を示唆するものであった。より詳細に分裂期中のその発現をさらに調べるため、T47D細胞をノコダゾールで同調し、穏やかに振盪して切り離すことで有糸分裂細胞を収集した。同調された有糸分裂細胞において0から1.5時間にかけて、LGN/GPSM2タンパク質が高い発現および有意なバンドシフトを示すことも確認された(図3CおよびD)。この仮説を明らかにするため、ノコダゾール処理したT47D細胞抽出物を用いてλタンパク質ホスファターゼ分析を行い(材料および方法を参照のこと)、そのシフトバンドがλタンパク質ホスファターゼ処理後に消失することを見出し(図3E)、有糸分裂細胞中でのLGN/GPSM2のリン酸化が示唆された。
4.乳がん細胞株の成長に及ぼすLGN/GPSM2−siRNAの効果
細胞成長または生存におけるLGN/GPSM2の役割について詳しく調べるため、LGN/GPSM2に特異的なsiRNA発現ベクターを、U6プロモーターの制御下で構築し(psiU6BX−siGPSM2,#1および#2)、LGN/GPSM2の発現が高レベルであったT47D細胞またはBT20細胞中へトランスフェクトした。2種類のsiGPSM2(si#1およびsi#2)による処理は、対照siRNA(siEGFPおよびsiSCR)でのLGN/GPSM2の発現の効果的な低減を引き起こした。MTTおよびコロニー形成アッセイ法から、対照と比べて両細胞株で生存細胞の数が減少したことが明らかになった(図4A〜F)。siLGN/GPSM2の特異性を確認するため、siLGN/GPSM2−si#1の3塩基ミスマッチおよびスクランブル配列をコードする発現ベクター(si#1−mmおよびsi#1−SCR)を構築した。ミスマッチまたはスクランブルのどちらかをトランスフェクトしたT47D細胞は成長の抑制を示さず、siRNA配列の特異性を示すものであった(図4G〜I)。
細胞成長または生存におけるLGN/GPSM2の役割について詳しく調べるため、LGN/GPSM2に特異的なsiRNA発現ベクターを、U6プロモーターの制御下で構築し(psiU6BX−siGPSM2,#1および#2)、LGN/GPSM2の発現が高レベルであったT47D細胞またはBT20細胞中へトランスフェクトした。2種類のsiGPSM2(si#1およびsi#2)による処理は、対照siRNA(siEGFPおよびsiSCR)でのLGN/GPSM2の発現の効果的な低減を引き起こした。MTTおよびコロニー形成アッセイ法から、対照と比べて両細胞株で生存細胞の数が減少したことが明らかになった(図4A〜F)。siLGN/GPSM2の特異性を確認するため、siLGN/GPSM2−si#1の3塩基ミスマッチおよびスクランブル配列をコードする発現ベクター(si#1−mmおよびsi#1−SCR)を構築した。ミスマッチまたはスクランブルのどちらかをトランスフェクトしたT47D細胞は成長の抑制を示さず、siRNA配列の特異性を示すものであった(図4G〜I)。
細胞成長に及ぼすLGN/GPSM2の効果をさらに詳しく調べるため、本発明者らはLGN/GPSM2発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞を用いてBrdUrd取り込みアッセイ法を行った。DNA合成はLGN/GPSM2発現の誘導によって増強されるように思われた(P=0.019)(図5AおよびB)。さらに、LGN/GPSM2発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたCOS−7細胞を用い細胞成長について調べた。細胞成長はLGN/GPSM2発現の誘導によって有意に上方制御された(p=0.004)(図5CおよびD)。
詳細な分析のため、T47D細胞に、LGN/GPSM2特異的なsiRNAオリゴヌクレオチド(siLGN/GPSM2)をトランスフェクトし、タンパク質レベルでの有意なノックダウン効果が確認された(図6A)。LGN/GPSM2発現のノックダウンは、フローサイトメトリー分析によって示されるように、対照siEGFPをトランスフェクトした細胞(71.6%)と比べて、G1期細胞(80.7%)の集団の著しい増加を引き起こした(図6B)。形態学的観察により、siLGN/GPSM2をトランスフェクトした細胞における細胞間橋形成が示され、このことは、無秩序な細胞質分裂を示唆していた(図6C)。このように、siLGN/GPSM2の見掛け上の「G1期停止」は、極めて脆弱でかつ引き裂かれる細胞間橋によってつながれたそのような異常分裂細胞により、引き起こされた。
5.LGN/GPSM2はTIOBP/Tara、F−アクチン結合タンパク質と相互作用する
LGN/GPSM2は、微小管紡錘体結合タンパク質NuMA(Du Q et al., Curr Biol. 2002 12:1928-1933、Du Q et al., Nat Cell Biol. 2001 3:1069-1075、Du and Macara, Cell 2004 119:503-516)およびヘテロ三量体G−タンパク質aサブユニット(Gα; Mochizuki et al., Gene 1996 181:39-43、McCudden et al., Biochem Biophys Acta. 2005 1745:254-264)などの、いくつかの分子と結び付くことが報告されている。しかしながら、これらのタンパク質はいずれも、がん細胞の細胞質分裂におけるLGN/GPSM2の役割を実証するには十分でなかった。