KR101389018B1

KR101389018B1 - 담도암 암 줄기세포 특성에 기초한 담도암 신규 바이오마커 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101389018B1
Application number: KR1020120071292A
Authority: KR
Inventors: 송시영; 박수빈; 김선아; 박정엽
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-04-29
Also published as: KR20130010831A

Abstract

본 발명은 담도암 암 줄기세포 및 담도암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 담도암 또는 암 치료제 타겟은 담도암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 데 매우 유용하다. 또한, 본 발명을 이용하면 담도암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

Description

담도암 암 줄기세포 특성에 기초한 담도암 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarkers for Biliary tract Cancer Based on Biliary tract Cancer Stem Cell Characteristics and Uses thereof}

본 발명은 담도암 암 줄기세포 특성에 기초한 담도암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

소화기암은 인체에 발생하는 암의 55% 이상을 차지하며, 이중 위암, 간암, 대장암이 대부분으로 그동안 국내에서는 담도암은 거의 관심 밖의 암이었다. 그러나 담도암은 전 세계적으로 환자수가 점차 증가하고 있는 암으로 미국의 경우 연간 5000명의 새로운 담도암 환자가 발생하며 우리나라의 경우 담낭 및 담도암은 전체 암 발생의 3.6%를 차지하고 있다.

담도암의 예후는 매우 나빠서 유병율과 사망률이 비슷한 수준으로 아직까지 정립된 치료가 없으며, 근치적 절제가 완치를 기대할 수 있는 유일한 치료법이나 80% 이상에서 진단 당시 수술이 불가능하고 수술을 하여도 재발이나 전이가 흔하기 때문에 5년 생존률은 5% 미만이다. 또한 특별한 조기진단법이 없어서 발견되었을 때는 이미 병이 진행되어 치료가 늦어지는 경우가 대부분이다.

암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포가 존재하며, 이들 세포는 in vitro에서 부유 배양 시 스피어(sphere)를 형성하게 되고, 스피어 배양으로 얻은 세포는 원 세포주에 비해 강력한 암 형성 능력을 가진다고 보고된 바 있다(A. Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci U S A.: 106, 268-273(2009)). 또한 암 줄기세포는 암의 발생은 물론 기존의 암 치료법이 적용된 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 시작, 재발이나 전이는 물론 항암제 내성에도 관여하므로 암 줄기세포의 증식을 막는 것은 암 치료에 있어서 중요하다(BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery: 8, 806-823(2009)).

현재, 선진국에서는 유방암(M. Al-Hajj et al., Proc Natl Acad Sci U S A.: 100(7), 3983-3988(2003)), 간암(ZF Yang et al., Cancer cell; 13, 153-166(2008)), 대장암(P. Dalerba et al., Proc Natl Acad Sci U S A.: 104(24), 10158-63(2007)), 췌장암(C. Li et al. Cancer Res: 67(3) 1030-1037(2007))등의 분야에서는 이미 어느 정도의 암 줄기세포에 대한 정보들이 확보되어 있기 때문에, 이들 선진국의 방향과는 차별화 할 수 있는 장기 및 조직의 암 줄기세포에 대한 연구가 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 담도암 암 줄기세포 특성에 기초한 담도암에 대한 신규 바이오마커 및 담도암의 치료용 타겟을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 담도암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 담도암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 담도암 암 줄기세포 생물학적 특성에 근거하여 담도암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 담도암 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 담도암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 담도암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명자들은 담도암 암 줄기세포 특성에 기초한 담도암에 대한 신규 바이오마커 및 담도암의 치료용 타겟을 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 담도암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 담도암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 담도암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

본 발명은 담도암 세포주로부터 분리된 담도암 암 줄기세포로부터 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하고 이들이 담도암 치료 타겟이 될 수 있고, 담도암을 조기에 매우 정확하게 진단 및 예후를 분석할 수 있는 특징을 가진다.

본 발명의 상기 2개 마커는 담도암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현된다. 더욱이, 상기 2개 마커는 담도암 세포와 담도암 암 줄기세포를 구별할 수 있는 능력, 즉 담도암 세포와 비교하여 담도암 암 줄기세포에서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.

본 발명에서 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현“세포 또는 조직”은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 담도암 암 줄기세포 또는 담도암 조직이다.

본 발명자들은 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 경우, 일반 담도암세포와 달리 담도암 암 줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다. 일반 담도암 세포와는 달리 담도암 암 줄기세포 내에서만 타겟 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 암 줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암 줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 담도암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 담도암 치료제로 판정된다.

