KR20110063490A - 암 치료 및 진단의 표적 유전자인 ｓｙｎｇｒ４ - Google Patents

암 치료 및 진단의 표적 유전자인 ｓｙｎｇｒ４ Download PDF

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야타로 다이고
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 폐암 발암에서 SYNGR4 유전자에 의한 역할에 관한 것이고 하나 또는 그 이상의 상기 SYNGR4 유전자에 대한 이중 가닥 분자, 또는 이러한 이중 가닥 분자 및 항체를 포함하는 조성물, 벡터 또는 세포를 투여함으로써 폐암 치료 또는 예방을 위한 방법을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 SYNGR4 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 과발현되는 유전자를 사용한, 폐암 진단 또는 폐암, 구체적으로 NSCLC 또는 SCLC에 걸린 환자의 예후를 분석/검출하는 방법을 특징으로 한다. 그 목적을 달성하기 위하여, SYNGR4는 폐암에 대한 신규한 혈청학적 바이오마커로서 사용할 수 있다. 또한, 폐암 치료 및 예방용 조성물 확인 방법이다.

Description

암 치료 및 진단의 표적 유전자인 ＳＹＮＧＲ４{SYNGR4 FOR TARGET GENES OF CANCER THERAPY AND DIAGNOSIS}
관련된 출원에 대한 상호-참조
본 발명의 청구범위는 2008년 8월 27일에 제출된, 미국의 가출원 제 61/190,358호를 근거로 우선권을 주장하고, 그 전체가 본 발명의 참조로서 통합된다.
기술분야
본 발명은 생명 과학 분야, 특히 암 연구, 암 진단 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폐암의 치료 및 예방 방법뿐만 아니라 폐암의 검출 및 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폐암의 치료 및/또는 예방용 스크리닝 방법에 관한 것이다.
폐암은 가장 흔한 암 중 하나이고 세계적으로 암 사망의 주된 원인이다(NPL 1: Shibuya K et al., BMC Cancer 2002, 2:37). 방사선요법 및 화학요법과 같은, 다양한 아쥬반트 치료 양상과 결합된 현대 외과적 기술의 사용에도 불구하고, 폐암 환자의 5년 생존율은 아직 약 20%에 불과하다(NPL 2: Naruke T, et al., Ann Thorac Surg 2001, 71(6): 1759-64). 게피티닙(gefitinib) 및 베바시주맙 (Bevacizumab)과 같이 분자에 의해 표적화된 약물의 최근 개발은 희망을 가져다주지만, 게피티닙에 의한 간질성 폐렴 또는 베바시주맙에 의한 심각한 출혈과 같은 치명적인 부작용이 보고되고 있다. 따라서, 부작용이 없는 암 특이적 분자를 표적하는 새로운 약제의 개발이 시급하게 요구된다(NPL 3: Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002, 20: 2240-50; NPL 4: Inoue A, et al., Lancet 2003, 361: 137-9; NPL 5: Johnson DH, et al., J Clin Oncol 2004, 22: 2184-91). 발암성 기능을 가진 일부 암-정소 항원(cancer-testis antigens)을 포함하는, 종양 항원(Oncoantigens)은, 이상적인 치료 표적이다. 암-정소 항원은 정소, 난소, 및 태반과 같은, 생식 조직에 있는 세포를 제외하고, 정상 세포에서는 발현되지 않지만, 암세포에서 매우 높게 발현되는 단백질로 알려져 있다. 이러한 조직으로부터 분리된 상기 세포들은 MHC 클래스 Ⅰ 분자를 발현하지 않기 때문에, 암-정소 항원은 또한 암 백신과 같은, 면역요법을 위한 효과적인 표적이 될 것으로 여겨진다(NPL 6: Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53).
cDNA 마이크로어레이 기술을 사용한 많은 유전자의 발현 수준의 체계적인 분석은 발암현상의 기전에 관련되거나 항암 치료에 효능이 있는 분자를 선별하기 위한 효과적인 접근이다; 이러한 유전자 또는 이의 유전자 산물의 일부는 신규한 치료 및/또는 암 바이오마커의 개발을 위해 효과적인 표적 분자가 될 수 있다. 이전에, 레이저 현미해부에 의한 종양 세포의 농축과 결합하여, 그런 다음 31개의 정상 인간 조직(27명의 성인 및 4개의 태아 기관)의 상기 발현 프로파일 데이터와 비교하여 101개의 임상 폐암 시료의 게놈-와이드 발현 프로파일 분석이 수행되었다(NPL 6:Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53; NPL 7:Kikuchi T, et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205; NPL 8:Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99; NPL 9:Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43; NPL 10:Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805; NPL 11:Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75).
본 발명에 있어서, 스크리닝 시스템은 임상 폐암 재료의 종양-조직 마이크로어레이 분석과 RNA 간섭 기술의 결합에 의해 확립되었다(NPL 12:Suzuki C, et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41; NPL 13:Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; NPL 14:Kato T, et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; NPL 15:Furukawa C, et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; NPL 16:Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84; NPL 17:Suzuki C, et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; NPL 18:Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; NPL 19:Takahashi K, et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19; NPL 20:Hayama S, et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48; NPL 21:Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; NPL 22:Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; NPL 23:Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; NPL 24:Hayama S, et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22 ; NPL 25:Kato T, et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; NPL 26:Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; NPL 27:Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11; NPL 28:Mano Y, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13; NPL 29:Suda T, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1803-8; NPL 30:Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008, 14: 2363-70; NPL 31:Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008, 99: 1448-54). 이러한 체계적인 접근은 시냅토자이린 4(Synaptogyrin 4)("SYNGR4")가 일차 폐암에서 흔히 과발현되는 신규한 암-정소 항원이고 세포 침습 및 암세포의 성장/생존과 관련됨을 밝혔다.
SYNGR4는 19q-암(arm) 신경교종(glioma) 종양 억제 부위에서 이의 염색체상 위치가 최초로 확인된 25kD의 단백질이다(NPL 32:Smith JS, et al., Genomics 2000, 64: 44-50). SYNGR4는 시냅토자이린(synaptogyrin) 패밀리의 새로운 구성원으로 여겨진다. SYNGR1~3은 신경 또는 비-신경 세포의 미세소포체(microvesicles)에서 풍부하게 발현된다(NPL 33:Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7; NPL 34:Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700; NPL 35:Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89). SYNGR1 및 SYNGR2(셀루자이린)의 기능은 잘 알려져 있다. SYNGR1 및 SYNGR2는 구분되는 발현 프로파일을 가지는데, SYNGR1은 중추신경계에서 주로 발현되고 SYNGR2는 뇌를 제외한 다양한 기관에 편재하여 발현된다(NPL 33:Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7). SYNGR1 단백질은 뉴런의 시냅스 소낭(synaptic vesicles)에 위치하고 뉴런의 유연성 및 원형질막으로부터의 엔도사이토시스(endocytosis)에 기능적으로 영향을 준다(NPL 34:Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700; NPL 35:Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89). SYNGR2 단백질은 대부분 타입의 세포에서 편재하여 관찰되는 시냅스-유사 미세소포체(synaptic-like microvesicles, SLMVs)의 구성성분이다(NPL 36:Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8; NPL 37:Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72). SYNGR2는 SLMVs, 시냅토파이신(synaptophysin)에서 주요 구성요소 단백질을 SLMVs 위로 동원함으로써 SLMVs의 생체내합성(biogenesis)에 중요하다(NPL 36:Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8; NPL 37:Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72). SYNGR3 단백질은 SYNGR1의 발현 프로파일과 동일하게 나타나지만, SYNGR3의 정확한 기능은 알려진바 없다(NPL 38:Belizaire R, et al., J Comp Neurol 2004, 470: 266-81). SYNGR4의 생리적 및 발암적 기능은 잘 알려져 있지 않다.
[NPL 1] Shibuya K et al., BMC Cancer 2002, 2:37 [NPL 2] Naruke T, et al., Ann Thorac Surg 2001, 71(6): 1759-64 [NPL 3] Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002, 20: 2240-50 [NPL 4] Inoue A, et al., Lancet 2003, 361: 137-9 [NPL 5] Jphnson DH, et al., J Clin Oncol 2004, 22: 2184-91 [NPL 6] Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53 [NPL 7] Kikuchi T, et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205 [NPL 8] Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99 [NPL 9] Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43 [NPL 10] Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805 [NPL 11] Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75 [NPL 12] Suzuki C, et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41 [NPL 13] Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70 [NPL 14] Kato T, et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46 [NPL 15] Furukawa C, et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10 [NPL 16] Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84 [NPL 17] Suzuki C, et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25 [NPL 18] Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45 [NPL 19] Takahashi K, et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19 [NPL 20] Hayama S, et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48 [NPL 21] Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42 [NPL 22] Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51 [NPL 23] Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25 [NPL 24] Hayama S, et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22 [NPL 25] Kato T, et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53 [NPL 26] Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31 [NPL 27] Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11 [NPL 28] Mano Y, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13 [NPL 29] Suda T, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1803-8 [NPL 30] Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008, 14: 2363-70 [NPL 31] Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008, 99: 1448-54 [NPL 32] Smith JS, et al., Genomics 2000, 64: 44-50 [NPL 33] Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7 [NPL 34] Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700 [NPL 35] Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89 [NPL 36] Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8 [NPL 37] Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72 [NPL 38] Belizaire R, et al., J Comp Neurol 2004, 470: 266-81
발명의 개요
본 발명은 암-정소 항원의 구성원으로서 SYNGR4의 발견, 암 백신 치료를 위한 이상적인 표적, 및 폐의 발암 및 종양 진행에 있어서 SYNGR4의 역할에 부분적으로, 기초한다. SYNGR4는 폐암에 대한 유용한 바이오마커 및 치료 표적이다.
따라서, 본 발명은 SYNGR4, 및 폐암 발암 및 SYNGR4를 과발현하는 다른 암에서 그것의 역할에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 SYNGR4에 결합 및/또는 억제하는 유용한 약제의 스크리닝 방법뿐만 아니라, 예를 들면, 폐암, 바람직하게는 SCLC 및 NSCLC와 같이 SYNGR4가 과발현되는 암의 검출, 진단, 치료 및/또는 예방용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명은 SYNGR4의 발현을 억제하는 특이적인 서열(바람직하게는, 서열번호: 11, 12, 19 및 20)로 구성된 이중 가닥 분자가 예를 들면, 폐암 세포와 같이, SYNGR4가 과발현되는 암세포의 세포 성장을 억제하는데 효과적이라는 발견으로부터, 부분적으로, 발생한다. 특히, SYNGR4 유전자를 표적으로 하는 작은 간섭 RNAs(siRNAs)가 본 발명에 의해 제공된다. 이러한 이중 가닥 분자는 분리된 상태에서 사용되거나 벡터 내에 암호화될 수 있고 상기 벡터로부터 발현될 수 있다. 따라서, 이러한 이중 가닥 분자뿐만 아니라, SYNGR4의 발현을 억제하는 이중 가닥 분자를 발현하는 벡터 및 숙주 세포를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 이중 가닥 분자 또는 본 발명의 벡터를 그것을 필요로 하는 개체에 투여함으로써 세포 성장을 억제하고 폐암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상의 상기 이중 가닥 분자 또는 벡터로 구성되는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 SYNGR4의 발현 억제에 효과적인 본 발명의 적어도 하나의 이중 가닥 분자 또는 벡터를 포함하는 폐암 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 환자 유래 생물학적 시료에서 SYNGR4의 발현 수준을 검출함으로써 개체에서 폐암에 대한 소인을 진단 또는 결정하는 방법을 제공한다. SYNGR4의 정상 대조군 수준과 비교하여 SYNGR4의 발현 수준의 증가는 상기 개체가 폐암에 걸렸거나 폐암 발생 위험에 있는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명은 SYNGR4의 높은 발현 수준이 암 환자, 바람직하게는 폐암 환자에서 낮은 생존율과 상관관계가 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 암, 예를 들면, 폐암에 걸린 환자의 평가 또는 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 SYNGR4의 발현 수준을 검출하는 단계, 그것을 먼저 결정된 참조 발현 수준과 비교하고 그들 사이의 차이로부터 상기 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 예를 들면, 폐암과 같은 SYNGR4의 과발현에 의해 부분적으로 증진되거나, 야기되거나, 증진되는 암의 치료 및/또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 화합물은 SYNGR4 유전자와 결합하고, SYNGR4의 생물학적 활성을 감소시키며, SYNGR4 및 다른 단백질 사이의 상호작용을 억제하거나 SYNGR4 유전자 또는 상기 SYNGR4 유전자의 전사 개시 부위에 의해 조절되는 리포터 유전자의 발현을 감소시킨다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 상기 SYNGR4 단백질에 결합하거나 또는 활성을 억제하는 항체를 투여함으로써 예를 들면, 폐암과 같은 SYNGR4의 과발현에 의해 부분적으로 증진되거나, 야기되거나, 증진되는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 측면이 어떤 목표들을 충족시킬 수 있음과 동시에 하나 이상의 다른 측면이 다른 어떤 목표들을 충족시킬 수도 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 각각의 목표는 본 발명의 모든 측면에서 동등하게 적용되지 않을 수 있다. 이와 같이, 상기 목표는 본 발명의 어느 하나의 측면에 관한 대안으로 보여질 수 있다. 본 발명의 상기 및 다른 목표 및 특성은 하기 도면 및 실시예와 함께 기재된 상세한 설명에 의해 더욱 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상기 요약 및 하기 바람직한 실시예의 상세한 설명은 본 발명을 이해하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 대안적 실시예를 제한하는 것은 아니다.
[도 1a-c] 종양 조직, 세포주 및 정상 조직에서 SYNGR4의 분석. A, 15개의 임상 폐암 및 정상 폐 조직 시료에서 SYNGR4의 발현(위 패널) [폐선암(lung adenocarcinoma, ADC), 폐 편평상피세포암(lung squamous cell carcinoma, SCC) 및 소세포폐암(small cell lung carcinoma, SCLC); 위] 및 반정량적 RT-PCR 분석에 의해 검출된 22개의 폐암 세포주(아래 패널). B, SYNGR4-양성 및 -음성 폐암 세포주, 및 기관지 상피 세포에서 내생적 SYNGR4 단백질의 발현 및 세포내 위치. SYNGR4는 NCI-H1373, LC319, A549, 및 SBC3 세포에 있어서 세포질에서 주로 염색되었고 과립 형태를 갖는 세포 표면에서 약하게 염색되었으나, NCI-H1781 및 BEAS-2B 및 SAEC 세포주 유래 기관지 상피에서는 염색되지 않았다. C, C-말단 myc/His-태그된 SYNGR4로 형질전환된 COS-7 세포에 항-myc 항체 및 N-말단 3X Flag-태그된 SYNGR4로 형질전환된 COS-7 세포에 항-Flag 항체를 사용한 면역세포화학법에 의한 세포 표면 SYNGR4의 검출. 세포 표면상에 SYNGR4 염색은 Triton-X 처리가 있거나 없는 상태에서 관찰되었으나, acid glycine과 함께 세포 표면 항체를 제거함으로써 SYNGR4 염색은 사라졌고, 이는 SYNGR4의 C-말단 및 N-말단이 세포막의 외부에 있음을 나타낸다.
[도. 1d] D, 유세포분석에 의한 폐암 세포주에서 세포 표면 SYNGR4의 검출. SYNGR4는 SYNGR4 발현 세포주의 세포 표면에서 검출되었다.
[도. 2] 정상 조직 및 폐암에서 SYNGR4의 발현, 및 이의 NSCLC 환자에 대한 나쁜 예후와의 관련성. A, 16개의 정상 성인 인간 조직에서 SYNGR4 전사체의 노던 블랏 분석. 정소에서 강한 신호가 관찰되었다. B, 면역조직화학법에 의한 정상 조직과 폐암 사이에서 SYNGR4 단백질 발현의 비교. C, 폐암 조직 및 정상 조직에서 강한, 약한, 및 결여된 SYNGR4 발현에 대한 예시(왼쪽 사진). 원본 배율, X100. SYNGR4의 발현 수준에 따라 NSCLC에 걸린 환자의 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석(로그 순위 검정에 의해 P = 0.0002)(오른쪽 패널).
[도. 3a] SYNGR4의 성장 증진 효과. A, SYNGR4에 대한 siRNAs에 의한 폐암 세포의 성장 저해. 위 패널, 반정량적 RT-PCR에 의해 분석된, si-SYNGR4s (#1 및 #2) 및 대조군 siRNAs(si-EGFP/enhanced green fluorescent protein gene, si-LUC/Luciferase)에 의한 A549 세포(왼쪽) 및 SBC-5 세포(오른쪽)에서 SYNGR4 발현에 대한 유전자 녹다운 효과. 아래 패널, si-SYNGR4s 또는 대조군 siRNAs로 형질전환된 A549 및 SBC-5 세포의 콜로니 형성 및 MTT 분석. 세로, 3회 분석의 상대적 흡광도; bars, SD.
[도. 3b] B, SYNGR4가 외인성으로 과발현되는 COS-7 또는 NIH-3T3 세포에서 세포 증식의 증진. 위 패널, 웨스턴 블랏팅에 의한 일시적인 SYNGR4 발현의 검출. 아래 패널, SYNGR4 발현 벡터의 형질전환 후 96시간에 COS-7 세포의 MTT 분석. 세로, 3회 분석의 상대적 흡광도; bars, SD.
[도. 4a] SYNGR4의 세포 침습 효과. A, SYNGR4를 외인성으로 과발현하는 포유동물 세포에서 세포 침습의 증진. 위 패널, 웨스턴 블랏팅에 의해 검출된, COS-7(왼쪽) 및 NIH3T3(오른쪽) 세포에서 SYNGR4 단백질의 일시적 발현. 아래 패널, 인간 SYNGR4에 대한 발현 플라스미드로 형질전환한 후 마트리겔 매트릭스에서 COS-7 및 NIH3T3 세포의 침습 특성을 증명한 분석. 김자(Giemsa) 염색(X200; 왼쪽 아래), 및 마트리겔 코딩된 필터를 통해 이동한 세포수를 나타내는 그래프 패널(오른쪽 아래). Bars, SD. 분석은 3회 3개의 웰에서 실시되었다.
[도. 4b] B, 외인성으로 SYNGR4를 발현하는 COS-7 세포에서 세포 침습 활성에 대한 항-SYNGR4 항체의 억제 효과. 왼쪽 패널, 항-SYNGR4 항체 또는 이소타입 IgG, 또는 PBS로 처리된 침습된 COS-7 세포의 현미경 검사. 오른쪽 패널, 마트리겔 코팅된 필터를 통해 이동한 COS-7 세포의 수; bars, SD. 분석은 3회 3개의 웰에서 실시되었다.
[도. 4c] C, 폐암 세포에서 세포 침습 활성에 대한 항-SYNGR4 항체의 억제 효과. 위 패널, 항-SYNGR4 항체, 이소타입 IgG, 또는 PBS로 처리된 침습된 A549 세포(왼쪽) 및 NCI-H1781 세포(오른쪽)의 현미경 검사. 아래 패널, 마트리겔 코팅된 필터를 통해 침습한 암세포의 수; bars, SD. 분석은 3개의 웰에서 3회 실시되었다.
[도. 5a-b] GRB2와 SYNGR4의 상호작용. A, SYNGR4의 인산화의 확인. 왼쪽 위 패널, COS-7 세포에서 외인성 SYNGR4 단백질의 포스파타아제 처리. 포스파타아제 처리된 시료에서 이동된 밴드는 SYNGR4가 인산화된 것을 나타낸다. 왼쪽 아래 패널, SYNGR4를 외인성으로 발현하는 COS-7 세포 또는 항-포스포티로신 항체에 의해 목 벡터로 형질전환된 COS-7 세포로부터 유래된 용해물의 면역침전물의 면역블랏. 오른쪽 패널, SYNGR4 단백질의 단백질 서열. 숫자는 N-말단으로부터의 아미노산을 나타낸다. B, 포유동물 세포에서 면역침전(immunoprecipitation, IP)에 의한 GRB2와 결합하는 외인성 SYNGR4의 확인. 왼쪽 패널, COS-7 세포는 목 또는 SYNGR4로 형질전환 되었고 항-myc 항체를 사용하여 IP-myc를 실시한 후, 항-GRB2 항체로 면역블랏팅(immunoblotting, IB)을 실시하였다. 동시에, 침전되지 않은 세포 용해물(투입)을 사용한 면역블랏팅이 동시에 실시되었다. SYNGR4의 면역침전을 확인하기 위하여 항-myc 항체를 사용한 재-면역블랏팅을 실시하였다. 오른쪽 패널, COS-7 세포는 목(Mock) 또는 SYNGR4로 형질감염하고 항-GRB2 항체를 사용하여 IP-GRB2를 실시하였고, 항-myc 항체로 면역블랏팅을 실시하였다. GRB2의 면역침전을 확인하기 위하여 항-GRB2 항체를 사용한 재-면역블랏팅을 실시하였다.
[도 5C]C, SYNGR4에서 타이로신-46을 인산화하였고 SYNGR4 (SYNGR4-Y46F)에서 타이로신-46을 페닐알라닌으로 치환함으로써 GRB2와의 상호작용에 중요하게 되었다. 왼쪽 패널, COS-7 세포를 목(Mock) 또는 SYNGR4 또는 SYNGR4-Y46F의 야생형(WT)으로 형질전환하였고 항-Flg 항체를 사용하여 IP-Flag를 실시하였고, 항-포스포타이로신 항체로 면역블랏팅(IB)을 실시하였다. 오른쪽 패널, COS-7 세포를 목(Mock) 또는 SYNGR4-WT 또는 Y46F로 형질전환하여 항-myc 항체를 사용하여 IP-myd를 실시하였고, 항-GRB2 항체로 면역블랏팅을 실시하였다. SYNGR4의 면역침전을 확인하기 위하여 항-myc 항체를 사용한 재-면역블랏팅을 실시하였다.
[도. 6a] MARK의 업스트림 SYNGR4 의존적 GRB2-PAK1 전달경로를 통한 MARK 신호의 활성화. A, 포유동물 세포에 SYNGR4 또는 SYNGR4에 대한 siRNA 형질전환에 의한 MARK 신호 분자 인산화의 상태. 왼쪽 패널, COS-7 세포를 목(Mock) 또는 SYNGR4로 형질전환하였고 형질전환 24시간 후에 형질전환 세포 용해물을 항-phospho c-RAF (Ser338), 항-c-RAF, 항-phospho MEK1/2 (Ser217/221), 항-phospho MEK1(Ser298), 항-phospho ERK (Thr202/Tyr204), 항-ERK, 항-myc, 및 항-GAPDH 항체로 면역블랏팅을 실시하였다. 오른쪽 패널, A549 및 SBC-3 세포를 SYNGR4에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA(EGFP)로 형질전환하였고 형질전환 24시간 후에 세포 용해물을 항-phospho c-RAF (Ser338), 항-c-RAF, 항-phospho MEK1/2 (Ser217/221), 항-phospho MEK1 (Ser298), 항-phospho ERK (Thr202/Tyr204), 항-ERK, 및 항-GAPDH 항체로 면역블랏팅을 실시하였다. 또한 SYNGR4 전사의 녹다운(knockdown)을 측정하기 위하여 세포 총 RNA를 수득하였고 역전사 반응을 실시한 후, PCR 반응을 실시하였다. GAPDH 전사를 내부 대조군으로 사용하였다.
[도. 6b-d]B, SYNGR4에 의한 MARK 신호 증진 효과는 GRB2를 통해 매개되었다. COS-7 세포는 GRB2에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA(EGFP)로 형질전환하였고 형질전환 4시간 후에 세포를 목(mock) 또는 SYNGR4로 형질전환하였다. 두 번째 형질전환 24시간 후에 세포 용해물은 항-phospho c-RAF (Ser338), 항-c-RAF, 항-phospho MEK1/2 (Ser217/221), 항-phospho MEK1 (Ser298), 항-phospho ERK (Thr202/Tyr204), 항-ERK, 항-GRB2, 항-myc, 및 항-GAPDH 항체를 순차적으로 사용하여 면역블랏팅을 실시하였다. C, 돌연변이-SYNGR4 발현 COS-7 세포에서 증진된 MAPK 신호의 손상된 기능. COS-7 세포는 목, 야생형 SYNGR4 (WT), 또는 돌연변이 SYNGR4 (Y46F)로 형질전환하였고 형질전환 24시간 후에 세포 용해물을 항-phospho c-RAF (Ser338), 항-c-RAF, 항-phospho MEK1/2 (Ser217/221), 항-phospho MEK1 (Ser298), 항-phospho ERK (Thr202/Tyr204), 항-ERK, 항-myc, 및 항-GAPDH 항체로 형질전환하였다. D, 폐암 세포에서 SYNGR4 형질전환에 의한 PAK1 인산화의 효과. A549 및 SBC-3 세포를 SYNGR4에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA (EGFP)로 형질전환하였고 형질전환 24시간 후 세포 용해물을 항-phospho PAK1 (Thr423), PAK1, 및 GAPDH 항체로 면역블랏팅을 실시하였다. 또한 SYNGR4 전사의 녹다운을 측정하기 위하여 세포 총 RNA를 수득하였고 역전사 반응을 실시한 후, PCR 반응을 실시하였다. GAPDH 전사를 내부 대조군으로 사용하였다.
[도. 6e]E, SYNGR4에 의한 MAPK 신호 증진의 효과는 PAK1을 통해 매개되었다. COS-7 세포는 PAK1에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA (EGFP)로 형질전환하였고 형질전환 4시간 후에 세포를 목(mock) 또는 SYNGR4로 형질전환하였다. 두 번째 형질전환 24시간 후에 세포 용해물은 항-phospho c-RAF (Ser338), 항-c-RAF, 항-phospho MEK1/2 (Ser217/221), 항-phospho MEK1 (Ser298), 항-phospho ERK (Thr202/Tyr204), 항-ERK, 항-PAK1, 항-myc, 및 항-GAPDH 항체를 순차적으로 사용하여 면역블랏팅을 실시하였다.
[도. 6f-g]F, 돌연변이 SYNGR4 발현 COS-7 세포에서 세포 성장 증진 및 침습의 손상된 기능. 왼쪽 패널, COS-7 세포는 목, 야생형 SYNGR4 (WT), 또는 돌연변이 SYNGR4 (Y46F)로 형질전환하였고 120시간 후에 콜로닝 형성(Top) 및 MTT (아래) 분석을 수행하였다. 세로, 3회 분석의 상대적 흡광도; bars, SD. 오른쪽 패널, COS-7 세포를 mock, SYNGR4-WT, 또는 SYNGR4-Y46F로 형질전환하였고 이를 이용하여 마트리겔 침습 챔버에서 22시간 동안 배양하였고, 마트리겔 코팅 필터를 통해 이동한 세포를 계수하였다. 김자 염색(×200; 오른쪽 위), 및 이동한 세포의 수를 나타내는 그래프 패널 (오른쪽 아래). Bars, SD. 분석은 3개 웰에서 3회 수행하였다. G, SYNGR4와 관련된 가능한 상호작용 캐스캐이드.
[도. 7] 추가 도면. A, SYNGR4 항체에 대해 전-배양한 항원 펩티드가 있거나 없는 상태에서 폐암 조직의 면역조직화학분석. B, GTP-결합 RAS 검출을 위한 RAF1 풀-다운 분석. COS-7 세포를 목 또는 SYNGR4 발현 플라스미드로 형질전환하였고 24시간 후 세포 용해물을 재조합 활성 RAF1 결합된 비드와 배양하였으며, 항-RAS 항체로 면역블랏팅을 실시하였다.
정의
본 발명에서 사용되는 용어 “1개(a, an)" 및 "상기(the)"는 특별히 나타내지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 전체 생물체 또는 그것의 조직(예를 들면, 폐 조직), 세포 또는 구성요소(예를 들면, 이에 한정되지 않으나, 혈액, 혈청, 혈장, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 객담, 양수, 양막 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하는, 체액)의 부분집합을 의미한다. 또한, "생물학적 시료"는 전체 생물체 또는 그것의 세포, 조직 또는 구성요소, 또는 이들의 분획물 또는 일부분으로부터 제조된 균질현탁액, 용해물, 추출물, 세포 배양물 또는 조직 배양물을 의미한다. 마지막으로 "생물학적 시료"는 생물체가 번식하는 영양 배지 또는 겔과 같은 배지를 나타내고, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 세포 구성성분을 포함한다.
상기 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위해 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기, 또는 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인위적인 화학적 모방체와 같은, 비자연적으로 발생하는 잔기가 있는 아미노산 폴리머에 적용된다.
SYNGR4 유전자 또는 SYNGR4 단백질
본 발명의 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다:
SYNGR4: 서열번호 13 및 14.
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록 번호를 통해 이용가능하다:
SYNGR4: NM_012451.
먼저 본 발명은 SYNGR4 발현이 세포 증식/생존 및 전이를 활성화함으로써 폐 종양의 진행을 증진할 수 있다는 것을 제시한다.
GRB2 유전자 또는 GRB2 단백질
본 발명의 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다:
GRB2: 서열번호 22 및 25.
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록 번호를 통해 이용가능하다:
GRB2: NM_002086 및 NM_203506.
상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 상피 성장 인자 수용체에 결합하고 1개의 SH2 도메인과 2개의 SH3 도메인을 포함한다. 그것의 2개의 SH3 도메인은 다른 단백질의 프롤린이 풍부한 부위와 직접적으로 복합체를 형성하고, 그것의 SH2 도메인은 타이로신 인산화된 서열에 결합한다. 상기 유전자는 C.elegans의 Sem5 유전자와 유사하고, 신호 전달 경로와 관련된다. 다른 이소폼(isoform)을 암호화하는 2개의 호환적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 상기 유전자에 대해 확인되었다. 상기 변이체(1)(NM_002086)은 더욱 긴 전사체를 나타내고 더 긴 이소폼을 암호화한다.
PAK1 유전자 또는 PAK1 단백질
본 발명의 상기 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다;
PAK1: 서열번호 26 내지 29.
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록번호를 통해 이용가능하다:
PAK1: NM_001128620 및 NM_002576.
PAK 단백질은 세포골격(cytoskeleton) 재구성 및 세포핵 신호에 RhoGTPases를 연관시키는데 중요한 이펙터이다. 세린/트레오닌 p21-활성 키나제(serine/threonine p21-activating kinases)의 패밀리인, PAK 단백질에는, PAK1, PAK2, PAK3 및 PAK4를 포함한다. 상기 단백질들은 작은 GTP 결합 단백질 Cdc42 및 Rac에 대한 표적으로서 작용하고 다양한 범위의 생물학적 활성에 개입되어 있다. PAK1은 세포 운동성 및 형태를 조절한다. 상기 유전자에 대한 다른 이소폼을 암호화하는 호환적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 확인되었다. 상기 변이체 (1)(NM_001128620)은 더 긴 이소폼을 암호화한다.
c-Raf 유전자 또는 c-Raf 단백질
본 발명의 상기 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다;
c-Raf: 서열번호 30 내지 31;
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록번호를 통해 이용가능하다.
c-Raf: NM_002880;
상기 유전자는 바이러스 raf 유전자 (v-raf)의 세포 상동체이다. 암호화되는 단백질은 MAP 키나제 키나제 키나제 (MAP3K)이고, 그것이 직접적으로 결합하는 세포막 관련 GTPases의 Ras 패밀리 중 다운스트림 기능을 한다. 일단 활성화되면, 상기 세포 RAF1 단백질은 이중 특이성 단백질 키나제 MEK1 및 MEK2를 활성화하기 위하여 인산화할 수 있고, 상기 세린/트레오닌 특이적 단백질 키나제, ERK1 및 ERK2를 활성화하기 위하여 차례대로 인산화한다. 인산화된 ERKs는 세포 생리의 다면 발현성 이펙터이고 세포 분열 사이클, 세포사멸, 세포 분화 및 세포 이동과 관련된 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 한다. 상기 유전자에서의 돌연변이는 누난 신드롬 5 (Noonan syndrome 5) 및 레오파드 신드롬 2(LEOPARD syndrome 2)와 관련된다.
MEK1/2 유전자 또는 단백질
본 발명의 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다;
MEK1: 서열번호 32 및 33, MEK2: 서열번호 34 및 35.
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록번호를 통해 이용가능하다:
MEK1: NM_002755, MEK2: NM_030662.
MEK1은 이중 특이성 단백질 키나제 패밀리의 구성원이고, 마이토젠-활성화 단백질(mitogen-activated protein, MAP) 키나제 키나제로서 작용한다. 또한 MAP 키나제는, 세포외 신호-조절 키나제 (extracellular signal-regulated kinases, ERKs)로 알려져 있고, 다중 생화학적 신호에 대한 통합 포인트로서 작용한다. 상기 단백질 키나제는 MAP 키나제의 업스트림에 있고 다양한 세포 외 및 세포내 신호에 대한 MAP 키나제의 효소 활성을 자극한다. MAP 키나제 신호 전달 경로의 필수적인 구성요소로서, 상기 키나제는 증식, 분화, 전사 조절 및 발생과 같은 많은 세포 과정과 관련된다. MEK2는 MAP 키나제 키나제 패밀리에 속하는 이중 특이성 단백질 키나제이다. 상기 키나제는 마이토젠 성장 인자 신호 전달에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이는 MAPK1/ERK2 및 MAPK2/ERK3를 인산화하여 활성화한다. 상기 키나제 자체의 활성화는 MAP 키나제 키나제 키나제에 의한 상기 Ser/Thr 인산화에 의존적이다. 상기 유전자의 돌연변이는 cardiofaciocutaneous 신드롬 지연, 및 누난 신드롬에서 발견되는 것과 유사한 독특한 얼굴 모습을 야기한다. 또한 상기 키나제의 억제 또는 분해는 여시니아(Yersinia) 및 탄저병의 발병에 관련된 것으로 확인되었다. 유사 유전자는, 7번 염색체 상에 위치하고, 상기 유전자에 대해 동정되었다.
ERK1/2 유전자 또는 단백질
본 발명의 유전자의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 하기 번호로 나타내어지나, 이에 한정되지 않는다;
ERK1: 서열번호 36 내지 41, ERK2: 서열번호 42 내지 45.
더욱이, 또한 상기 서열 데이터는 하기 등록번호를 통해 이용가능하다:
ERK1: NM_002746, NM_001040056, NM_001109891, ERK2: NM_002745, NM_138957.
ERK1은 MAP 키나제 패밀리의 구성원이다. 또한 MAP 키나제는, 세포외 신호-조절 키나제 (extracellular signal-regulated kinases, ERKs)로 알려져 있고, 다양한 세포외 신호에 반응하여 증식, 분화, 및 세포 주기 진행과 같은 다양한 세포 과정을 조절하는 신호 캐스캐이드에서 작용한다. 상기 키나제는 업스트림 키나제에 의해 활성화되고, 세포핵 표적을 인산화하는 핵으로의 그것의 전좌를 야기한다. 다른 단백질 이소폼을 암호화하는 호환적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 기재되었다(NM_002746, NM_001040056, NM_001109891). 상기 변이체 (1) (NM_002746)은 가장 흔한 전사체이고 이소폼 1을 암호화하는 것을 나타낸다. ERK2는 MAP 키나제 패밀리의 구성원이다. 또한 MAP 키나제는, 세포외 신호-조절 키나제 (extracellular signal-regulated kinases, ERKs)로 알려져 있고, 다중 생화학적 신호에 대한 통합 포인트로서 작용하며, 증식, 분화, 전사 조절 및 발생과 같은 다양한 세포 과정과 관련된다. 상기 키나제의 활성화는 업스트림 키나제에 의한 그것의 인산화가 필요하다. 활성화에 대하여, 상기 키나제는 자극된 세포의 세포핵으로 전좌하고, 그곳에서 세포핵 표적을 인산화한다. 동일한 단백질을 암호화하나, UTRs에 차이가 있는, 2개의 호환적으로 스플라이싱된 전사체 변이체는, 상기 유전자에 대해 보고되었다. 변이체 (1) (NM_002745)은 더 긴 전사체를 나타낸다. 변이체 1 (NM_002745) 및 2 (NM_138957) 모두는 동일한 단백질을 암호화한다.