それゆえ、その相互作用タンパク質を探索するために、本発明者らは、G2/M期を豊富に含む乳がん細胞株からLGN/GPSM2を免疫沈降し、MS分光分析によって相互作用タンパク質を単離した。このアプローチで、TRIOBP/Tara(Seipel et al., J Cell Sci. 2001 114:389-399)が候補タンパク質と同定された(図7A)。共免疫沈降アッセイ法から、LGN/GPSM2とTRIOBP/Taraとの相互作用が確認された。興味深いことに、その相互作用は、ノコダゾールでの処理によって回収された有糸分裂細胞において増強されることが分かり(図7B)、これらのタンパク質が細胞周期依存的な様式で相互作用することを示唆するものであった。内在性LGN/GPSM2およびTRIOBP/Taraはいずれも分裂細胞の中央体に局在化することが観察された(図7C)。横断面からの観察により、LGN/GPSM2は図2Cに示されるように中央体の真ん中に見出され、中央体周囲の連続的な環に見られたTRIOBP/Taraと隣接していた(図7C、右側二枚のパネル)。
LGN/GPSM2は、微小管紡錘体結合タンパク質NuMA(Du Q et al., Curr Biol. 2002 12:1928-1933、Du Q et al., Nat Cell Biol. 2001 3:1069-1075、Du and Macara, Cell 2004 119:503-516)およびヘテロ三量体G−タンパク質aサブユニット(Gα; Mochizuki et al., Gene 1996 181:39-43、McCudden et al., Biochem Biophys Acta. 2005 1745:254-264)などの、いくつかの分子と結び付くことが報告されている。しかしながら、これらのタンパク質はいずれも、がん細胞の細胞質分裂におけるLGN/GPSM2の役割を実証するには十分でなかった。それゆえ、その相互作用タンパク質を探索するために、本発明者らは、G2/M期を豊富に含む乳がん細胞株からLGN/GPSM2を免疫沈降し、MS分光分析によって相互作用タンパク質を単離した。このアプローチで、TRIOBP/Tara(Seipel et al., J Cell Sci. 2001 114:389-399)が候補タンパク質と同定された(図7A)。共免疫沈降アッセイ法から、LGN/GPSM2とTRIOBP/Taraとの相互作用が確認された。興味深いことに、その相互作用は、ノコダゾールでの処理によって回収された有糸分裂細胞において増強されることが分かり(図7B)、これらのタンパク質が細胞周期依存的な様式で相互作用することを示唆するものであった。内在性LGN/GPSM2およびTRIOBP/Taraはいずれも分裂細胞の中央体に局在化することが観察された(図7C)。横断面からの観察により、LGN/GPSM2は図2Cに示されるように中央体の真ん中に見出され、中央体周囲の連続的な環に見られたTRIOBP/Taraと隣接していた(図7C、右側二枚のパネル)。
LGN/GPSM2は細胞質分裂細胞の中央体において役割を果たしているので、LGN/GPSM2欠損細胞におけるF−アクチンの発現および細胞内局在をsiRNA処理によって調べた。興味深いことに、LGN/GPSM2が枯渇した細胞質分裂細胞は、siEGFPで処理された細胞と比べて分裂細胞間のF−アクチン構造が乏しく(図7D)、このことは、中央体でのアクチン重合にLGN/GPSM2が不可欠であることを示唆していた。
6.LGN/GPSM2は有糸分裂期にPBK/TOPKによりリン酸化される
上記のように、LGN/GPSM2の一過性のリン酸化が乳がん細胞においてG2/M期で認められた。PBK/TOPKはセリン/トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞質分裂において極めて重要であると考えられる。なぜなら、PBK/TOPKは細胞質分裂細胞で中央体に局在化し、その発現のノックダウンが、細胞質分裂の失敗によって細胞間橋を有する異常な細胞形態を引き起こしたからである(Park et al., 未発表データ)。図8Aは、LGN/GPSM2がPBK/TOPKと相互作用し、その相互作用が有糸分裂細胞において増強されたことを示す。リン酸化されたPBK/TOPKはLGN/GPSM2と選択的に結び付くように思われる。PBK/TOPKが直接的にLGN/GPSM2をリン酸化するかどうかについて詳しく調べるため、本発明者らは、精製された全長LGN/GPSM2組み換えタンパク質および全長PBK/TOPK組み換えタンパク質を用いてキナーゼアッセイ法を行い、インビトロでのPBK/TOPKによるLGN/GPSM2タンパク質のリン酸化を見出した(図8B)。さらに、精製された全長GST−LGN/GPSM2組み換えタンパク質および全長PBK/TOKP組み換えタンパク質を用いてキナーゼアッセイ法を行った。オートラジオグラフィー画像もPBK/TOPKによるLGN/GPSM2タンパク質のリン酸化を示した(図8C)。siRNAオリゴヌクレオチドを用いたPBK/TOPK発現のノックダウンによって、細胞周期はsiEGFPで処理された細胞と同様であったものの、G2/Mで同調された細胞でのそのリン酸化バンドの消失が起こり(図8C)、このことは、インビボでのPBK/TOPKによるリン酸化を実証するものであった。