상기 단계 (a)에서 사용되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem. Int . Ed . Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 담도암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질과 시험 물질을 접촉시킨다.

본 발명에서 이용되는 단백질은 세포 표면에 전시(displaying)되어 있는 형태, 바이러스(예컨대, 박테리오파아지) 표면에 전시되어 있는 형태, 분리된(isolated) 형태 또는 정제된(purified) 형태일 수 있다.

세포 표면 또는 바이러스 표면에 전시되어 있는 단백질을 이용하는 경우, 스크리닝의 신속화 또는 자동화를 위하여 상기 세포 또는 바이러스는 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 또한, 분리된(isolated) 또는 정제된(purified) 형태의 단백질도 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 기질로서 이용가능한 것은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 폴리스틸렌과 폴리프로필렌과 같은 탄화수소 폴리머, 유리, 금속 및 젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고상의 기질은 딥스틱, 마이크로타이터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 면역블롯 막(예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막)의 형태로 제공될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,143,825호, 제5,374,530호, 제4,908,305호 및 제5,498,551호). 가장 바람직하게는, 상기 고상 기질은 마이크로타이터 플레이트이다.

본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 상기 단백질들은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

검출가능한 표지가 레이블링된 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

택일적으로, 시험물질의 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 QP-C에 결합하는 지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 셀이 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 QP-C 사이의 결합에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:19061912(1992)).

시험물질의 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다(Sjolander & Urbaniczky, Anal . Chem . 63:23382345(1991), and Szabo et al., Curr . Opin . Struct. Biol . 5:699705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al., J. Biol . Chem . 268, 1204612054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, 상기 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, 상기 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL-4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 인 비보에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 상기 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 결론적으로 담도암의 예방 또는 치료용 물질로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.

본 발명에서 이용되는 시료는 상술한 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 이외에, 펩타이드, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody, 미국 특허 제5,831,012호), 아비머(Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12):1556(2005)) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain, Arnoux B et al., Acta Crystallogr . D Biol . Crystallogr . 58(Pt 7):12524(2002)), 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2):2618(2006))을 포함한다.

발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명에서 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현세포 또는 조직은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 담도암 암 줄기세포 또는 담도암 조직이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(b) 상기 단백질에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는 지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 또는 암 줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 암의 근본적인 치료를 가능하게 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

특히, 본 발명의 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트는 담도암 암 줄기세포에 의해 유래되는 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트이다.

본 명세서에서 표현 “담도암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 담도암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “담도암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “담도암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 “담도암(biliary duct cancer)”이란 담도에 생긴 암세포로 이루어진 종괴를 의미한다. 담도암은 다른 암에 비해 발생 빈도는 낮지만 조기 진단이 어렵고 주변 장기나 림프절로 전이가 잘 되어 예후가 평균적으로는 좋지 않다. 담도암은 전체 소화기암의 3%를 차지하며 서구에서는 드물지만 우리나라를 비롯한 동아시아 지역은 담도암의 호발 지역이다. 담도암의 종류를 놓고 보면 간외담도암은 전세계적으로 감소 추세이지만 간내담도암은 증가하고 있다. 담도암은 50-70세에서 호발하고 남자에서 더 잘 발생한다. 또한, 담도에 발생하는 종양은 대부분 악성이며, 담도 폐쇄로 인한 황달 때문에 진단되는 경우가 많다. 발병원인은 아직 불명확하며, 다만 담즙 속에 들어있는 발암성 물질이 담도에 자극을 주어 발생한다는 보고가 있다.

본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 담도암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 담도암을 진단하는데 있어서 사용되는 표현 "단백질 발현 분석"은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 담도암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 담도암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 담도암 및/또는 담도암 암 줄기세포를 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 담도암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 (multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 담도암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 담도암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 담도암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 담도암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 담도암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 담도암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 담도암 의심 환자의 실제 담도암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 담도암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 담도암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 담도암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 담도암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 담도암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 담도암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 담도암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 담도조직 및 담도암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 담도암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 담도암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.

본 발명에서 담도암을 진단하기 위하여 사용되는 표현폴리뉴클레오타이드 측정은 생물학적 시료에서 본원 발명의 단백질 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 마커로 사용되는 상기 단백질군으로부터 선택되는 각각의 단백질 마커를 코딩하는 염기서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA의 단편을 의미한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

상기 암은 예를 들어, 담도암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 표현 “암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 담도암 암 줄기세포 및 담도암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 담도암 또는 암 치료제 타겟은 담도암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 데 매우 유용하다.