본 발명의 하나의 측면에 따라, 또한 기능적 등가물은 상기 “폴리펩티드”로서 간주된다. 본 명세서에서, 단백질의 “기능적 등가물”은 상기 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 즉, 본 발명에서 상기 생물학적 활성을 보유하는 임의의 폴리펩티드는 기능적 등가물로서 사용될 수 있다. 이러한 기능적 등가물은 자연적으로 발생한 상기 단백질의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가, 또는 삽입된 것을 포함한다. 또는, 디폴트 설정을 하여, 예를 들면, BLAST 또는 ALIGN와 같은, 알려진 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정함으로써, 상기 폴리펩티드는 상기 각 단백질의 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성 (또한 서열 동일성으로서 나타냄), 더욱 바람직하게는 예를 들면, SYNGR4 폴리펩티드, 예를 들면, 서열번호 14의 참조 서열에 대해 적어도 약 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 엄격한 조건에서 상기 유전자의 자연적으로 발생한 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 알려진 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정함으로써, 예를 들면, SYNGR4 폴리펩티드, 예를 들면, 서열번호 13의 참조 서열에 대해 적어도 약 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
본 발명의 폴리펩티드는 그것을 생산하는데 사용되는 세포 또는 숙주 또는 사용된 정제 방법에 의존적인, 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 당쇄의 존재 또는 부재, 또는 형태에 있어서 변이를 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 인간 단백질에 대한 기능적 동등성을 갖는 한, 그것은 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 용어 "엄격한 (혼성화) 조건"은 핵산 분자가 일반적으로 핵산의 복합 혼합물에서, 그것의 표적 서열에 혼성화 되나, 다른 서열에는 검출되지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경에서는 달라진다. 더 긴 서열은 특별히 더 높은 온도에서 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 포괄적 안내는 “혼성화의 원리 및 핵산 분석의 전략에 대한 개관”(Tijssen, techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic probes, "Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993))에서 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 일정한 pH의 이온 세기에서 특정 서열에 대한 융점(Tm)보다 낮은 약 5-10℃에서 선택된다. 상기 Tm(일정한 pH의 이온 세기, pH, 및 핵산 농도)은 평형상태(과량의 표적 서열이 존재할 때, Tm에서 50%의 탐침이 평형 상태에 있다)에서 표적에 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열에 혼성화되는 온도이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 시약을 첨가하여 도달할 수 있다. 선별적 또는 특이적인 혼성화를 위하여, 양성 신호가 바탕값의 적어도 두 배이고, 바람직하게는 바탕값 혼성화의 10배이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50℃에서 0.2× SSC, 및 0.1% SDS로 세척하면서, 50% 포름아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 65℃에서 반응, 또는 5× SSC, 1% SDS, 65℃에서 반응.
본 발명의 문맥에 있어서, 상기 인간 단백질에 대한 기능적 등가물인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 분리하기 위한 혼성화의 조건은 당업자라면 일상적으로 선별할 수 있다. 예를 들면, 혼성화는 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)를 이용하여 68℃에서 30분 또는 그 이상 전-혼성화 수행, 표지 된 탐침 첨가, 및 68℃에서 1시간 또는 그 이상 가열하는 것을 통해 수행될 수 있다. 이후 세척 단계는 예를 들면, 낮은 엄격한 조건에서 수행될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건은 42℃, 2x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 50℃, 2x SSC, 0.1% SDS를 포함한다. 높은 엄격한 조건을 사용하는 것이 대개는 바람직하다. 예시적인 높은 엄격한 조건은 2x SSC, 0.01% SDS로 상온에서 20분간 3회 세척, 그런 다음 1x SSC, 0.1% SDS로 37℃에서 20분간 3회 세척하고, 1x SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 20분간 2회 세척을 포함한다. 그러나 온도, 염 농도와 같은, 몇몇의 인자는 혼성화의 엄격함에 영향을 줄 수 있고 당업자는 요구되는 엄격함을 달성하기 위하여 상기 인자를 적절하게 선별할 수 있다.
일반적으로, 단백질에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 알려졌다. 사실, 돌연변이 되거나 변형된 단백질, 특정 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가되어 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 본래의 생물학적 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다(Mark et al ., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6(1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500(1982); Dalbadie-McFarland et al ., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982)). 따라서, 당업자는 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산 또는 "보존된 변환(conservative modifications)"으로 고려되는 아미노산 서열에 대한 개별적 첨가, 결실, 삽입, 또는 치환을 인식할 것이고, 단백질의 변화 결과, 유사한 기능을 갖는 단백질이라면, 본 발명의 내용에 사용가능하다.
상기 단백질의 활성이 남아있는 한, 아미노산 돌연변이의 개수는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서, 본 발명자들은 강한 SYNGR4 발현이 NSCLC 환자에 대한 나쁜 임상적 결과와 관련됨을 제시하였고, siRNA에 의한 SYNGR4의 내인성 발현 억제는 폐암 세포의 생존력의 뚜렷한 감소를 야기하였으며, SYNGR4의 외인성 발현은 포유동물 세포에서 세포 성장 및 세포 이동/침습 활성을 증진시켰다. 더욱이, SYNGR4에서 Tyr46은 인산화되었고 GRB2와의 결합 및 GRB2/PAK1/MAPK 신호 경로의 활성화에 중요하다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 일반적으로 5% 또는 그 이하의 아미노산 서열이 변화하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어서, 돌연변이체에서 돌연변이되는 아미노산의 개수는 일반적으로 30개 또는 그 이하의 아미노산, 바람직하게는 20개 또는 그 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개 아미노산 또는 그 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 6개 또는 그 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 3개 또는 그 이하의 아미노산이다.
돌연변이되는 아미노산 잔기는 바람직하게는 상기 아미노산 측쇄의 특성이 보존되는 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다(보존적 아미노산 치환으로 알려진 과정). 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공동으로 특징을 가지는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 하이드록시기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드가 포함된 측쇄(D, N, E, Q); 염기가 포함된 측쇄(R, K, H); 및 방향족이 포함된 측쇄(H, F, Y, W)가 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아미노산을 포함하는 각각의 하기 8개의 군은 서로에 대한 보존적 치환이다:
(1) 알라닌(Alanine, A), 글리신(Glycine, G);
(2) 아스파트산(Aspartic acid, D), 글루타민산(Glutamic acid, E);
(3) 아스파라긴(Aspargine, N), 글루타민(Glutamine, Q);
(4) 아르기닌(Arginine, R), 라이신(Lysine, K);
(5) 이소류신(Isoleucine, I), 류신(Leucine, L), 메티오닌(Methionine, M), 발린(Valine, V);
(6) 페닐알라닌(Phenylalanine, F), 티로신(Tyrosine, Y), 트립토판(Tryptophan, W);
(7) 세린(Serine, S), 트레오닌(Threonine, T); 및
(8) 시스테인(Cystein, C), 메티오닌(Methionine, M) (예를 들어, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 폴리펩티드는 본 발명에 포함된다. 그러나, 본 발명은 상기 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 한, 이에 한정되지 않고 상기 단백질은 비-보존적인 변형을 포함한다. 더욱이, 상기 변형된 단백질은 다형성 변종, 종간 상동체, 및 이러한 단백질의 대립형질에 의해 암호화되는 것들을 제외하지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 유전자는 본 발명의 이러한 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 혼성화와 더불어, 예를 들어, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은, 유전자 증폭 방법은, 정보에 대한 서열에 기초하여 합성된 프라이머를 사용하여, 상기 단백질에 대한 기능적 등가물인 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는데 사용될 수 있다. 상기 인간 유전자 및 단백질에 대한 기능적 등가물인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 각각, 보통 원래 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 높은 상동성을 갖는다. "높은 상동성"은 일반적으로 40% 또는 그 이상, 바람직하게는 60% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 80% 또는 그 이상, 가장 바람직하게는 90% 내지 95% 또는 그 이상의 상동성을 의미한다. 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동체는 "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"에 있는 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
항체
본 발명에서 사용되는 상기 용어 "항체"는 설계된 단백질 또는 이의 펩티드에 특이적으로 반응하는 면역글로불린 및 이의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 인간 항체, 영장류화 항체, 키메라 항체, 이중특이성 항체, 인간화 항체, 다른 단백질 또는 방사선표지물과 융합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 광범위한 의미로 사용되고 특히 온전히 단일클론 항체, 다클론 항체, 두개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다. "항체"는 모든 종류(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 나타낸다.
SYNGR4에 특이적으로 결합하는 항체는 폐암 세포 증식 및 침습 활성을 억제하는데 유용하다(도. 4a-c 및 도. 6f).
따라서 본 발명의 상기 항체는 폐암 치료를 위해 사용된다. 이러한 항체는 공지의 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 상기 항체의 제조를 위한 예시적인 기술들은 당업계에 잘 알려져 있고 본 명세서에 기재되었다.
본 발명은 폐암 치료 및 예방을 위해, SYNGR4에 대한 항체를 사용한다. 이러한 항체는 공지된 방법에 의해 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 상기 항체의 제조를 위한 예식적인 기술들이 기재되었다.
(ⅰ) 다클론 항체:
다클론 항체는 바람직하게는 관련된 항체 및 아쥬반트의 다중 피하 (subcutaneous, sc) 또는 복강내(intraperitoneal, ip) 주사에 의해 동물에서 생산할 수 있다. 상기 관련된 항체는 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포숙시니마이드 에스터(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(시스테인 잔기를 통한 결합), N-하이드록시숙시니마이드(N-hydroxysuccinimide)(라이신 잔기를 통해), 글루타알데하이드(glutaraldehyde), 숙시닉 안하이드라이드(succinic anhydride), SOC12, 또는 R과 R'은 다른 알킬기인, R'N=C=NR와 같은, 이작용기 또는 유도체화 시약을 사용하여 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 같은, 면역화되는 종에서 면역원성이 있는 단백질과 결합하는데 유용할 것이다. 동물들은 상기 항원, 예를 들면, SYNGR4, 면역원성의 결합체, 또는 유도체에 대하여 예를 들면, 3배 부피의 프로인트 완전 아쥬반트(Freund's complete adjuvant)와 상기 단백질 또는 결합체의 100 μg 또는 5 μg를 결합하고 상기 용액을 여러 부위에 피부내로 주사함으로써 면역화한다. 한달 후 상기 동물을 프로인트 완전 아쥬반트에 원래 펩타이드 또는 결합체의 1/5 내지 1/10으로 여러 부위에 피하 주사하여 면역화한다. 7 내지 14일 후 상기 동물을 채혈하고 혈청은 항체 역가를 위해 분석하였다. 동물은 상기 역가가 안정기가 될 때까지 면역화하였다. 바람직하게는, 상기 동물은 동일한 항원, 그러나 다른 단백질 및/또는 다른 교차 결합 시약과 결합된 결합체로 면역화한다.
또한 결합체는 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 명반(alum)과 같은 응집체가 면역 반응을 증진시키기 위하여 적절하게 사용된다.
(ⅱ) 단일클론 항체:
단일클론 항체는 상당히 균질한 항체의 집단으로부터 수득되고, 즉, 상기 집단을 포함하는 상기 각각의 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 상기 수식어 “단일클론”은 별개의 항체의 혼합물이 될 수 없는 상기 항체의 특성을 나타낸다.
예를 들면, 상기 단일클론 항체는 Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 번호 4,816,567).
상기 하이브리도마 방법에 있어서, 마우스 또는 햄스터 같은, 다른 적절한 숙주 동물은, 면역화에 사용된 상기 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위하여 상기 기재된 바에 따라 면역화된다. 또는, 림프구는 시험관 내에서 면역화 될 수 있다. 그런 다음 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜과 같은, 적절한 융합제를 사용하여 마이엘로마 세포와 융합된다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이에 따라 제조된 상기 하이브리도마 세포는 비융합된, 부모 마이엘로마 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 물질을 포함하는 적절한 배양 배지에 분주하고 배양한다. 예를 들면, 만약 부모 마이엘로마 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT or HPRT)가 없다면, 상기 하이브리도마에 대한 배양 배지는 하이포잔틴, 아미노프테린(aminopterin), 및 티미딘(thymidine) (HAT 배지)를 포함할 것이며, 이 물질들은 HGPRT-결실 세포의 성장을 방해한다.
바람직한 마이엘로마 세포는 효율적으로 융합되고, 상기 선별된 항체 생산 세포에 의해 항체의 안정적인 고수준 생산을 돕는 것이고, HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감하다. 이들 중에, 바람직한 마이엘로마 세포주는 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA에서 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것과 같은, 쥐의 마이엘로마주이다. 또한 인간 마이엘로마 및 마우스-인간 헤테로마이엘로마 세포주는 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 제시되고 있다(Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 상기 항원에 대해 직접적인 단일클론 항체의 생산을 위해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 제조된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)와 같은, 시험관 내 결합 분석법에 의해 결정된다.
상기 단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들면, Munson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39의 30 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체가 제조된 것으로 확인된 후, 클론은 한계희석 과정에 의해 서브클론될 수 있고 표준 방법에 의해 성장할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적을 위해 적절한 배양 배지는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPML-1640 배지를 포함한다. 더욱이, 상기 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 상기 단일클론 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 일반적인 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
상기 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 일반적인 과정을 사용하여 손쉽게 분리되고 염기서열 분석된다(예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용함). 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 사용된다. 분리된 후, 상기 DNA는 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 그런 다음 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 위하여, 면역글로불린 단백질을 그 외에는 생산하지 않는 E.Coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 마이엘로마 세포와 같은 숙주 세포내로 형질전환된다. 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 종설 논문은 Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):256-62 및 Pluckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88을 포함한다.
SYNGR4에 대해 반응하는, 특정 항체, 또는 항체 단편을 형성하는 또 다른 방법은, SYNGR4와 함께 박테리아에서 발현되는, 면역글로불린 유전자, 또는 이의 부분을 암호화하는 발현 라이브러리를 선별하는 것이다. 예를 들면, 완전한 Fab 단편, VH 부위 및 Fv 부위는 파지 발현 라이브러리를 사용하여 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를 들면, Ward ES, et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6; Huse WD, et al., Science. 1989 Dec 8;246(4935):1275-81; 및 McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4를 참조한다. SYNGR4 펩티드가 있는, 이러한 라이브러리의 탐색은, SYNGR4와 반응하는 면역글로불린 단편을 동정할 수 있다. 또는, SCID-hu-마우스 (Genpharm으로부터 입수가능)가 항체 또는 이의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 파지 라이브러리를 사용하여, 각각, 쥐 및 인간 항체의 분리를 기재하고 있는 McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4; Clarkson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8; 및 Marks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 후속 발표에서는 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전력으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합뿐만 아니라(Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 1121(9):2265-6). 체인 셔플링에 의한 고친화성(nM 범위) 인간 항체의 제조(Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83)를 제시한다. 따라서, 단일클론 항체의 분리를 위한 이러한 기술은 통상적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술의 대체로서 가능하다.
또한 상기 DNA는 예를 들면, 균일한 쥐 서열에 있는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나(미국 특허 번호 4,816,567; Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5), 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 서열에 공유적으로 결합함으로써 변형될 수 있다.
일반적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인이 치환되거나, 또는 하나의 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 부위 및 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메릭 이가 항체를 형성하기 위하여 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인이 치환된다.
(ⅲ) 인간화 항체:
비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법이 당업계에 제시되고 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것의 내로 삽입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 대개 "임폴트(import)" 잔기로서 나타내고, 이는 일반적으로 "임폴트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 과가변 부위 서열을 치환함으로써, 윈터 및 연구진의 방법에 따라 근본적으로 실시될 수 있다(Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메릭 항체이고 (미국 특허 번호. 4,816,567) 온전한 인간 가변 도메인보다 상당히 적게 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환되고 있다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 과가변부 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위에서의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다
인간화 항체의 제조에 사용되는, 경쇄 및 중쇄 모두, 인간 가변 도메인의 선택은, 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)"이라는 방법에 따라, 설치류 항체의 상기 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 탐색된다. 상기 설치류의 서열과 가장 가까운 상기 인간 서열은 그런 다음 상기 인간화 항체에 대해 인간 프레임워크 부위 (framework region, FR)로서 받아들여진다(Sims MJ, et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308; Chothia C & Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 일치 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 부위를 사용한다. 상기 동일한 프레임워크는 몇몇의 다른 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다(Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9; Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32).
상기 항원 및 다른 유리한 생물학적 특성에 대한 높은 친화성의 보유와 함게 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념의 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 흔히 사용 가능하고 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 보여주고 표현하는 컴퓨터 프로그램이 사용 가능하다. 이러한 표현의 관찰은 상기 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능성 있는 역할의 분석, 즉, 그것의 항원에 결합하기 위한 상기 후보 면역글로불린의 활성에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로, FR 잔기는 수용자 및 임폴트 잔기로부터 선별되고 결합될 수 있고 그리하여 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은, 원하는 항체 특성이 얻어진다. 일반적으로, 상기 과가변부 잔기는 항원 결합 영향력에 직접적이고 가장 현저히 연관되어 있다.
(ⅳ) 인간 항체:
인간화에 대한 대체로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들면, 면역화에 대해, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 전체 목록을 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들면, 마우스)을 현재 생산가능하다. 예를 들면, 키메릭 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 부위(heavy-chain joining region, JH)의 동형접합적 결실이 제시되고 있고 그 결과 내인성 항체 생산의 완벽한 억제가 야기된다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 상기 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 공격에 대해 인간 항체의 생산을 야기할 것이다. 예를 들면, Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5; Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8; Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40; 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369 및 5,545,807을 참조한다. 또는, 파지 디스플레이 기술(McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4)은 비면역화된 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 목록으로부터, 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은, 섬질의 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코드 단백질 유전자 중 하나로 뼈대가 완성되어 클로닝되고, 상기 파아지 입자의 표면에서 기능적 항체 단편으로서 표현된다. 상기 섬질의 입자가 파아지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 상기 항체의 기능적 특성에 기초한 선별은 그러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선별을 야기한다. 따라서, 상기 파아지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파아지 디스플레이는 다양한 구성 방식에서 실시될 수 있다; 그들의 총평을 위해 예를 들면, Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71을 참조한다. V 유전자 단편의 몇몇 공급원은 파아지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다.
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 분리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 목록은 구축될 수 있고 항원(자가 항원을 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체는 Marks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97, 또는 Griffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34에 기재된 기술에 따라 근본적으로 분리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
또한 인간 항체는 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 번호 20 5,567,610 및 5,229,275 참조). SCID 마우스를 사용한 인간 항체 생성의 바람직한 방법은 공동소유하는, 공동 계류중인 출원에 공개된다.
(ⅴ) 항체 단편:
다양한 기술이 항체 단편이 제조를 위해 개발되고 있다. 일반적으로, 이러한 단편들은 온전한 항체의 단백질 가수 분해를 통해 유래되었다(Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar;24(1-2):107-17; Brennan M, et al., Science. 1985 Jul 5;229(4708):81-3 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 제시된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 또는, Fab'SH 단편은 E.coli로부터 직접적으로 찾을 수 있고 F (ab') 2개 단편을 형성하기 위하여 화학적으로 결합될 수 있다(Carter P, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7). 또 다른 접근법에 따라, F (ab') 2개 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에 있어서, 선택된 상기 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 또한 상기 항체 단편은 예를 들면, 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같이, "선형 상체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다.
(ⅵ) 비-항체 결합 단백질:
상기 용어 "비-항체 결합 단백질" 또는 "비-항체 리간드" 또는 "항원 결합 단백질"은 하기 보다 상세히 기재한 바와 같이, 아드넥틴(adnectins), 아비머(avimers), 단쇄 폴리펩티드 결합 분자, 및 항체-유사 결합 펩티도미메틱스를 포함한, 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드를 사용하는 항체 모방체를 호환적으로 의미한다.
항체와 유사한 방법으로 표적하고 표적에 결합하는 다른 화합물들이 개발되고 있다. 이러한 어떠한 "항체 모방체"는 항체의 가변부에 대한 대체 단백질 프레임워크로서 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드를 사용한다.
예를 들면, Ladner 등은(US Pat No. 5,260,203) 합쳐졌으나, 분자적으로는 분리된, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부와 유사한 결합 특이성을 갖는 단일 폴리펩티드 체인 결합 분자를 제시한다. 상기 단쇄 결합 분자는 펩티드 링커에 의해 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부 모두의 항원 결합 부위를 포함하고 상기 두 펩티드 항체와 유사한 구조로 접힐 것이다. 상기 단쇄 결합 분자는 작은 크기, 큰 안정성 및 더욱 쉬운 변형을 포함하는, 종래의 항체를 뛰어넘는 몇몇의 장점을 나타낸다.
Ku 등은(Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995)) 시토크롬 b562를 기초로 항체에 대한 대체를 제시한다. Ku 등은(1995) 소혈청알부민에 대한 결합을 위해 임의로 추출되고 선별된 시토크론 b562의 2개의 루프가 있는 라이브러리를 형성하였다. 각각의 돌연변이체는 항-BSA 항체와 유사한 BSA와 선별적으로 결합하기 위해 확인되었다.
Lipovsek 등은(미국 특허 번호 6,818,418 및 7,115,396) 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유사 단백질 스캐폴드 및 적어도 하나의 가변 루프를 나타내는 항체 모방체를 제시한다. 아드넥틴으로 알려진, 이러한 피브로넥틴-기반 항체 모방체는 모든 표적화 리간드에 대해 높은 친화성 및 특이성을 포함한, 천연 또는 가공된 항체의 많은 동일한 특성을 나타낸다. 발전하는 신규하거나 또는 증진된 결합 단백질을 위한 모든 기술은 이러한 항체 모방체로 사용될 수 있다.
이러한 피브로넥틴-기반 항체 모방체의 구조는 IgG 중쇄의 가변부의 구조와 유사하다. 따라서, 이러한 모방체는 성질이 유사한 항원 결합 특성 및 원래의 항체에 대한 친화성을 나타낸다. 또한, 이러한 피브로넥틴 기반 항체 모방체는 항체 및 항체 단편을 뛰어넘는 어떠한 이점을 나타낸다. 예를 들면, 이러한 항체 모방체는 원래의 접힘 안정성을 위한 이황화 결합에 의존적이지 않고, 따라서, 보통 항체를 분해하는 조건하에서 안정적이다. 게다가, 이러한 피브로넥틴 기반 항체 모방체의 구조가 IgG 중쇄와 유사하기 때문에, 루프 확률화 및 셔플링을 위한 과정이 생체 내에서 항체의 친화성 성숙의 과정과 유사한 시험관 내에서 실시될 수 있다.
Beste 등은(Proc Natl Acad Sci USA 96(5):1898-1903 (1999)) 리포칼린(lipocalin) 스캐폴드에 기초한 항체 모방을 제시한다. 리포칼린은 상기 단백질의 말단에 4개의 과가변 루프를 갖는 베타-통형으로 구성된다. Beste (1999)는 상기 루프를 임의의 돌연변이화하고 예를 들어, 플루오레세인과 결합에 대해 선별하였다. 하나의 변이체는 항-플루오레세인 항체와 유사한 결합을 나타내면서, 3개의 변이체들이 플루오레세인과 특이적 결합을 하는 것으로 나타났다. 추가 분석은 모든 임의의 부위가 가변적인 것을 나타냈고, 안티칼린(Anticalin)(상표로 등록된)이 항체에 대한 대체로서 적절하게 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
안티칼린 (상표로 등록된)은 일반적으로 160 및 180 잔기 사이의, 작은, 단쇄 펩티드이며, 절감된 생산 비용, 증가된 저장에 안정성 및 감소된 면역 반응을 포함한, 항체를 뛰어넘는 몇몇의 장점을 제공한다.
Hamilton 등은(미국 특허 번호 5,770,380) 결합 부위로서 사용된 다중 가변 펩티드 루프에 부착된, 엄격한, 칼릭세린(calixarene)의 비-펩티드 유기 스캐폴드를 사용한 합성적 항체 모방을 제시한다. 상기 펩티드 루프는 서로에 대하여, 상기 칼릭세린으로부터 기하학적으로 동일한 측면으로부터 나타난다. 이러한 기하학적 확인 때문에, 모든 상기 루프는 리간드에 대한 결합, 결합 친화성 증가에 사용 가능하다. 그러나, 다른 항체 모방체와 비교하여, 상기 칼릭세린 기반 항체 모방체는 전적으로 펩티드로 이루어져 있지 않고, 따라서 프로테아제 효소에 의한 공격에 덜 취약하다. 상기 스캐폴드는 펩티드, DNA 또는 RNA 어느 것으로도 순수하게 이루어지지 않고, 이러한 항체 모방체는 극한의 환경 조건하에서 비교적 안정적이고 긴 수명을 갖는다. 또한, 칼릭세린 기반의 항체 모방체가 비교적 작기 때문에, 면역 반응을 덜 발생시킬 수 있다.
Murali 등은(Cell Mol Biol. 49(2):209-216 (2003)) 더 작은 펩티드미메틱스로 항체를 감소시키기 위한 방법론을 제시하고, 그들은 또한 항체에 대한 대체로서 유용할 수 있는 "항체 유사 결합 펩티드미메틱스"(ABiP)라고 명명한다.
Silverman 등은(Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561) "아비머(avimers)"라고 명명된 다중 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드인 융합 단백질을 제시한다. 시험관 내 엑손 셔플링 및 파아지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 발달된 상기 아비머는 다양한 표적 분자에 대한 그들의 친화성 및 특이성에 있어서 항체와 다소 유사한 결합 단백질의 하나의 종류이다. 그 결과인 다중도메인 단백질은 단일-에피토프 결합 단백질과 비교하여 증진된 친화성(경우에 따라서는 서프-나노몰) 및 특이성을 나타낼 수 있는 다중 독립된 결합 도메인을 포함할 수 있다. 구성의 방법에 관한 추가적인 상세한 내용 및 아비머의 사용이 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384에 기재되었다.
비-면역글로불린 단백질 프레임워크와 더불어, 항체 특성은 이에 한정되지 않으나, 본 발명에서 사용에 적합한 모든 RNA 분자 및 비천연적인 올리고머(예를 들면, 프로테아제 억제제, 벤조디아제핀, 퓨린 유도체 및 베타-회전 미믹스)를 포함한 화합물에서 또한 모방되었다.
(ⅶ) 약학적 조성물:
본 발명에 따라 사용되는 본 항체의 약학적 조성물은 선택적 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 원하는 정도의 순도를 갖는 항-SYNGR4 항체를 혼합함으로써 저장을 위해, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로, 제조될 수 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams and Wilkins, 2005). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 인산염, 구연산염, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(옥사데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)); 헥사메토니윰 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤즈알코니윰 클로라이드(benzalkonium chloride); 벤즈에토니윰 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 잔기 이하) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리바이닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 폴리머; 클리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 짝이온; 금속 복합물(예를 들면, Zn-단백질 복합물); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 비이온 계면활성제와 같은 버퍼를 포함한다.
피하주사에 적합한 동결건조된 제형은 W097/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 높은 단백질 농도를 위해 적절한 희석제로 재구성될 수 있고 상기 재구성된 제형은 본 발명에서 치료될 포유동물에 피하로 주사될 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 제형은 치료되는 특정 증상에 대해 필요한 것으로서, 바람직하게는 서로 부정적인 효과가 없는 상보적 활성을 가지는 것인, 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역억제제를 추가적으로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 다음 약제의 유효한 양은 조성물에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 형태, 및 상기 언급한 다른 인자에 의존적이다. 이는 일반적으로 상기 사용된 투여 경로에 따라 동일한 용량 또는 상기 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
또한 활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation)에 의해 또는 계면의 중합반응에 의해, 예를 들면 콜로이달 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스페어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐과 같은, 제조된 마이크로캡슐에 포함될 수 있다. 이러한 기술은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams and Wilkins, 2005에 제시되어 있다.
지속적으로 분비되는 약제가 제조될 수 있다. 지속적으로 분비되는 약제의 적절한 예시에는 상기 약제를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐과 같은, 성형품의 형태이다. 지속적으로 방출하는 매트릭스의 예시에는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들면, 폴리 (2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리 (바이닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루타민산 및 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 금색 분해가능한 에틸렌-바이닐 아세테이트, LUPRON DEPOT (젖산-글리콜산 코폴리머 및 루프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate)로 구성된 주사가능한 마이크로스페어)와 같은 분해가능한 젖산-글리콜산 코폴리머, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티릭산(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)을 포함한다. 생체 내 투여를 위해 사용되는 상기 제형은 반드시 멸균되어야한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 손쉽게 실시될 수 있다.
(ⅷ) 항체를 이용한 치료:
항-SYNGR4 항체를 포함하는 조성물은 우수한 의료행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 복용되며, 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간, 키메릭 또는 인간화 항체 scFv, 또는 항체 단편일 수 있다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 바람직하게는 치료되는 폐암, 바람직하게는 치료되는 포유동물, 상기 각각의 환자의 임상적 상태, 질환 또는 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료행위자에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 투여되는 상기 항체의 치료적으로 유효한 양은 이러한 고려사항에 의해 지배될 수 있다.
일반적인 제의에 따라, 투여량 당 비경구적으로 투여되는 상기 항체의 치료적으로 유효한 양은 약 2 내지 10 ㎎/㎏의 범위로 사용되는 항체의 일반적인 개시 범위를 갖는, 하루당 환자 몸무게의 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏의 범위일 수 있다.
그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 항체의 제시되는 용량은 많은 치료적 신중성에 지배를 받는다. 적절한 용량 및 일정을 선택하는 중요한 요인은 상기 제시한 바에 따라, 얻은 결과이다.
예를 들면, 상대적으로 높은 용량은 진행중인 급성 질환의 치료에 처음으로 필요로할 것이다. 가장 효과적인 결과를 얻기 위해서, 질환 및 장애에 따라, 항체는 상기 질환 또는 장애의 최초 징후, 진단, 외관, 또는 발생에 가능한 가깝거나 또는 상기 질환 또는 장애의 차도 동안 투여될 수 있다.
상기 항체는 비경구적, 피하, 복강내, 폐내, 흡입 및 비강내를 포함하는, 모든 적절한 수단에 의해 투여될 수 있고, 만약 국소적 면역억제 치료가 요구된다면, 병변내 투여한다. 비경구적인 투입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다.
더욱이, 상기 항체는 예를 들면, 항체의 감소한 투여량으로, 펄스 투입에 의해 적절하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여량은 주사에 의해 제공되고, 상기 투여가 잠시 동안인지 또는 만성적인지에 따라, 가장 바람직하게는 정맥 또는 피하 주사한다.
본 발명의 상기 항체와 함께 세포독성제, 화학치료제, 면역저해제 및/또는 사이토카인과 같은, 다른 화합물을 추가적으로 투여할 수 있다. 결합된 투여는 분리된 제형 또는 단일 약학적 조성물, 및 순서대로 연속적 투여를 사용한, 공동 투여를 포함하고, 여기에서 바람직하게는 두 개 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타내는 시간대가 있다.
환자에 대한 항체의 투여를 제외하고, 본 발명은 유전자 치료에 의한 상기 항체의 투여를 고려한다. 항체를 암호화하는 핵산의 이러한 투여는 "항체의 치료적으로 유효한 양을 투여" 표현에 의해 포함된다. 예를 들면, 1996년 3월 14일에 공개된, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 치료의 사용에 대한 W096/07321을 참조한다.
핵산(벡터와 선택적으로 결합된)을 환자의 세포내로 전달하는 두 가지 주요 접근법이 있다; 생체 내 및 생체 외. 생체 내 전달을 위해 상기 핵산은 상기 환자, 일반적으로 상기 항체가 요구되는 부위에 직접적으로 주사될 수 있다. 생체 외 처리를 위하여, 상기 환자의 세포가 제거되고, 상기 핵산은 이렇게 분리된 세포내로 도입되며 상기 변형된 세포는 직접적 또는, 예를 들면, 상기 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화되어 상기 환자에게 투여된다(예를 들면, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187을 참조한다). 핵산을 살아있는 세포 내로 도입하기 위해 사용 가능한 다양한 기술들이 있다. 상기 기술은 상기 핵산이 만들어진 숙주의 세포에서 배양된 세포 내로 시험관 내 또는 생체 내 중 어느 것으로 전달되는지에 따라 다양하다. 시험관 내에서 핵산을 포유동물 세포 내로 전달하는데 적절한 방법은 리포솜, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DAEA-덱스트란, 인산칼슘 침전법, 등의 사용을 포함한다. 유전자의 생체 외 전달에 주로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바랍직한 생체 내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터(아데노바이러스, 단순포진 Ⅰ 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스)를 사용한 형질전환 및 리피드 기반 시스템(상기 유전자의 리피드 매개된 전달을 위한 유용한 리피드는, 예를 들면, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)을 포함한다. 어떠한 상황에 있어서 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 상기 표적 세포 상에 수용체에 대한 리간드, 등과 같이, 표적 세포를 표적하는 약제에 상기 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직하다. 여기에 리포솜이 사용되고, 예를 들면, 특정 세포 형태성의 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 주기에 내면화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치를 표적하고 세포내 수명을 증진시키는 단백질과 같은, 엔도사이토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 흡수 촉진을 위해 사용될 수 있다. 수용체 매개 엔도사이토시스의 기술이 예를 들면, Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87 : 3410-3414 (1990)에 기재되어 있다. 현재 알려진 유전자 마킹 및 유전자 치료 과정의 총설은 Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)를 참조한다. 또한 WO 93/25673을 참조하고 상기 참조는 그 안에 인용하였다.
이중 가닥 분자
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "이중 가닥 분자"는 예를 들면, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)(siRNA; 예를 들면, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)) 및 짧은 간섭 DNA/RNA[siD/R-NA; 예를 들면, DNA 및 RNA의 이중 가닥 키메라(dsD/R-NA) 또는 DNA 및 RNA의 작은 헤어핀 키메라(shD/R-NA))를 포함하고, 표적 유전자의 발현을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 분리되거나 재조합된다.
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "dsRNA"는 표적 mRNA의 전사를 방해하는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. RNA가 전사되는 것으로부터 주형이 되는 DNA가 있는 것을 포함하는, siRNA를 세포 내로 도입하는 표준 기술이 사용된다. 상기 siRNA는 SYNGR4 센스 핵산 서열(또한 "센스 가닥"으로서 나타내진다), SYNGR4 안티센스 핵산 서열(또한 "안티센스 가닥"으로 나타내진다) 또는 모두를 포함한다. 상기 siRNA는 예를 들면, 헤어핀과 같은, 센스 및 표적 유전자의 상보적인 안티센스 핵산 서열을 갖는 단일 전사체를 구성할 수 있다. 상기 siRNA는 dsRNA 또는 shRNA 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "dsRNA"는 서로에게 상보적인 서열로 구성된 2개의 RNA 분자의 컨스트럭트 및 이중 가닥 RNA 분자를 형성하기 위한 상보적인 서열을 통해 함께 어닐링되는 것을 의미한다. 2개 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" RNAs뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비-암호화 부위로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "shRNA"는 서로 상보적인 제1 및 제2 부위, 즉, 센스 및 안티센스 가닥으로 구성된, 스템-루프 구조를 갖는 siRNA를 의미한다. 상기 부위의 상보성 및 방향성의 정도는 염기쌍이 부위들 사이에 형성하는데 충분하고, 상기 제1 및 제2 부위는 루프 부위에 의해 결합되며, 상기 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이의 염기쌍의 결여에 기인한다. shRNA의 상기 루프 부위는 상기 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재한 단일 가닥 영역이며, "개재 단일 가닥(intervening single-strand)"이라고도 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "siD/R-NA"는 RNA 및 DNA 모두로 구성되고, RNA 및 DNA의 하이브리드 및 키메라를 포함하며, 표적 mRNA의 번역을 방해하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 하이브리드는 DNA로 구성된 폴리뉴클레오티드 및 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드가 서로 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하는 분자를 가리키고; 한편 키메라는 이중 가닥 분자를 구성하는 가닥의 한쪽 또는 양쪽이 RNA 및 DNA를 포함할 수 있는 것을 나타낸다. siD/R-NA를 세포 내로 도입하는 표준적인 기술이 이용된다. 상기 siD/R-NA는 SYNGR4 센스 핵산 서열(또한 "센스 가닥"이라고 나타냄), 및 SYNGR4 안티센스 핵산 서열(또한 "안티센스 가닥"이라고 나타냄), 또는 이들 모두를 포함한다. 상기 siD/R-NA는, 예를 들면, 헤어핀과 같은, 표적 유전자로부터의 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 서열 모두를 갖는 단일 전사체로 구성될 수 있다. 상기 siD/R-NA는 dsD/R-NA 또는 shD/R-NA 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "dsD/R-NA"는 서로 상보적인 서열을 포함하고, 상기 상보적 서열을 통해 서로 어닐링(anealing)하여 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 형성하고 있는 2개의 분자로 이루어진 구조물을 나타낸다. 상기 두 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비암호화 뷰위로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 dsD/R-NA를 구성하는 2개의 분자의 하나 또는 두 개 모두는 RNA 및 DNA로 구성되거나(키메릭 분자), 또는, 상기 분자의 하나는 RNA로 구성되고 다른 하나는 DNA로 구성된다(하이브리드 이중 가닥).
본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "shD/R-NA"는, 서로 상보적인 제1 및 제2 부위, 즉, 센스 및 안티센스 가닥으로 구성되는, 스템-루프 구조를 갖는 siD/R-NA를 나타낸다. 상기 부위의 상보성과 방향성의 정도는 염기쌍이 영역들 사이에 형성하는데 충분하고, 제1 및 제2 부위는 루프 부위에 의해 연결되며, 상기 루프는 루프 부위 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이에 염기쌍의 결여로부터 기인한다. shD/R-NA의 상기 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재한 단일 가닥 부위이며, 상기 "개재 단일 가닥"이라고도 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는, "분리된 핵산"은 그것의 원래의 환경(예를 들면, 만약 천연적으로 발생한 경우 천연 환경)으로부터 제거된 핵산이고 따라서, 그것의 천연 상태로부터 합성적으로 변형된다. 본 발명에 있어서, 분리된 핵산의 예시에는 DNA, RNA, 및 이의 유도체를 포함한다.