上記のように、LGN/GPSM2の一過性のリン酸化が乳がん細胞においてG2/M期で認められた。PBK/TOPKはセリン/トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞質分裂において極めて重要であると考えられる。なぜなら、PBK/TOPKは細胞質分裂細胞で中央体に局在化し、その発現のノックダウンが、細胞質分裂の失敗によって細胞間橋を有する異常な細胞形態を引き起こしたからである(Park et al., 未発表データ)。図8Aは、LGN/GPSM2がPBK/TOPKと相互作用し、その相互作用が有糸分裂細胞において増強されたことを示す。リン酸化されたPBK/TOPKはLGN/GPSM2と選択的に結び付くように思われる。PBK/TOPKが直接的にLGN/GPSM2をリン酸化するかどうかについて詳しく調べるため、本発明者らは、精製された全長LGN/GPSM2組み換えタンパク質および全長PBK/TOPK組み換えタンパク質を用いてキナーゼアッセイ法を行い、インビトロでのPBK/TOPKによるLGN/GPSM2タンパク質のリン酸化を見出した(図8B)。さらに、精製された全長GST−LGN/GPSM2組み換えタンパク質および全長PBK/TOKP組み換えタンパク質を用いてキナーゼアッセイ法を行った。オートラジオグラフィー画像もPBK/TOPKによるLGN/GPSM2タンパク質のリン酸化を示した(図8C)。siRNAオリゴヌクレオチドを用いたPBK/TOPK発現のノックダウンによって、細胞周期はsiEGFPで処理された細胞と同様であったものの、G2/Mで同調された細胞でのそのリン酸化バンドの消失が起こり(図8C)、このことは、インビボでのPBK/TOPKによるリン酸化を実証するものであった。
7.GPSM2上のリン酸化部位としてのSEQ ID NO:53のS401、T519、およびS558の同定
図3B、3D、および3Eは有糸分裂期のGPSM2のリン酸化形態の存在を示す。分裂期におけるGPSM2上のリン酸化部位を探索するため、一過性に発現されたHAタグ付LGN/GPSM2を、有糸分裂期に同調されたMCF−7細胞から免疫沈降し、LC/MS/MSで分析した(図9A)。四つのLGN/GPSM2由来ペプチド:残基番号399〜409、508〜526、および551〜566は、MASCOTデータベース検索においてリン酸化ペプチドと最終的に同定された(図9B〜9D)。この結果は、LGN/GPSM2が、ノコダゾール処理MCF−7細胞においてリン酸化されたSEQ ID NO:53のセリン401、トレオニン519、およびセリン558においてリン酸化されることを示唆するものであった。トレオニン519およびセリン558はGoLoCoドメインに位置している(図9E)。
図3B、3D、および3Eは有糸分裂期のGPSM2のリン酸化形態の存在を示す。分裂期におけるGPSM2上のリン酸化部位を探索するため、一過性に発現されたHAタグ付LGN/GPSM2を、有糸分裂期に同調されたMCF−7細胞から免疫沈降し、LC/MS/MSで分析した(図9A)。四つのLGN/GPSM2由来ペプチド:残基番号399〜409、508〜526、および551〜566は、MASCOTデータベース検索においてリン酸化ペプチドと最終的に同定された(図9B〜9D)。この結果は、LGN/GPSM2が、ノコダゾール処理MCF−7細胞においてリン酸化されたSEQ ID NO:53のセリン401、トレオニン519、およびセリン558においてリン酸化されることを示唆するものであった。トレオニン519およびセリン558はGoLoCoドメインに位置している(図9E)。
セリン401は、Auroraキナーゼファミリーの基質の間で頻繁に見られるアミノ酸配列に位置している(Ohashi et al., 2006)。トレオニン519のアラニンへの置換は、SDS−PAGEにおける移動度の有意な増加を示し(図9F)、SDS−PAGEにおける移動度の有意な変化がトレオニン519でのリン酸化によるものであることを示唆していた。セリン401のアラニンへの置換はAuroraキナーゼAおよびBの両方によるGST−LGN/GPSM2のリン酸化を区別し、LGN/GPSM2が有糸分裂期にAuroraキナーゼAおよび/またはBによってセリン401の位置でリン酸化されることを示していた(図10A、10B)。図8中でLGN/GPSM2をリン酸化することが示されたPBK/TOPKは、ここで同定されたこれらのアミノ酸をリン酸化しなかった(図10C)。PBK/TOPKによって標的化されるアミノ酸はおそらく、質量分析によって網羅されなかったアミノ酸の中に存在する。トレオニン519およびセリン558に対して考えうるキナーゼは、依然として調査中である。
LGN/GPSM2の過剰発現は、図5Bに示されるように細胞成長を増強する。SEQ ID NO:53のセリン401、トレオニン519、および/またはセリン558でのリン酸化がLGN/GPSM2を介した成長増強に必要であるか否かを判定するため、野生型または各置換体をトランスフェクトしたCOS−7細胞でMTTアッセイ法を行った。野生型LGN/GPSM2はモックトランスフェクタントと比べて細胞成長を増強したが、置換体は全て、成長増強活性をモック対照レベルにまで抑制した(図11)ことから、これらのリン酸化部位の全てが成長の制御に寄与することが示唆された。これらのリン酸化部位が細胞成長を異なる機序または同じ機序によって調節するか否かは未だ解明されていない。
III.考察