(ⅳ) 또한, 본 발명을 이용하면 담도암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

도 1은 담도암 및 인접 정상조직에서 암 줄기세포 관련 기존 표지자들의 발현차이를 면역조직 화학염색을 통해 나타낸 그림이다.
a) 항-Notch-1 항체, b) 항-SHH(sonic hedgehog) 항체, c)항-Gli-1 항체
도 2는 인체 담도계암 세포주 SNU245 및 SNU1196에서 암 줄기세포 표지자로 알려진 CD24, CD44, ESA 및 CD133의 발현을 유세포 분석을 통해 나타낸 그림이다.
도 3은 인체 담도계암 세포주로부터 배양한 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포를 나타낸 그림이다.
도 4는 인체 담도계암 스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 인체 담도계암 세포주 SNU245와 SNU1196에서 배양한 스피어 세포의 특성을 집락형성 분석법(clonogenic assay)를 이용해 나타낸 그림이다.
도 6은 SNU1196 세포의 접착 및 스피어 세포를 누드마우스에 피하 주사하고 12주 후 종양 크기 및 H&E 염색을 통한 병리조직학적 형태를 나타낸 그림이다.
도 7은 인체 담도계암 조직에서 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자 TAGLN2의 발현분석 결과를 나타낸 그림이다.
a) 정상 조직과 암조직에서 TAGLN2 발현 차이(10X10 배율), b) 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA) 1, c) 조직 마이크로어레이 2, d-e) 정상 조직과 암조직에서 TAGLN2 발현 차이(40 X 10 배율)
도 8은 인체 담도계암 조직에서 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자 TMEM165의 발현분석 결과를 나타낸 그림이다.
a) 정상 조직과 암조직에서 TMEM165 발현 차이(10 X 10 배율), b) 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA) 1, c) 조직 마이크로어레이 2, d-e) 정상 조직과 암조직에서 TMEM165 발현 차이(40 X 10 배율)
도 9는 SNU245, SNU308, SBU478, SNU869, SNU1079 및 SNU1196 의 6종의 인체 담도계암 세포주에서 mRNA를 추출 후 RT-PCR을 통해 TAGLN2의 발현을 확인한 결과이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 10은 인체 담도계암 세포주 SNU1196에 TAGLN2 siRNA 를 형질주입 후, 시간에 따른 TAGLN2의 발현 감소를 RT-PCR 및 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추고, 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
(a) RT-PCR, (b) 웨스턴 블랏
도 11은 TAGLN2 발현 억제에 따른 암세포 전이 분석(Migration assay)의 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 TAGLN2 발현을 억제시켰을 때, 항암제 젬싸이타빈(Gemcitabine)에 대한 민감도를 분석한 그래프이다.
도 13은 TAGLN2 발현 억제에 따른 세포내 다양한 신호체계의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
(a) 암 줄기세포 마커 그리고 암 줄기세포 관련 Wnt신호체계, (b) PI3K 신호체계, MAPK 신호체계, 그리고 세포사멸(apoptosis) 관련 마커
도 14는 SNU245, SNU308, SBU478, SNU869, SNU1079 및 SNU1196 의 6종의 인체 담도계암 세포주에서 mRNA를 추출 후 RT-PCR을 통해 TMEM165의 발현을 확인한 결과이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 15는 담도계암 세포주 SNU1196에 TMEM165 shRNA 플라스미드를 형질주입 후, TMEM165의 발현 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 16은 TMEM165 넉-다운(k/d)에 따른 암세포의 다양한 특성들의 변화를 분석한 결과이다.
(a) 세포증식 그래프(Proliferation assay), (b) 스피어 형성(sphere formation) 분석 (c) 암세포 전이 분석(Migration assay), (d) 암세포 침윤 분석(Invasion assay), (e) 항암제 감수성 분석
도 17은 TMEM165 발현 억제에 따른 세포내 다양한 신호체계의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
(a) 암 줄기세포 관련 마커, (b) PI3K 신호 체계 그리고 MAPK 신호체계

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

면역조직 화학염색을 통한 인체 담도암 조직에서 암 줄기세포 신호체계의 발현 분석

인체 정상 및 담도암 조직 슬라이드를 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1:200으로 희석하여 반응시킨 1차 항체는 래빗 폴리클로날 Notch3(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 Shh(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 Gli1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 이다. 블록화된 섹션을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 그 이후의 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA)에 포함된 표준 프로토콜에 따라 실시하였다. 마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.