SYNGR4에 대한 이중 가닥 분자는, 표적 mRNA에 혼성화하고, 상기 유전자의 정상적인 단일 가닥 mRNA 전사체와 연관됨으로써 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 SYNGR4 단백질의 생산을 감소 또는 억제하고, 따라서 번역을 방해하여, 상기 단백질의 발현을 억제한다. 본 발명에서 나타낸 바와 같이, 폐암 세포주에서 SYNGR4의 발현은 SYNGR4 암호화 유전자에 특이적으로 어닐링되는 dsRNA에 의해 억제된다(도. 3a). 따라서 본 발명은 상기 SYNGR4 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우 SYNGR4의 발현을 억제하는 분리된 이중 가닥 분자를 제공한다. 이중 가닥 분자의 표적 서열은 하기 언급된 것과 같은 siRNA 설계 알고리즘에 의해 설계될 수 있다.
SYNGR4 표적 서열은 예를 들면, 뉴클레오티드
서열번호 11 (서열번호 13의 389-407nt 지점)
서열번호 12 (서열번호 13의 754-772nt 지점)을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 하기 이중 가닥 분자 [1] 내지 [18]을 제공한다:
[1] 세포 내로 도입되는 경우, 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화되는, 그것에 상보적인 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 분자이고, 특이적으로 SYNGR4의 발현을 억제하는, 분리된 이중 가닥 분자;
[2] 상기 이중 가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12(서열번호 13의 754-772nt 지점에서)중에서 선택되는 표적 서열에 매칭하는 SYNGR4 mRNA에 작용하는, 상기 [1]의 이중 가닥 분자;
[3] 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, 상기 [2]의 이중 가닥 분자;
[4] 약 100개 이하 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 상기 [3]의 이중 가닥 분자;
[5] 약 75개 이하 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 상기 [4]의 이중 가닥 분자;
[6] 약 50개 이하 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 상기 [5]의 이중 가닥 분자;
[7] 약 25개 이하 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 상기 [6]의 이중 가닥 분자;
[8] 약 19개와 약 25개 뉴클레오티드 사이의 길이를 갖는, 상기 [7]의 이중 가닥 분자;
[9] 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [1]의 이중 가닥 분자;
[10] [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 가닥, [B]는 3 내지 23개의 폴리뉴클레오티드로 구성된 상기 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥인, 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, 상기 [9]의 이중 가닥 분자;
[11] RNA로 구성된, 상기 [1]의 이중 가닥 분자;
[12] DNA 및 RNA 모두로 구성된, 상기 [1]의 이중 가닥 분자;
[13] 상기 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드 및 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드인, 상기 [12]의 이중 가닥 분자;
[14] 상기 센스 및 안티센스 가닥이 각각 DNA 및 RNA로 구성된, 상기 [13]의 이중 가닥 분자;
[15] 상기 분자는 DNA 및 RNA의 키메라인, 상기 [12]의 이중 가닥 분자;
[16] 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 측면 부위, 또는 센스 가닥의 5'-말단에 측변 부위 및 안티센스 가닥의 3'-말단에 측면 부위 모두가 RNA인, 상기 [15]의 이중 가닥 분자;
[17] 상기 측면 부위는 9 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된, 상기 [16]의 이중 가닥 분자; 및
[18] 상기 분자는 3'오버행을 포함하는, 상기 [2]의 이중 가닥 분자;
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 하기에 더욱 상세히 기재될 것이다.
세포에서 표적 유전자 발현을 억제하는 활성을 갖는 이중 가닥 분자 설계 방법이 알려져 있다(예를 들면, 그 전체에서 참조에 의해 본 발명에 통합되는, 미국 특허 번호 6,506,559 참조). 예를 들면, siRNA 설계 컴퓨터 프로그램은 Ambion 웹사이트에서 이용가능하다(on the worldwide web at ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).
상기 컴퓨터 프로그램은 하기 과정에 기초한 이중 가닥 분자에 대한 표적 뉴클레오티드 서열을 선별한다.
표적 부위의 선별
1. 상기 전사체의 AUG 시작 코돈(codon)으로부터 시작하여, AA 디-뉴클레오티드(di-nucleotide) 서열에 대한 다운스트림(downstream)을 스캔한다. 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 각각의 AA 및 3'에 인접한 19개의 뉴클레오티드의 발생을 기록한다. Tuschl 등은 5' 및 3' 비번역 부위(untranslated regions, UTRs) 및 시작 코돈 근방 부위(75 염기 이내)에 대한 siRNA 설계를 방지하는 것을 제안하였고, 이는 이러한 부위가 조절 단백질 결합 부위에서 더욱 풍부할 수 있으며, UTR 결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체가 siRNA 엔도뉴클레아제(endonuclease) 복합체의 결합을 방해할 수 있기 때문이다.
2. 잠재적인 표적 부위를 적절한 인간 게놈 데이터베이스 (인간, 마우스, 랫트, 등)와 비교하여 다른 암호화 서열에 대하여 유의적인 상동성을 갖는 임의의 표적 서열을 검토 대상에서 제외한다. 기본적으로, NCBI 서버: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 찾을 수 있는, 블라스트(BLAST)가 이용된다(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402).
3. 합성을 위해 적합한 표적 서열을 선별한다. 평가하기 위한 유전자의 길이에 따라 몇몇의 표적 서열이 선별될 수 있다.
상기 프로토콜을 사용하여, 본 발명의 상기 분리된 이중 가닥 분자의 상기 표적 서열은 SYNGR4 유전자에 대하여 서열번호 11, 12, 19 및 20으로서 설계되었고, 상기 언급한 표적 서열을 표적하는 이중 가닥 분자는 상기 표적 서열을 발현하는 세포의 성장을 저해하는 그들의 활성에 대해 각각 검사되었다. 따라서, 본 발명은 SYNGR4 유전자에 대하여 서열번호 11 (서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 12 (서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 19 (서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 20 (서열번호 13의 520-538nt 지점에서)의 군으로부터 선택되는 임의의 서열을 표적하는 이중 가닥 분자를 제공한다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 단일 표적 SYNGR4 유전자 서열로 보내질 수 있거나 복수의 표적 SYNGR4 유전자 서열에 보내질 수 있다.
SYNGR4 유전자의 상기 언급한 표적 서열을 표적하는 본 발명의 이중 가닥 분자는 표적 서열의 임의의 핵산 서열 및/또는 상기 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. SYNGR4 유전자를 표적하는 폴리뉴클레오티드의 예시로는 서열번호 11, 12, 19 또는 20의 서열을 포함하는 것 및/또는 이러한 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함한다; 그러나, 본 발명은 이러한 예시들에 한정되지 않고, 상기 핵산 서열에서 소수의 변형은 상기 변형된 분자가 SYNGR4 유전자의 발현을 억제하는 활성을 보유하는 한 사용가능하다. 본 발명에서, 핵산 서열과 관련되어 사용된 상기 어구 "소수의 변형"은 상기 서열에 대한 핵산의 하나, 두개 또는 다수의 치환, 결실, 첨가 및 삽입을 나타낸다.
본 발명의 문맥에 있어서, 핵산 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 관한 상기 용어 "다수"는 3~7, 바람직하게는 3~5, 더욱 바람직하게는 3~4, 가장 바람직하게는 3개의 핵산 잔기를 의미할 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 이중 가닥 분자는 실시예에서 사용된 방법을 사용하여 그것의 활성에 대하여 검사될 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에 있어서, SYNGR4 유전자의 mRNA의 다양한 부분의 센스 가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되는 이중 가닥 분자는 표준 방법에 따라 폐암 세포주(예를 들면, A549 및 SBC-5를 사용한)에서 SYNGR4 유전자 산물의 생산을 감소시키는 그들의 활성에 대해 시험관 내에서 검사된다. 또한, 예를 들면, 후보 물질의 부재하에서 배양된 세포와 비교하여 후보 이중 가닥 분자가 접촉된 세포에서 SYNGR4 유전자 산물의 감소는 예를 들면, 실시예 1 "반정량적 RT-PCR"에 기재된 SYNGR4 mRNA에 대한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 검출될 수 있다. 시험관 내 세포 기반 분석에서 SYNGR4 유전자 산물의 생성을 감소하는 서열은 그런 다음 폐암 세포 성장에 대한 그들의 억제 효과에 대하여 검사될 수 있다. 시험관 내 세포 기반 분석에서 폐암 세포 성장을 억제하는 서열은, SYNGR4 산물의 감소된 생산과 감소된 폐암 세포 성장을 확인하기 위하여, 그런 다음 폐암에 걸린 동물, 예를 들면, 누드 마우스 이종이식 모델을 사용하여 그들의 생체 내 활성을 검사할 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드가 RNA 또는 이의 유도체인 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에서 염기 "t"는 "u"로 교체된다. 본 발명에서 사용되는, 상기 용어 "상보적인"은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick ) 또는 후그스틴 염기쌍을 의미하고, 상기 용어 "결합"은 두 폴리뉴클레오티드 사이에 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-인산디에스테르 결합을 포함하는 경우, 또한 이러한 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법으로 서로 결합될 수 있다. 일반적으로, 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열은 미스매치가 약간 있거나 없는 안정적인 이중가닥을 형성하기 위하여 적절한 조건하에서 혼성화한다. 또한, 본 발명의 상기 분리된 폴리뉴클레오티드의 상기 센스 서열 및 안티센스 서열은 혼성화에 의해 이중 가닥 분자 또는 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 이러한 이중가닥은 10개의 매치마다 1개 이내의 미스매치를 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 이중가닥의 상기 가닥은 미스매치가 없는 이중가닥과 같이, 완벽하게 상보적이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 SYNGR4에 대하여 바람직하게는 1000개 이하 길이의 뉴클레오티드이다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 모든 상기 유전자에 대하여 500, 200, 100, 75, 50, 또는 25개 이하 길이의 뉴클레오티드이다. 본 발명의 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 SYNGR4 유전자에 대한 이중 가닥 분자 형성를 형성하거나 또는 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 주형 DNA를 제조하는데 유용하다. 상기 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 분자 형성을 위해 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥은 19개의 뉴클레오티드보다 길 수 있고, 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드보다 길 수 있으며, 더욱 바람직하게는 약 19 및 25개 사이 길이의 뉴클레오티드이다. 따라서, 본 발명은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 상기 이중 가닥 분자를 제공하고, 상기 센스 가닥은 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 센스 가닥은 19 및 25개 사이의 뉴클레오티드 쌍 길이를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에서 안티센스 가닥과 혼성화한다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-인산디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 화학적 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성, 유효성, 및/또는 세포 흡수를 증가시킬 수 있다. 당업자는 본 발명의 분자 내에 삽입될 수 있는 다른 형태의 화학적 변형을 알 수 있을 것이다(WO03/070744; WO2005/045037). 하나의 실시태양에 있어서, 변형은 분해에 대해 향상된 저항성 또는 향상된 흡수를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형의 예시로는, 이에 한정되지 않으나, 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드(2'-O-methyl ribonucleotides)(특히 이중 가닥 분자의 센스 가닥 상에), 2'-디옥시-플루오로 리보뉴클레오티드(2'-deoxy-fluoro ribonucleotides), 2'-디옥시 리보뉴클레오티드(2'-deoxy ribonucleotides), "일반적인 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5'-C-메틸 뉴클레오티드(5'-C-methyl nucleotides), 및 역 디옥시베이직 잔기 삽입(inverted deoxybasic residue incorporation)(US20060122137)을 포함한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상하거나 또는 표적 효율을 증가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 변형의 예시로는, 이에 한정되지 않으나, 이중 가닥 분자의 두 상보적인 가닥 사이에 화학적 교차 결합, 이중 가닥 분자의 하나의 가닥의 3' 또는 5' 말단의 화학적 변형, 당 변형, 뉴클레오베이스 변형 및/또는 백본 변형, 2-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드 및 2'-디옥시 리보뉴클레오티드를 포함한다(WO2004/029212). 또 다른 실시태양에 있어서, 변형은 상기 표적 mRNA 및/또는 상기 상보적인 이중 가닥 분자에서 상보적인 뉴클레오티드에 대한 증가된 또는 감소된 친화성을 위하여 사용될 수 있다(WO2005/044976). 예를 들면, 비변형된 피리미딘 뉴클레오티드는 2-티오(2-thio), 5-알키닐(5-alkynyl), 5-메틸(5-methyl), 또는 5-프로피닐 피리미딘(5-propynyl pyrimidine)에 대해 치환될 수 있다. 또한, 비변형된 퓨린은 7-데아자(7-deaza), 7-알킬(7-alkyl), 또는 7-알케닐 퓨린(7-alkenyl purine)으로 치환될 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 이중 가닥 분자가 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 분자인 경우, 상기 3' 말단 뉴클레오티드 오버행한 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 교체될 수 있다(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200). 보다 상세하게는, US20060234970와 같이 공개된 문헌이 사용가능하다. 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않고 상기 결과에 의한 분자가 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 보유하는 한 모든 공지의 화학적 변형은 본 발명의 상기 이중 가닥 분자에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA 모두, 예를 들면, dsD/R-NA 또는 shD/R-NA를 포함할 수 있다. 특히, DNA 가닥 및 RNA 가닥의 하이브리드 폴리뉴클레오티드 또는 DNA-RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 증가된 안정성을 나타낸다. DNA 및 RNA의 혼합, 즉 DNA 가닥(폴리뉴클레오티드) 및 RNA 가닥(폴리뉴클레오티드)로 구성된 하이브리드 형태의 이중 가닥 분자, 임의의 또는 두 개의 상기 단일 가닥 상에 DNA 및 RNA를 모두 포함하는 키메라 형태의 이중 가닥 분자(폴리뉴클레오티드), 또는 유사체는 상기 이중 가닥 분자의 향상된 안정성을 위해 형성될 수 있다.
상기 DNA 가닥 및 RNA 가닥의 하이브리드는 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입된 경우 상기 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 한 상기 센스 가닥은 DNA이고 상기 안티센스 가닥은 RNA, 또는 그 반대 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 DNA이고 상기 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 또한, 상기 키메라 형태의 이중 가닥 분자는 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입된 경우 상기 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 활성을 갖는 한 상기 및 안티센스 가닥은 DNA 및 RNA로 구성되거나, 상기 센스 및 안티센스 가닥 중 어느 하나가 DNA 및 RNA로 구성되는 것 중 어느 하나일 수 있다. 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키기 위하여, 상기 분자는 바람직하게는 가능한 많은 DNA를 포함하고, 반대로 상기 표적 유전자 발현의 억제를 유도하기 위하여, 상기 분자는 상기 발현의 충분한 억제를 유도하기 위한 범위 내에서 RNA가 요구된다.
상기 키메라 타입 이중 가닥 분자의 바람직한 실시예에 따라, 상기 이중 가닥 분자의 업스트림 부분 부위(즉, 상기 센스 또는 안티센스 가닥 내에 상기 표적 서열 또는 이에 상보적인 서열의 측면에 있는 부위)는 RNA이다. 바람직하게는, 상기 업스트림 부분 부위는 상기 센스 서열의 5'측(5' 말단)이고 상기 안티센스 가닥의 3'측(3'말단)을 나타낸다. 또는, 상기 센스 가닥의 5'말단 및/또는 안티센스 가닥의 3'말단 측면에 있는 부위를 업스트림 부분 부위라고 나타낸다. 이는, 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 3'말단에 측면에 있는 부위, 또는 상기 센스 가닥의 5'말단에 측면에 있는 부위 및 상기 안티센스 가닥의 3'말단에 측면에 있는 부위 모두는 RNA로 구성된다. 예를 들어, 본 발명의 상기 키메라 또는 하이브리드 타입 이중 가닥 분자는 하기 조합을 포함한다.
센스 가닥:
5'-[---DNA---]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'
:안티센스 가닥,
센스 가닥:
5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'
:안티센스 가닥, 및
센스 가닥:
5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(---RNA---)-5'
:안티센스 가닥.
상기 업스트림 부분 부위는 상기 이중 가닥 분자의 센스 또는 안티센스 가닥 내에 상기 표적 서열 또는 이의 상보적인 서열의 말단으로부터 바람직하게는 9 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된 도메인이다. 또한, 이러한 키메라 타입 이중 가닥 분자의 바람직한 예시로는 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 업스트림 절반의 부위(상기 센스 가닥에 대한 5'측 부위 및 상기 안티센스 가닥의 3'측 부위)가 RNA이고 다른 절반은 DNA인 19 내지 21개의 뉴클레오티드의 가닥 길이를 갖는 것을 포함한다. 이러한 키메라 타입 이중 가닥 분자에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 효과는 전체 안티센스 가닥이 RNA인 경우에 가장 높다(US20050004064).
본 발명에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 DNA 및 RNA로 구성된 짧은 헤어핀(shD/R-NA)과 같은, 헤어핀을 형성할 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 턴을 만드는 RNA 또는 RNA 및 DNA의 복합체의 서열이다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 단일 가닥 상에 상기 센스 표적 서열 및 상기 안티센스 표적 서열을 포함하고 상기 서열은 루프 서열에 의해 분리된다. 일반적으로, 상기 헤어핀 구조는 dsRNA 또는 dsD/R-NA 내에 세포 기계(cellular machinery)에 의해 절단되고, 그런 다음 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 결합된다. 이러한 복합체는 상기 dsDNA 또는 dsD/R-NA의 표적 서열에 매치되는 mRNA에 결합하여 절단한다.
임의적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 루프 서열은 상기 헤어핀 루프 구조를 형성하기 위하여 상기 센스 및 안티센스 서열 사이에 위치할 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는 이중 가닥 분자를 제공하고, 상기 [A]는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 개재 단일 가닥이고 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥이다. SYNGR4에 대한 상기 표적 서열은 예를 들면, 서열번호 11, 12, 19 및 20의 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않고, [A]에 있어서 상기 표적 서열은 상기 이중 가닥 분자가 상기 표적화된 SYNGR4 유전자의 발현을 저해하는 활성을 보유하는 한 이러한 실시예로부터 변형된 서열일 수 있다. 상기 부위 [A]는 상기 부우위 [B]로 구성된 루프를 형성하기 위하여 [A']와 혼성화한다. 상기 개재 단일 가닥 부분 [B], 즉, 루프 서열은 바람직하게는 3 내지 23개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 루프 서열은, 예를 들면 하기 서열 중에서 선택될 수 있다(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html에 웹상에서). 또한, 23개의 뉴클레오티드로 구성된 루프 구조는 활성 siRNA(Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC, CCACC, 또는 CCACACC: Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG: Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5; Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10; 및
UUCAAGAGA: Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67도 제공한다.
헤어핀 루프 구조를 갖는 본 발명의 바람직한 이중 가닥 분자의 실시예는 하기에 나타낸다. 하기 구조에 있어서, 상기 루프 구조는 AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, 및 UUCAAGAGA 중에서 선택될 수 있다; 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다:
CAAGAUGGAGUCUCCGCAG-[B]-CUGCGGAGACUCCAUCUUG
(표적 서열 서열번호 11에 대하여);
AUGAUGCUCCAGUCCCUUA-[B]-UAAGGGACUGGAGCAUCAU
(표적 서열 서열번호 12에 대하여);
CGCAUUGCCGGCACCCGCU-[B]-AGCGGGTGCCGGCAATGCG
(표적 서열 서열번호 19에 대하여);
GCAUUGCCGGCACCCGCUU-[B]-AAGCGGGTGCCGGCAATGC
(표적 서열 서열 번호 20에 대하여);
또한, 상기 이중 가닥 분자의 억제 활성을 향상시키기 위하여, 뉴클레오티드 "u"는 3' 오버행으로서, 상기 표적 서열의 안티센스 가닥의 3'말단에 첨가될 수 있다. 첨가되는 "u"의 개수는 적어도 2개, 일반적으로는 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개이다. 상기 첨가된 "u"는 상기 이중 가닥 분자의 상기 안티센스 가닥의 3'말단에서 단일 가닥을 형성한다.
상기 이중 가닥 분자의 제조 방법은 당업게에 공지된 화학적 합성법을 사용하는 것이 바람직하나 특별히 한정되지 않는다. 상기 화학적 합성법에 따라, 센스 및 안티센스 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 개별적으로 합성되고 그런 다음 이중 가닥 분자를 얻을 수 있는 적절한 방법을 통해 함께 어닐링 된다. 상기 어닐링에 대한 구체적인 실시예는 적어도 약 3:7, 더욱 바람직하게는 약 4:6, 및 가장 바람직하게는 대체로 같은 몰의 양 (즉, 약 5:5의 몰 비율)의 바람직한 몰 비율로 혼합된 상기 합성된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다음에, 상기 복합체는 이중 가닥 분자가 분리되는 온도로 가열하고 그런 다음 서서히 냉각한다. 상기 어닐링된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 사용되는 당업계에 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 정제 방법의 예시에는 아가로스 겔 전기영동을 사용한 방법을 포함하거나 여기에서 잔존하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 적절한 효소를 사용한 분해에 의해 선택적으로 제거된다.
SYNGR4 서열 측면에 있는 조절 서열은 동일하거나 또는 다를 수 있고, 이러한 그것의 발현은 독립적으로, 또는 시간 또는 공간적 방식에 있어서 조절될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자는 예를 들면, 소핵 RNA (small nuclear RNA, snRNA) U6 또는 인간 H1 RNA 프로모터로부터의 RNA pol Ⅲ 전사 유닛을 포함하는 벡터 내로 SYNGR4 유전자 주형 클로닝에 의해 세포 내로 전사될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 포함하는 벡터:
또한 본 발명에 포함된 것은 본 발명에서 기재된 하나 또는 그 이상의 상기 이중 가닥 분자를 포함하는 벡터이이고, 이러한 벡터를 포함하는 세포이다.
구체적으로, 본 발명은 하기 [1] 내지 [10]의 벡터를 제공한다.
[1] 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 이중-가닥 분자에서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중-가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화하고, 세포 내로 도입될 때, 특이적으로 SYNGR4의 발현을 억제하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터.
[2] 서열번호 11 (서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12 (서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 서열번호 19 (서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 서열번호 20 (서열번호 13의 520-538nt 지점에서) 중에서 선택되는 표적 서열에 매치되는, mRNA에 작용하는 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [1]의 벡터;
[3] 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, 상기 [1]의 벡터;
[4] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 100개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에 안티센스 서열과 혼성화하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [1]의 벡터;
[5] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 75개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에 안티센스 서열과 혼성화하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [4]의 벡터;
[6] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 50개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에 안티센스 서열과 혼성화하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [5]의 벡터;
[7] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 25개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에 안티센스 서열과 혼성화하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [6]의 벡터;
[8] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 19개 및 약 25개 사이 길이의 뉴클레오티드를 갖는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에 안티센스 서열과 혼성화하는, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는, 상기 [7]의 벡터;
[9] 상기 이중 가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [1]의 벡터,
[10] 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는 이중 가닥 분자를 암호화하는 상기 [9]의 벡터, 여기에서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 상기 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 발견가능한 형태로 본 발명의 이중 가닥 분자를 암호화한다. 본 발명에 있어서, 상기 용어 "발현가능한 형태로"는 세포 내로 도입될 때, 상기 분자를 발현할 벡터를 나타낸다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 벡터는 상기 이중 가닥 분자의 발현을 위해 필수적인 조절 요소들을 포함한다. 본 발명의 이러한 벡터는 본 이중 가닥 분자의 제조를 위해, 또는 암치료용 활성 성분으로서 직접적으로 사용될 수 있다.
또는, 본 발명은 센스 가닥 핵산 및 안티센스 가닥 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 각각의 조합을 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 센스 가닥 핵산은 서열번호 11, 12, 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥 핵산은 상기 센스 가닥에 상보적인 서열로 구성되며, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥의 전사체는 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화하며, 상기 벡터는, 상기 SYNGR4 유전자를 발현하는 세포 내로 도입될 때, 상기 유전자의 발현을 억제한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 약 19 및 25개 사이 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이다(예를 들면, 서열번호 13의 상기 뉴클레오티드 서열로부터 인접한 뉴클레오티드). 더욱 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 상기 조합은 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 통해 연결된 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥을 포함하는 단일 뉴클레오티드 전사체를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 상기 조합은 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖고, 여기서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20을 포함하는 뉴클레오티드 서열; [B]는 약 3 내지 약 23개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열; 및 [A']은 [A]에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 벡터는 예를 들어, 두 가닥의 발현을 위하여(DNA 분자의 전사체에 의해) 조절 서열이 SYNGR4 서열에 어느 정도 효력 있게 연결되기 위하여 발현 벡터 내로 SYNGR4 서열을 클로닝하여 제조될 수 있다(Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5). 예를 들면, mRNA에 대한 상기 안티센스인 RNA 분자는 제1 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 3'말단에 측면에 있는 프로모터 서열) 에 의해 전사되고 상기 mRNA에 대한 상기 안티센스 가닥인 RNA 분자는 제2 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 5'말단에 측면에 있는 프로모터 서열)에 의해 전사된다. 상기 센스 및 안티센스 가닥은 상기 유전자의 침묵을 위하여 이중 가닥 분자 컨스트럭트를 형성하기 위하여 생체 내에서 혼성화한다. 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 및 안티센스 가닥을 각각 암호화하는 두 개의 벡터 컨스트럭트는 각각 상기 센스 및 안티센스 가닥을 발현한 다음 이중 가닥 분자 컨스트럭트를 형성하는데 사용된다. 또한, 상기 클로닝된 서열은 2차 구조(예를 들면, 헤어핀)를 갖는 컨스트럭트를 암호화할 수 있다; 즉, 벡터의 단일 전사체는 상기 표적 유전자의 상기 센스 및 상보적인 안티센스 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 상기 벡터는 상기 표적 세포의 게놈 내로의 안정적인 삽입을 얻기 위해 준비될 수 있다(예를 들면, 상동성 재조합 카세트 벡터의 기재에 관한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 번호 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조한다. DNA 기반 전달 기술의 예로는 "노출된 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드 유래의) 전달, 양이온 리피드 복합체, 및 입자 매개("유전자 총") 또는 압력 매개 전달(예를 들면, 미국 특허 번호 5,922,687 참조)을 포함한다.
본 발명의 상기 벡터는 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 벡터를 포함한다. 발현 벡터의 예시로는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은, 약화된 바이러스 숙주를 포함한다 (예를 들면, 미국 특허 번호 4,722,848 참조). 이러한 접근은 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서, 백시니아 바이러스의 사용과 관련된다. 상기 표적 유전자를 발현하는 세포 내로 도입함에 따라, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 분자를 발현하고 따라서 상기 세포의 증식을 저해한다. 사용가능한 벡터의 또 다른 예시에는 Bacille Calmette Guerin(BCG)를 포함한다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 다양한 다른 벡터들은 약학적 투여 및 상기 이중 가닥 분자의 생산에 유용하다; 예시들에는 아데노 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라 티피 벡터, 해독된 탄저병 톡신 벡터, 및 유사체를 포함한다. 예를 들면, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; 및 Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조한다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 사용한 암세포 성장 억제 또는 감소 및 암 치료 방법:
NSCLC를 억제하는 어떤 siRNA의 활성은 이전에 WO 2005/89735에 기재되어 있고, 본 발명에 참조로서 삽입된다. 본 발명에 있어서, SYNGR4에 대한 2개의 다른 dsRNA는 폐암 세포 성장을 억제하는 그것의 활성에 대하여 검사되었다. SYNGR4에 대한 상기 2개의 dsRNA(도, 3A,3B)는, 세포 증식의 저해와 일치하여 폐암 세포주에서 상기 유전자의 발현을 효과적으로 녹다운하였다.
따라서, 본 발명은 SYNGR4의 발현을 억제함으로써, 폐암 성장 억제 방법을 제공한다. SYNGR4 유전자 발현은 SYNGR4 유전자를 특이적으로 표적하는 상기 이중 가닥 분자 또는 상기 SYNGR4 유전자를 특이적으로 표적하는 이중 가닥 분자를 발현하는 상기 벡터의 사용을 포함한, 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 억제될 수 있다.
폐암 세포의 세포 성장을 억제하기 위한 본 이중 가닥 분자 및 벡터의 이러한 활성은 그들이 폐암 치료 및/또는 예방 방법에 사용할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 상기 SYNGR4 유전자가 정상 조직에서는 과발현되지 않기 때문에 부작용없이 SYNGR4 유전자에 대한 이중 가닥 분자 또는 상기 분자를 발현하는 벡터를 투여함으로써 폐암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다(도. 1a, 2a 및 b).
구체적으로, 본 발명은 하기 방법 [1] 내지 [36]을 제공한다:
[1] 암세포의 성장 억제 및/또는 암 치료 방법, 상기 암세포 또는 상기 암은 상기 SYNGR4 유전자를 과발현하고, 상기 방법은 상기 유전자를 과발현하는 암세포에서 SYNGR4의 발현을 특이적으로 억제하는 적어도 하나의 분리된 이중 가닥 분자와 상기 세포를 접촉시켜, 상기 폐암 세포의 성장을 억제하고 및/또는 상기 폐암을 치료하는 단계를 포함한다.
[2] 상기 이중 가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12(서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 서열번호 19(서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 서열번호 20(서열번호 13의 520-538nt 지점에서) 중에서 선택되는 표적 서열에 매칭하는 SYNGR4 mRNA에 작용하는, 상기 [1]의 방법.
[3] 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, 상기 [2]의 방법.
[4] 치료되는 상기 암은 폐암인, 상기 [1]의 방법;
[5] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC인, 상기 [4]의 방법;
[6] SYNGR4의 발현을 특이적으로 억제하는 다수의 이중 가닥 분자가 투여되는, 상기 [1]의 방법;
[7] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [3]의 방법;
[8] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [7]의 방법;
[9] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [8]의 방법;
[10] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [9]의 방법;
[11] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 19개와 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [10]의 방법;
[12] 상기 이중 가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [1]의 방법;
[13] 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, 상기 [12]의 방법, 여기에서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 상기 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥;
[14] 상기 이중 가닥 분자가 RNA인, 상기 [1]의 방법;
[15] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA 모두를 포함하는, 상기 [1]의 방법;
[16] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드 및 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드인, 상기 [15]의 방법;
[17] 상기 센스 및 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 각각 DNA 및 RNA로 구성된, 상기 [16]의 방법;
[18] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA의 키메라인, 상기 [15]의 방법;
[19] 상기 안티센스 가닥의 상기 3'말단에 측면에 있는 부위, 또는 센스 가닥의 5'말단에 측면에 있는 부위 및 안티센스 가닥의 상기 3'말단에 측면에 있는 부위는 모두 RNA로 구성된, 상기 [18]의 방법;
[20] 상기 측면에 있는 부위는 9 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된, 상기 [19]의 방법;
[21] 상기 이중 가닥 분자는 3'오버행을 포함하는, 상기 [1]의 방법;
[22] 상기 이중 가닥 분자는 상기 분자와 더불어, 형질전환 증진제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 포함되는, 상기 [1]의 방법.
[23] 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 의해 암호화되는, 상기 [1]의 방법.
[24] 상기 이중 가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12(서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 서열번호 19(서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 서열번호 20(서열번호 13의 520-538nt 지점에서) 중에서 선택되는 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용하는 상기 벡터에 의해 암호화되는, 상기 [23]의 방법;
[25] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 상기 서열을 포함하는, 상기 [24]의 방법.
[26] 치료되는 상기 암은 폐암인, 상기 [23]의 방법;
[27] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC인, 상기 [26]의 방법;
[28] 다수의 종류의 상기 이중 가닥 분자가 투여되는, 상기 [23]의 방법;
[29] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [25]의 방법;
[30] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [29]의 방법;
[31] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [30]의 방법;
[32] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [31]의 방법;
[33] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 19개 및 약 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [32]의 방법;
[34] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [23]의 방법;
[35] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, 상기 [34]의 방법, 여기에서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥; 및
[36] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자는 상기 분자와 더불어, 형질전환 증진제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 포함되는, 상기 [23]의 방법.
본 발명의 상기 방법은 하기에 더욱 상세히 기재될 것이다.
SYNGR4 유전자를 발현하는 세포의 성장은 상기 세포를 상기 SYNGR4 유전자에 특이적으로 어닐링하는 이중 가닥 분자, 상기 분자를 발현하는 벡터 또는 이를 포함하는 조성물과 접촉함으로써 억제될 수 있다. 상기 세포는 추가적으로 형질전환제와 접촉될 수 있다. 적합한 형질전환제는 당업계에 알려져 있다. 상기 용어 "세포 성장의 억제"는 상기 세포가 낮은 비율로 증식하거나 상기 분자를 발현하지 않는 세포에 비해 생존도가 감소하는 것을 나타낸다. 세포 성장은 예를 들면, MTT 세포 증식 분석법을 사용하는 것을 포함한, 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
모든 종류의 세포의 성장은 상기 세포가, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 표적 유전자인, SYNGR4를 발견 또는 과발현하는 한 본 발명의 방법에 따라 억제될 수 있다. 바람직한 세포에는, NSCLC 및 SCLC 모두를 포함한, 폐암 세포를 포함한다.
따라서, SYNGR4의 과발현에 의해 어느 정도 야기되거나 증진된 질환에 걸렸거나 발생의 위험에 있는 환자들은 적어도 하나의 본 발명의 이중 가닥 분자, 적어도 하나의 상기 분자를 발현하는 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 상기 분자를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 폐암에 걸린 환자는 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 암의 형태는 진단되는 종양의 특정 형태에 따라 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 폐암은, 폐암 마커로써, 예를 들면, 암태아성 항원(Carcinoembryonic antigen, CEA), CYFRA, pro-GRP 등, 또는 흉부 X-Ray 및/또는 객담세포진 검사(sputum cytology)로 진단될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 방법에 의해 치료된 환자는 RT-PCR 또는 면역분석에 의해 상기 환자로부터의 생검에서 SYNGR4의 발현을 검출함으로써 선별될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 전에, 상기 개체에서의 상기 생검 시료는 예를 들면, 면역조직화학분석법 또는 RT-PCR과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 SYNGR4 유전자 과발현에 대하여 확인된다.
폐암 세포 성장 억제와 이에 따른 폐암 치료를 위한 본 발명의 방법에 따라, 다수의 이중 가닥 분자(또는 이를 발현하는 벡터 또는 이를 포함하는 조성물)를 투여할 경우, 각각의 상기 분자는 다른 구조를 가질 수 있으나 SYNGR4의 동일한 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용한다. 또는, 다수의 이중 가닥 분자는 상기 SYNGR4 유전자 내에 다른 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용하거나 또는 다른 유전자의 다른 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 SYNGR4에 대한 이중 가닥 분자를 사용할 수 있다. 또는, 예를 들면, 상기 방법은 상기 SYNGR4 암호화 서열 내의 하나, 두 개, 또는 그 이상의 표적 서열에 대한 이중 가닥 분자를 사용할 수 있다.
폐암 세포 성장을 억제하기 위하여, 본 발명의 이중 가닥 분자는 상기 분자와 상응하는 mRNA 전사체의 결합을 얻기 위한 형태로 상기 세포 내로 직접적으로 도입될 수 있다. 또는, 상기 기재된 바와 같이, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 DNA는 벡터로서 세포 내에 도입될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자 및 벡터를 상기 세포 내로 도입하기 위하여, FuGENE(Roche diagnostics), 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen), 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)와 같은, 형질전환 증진제가 사용될 수 있다.
억제 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 문맥에서 상기 용어 "특이적으로 억제"는 SYNGR4와 다른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현 또는 생물학적 기능과 비교하여 SYNGR4의 발현 또는 생물학적 기능을 우선적으로 억제하는 약제 또는 리간드의 활성을 나타낸다. 특이적 억제는 일반적으로 10배 발현 또는 측정된 생물학적 기능(예를 들면, 세포 성장 또는 증식, 세포사멸의 억제, SYNGR4 세포내 신호)의 배경값에 대해 적어도 약 2배 억제, 바람직하게는 약 10배 이상이고 가장 바람직하게는 100배 이상 억제를 야기한다. 발현 수준 및/또는 생물학적 기능은 처리된 세포와 비처리된 세포, 또는 처리 전과 후 세포군의 비교로 측정될 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, SYNGR4의 발현 또는 생물학적 기능은 완전히 억제된다. 일반적으로, 특이적인 억제는 SYNGR4 발현 또는 생물학적 기능에 있어서 적절한 통계검사를 사용한 통계적으로 유의적인 감소(예를 들면, p≤0.05)이다.
개체에 있어서 SYNGR4 유전자의 발현 감소, 상기 암의 크기 감소, 유병률, 또는 전이 가능성의 감소와 같은 임상적 이점을 유도한다면 치료는 "효과적인"것으로 여긴다. 상기 치료가 예방적으로 적용될 경우, "효과적인"은 형성되는 암을 지연 또는 예방하거나 또는 암의 임상적 증상을 예방 또는 완화하는 것을 의미한다.