がん関連遺伝子およびその産物の同定および特徴付けを通じて、がん療法のための分子標的薬がこの20年間に開発されたが、現在利用可能な治療によって利益を受けることができる患者の割合は依然として非常に限られている(Navolanic and McCubrey Int J Oncol. 2005 27:1341-1344、Bange et al., Nat Med. 2001 7:548-552)。それゆえ、悪性細胞に極めて特異的であり、かつ有害反応のリスクが最小でありうる新しい抗がん剤を開発することが急務である。本発明において、LGN/GPSM2は臨床乳がん症例および細胞株において上方制御されるが、調べたいずれの正常ヒト主要組織においてもほとんど検出できないことが実証された。
がん関連遺伝子およびその産物の同定および特徴付けを通じて、がん療法のための分子標的薬がこの20年間に開発されたが、現在利用可能な治療によって利益を受けることができる患者の割合は依然として非常に限られている(Navolanic and McCubrey Int J Oncol. 2005 27:1341-1344、Bange et al., Nat Med. 2001 7:548-552)。それゆえ、悪性細胞に極めて特異的であり、かつ有害反応のリスクが最小でありうる新しい抗がん剤を開発することが急務である。本発明において、LGN/GPSM2は臨床乳がん症例および細胞株において上方制御されるが、調べたいずれの正常ヒト主要組織においてもほとんど検出できないことが実証された。
LGN/GPSM2遺伝子は、SMART予測によって予測された6つの高度に保存されたTPR(テトラトリコペプチド反復配列)ドメインをN末端に含み、かつ4つのGoLocoドメインをC末端に含む推定684アミノ酸のタンパク質をコードする。これらの結果はまた、LGN/GPSM2タンパク質が間期細胞の核内に主に局在し、後期細胞では紡錘体中央帯に一連の狭小な棒状物として蓄積し、終期および細胞質分裂段階には収縮環に最終的に濃縮されることも実証した。これらの知見は、細胞周期の進行におけるこのタンパク質の役割を実証している。
siRNA技術を用いて、内在性LGN/GPSM2発現のノックダウンが、おそらくは細胞質分裂過程における機能不全による、異常な細胞分裂およびその後の細胞死によって、乳がん細胞株T47DおよびBT−20の細胞成長を有意に抑制することがさらに実証された。
これらの知見は、乳がん細胞の成長におけるLGN/GPSM2の重要な役割を暗示しており、LGN/GPSM2が乳がんの治療のための分子標的であることを実証している。
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションおよびゲノム全域のcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた本明細書に記載のがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療法に対する標的として、特定の遺伝子が同定された。これらの差次的に発現された遺伝子、すなわちLGN/GPSM2の発現に基づいて、本発明はがん、特に乳がんを同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
レーザーキャプチャーダイセクションおよびゲノム全域のcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた本明細書に記載のがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療法に対する標的として、特定の遺伝子が同定された。これらの差次的に発現された遺伝子、すなわちLGN/GPSM2の発現に基づいて、本発明はがん、特に乳がんを同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
本明細書において提供されるデータは、がんの包括的な理解の一助となり、新規な診断戦略の開発を促進し、かつ治療的薬物および予防的物質に対する分子標的の同定を促進する。このような情報は、腫瘍形成をより深く理解するのに寄与し、かつがんを診断し、治療し、かつ最終的には予防するための新規な戦略を開発するための指標を提供する。
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
さらに、特定の態様を参照して詳細に本発明を説明したが、前述の記載は本質的に例示的かつ説明的であり、本発明およびその好ましい態様を例示すると意図されることを理解すべきである。規定どおりの実験法によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正をその中で実施できることを、当業者は容易に認識すると考えられる。したがって本発明は、上記の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されることが意図される。
Claims (36)
- 対象由来の生物試料におけるLGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象におけるがんまたはがん発症の素因を診断するための方法であって、
前記遺伝子の正常対照レベルと比べた前記発現レベルの増大が、前記対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクがあることを示唆する、方法。 - 発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10%大きい、請求項1記載の方法。