담도계암 세포주에서 암 줄기세포 마커들의 발현을 유세포분석(Flow cytometry)을 통해 확인

인체 담도계암 세포주 SNU-245 및 SNU-1196 세포에 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음 기존에 암 줄기세포 마커로 알려진 항체들로 염색하였으며, 항체는 PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), APC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), FITC-ESA(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 PE-CD133(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 이다. 유세포 분석은 BD LSR II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.

인체 담도계암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양

인체 담도계암 세포주 6주(SNU245, SNU478, SNU869, SNU1196, SNU308, SNU1079)는 한국 세포주 은행(KCLB, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 한국 세포주 은행에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장배지 즉 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다. 스피어(Sphere) 배양을 위하여 담도계암 세포주들을 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% BSA(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)를 보충한 혈청 프리 RPMI 배지에 1000 세포/㎖의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7-10일 동안 배양하였다(D. Ponti et. al, Cancer Res : 65(13), 5506-5511(2005)). 같은 배양액으로 배양 접시(Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시켜 접합(adherent) 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다.

스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 폴리뉴클레오타이드 측정

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 SNU245와 SNU1196 세포의 접착과 스피어 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II(Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고, 베타액틴(Betaactin)유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열, PCR 반응 온도 및 싸이클수는 하기 표 1에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	Tm/사이클
Notch3	ATGGTGGGAACTAAACACAGCT	ATGACCCTGGAGGAAGCACA	55℃/35
Hes1	GTGCTGTCTGGATGCGGAGT	GAACACTCACACTCAAAGCCC	55℃/35
Ihh	CCTGAACTCGCTGGCTATCT	AATACACCCAGTCAAAGCCG	56℃/35
Gli1	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	57℃/35
Nanog	ACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCT	AGAGTAAAGGCTGGGGTAGGTA	61℃/30
Oct4	GTGGAGGAAGCTGACAACAA	AGCAGCCTCAAAATCCTCTC	62℃/27
PTEN	GGACGAACTGGTGTAATGAT	CAGACCACAAACTGAGGATT	56℃/30
FZD7	CCAACGGCCTGATGTACTTT	GCCATGCCGAAGAAGTAGAG	61℃/30
β-catenin	GTATGAGTGGGAACAGGGATTT	CCTGGTCCTCGTCATTTAGC	52℃/25
C-met	CAATGTGAGATGTCTCCAGC	CCTTGTAGATTGCAGGCAGA	56℃/28
Snail	AAGCTTCCATGGCGCGCTCTTTCCTCGTCAGGAAGCCC	GGATCCTCAGCGGGGACATCCTGAGCAGCCGGACTCTTG	61℃/30
Vimentin	GAGAACTTTGCCGTTGAAGC	GCTTCCTGTAGGTGGCAATC	55℃/27
CD90	GACCCGTGAGACAAAGAAGC	ACTGTGACGTTCTGGGAGGA	61℃/35
CEACAM1	ATACCTGCCACGCCAATAAC	TTATGCTGAGGGTGGTGTTG	61℃/35
β -actin	GGCATCCTCACCCTGAAGTA	GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA	55℃/25

스피어 세포의 자가재생 및 군락형성 검증

반고형 한천 군락 형성 시험(soft agar colony forming assay)은 표준 프로토콜을 변형하여 수행하였다(MJ Son et al., Cell stem cells: 4, 440-452(2009)). Difco agar noble(Becton, Dickinson company, Sparks, MD)을 사용하였으며, 2X 스피어 배양액과 1:1의 비율로 0.6%의 하층 아가(bottom agar)를 24웰 플레이트에 넣은 후 실온에서 고체화하였다. 인체 담도계암 세포주 SNU245 및 SNU1196 으로부터 배양된 접착과 스피어 세포를 0.25% 트립신 EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 동일한 수의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 스피어 배양액에 현탁시킨 접착 및 스피어 세포와 아가를 혼합시켜 0.3%의 상층 아가(top agar)를 만들어 하층 아가 위에 분주하였다. 성장인자가 포함된 스피어 배양액은 2-3일마다 교체하였다. 2-3주간 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였고 세포 군집을 세어 자가 재생 및 비부착증식(anchorage independent growth)를 비교 분석하였다.