효과적인 것은 특정 종양 타입을 진단 또는 치료하는 모든 공지의 방법과 관련하여 결정된다.
본 발명의 상기 이중 분자는 상기 부화학량론적(substoichiometric) 양에서 상기 SYNGR4 mRNA를 분해하는 것으로 이해된다. 모든 학설에 의해 메이고자 하지 않으나, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 촉매 방식으로 상기 표적 mRNA의 분해를 야기한다고 여겨진다. 따라서, 표준 암 치료와 비교하여, 치료 효과를 미치기 위하여 상당히 적은 이중 가닥 분자가 암의 부위에 또는 그 근처에 전달될 필요가 있다.
당업자는 개체의 체중, 나이, 성별, 질환의 타입, 증상 및 다른 상태들과 같은 인자; 투여 경로; 및 상기 투여가 국소적인지 전신적인지를 고려함으로써, 주어진 개체에게 투여되는 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 유효한 양을 손쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 유효한 양은 암 부위에서 또는 근처에서 약 1 나노몰(nM) 내지 약 100 nM, 바람직하게는 약 2 nM 내지 약 50 nM, 더욱 바람직하게는 약 2.5 nM 내지 10 nM의 세포내 농도이다. 상기 이중 가닥 분자의 더욱 많거나 적은 양이 투여될 수 있는 것이 고려된다. 특정 상황에 대하여 요구되는 정확한 투여량은 당업자에 의해 손쉽고 일상적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 폐암, 특히 NSCLC 또는 SCLC와 같은, SYNGR4를 발현하는 암의 성장 또는 전이를 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, SYNGR4의 표적 서열(즉, 서열번호 11, 12, 19 또는 20)을 포함하는 이중 가닥 분자는 폐암의 치료를 위한 것이 특히 바람직하다.
암 치료를 위하여, 또한 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 상기 이중 가닥 분자와 다른 약학적 약제와 조합하여 개체에 투여될 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 암을 치료하기 위해 설계된 또 다른 치료적 방법과 조합하여 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 암 치료에 현재 사용되거나 암 전이를 방지하는 치료적 방법(예를 들면, 방사선 치료, 수술 및 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 타목시펜(tamoxifen)과 같은, 화학요법제를 사용한 치료)과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 노출된 이중 가닥 분자로서, 전달 시약과 조합으로, 또는 상기 이중 가닥 분자를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서, 상기 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자와 조합으로 투여하기 위한 적절한 전달 시약은 Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴(lipofectin); 리포펙타민(lipofectamine); 셀펙틴(cellfectin); 또는 다양이온(polycations)(예를 들면, 폴리라이신), 또는 리로솜을 포함한다. 바람직한 전달 시약은 리포솜이다.
리포솜은 폐 종양 조직과 같은, 특정 조직에 대한 상기 이중 가닥 분자의 전달을 도울 수 있고, 또한 상기 이중 가닥 분자의 혈중 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 적절하게 사용되기 위한 리포솜은 표준 운반체 형성 리피드로부터 형성되고, 이는 중성 또는 음성적 전하의 인지질 및 콜레스테롤과 같은, 스테롤을 포함한다. 리피드의 선택은 일반적으로 원하는 리포솜 크기 및 혈류에서의 상기 리포솜의 반감기와 같은 인자들을 고려함으로써 유도된다. Szoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467; 및 미국 특허 번호 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 및 5,019,369에 기재된 예시와 같이, 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 알려져 있고, 그 전체 개시는 참조로서 본 발명에 삽입된다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 가닥 분자를 캡슐화하는 상기 리포솜은 상기 리포솜을 암 부위로 전달할 수 있는 리간드 분자를 포함한다. 종양 항원 또는 내피 세포 표면 항원에 결합하는 단일클론 항체와 같은, 종양 또는 혈관 내피 세포에 지배적인 수용체에 결합하는 리간드가 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 이중 가닥 분자를 캡슐화하는 상기 리포솜은 단핵 마크로파지 및 세망내피계에 의한 제거를 피하기 위하여, 예를 들면, 상기 구조의 표면에 결합하는 옵소닌작용 억제 모이어티를 가짐으로써, 변형된다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명의 리포솜은 옵소닌작용 억제 모이어티 및 리간드 모두를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 상기 리포솜을 제조하는데 사용하기 위한 옵소닌작용 억제 모이어티는 일반적으로 상기 리포솜 막에 결합하는 거대한 친수성 폴리머이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 옵소닌작용 억제 모이어티는 그것이 상기 막에 화학적 또는 물리적으로 부착될 때 예를 들면, 막 자체 내로 리피드-용해성 앵커(anchor)의 상호작용, 또는 막 리피드의 활성기에 직접적인 결합에 의해, 리포솜 막에 "결합"된다. 예를 들면, 그 전체 개시가 참조로서 본 발명에 삽입되는, 미국 특허 번호 4,920,016에 기재된 바와 같이, 이러한 옵소닌작용 억제 친수성 폴리머는 마크로파지-단핵구 시스템(macrophage-monocyte system, "MMS") 및 세망내피계(reticuloendothelial system, "RES")에 의해 상기 리포솜의 흡수를 상당히 감소시키는 보호적 표면층을 형성한다. 따라서 옵소닌작용-억제 모이어티로 변형된 리포좀은 변형되지 않은 리포좀 보다 훨씬 오래 순환을 유지한다. 이런 이유로, 이러한 리포좀을 때때로 "잠행(stealth)" 리포좀으로 불린다.
잠행 리포좀은 다공성 또는 "구멍이 난(leaky)" 미세혈관계(microvasculature)에 의해 영양분을 받는 조직에서 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들면 고형암과 같은 이런 미세혈관계 결점에 의해 특정되는 표적 조직은, 이러한 리포좀을 효율적으로 축적할 것이다; Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53 참조한다. 게다가, RES에 의해 감소된 흡수는 간 및 비장에서 유의적인 축적을 방지함으로써 잠행 리포좀의 독성을 낮춘다. 따라서, 옵소닌작용-억제 모이어티로 변형된 본 발명의 리포좀은 종양 세포에 대해 본 발명의 이중 가닥 분자를 전달할 수 있다.
리포좀을 변형하는데 적절한 옵소닌작용-억제 모이어티는 바람직하게 약 500 내지 약 40,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000의 분자량을 가지는 수용성 고분자이다. 이러한 고분자는 강글리오사이드(ganglioside) GM. sub.1. 등의 강글리오사이드 뿐만 아니라, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 유도체; 예를 들면, 메톡시 PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아르산염; 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 폴리-N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone)과 같은 합성 고분자; 선형, 측쇄형 또는 덴드리머형 폴리아미도아민(polyamidoamine); 폴리아크릴산(polyacrylic acid); 카르복실 또는 아미노기가 화학적으로 연결된 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol) 및 폴리자일리톨(polyxylitol) 등의 폴리알콜을 포함한다. 또한 PEG의 공중합체(copolymer), 메톡시(methoxy) PEG, 또는 메톡시 PPG, 또는 이들의 유도체가 적절하다. 게다가, 상기 옵소닌작용-억제 고분자는 PEG 및 폴리아미노산, 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 공중합체가 차단될 수 있다. 또한, 상기 옵소닌작용-억제 고분자는 예를 들면, 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 마누론산(mannuronic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 펙트산(pectic acid), 뉴라민산(neuraminic acid), 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan)과 같은 아미노산 또는 카르복실산을 포함하는 천연 폴리사카라이드; 아미네이트 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드(선형 또는 측쇄형); 또는 예를 들면, 결과적으로 카르복실기의 연결을 갖는 탄산의 유도체와 반응하는 카르복실화 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드일 수 있다.
바람직하게, 상기 옵소닌작용-억제 모이어티는 PEG, PPG, 또는 이들의 유도체이다. PEG 또는 PEG 유도체로 변형된 리포좀은 때때로 "PEG화된(PEGylated) 리포좀"으로 불린다.
상기 옵소닌작용-억제 모이어티는 많이 잘 알려진 기술 중 하나에 의해 상기 리포좀에 결합될 수 있다. 예를 들면, PEG의 N-하이드록시숙시니마이드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)는 포스파티딜-에탄올아민 지질 가용성 앵커(phosphatidyl-ethanolamine lipid-soluble anchor)에 결합되고, 그런 다음 막에 결합될 수 있다. 유사하게, 덱스트란 중합체는 Na(CN)BH3를 이용한 환원적인 아미노화를 통한 스테아릴아민 지질-가용성 알콜(stearylamine lipid-soluble anchor) 및 60℃에서 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran) 및 물을 30:12 비율로 혼합한 용액으로 유도될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 벡터는 상기 기재된 것이다. 본 발명의 적어도 하나의 이중 가닥 분자를 발현하는 이러한 벡터는 직접적으로 또는 Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 또는 다양이온(예를 들면, 폴리신), 또는 리포좀을 포함하는 적절한 전달 시약과 조합으로 투여될 수 있다. 개체 내 암 부위에, 본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 전달하는 방법은 당업계에 있는 기술이다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 암 부위 내로 상기 이중 가닥 분자를 전달하기 위한 적절한 모든 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자는 유전자 총(gene gun), 전기천공법(electroporation), 또는 다른 적절한 비경구 또는 장내 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
적절한 장내 투여 경로는 경구, 직장 또는 비강내 전달을 포함한다.
적절한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예를 들면, 정맥주사(intravenous bolus injection), 정맥 투입(intravenous infusion), 동맥주사(intra-arterial bolus injection), 동맥 투입(intra-arterial infusion) 및 맥관구조 내 카테터 점적 주사(catheter instillation into the vasculature)]; 내(peri)- 및 위(intra)-조직 주사(예를 들면, 종양 내 및 종양 위 주사(peri-tumoral and intra-tumoral injection); 피하 주사 또는 피하 주입을 포함하는 증착(deposition)(삼투압 펌프에 의한 것과 같은); 예를 들면, 카테터 또는 다른 배치 장치에 의해 암 부위 또는 근처에 직접 투여[예를 들면, 좌약(suppository) 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질을 갖는 임플란트]; 및 흡입법을 포함한다. 상기 이중 가닥 분자 또는 벡터의 주사 또는 투입은 암 부위 또는 근처에 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 단 회 투여 또는 다수 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 투여가 투입될 때, 상기 투입은 단 회 지속적 투입되거나 또는 다수 투입으로 전달될 수 있다. 조직 내로 직접적으로 약제의 주사는 암의 부위 또는 근처에 하는 것이 바람직하다. 암 부위 또는 근처에서 조직 내로 약제를 다수 투여하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 당업자는 주어진 개체에 본 발명의 상기 이중 가닥 분자를 투여하기 위한 적절한 투여량 요법을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자는 예를 들면, 암 부위 또는 근처에 단 회 투여 또는 증착으로 한번에 개체에 투여될 수 있다. 또는, 상기 이중 가닥 분자는 약 3 내지 약 28일, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 10일의 기간 동안 개체에 하루에 한번 또는 두 번씩 투여될 수 있다. 바람직한 투여량 요법에서, 상기 이중 가닥 분자는 7일 동안 하루에 한 번 암 부위 또는 근처에 주사된다. 투여량 요법이 다수 투여를 포함할 때, 상기 개체에 투여되는 유효한 양의 이중 가닥 분자는 전체 투여량 요법에 걸쳐서 투여된 이중 가닥 분자의 총 양을 포함할 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 포함하는 조성물:
상기와 더불어, 또한 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 이중 가닥 분자 또는 상기 분자를 암호화하는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 하기 조성물 [1] 내지 [36]을 제공한다:
[1] SYNGR4의 발현 및 세포 증식을 억제하는 적어도 하나의 분리된 이중 가닥 분자를 포함하는, 암세포의 성장 억제 및 암 치료용 조성물, 상기 암세포 또는 상기 암은 상기 SYNGR4 유전자를 과발현하고, 상기 분자는 상기 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화 되는, 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된다.
[2] 상기 이중 가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12(서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 서열번호 19(서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 서열번호 20(서열번호 13의 520-538nt 지점에서) 중에서 선택되는 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용하는, 상기 [1]의 조성물.
[3] 상기 이중 가닥 분자에서, 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, 상기 [2]의 조성물.
[4] 치료되는 상기 암은 폐암인, 상기 [1]의 조성물;
[5] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC인, 상기 [4]의 조성물;
[6] 상기 조성물은 다수의 종류의 상기 이중 가닥 분자를 포함하는, 상기 [1]의 조성물;
[7] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [3]의 조성물;
[8] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [7]의 조성물;
[9] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [8]의 조성물;
[10] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [9]의 조성물;
[11] 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 19개와 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [10]의 조성물;
[12] 상기 이중 가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [1]의 조성물;
[13] 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, 상기 [12]의 조성물, 여기에서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 상기 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥;
[14] 상기 이중 가닥 분자가 RNA인, 상기 [1]의 조성물;
[15] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및/또는 RNA인, 상기 [1]의 조성물;
[16] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드 및 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드인, 상기 [15]의 조성물;
[17] 상기 센스 및 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 각각 DNA 및 RNA로 구성된, 상기 [16]의 조성물;
[18] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA의 키메라인, 상기 [15]의 조성물;
[19] 상기 안티센스 가닥의 상기 3'말단에 측면에 있는 부위, 또는 센스 가닥의 5'말단에 측면에 있는 부위 및 안티센스 가닥의 상기 3'말단에 측면에 있는 부위 모두는 RNA로 구성된, 상기 [18]의 조성물;
[20] 상기 측면에 있는 부위는 9 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된, 상기 [19]의 조성물;
[21] 상기 이중 가닥 분자는 3'오버행을 포함하는, 상기 [1]의 조성물;
[22] 상기 조성물은 형질전환 증진제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 상기 [1]의 조성물.
[23] 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 의해 암호화되고 상기 조성물에 포함되는, 상기 [1]의 조성물.
[24] 상기 이중 가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 389-407nt 지점에서), 서열번호 12(서열번호 13의 754-772nt 지점에서), 서열번호 19(서열번호 13의 519-537nt 지점에서) 및 서열번호 20(서열번호 13의 520-538nt 지점에서) 중에서 선택되는 표적 서열에 매칭하는 mRNA에 작용하는 상기 벡터에 의해 암호화되는, 상기 [23]의 조성물;
[25] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 상기 서열을 포함하는, 상기 [24]의 조성물.
[26] 치료되는 상기 암은 폐암인, 상기 [23]의 조성물;
[27] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC인, 상기 [26]의 조성물;
[28] 다수의 종류의 상기 이중 가닥 분자가 투여되는, 상기 [23]의 조성물;
[29] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [25]의 조성물;
[30] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [29]의 조성물;
[31] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [30]의 조성물;
[32] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 가닥은 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [31]의 조성물;
[33] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 서열은 약 19개 및 약 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, 상기 [32]의 조성물;
[34] 상기 벡터에 의해 암호화되는 상기 이중 가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해 연결된 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, 상기 [23]의 조성물;
[35] 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, 상기 [23]의 조성물, 여기에서 [A]는 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 개재 단일 가닥, 및 [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥; 및
[36] 상기 조성물은 형질전환 증진제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 상기 [23]의 조성물.
본 발명의 상기 방법은 하기에 더욱 상세히 기재될 것이다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 바람직하게는 당업계에 공지된 기술에 따라, 개체에 투여되기 전에 약학적 조성물로서 제형화 된다. 본 발명의 약학적 조성물은 최소한 멸균되고 발열원이 없는 것으로서 특정된다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "약학적 제형"은 인간 및 가축에 대한 사용을 위한 제형이다. 본 발명의 약학적 조성물의 제조 방법은, 예를 들면 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., Lippincott, Williams and Wilkins. (2005)에 기재된 바와 같이, 당업계 범위 내에 있고, 그 전체 개시는 참조로서 본 발명에 삽입된다.
본 발명의 약학적 제형은 약학적으로 허용가능한 담체 배지에 혼합된, 본 발명의 적어도 하나의 상기 이중 가닥 분자 또는 그들을 암호화하는 벡터(예를 들면, 체중당 0.1 내지 90%), 또는 상기 분자의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 바람직한 약학적으로 허용가능한 담체 배지는 물, 완충수, 생리식염수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 및 유사체이다.
본 발명에 따라, 상기 조성물은 다수의 이중 가닥 분자를 포함할 수 있고, 상기 각각의 분자는 SYNGR4의 동일한 표적 서열, 또는 다른 표적 서열에 보내질 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 SYNGR4에 대한 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다. 또는, 예를 들면, 상기 조성물은 하나, 두 개 또는 그 이상의 표적 서열 SYNGR4에 대한 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 하나 또는 다수의 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 하나, 두 개 또는 몇몇 종류의 본 발명의 이중 가닥 분자를 암호화할 수 있다. 또는, 예를 들면, 본 발명의 조성물은 각각의 벡터가 다른 이중 가닥 분자를 암호화하는, 다수의 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 가닥 분자는 본 발명의 조성물 내에 리포솜으로서 포함될 수 있다. 리포솜의 상세한 설명에 관한 "상기 이중 가닥 분자를 사용한 암 치료 방법"의 항목을 참조한다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 약학적 부형제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 부형제는 안정제, 항산화제, 삼투압 조절제, 완충용액, 및 pH 조절제를 포함한다. 적절한 첨가제는 생리학적으로 생체에 적합한 완충용액(예를 들면, 트로메타민 염산염(tromethamine hydrochloride)), 킬란트(chelants)(예를 들면, DTPA 또는 DTPA-비스아마이드(bisamide)와 같은) 또는 칼슘 킬레이트 혼합물(예를 들면 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아마이드)의 첨가, 또는, 선택적으로, 칼슘 또는 나트륨 염의 첨가(예를 들면, 염화칼슘(calcium chloride), 아스코르브산칼슘(calcium ascorbate), 클루콘산칼슘(calcium gluconate) 또는 젖산칼슘(calcium lactate))를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 액상에 사용하기 위하여 포장될 수 있거나, 또는 동결건조될 수 있다.
고체 조성물을 위하여, 통상적인 비독성 고체 담체가 사용될 수 있다; 예를 들면, 약학적 수준의 만니톨(mannitol), 유당(lactose), 전분(starch), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 사카린나트륨(sodium saccharin), 탤컴(talcum), 셀룰로스(cellulose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 및 유사체.
예를 들면, 구강 투여를 위한 고체 약학적 조성물은 상기 기재된 모든 담체 및 부형제 및 10~95%, 바람직하게는 25~75%의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다. 에어로졸 (흡입적) 투여를 위한 약학적 조성물은, 상기 기재된 바와 같은 리포솜, 및 분사제(propellant)에 캡슐화된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 이중 가닥 분자를 체중당 0.01~20%, 바람직하게는 체중당 1~10%를 포함할 수 있다. 또한 담체는 원하는 것으로서; 예를 들면, 비강 전달을 위한 레시틴을 포함할 수 있다.
상기와 더불어, 본 발명의 조성물은 그들이 본 발명의 이중 가닥 분자의 생체 내 기능을 억제하지 않는 한 다른 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 암 치료에 통상적으로 사용되는 화학요법제를 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서, 또한 본 발명은 SYNGR4의 과발현에 의해 특정되는 폐암 치료용 약학적 조성물 제조에 대한 본 발명의 상기 이중 가닥 핵산 분자의 용도를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 SYNGR4의 과발현에 의해 특정되는 폐암 치료용 약학적 조성물 제조에 대한 세포 내 SYNGR4 유전자의 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자의 용도에 관한 것이고, 상기 분자는 상기 이중 가닥 핵산 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화 되는, 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 서열을 표적한다.
또는, 본 발명은 추가적으로 SYNGR4의 과발현에 의해 어느 정도 야기되고 촉진되는 암, 예를 들면, SYNGR4의 과발현에 의해 특정되는 폐암 치료용 약학적 조성물 제조를 위한 방법 또는 과정을 제공하고, 상기 방법 또는 과정은 상기 유전자가 과발현되는, 세포 내 SYNGR4의 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자와 함께 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하고, 상기 분자는 상기 이중 가닥 핵산 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화되는, 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 활성 성분으로서 포함하며, 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 서열을 표적한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 또한 본 발명은 SYNGR4의 과발현에 의해 어느 정도 야기되고 촉진되는 암, 예를 들면, SYNGR4의 과발현에 의해 특정되는 폐암 치료용 약학적 조성물 제조를 위한 방법 또는 과정을 제공하고, 상기 방법 또는 과정은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 활성 성분을 혼합하는 단계를 포함하고, 상기 활성성분은 상기 유전자가 과발현되는, 세포 내 SYNGR4의 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자이며, 상기 분자는 상기 이중 가닥 핵산 분자를 형성하기 위해 서로 혼성화 되는, 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며, 서열번호 11, 12, 19 및 20 중에서 선택되는 서열을 표적한다.
폐암 검출 또는 진단 방법
SYNGR4의 발현은 폐암 세포에서 특이적으로 높아지는 것을 발견하였다(도. 1). 따라서, 그들의 전사 및 번역 산물뿐만 아니라 본 발명에서 확인된 상기 유전자는 폐암에 대한 마커로서 진단적 유용성을 발견하였고 폐 조직 시료에서 SYNGR4의 발현을 측정함으로써, 폐암을 진단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 상기 개체에서 SYNGR4의 발현 수준을 측정함으로써 폐암을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 진단될 수 있는 폐암에는 NSCLC 및 SCLC를 포함한다. 또한, 폐 선암 및 폐 편평세포암종(squamous cell carcinoma, SCC)을 포함하는, NSCLC는, 또한 본 발명에 의해 진단되거나 검출될 수 있다.
본 발명에 따라, 개체의 상태 검사를 위한 중간 결과를 제공받을 수 있다. 상기 질환에 걸린 개체를 진단하기 위하여 이러한 중간 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 종사자를 도울 수 있는 추가적인 정보와 결합될 수 있다. 또는, 본 발명은 개체 유래 조직에서 암성 세포를 검출하고, 상기 질환에 걸린 상기 개체를 진단하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공하기 위해 사용될 수 있다.
또는, 본 발명은 개체 유래 폐 조직 시료에서 암 세포를 검출 또는 확인하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체 유래 생물학적 시료에서 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 상기 발현 수준에 증가는 상기 폐 조직에서 암 세포의 존재 또는 여지를 나타낸다.
이러한 결과는 상기 질환에 걸린 개체를 진단하는데 있어서 의사, 간호사, 또는 보건 종사자를 도울 수 있는 추가적인 정보와 결합될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 상기 질환에 걸린 개체를 진단하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따라, 개체로부터 수득한 조직에서 암 세포의 존재에 관하여 의문이 있는 경우, 조직 병리학, 혈액 내 공지의 종양 마커의 수준, 및 상기 개체의 임상적 과정, 등을 포함하는 상기 질환의 다른 측면과 더불어, 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 고려함으로써 임상적 결정이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 몇몇의 잘 알려진 혈액 내 진단적 폐 종양 마커는 IAP, ACT, BFP, CA19-9, CA50, CA72-4, CA130, CEA, KMO-1, NSE, SCC, SP1, Span-1, TPA, CSLEX, SLX, STN 및 CYFRA이다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 유전자 발현 분석의 결과는 개체의 질환 상태의 추가적인 진단을 위한 중간 결과로서 사용된다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 암의 진단적 마커를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 폐암의 진단적 마커로써 개체 유래 생물학적 시료 내 SYNGR4 유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 하기 방법 [1] 내지 [10]을 제공한다:
[1] (a) 생물학적 시료에서 SYNGR4의 아미노산 서열을 암호화하는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 정상 대조군 수준과 비교하여 검출된 상기 발현 수준의 증가를 질환의 존재와 관련시키는 단계를 포함하는, 폐암 진단 방법.
[2] 상기 발현 수준은 상기 정상 대조군 수준 보다 적어도 10% 높은, 상기 [1]의 방법.
[3] 상기 발현 수준은
(a) SYNGR4의 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계,
(b) SYNGR4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 검출하는 단계, 및
(c) SYNGR4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 단계 중에서 선택되는 방법에 의해 검출되는, 상기 [1]의 방법.
[4] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC인, 상기 [1]의 방법.
[5] 상기 발현 수준은 상기 유전자의 유전자 전사체에 대한 탐침의 혼성화를 검출함으로써 결정되는, 상기 [3]의 방법.
[6] 상기 발현 수준은 상기 유전자의 발현 수준으로서 유전자에 의해 암호화되는 상기 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 결정되는, 상기 [3]의 방법.
[7] 상기 생물학적 시료는 생물학적 시료는 생검(biopsy), 타액(sputum) 또는 혈액(blood)를 포함하는, 상기 [1]의 방법.
[8] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 상피세포를 포함하는, 상기 [1]의 방법.
[9] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 암 세포를 포함하는, 상기 [1]의 방법.
[10] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 암성 내피세포를 포함하는, 상기 [1]의 방법.
폐암 진단의 상기 방법은 하기에 더욱 상세히 기재될 것이다.
본 발명의 방법에 의해 진단되는 개체는 바람직하게는 표유동물이다. 바람직한 포유동물은, 이에 한정되지 않으나, 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함한다.
상기 진단을 수행하기 위하여 진단되는 상기 개체로부터 생물학적 시료를 수집하는 것이 바람직하다. SYNGR4의 확실한 전사 또는 번역 산물을 포함하는 한 모든 생물학적 시료가 상기 결정을 위한 상기 생물학적 시료로서 사용될 수 있다. 상기 생물학적 시료는, 이에 한정되지 않으나, 진단을 위해 필요하거나 또는 암에 걸린것으로 의심되는 신체의 조직, 및 생검, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 흉수 및 소변과 같은, 유체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는 상피세포, 더욱 바람직하게는 암성 상피세포 또는 암으로 의심되는 조직, 예를 들어, 폐 조직으로부터 유래된 상피세포를 포함하는 세포군을 포함한다. 또한, 만약 필요하다면, 상기 세포는 상기 수득된 신체의 조직 및 유체로부터 정제되고, 그런 다음 상기 생물학적 시료로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 개체 유래 생물학적 시료에서 SYNGR4의 상기 발현 수준이 측정된다. 상기 발현 수준은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 전사(핵산) 산물 수준에서 결정된다. 예를 들면, SYNGR4의 mRNA은 혼성화 방법(예를 들면, 노던 혼성화)에 의해 탐침을 사용하여 정량할 수 있다. 상기 검출은 칩 또는 어레이 상에서 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 SYNGR4를 포함하는 다수의 유전자(예를 들면, 다양한 암 특이적 항원)의 발현 수준을 검출하기 위한 것이 바람직하다. 당업자는 상기 SYNGR4(서열번호 13; GenBank 등록 번호: NM_012451)의 서열 정보를 사용하는 이러한 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, SYNGR4의 cDNA는 상기 탐침으로서 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 및 동위원소와 같은, 적절한 표지물질로 표지될 수 있고, 상기 유전자의 상기 발현 수준은 상기 혼성화된 표지물질의 세기로서 검출될 수 있다.
또한, SYNGR4의 상기 전사 산물은 증폭 긱반 검출 방법 (예를 들면, RT-PCR)에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다. 또한 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보에 기초하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 상기 프라이머(서열번호 7 및 8)는 RT-PCR 또는 노던 블랏에 의한 검출을 위해 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 탐침 또는 프라이머는 SYNGR4의 mRNA에 대해 엄격한, 적당히 엄격한, 또는 조금 엄격한 조건하에서 혼성화한다. 본 발명에서 사용한 것과 같이, 상기 용어 "엄격한 (혼성화) 조건"은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화 되나, 다른 서열에는 혼성화 되지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 다른 환경에서는 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적인 혼성화는 더 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 일정한 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것에서 선택된다. 상기 Tm(일정한 이온 세기, pH 및 핵산 농도하에서)은 표적 서열에 상보적인 상기 탐침의 50%가 평형상태에서 상기 표적 서열과 혼성화 하는 온도이다. Tm에서, 상기 표적 서열은 일반적으로 과잉으로 존재하기 때문에, 50%의 상기 탐침이 평형을 이룬다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 이하의 나트륨 이온, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온(또는 다른 염)이고 상기 온도가 짧은 탐침 또는 프라이머(예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이며 긴 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은, 불안정화제를 첨가하여 도달할 수 있다.
또는, 상기 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4 단백질의 양이 결정될 수 있다. 상기 번역 산물로서 상기 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역분석법을 포함한다. 상기 항체는 단일클로 또는 다클론일 수 있다. 또한, 단편이 SYNGR4 단백질에 대한 결합 활성을 보유하는 한, 상기 항체의 모든 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)이 상기 검출을 위해 사용될 수 있다. 단백질의 검출을 위한 이러한 종류의 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위하여 모든 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
그것의 번역 산물에 기초한 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 또 다른 방법으로서, 염색의 세기가 SYNGR4 단백질에 대한 항체를 사용한 면역조직화학분석법을 통해 확인될 수 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 상기 단백질의 증가된 존재와 SYNGR4 유전자의 높은 발현 수준을 동시에 나타낸다.
더욱이, SYNGR4 유전자의 발현 수준과 더불어, 예를 들면, 폐암에서 상이하게 발현되는 것으로 알려진 유전자와 같은, 다른 암 관련 유전자의 발현 수준이, 상기 진단의 정확성을 향상시키기 위해 또한 결정될 수 있다. 또한 상기 SYNGR4의 발현 수준은 암 또는 전암 상태에 대해 상기 세포 및/또는 조직의 병리학 결정과 관련될 수 있다.
생물학적 시료에서, 상기 상응하는 암 마커 유전자의 대조군 수준으로부터, 예를 들면, 10%, 25%, 또는 50% 증가; 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상, 또는 그 이상 증가될 경우, 상기 SYNGR4 유전자를 포함한, 암 마커 유전자의 발현 수준이 증가된 것으로 여길 수 있다.
상기 대조군 수준은 질환 상태(암성 또는 비암성)가 알려진 개체/개체들로부터 미리 수집되어 저장된 시료(들)을 사용함으로써 상기 검사 생물학적 시료와 동시에 결정될 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 질환 상태가 알려진 개체로부터의 시료에서 SYNGR4 유전자의 미리 결정된 발현 수준(들)을 분석함으로써 수득된 결과에 기초한 통계 방법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 상기 대조군 수준은 미리 검사된 세포로부터의 발현 패턴의 데이터베이스일 수 있다. 또한, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 생물학적 시료 내 SYNGR4 유전자의 발현 수준은 다중 대조군 수준과 비교될 수 있고, 상기 대조군 수준은 다중 참조 시료로부터 결정될 수 있다. 환자 유래 생물학적 시료, 예를 들면, 폐 조직의 것과 유사한 조직 타입으로부터 유래된 참조 시료로부터 결정된 대조군 수준을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 공지의 질환 상태를 가지는 군집에서 SYNGR4 유전자의 발현 수준의 표준값을 사용하는 것이, 바람직하다. 상기 표준값은 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D.의 범위 또는 +/- 3 S.D.의 범위는 표준값으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, 암이 아닌 것으로 알려진 생물학적 시료로부터 결정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"으로써 나타낸다. 반면에, 만약 상기 대조군 수준이 암성 생물학적 시료로부터 결정된다면, "암성 대조군 수준"으로써 나타낸다.
SYNGR4 유전자의 발현 수준이 상기 정상 대조군 수준과 비교하여 증가되거나 또는 상기 암성 대조군 수준과 유사한 경우, 상기 개체는 암에 걸렸거나 또는 암 발생의 위험이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한, 다중 암 관련 유전자의 발현 정도가 비교되는 것에 대하여, 암성인 상기 시료 및 상기 참조 사이에 유전자 발현 패턴에 유사성은 상기 개체가 암에 걸렸거나 암 발생 위험이 있다는 것을 나타낸다.
검사 생물학적 시료 및 상기 대조군 수준의 발현 수준 사이에 차이는 대조군 핵산, 예를 들면, 상기 세포의 암성 또는 비암성 상태에 의존적으로 차이가 있지 않다는 것으로 알려진 발현 수준을 갖는, 하우스키핑 유전자와 같은, 대조군 핵산의 발현 수준에 대해 표준화될 수 있다. 바람직한 대조군 유전자는, 이에 한정되지 않으나, 베타-액틴, 글리세알데하이드 3 포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1을 포함한다.
암의 예후 평가 방법
본 발명은, 부분적으로는, SYNGR4 발현이 폐암에 걸린 환자의 나쁜 예후와 상당히 연관되었음을 발견한 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 환자의 생물학적 시료내 상기 SYNGR4의 발현 수준 검출; 대조군 수준과 상기 검출된 발현 수준 비교; 및 나쁜 예후(나쁜 생존율)의 지표로서 상기 정상 대조군 수준과 비교하여 SYNGR4의 증가된 발현 수준을 결정함으로써, SYNGR4의 과발현에 의해 어느 정도 야기되거나 증진된 암, 특히 폐암에 걸린 환자의 예후를 결정 또는 평가하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에 있어서, 암성 대조군 수준과 비교하여 유사하거나 증가된 SYNGR4의 발현 수준 결정은 나쁜 예후의 지표이다.
본 발명에서, 상기 용어 "예후"는 상기 사례의 특성 및 증상에 의해 나타내지는 것과 같은 상기 질환의 회복의 예상뿐만 아니라 상기 질환의 가능성있는 결과에 관해서 예측하는 것을 나타낸다. 따라서, 낮은 가능성, 음성 또는 나쁜 예후는 낮은 치료후 생존 기간 또는 생존율에 의해 정의된다. 반대로, 양성, 호의적인, 또는 좋은 예후는 증가된 치료후 생존 기간 또는 생존율에 의해 정의된다.
상기 용어 "예후 평가"는 상기 환자의 암의 추후 결과를 예상, 예측 또는 주어진 검출 또는 측정과의 연관성의 능력을 나타낸다(예를 들면, 악성종양, 암 치료 가능성, 생존, 및 같은 종류의 것). 예를 들면, 시간이 흐름에 따른 SYNGR4의 상기 발현 수준의 결정은 상기 환자의 결과의 예측을 가능하게 한다(예를 들면, 악성종양의 증가 또는 감소, 암의 단계, 암 치료의 가능성, 생존, 및 같은 종류의 것의 증가 또는 감소)
본 발명의 문맥에 있어서, 상기 용어 "예후 평가 (또는 결정)"은 예측 및 암, 진행, 특히 암 재발, 전이성 확산 및 질환 악화의 예측 및 가능성 분석을 포함하는 것을 의미한다. 예후 평가를 위한 본 발명의 방법은 치료적 개입, 질환 단계와 같은 진단적 기준, 및 종양 질환의 전이 또는 재발에 대한 질환 모니터링 및 감시를 포함하는, 치료 양상에 관한 임상적인 결과를 만드는데 사용되는 것을 의미한다.
상기 방법에 사용되는 상기 환자 유래 생물학적 시료는 상기 SYNGR4 유전자가 상기 시료에서 검출되는 한 평가되는 상기 개체로부터 유래된 모든 시료일 수 있다. 상기 개체 유래 생물학적 시료는 예를 들면, 폐암을 갖거나 의심되는 것으로 알려진 환자와 같은, 개체로부터 유래된 모든 시료일 수 있다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는 폐암(상기 폐로부터 수득한 세포)이다. 또한, 상기 생물학적 시료는 객담, 혈액, 혈청, 또는 혈장과 같은 신체의 유체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 조직으로부터 정제된 세포일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 치료 전, 동안, 및/또는 후를 포함하는, 다양한 시점에 환자로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 환자 유래 생물학적 시료에서 측정된 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준 더 높을수록, 치료 후 차도, 회복, 및/또는 생존에 대한 예후가 더 나쁘고 나쁜 임상적 결과의 가능성이 더 높은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 비교에 사용된 상기 "대조군 수준"은, 예를 들면, 치료 후 암의 좋거나 긍정적인 예후를 나타내는 개인, 또는 개인의 집단에서 모든 종류의 치료 전 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준일 수 있고, 이는 "좋은 예후 대조군 수준"으로 나타내질 것이다. 또는, 상기 "대조군 수준"은 치료 후 암의 나쁘거나 부정적인 예후를 나타내는 개인, 또는 개인의 집단에서 모든 종류의 치료 전 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준일 수 있고, 이는 "나쁜 예후 대조군 수준"으로 나타내질 것이다. 상기 "대조군 수준"은 단일 참조 집단으로부터 또는 다수의 발현 패턴으로부터 유래된 단일 발현 패턴이다. 따라서, 상기 대조군 수준은 암 환자, 또는 질환 상태(좋거나 나쁜 예후)가 알려진 상기 환자군에서 모든 종류의 치료 전에 검출되는 상기 SYNGR4 유전자의 상기 발현 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 암은 폐암이다. 알려진 질환 상태를 갖는 환자군에서 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준의 표준값을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표준값은 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D.의 범위가 표준값으로서 사용될 수 있다.
상기 대조군 수준은 질환 상태(좋은 예후 또는 나쁜 예후)가 알려진 암 환자(들)(대조군 또는 대조군 그룹)로부터 모든 종류의 치료 전에 미리 수집되고 저장된 시료(들)을 사용함으로써 상기 검사 생물학적 시료를 사용하여 동시에 결정될 수 있다.