- 発現レベルが
(a)LGN/GPSM2遺伝子のmRNAを検出すること;
(b)LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること;および
(c)LGN/GPSM2遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれかによって決定される、請求項1記載の方法。 - 対象由来の生物試料が生検材料である、請求項1記載の方法。
- がんが乳がんである、請求項1記載の方法。
- LGN/GPSM2遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する検出試薬を含む、がんを診断または検出するためのキット。
- がんが乳がんである、請求項6記載のキット。
- (a)LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片と試験化合物とを接触させる段階;
(b)前記ポリペプチドまたは断片と試験化合物との間の結合を検出する段階;および
(c)前記ポリペプチドまたは断片に結合する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - (a)LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその断片と試験化合物とを接触させる段階;
(b)前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階;
(c)前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を、試験化合物の非存在下で検出された生物活性と比較する段階;および
(d)前記ポリペプチドの生物活性を抑制する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - 生物活性が細胞増殖活性またはDNA合成増強活性である、請求項9記載の方法。
- (a)LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞と試験化合物とを接触させる段階;
(b)LGN/GPSM2遺伝子の発現レベルを検出する段階;
(c)前記発現レベルを、試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較する段階;および
(d)前記発現レベルを低減する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - (a)LGN/GPSM2遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞に、試験化合物を接触させる段階;
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;
(c)前記発現レベルまたは活性を、試験化合物の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)前記発現レベルまたは活性を低減する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - (a)試験化合物の存在下で、TRIOBP/taraポリペプチドのLGN/GPSM2結合ドメインを含むポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドのTRIOBP/tara結合ドメインを含むポリペプチドとを接触させる段階;
(b)前記ポリペプチド間の結合を検出する段階;および
(c)前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - TRIOBP/tara結合ドメインを含むポリペプチドが、LGN/GPSM2ポリペプチドを含む、請求項13記載の方法。
- LGN/GPSM2結合ドメインを含むポリペプチドが、TRIOBP/taraポリペプチドを含む、請求項13記載の方法。
- (a)試験化合物の存在下で、PBK/TOPKポリペプチドのLGN/GPSM2結合ドメインを含むポリペプチドとLGN/GPSM2ポリペプチドのPBK/TOPK結合ドメインを含むポリペプチドとを接触させる段階;
(b)前記ポリペプチド間の結合またはLGN/GPSM2ポリペプチドのPBK/TOPK結合ドメインを含むポリペプチドのリン酸化レベルを検出する段階;および
(c)前記ポリペプチド間の結合またはLGN/GPSM2のリン酸化レベルを阻害する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - PBK/TOPK結合ドメインを含むポリペプチドが、LGN/GPSM2ポリペプチドを含む、請求項16記載の方法。
- LGN/GPSM2結合ドメインを含むポリペプチドが、PBK/TOPKポリペプチドを含む、請求項16記載の方法。
- (a)リン酸化に適した条件の下、試験化合物の存在下でタンパク質キナーゼとLGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物とを接触させる段階;
(b)SEQ ID NO:53のアミノ酸配列中のSer401、Thr519、および/またはSer558に対応する一つまたは二つのセリン残基および/またはトレオニン残基での、LGN/GPSM2ポリペプチドまたはその機能的等価物のリン酸化レベルを検出する段階;