담도계 암세포주 SNU1196 스피어 세포의 암화능력 확인

인체 담도계암 세포주 SNU1196으로부터 배양된 접착과 스피어 세포를 0.25% 트립신 EDTA(Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 동일한 수(1000 cells)의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 누드 마우스(Orientbio, Seoul)의 양 옆구리에 피하주사하였다. 이후 12 주간 관찰한 후 해부하여 스피어 세포의 암화능력을 확인하였다.

cDNA 마이크로어레이

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 제조사 지시에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭 분광기(NanoDrop Technologies, Inc., DE)를 사용하여 정량 분석하고, Agilent 2100 생분석기(Agilent Technologies, Santa Clare, CA)에 의해 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. 마이크로어레이 실험 절차는 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 디지털 제노믹스(Seoul, Korea)에서 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 간략히 정리하면, 각각의 총 RNA 6 ㎍ 분량을 사용하여 이중사 cDNA를 준비하고, 비오틴-표지(IVT 라벨링 키트; Affymetrix)를 하여 증폭하였다. 상기 표지된 cDNA를 조각내어 Affymetrix GeneChip 인간 지놈 U133 플러스 2.0 고농도 올리고뉴클레오타이드 어레이(Affymatrix, Santa Clara, CA)에 혼성화시켰다. 그 다음 마이크로어레이를 Genechip Fluidics 스테이션 450(Affymetrix)으로 세척하고 Genechip 어레이 스캐너 3000 7G(Affymetrix)를 사용하여 스캔하였다. Affymetrix 발현 Console 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 발현 데이터를 생성시키고, 이를 MAS5 알고리즘 표준화하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 MAS5 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 적어도 하나의 샘플 군 내 50%가 넘는 샘플에서, MAS5 탐지 콜에 의할 때 프레즌트 콜이 아닌 프로브 세트는 걸러내었다. 두 그룹 간에 다르게 발현하는 유전자를 결정하기 위하여 MASS 발현 값에 대하여 짝지은 t-테스트를 수행하였고, 1.2배가 넘는 차이를 보이는 유전자를 고려하였다. 모든 개별적인 칩 분석은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 2회 반복 수행하였다. 이후 본 발명자들이 이미 확보하고 있는 인체 담도계암 조직의 cDNA chip 자료와의 통합 분석을 통해 보다 정제된 후보군 도출을 하였다.

면역조직 화학염색을 통한 인체 담도계암 조직에서의 담도계암 암 줄기세포 관련 단백질 TAGLN2 및 TMEM165의 발현 분석

인체 담도 조직 슬라이드(정상 및 담도계암 전체 슬아이드와 TMA조직)를 자일렌 내에서 탈파라핀화 시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1차 항체는 래빗 폴리클로날 TAGLN2 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), 래빗 폴리클로날 TMEM165 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)이다. 희석 농도는 각각 1:500과 1:1000이다. 블록화된 섹션을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 그 이후의 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA)에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다. 마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.

담도계암 세포주에서의 TAGLN2 및 TMEM165 mRNA 발현 확인

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 총 6주의 인체 담도계암 세포주(SNU245, SNU308, SNU478, SNU869, SNU1079 및 SNU1196)로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. TAGLN2 또는 TMEM165 유전자의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 담도계암 세포주에서의 TAGLN2 또는 TMEM165 발현을 분석하였고, 베타액틴(Beta-actin)유전자의 발현을 대조군으로 하였다. TAGLN2 와 TMEM165 유전자의 프라이머 염기 서열은 표 2에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)
TAGLN2	TAT GGC ATT AAC ACC ACT GA	GGA TTC TCC TTG GAT TTC TT
TMEM165	CTG ACC CCT TTT TAA GGA AT	CTT GTT GTG CCA TGT TAT TG

TAGLN2 siRNA 의 형질주입( transfection )

TAGLN2에 대한 siRNA는 Santa cruz사의 sc-106633(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)을 사용하였다. 담도암 세포주 SNU1196 9 X 10⁴개당 siRNA 30 nM을 리포펙타민 RNAiMAX(Invitrogen)을 이용하여 형질주입 후 30시간, 48시간, 72시간 그리고 96시간 후 TAGLN2의 발현량을 확인하였다. 대조군 siRNA(santa cruz, sc-37007)를 도입한 세포를 대조군으로 사용하였다.