또는, 상기 대조군 수준은 대조군 그룹으로부터 미리 수집되고 저장된 시료들에서 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 수득된 결과에 기초한 통계 방법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 상기 대조군 수준은 미리 검사된 세포에서의 발현 패턴의 데이터베이스일 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 생물학적 시료내 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준은 다중 대조군 수준과 비교될 수 있고, 상기 대조군 수준은 다중 참조 시료로부터 결정된다. 상기 환자 유래 생물학적 시료와 유사한 조직 타입으로부터 유래된 참조 시료로부터 결정된 대조군 수준을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 치료 후 차도, 회복, 생존, 및/또는 임상적 결과에 대해 좋은 예후 대조군 수준에 대한 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준에 유사성은 상기 환자의 더욱 호의적인 예후를 나타내고 상기 좋은 예후 대조군 수준에 대한 상기 발현 수준에 증가는 덜 호의적인, 나쁜 예후를 나타낸다. 반면에, 치료 후 차도, 회복, 생존, 및/또는 임상적 결과에 대해 나쁜 예후 대조군 수준에 대한 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준에 감소는 상기 환자의 더욱 호의적인 예후를 나타내고 상기 나쁜 예후 대조군 수준에 대한 상기 발현 수준에 유사성은 덜 호의적인, 나쁜 예후를 나타낸다.
생물학적 시료내 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준은 상기 발현 수준이 상기 대조군 수준으로부터 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, 10.0배 이상, 또는 그 이상 차이가 나는 경우 변화된 것으로 여길 수 있다.
상기 검사 생물학적 시료 및 상기 대조군 수준 사이에 상기 발현 수준에 차이는 예를 들면, 하우스킵핑 유전자와 같은, 대조군에 대해 표준화될 수 있다. 예를 들면, 베타-액틴, 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1을 암호화하는 것을 포함하는, 발현 수준이 암성 또는 비암성 세포 사이에 차이가 있지 않은 것으로 알려진 폴리뉴클레오티드가 상기 SYNGR4 유전자의 상기 발현 수준을 표준화하는데 사용될 수 있다.
상기 발현 수준은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 상기 환자 유래 생물학적 시료내 상기 유전자 전사체를 검출함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 검출된 상기 유전자 전사체는 mRNA 및 단백질과 같은, 전사 및 번역 산물 모두를 포함한다.
예를 들면, 상기 SYNGR4 유전자의 상기 전사체 산물은 혼성화, 예를 들면, 상기 유전자 전사체에 대한 SYNGR4 유전자 탐침을 사용하는, 노던 블랏 혼성화 분석에 의해 검출될 수 있다. 상기 검출은 칩 또는 어레이 상에서 실시될 수 있다. 어레이의 사용은 상기 SYNGR4 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 상기 발현 수준을 검출하기 위해 바람직하다. 또 다른 실시예에 따라, 상기 SYNGR4 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 역전사 기반 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭 기반 검출 방법이, 상기 검출을 위해 사용될 수 있다 (실시예 참조). 상기 SYNGR4 유전자 특이적 탐침 또는 프라이머는 상기 SYNGR4 유전자 (서열번호 13)의 전체 서열을 나타냄으로써 통상적인 기술을 사용하여 설계 및 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 상기 프라이머 (서열번호 1 및 2)는 RT-PCR에 의한 검출을 위해 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 방법에 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한, 적당히 엄격한, 또는 조금 엄격한 조건하에서 상기 SYNGR4 유전자의 상기 mRNA에 혼성화한다. 본 발명에서 사용된 것과 같은, 상기 용어 "엄격한 (혼성화) 조건"은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화 되나, 다른 서열에는 검출되지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 다른 환경에서는 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적인 혼성화는 더 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 일정한 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm(일정한 이온 세기, pH, 및 핵산 농도)은 표적 서열에 상보적인 탐침의 50%가 평형상태에서 상기 표적 서열과 혼성화하는 온도이다. Tm에서, 상기 표적 서열이 일반적으로 과잉으로 존재하기 때문에, 상기 탐침의 50%가 평형상태에 존재한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온 이하이고, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온(또는 다른 염들)이 있는 것일 수 있고 상기 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머(예를 들면 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 더 긴 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 60℃이다. 또한 엄격한 조건은 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은, 불안정화제를 첨가하여 도달할 수 있다.
또는, 상기 번역 산물은 본 발명의 평가를 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, 상기 SYNGR4 단백질의 양이 결정될 수 있다. 번역 산물로서 상기 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 SYNGR4 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있다. 또한, 단편이 상기 SYNGR4 단백질에 대한 결합 활성을 보유하는 한 상기 항체의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)이 상기 검출을 위해 사용될 수 있다. 단백질의 검출을 위한 이러한 종류의 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 모든 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
그것의 번역 산물에 기초한 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 또 다른 방법으로서, SYNGR4 단백질에 대한 항체를 사용한 면역조직화학분석법을 통한 염색의 세기가 관찰될 수 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 상기 SYNGR4 단백질의 증가된 존재와 동시에 상기 SYNGR4 유전자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
또한, 상기 SYNGR4 단백질은 세포 증식 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준은 지표로서 이러한 세포 증식 활성을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4를 발현하는 세포가 생물학적 시료의 존재하에서 제조 및 배양되고, 그런 다음 미리 결정된 기간 내에 증식의 정도를 검출함으로써, 또는 상기 생물학적 시료의 상기 세포 증식 활성의 세포주기 또는 코로니 형성 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.
또한, 상기 평가의 정확성을 향상시키기 위하여 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준과 더불어, 또한 다른 폐암 관련 유전자, 예를 들면, 폐암에서 상이하게 발현되는 것으로 알려진 유전자의 발현 수준이 결정될 수 있다. 이러한 다른 폐암 관련 유전자의 예시로는 본 발명에 기재된 것 및 WO 2004/031413 및 WO 2005/090603에 것들을 포함하고, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 삽입된다.
또는, 본 발명에 따라, 또한 중간 결과가 개체의 예후를 평가하기 위한 다른 검사 결과와 더불어 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 개체의 예후를 평가, 결정, 또는 추정하기 위해 의사, 간호사, 또는 다른 종사자를 도울 수 있다. 개체의 임상적 증상 및 신체적 조건을 포함하는 예후를 평가하기 위하여, 본 발명에 의해 수득된 상기 중간 결과와 조합하여, 추가 정보가 고려될 수 있다.
상기 방법에 따라 암의 예후에 대해 평가되는 상기 환자는 바람직하게는 포유동물이고 인간, 비안간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함한다.
예 진단 또는 암의 예후 평가용 키트:
본 발명은 예 진단 또는 암의 예후 평가용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 폐암이다. 더욱 구체적으로, 상기 키트는 환자 유래 생물학적 시료내 상기 SYNGR4 유전자의 발현 검출을 위한 적어도 하나의 시약을 포함하고, 상기 시약은 하기 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) 상기 SYNGR4 유전자의 mRNA 검출용 시약;
(b) 상기 SYNGR4 단백질 검출용 시약; 및
(c) 상기 SYNGR4 단백질의 상기 생물학적 활성 검출용 시약.
적절한 상기 SYNGR4 유전자의 mRNA 검출용 시약은 상기 SYNGR4 mRNA의 일부분에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한, 상기 SYNGR4 mRNA에 특이적으로 결합하거나 동일한 핵산을 포함한다. 이러한 종류의 올리고뉴클레오티드는 상기 SYNGR4 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로써 예시된다. 이러한 종류의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 제조될 수 있다. 만약 필요하면, 상기 SYNGR4 mRNA 검출용 시약은 예를 들면, 비드, 어레이 칩, 다공성 스트립, 등과 같은 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 SYNGR4 mRNA 검출용 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
적절한 상기 SYNGR4 단백질 검출용 시약은 상기 SYNGR4 단백질에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있다. 또한, 단편이 상기 SYNGR4 단백질에 대한 결합 활성을 보유하는 한, 상기 항체의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)이 상기 시약으로써 사용될 수 있다. 단백질의 검출을 위한 이러한 종류의 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 모든 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 직접 결합 또는 간접 표지 기술을 통해 신호 생성 분자와 표지될 수 있다. 항체 표지 및 그들의 표적에 대한 항체의 결합 검출을 위한 표지 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 모든 표지와 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 SYNGR4 단백질 검출용 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
또한, 상기 생물학적 시료 내에서 발현되는 SYNGR4 단백질 때문에 예를 들면, 세포 증식 활성 측정과 같은 것에 의하여 상기 생물학적 활성이 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 환자 유래 생물학적 시료의 존재하에 배양되고, 그런 다음 증식 속도를 결정함으로써, 또는 상기 생물학적 시료의 상기 세포 증식 활성의 세포주기 또는 코로니 형성 능력을 측정함으로써 상기 SYNGR4 단백질의 존재 또는 부재하에서 결정될 수 있다. 만약 필요하면, 상기 SYNGR4 mRNA 검출용 시약은 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 SYNGR4 단백질의 생물학적 활성 검출용 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
상기 키트는 하나 이상의 상기 기재된 시약을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 고체 지지체 및 상기 SYNGR4 유전자에 대한 탐침 결합용 시약 또는 상기 SYNGR4 단백질에 대한 항체, 세포 배양용 배지 및 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 상기 SYNGR4 단백질에 대한 항체 검출용 이차 항체를 포함한다. 예를 들면, 좋은 예후 또는 나쁜 예후를 갖는 환자로부터 수득된 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 사용을 위한 설명서와 함께 완충용액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 포장 삽입물 (예를 들면, 서면, 테입, CD-ROM, 등)을 포함하는, 상업적인 실수요자 관점에서 유용한 다른 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 이러한 것은 라벨과 함께 용기에 포함될 수 있다. 적절한 용기는 병, 유리병, 및 검사튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양과 같이, 상기 시약이 상기 SYNGR4 mRNA에 대한 탐침일 때, 상기 시약은 적어도 하나의 검출 부위를 형성하기 위하여, 다공성 스트립과 같은, 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 상기 다공성 스트립의 측정 또는 검출 부위는, 각각 핵산(탐침)을 포함하는, 다양한 부위를 포함할 수 있다. 또한 검출 스트립은 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 상기 검사 스트립으로부터 분리된 스트립 상에 위치할 수 있다. 선택적으로, 다른 검출 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 제1 검출 부위에서 더 많은 양 및 그 다음의 부위에서 더 적은 양을 포함할 수 있다. 검사 시료의 첨가에 있어서, 검출 신호를 표시하는 부위의 수는 상기 시료내 존재하는 SYNGR4 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 검출 부위는 모든 적절한 검출 형태로 설정될 수 있고 일반적으로 검사 스트립의 너비에 걸친 막대기 또는 점의 형태에서 있다.
본 발명의 상기 키트는 양성 대조군 시료 또는 SYNGR4 표준 시료를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양성 대조군 시료는 SYNGR4 양성 혈액 시료를 수집함으로써 제조될 수 있고 그런 다음 그러한 SYNGR4 수준이 분석된다. 또한, 정제된 SYNGR4 단백질 또는 뉴클레오티드는 양성 시료 또는 상기 SYNGR4 표준을 형성하기 위하여 SYNGR4가 없는 혈청에 첨가될 수 있다.
항폐암 화합물에 대한 스크리닝
본 발명의 문맥에 있어서, 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 확인된 약제는 모든 화합물 또는 몇몇의 화화물을 포함하는 조성물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 세포 또는 단백질에 노출되는 상기 검사 시약은 단일 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있다. 화합물의 조합이 상기 방법에 사용될 때, 상기 화합물은 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다.
모든 검사 시약, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양 상층액, 발효 미생물의 산물, 해양생물의 추출물, 식물 추출물, 정제 또는 미정제 단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 마이크로분자 화합물(안티센스 RNA, siRNA, 리보자임, 및 앱타머 등과 같은, 핵산 컨스트럭트를 포함하는) 및 천연 화합물은 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 상기 검사 시약은 (1) 생물학적 라이브러리, (2) 공간적으로 다룰 수 있는 평형 고체상 또는 액체상 라이브러리, (3) 디콜볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법, (4) "하나의 비드 하나의 화합물" 라이브러리 방법 및 (5) 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 공지된 조합의 라이브러리 방법에서 모든 수많은 접근법의 사용으로 수득될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 상기 생물학적 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리에 한정되고, 반면에 다른 4개의 접근법은 화합물의 펩티드, 비펩티드 올리고머 또는 작은 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67). 분자 라이브러리의 상기 합성을 위한 방법의 예시는 당업계에서 확인할 수 있다(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13; Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6; Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994; Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061; Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51). 화합물의 라이브러리는 용액 내에서(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21 참조) 또는 비드(Lam, Nature 1991, 354: 82-4), 칩(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6), 박테리아(미국 특허 번호 5,223,409), 포자(미국 특허 번호 5,571,698; 5,403,484, 및 5,223,409), 플라스미드(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9) 또는 파아지(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90; Devlin, Science 1990, 249: 404-6; Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10; 미국 특허 출원 2002103360) 상에 존재할 수 있다.
모든 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 상기 화합물의 구조 중 일부분이 있는 화합물은 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 변환되고, 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 의해 수득된 약제에 포함될 수 있다.
또한, 상기 스크리닝된 검사 약제가 단백질일 때, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위하여, 상기 단백질의 암호화 핵산 서열을 추측하기 위해 상기 단백질의 전체 아미노산 서열이 결정될 수 있거나, 또는 상기 서열에 기초한 탐침으로서 올리고 DNA를 제조하기 위하여 상기 수득된 단백질의 부분적 아미노산 서열이 분석될 수 있고, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위해 상기 탐침와 함께 cDNA 라이브러리를 스키리닝한다. 상기 수득된 DNA는 암 치료 또는 예방을 위한 후보인 상기 검사 약제를 제조하는데 그것의 유용성에 대해 확인될 수 있다.
또한 본 발명에 기재된 상기 스크리닝에서 검사 약제는 생체 내에서 원래 단백질의 생물학적 활성이 결여된 SYNGR4 단백질 또는 이의 부분적 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
비록 검사 시약 라이브러리의 구성은 당업계에 잘 알려져 있고, 본 발명의 하기에, 본 발명의 스크리닝 방법을 위한 검사 시약 및 이러한 시약의 구성 라이브러리에 추가적인 안내가 제공된다.
(ⅰ) 분자 모델링 :
검사 약제 라이브러리의 구성은 추구 특성을 갖는 것으로 알려진 화합물의 분자 구조, 및/또는 SYNGR4의 분자 구조에 의해 촉진된다. 추가적인 평가에 적절한 시험 약제의 예비 스크리닝을 위한 하나의 접근법은 상기 시험 약제 및 그것의 표적 사이에 상호작용의 컴퓨터 모델링이다.
컴퓨터 모델링 기술은 선택된 분자의 3차원 원자 구조의 가시화 및 상기 분자와 상호작용할 신규한 화합물의 합릭적인 설계를 가능하게 한다. 상기 3차원의 구조는 상기 선택된 분자의 X선 결정학적 분석 또는 NMR 이미징에서의 데이터에 전형적으로 좌우된다. 상기 분자 역학은 역장(force field) 데이터를 요구한다. 컴퓨터 그래픽 시스템은 어떻게 신규한 화합물이 상기 표적 분자에 결합될지 예측을 가능하게 하고 뛰어난 결합 특이성을 위해 상기 화합물 및 표적 분자의 구조의 실험적 조작을 가능하게 한다. 상기 분자와 화합물의 상호작용의 예측은 작은 변화들이 하나 또는 두 개의 요구하는 분자 역학 소프트웨어 및 계산적으로 집약적인 컴퓨터에서 만들어질 때, 일반적으로 사용자 친화적으로, 분자 설계 프로그램과 상기 사용자 사이에 메뉴에 따라 조작되는 인터페이스와 연결될 것이다.
일반적으로 상기에 기재된 상기 분자 모델링 시스템의 예시로는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램, Polygen Corporation, Waltham, Mass를 포함한다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 역학 기능을 수행한다. QUANTA는 구성, 그래픽 모델링 및 분자 구조의 분석을 수행한다. QUANTA는 상호적인 구성, 변형, 가시화, 및 서로의 분자의 행동 분석을 가능하게 한다.
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66; Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62; 및, 핵산 구성성분에 대한 모델 수용체에 관하여, Askew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90과 같은, 많은 문헌들에서는 특정 단백질들과 상호적인 약제의 컴퓨터 모델링을 검토하였다.
화학물질을 스크리닝하고 그래프로 묘사하는 다른 컴퓨터 프로그램은 BioDesign, Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario와 같은 회사들로부터 이용가능하다. 예를 들면, DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50을 참조한다.
일단 추정상의 억제제가 확인되면, 하기 기재된 바와 같이, 상기 확인된 추정상의 억제제의 화학적 구조에 기초한 많은 변이체를 구성하기 위하여 조합의 화학 기술들이 사용될 수 있다. 후보 억제제의 상기 결과의 라이브러리, 또는 "검사 시약"은 폐암 치료 또는 예방용 시험 약제를 확인하기 위하여 본 발명의 상기 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
(ⅱ) 조합의 화학 합성:
시험 약제의 조합의 라이브러리는 공지의 억제제에 존재하는 중심부 구조의 지식과 관련한 합리적인 약제 설계 프로그램의 부분으로서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 높은 처리 스크리닝 촉진하는, 상기 라이브러리가 적정의 크기로 유지되게 한다. 또는, 간단한, 특히 짧은, 폴리머 분자 라이브러리는 상기 라이브러리를 구성하는 분자 패밀리의 모든 치환을 간단히 합성함으로써 구성될 수 있다. 이러한 후자의 접근법의 예시는 6개 아미노산 길이의 모든 펩티드의 라이브러리일 수 있다. 이러한 펩티드 라이브러리는 모든 6개 아미노산 서열 치환을 포함한다. 라이브러리의 이러한 타입은 선형 조합의 화학적 라이브러리라고 나타낸다.
조합의 화학적 라이브러리의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있고, 화학적 또는 생물학적 합성 중 어느 하나에 의해 형성될 수 있다. 조합의 화학적 라이브러리는 이에 한정되지 않으나, 펩티드 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 5,010,175; Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6 참조)를 포함한다. 또한 화학적 다양성 라이브러리를 형성하기 위한 다른 화학물질이 사용될 수 있다. 이러한 화학물질에는 이에 한정되지 않으나, 펩티드(예를 들면, PCT 출원 번호 WO 91/19735), 암호화된 펩티드(예를 들면, WO 93/20242), 램덤 바이오-올리고머(예를 들면, WO 92/00091), 벤조디아제핀(benzodiazepines)(예를 들면, 미국 특허 5,288,514), 히단토인(hydantoins), 벤조디아제핀 다이펩티드와 같은 다이버소머(diversomers)(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13), 비닐자리 폴리펩티드(vinylogous polypeptides)(Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568), 클루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩티달 펩디도미메틱스(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기적 합성(Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661), 올리고카바메이트(oligocarbamates)(Cho et al., Science 1993, 261: 1303), 및/또는 펩티딜포스포네이트(peptidylphosphonates)(Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658), 핵산 라이브러리(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995-2009 Wiley Interscience; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 5,539,083 참조), 항체 라이브러리(예를 들면, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3):309-14 및 PCT/US96/10287 참조), 카보하이드레이트 라이브러리(예를 들면, Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22; 미국 특허 5,593,853 참조), 및 작은 유기 분자 라이브러리(예를 들면, 벤조디아제핀, Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31.; 이소프레노이드(isoprenoids), 미국 특허 5,569,588; 티아졸리디논(thiazolidinones) 및 메타티아자논(metathiazanones), 미국 특허 5,549,974; 피롤리딘(pyrrolidines), 미국 특허 5,525,735 및 5,519,134; 몰폴리노 화합물(morpholino compounds), 미국 특허 5,506,337; 벤조디아제핀, 5,288,514, 및 이와 유사한 것 참조)을 포함한다.
조합의 라이브러리의 제조를 위한 장치는 상업적으로 사용가능하다(예를 들면, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA 참조). 아울러, 수많은 조합의 라이브러리는 그 자체를 상업적으로 사용가능하다(예를 들면, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc. 참조).
(ⅲ) 다른 후보:
또 다른 접근법은 라이브러리를 제조하기 위하여 재조합 박테리오파아지를 사용한다. 상기 "파아지 방법"(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90; Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)의 사용하여, 매우 큰 라이브러리를 구성할 수 있다(예를 들면, 106 -108 화학적 실체). 두 번째 접근법은 일차적으로 Geysen 방법(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15; Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)의 화학적 방법을 사용하고; Fodor 등의 방법(Science 1991, 251: 767-73)이 예시된다. Furka 등(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR:013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93), Houghten (미국 특허 4,631,211) 및 Rutter 등(미국 특허 5,010,175)은 작용제(agonists) 또는 길항제(antagonists)로서 검사될 수 있는 펩티드의 혼합물을 제조하기 위한 방법을 기재한다.
앱타머는 특이적 분자 표적에 강력하게 결합하는 핵산으로 구성된 고분자이다. Tuerk 및 Gold(Science. 249:505-510 (1990))는 앱타머의 선택을 위하여 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법을 제시한다. 상기 SELEX 방법에 있어서, 핵산 분자의 큰 라이브러리(예를 들면, 1015 다른 분자)가 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.
SYNGR4 결합 화합물에 대한 스크리닝
본 발명에 있어서, SYNGR4의 과발현이 폐암에서 검출되었고, SYNGR4의 비발현이 정상 기관에서 관찰되었다(도. 1 및 2). 따라서, 상기 SYNGR4 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 사용하여, 본 발명은 SYNGR4에 결합하는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 폐암에서 SYNGR4의 발현 때문에, SYNGR4에 결합하는 화합물은 폐암 세포의 증식을 저해할 것으로 예상되고, 이에 폐암 치료 또는 예방에 유용할 것이다. 따라서, 또한 본 발명은 폐암 세포의 증식을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 사용하여 폐암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 이러한 스크리닝 방법의 하나의 실시태양은 하기 단계를 포함한다:
(a) 검사 화합물을 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉하는 단계;
(b) 상기 폴리펩티드와 상기 검사 화합물 사이에 결합 활성을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, SYNGR4의 발현 저해는, 폐암 성장을 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 후보 화합물에 대한 스크리닝에 의해, 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 용도가 확인된 후보 화합물을 확인할 수 있다. 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 상기 후보 화합물의 유용성은 폐암에 대한 치료적 약제를 확인하기 위한 이차적 및/또는 추가적 스크리닝에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에 따라, 폐암 세포 성장 억제에 대한 상기 검사 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 발현에 의해 어느 정도는 야기 또는 증진되는 질환("SYNGR4 관련성 질환")을 치료 또는 예방하기 위한 후보 약제 또는 화합물의 상기 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하여, 하기 단계를 포함하는 세포 성장을 억제하기 위한 후보 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 관련성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보 약제 또는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 시험 약제 또는 화합물을 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 접촉하는 단계;
b) 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편, 및 상기 검사 조성물 사이에 생물학적 활성을 검출하는 단계, 및
c) 상기 검사 약제 또는 화합물의 상기 약학적 효과와 b)의 상기 생물학적 활성을 관련시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편에 대한 결합 활성과 연관시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물이 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편에 결합할 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 상기 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 및 화합물로서 확인 또는 선별될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물이 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편에 결합하지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의성 없는 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 및 화합물로서 확인될 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝 방법은 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
스크리닝에 사용되는 상기 SYNGR4 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 천연 또는 부분적 펩티드로부터 유래된 단백질일 수 있다. 시험 화합물과 접촉되는 상기 폴리펩티드는, 예를 들면, 정제된 폴리펩티드, 용해성 단백질, 담체에 결합되는 형태 또는 다른 폴리펩티드와 융합된 융합 단백질일 수 있다.
단백질에 대한 스크리닝 방법으로서, 예를 들면, 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 사용하여 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 것, 당업계에 공지된 모든 방법이 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝은, 예를 들면, 면역침전법, 구체적으로, 하기 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS 및 pCD8과 같은, 외래 유전자에 대한 발현 벡터로 상기 유전자를 삽입함으로써 숙주세포(예를 들면, 동물) 등에서 발현된다.
상기 발현에 사용되는 프로모터는 흔히 사용될 수 있는 모든 프로모터일 수 있고, 예를 들면, SV40 초기 프로모터(Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)), EF-알파 프로모터(Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)), CAG 프로모터(Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)), RSV LTR 프로모터(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), SR 알파 프로모터(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), CMV 즉시 초기 프로모터(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), SV40 후기 프로모터(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), 아데노바이러스 후기 프로모터(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), HSV TK 프로모터 등을 포함한다.
외래 유전자의 발현을 위한 숙주 세포 내로 상기 유전자의 도입은 모든 방법, 예를 들면, 전기천공법(Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), 인산칼슘법(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), DEAE 덱스트란법(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)), 리포펙틴법(Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)) 등에 따라 실시될 수 있다.
SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에, 특이성을 나타내는, 단일클론 항체의 에피토프 도입에 의해 단일클론 항체의 인식 부위(에피토프)를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상업적으로 사용가능한 에피토프-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). 상업적으로 사용가능한 다중 클로닝 부위의 사용에 의해 예를 들면, 베타-갈락토시다제, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP) 등을 갖는 융합 단백질을 발현할 수 있다. 또한, 융합에 의해 상기 SYNGR4 폴리펩티드의 특성을 변화시키지 않도록 몇몇의 다수의 아미노산으로 구성된 오직 작은 에피토프를 삽입함으로써 제조되는 융합 단백질이 또한 보고된다. 폴리히스티딘(His-tag), 인플루엔자 집합체 HA, 인간 c-myc, FLAG, 소수포성 입안염 바이러스 당단백질(vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7-tag), 인간 단순 포진 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag (단일클론 파지 상에 에피토프) 등과 같은 에피토프, 및 그들을 인식하는 단일클론 항체가 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하기 위한 상기 에피토프-항제 시스템으로써 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).
면역침전에 있어서, 면역 복합체는 적절한 세제를 사용하여 제조된 세포 용해물에 이러한 항체를 첨가함으로써 형성된다. 상기 면역 복합체는 상기 SYNGR4 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와 결합 활성을 포함하는 폴리펩티드, 및 항체로 구성된다. 또한 면역침전은 상기 에피토프에 대한 항체의 사용뿐만 아니라, 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 대한 항체의 사용으로써 수행될 수 있고, 상기 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역 복합체는 상기 항체가 마우스 IgG 항체일때 예를 들면 단백질 A 세파로스 또는 단백질 G 세파로스에 의해, 침전될 수 있다. 만약 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드가 GST와 같은, 에피토프를 갖는 융합 단백질로서 제조되고, 면역 복합체는 글루타치온-세파로스 4B와 같은, 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 물질을 사용한, 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 사용으로서 동일한 방법으로 형성될 수 있다.
면역침전은 하기 또는 예를 들면, 문헌(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))에 있는 방법에 따라 수행될 수 있다.
SDS-PAGE는 주로 면역침전된 단백질의 분석에 사용되고 상기 결합된 단백질은 적절한 농도를 갖는 겔을 사용하여 상기 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다. 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합된 상기 단백질은 쿠마시(Coomassie) 염색 또는 실버 염색과 같은, 흔한 염색법에 의해 검출되기 어렵기 때문에, 상기 단백질에 대한 검출 민감성은 방사성 동위원소, 35S-메티오닌 또는 35S-시스테인, 상기 세포 내 표지 단백질을 포함하는 배양 배지에서의 세포 배양, 및 상기 단백질의 검출에 의해 향상될 수 있다. 상기 표적 단백질은 단백질의 상기 분자량이 밝혀진 경우, 상기 SDS-폴리아크릴아마이드 겔로부터 직접 정제될 수 있고 그것의 서열이 결정될 수 있다.
상기 폴리펩티드를 사용하여 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 단백질에 대한 스크리닝 방법으로서, 예를 들면, 웨스트-웨스턴 블랏팅 분석(Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991))이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 파아지 벡터(예를 들면, ZAP)를 사용한 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 배양된 세포(예를 들면, LC176, LC319, A549, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H522, PC3, PC9, PC14, SK-LU-1, EBC-1, RERF-LC-AI, SK-MES-1, SW900, 및 SW1573)로부터 cDNA 라이브러리의 제조, LB-아가로스 상에 상기 단백질의 발현, 필터 상에 발현된 상기 단백질의 고정, 상기 필터와 상기 정제되고 표지된 SYNGR4 폴리펩티드의 반응, 및 상기 표지에 따라 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합된 상기 플라그 발현 단백질의 검출을 통해 수득될 수 있다. 본 발명의 상기 폴리펩티드는 비오틴과 아비딘 사이에 결합을 이용함으로써, 또는 상기 SYNGR4에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 SYNGR4 폴리펩티드와 융합되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 이용함으로써 표지될 수 있다. 또한 방사성 동위원소 또는 형광을 사용한 방법 및 이러한 것이 사용될 수 있다.
또는, 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 대한 또 다른 실시태양에 있어서, 세포를 사용한 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 사용될 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene); 참조 "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)").
상기 투-하이브리드 시스템에 있어서, 상기 SYNGR4 폴리펩티드는 상기 SRF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되고 효모 세포에서 발현된다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 세포로부터 제조되고, 이러한 상기 라이브러리는, 발현될 때, 상기 VP16 또는 GAL4 전사 활성 부위에 융합된다. 상기 cDNA 라이브러리는 그런 다음 상기 효모 세포에 도입되고 상기 라이브러리에서 유래된 cDNA는 검출된 상기 양성 클론으로부터 분리된다(본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포에서 발현되고, 상기 두 개의 결합이 리포터 유전자를 활성화하고, 양성 클론을 검출가능하게 함). 상기 cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 상기 분리된 cDNA를 E.Coli에 도입하여 상기 단백질을 발현함으로써 제조될 수 있다. 리포터 유전자로서, 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제 유전자 및 이들이 HIS3 유전자와 더불어 사용될 수 있다.
또한 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 친화성 컬럼의 담체 상에 고정화될 수 있고, 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는, 검사 화합물은, 상기 컬럼에 사용에 사용된다. 본 발명의 검사 화합물은, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 용해물, 등일 수 있다. 상기 검사 화합물을 로딩한 후, 상기 컬럼은 세척되고, 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합하는 화합물이 제조될 수 있다. 상기 검사 화합물이 단백질일 때, 수득된 단백질의 상기 아미노산 서열이 분석되고, 올리고 DNA는 상기 서열을 기초로 합성되며, cDNA 라이브러리는 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위한 탐침으로써 상기 올리고 DNA를 사용하여 스크리닝 된다.
표면 플라스몬 공명 현상을 사용한 바이오센서가 본 발명에서 결합된 화합물을 검출 또는 정량하기 위한 수단으로써 사용될 수 있다. 이러한 바이오센서가 사용될 때, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 및 검사 화합물 사이에 상호작용은 표지가 없고 폴리펩티드의 오직 극미량을 사용한, 표면 플라스몬 공명 신호로서 실시간 관찰될 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia). 따라서, 이러한 BIAcore와 같은 바이오센서를 사용하여 본 발명의 상기 폴리펩티드와 검사 화합물 사이에 결합을 측정하는 것이 가능하다.
상기 SYNGR4 단백질에 결합하는 단백질뿐만 아니라 화학적 화합물(작용제 및 길항제를 포함하는)을 분리하기 위하여 상기 고정화된 SYNGR4 폴리펩티드가 합성 화학적 화합물, 또는 천연 물질 뱅크 또는 랜덤 파아지 펩티드 디스플레이 라이브러리에 노출된 경우 결합하는 분자에 대한 스크리닝 방법, 및 조합의 화학 기술에 기초한 높은 처리율(Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))을 사용한 스크리닝 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다.
SYNGR4 의 생물학적 활성을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝
본 발명에 있어서, 상기 SYNGR4 단백질은 폐암 세포의 세포 증식(도. 3b) 및 세포 침습 활성(도. 4a)의 증진 활성을 가진다. 이러한 생물학적 활성을 사용하는, 본 발명은 폐암 세포의 증식을 저해하는 화합물 스크리닝 방법, 및 폐암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리뉴클레오티드를 사용한 폐암 치료 또는 예방용 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 검사 화합물은 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉하는 단계;
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물 부재하에서 검출된 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비교하여 SYNGR4의 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 저해하는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, SYNGR4의 발현을 저해하는 것은, 폐암 성장이 감소하는 것을 나타낸다. 따라서, SYNGR4 폴리펩티드의 상기 생물학적 활성을 억제하는 후보 화합물의 스크리닝에 의해, 폐암 치료 또는 예방에 사용하는 후보 화합물이 확인될 수 있다. 암 치료 또는 예방에 대한 이러한 후보 화합물의 가능성은 폐암 치료 또는 예방에 유용한 치료적 약제를 확인하기 위하여 이차적 및/또는 추가적 스크리닝에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4 단백질에 결합하는 화합물이, 예를 들면, 상기 폐암 세포의 증식적 또는 침습적 활성을 억제할 때, 이러한 화합물은 상기 SYNGR4 특이적 치료 효과를 갖는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 세포 성장 억제에 대한 상기 검사 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 관련성 질환 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용한, 상기 세포 성장 억제에 대한 후보 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 관련성 질환 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
a) 검사 약제 또는 화합물을 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 접촉하는 단계; 및
b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드 또는 단편의 생물학적 활성을 검출하는 단계, 및
c) b)의 상기 생물학적 활성과 상기 검사 약제 또는 화합물의 치료 효과를 관련시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 상기 바이오 활성과 관련될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 저해 또는 억제할 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 상기 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 또는 화합물로서 확인 또는 선택될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 저해 또는 억제하지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의적이지 않은 치료 효과를 갖는 상기 약제 또는 화합물로서 확인될 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
모든 SYNGR4 폴리펩티드는 그들이 상기 SYNGR4 단백질의 상기 생물학적 활성을 포함하는 한 스크리닝에 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 활성에는 SYNGR4 단백질의 세포 증식 활성 또는 침습 활성을 포함한다. 예를 들면, SYNGR4 단백질이 사용될 수 있고 이러한 단백질에 대한 기능적으로 동등한 폴리펩티드 또한 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 세포에 의해 내생적으로 또는 외생적으로 발현될 수 있다. 추가적으로 SYNGR4 단백질은 GRB2와의 상호작용 활성을 가지고, SYNGR4의 티로신-46 잔기는 상기 활성에 대해 필수적이다. SYNGR4는 GRB2-PAK1 및 그 후의 MAPK 신호 활성화와 함께 발암성 기능을 가할 수 있다.
이러한 스크리닝에 의해 분리된 상기 화합물은 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드의 길항제에 대한 후보이다. 상기 용어 "길항제"는 이에 결합함으로써 상기 폴리펩티드의 기능을 억제하는 분자를 나타낸다. 또한 상기 용어는 SYNGR4를 암호화하는 유전자의 발현을 감소 또는 억제하는 분자를 나타낸다. 더욱이, 이러한 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 상기 SYNGR4 폴리펩티드와 분자(DNAs 및 단백질을 포함하는)와의 생체 내 상호작용을 억제하는 화합물에 대한 후보이다.
본 발명에서 검출되는 상기 생물학적 활성이 세포 증식일 때, 예를 들면, 도. 3에 나타낸, 예를 들면, 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 발현하는 세포 제조, 검사 화합물의 존재하에서 상기 세포의 배양, 및 세포 증식의 속도 결정, 생존 세포 또는 콜로니 형성 활성 측정에 의한 것뿐만 아니라, 세포 주기 및 이의 측정에 의해 검출될 수 있다. SYNGR4를 발현하는 상기 세포의 증식 속도를 감소시키는 상기 화합물은 폐암 치료 또는 예방용 후보 화합물로서 선택된다.
더욱 구체적으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 검사 화합물을 SYNGR4를 과발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 세포 증식 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 상기 세포 증식 활성과 비교하여 상기 세포 증식 활성을 감소시키는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
(d) SYNGR4를 적게 발현하거나 발현하지 않는 상기 세포에서 효과가 없는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명의 방법에서 검출되는 상기 화학적 활성이 침습 활성일 때, 예를 들면, 도. 4a에 나타낸, SYNGR4 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제조하고 예를 들면, 마트리겔 침습 분석과 같은, 당업계에 공지된 모든 방법을 사용하여 침습 세포 수를 계수함으로써 검출될 수 있다. 상기 침습 세포 수를 감소시키는 상기 화합물은 폐암 치료 또는 예방용 화합물로서 선택된다.