(c)前記リン酸化レベルを、試験化合物の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較する段階;ならびに
(d)前記リン酸化レベルを低減する試験化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する段階
を含む、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - がんが乳がんである、請求項8、9、11、12、13、16、または19のいずれか一項記載の方法。
- センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖がSEQ ID NO:20または21からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ前記二本鎖分子が、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
- センス鎖が標的配列の位置でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、請求項21記載の二本鎖分子。
- 一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のオリゴヌクレオチドである、請求項21記載の二本鎖分子。
- ポリヌクレオチドが一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有し、
式中[A]が、SEQ ID NO:20または21を含むヌクレオチド配列であり;[B]が、約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]が[A]に相補的なヌクレオチド配列である、
請求項21記載の二本鎖分子。 - センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方を含むベクターであって、センス鎖核酸がSEQ ID NO:20または21のヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ前記ベクターが、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
- センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含むベクターであって、センス鎖核酸がSEQ ID NO:20または21のヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖核酸がセンス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ前記ベクターが、LGN/GPSM2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
- ポリヌクレオチドが、約19〜25ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、請求項25または26記載のベクター。
- 二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写産物である、請求項25記載のベクター。
- ポリヌクレオチドが一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有し、
式中[A]が、SEQ ID NO:20または21を含むヌクレオチド配列であり;[B]が、約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]が[A]に相補的なヌクレオチド配列である、
請求項28記載のベクター。 - LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を対象に投与する段階を含む、対象においてLGN/GPSM2を発現しているがんを治療または予防する方法であって、前記二本鎖分子が、LGN/GPSM2遺伝子の発現のみならずLGN/GPSM2遺伝子を発現している細胞との接触により細胞増殖も阻害する、方法。
- 二本鎖分子が請求項21記載の二本鎖分子であり、かつベクターが請求項25または26記載のベクターである、請求項30記載の方法。
- LGN/GPSM2を発現するがんが乳がんまたは肝細胞がんである、請求項30記載の方法。
- LGN/GPSM2遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療または予防するための組成物であって、前記二本鎖分子が、LGN/GPSM2遺伝子の発現のみならずLGN/GPSM2遺伝子を発現している細胞との接触により細胞増殖も阻害する、組成物。
- 二本鎖分子が請求項21記載の二本鎖分子であり、かつベクターが請求項25または26記載のベクターである、請求項33記載の組成物。
- がんが乳がんである、請求項33記載の組成物。
- SEQ ID NO:39のヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
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