TMEM165 발현 저해(넉-다운, k/d) 세포주 구축

TMEM165의 발현 저해로 인한 다양한 특성 변화를 확인하기 위하여 TMEM165 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드(SureSiliencing shRNA plasmids)를 QIAGEN사로부터 구입하였고(QIAGEN, Valencia, CA), SNU1196 세포주에 영구 주입하여 TMEM165 넉-다운(k/d) 세포주를 수립하였다.

본 발명에 사용된 TMEM165에 대한 shRNA-1의 서열은 GGA AGA AGT TCA AGC TGA ATT, shRNA-4의 서열은 TCC TGC TAC CCA AAC TAA TTT 이고, 대조군 shRNA의 서열은 GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC이며, 선별 마커로는 퓨로마이신 2.0 ㎍/㎖(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)을 사용하였다. TMEM165 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드를 세포에 형질주입할 때에는 리포펙타민2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였다. 24시간 후, 배양액을 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신이 포함된 배양액으로 바꾸어 준 후, 3일 이상 지속배양 하였다. 퓨로마이신 배양액에서 살아남은 세포를 100 mm 플레이트에 20-30 개의 적은 수로 부착시켜 배양시킨 후, 클로닝 실린더(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)를 이용하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이후 웨스턴 블랏을 통해 TMEM165 넉-다운을 확인하였다.

웨스턴 블랏을 이용한 단백질 발현 분석

아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 세포 수득 후 PBS로 세포를 씻어준 후 단백질을 추출하였고, SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블록킹하였다. 그 다음, 각각의 멤브레인을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 1차 항체는 래빗 폴리클로날 TAGLN2(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), 래빗 폴리클로날 TMEM165(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), 래빗 폴리클로날 c-MET(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 phospho-GSK3(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 마우스 모노클로날 b-catenin(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 Ihh(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 phospho-AKT(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 AKT(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 p21RAS (BD transduction laboratories, San Diego, CA), 래빗 폴리클로날 phospho-MEK(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 MEK(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 phospho-ERK(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 고트 폴리클로날 ERK(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 BAX(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 BCLxL(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GAPDH(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)를 사용하였다. 1차 항체와 반응한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)이 접합된 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 Enhanced chemiluminescence system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다.

세포 증식 속도 분석 ( Proliferation assay )

각 세포를 1.1 × 10⁴개씩 24웰-플레이트에 부착시킨 후, 8일간 매 2일마다 일정시간에 세포를 0.25% 트립신EDTA로 분리하고 세포 계수기(hematocytometer)에서 세포수를 측정하였다.

스피어 세포 형성 분석 (Sphere forming assay)

스피어 배양을 위해 TMEM165 넉-다운(k/d) 세포주들과 대조군 세포주를 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% BSA(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)를 보충한 혈청 프리 RPMI 배지에 1000 세포/㎖의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7-10일 동안 배양한 후(D. Ponti et. al, CancerRes:65(13),5506-5511(2005)) 스피어 형성 차이를 현미경으로 관찰하였다.

암세포 전이분석( migration assay )과 암세포 침윤분석( invasion assay )

암세포 전이 및 침윤분석은 트랜스웰(Corning Inc., Tewksbury MA)에서 수행되었다. 암세포 침윤분석의 경우, 무혈청 배지(serum free media)에 4분의 1로 희석된 마트리겔(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)을 상부 웰에 85 μl씩 넣고 37℃에서 고형화시켜 사용하였다. 상부 웰에는 무혈청 배지에 현탁시킨 세포를 1.0 X 10⁴개씩, 하부 웰(lower well)에는 NIH3T3 섬유아 세포의 배양액을 500 μl씩 분주한 후 전이분석은 24시간, 침윤분석은 72시간 배양하였고, 필터를 통과하여 필터 아래쪽에 부착된 세포를 고정 및 염색한 후 현미경 관찰을 통하여 전이 및 침윤된 세포수를 측정하였다.

항암제 감수성 분석

각 세포를 10³개씩 96웰-플레이트에 부착시킨 후, 다음날 젬싸이타빈 (Gemcitabine,Lilly france SAS)을 0, 20, 200, 2000 nM 의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다. MTT 용액(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)을 넣고 4시간 반응시킨 후 DMSO(sigma-Aldrich) 처리하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 감수성을 분석하였다.