더욱 구체적으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 검사 화합물을 SYNGR4를 과발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포의 침습 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 상기 세포의 침습 활성과 비교하여 상기 세포의 침습 활성을 감소시키는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
(d) SYNGR4를 적게 발현하거나 발현하지 않는 상기 세포에서 효과가 없는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서,
본 발명에 있어서, SYNGR4의 발현을 저해하는 것은, 폐암 세포 침습이 감소하는 것을 나타낸다. 따라서, 폐암 세포 침습을 감소시키는 후보 화합물의 스크리닝에 의해, 폐암 세포 침습 치료 또는 예방에 사용하는 후보 화합물이 확인될 수 있다. 폐암 세포 침습 치료 또는 예방에 대한 이러한 후보 화합물의 가능성은 암 침습에 대한 치료적 약제를 확인하기 위하여 이차적 및/또는 추가적 스크리닝에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 암 세포 침습 억제에 대한 상기 검사 약제 또는 화합물 또는 폐암 세포 침습 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용한, 폐암 세포 침습 억제에 대한 후보 약제 또는 화합물 또는 폐암 세포 침습 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 시험 약제 또는 화합물을 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 세포의 침습 활성을 측정하는 단계; 및
c) b)의 상기 세포의 침습 활성과 상기 검사 약제 또는 화합물의 치료 효과를 관련시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 상기 침습 활성과 관련될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 침습 활성을 저해 또는 억제할 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 상기 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 또는 화합물로서 확인 또는 선택될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 침습 활성을 저해 또는 억제하지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의적이지 않은 치료 효과를 갖는 상기 약제 또는 화합물로서 확인될 수 있다.
본 발명에서 정의된 "생물학적 활성 저해"는 바람직하게는 상기 화합물의 부재하에서와 비교하여 SYNGR4의 상기 생물학적 활성의 적어도 10% 저해, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 70% 저해이고 가장 바람직하게는 90% 저해를 나타낸다.
SYNGR4의 발현을 변화하는 화합물에 대한 스크리닝
본 발명에 있어서, siRNA에 의한 SYNGR4의 발현의 감소는 폐암 세포 증식을 억제한다(도. 3a). 따라서, 본 발명은 SYNGR4의 발현을 억제하는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. SYNGR4의 발현을 억제하는 화합물은 폐암 세포의 증식을 저해하는 것으로 예상되고, 이에 폐암 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 또한 본 발명은 폐암 세포의 증식을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 폐암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 문맥에 있어서, 이러한 스크리닝은 예를 들면, 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 후보 화합물을 SYNGR4를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및
(b) 대조군과 비교하여 SYNGR4의 발현 수준을 감소시키는 상기 후보 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, SYNGR4의 발현의 저해는, 폐암 세포 성장을 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, SYNGR4의 발현 수준을 억제하는 후보 화합물을 스크리닝함으로써, SYNGR4의 과발현에 의해 어느 정도 야기되고 증진되는 암을 치료 또는 예방하는데 사용되는 후보 화합물이 확인될 수 있다. SYNGR4 관련성 암에 대한 치료적 약제를 확인하기 위하여 암을 치료 또는 예방하기 위한 이러한 후보 화합물의 가능성은 이차적 및/또는 추가적 스크리닝에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에 따라, 세포 성장 억제에 대한 상기 검사 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 관련성 질환 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 암 세포의 활성을 저해하는 후보 약제 또는 화합물의 스크리닝 방법, 및 SYNGR4 관련성 질환의 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 문맥에 있어서, 이러한 스크리닝은, 예를 들면, 하기 단계를 포함한다:
a) 검사 약제 또는 화합물을 상기 SYNGR4 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
c) b)의 상기 발현 수준과 상기 검사 약제 또는 화합물의 치료 효과를 관련시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 상기 SYNGR4 유전자의 발현 수준과 관련될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 상기 SYNGR4의 발현 수준을 감소시킬 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 상기 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 또는 화합물로서 확인 또는 선택될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 상기 SYNGR4의 발현 수준을 감소시키지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의적이지 않은 치료 효과를 갖는 상기 약제 또는 화합물로서 확인될 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
상기 SYNGR4를 발현하는 세포는 예를 들면, 폐암으로부터 확립된 세포주(예를 들면, A427, A549, LC319, PC14, PC3, PC9, NCI-H1373, NCI-H1781, NCI-H358, NCI-H226, NCI-H520, NCI-H1703, NCI-H2170, EBC-1, RERF-LC-AI, LX1, DMS114, DMS273, SBC-3, SBC-5, NCI-H196, NCI-H446)를 포함하고; 이러한 세포는 본 발명의 상기 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, RT-PCR, 노던 블랏 분석, 웨스턴 블랏 분석, 면역염색 및 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에서 정의된 "발현 수준의 감소"는 바람직하게는 상기 화합물의 부재하에서의 발현 수준과 비교하여 SYNGR4의 발현 수준의 적어도 10% 감소, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소된 수준이고 가장 바람직하게는 95% 감소된 수준을 나타낸다. 화학적 화합물, 이중 가닥 뉴클레오티드, 등을 포함하는, 사용되는 상기 화합물이 본 발명에 기재된다. 상기 이중 가닥 뉴클레오티드의 제조는 상기 기재된 설명에 있다. 스크리닝 방법에 있어서, 폐암 치료 또는 예방을 위해 사용되는 SYNGR4의 발현 수준을 감소시키는 화합물은 후보 화합물로서 선택된다.
또는, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 후보 화합물을 SYNGR4의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절하에 발현되는 리포터 유전자가 포함된, 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 상기 후보 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, SYNGR4의 발현의 저해는, 폐암 세포 성장을 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 리포터 유전자의 발현 활성을 억제하는 후보 화합물을 스크리닝함으로써, 폐암을 치료 또는 예방하는데 사용되는 후보 화합물이 확인될 수 있다. 폐암에 대한 치료 약제를 확인하기 위하여 암을 치료 또는 예방하기 위한 이러한 후보 화합물의 가능성은 이차적 및/또는 추가적 스크리닝에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에 따라, 폐암 세포 성장 억제에 대한 상기 검사 약제 또는 화합물 또는 SYNGR4 관련성 질환 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 폐암 세포의 증식을 저해하는 후보 약제 또는 화합물의 스크리닝 방법, 및 SYNGR4 관련성 질환의 치료 또는 예방용 후보 약제 또는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 검사 약제 또는 화합물을 SYNGR4의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절하에 발현되는 리포터 유전자로 구성된, 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
c) b)의 상기 발현 수준을 상기 검사 약제 또는 화합물의 치료 효과와 관련시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성과 관련될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킬 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 상기 치료 효과를 갖는 상기 후보 약제 또는 화합물로서 확인 또는 선택될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의적이지 않은 치료 효과를 갖는 약제 또는 화합물로서 확인될 수 있다.
적절한 리포터 유전자 및 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 리포터 유전자는 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), 디스코소마 종 적색 형광 단백질(Discosoma sp. Red Fluorescent Protein, DsRed), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chrolamphenicol Acetyltransferase, CAT), lacZ 및 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase, GUS)이고, 숙주 세포는 COS7, HEK293, HeLa 및 등이다. 상기 스크리닝에 요구되는 상기 리포터 컨스트럭트는 리포터 유전자 서열을 상기 SYNGR4의 전사 조절 부위에 연결함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 SYNGR4의 전사 조절 부위는 시작 코돈에서부터 적어도 500bp 업스트림 까지의 부위이고, 바람지하게는 1000bp, 더욱 바람직하게는 5000 또는 10000bp 업스트림 까지이다. 상기 전사 조절 부위를 포함하는 뉴클레오티드 단편은 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있고 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 상기 스크리닝에 요구되는 상기 리포터 컨스트럭트는 리포터 유전자 서열을 이러한 유전자 중 어느 하나의 전사 조절 부위에 연결함으로써 제조될 수 있다. 전사 조절 부위를 확인하기 위한 방법, 또는 분석 프로토콜은 잘 알려져 있다(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press).
상기 리포터 컨스트럭트를 포함하는 상기 벡터는 숙주 세포로 침투되고 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 검출된다(예를 들면, 광도계(luminometer), 흡수 분광계(absorption spectrometer), 유세포분석기 등을 사용한). 본 발명에서 정의된 "발현 또는 활성 감소"는 상기 화합물 부재하에서와 비교하여 바람직하게는 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성의 적어도 10% 감소이고, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소이고 가장 바람직하게는 적어도 95% 감소이다.
지표로서 SYNGR4의 인산화 수준을 사용한 스크리닝
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SYNGR4 단백질이 인산화된 것으로 확인되었다. 따라서, SYNGR4 단백질의 상기 인산화를 억제하는 화합물은 지표로서 이러한 변형을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 SYNGR4 단백질의 인산화를 억제하기 위한 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 또한 암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 특히 암 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 스크리닝 약제에 적합하다. 더욱 구체적으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) (1) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(2) 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 단백질에 동일한 생물학적 활성을 갖고 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가된 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(3) 서열번호 14의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 동일한 생물학적 활성을 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서울 동일성을 공유하는 폴리펩티드; 및
(4) 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드에 동일한 생물학적 활성을 갖는, 엄격한 조건에서 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 검사 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 폴리펩티드의 인산화 수준을 검출하는 단계;
(c) 상기 화합물의 부재하에서 검출된 상기 폴리펩티드의 인산화 수준과 상기 폴리펩티드의 인산화 수준을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 폴리펩티드의 인산화의 억제제로서 상기 폴리펩티드의 인산화 수준을 감소시킨 상기 화합물 또는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에서, 모든 세포는 그것이 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 발현하는 한 사용할 수 있다. 본 발명의 스크리닝에 사용되는 상기 세포는, 예를 들면, 폐암 또는 정소로부터 유래된 세포 및 이로부터 확립된 세포주와 같이, 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 자연적으로 발현하는 세포일 수 있다. A427, A549, LC319, PC-3, PC-9, PC-14, NCI-H1373, NCI-H1781, NCI-H358, NCI-H226, EBC-1, NCI-H520, NCI-H1703, NCI-H2170, RERF-LC-AI, DMS114, DMS273, SBC-3, SBC-5, NCI-H196, 및 NCI-H446과 같은 폐암의 세포주가 사용될 수 있다.
또는, 상기 스크리닝에 사용되는 상기 세포는 상기 SYNGR4 폴리펩티드를 자연적으로 발현하지 않는 세포일 수 있고 이는 SYNGR4 폴리펩티드- 또는 SYNGR4 기능적 등가물 발현 벡터로 형질전환된다. 이러한 재조합 세포는 상기 언급한 바와 같이 공지의 유전 공학 방법(예를 들면, Morrison DA., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62)을 통해 수득될 수 있다.
상기 기재된 모든 검사 화합물은 본 발명의 스크리닝에 사용될 수 있다. 그러나, 세포 내로 침투할 수 있는 화합물을 선택하는 것이 바람직하다, 또는, 상기 검사 화합물이 폴리펩티드일 때, 본 발명의 스크리닝에서 세포와 상기 검사 약제의 접촉은 상기 세포를 상기 검사 약제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환하여 상기 세포에서 상기 검사 약제를 발현함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서, SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물의 인산화에 적절한 조건은 시험관 내에서 제공될 수 있다. 이러한 스크리닝 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 검사 화합물을 본 발명의 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들면, 티로신-46을 포함하는)과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드의 인산화를 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 검출된 생물학적 활성과 비교하여 상기 폴리펩티드의 인산화를 저해하는 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 언급한 바와 같이, 상기 SYNGR4 단백질의 상기 생물학적 활성은 바람직하게는 인산화된 활성이다. 당업자는 인산화 수준을 평가할 수 있다.
따라서, 이러한 실시태양에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 SYNGR4의 인산화 억제용 또는 암 예방 또는 치료용 약제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) (1) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(2) 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 단백질에 동일한 생물학적 활성을 갖고 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가된 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(3) 폴리펩티드가 서열번호 14의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 동일한 생물학적 활성을 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 폴리펩티드; 및
(4) 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 인산화 부위를 포함하는 이의 단편에 동일한 생물학적 활성을 갖는, 엄격한 조건에서 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 인산화를 가능하게 하는 조건하에서 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편의 상기 인산화 수준을 검출하는 단계;
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 검출된 상기 폴리펩티드의 상기 인산화 수준과 상기 기질의 인산화 수준을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 폴리펩티드의 상기 인산화 억제용 또는 암 치료 또는 예방용 화합물로서 상기 폴리펩티드의 상기 인산화 수준을 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
이러한 실시태양에 있어서, SYNGR4 폴리펩티드의 인산화를 가능하게 하는 조건은 상기 폴리펩티드를 상기 SYNGR4 폴리펩티드 및 ATP에 대한 적절한 키나제와 배양함으로써 제공될 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 SYNGR4 폴리펩티드는 추가적으로 AURKB 폴리펩티드와 접촉된다. 또한, 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 SYNGR4 폴리펩티드의 인산화를 향상시키는 물질이 스크리닝의 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 인산화가 상기 물질의 첨가에 의해 향상될 때, 상기 인산화 수준은 더 높은 민감성으로 결정될 수 있다.
SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물의 상기 인산화 수준은 당업계에 공지된 모든 방법에 따라 검출될 수 있다(예를 들면, 실시예 참조).
지표로서 SYNGR4의 상호작용을 사용한 스크리닝
또한, 본 발명은 상기 SYNGR4가 GRB2와 상호작용한다는 것을 나타낸다(도. 5). 따라서, 두 폴리펩티드의 상호작용은 발암 또는 세포 증식, 특히 암의 세포 증식에 중요한 역할을 한다. 본 발명에서, 암 치료 또는 예방에 유용한 화합물에 대한 스크리닝을 할 것이고, 이는 SYNGR4 폴리펩티드와 GRB2 폴리펩티드 사이의 상호작용 또는 그 반대의 상호작용도 억제한다. 따라서, 본 발명은 SYNGR4 폴리펩티드와 GRB2 폴리펩티드 사이에 상호작용을 억제하는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 SYNGR4 폴리펩티드와 GRB2 폴리펩티드 사이에 결합을 억제하는, 또는 암 치료 또는 예방 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 검사 화합물 존재하에서 GRB2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드 사이에 결합을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 GRB2 및 SYNGR4 폴리펩티드 사이에 결합을 억제하는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명의 문맥에 있어서, GRB2 또는 SYNGR4 폴리펩티드의 기능적 등가물은 각각 SYNGR4 폴리펩티드(서열번호 14) 또는 GRB2 폴리펩티드(서열번호 23 또는 25)에 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드이다(정의 참조).
PAK1, c-Raf, MEK1/2 및 ERK1/2의 인산화 활성을 저해하는 화합물 스크리닝
본 발명의 문맥에 있어서, PAK1 (Thr423), c-Raf (Ser338), MEK1 (Ser 298), MEK1/2 (Ser217/221) 및 ERK1/2 (Thr202/204)의 인산화는 SYNGR4 녹다운에서 감소되는 것을 확인하였습니다. 반면에, 인산화된 PAK1 (Thr423), c-Raf (Ser338), MEK1 (Ser 298), MEK1/2 (Ser217/221) 및 ERK1/2 (Thr202/204)는 SYNGR4 발현에 따라 증가되었다 (도. 6). 이러한 발견은 PAK1, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK1/2가 상기 세포 증식을 유도하는 SYNGR4 폴리펩티드의 인산화 신호에 대한 다운스트림 반응기 분자인 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서, SYNGR4의 다운스트림 반응기는 SYNGR4 직접적 또는 간접적 방법에 의해 인산화되는 분자를 나타낸다. 따라서, SYNGR4의 다운스트림 반응기는 SYNGR4로부터의 신호 경로 동안에 인산화되는 분자를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따라, SYNGR4는 SYNGR4의 다운스트림 반응기 중 하나인 PAK1의 인산화 수준을 향상시킨다. 더불어, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK의 인산화 수준은 SYNGR4의 인산화에 이어 증가된다. 이에, 또한 이러한 분자들은 SYNGR4의 다운스트림 반응기이다. 따라서, 지표로서 이러한 활성을 사용함으로써, 본 발명은 SYNGR4, GRB2 및 PAK1, 및 c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2를 발현하는 암세포의 증식을 저해하는 화합물 스크리닝 방법, 및 암, 특히 폐암을 포함하는 암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인산화하는 다운스트림 반응기에 대한 SYNGR4의 활성을 억제용, 또는 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드를 사용한 암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) PAK1, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK1/2로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다운스트림 작용기의 인산화를 위한 조건하에서 폴리뉴클레오티드 GRB2 및 PAK1에 의해 암호화되는 폴리펩티드 존재하에서 검사 화합물을 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
(b) SYNGR4의 상기 다운스트림 작용기의 인산화 수준을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 검출된 SYNGR4의 상기 다운스트림 작용기의 상기 인산화 수준과 비교하여 SYNGR4의 다운스트림 작용기의 인산화 수준이 저해되는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 검출되는 SYNGR4의 상기 다운스트림 작용기의 상기 인산화 수준은 각각, PAK1의 Thr423, c-Raf의 Ser338, MEK1의 Ser298, MEK1/2의 Ser217/221, 및 ERK1/2의 Thr202/204의 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 PAK1, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK1/2로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다운스트림 작용기의 인산화를 위한 조건은 SYNGR4 및 적어도 하나의 이의 다운스트림 작용기를 발현하는 세포의 배양을 통하여 제공될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4 및 GRB2를 포함하는 이러한 모든 다운스트림 작용기를 발현하는 세포는 이러한 다운스트림 작용기의 인산화를 위한 조건인 것이 바람직하다. 특히, 이러한 분자를 발현하는 폐암 세포주가 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 또한 SYNGR4 발현을 위한 벡터로 형질전환된 상기 다운스트림 작용기를 내인적으로 발현하는 모든 세포가 본 발명에 유용하다.
본 발명에 따라, PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2의 인산화 활성 저해에 대한 상기 검사 화합물 또는 SYNGR4에 관련된 암(예를 들면, 폐암) 치료 또는 예방용 후보 화합물의 치료 효과가 평가될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 하기 단계를 포함하고 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용한, 인산화 활성 저해용 후보 화합물, 또는 SYNGR4에 관련된 암 치료 또는 예방용 후보 화합물 스크리닝 방법을 제공한다:
a) PAK1, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK1/2로 구성된 군으로부터 선택되는 SYNGR4의 적어도 하나의 다운스트림 작용기의 인산화를 위한 조건하에서, GRB2 및 PAK1, 및 c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 존재하에서 검사 화합물을 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 접촉시키는 단계,
b) SYNGR4의 상기 다운스트림 작용기의 상기 인산화 수준을 검출하는 단계; 및
c) b)의 상기 인산화 수준을 상기 검사 약제 또는 화합물의 치료 효과와 관련시키는 단계.
본 발명의 문맥에 있어서, 상기 치료 효과는 SYNGR4에 의해 향상되는 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 상기 인산화 활성과 관련될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 상기 인산화 활성을 저해 또는 억제시킬 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 치료 효과를 갖는 후보 약제 또는 화합물로서 확인 또는 선택될 수 있다. 또는, 상기 검사 약제 또는 화합물의 부재하에서 검출된 수준과 비교하여 상기 검사 약제 또는 화합물이 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 상기 인산화 활성을 저해 또는 억제시키지 않을 때, 상기 검사 약제 또는 화합물은 유의적이지 않은 치료 효과를 갖는 약제 또는 화합물로서 확인될 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
모든 폴리펩티드는 그들이 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2의 인산화 활성을 저해하는 한 스크리닝에 사용될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4 단백질 및 GRB2, PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2 단백질이 사용될 수 있고 이러한 단백질에 기능적으로 동일한 폴리펩티드 또한 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 세포에 의해 내인적으로 또는 외인적으로 발현될 수 있다.
이러한 스크리닝에 의해 분리된 상기 화합물은 SYNGR4 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드의 길항제에 대한 후보이다. 상기 용어 "길항제"는 이에 결합함으로써 상기 폴리펩티드의 기능을 억제하는 분자를 나타낸다. 또한 이 용어는 SYNGR4를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 감소 또는 억제하는 분자를 나타낸다. 또한, 이러한 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 상기 SYNGR4 폴리펩티드와 GRB2의 생체 내 상호작용을 억제시키는 화합물에 대한 후보이다.
본 발명의 방법에서 검출되는 상기 생물학적 활성이 인산화일 때, 그것은 예를 들면, SYNGR4, GRB2 및 PAK1, 및 c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2를 발현하는 세포 제조, 검사 화합물의 존재하에서 상기 세포의 배양, 및 PAK1, c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2의 인산화 결정, 생존 세포 또는 콜로니 형성 활성뿐만 아니라, 이러한 세포 주기 측정을 통해, 검출될 수 있다. SYNGR4를 발현하는 상기 세포의 PAK1, 및 c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2의 인산화를 감소시키는 상기 화합물은 폐암을 포함한 암 치료 또는 예방용 후보 화합물로서 선택된다.
바람직한 실시태양에 있어서, SYNGR4 폴리펩티드를 발현하지 않는 대조군 세포가 사용된다. 따라서, 또한 본 발명은 하기 단계를 포함하고 상기 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용한, 상기 세포 성장을 억제하기 위한 후보 물질 또는 SYNGR4 관련성 질환 치료 또는 예방용 후보 물질 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 검사 화합물을 YNGR4, GRB2 및 PAK1, 및 c-Raf, MEK1/2 또는 ERK1/2를 과발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
(b) PAK1 (Thr423), c-Raf (Ser338), MEK1 (Ser 298), MEK1/2 (Ser217/221) 및 ERK1/2 (Thr202/204)의 상기 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 검사 화합물의 부재하에서 상기 세포 증식 활성과 비교하여 상기 인산화 활성을 감소시키는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
(d) SYNGR4를 발현하지 않거나 적게 발현하는 상기 세포에서 효과가 없는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
또는, 본 발명에 따라, SYNGR4의 다운스트림 작용기 분자의 SYNGR4 매개 인산화를 억제하는 활성에 대하여 SYNGR4 폴리펩티드에 대한 잠재적 길항제가 평가될 수 있다. 예를 들면, SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 모든 화합물은 상기 폴리펩티드에 대한 잠재적 길항제일 수 있다. 이러한 화합물은 하기 단계를 포함하는 하기 방법에 의해 분리될 수 있다:
ⅰ) 검사 화합물을 SYNGR4 폴리펩티드와 접촉시키는 단계,
ⅱ) 상기 검사 화합물과 SYNGR4 폴리펩티드 사이에 결합을 검출하는 단계, 및
ⅲ) SYNGR4 폴리펩티드에 대한 상기 잠재적 길항제로서 상기 SYNGR4 폴리펩티드에 결합하는 상기 검사 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에서 정의된 상기 용어 "인산화 저해 또는 감소"는 바람직하게는 상기 화합물의 부재하에서와 비교하여 SYNGR4의 상기 생물학적 활성의 적어도 10% 저해이고, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 저해이며 가장 바람직하게는 90% 저해이다. 본 발명의 측면은 하기 실시예에 기재된고, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위에 제한되지 않는다.
언급되지 않으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 하나의 보통의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 발명에 기재된 것과 동일하거나 유사한 방법 및 재료가 실제적으로 또는 본 발명의 시험에서 사용될 수 있으나, 적절한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있다.
본 발명은 추가적으로 하기 실시예에 기재되고, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위에 한정되지 않는다.
실시예
실시예 1: 일반적인 방법
1. 세포주 및 조직 시료.
본 실시예에서 사용된 22개의 인간 폐암 세포주는 9개의 선암(adenocarcinomas)(ADC; A427, A549, LC319, PC-3, PC-9, PC-14, NCI-H1373, NCI-H1781, 및 NCI-H358), 하나의 선평편암종 (Adenosquamous carcinoma)(ASC; NCI-H226), 5개의 편평상피세포암(squamous cell carcinomas)(SCC; EBC-1, NCI-H520, NCI-H1703, NCI-H2170, 및 RERF-LC-AI), 하나의 대세포암(large cell carcinoma)(LX1), 및 6개의 소세포폐암(small cell lung cancers)(SCLC; DMS114, DMS273, SBC-3, SBC-5, NCI-H196, 및 NCI-H446)을 포함한다. 인간 기관지 상피세포(BEAS-2B) 및 인간 소기도상피세포(small airway epithelial cell, SAEC)가 대조군으로서 사용되었다. 모든 세포는 10% FCS가 첨가된 적절한 배지에서 단층으로 성장되었고 5% CO2의 습한 공기에서 37℃에 유지되었다. 일차 폐암 시료는 초기에 수득되었다. 임상적 단계는 International Union Against Cancer TNM classification (Sobin L et al., 6th ed. New York 2002)에 따라 판단되었다. 203개의 ADCs, 100개의 SCCs, 25개의 LCCs, 11개의 ASCs 및 인접한 정상 폐 조직을 포함하는 일차 NSCLCs(단계 Ⅰ-ⅢA) 중 총 339개의 포르말린-고정된 시료는, Saitama Cancer Center (Saitama, Japan)에서 수술받은 환자로부터의 임상병리적인 데이터와 더불어 초기에 수득되었다. 언급된 모든 임상 재료의 사용은 각 기관의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
2. 반정량적 역전사-PCR
각 시료로부터의 총 3 ㎍ 분취량의 mRNA는 랜덤 프라이머(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) 및 SuperScript Ⅱ(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 단일 가닥 cDNA로 역전사하였다. 반정량적 역전사-PCR(RT-PCR) 실험은 SYNGR4에 특이적인 하기 합성 프라이머 세트 또는 내부 대조군으로서 베타-액틴(ACTB)에 특이적인 프라이머로 수행하였다: SYNGR4, 5'-CAACAGCCCTGTGAACATGC-3' (서열번호 1) 및 5'-ACCCTTCTGGAGGGAGGATTC-3' (서열번호 2); ACTB, 5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (서열번호 3) 및 5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (서열번호 4). PCRs은 증폭의 선형 위상 내가 되도록 산물 강도를 달성하기 위하여 사이클의 수를 최적화하였다.
3. 노던 블랏 분석
16개의 조직에 걸친 인간 다중 조직 블랏(BD Biosciences, Palo Alto, CA)은 프라이머 5'-CGGCTACCAGAACAAGATGG-3' (서열번호 5) 및 5'-GAAGCGCTTGTAAGGGACTG-3' (서열번호 6)을 사용하여 탐침으로서 제조된 SYNGR4의 [알파-32P]-dCTP-표지된, 406-bp PCR 산물과 혼성화하였다. 전혼성화, 혼성화, 및 세척은 하기 제조자의 설명서에 따라 실시되었다. 상기 블랏은 -80℃에서 7일간 증감 스크린으로 방사능촬영하였다.
4. SYNGR4 발현 벡터의 구성
SYNGR4의 전체 암호화 부위는 프라이머 세트 5'-GGAATTCCAGACCGTGCATCATGCACATCCCCAAAAGCCTCCAG-3' (서열번호 7) 및 5'-CCGCTCGAGCGGGTTGTCAGGCATCATAGCAAGC-3' (서열번호 8)을 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 상기 산물은 EcoRⅠ 및 XhoⅠ로 분해하였고, 상기 SYNGR4 단백질의 COOH-말단에 c-myc-His 에피토프 서열 (LDEESILKQEHHHHHH)(서열번호 15)을 포함하는 pcDNA3.1-myc/His A(+) 벡터(Invitrogen)의 적절한 부위 내로 클로닝되었다. 또한 본 발명자들은 pCAGGSn-3Fc 벡터 및 pCAGGSn-3FH 벡터를 사용하여 발현 벡터를 구성하였고, 이는 상기 SYNGR4 단백질의 NH2 말단에 3× Flag 에피토프 서열(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) (서열번호 16)을 포함한다. Tyr46가 페닐알라닌 (Y46F)로 치환된 돌연변이 SYNGR4의 형성은 표준 돌연변이화 PCR(Suzuki C, et al. Cancer Res 2005; 65:11314-25.)에 의해 수행되었다. SYNGR4-Y46F에 대해 사용된 프라이머 세트는 하기와 같다; 정방향, 5'-CGACGGCTtCCAGAACAAG-3' (서열번호 17) 및 역방향, 5'-CTTGTTCTGGaAGCCGTCG-3' (서열번호 18) (소문자는 돌연변이된 뉴클레오티드를 나타냄). 요약하면, 상기 SYNGR4 서열은 정방향 클로닝 프라이머 및 역방향 Y46F 프라이머 또는 정방향 Y46F 프라이머 및 역방향 클로닝 프라이머의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 두 가지의 증폭된 PCR 산물을 정제하였고 돌연변이화 PCR을 수행함으로써 융합하였다.
5. 면역세포화학분석
투과적 조건하에서 분석을 위하여, 세포를 글라스 커버슬립(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)에 올려놓았고, 4% 파라포름알데하이드로 고정화하였으며, PBS에 포함된 0.1% Triton X-100으로 5분간 실온에서 투과적으로 만들었다. 비특이적인 결합은 Casblock (ZYMED, San Francisco, CA)에 의해 10분간 실온에서 블로킹하였다. 그런 다음 세포를 1% BSA가 포함된 PBS에 희석된 1.3 ㎍/㎖의 염소 다클론 항-인간 SYNGR4 항체로 60분간 실온에서 배양하였다. PBS로 세척한 후에, 상기 세포는 Alexa488 결합된 이차 항체(Invitrogen)로 60분간 상온에서 염색하였다. PBS로 또 한번 세척한 후, 각 시료는 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)이 포함된 Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)로 마운팅하였고 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2 AOBS; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 가시화하였다. SYNGR4의 세포 위치를 결정하기 위하여, 고정화된 세포는 투과성이 있거나 없는 조건 내로 분리되었다. 일차 항체로 블로킹 및 배양한 후 세포는 세포 표면에 결합하는 항체를 제거하기 위하여 5분간 산 글리신으로 처리하였다. 산 글리신 처리 후, 이차 항체 및 4',6-디마이디노-2-페닐인돌을 정상적인 절차에 의해 처리하였다.
6. 유세포분석.
폐암 세포 (2×106 세포)는 세포 표면 SYNGR4 또는 대조군 염소 IgG(5 ㎍/㎖; R&D Systems, Inc.)를 검출하기 위하여 염소 항-SYNGR4 항체(5 ㎍/㎖; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 4℃에서 30분간 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척한 다음 4℃에서 30분간 AlexaFluor 488 결합된 항-염소 IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) 상에서 분석하여 ModFit 소프트웨어(Verity Software House, Inc., Topsham, ME)로 분석하였다. 평균 형광 세기는 상대적 신호 세기값, 즉, 항-SYNGR4 항체로 처리된 세포/대조군 염소 IgG로 처리된 세포로서 측정하였다.
7. 면역조직화학법 및 조직 마이크로어레이.
본 발명에 있어서, 파라핀 블록에 넣은 임상 시료에서 상기 SYNGR4는 하기 방법으로 상기 섹션을 염색하였다. 간략하게, 내인적 퍼록시다제 및 단백질의 ㅂ블로킹 후에 NGR4에 대한 20 ㎍/㎖의 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 각 슬라이드에 첨가하였고, 상기 섹션을 이차 항체로서 HRP-표지된 항-염소 IgG [Histofine Simple Stain MAX PO (G), Nichirei, Tokyo, Japan]와 함께 배양하였다. 기질-크로모젠을 첨가하고, 상기 시료는 헤마톡실린으로 대비염색하였다. SYNGR4에 특이적인 항체를 확인하기 위한 항원 블로킹 분석을 하기와 같이 실시하였다. 면역조직화학적 염색 전에, 20 ㎍/㎖의 항-SYNGR4 항체(Catalog No.sc-34968; Santa Cruz Biotechnology)를 SYNGR4 항원 펩티드(Catalog No.sc-34968P; Santa Cruz Biotechnology)와 37℃에서 60분간 배양하였고 면역 혼합물을 제거하기 위하여 상기 반응 산물은 12,000×g에서 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층액은 추가적 분석을 위한 중성화된 항체로서 사용하였다. 항-SYNGR4 항체와 그것의 항원 펩티드의 반응 몰 비율은 1:8이었다.
종양 조직 마이크로어레이는 다른 곳에 기재된 바와 같이 포르말린-고정화된 339 일차 폐암으로 구성하였다(Chin SF et al., Mol Pathol 2003, 56: 275-9; Callagy G et al., Diagn Mol Pathol 2003, 12: 27-34; Callagy G et al., J Pathol 2005, 205: 388-96). 시료를 위한 상기 조직 부위는 슬라이드 상에서 상응하는 H&E-염색된 섹션과 시각적 정렬을 바탕으로 선택되었다. 공여자 종양 블록으로부터 채취한 3개, 4개, 또는 4개의 조직 중심부(직경, 0.6 ㎜; 깊이, 3~4 ㎜)를 조직 마이크로어레이(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)와 함께 수용자 파라핀 블록에 넣었다. 정상 조직의 중심부는 각 케이스로부터 수득하였고, 상기 결과의 마이크로어레이 블록의 5 ㎛ 섹션을 면역조직화학 분석을 위해 사용하였다. 3개의 독립된 조사자는 임상병리적인 데이터의 사전 지식 없이 반정량적으로 SYNGR4 양성을 분석하였다. SYNGR4 염색의 세기는 하기 기준을 사용하여 평가되었다: 강한 양성 (점수 2+), 종양 세포의 > 50%에서 갈색 염색이 세포질에서 거의 모호한; 약한 양성 (1+), 종양 세포 세포질에서 현저한 갈색 염색의 덜한 정도; 결핍 (점수 0), 종양 세포에서 현저한 발현이 없음. 케이스들은 검토자가 이와 같이 독립적으로 정의할 경우 오직 강한 양성으로서 받아들였다.
8. 통계적 분석.
StatView 통계적 프로그램(SAS, Cary, NC)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 종양 특이적 생존 곡선은 NSCLC와 관련된 사망 기간 또는 최후 추적 관찰에 대한 조사 데이터로부터 계산하였다. Kaplan-Meier 커브는 각 관련 변수 및 SYNGR4 발현을 위해 측정하였다; 환자 서브그룹 중에서 생존 시간에 차이는 로그 순위 검정을 사용하여 분석하였다. 임상병리적 변수 및 암 관련 사망 사이의 관계를 결정하기 위한 단변량 및 다변량 분석은 콕스 비례 위험 회귀 모델을 사용하여 수행하였다. 먼저, 사망과 나이, 성별, 병리학적 종양 분류, 및 병리학적 노드 분류를 포함하는, 다른 예후 인자 사이의 관련성을, 한 번에 하나의 인자를 고려하여, 분석하였다. 두 번째, 다변량 콕스 분석은 < 0.05의 P값의 초기 수준을 만족시키는 임의의 모든 변수와 함께, 상기 모델로 항상 강한 SYNGR4 발현을 유도하는 역방향(단계적) 과정에 적용되었다. 추가 인자에 이어 상기 모델로서, 독립적 인자는 P < 0.05의 출구 수준을 초과하지 않았다.
9. RNA 간섭 분석.
본 발명은, 포유동물 세포에서 작은 간섭 RNA(siRNAs)에 대해 설계된, 벡터 기반의 RNA 간섭 시스템, psiH1BX3.0을 구축하였다(Suzuki C et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41). 10 ㎍의 siRNA 발현 벡터를 30 ㎕의 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)을 사용하여 폐암 세포주 SBC-5 및 A549로 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포는 적절한 농도의 게네티신(G418) 존재하에서 7일간 배양하였고; 콜리니 수는 김사 염색에 의해 계수되었으며; 세포의 생존도는 처리 후 7일째에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석에 의해 평가되었다. 간략하게는, cell counting kit-8 solution (Dojindo)를 1/10 부피의 농도로 각 디쉬에 첨가하였고, 상기 플레이트를 37℃에서 추가적으로 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 참조에 따라 Microplate Reader 550 (Bio-Rad)을 사용하여, 490 ㎚, 및 630 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. SYNGR4 mRNA 발현의 저해를 확인하기 위하여, 하기 합성된 SYNGR4 특이적 프라이머를 사용하여 표준 과정에 따라 반정략적 RT-PCR 실험을 수행하였다. RNA 간섭을 위한 상기 합성 올리고뉴클레오티드의 표적 서열은 하기와 같다: 대조군 1 (EGFP: 향상된 녹색 형광 단백질 유전자(enhanced green fluorescent protein gene), 에쿼리아 빅토리아(Aequorea Victoria) 녹색 형광 단백질의 돌연변이체), 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(서열번호 9); 대조군 2 (luciferase/LUC: 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제 유전자), 5'-CGTACGCGGAATACTTCGA-3'(서열번호 10); siRNA-SYNGR4-#1, 5'-CAAGATGGAGTCTCCGCAG-3'(서열번호 11); siRNA-SYNGR4-#2, 5'-ATGATGCTCCAGTCCCTTA-3'(서열번호 12), siRNA-SYNGR4-#3, 5'-CGCAUUGCCGGCACCCGCU-3'(서열번호 19), siRNA-SYNGR4-#4, 5'-GCAUUGCCGGCACCCGCUU-3'(서열번호 20), siRNA-PAK1, 5'-CAAACAUUGUGAAUUACUU-3'(서열번호 21). 상기 siRNA 컨스트럭트의 상기 센스 서열은 3'에 TT를 추가하였다.
10. 세포 성장 분석.
SYNGR4를 발현하는 플라스미드 또는 목 플라스미드 중 어느 하나가 형질전환된 COS-7 세포를 6웰 플레이트 위에 분주하였고(5 × 104 세포수/웰), 10% FBS 및 0.4 ㎎/㎖ 게네티신이 포함된 배지에서 유지하였다. 72시간 후에 Cell Counting Kits (Wako, Osaka, Japan)를 사용한 MTT 분석에 의해 세포 증식을 평가하였다.
11. 마트리겔 침습 분석.
SYNGR4를 발현하는 플라스미드 또는 목 플라스미드 중 어느 하나가 형질전환된 COS-7 및 NIH3T3 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM에서 거의 합류될 때까지 성장하였다. 상기 세포를 트립신 처리에 의해 회수하여, 혈청 또는 프로테나제 억제제의 첨가 없이 DMEM으로 세척하였으며, 2×105/㎖로 DMEM에 현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 제조하기 전, 마트리겔 매트릭스 (Becton Dickinson Labware)의 건조된 측을 DMEM으로 2시간 동안 실온에서 재수화하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM (0.75 ㎖)을 24웰 마트리겔 침습 챔버의 각각의 아래 챔버에 첨가하였고, 0.5 ㎖(1×105/세포)의 세포 현탁액을 각각의 위 챔버의 인서트(insert)에 첨가하였다. 인서트의 플레이트는 22시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 상기 챔버는 처리되었다; 상기 마트리겔을 통해 침습된 세포를 고정화하였고 공급자(Becton Dickinson Labware)의 지시에 따라 김사 염색하였다.
12. SYNGR4의 상기 세포 침습 활성을 저해하는 항체 처리 분석.
SYNGR4를 내인적으로 또는 외인적으로 과발현하는 포유동물 세포의 상기 침습 활성에 대한 항-SYNGR4 항체의 억제 효과를 분석하기 위하여, 마트리겔 침습 분석을 항-SYNGR4 항체(Santa Cruz Biotechnology) 처리하에 실시하였다. SYNGR4를 발현하는 플라스미드 또는 목 플라스미드 중 어느 하나가 형질전환된 COS-7 세포, 또는 내인적인 SYNGR4를 발현하는 폐암 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM에서 거의 합류될 때까지 성장하였다. 상기 세포를 트립신 처리에 의해 회수하여, FBS의 첨가 없이 DMEM으로 세척하였으며, SYNGR4를 발현하는 COS-7, 목으로 형질전환된 COS-7, 또는 SYNGR4를 내인적으로 발현하는 폐암 세포에 대한 항-SYNGR4 항체 100 nM or 200 nM와 함께 1×105 세포/챔버의 개수로 마트리겔 챔버 내로 수득하였다. 또한 이러한 세포는 대조군 분석으로서 200 nM 이소타입 염소 IgG 또는 PBS로 처리하였다. 10% FBS가 포함된 아래 챔버 DMEM (0.75 ㎖)을 24웰 마트리겔 침습 챔버의 각각의 아래 챔버에 첨가하였고, 위 챔버와 같은 동일한 농도의 항-SYNGR4 항체, 이소타입 IgG, 또는 PBS를 아래 챔버에 첨가하였다. 인서트의 플레이트는 22시간 동안 37℃에서 배양하였고 배양 후에 상기 챔버는 처리되었다; 상기 마트리겔을 통해 침습된 세포를 고정화하였고 김사 염색였으며 침습된 세포의 수를 계수하였다.
13. 항체 및 시약.
항-SYNGR4 항체(Catalog No.sc-34968), 항-myc, 및 항-GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 항-포스포 ERK1/2(Anti-phospho ERK1/2) (Thr202/Tyr204), 항-ERK1/2, 항-포스포 MEK1/2(Ser217/221), 항-포스포 MEK1(Ser298), 항-MEK1/2, 항-포스포 c-Raf(Ser338), 항-c-Raf, 항-포스포 AKT(Thr308), 항-포스포 AKT(Ser473), 항-AKT, 항-GRB2, 항-PAK1, 및 항-포스포 PAK1/2(Thr423) 항체는 Cell signaling biotechnology로부터 구입하였다. 항-Flag M2 항체는 Sigma-Aldrich로부터 받았다. 항-포스포 트립신 항체는 Millipore에서 받았다. 유세포분석에 사용된 이소타입 염소 IgG는 R & D systems, Inc에서 받았다. Rac 및 Ras 활성 분석 키트는 Cell Biolabs, Inc에서 구입하였고, 분석은 제조자의 프로토콜에 따라 실시하였다.
14. 웨스턴 블랏 분석.
si-SYNGR4-#1 또는 si-EGFP549로 형질전환된 A549 및 SBC-3 세포, 및 SYNGR4-Y46F의 야생형 또는 돌연변이체를 발현하는 플라스미드, 또는 목 플라스미드 중 어느 하나로 형질전환된 COS-7 세포의 용해물을 웨스턴 블랏에 이용하였다. 간략하게는, 세포를 프로테아제 억제제(Protease Inhibitor Cocktail Set III; Calbiochem)의 존재하에서 1 ㎖의 용해 버퍼(0.5% NP-40, 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol NaCl)에서 배양하였다. 웨스턴 블랏은 이전에 게시된 바에 따라(Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25.), ECL 웨스턴-블랏팅 분석 시스템(GE Healthcare Bio-sciences)을 사용하여 수행하였다. SYNGR4의 MAPK 신호 활성화의 분석을 위하여, 각 MAPK 신호 단백질에 특이적인 항체(하기 참조)를 사용하였고, 염소 항-마우스 및 -토끼 IgG-HRP 항체(GE Healthcare Bio-sciences)를 이러한 실험을 위한 이차 항체로서 사용하였다.
15. 포스파타아제 분석.
SYNGR4를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 COS-7 세포를 용해 버퍼를 사용하여 용해하였고 1시간 동안 30℃에서 50 mmol/L Tris-HCL (pH 7.5), 0.1 mmol/L Na2-EDTA, 5 mmol/L dithiothreitol, 2 mmol/L MgCl2 및 0.01% Brij-35가 포함된 포스파타아제 버퍼에 5 유닛의 람다-포스파타아제(New England Biolabs)를 처리한 후, 하기 기재된 방법과 같이 웨스턴 블랏팅하였다.
16. 면역침전.
SYNGR4를 발현하는 플라스미드 또는 목 플라스미드 중 어느 하나가 형질전환된 COS-7 세포의 세포 용해물을 면역침전 및 웨스턴 블랏팅에 사용하였다. 간략하게는, 세포를 프로테아제 억제제(Protease Inhibitor Cocktail Set III; Calbiochem Darmstadt) 존재하에서 1 ㎖의 용해 버퍼(0.5% NP-40, 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol NaCl)에 배양하였다. 세포 추출물을 프로테아제 억제제 존재하에서 1 ㎖의 용해 버퍼의 최종 부피로, 30 ㎖ 단백질 G-아가로스 비드(Invitrogen)와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양함으로써 안전성을 미리 보증하였다. 면역침전 및 차후의 웨스턴 블랏팅을 외인적 SYNGR4 및 내인적 GRB2에 특이적인 항체(항-myc 항체 또는 항-Flag 항체) 또는 인산화된 티로신을 사용하여 실시하였다
실시예 2: 폐암 및 정상 조직에서 SYNGR4 발현
신규한 바이오마커 개발 및 암 세포의 생물학적 특성에 기초한 치료에 이용될 수 있는 신규한 분자를 확인하기 위하여, cDNA 마이크로어레이를 사용하여 101개의 폐 상피성암의 게놈-와이드 발현 프로파일 분석을 실시하였다(Kikuchi T et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205; Kakiuchi S et al., Mol cancer Res 2003, 1: 485-99; Kakiuchi S et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43; Kikuchi T et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805; Taniwaki M et al., Int J Oncol 2006, 29: 567- 75). 스크리닝된 32,256개의 유전자 중에서, 검사된 상기 폐암 시료의 다수에서 암 세포내 EBI3 전사체의 증가된 발현(5배 또는 그 이상)이 확인되었다. 15개의 폐암 조직 중 10개에서, 22개의 폐암 세포주에서 17개에서, 반정량적 RT-PCR 실험의 방법에 의해 그것의 과발현을 확인하였다(도. 1a). 본 발명자들은 폐암 세포에서 내인적 SYNGR4의 세포내 위치를 확인하기 위하여 면역형광 분석을 실시하였다. SYNGR4는 반정량적 RT-PCR 실험에 의해 SYNGR4 전사체가 검출된 LC319, NCI-H1373, 및 A549 세포에서 높은 수준으로 주로 세포질과 종양 세포의 표면상에서 검출되었으나, SYNGR4 유전자의 발현이 나타나지 않은, 기관지 상피 유래 BEAS-2B 및 SAEC 세포뿐만 아니라 NCI-H1781 세포에서는 검출되지 않았다(도. 1b). 또한 상기 결과는 SYNGR4 항체의 특이성을 나타냈다. SYNGR4는 4개의 막관통 도메인과 함께 세포 표면 단백질을 암호화하는 것으로 예상되었으나, SYNGR4의 N-말단 및 C-말단 모두 세포내 또는 세포외 부분에 상응하는지의 여부를 나타낸 보고는 없다. 따라서, 본 발명자들은 우선 Triton-X와 같은 세포 투과성 시약이 있거나 없이 면역세포화학 분석을 실시하였다. C-말단에 myc/His 태그를 갖고 SYNGR4 발현을 위해 설계된 플라스미드(pcDNA3.1-SYNGR4-myc/His) 및 N-말단에 3X Flag-태그를 갖는 것(pCAGGSn3F-SYNGR4)을 구성하였다. 그런 다음, 상기 플라스미드 또는 목 플라스미드를 COS-7 세포로 형질전환하였고 myc-태그된 SYNGR4를 검출하기 위한 항-myc 항체 및 Flag-태그된 SYNGR4를 검출하기 위한 항-Flag 항체를 사용하여 상기 세포를 염색하였다. Triton-X로 전처리된 상기 세포의 면역세포화학적 염색에 의해 세표 표면 상과 세포질 내에서 SYNGR4 단백질의 발현을 확인하였다. SYNGR4 단백질의 오직 세포 표면 염색이 Triton-X 처리 없이 관찰되었고(도. 1c, 왼쪽 위 패널), SYNGR4 단백질의 C-말단이 세포외 부분임을 나타낸다. 또한 SYNGR4는 N-말단-태그된 SYNGR4 발현 벡터로 형질전환된 COS-7 세포의 세포 표면상에서 염색되었다(데이터 제시 안함). 항-SYNGR4 항체가 SYNGR4의 C-말단을 인식하기 때문에, Triton-X 처리 없이 폐암 LC319 세포의 면역형광 분석을 수행하였고, 내인적 SYNGR4 단백질의 C-말단이 세포외적으로 위치함을 확인하였다(도. 1c, 왼쪽 아래 패널). SYNGR4의 C-말단 및 N-말단이 모두 세포외 부분임을 추가적으로 확인하기 위하여, 일차 항체 반응 후에 산 글리신으로 상기 세포를 처리함으로써 면역형광 분석을 실시하였다. 예상으로는, SYNGR4-양성 COS-7 세포 LC319 세포의 세포 표면상에서 SYNGR4 염색은 산 글리신 처리로 상기 항체를 떼어냄으로써 사라졌다(도. 1c, 오른쪽 패널). 또한 SYNGR4의 C-말단을 인식하는 동일한 항-SYNGR4 항체를 사용하여 유세포분석을 통해 SYNGR4-양성 및 -음성 폐암 세포의 표면상에서 SYNGR4 단백질의 수준을 측정하였고, SYNGR4의 C- 및 N-말단 모두 세포 표면상에서 검출되고, 막 SYNGR4 단백질의 수준이 반정량적 RT-PCR에 의해 검출된 SYNGR4 유전자의 발현 수준과 관련된다는 것을 확인하였다(도. 1d).
SYNGR4 cDNA 단편을 탐침으로서 사용한 노던 블랏 분석으로 오직 정소에서 1.2 kb의 전사체를 확인하였으나, 다른 모든 정상 조직에서는 확인되지 않았다(도. 2a). 또한 본 발명은 5개의 정상 조직(간, 심장, 신장, 폐, 및 정소) 및 폐암 조직(ADC, SCC, 및 SCLC) 상에서 SYNGR4에 특이적인 다클론 항체로 SYNGR4 단백질의 발현을 검사하였다. SYNGR4 염색은 주로 폐 종양 세포 및 정소의 세포질에서 관찰되었으나, 다른 4개의 정상 조직에서는 검출되지 않았다(도. 2b).
실시예 3: NSCLC 환자에 대한 나쁜 예후와 SYNGR4 발현의 관련성.
기관지 발암에 있어서 SYNGR4의 생물학적 또는 임상병리학적 중요성을 조사하기 위하여, 치료적 외과 절제를 받은 339개의 NSCLC 케이스로부터 조직 섹션을 포함하는 조직 마이크로어레이 상에서 면역조직화학 염색을 수행하였다. SYNGR4에 특이적인 다클론 항체로 검출된 SYNGR4 염색은 주로 종양 세포의 막과 세포질에서 관찰되었으나 정상 폐 세포에는 없었다(도. 2c, 왼쪽 패널). 본 발명은 결핍(점수 0) 내지 약한/강한 양성(점수 1+ 내지 2+) 범위의 조직 어레이 상에서 SYNGR4 발현 패턴을 분류하였다. 339개의 NSCLC 중, SYNGR4는 127개의(37.5%) 케이스에서 강하게 염색되었고(점수 2+), 157개의(46.3%) 케이스에서는 약하게 염색되었으며(점수 1+), 55개의(16.2%) 케이스에서는 염색되지 않았다(점수 0)(표 1A). 그런 다음, 다양한 임상병리학적 변수와 SYNGR4 발현(강한 양성과 약한 양성/결핍)의 관련성을 검사하였고 성별(남성에서 더욱 높음; Fisher'의 정확검정법에 의해 P = 0.0487), 조직학적 타입(비-ADC에서 더욱 높음; Fisher'의 정확검정법에 의해 P = 0.0116), 및 림프절 전이(pN1-2에서 더욱 높음; Fisher'의 정확검정법에 의해 P = 0.0175)와의 그것의 유의적인 관련성을 발견하였다(표 1A). NSCLC 환자의 중간값 생존기간은 더욱 높은 SYNGR4의 발현 수준에 따라 현저하게 더욱 낮다(P = 0.0002, 로그 순위 검정; 도. 2c, 오른쪽 패널). 또한 본 발명은 환자 예후와, 나이, 성별, 병리학적 종양 단계(종양 크기; T1과 T2-3), 병리학적 노드 단계(노드 상태; NO와 N1-2), 조직학(ADC와 다른 조직학적 타입), 및 SYNGR4 상태(점수 0, 1+와 점수 2+)를 포함하는, 몇 가지 인자 사이의 관련성을 평가하기 위하여 단변량 분석을 적용하였다. 모든 이러한 변수들은 나쁜 예후와 상당히 연관되었다. 콕스 비례 위험 모델을 사용한 다변량 분석은 다른 3개의 인자(나이, 종양 크기, 및 림프절 전이)뿐만 아니라 SYNGR4(P = 0.0078)가 외과적으로 치료된 NSCLC 환자에 대한 독립된 예후 인자인 것을 결정하였다(표 1B).
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 4: SYNGR4의 세포 성장 효과.
SYNGR4의 상향 조절이 폐암 세포의 성장 및/또는 생존에 중요한 역할을 하는지 분석하기 위하여, 2개의 다른 대조군 siRNA와 함께(EGFP 및 LUC에 대한 siRNAs), SYNGR4에 대한 siRNA에 의한 내인적 SYNGR4 발현의 억제를 평가하였다. 유효한 siRNA로 NSCLC 세포(A549)(왼쪽 패널) 및 SCLC 세포(SBC-5)(오른쪽 패널)의 처리는 SYNGR4 발현을 감소시키고(도. 3a), 그 결과 MTT 및 콜로니 형성 분석에 의해 측정된 세포 생존도 및 콜로니 수의 유의적인 억제가 나타났다(도. 3a). 종양형성에서 SYNGR4의 역할을 밝히기 위하여, SYNGR4 발현 플라스미드 또는 목 플라스미드를 COS-7 세포로 형질전환하였고 세포 성장에 대한 SYNGR4의 효과를 평가하였으며, SYNGR4를 외인적으로 과발현하는 COS-7 세포에서 유의적인 세포 증식을 관찰하였다(도. 3b). siRNA 분석의 결과에 따라, 상기 데이터는 SYNGR4가 상기 종양 성장 및/또는 생존에 요구된다는 결론과 일치한다.
실시예 5: SYNGR4에 의한 포유동물 세포 침습의 증진.
강한 SYNGR4 발현이 폐암 환자의 림프절 전이 및 더 나쁜 예후와 관련되어 있기 때문에, 포유동물 세포에서 세포 침습에 있어서 SYNGR4의 역할은 마트리겔 분석에 의해 검사되었다. SYNGR4 발현 벡터를 COS-7 또는 NIH3T3 세포로의 형질전환은, 목 벡터로 형질전환된 세포와 비교하여 마크리겔을 통한 그것의 침습을 현저히 향상시켰다(도. 4a).
실시예 6: 상기 세포 침습 활성에 대한 항-SYNGR4 항체의 억제 효과.
SYNGR4가 세포 표면에서 발현된다는 것을 발견하여, SYNGR4의 기능을 SYNGR4에 대한 항체를 사용하여 막았다. SYNGR4의 C-말단은 세포 표면의 외부인 것으로 보여, 이러한 병번이 항체 처리에 의해 표적화 되었다. 본 발명자들은 SYNGR4 발현 벡터 또는 목 벡터로 형질전환된 COS-7 세포를 SYNGR4 항체에 의한 SYNGR4 의존적 세포 침습의 억제의 평가를 위한 마트리겔 분석에 사용하였다. SYNGR4에 의해 유도된 침습 활성은 농도 의존적으로 항-SYNGR4 항체에 의해 현저히 차단되었다(도. 4b). 그런 다음 폐암 세포 침습에 대한 항-SYNGR4 항체의 기능적 차단 효과를 평가하였다. COS-7 세포의 상기 결과에 따라, 내인적으로 SYNGR4가 높게 발현되는, A549 세포의 세포 침습성은, 항-SYNGR4 항체에 의해 농도 의존적으로 효과적으로 차단되었고, 반면에 상기 항체는 SYNGR4 음성 NCI-H1781 세포의 세포 침습성은 막지 못하였다(도. 4c). 이러한 결과는 SYNGR4가 세포 침습에 요구되고 항체 기반의 면역요법을 위한 적합한 표적이라는 결론과 일치한다.
SYNGR4 상의 GRB2 SH2 도메인 결합 모티프를 통한 GRB2와 SYNGR4의 상호작용
나타낸 바와 같이, SYNGR4는 막 단백질이고 N- 및 C-말단은 세포 표면의 외부이다. 본 발명자들은 다음으로 SYNGR4의 세포-내부 부위에서 전사후 변형을 평가하였다. SYNGR4 패밀리 단백질이 강하게 인산화되기 때문에(Janz R et al. Neuron 1999;24:687-700., Janz R, J Biol Chem. 1998; 273: 2851-7.), 본 발명자들은 먼저 SYNGR4를 외인적으로 발현하는 COS-7 세포에 포스파타아제를 처리하였고 밴드가 상기 처리후에 다소 이동되었으므로, SYNGR4가 인산화되기 쉽다는 것을 발견하였다(도. 5a, 왼쪽 위 패널). 본 발명자들은 다음으로 항-인산화된 티로신을 사용하여 면역침전된 외인성 SYNGR4 발현 COS-7 세포 용해물의 면역블랏팅에 의해 SYNGR4 단백질의 인산화된 잔기를 확인하기 위한 시도를 하였고(도. 5a, 오른쪽 패널), SYNGR4에서 티로신 잔기가 인산화된다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 그 다음으로 SYNGR4 단백질의 세포내 서열에서 티로신 잔기에 초점을 맞추고, 세포내적으로 위치된 티로신-46을 발견하였다(도. 5a, 아래 패널). SYNGR4 티로신-46이 예상되는 콘센서스 GRB2 SH2 도메인 결합 모티프(pY-X-N)에 포함되었기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 SYNGR4가 다양한 단백질과 상호작용하는 다중기능성 어댑터 단백질인, GRB2와 상호작용하는 가능성을 평가하였다. 그들의 상호작용은 면역침전 실험에 의해 확인되었고(도. 5b), 이는 SYNGR4가 GRB2를 사용한 기능적 신호 경로와 연관될 것이라는 것을 나타낸다. SYNGR4에서 티로신-46이 인산화되고 GRB2-상호작용 잔기로서 기능하는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 페닐알라닌 치환된 돌연변이 SYNGR4를 생성하여 항-Flag 항체에 의해 수득된 야행성 또는 돌연변이체 SYNGR4 면역침전체를 사용하여 항-인산화된 티로신을 사용한 면역블랏팅을 수행하였다. 예상으로는, 블랏팅된 인산-티로신은 상당히 감소되었고(도. 5c, 왼쪽 패널), 티로신-46이 인산화되었음을 나타낸다. 다음에 동일한 면역침전체를 사용하여 GRB2의 면역블랏팅을 실시하였고 GRB2-결합 SYNGR4의 양은 야생형 SYNGR4와 비교하여 돌연변이 SYNGR4-Y46F에서 감소하는 것으로 나타났다(도. 5c, 왼쪽 패널). 이러한 데이터는 SYNGR4에서 티로신-46이 SYNGR4와 GRB2의 상호작용을 위한 중요한 잔기인 것을 나타낸다.
PAK1을 통한 MAPK 신호 경로의 신규한 조절자로서의 SYNGR4.
포유동물 세포로 SYNGR4의 도입이 세포 성장 및 침습의 증진을 나타내기 때문에, 본 발명자들은 세포 성장 및 침습과 관련된 SYNGR4 의존적 신호 분자를 검색하기 위한 시도를 하였다. GRB2는 SOS와 협력함으로써 Ras-MAPK 경로에 대해 세포 표면의 신호를 매개하는 중요한 분자로 알려져 있다(Downward J. FEBS Lett. 1994; 338: 113-7). Ras-MAPK 신호가 폐암 진행의 가장 원인이 되는 신호 중 하나로 여겨지기 때문에(Sebolt-Leopold JS, Nat Rev Cancer. 2004; 4; 937-47), 본 발명자들은 먼저 COS-7 세포에서 RAS-MAPK 신호 분자의 활성화에 대한 외인적 SYNGR4 발현의 효과를 평가하였다. 본 발명자들은 RAF1 재조합 단백질을 사용한 풀-다운 분석에 의해 활성화된 RAS의 수준의 증가를 발견하지 못하였으나(도. 7b), 흥미롭게도 c-Raf, MEK, 및 ERK 단백질의 인산화는 외인적으로 발현되는 SYNGR4에 의해 현저하게 증가되었다(도. 6a, 왼쪽 패널). 또한 폐암 세포주, A549 및 SBC-3 세포에서, SYNGR4에 대한 siRNA에 의해 내인적인 SYNGR4 발현의 녹킹 다운(knocking down)함으로써, 본 발명자들은 각 MAPK 신호 단백질의 인산화에 있어서의 뚜렷한 감소를 발견하였다(도. 6a, 오른쪽 패널). 이러한 데이터는 MAPK 신호가 SYNGR4의 표적이지만, RAS 활성화를 통한 것은 아니라는 것을 제시한다. 본 발명자들은 다음으로 GRB2에 대한 siRNA에 의해 COS-7 세포에서 내인적인 GRB2 단백질 녹킹 다움 분석을 수행하였고, 그 다음으로 SYNGR4의 도입을 수행하였다(도. 6b). 비록 si-GRB2에 의한 기준 인산화 상태의 현저한 감소가 확인되었으나, MAPK 신호 단백질의 인산화 상태를 siGRB2 처리된 세포에서 SYNGR4의 도입에 의해 변화되지 않음을 확인하였고, GRB2-SOS-RAS 신호 경로의 종결 때문일 것이다. 본 발명자들은 COS-7 세포 내 현저히 감소된 GRB2에 대한 결합 친화성을 갖는 돌연변이 SYNGR4-Y46F를 도입함으로써 추가적으로 GRB2와 SYNGR4의 관계를 분석하였다. 예상으로는, MAPK 신호 분자의 인산화 상태는 야생형 SYNGR4를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 것과 비교하여 돌연변이 SYNGR4-Y46F 발현 벡터로 형질전환한 세포에서 현저히 감소하였다(도. 6c). 이러한 데이터는 GRB2가 그것의 다운스트림 신호 분자로서의 기능을 위해 SYNGR4에 대한 독립적인 상호작용 단백질인 것을 나타낸다. 다음으로 본 발명자들은 MAPK 신호 분자에 영향을 미치는 RAS를 제외한 다fms분자에 대하여 검색하였다. MAPK 신호 분자에 인산화 부위 중에서, MEK1의 세린-298은 p21 단백질-활성화된 키나제(p21 protein-activated kinase, PAK)에 의해 특이적으로 인산화되는 부위로서 알려져 있고(Slack-Davis JK, et al. J Cell Biol. 2003; 162: 281-91., Park ER et al. Cell Signal. 2007; 19: 1488-96.), 본 발명자들은 SYNGR4의 발현에 따라 향상되는 MEK1 인산화의 세린-298의 수준을 발견하였다(도. 6a 및 6c). 따라서, PAK1-Thr423의 인산화 상태를 평가하였고, 이는 SYNGR4에 대한 siRNA에 의해 폐암 세포에서 그것의 키나제 활성에 독립적인 인산화 부위로서 알려져 있으며 PAK1 활성이 감소되는 것을 확인하였다(도. 6d). 다음으로 PAK1에 대한 siRNA에 의한 내인적 PAK1의 녹킹 다운은 COS-7 세포에서 외인적 SYNGR4에 의해 유도된 인산화의 향상을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도. 6e). 상기 결과는 SYNGR4가 GRB2-PAK1와 그 뒤의 MAPK 신호 활성화에 항암적 기능을 가할 수 있음을 제시한다. 아울러, 본 발명자들은 SYNGR4에 의해 유도된 성장 및 침습 활성의 향상이 SYNGR4에서 페닐알라닌에 대한 티로신-46의 치환에 의해 억제되는지를 평가하였다. 돌연변이 SYNGR-S46F를 외인적으로 발현하는 COS-7 세포는 야생형 SYNGR가 도입된 세포와 비교하여 성장 및 침습 활성을 향상시키는 활성의 손실을 나타냈다(도. 6f). 이러한 발견에 따라 SYNGR4, GRB2, PAK1과 관련된 대안적인 성장 및 침습 증진 경로가 제시될 수 있다(도. 6g).
토의
암 유전체학 및 분자 생화학의 지식의 최근 축적은 분자 표적 약제와 같으 암의 치료에 대한 새로운 전략을 소개한다(Daigo Y et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53). 분자 표적화된 약제는 그들의 잘 정의된 작용의 메커니즘 덕분에, 최소의 부작용을 갖고, 약성 세포에 매우 특이적일 것으로 예상된다. 이러한 분자를 탐색하기 위하여, 폐암 세포에 특이적으로 활성화되는 단백질을 확인하기 위한 강력한 스크리닝 시스템이 구축되었다. 상기 전략은 하기와 같다:(a) 레이저 현미해부와 결합되고, 32,256개 이상의 유전자가 포함된, 게놈-와이드 cDNA 마이크로어레이 분석을 통한 101개의 폐암 시료 상향 조절된 유전자의 확인(Daigo Y et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53; Kikuchi T et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205; Kakiuchi S et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99; Kakiuchi S et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43; Kikuchi T et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805; Taniwaki M et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75); (b) cDNA 마이크로어레이 분석 및 다중-조직 노던 블랏 분석에 의한 정상 기관에서 이러한 유전자의 매우 낮거나 결핍된 발현의 검사; (c) 수백개의 NSCLC 조직 시료로 구성된 조직 마이크로어레이를 사용한 그들의 과발현의 임상병리학적 중요성의 확인(Suzuki C et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41; Ishikawa N et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; Kato T et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; Furukawa C et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; Ishikawa N et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84; Suzuki C et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; Ishikawa N et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; Takahashi K et al., Cancer Res 2006, 66: 9 408-19; Hayama S et al., Cancer res 2006, 66: 10339-48; Kato T et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; Suzuki C et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; Yamabuki T et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Hayama S et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Kato T et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; Taniwaki M et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; Ishikawa N et al., 2007, 67: 11601-11; Mano T et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13); 및 (d) 폐암 세포의 생존 또는 성장에 그들이 필수적인지 siRNA에 의한 상기 표적화된 유전자의 검사(Suzuki C et al., 2003, 63: 7038-41; Ishikawa N et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; Kato T et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; Furukawa C et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; Suzuki C et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; Ishikawa N et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; Takahashi K et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19; Hayama S et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48; Kato T et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; Suzuki C et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; Yamabuki T et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Hayama S et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22; Kato T et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; Taniwaki M et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; Ishikawa N et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11; Mano Y et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13; kato T et a;., Clin Cancer Res 2008, 14:2263-70). 상기 분석을 통하여, 진단 마커, 치료제, 및/또는 면역요법의 개발을 위한 후보인 발암 유전자를 암호화하는 몇몇의 유전자를 확인하였다. 그들 중에서, 종양 특이적 막투과 또는 분비 단백질을 암호화하는 유전자는 그들이 상기 세포 표면 또는 세포외 공간에 존재하기 때문에 상당한 이점을 갖는 것으로 여겨진다. 본 발명은, 부분적으로, 상기 유전자 중 어느 하나인, 다중-관통 막투과 단백질을 암호화하는, SYNGR4의 발견에 기초하고, SYNGR4가 임상적 폐암 시료 및 세포주에서 주로 과발현되며, 이는 그것의 유전자 산물이 폐암 세포의 성장 및 침습에서 중요한 역할을 하는 것을 보여준다. SYNGR4는 19q-암(arm) 신경교종 종양 저해자 부위의 전사체 지도화에 의해 그것의 염색체 위치가 최초로 제시된 25kD 단백질이지만(Smith JS et al., Genomics 2000, 64: 44-50; Kedra D et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7), 발암에 있어서 그것의 연관성뿐만 아니라 그것의 생물학적 기능을 제시한 보고가 없다.
본 발명의 실시예에 있어서, 강한 SYNGR4 발현이 NSCLC 환자에 대한 더 나쁜 임상적 결과와 관련되어 있음을 확인하였다. 또한 siRNA에 의한 SYNGR4의 내인적 발현의 억제는 폐암 세포의 생존도의 뚜렷한 감소를 야기하였음을 확인하였다. SYNGR4의 외인적 발현은 포유동물 세포에 있어서 세포 성장 및 세포 이동/침습 활성을 향상시켰다. 또한, SYNGR4에서 Tyr46은 인산화되고 GRB2와의 결합에 중요하다는 것을 나타냈다. GRB2는 세포질 신호 경로에 대한 세포 표면의 자극을 전달하는 중요한 분자이고(Downward J. FEBS Lett. 1994; 338: 113-7.), 세포 성장 및 침습을 유도하는 다운스트림 신호 경로와 관련된 GRB2의 몇몇의 상호작용 분자가 있다. MAPK 신호가 암 세포 증식을 위한 결정적인 역할을 갖는 것으로 여겨지기 때문에(Sebolt-Leopold JS and Herrera R. Nat Rev Cancer. 2004; 4; 937-47.), 본 발명자들은 SYNGR4의 기능을 설명하기 위한 이러한 신호 경로에 초점을 맞췄다. 예상적으로는, MAPK 신호 분자의 활성은 SYNGR4의 발현에 의해 향상되었고, SYNGR4에 대한 siRNA에 의해 저해되었다.
MEK1에서 PAK1 키나제에 의한 특이적 인산화 부위로서 알려져 있는, 세린-298의 인산화 수준은 (Slack-Davis JK, et al. J Cell Biol. 2003; 162: 281-91., 53), SYNGR4 발현에 따라 증가 되는 감소되었다. 더불어, PAK1에 의해 인산화되고 RAS에 따라 c-RAF 활성을 향상시키는 것으로 알려진, c-RAF에서 세린 338은(Chaudhary A, et al. Curr Biol 2000; 10: 551-4.), 또한 SYNGR4 발현에 따라 그것의 인산화 상태가 변화된다. 도 다른 증가는 GRB2가 PAK1과 직접 상호작용하여 활성화하는 것을 나타낸다(Puto LA, et al. J Biol Chem. 2003; 278: 9388-93.). 따라서 본 발명자들은 SYNGR4가 PAK1을 통해 MAPK 신호 경로를 양성적으로 조절할 것이라는 가설을 세웠다. 일관적으로, PAK1에 대한 siRNA에 의한 PAK1의 녹킹 다운은 각 단백질 내 인산화의 전체 제거 없이 MAPK 신호 단백질의 인산화의 향상에 대하여 SYNGR4의 효과를 감소시키는 것으로 나타났고, 이는 c-RAF 및 MEK1의 PAK1 매개된 조절이 표준 성장 인자의 극대화 및 MAPK 신호 경로의 RAS-매개된 조절에 중요할 수 있다는 사실과 일치한다(Beeser A, et al. J Biol Chem. 2005; 280: 36609-15.). 또한, PAK1는 Rac/Cdc42 GTPases의 반응기 중 하나이고 그것의 활성은 세포 침습, 세포골격 역할 및 세포 운동성과 매우 관련되어 있다(Kumar R, et al. Nat Rev Cancer. 2006; 6: 459-71.).
d 형태 및 Y46F SYNGR4 도입된 COS-7 세포 및 감소된 활성은 SYNGR4에 대한 siRNA 처리된 폐암 세포에서 발현되었다. 이러한 데이터는 SYNGR4가 GRB2-PAK1 경로를 통한 세포 침습을 증진한다는 우리의 가설을 뒷받침한다.
비록 폐의 발암에 있어서 SYNGR4의 상기 상세한 기능은 여전히 분석하에 있으나, 우리의 결과는 SYNGR4 발현이 세포 증식/생존 및 전이를 자극함으로써 폐 종양의 진행을 증진한다는 결론과 일치한다.
SYNGR4가 정상 조직 중 오직 정소에서만 발현되고 막 단백질이 항체 기반 치료에 대한 적합한 표적이 될 것으로 여겨지기 때문에, SYNGR4-양성 세포에서 SYNGR4 의존적 침습 활성을 막는 항-SYNGR4 항체의 효능이 검사되었고, 세포 침습은 항-SYNGR4 항체에 의해 현저하게 저해되었음을 확인하였다. 이러한 발견은 폐암 치료에 대한 항-SYNGR4 항체의 사용을 뒷받침한다.
본 발명은 SYNGR4 암-정소 항원이 주로 폐암에서 발현되고 이러한 질환에 대한 예측 바이오마커인 것을 나타낸다. 절제된 시료에서의 SYNGR4 과발현은 나쁜 예후를 나타내기 쉬운 상기 폐암 환자에 대한 아쥬반트 치료의 이용을 위한 유용한 지표가 될 수 있다. 게다가, SYNGR4는 폐암에 대한 분자 표적화된 약제 및 항체 기반의 면역요법과 같은, NSCLC의 공격적 특성에 필수적인 공헌자 및 신규한 치료적 접근법의 개발을 위한 표적이 될 것이다.
산업상 이용가능성
본 발명에 나타낸 바와 같이, 세포 성장은 상기 SYNGR4 유전자를 특이적으로 표적하는 이중 가닥 분자에 의해 저해된다. 따라서, 상기 신규한 이중 가닥 분자는 항암 약제의 개발을 위한 유용한 후보이다. 예를 들면, SYNGR4 단백질의 발현 차단 및/또는 그것의 활성을 방지하는 약제는 항암제, 구체적으로는 폐암의 치료용 항암제, 더욱 구체적으로는 NSCLC 및 SCLC의 치료용으로서 치료적 유용성을 확인할 수 있다.
인간 유전자 SYNGR4의 발현은 정상 기관과 비교하여, 폐암에서 현저하게 증가된다. 따라서, 상기 유전자는 폐암의 진단 마커로서 편리하게 사용될 수 있고 따라서 암화화되는 상기 단백질은 폐암의 진단 분석에서의 유용성을 확인하였다.
게다가, 또한 본 발명에 기재된 상기 방법은 하기 질환에 걸린 환자의 나쁜 예후의 예측뿐만 아니라, 소세포성폐암(small-cell lung carcinomas, SCLCs) 및 비소세포폐암(non-small cell lung cancers, NSCLCs)을 포함하는, 폐암의 진단에 유용하다. 또한, 본 발명은 폐암을 포함하는 암에 대한 치료적 접근법의 개발을 위한 후보를 제공한다. 아울러, SYNGR4 폴리펩티드는 항암 약제의 개발을 위한 유용한 표적이다. 예를 들면, SYNGR4에 결합하거나 SYNGR4의 발현을 차단하거나 또는 그것의 활성을 억제하는 약제는 항암제, 특히 폐암 치료용 항암제로서 치료적 유용성을 확인할 수 있다.
본 발명에서 언급된 모든 공개, 데이터베이스, 서열, 특허, 및 특허 출원은 참조로서 이에 삽입된다.
본 발명은 상세하게 설명하고 이의 구체적인 실시예에 관련된 한편, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 사상 및 범위, 첨가된 청구항에 의해 설정된 것의 한계 및 한도로부터 분리되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> SYNGR4 for Target Genes of Cancer Therapy and Diagnosis <130> 11fpi-02-04 <150> US 61/190,358 <151> 2008-08-27 <150> PCT/JP2009/004059 <151> 2009-08-24 <160> 45 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 'An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 1 caacagccct gtgaacatgc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 2 acccttctgg agggaggatt c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 3 gaggtgatag cattgctttc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 4 caagtcagtg tacaggtaag c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for northern blot probe <400> 5 cggctaccag aacaagatgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for northern blot probe <400> 6 gaagcgcttg taagggactg 20 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 7 ggaattccag accgtgcatc atgcacatcc ccaaaagcct ccag 44 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized primer for PCR <400> 8 ccgctcgagc gggttgtcag gcatcatagc aagc 34 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 9 gaagcagcac gacttcttc 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 10 cgtacgcgga atacttcga 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 11 caagatggag tctccgcag 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 12 atgatgctcc agtccctta 19 <210> 13 <211> 1009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggcgaaagga agggcgggcc ctcaggtgac gcagattggc cctccagaga aggggcggcc 60 ccttctcagg tgccgtcacc cccaaacctc agcactgcca ttccaggtcc ttaaagggga 120 gaccgcgatt ctaagaagca gccaagccca gggctggcct gaagcccccg gacggcagtg 180 cccagcaggc agcgcccagc accctggctc ccacctccca gtggccccaa aggaaaacag 240 ctgccatgca catccccaaa agcctccagg agctggccaa cagcgaagcc gtgcagtttc 300 tgagaaggcc caagaccatc acgcgggtct tcgaaggggt cttctccctg atcgtcttct 360 cctccctgct gaccgacggc taccagaaca agatggagtc tccgcagctc cactgcattc 420 tcaacagcaa cagcgtggcc tgcagctttg ccgtgggagc cggcttcctg gccttcctca 480 gctgcctggc cttcctcgtc ctggacacac aggagacccg cattgccggc acccgcttca 540 agacagcctt ccagctcctg gacttcatcc tggctgttct ctgggcagtt gtctggttca 600 tgggtttctg cttcctggcc aaccaatggc agcattcgcc gcccaaagag ttcctcctgg 660 ggagcagcag tgcccaggca gccatcgcct tcaccttctt ctccatcctt gtctggatat 720 tccaggccta cctggcattc caggacctcc gaaatgatgc tccagtccct tacaagcgct 780 tcctggatga gggtggcatg gtgctgacca ccctcccctt gccctctgcc aacagccctg 840 tgaacatgcc caccactggc cccaacagcc tgagttatgc tagctctgcc ctgtccccct 900 gtctgaccgc tccaaagtcc ccccggcttg ctatgatgcc tgacaactaa atatccttat 960 ccaaatcaat aaagagagaa tcctccctcc agaagggttt ctaaaaaca 1009 <210> 14 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met His Ile Pro Lys Ser Leu Gln Glu Leu Ala Asn Ser Glu Ala Val 1 5 10 15 Gln Phe Leu Arg Arg Pro Lys Thr Ile Thr Arg Val Phe Glu Gly Val 20 25 30 Phe Ser Leu Ile Val Phe Ser Ser Leu Leu Thr Asp Gly Tyr Gln Asn 35 40 45 Lys Met Glu Ser Pro Gln Leu His Cys Ile Leu Asn Ser Asn Ser Val 50 55 60 Ala Cys Ser Phe Ala Val Gly Ala Gly Phe Leu Ala Phe Leu Ser Cys 65 70 75 80 Leu Ala Phe Leu Val Leu Asp Thr Gln Glu Thr Arg Ile Ala Gly Thr 85 90 95 Arg Phe Lys Thr Ala Phe Gln Leu Leu Asp Phe Ile Leu Ala Val Leu 100 105 110 Trp Ala Val Val Trp Phe Met 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gggagcaagc gctgccctcg cagagcagcc ttggggtcgc cggccgctcg cagcgttgtg 180 gaggggcggg ccggacgctg agcggagcag ctgcgccacg ggtggcattg tgtgtcccag 240 agtgccggag cgagtcccag aagagaggcg aggctaagcc cagagcgctg ggttgcttca 300 gcagggaaga ctcccttccc cctgcttcag gctgctgagc actgagcagc gctcagaatg 360 gaagccatcg ccaaatatga cttcaaagct actgcagacg acgagctgag cttcaaaagg 420 ggggacatcc tcaaggtttt gaacgaagaa tgtgatcaga actggtacaa ggcagagctt 480 aatggaaaag acggcttcat tcccaagaac tacatagaaa tgaaaccaca tccgtggttt 540 tttggcaaaa tccccagagc caaggcagaa gaaatgctta gcaaacagcg gcacgatggg 600 gcctttctta tccgagagag tgagagcgct cctggggact tctccctctc tgtcaagttt 660 ggaaacgatg tgcagcactt caaggtgctc cgagatggag ccgggaagta cttcctctgg 720 gtggtgaagt tcaattcttt gaatgagctg gtggattatc acagatctac atctgtctcc 780 agaaaccagc agatattcct gcgggacata gaacaggtgc cacagcagcc gacatacgtc 840 caggccctct ttgactttga tccccaggag gatggagagc tgggcttccg ccggggagat 900 tttatccatg tcatggataa ctcagacccc aactggtgga aaggagcttg ccacgggcag 960 accggcatgt ttccccgcaa ttatgtcacc cccgtgaacc ggaacgtcta agagtcaaga 1020 agcaattatt taaagaaagt gaaaaatgta aaacacatac aaaagaatta aacccacaag 1080 ctgcctctga cagcagcctg tgagggagtg cagaacacct ggccgggtca ccctgtgacc 1140 ctctcacttt ggttggaact ttagggggtg ggagggggcg ttggatttaa aaatgccaaa 1200 acttacctat aaattaagaa gagtttttat tacaaatttt cactgctgct cctctttccc 1260 ctcctttgtc ttttttttca tccttttttc tcttctgtcc atcagtgcat gacgtttaag 1320 gccacgtata gtcctagctg acgccaataa taaaaaacaa gaaaccaagt gggctggtat 1380 tctctctatg caaaatgtct gttttagttg gaatgactga aagaagaaca gctgttcctg 1440 tgttcttcgt atatacacac aaaaaggagc gggcagggcc gctcgatgcc tttgctgttt 1500 agcttcctcc agaggagggg acttgtagga atctgccttc cagcccagac ccccagtgta 1560 ttttgtccaa gttcacagta gagtagggta gaaggaaagc atgtctctgc ttccatggct 1620 tcctgagaaa gcccacctgg gctgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg 1680 ggaggccaag gtgggcggat cacaaggtca ggagttcgag accaacctag ccaacatggt 1740 gaaaccccgt ctctactaaa aataagaaat tagccgggtg tggcacgcac ctgtagtccc 1800 agctacttgg gagcctgagg caggagaatc gcttgaacct gggaagtgga ggttgagtga 1860 gccgggaccg tgccattgta ctccagcctg ggtgacagag cgagattccg tctcaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa agcccacctg aaagcctgtc tctttccact ttgttggccc ttccagtggg 1980 attatcgagc atgttgtttt ttcatagtgc ctttttcctt atttcaaggg ttgcttctga 2040 gtggtgtttt tttttttttt ttaatttgtt ttgttttaaa ataagttaaa ggcagtccag 2100 agcttttcag ccaatttgtc tcctactctg tgtaaatatt tttccctccg ggcaggggag 2160 ccagggtaga gcaaaggaga caaagcagga gtggaaggtg aggcgttctc ctgcttgtac 2220 taagccagga ggctttaagc tccagcttta agggttgtga gccccttggg ggttcaggga 2280 actgcttgcc cagggtgcag tgtgagtgtg atgggccacc ggggcaagag ggaaggtgac 2340 cgcccagctc tcccacatcc cactggatct ggcttacagg ggggtcggaa gcctgtcctc 2400 accgtctcgg gggttgtggc ccccgccccc tccctatatg cacccctgga accagcaagt 2460 cccagacaag gagagcggag gaggaagtca tgggaacgca gcctccagtt gtagcaggtt 2520 tcactattcc tatgctgggg tacacagtga gagtactcac ttttcacttg tcttgctctt 2580 agattgggcc atggctttca tcctgtgtcc cctgacctgt ccaggtgagt gtgagggcag 2640 cactgggaag ctggagtgct gcttgtgcct cccttcccag tgggctgtgt tgactgctgc 2700 tccccacccc taccgatggt cccaggaagc agggagagtt ggggaaggca agattggaaa 2760 gacaggaaga ccaaggcctc ggcagaactc tctgtcttct ctccacttct ggtcccctgt 2820 ggtgatgtgc ctgtaatctt tttctccacc caaacccctt cccacgacaa aaacaagact 2880 gcctccctct cttccgggag ctggtgacag ccttgggcct ttcagtccca aagcggccga 2940 tgggagtctc cctccgactc cagatatgaa cagggcccag gcctggagcg tttgctgtgc 3000 caggaggcgg cagctcttct gggcagagcc tgtccccgcc ttccctcact cttcctcatc 3060 ctgcttctct tttcctcgca gatgataaaa ggaatctggc attctacacc tggaccattt 3120 gattgtttta ttttggaatt ggtgtatatc atgaagcctt gctgaactaa gttttgtgtg 3180 tatatattta aaaaaaaaat cagtgtttaa ataaagacct atgtacttaa tcctttaact 3240 ctgcggatag catttggtag gtagtgatta actgtgaata ataaatacac aatgaattct 3300 tca 3303 <210> 23 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Glu Ala Ile Ala Lys Tyr Asp Phe Lys Ala Thr Ala Asp Asp Glu 1 5 10 15 Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asp Ile Leu Lys Val Leu Asn Glu Glu Cys 20 25 30 Asp Gln Asn Trp 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aaaatgtaaa acacatacaa aagaattaaa cccacaagct 960 gcctctgaca gcagcctgtg agggagtgca gaacacctgg ccgggtcacc ctgtgaccct 1020 ctcactttgg ttggaacttt agggggtggg agggggcgtt ggatttaaaa atgccaaaac 1080 ttacctataa attaagaaga gtttttatta caaattttca ctgctgctcc tctttcccct 1140 cctttgtctt ttttttcatc cttttttctc ttctgtccat cagtgcatga cgtttaaggc 1200 cacgtatagt cctagctgac gccaataata aaaaacaaga aaccaagtgg gctggtattc 1260 tctctatgca aaatgtctgt tttagttgga atgactgaaa gaagaacagc tgttcctgtg 1320 ttcttcgtat atacacacaa aaaggagcgg gcagggccgc tcgatgcctt tgctgtttag 1380 cttcctccag aggaggggac ttgtaggaat ctgccttcca gcccagaccc ccagtgtatt 1440 ttgtccaagt tcacagtaga gtagggtaga aggaaagcat gtctctgctt ccatggcttc 1500 ctgagaaagc ccacctgggc tgggcgcggt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg 1560 aggccaaggt gggcggatca caaggtcagg agttcgagac caacctagcc aacatggtga 1620 aaccccgtct ctactaaaaa taagaaatta gccgggtgtg gcacgcacct gtagtcccag 1680 ctacttggga gcctgaggca ggagaatcgc ttgaacctgg gaagtggagg ttgagtgagc 1740 cgggaccgtg ccattgtact ccagcctggg tgacagagcg agattccgtc tcaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaag cccacctgaa agcctgtctc tttccacttt gttggccctt ccagtgggat 1860 tatcgagcat gttgtttttt catagtgcct ttttccttat ttcaagggtt gcttctgagt 1920 ggtgtttttt tttttttttt aatttgtttt gttttaaaat aagttaaagg cagtccagag 1980 cttttcagcc aatttgtctc ctactctgtg taaatatttt tccctccggg caggggagcc 2040 agggtagagc aaaggagaca aagcaggagt ggaaggtgag gcgttctcct gcttgtacta 2100 agccaggagg ctttaagctc cagctttaag ggttgtgagc cccttggggg ttcagggaac 2160 tgcttgccca gggtgcagtg tgagtgtgat gggccaccgg ggcaagaggg aaggtgaccg 2220 cccagctctc ccacatccca ctggatctgg cttacagggg ggtcggaagc ctgtcctcac 2280 cgtctcgggg gttgtggccc ccgccccctc cctatatgca cccctggaac cagcaagtcc 2340 cagacaagga gagcggagga ggaagtcatg ggaacgcagc ctccagttgt agcaggtttc 2400 actattccta tgctggggta cacagtgaga gtactcactt ttcacttgtc ttgctcttag 2460 attgggccat ggctttcatc ctgtgtcccc tgacctgtcc aggtgagtgt gagggcagca 2520 ctgggaagct ggagtgctgc ttgtgcctcc cttcccagtg ggctgtgttg actgctgctc 2580 cccaccccta ccgatggtcc caggaagcag ggagagttgg ggaaggcaag attggaaaga 2640 caggaagacc aaggcctcgg cagaactctc tgtcttctct ccacttctgg tcccctgtgg 2700 tgatgtgcct gtaatctttt tctccaccca aaccccttcc cacgacaaaa acaagactgc 2760 ctccctctct tccgggagct ggtgacagcc ttgggccttt cagtcccaaa gcggccgatg 2820 ggagtctccc tccgactcca gatatgaaca gggcccaggc ctggagcgtt tgctgtgcca 2880 ggaggcggca gctcttctgg gcagagcctg tccccgcctt ccctcactct tcctcatcct 2940 gcttctcttt tcctcgcaga tgataaaagg aatctggcat tctacacctg gaccatttga 3000 ttgttttatt ttggaattgg tgtatatcat gaagccttgc tgaactaagt tttgtgtgta 3060 tatatttaaa aaaaaaatca gtgtttaaat aaagacctat gtacttaatc ctttaactct 3120 gcggatagca tttggtaggt agtgattaac tgtgaataat aaatacacaa tgaattcttc 3180 a 3181 <210> 25 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Glu Ala Ile Ala Lys Tyr Asp Phe Lys Ala Thr Ala Asp Asp Glu 1 5 10 15 Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asp Ile Leu Lys Val Leu Asn Glu Glu Cys 20 25 30 Asp Gln Asn Trp Tyr Lys Ala Glu Leu Asn Gly Lys Asp Gly Phe Ile 35 40 45 Pro Lys Asn Tyr Ile Glu Met 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ctccctcccg cccccccatc atcccttccc tcgcagttcc cctgtcctga 360 ggggagcccc gccacgggca gcgcggcggc ggcggcagga gggagaaagt gaagcggtag 420 ctcgcgcaca ctcgcgccct cactcccggc taggcggcac ccaccgccgg gaggaggagg 480 aggagccgag aggagctgag cgagcgcgga agtagctgct gctggtggtg acaatgtcaa 540 ataacggcct agacattcaa gacaaacccc cagcccctcc gatgagaaat accagcacta 600 tgattggagc cggcagcaaa gatgctggaa ccctaaacca tggttctaaa cctctgcctc 660 caaacccaga ggagaagaaa aagaaggacc gattttaccg atccatttta cctggagata 720 aaacaaataa aaagaaagag aaagagcggc cagagatttc tctcccttca gattttgaac 780 acacaattca tgtcggtttt gatgctgtca caggggagtt tacgggaatg ccagagcagt 840 gggcccgctt gcttcagaca tcaaatatca ctaagtcgga gcagaagaaa aacccgcagg 900 ctgttctgga tgtgttggag ttttacaact cgaagaagac atccaacagc cagaaataca 960 tgagctttac agataagtca gctgaggatt acaattcttc taatgccttg aatgtgaagg 1020 ctgtgtctga gactcctgca gtgccaccag tttcagaaga tgaggatgat gatgatgatg 1080 atgctacccc accaccagtg attgctccac gcccagagca cacaaaatct gtatacacac 1140 ggtctgtgat tgaaccactt cctgtcactc caactcggga cgtggctaca tctcccattt 1200 cacctactga aaataacacc actccaccag atgctttgac ccggaatact gagaagcaga 1260 agaagaagcc taaaatgtct gatgaggaga tcttggagaa attacgaagc atagtgagtg 1320 tgggcgatcc taagaagaaa tatacacggt ttgagaagat tggacaaggt gcttcaggca 1380 ccgtgtacac agcaatggat gtggccacag gacaggaggt ggccattaag cagatgaatc 1440 ttcagcagca gcccaagaaa gagctgatta ttaatgagat cctggtcatg agggaaaaca 1500 agaacccaaa cattgtgaat tacttggaca gttacctcgt gggagatgag ctgtgggttg 1560 ttatggaata cttggctgga ggctccttga cagatgtggt gacagaaact tgcatggatg 1620 aaggccaaat tgcagctgtg tgccgtgagt gtctgcaggc tctggagttc ttgcattcga 1680 accaggtcat tcacagagac atcaagagtg acaatattct gttgggaatg gatggctctg 1740 tcaagctaac tgactttgga ttctgtgcac agataacccc agagcagagc aaacggagca 1800 ccatggtagg aaccccatac tggatggcac cagaggttgt gacacgaaag gcctatgggc 1860 ccaaggttga catctggtcc ctgggcatca tggccatcga aatgattgaa ggggagcctc 1920 catacctcaa tgaaaaccct ctgagagcct tgtacctcat tgccaccaat gggaccccag 1980 aacttcagaa cccagagaag 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catacggaat 1380 ggacagccga cctcccatgg caatttttga gttgttggat tacatagtca acgagcctcc 1440 tccaaaactg cccagtggag tgttcagtct ggaatttcaa gattttgtga ataaatgctt 1500 aataaaaaac cccgcagaga gagcagattt gaagcaactc atggttcatg cttttatcaa 1560 gagatctgat gctgaggaag tggattttgc aggttggctc tgctccacca tcggccttaa 1620 ccagcccagc acaccaaccc atgctgctgg cgtctaagtg tttgggaagc aacaaagagc 1680 gagtcccctg cccggtggtt tgccatgtcg cttttgggcc tccttcccat gcctgtctct 1740 gttcagatgt gcatttcacc tgtgacaaag gatgaagaac acagcatgtg ccaagattct 1800 actcttgtca tttttaatat tactgtcttt attcttatta ctattattgt tcccctaagt 1860 ggattggctt tgtgcttggg gctatttgtg tgtatgctga tgatcaaaac ctgtgccagg 1920 ctgaattaca gtgaaatttt ggtgaatgtg ggtagtcatt cttacaattg cactgctgtt 1980 cctgctccat gactggctgt ctgcctgtat tttcgggatt ctttgacatt tggtggtact 2040 ttattcttgc tgggcatact ttctctctag gagggagcct tgtgagatcc ttcacaggca 2100 gtgcatgtga agcatgcttt gctgctatga aaatgagcat cagagagtgt acatcatgtt 2160 attttattat tattatttgc ttttcatgta gaactcagca gttgacatcc 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catctctgca 1260 ccctggggcc tggacctgcc tcctgcctgc ccctctcccg ccagactgtt agaaaatgga 1320 cactgtgccc agcccggacc ttggcagccc aggccggggt ggagcatggg cctggccacc 1380 tctctccttt gctgaggcct ccagcttcag gcaggccaag gccttctcct ccccacccgc 1440 cctccccacg gggcctcggg acctcaggtg gccccagttc aatctcccgc tgctgctgct 1500 gcgcccttac cttccccagc gtcccagtct ctggcagttc tggaatggaa gggttctggc 1560 tgccccaacc tgctgaaggg cagaggtgga gggtgggggg cgctgagtag ggactcaggg 1620 ccatgcctgc ccccctcatc tcattcaaac cccaccctag tttccctgaa ggaacattcc 1680 ttagtctcaa gggctagcat ccctgaggag ccaggccggg ccgaatcccc tccctgtcaa 1740 agctgtcact tcgcgtgccc tcgctgcttc tgtgtgtggt gagcagaagt ggagctgggg 1800 ggcgtggaga gcccggcgcc cctgccacct ccctgacccg tctaatatat aaatatagag 1860 atgtgtctat ggctgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1902 <210> 37 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe 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cctacctgga 960 gcagtactat gacccgacgg atgagccagt ggccgaggag cccttcacct tcgccatgga 1020 gctggatgac ctacctaagg agcggctgaa ggagctcatc ttccaggaga cagcacgctt 1080 ccagcccgga gtgctggagg ccccctagcc cagacagaca tctctgcacc ctggggcctg 1140 gacctgcctc ctgcctgccc ctctcccgcc agactgttag aaaatggaca ctgtgcccag 1200 cccggacctt ggcagcccag gccggggtgg agcatgggcc tggccacctc tctcctttgc 1260 tgaggcctcc agcttcaggc aggccaaggc cttctcctcc ccacccgccc tccccacggg 1320 gcctcgggac ctcaggtggc cccagttcaa tctcccgctg ctgctgctgc gcccttacct 1380 tccccagcgt cccagtctct ggcagttctg gaatggaagg gttctggctg ccccaacctg 1440 ctgaagggca gaggtggagg gtggggggcg ctgagtaggg actcagggcc atgcctgccc 1500 ccctcatctc attcaaaccc caccctagtt tccctgaagg aacattcctt agtctcaagg 1560 gctagcatcc ctgaggagcc aggccgggcc gaatcccctc cctgtcaaag ctgtcacttc 1620 gcgtgccctc gctgcttctg tgtgtggtga gcagaagtgg agctgggggg cgtggagagc 1680 ccggcgcccc tgccacctcc ctgacccgtc taatatataa atatagagat gtgtctatgg 1740 ctgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1770 <210> 41 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile 35 40 45 Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg 50 55 60 Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg 85 90 95 His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp 115 120 125 Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 145 150 155 160 Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr 165 170 175 Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 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ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300 gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360 tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420 caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480 gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540 gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600 ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660 cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720 tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780 acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840 aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900 atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaccacatt 960 ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct 1020 aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca 1080 aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140 aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt 1200 gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag 1260 gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct 1320 taaatttgtc aggacaaggg ctcagaggac tggacgtgct cagacatcgg tgttcttctt 1380 cccagttctt gacccctggt cctgtctcca gcccgtcttg gcttatccac tttgactcct 1440 ttgagccgtt tggaggggcg gtttctggta gttgtggctt ttatgctttc aaagaatttc 1500 ttcagtccag agaattcctc ctggcagccc tgtgtgtgtc acccattggt gacctgcggc 1560 agtatgtact tcagtgcacc tactgcttac tgttgcttta gtcactaatt gctttctggt 1620 ttgaaagatg cagtggttcc tccctctcct gaatcctttt ctacatgatg ccctgctgac 1680 catgcagccg caccagagag agattcttcc ccaattggct ctagtcactg gcatctcact 1740 ttatgatagg gaaggctact acctagggca ctttaagtca gtgacagccc cttatttgca 1800 cttcaccttt tgaccataac tgtttcccca gagcaggagc ttgtggaaat accttggctg 1860 atgttgcagc ctgcagcaag tgcttccgtc tccggaatcc ttggggagca cttgtccacg 1920 tcttttctca tatcatggta gtcactaaca tatataaggt atgtgctatt ggcccagctt 1980 ttagaaaatg cagtcatttt tctaaataaa aaggaagtac tgcacccagc agtgtcactc 2040 tgtagttact gtggtcactt gtaccatata gaggtgtaac acttgtcaag aagcgttatg 2100 tgcagtactt aatgtttgta agacttacaa aaaaagattt aaagtggcag cttcactcga 2160 catttggtga gagaagtaca aaggttgcag tgctgagctg tgggcggttt ctggggatgt 2220 cccagggtgg aactccacat gctggtgcat atacgccctt gagctacttc aaatgtgggt 2280 gtttcagtaa ccacgttcca tgcctgagga tttagcagag aggaacactg cgtctttaaa 2340 tgagaaagta tacaattctt tttccttcta cagcatgtca gcatctcaag ttcatttttc 2400 aacctacagt ataacaattt gtaataaagc ctccaggagc tcatgacgtg aagcactgtt 2460 ctgtcctcaa gtactcaaat atttctgata ctgctgagtc agactgtcag aaaaagctag 2520 cactaactcg tgtttggagc tctatccata ttttactgat ctctttaagt atttgttcct 2580 gccactgtgt actgtggagt tgactcggtg ttctgtccca gtgcggtgcc tcctcttgac 2640 ttccccactg ctctctgtgg tgagaaattt gccttgttca ataattactg taccctcgca 2700 tgactgttac agctttctgt gcagagatga ctgtccaagt gccacatgcc tacgattgaa 2760 atgaaaactc tattgttacc tctgagttgt gttccacgga 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ctattataag gttaatttgg 3660 agtcctcttc taaatagaaa accatatcct tggctactaa catctggaga ctgtgagctc 3720 cttcccattc cccttcctgg tactgtggag tcagattggc atgaaaccac taacttcatt 3780 ctagaatcat tgtagccata agttgtgtgc tttttattaa tcatgccaaa cataatgtaa 3840 ctgggcagag aatggtccta accaaggtac ctatgaaaag cgctagctat catgtgtagt 3900 agatgcatca ttttggctct tcttacattt gtaaaaatgt acagattagg tcatcttaat 3960 tcatattagt gacacggaac agcacctcca ctatttgtat gttcaaataa gctttcagac 4020 taatagcttt tttggtgtct aaaatgtaag caaaaaattc ctgctgaaac attccagtcc 4080 tttcatttag tataaaagaa atactgaaca agccagtggg atggaattga aagaactaat 4140 catgaggact ctgtcctgac acaggtcctc aaagctagca gagatacgca gacattgtgg 4200 catctgggta gaagaatact gtattgtgtg tgcagtgcac agtgtgtggt gtgtgcacac 4260 tcattccttc tgctcttggg cacaggcagt gggtgtagag gtaaccagta gctttgagaa 4320 gctacatgta gctcaccagt ggttttctct aaggaatcac aaaagtaaac tacccaacca 4380 catgccacgt aatatttcag ccattcagag gaaactgttt tctctttatt tgcttatatg 4440 ttaatatggt ttttaaattg gtaactttta tatagtatgg taacagtatg ttaatacaca 4500 catacatacg cacacatgct ttgggtcctt ccataatact tttatatttg taaatcaatg 4560 ttttggagca atcccaagtt taagggaaat atttttgtaa atgtaatggt tttgaaaatc 4620 tgagcaatcc ttttgcttat acatttttaa agcatttgtg ctttaaaatt gttatgctgg 4680 tgtttgaaac atgatactcc tgtggtgcag atgagaagct ataacagtga atatgtggtt 4740 tctcttacgt catccacctt gacatgatgg gtcagaaaca aatggaaatc cagagcaagt 4800 cctccagggt tgcaccaggt ttacctaaag cttgttgcct tttcttgtgc tgtttatgcg 4860 tgtagagcac tcaagaaagt tctgaaactg ctttgtatct gctttgtact gttggtgcct 4920 tcttggtatt gtaccccaaa attctgcata gattatttag tataatggta agttaaaaaa 4980 tgttaaagga agattttatt aagaatctga atgtttattc attatattgt tacaatttaa 5040 cattaacatt tatttgtggt atttgtgatt tggttaatct gtataaaaat tgtaagtaga 5100 aaggtttata tttcatctta attcttttga tgttgtaaac gtacttttta aaagatggat 5160 tatttgaatg tttatggcac ctgacttgta aaaaaaaaaa actacaaaaa aatccttaga 5220 atcattaaat tgtgtccctg tattaccaaa ataacacagc accgtgcatg tatagtttaa 5280 ttgcagtttc atctgtgaaa acgtgaaatt gtctagtcct tcgttatgtt ccccagatgt 5340 cttccagatt tgctctgcat gtggtaactt gtgttagggc tgtgagctgt tcctcgagtt 5400 gaatggggat gtcagtgctc ctagggttct ccaggtggtt cttcagacct tcacctgtgg 5460 gggggggggt aggcggtgcc cacgcccatc tcctcatcct cctgaacttc tgcaacccca 5520 ctgctgggca gacatcctgg gcaacccctt ttttcagagc aagaagtcat aaagatagga 5580 tttcttggac atttggttct tatcaatatt gggcattatg taatgactta tttacaaaac 5640 aaagatactg gaaaatgttt tggatgtggt gttatggaaa gagcacaggc cttggaccca 5700 tccagctggg ttcagaacta ccccctgctt ataactgcgg ctggctgtgg gccagtcatt 5760 ctgcgtctct gctttcttcc tctgcttcag actgtcagct gtaaagtgga agcaatatta 5820 cttgccttgt atatggtaaa gattataaaa atacatttca actgttcagc atagtacttc 5880 aaagcaagta ctcagtaaat agcaagtctt tttaaa 5916 <210> 43 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly 1 5 10 15 Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly 20 25 30 Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys 35 40 45 Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr 50 55 60 Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His 65 70 75 80 Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu 85 90 95 Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu 100 105 110 Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr 115 120 125 Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn 130 135 140 Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160 Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro 165 170 175 Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp 180 185 190 Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser 195 200 205 Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn 210 215 220 Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile 245 250 255 Asn Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys 260 265 270 Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp 275 280 285 Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val 290 295 300 Glu Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser 305 310 315 320 Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp 325 330 335 Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala 340 345 350 Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 355 360 <210> 44 <211> 1499 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60 gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120 cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180 gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240 atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300 gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360 tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420 caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480 gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540 gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600 ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660 cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720 tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780 acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840 aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900 atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaccacatt 960 ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct 1020 aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca 1080 aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140 aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt 1200 gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag 1260 gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct 1320 taaatttgtc aggtacctgg agtttaatac agtgagctct agcaagggag gcgctgcctt 1380 ttgtttctag aatattatgt tcctcaaggt ccattatttt gtattctttt ccaagctcct 1440 tattggaagg tattttttta aatttagaat taaaaattat ttagaaagtt acatataaa 1499 <210> 45 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly 1 5 10 15 Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly 20 25 30 Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys 35 40 45 Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr 50 55 60 Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His 65 70 75 80 Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu 85 90 95 Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu 100 105 110 Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr 115 120 125 Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn 130 135 140 Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160 Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro 165 170 175 Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp 180 185 190 Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser 195 200 205 Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn 210 215 220 Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile 245 250 255 Asn Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys 260 265 270 Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp 275 280 285 Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val 290 295 300 Glu Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser 305 310 315 320 Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp 325 330 335 Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala 340 345 350 Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 355 360

Claims (36)

  1. (a) (ⅰ) SYNGR4의 mRNA를 검출하는 방법, (ⅱ) SYNGR4 단백질을 검출하는 방법, (ⅲ) SYNGR4 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해, 개체 유래 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준의 증가를 폐암의 존재를 관련시키는 단계를 포함하는, 폐암 진단 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준은 상기 정상 대조군 수준 보다 적어도 10% 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준은 SYNGR4 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 개체 유래 생물학적 시료는 생검(biopsy), 타액(sputum), 혈액(blood), 흉수(pleural effusion) 또는 소변(urine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. (a) 환자 유래 생물학적 시료에서 SYNGR4 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) (b)의 비교를 바탕으로 상기 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하는, 폐암에 걸린 환자의 예후를 평가 또는 결정하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 대조군 수준은 좋은 예후 대조군 수준이고 상기 대조군 수준과 비교하여 상기 발현 수준의 증가는 나쁜 예후로 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 증가는 상기 대조군 수준 보다 적어도 10% 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 발현 수준은
    (a) SYNGR4의 mRNA를 검출하는 방법;
    (b) 상기 SYNGR4 단백질을 검출하는 방법; 및
    (c) 상기 SYNGR4 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 환자 유래 생물학적 시료는 생검(biopsy), 타액(sputum), 혈액(blood), 흉수(pleural effusion) 또는 소변(urine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. (a) SYNGR4의 mRNA 검출용 시약;
    (b) 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 검출용 시약; 및
    (c) 상기 단백질의 생물학적 활성 검출용 시약으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시약을 포함하는, 폐암 진단용 또는 폐암에 걸린 환자의 예후 평가 또는 결정용 키트.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 시약은 상기 유전자의 유전자 전사체에 대한 탐침(probe)인 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 시약은 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 센스 가닥 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 가닥들은 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화하며, 세포 내로 도입되는 경우, 세포 증식뿐만 아니라 SYNGR4의 생체 내 발현을 억제하는, 분리된 이중 가닥 분자.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 11, 12, 19 및 20으로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 19 및 20 사이인 뉴클레오티드 쌍을 갖는 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 상기 표적 서열에서 안티센스 가닥과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  16. 제 13항에 있어서, 개재 단일 가닥(intervening single-strand)에 의해 연결된 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  17. 제 16항에 있어서, 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3', {여기서 [A]는 서열번호: 11, 12, 19 및 20으로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 상기 센스 서열, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 상기 개재 단일 가닥, 및 [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥}을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  18. 제 13항 내지 제 17항의 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터.
  19. 센스 가닥 핵산은 서열번호 11, 12, 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥 핵산은 상기 센스 가닥에 상보적인 서열로 구성되고, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥의 전사체는 이중 가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화하며, SYNGR4 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되는 경우, 상기 유전자의 발현을 억제하는, 상기 센스 가닥 핵산 및 안티센스 가닥 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 각 조합을 포함하는 벡터.
  20. 제 18항 또는 제 19항의 벡터 또는 제 13항의 분리된 이중 가닥 분자 중 적어도 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, SYNGR4 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 암의 치료 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 치료되는 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18항 또는 제 19항의 벡터 또는 제 13항의 분리된 이중 가닥 분자 중 적어도 어느 하나를 포함하는, SYNGR4 유전자를 발현하는 암의 치료용 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 치료되는 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. (a) 시험 화합물을 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 폴리펩티드와 상기 시험 화합물 사이의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 폐암 치료 또는 예방용, 또는 폐암 세포 성장 억제용 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  25. (a) 시험 화합물을 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 시험 화합물의 부재하에서 검출된 상기 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비교하여 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 저해하는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 폐암 치료 또는 예방용, 또는 폐암 세포 성장 억제용 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 세포 증식의 촉진 및 세포 침습으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) SYNGR4를 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 시험 화합물의 부재하에서 측정된 상기 SYNGR4의 발현 수준과 비교하여 상기 SYNGR4의 발현 수준이 감소하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 폐암 치료 또는 예방용 또는 폐암 세포 성장 억제용 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  28. (a) SYNGR4의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성 수준이 감소하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 폐암 치료 또는 예방용 또는 폐암 세포 성장 억제용 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  29. 약학적으로 유효한 양의 항 SYNGR4 항체 또는 이의 절편을 포함하는, 폐암 치료 또는 예방용 조성물.
  30. 항 SYNGR4 항체 또는 이의 절편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 폐암의 치료 또는 예방 방법.
  31. (a) 시험 화합물의 존재하에서 SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능성 등가물을 GRB2 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 폴리펩티드 사이의 결합을 측정하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 측정된 결합 수준을 상기 시험 화합물의 부재하에서 검출된 결합 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 상기 시험 화합물의 부재하에서 측정된 결합 수준과 비교하여 결합 수준을 감소 또는 억제시키는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, SYNGR4 폴리펩티드와 GRB2 폴리펩티드 사이의 결합 억제용, 또는 암 치료 또는 예방용 후보 화합물 스크리닝 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 SYNGR4의 기능적 등가물은 타이로신-46(Tyrosine-46)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. (a) SYNGR4 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 상기 폴리펩티드의 인산화가 가능한 상태하에서 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) (a)에 기재된 상기 폴리펩티드의 타이로신-46 잔기에서 상기 인산화 수준을 측정하는 단계;
    (c) 타이로신-46 잔기의 상기 인산화 수준을 상기 화합물의 부재하에서 측정된 단백질에서 타이로신-46 잔기의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 폴리펩티드의 타이로신-46 잔기의 상기 인산화 수준을 감소시키는 화합물을 후보 화합물로 선별하는 단계를 포함하는, SYNGR4의 인산화 억제용, 또는 암 치료 또는 예방용 후보 화합물 스크리닝 방법.
  34. (a) PAK1, c-Raf, MEK1, MEK1/2 및 ERK1/2로 구성되는 군으로부터 선택되는 SYNGR4 다운-스트림 이펙터 중 하나 이상을 인산화하기 위한 상태에서, 폴리뉴클레오티드 GRB2에 의해 암호화되는 폴리페티드 및 PAK1의 존재하에서 SYNGR4의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) SYNGR4 상기 다운-스트림 이펙터의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 시험 화합물의 부재하에서 측정된 SYNGR4의 다운-스트림 이펙터의 상기 인산화 수준과 비교하여 SYNGR4의 다운-스트림 이펙터의 인산화 수준이 저해되는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 다운-스트림 이펙터의 인산화를 위한 SYNGR4의 활성 억제용, 또는 암 치료 또는 예방용 후보 화합물 스크리닝 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 측정되는 상기 SYNGR4의 다운-스트림 이펙터의 인산화 수준은 각각 PAK1의 Thr423, c-Raf의 Ser338, MEK1의 Ser298, MEK1/2의 Ser217/221, 및 ERK1/2의 Thr202/204의 인산화 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 31항 내지 제 35항에 있어서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
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