실험 결과

담도암 및 인접 정상조직에서 암 줄기세포 관련 다양한 기존 표지자의 면역화학염색을 통한 발현분석

줄기세포에 관련된 시그널인 Notch 및 Hedgehog의 발현 여부를 인체 담도암 조직에서 알아보고자 면역화학염색을 수행하였다. 소화기관련 암조직에 비하여 담도암 조직에서 notch-1, sonic hedgehog 및 Gli-1과 같은 줄기세포 관련 단백의 발현이 현저히 증가해 있어(도 1a-c) 암 줄기세포 관련 신호체계들이 담도암 암화과정에 매우 밀접하게 관여하고 있음을 확인하였다.

유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커들의 발현 확인

암 줄기세포 표지자로 보고된 CD24, CD44, ESA 및 CD133의 발현을 인체 담도계암 세포주 SNU245 및 SNU1196에서 확인하고자 유세포 분석을 수행하였다. SNU245 세포에 비해 SNU1196 세포에서 각 마커들의 발현이 높게 나타남을 확인하였고, CD44와 ESA는 SNU245 및 SNU1196에서 50-90%로 높게 발현하는 반면 CD133은 SNU1196에서 0.5%만이 발현하였다. CD24의 경우 SNU245에서는 2.3%, SNU1196에서는 96%의 발현을 나타내어 담도계암 세포주 내에서도 세포주간의 발현 차이가 큰 것을 확인하였다(도 2).

인체 담도계 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양

암 줄기세포의 특성을 나타내는 스피어 형성 유무를 확인하였고, 총 6종의 담도계암 세포주 중 SNU245 및 SNU1196을 선택하여 후속 실험을 진행하였다(도 3).

담도계암 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 폴리뉴클레오타이드 분석

스피어의 형성이 확인된 담도계암 세포주 중 SNU245 및 SNU1196을 선택하여 스피어를 분리 배양하였으며, RT-PCR 을 통하여 다양한 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 확인하였다. 담도계암 세포주들의 접착에 비해 스피어 세포에서 Notch, Hedgehog 및 Wnt등 줄기세포 관련 신호전달 체계가 활성화되어 있는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 암 줄기세포의 특성인 Epithelial to Mesenchymal transition의 마커인 c-met, snail 및 vimentin과 최근 간암 줄기세포 마커로 보고된 CD90 의 발현 또한 증가되어 있음을 알 수 있었다(도 4). 이는 스피어 세포내에 다량의 암 줄기세포를 포함하고 있음을 시사하며, 스피어에서 특이적으로 발현하는 유전자 및 단백질 프로파일을 조사함으로써 담도계암 줄기세포 특이 표지자를 예측할 수 있을 것으로 사료된다.

담도계암 스피어 세포에서 집락형성 분석법(clonogenic assay)를 통한 암 줄기세포의 특성 확인

집락형성 분석법을 통하여 인체 담도계암 세포주 SNU245 및 SNU1196에서 배양한 스피어 세포의 특성을 검증하였다. 접착 세포에 비해 스피어 세포가 콜로니를 더 많이 형성하여 줄기세포의 가장 중요한 특성인 자가재생 및 비부착증식 능력이 높음을 확인하였다(도 5).

담도계암 스피어 세포의 암화능력 검증

인체 담도계암 세포주 SNU1196 스피어 세포의 암화능력을 확인하기 위하여, 대조군인 접착 세포와 스피어 세포를 각각 1000개씩 누드마우스의 양 옆구리에 피하 주사한 후 12주간 관찰하였다. 암 줄기세포의 특성을 지니는 스피어 세포를 주입한 그룹이 접착 세포를 주입한 그룹에 비해 암 형성능력이 더 높게 나타나 결과적으로, 스피어 세포의 성장이 더욱 빠르며, 조직학적으로도 내부 궤사가 심하여 보다 악성 양성을 나타냄을 확인하였다(도 6). 담도계암 세포주로부터 형성된 스피어 세포가 암 줄기세포와 관련된 유전자 및 마커들을 발현하고 있으며, 암화능력이 증가되어 있는 결과들(도 1-6)을 토대로, 스피어에서 특이적으로 발현하는 바이오마커를 조사함으로써 담도계암 줄기세포 특이 표지자를 예측할 수 있을 것으로 판단하였다.

cDNA 어레이를 통해 담도계암 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 바이오마커 발굴

SNU245 및 SNU1196 세포의 스피어 및 부착 세포내 다르게 발현되는 유전자를 분석하고 담도계암 줄기세포 관련 타겟 표지자를 규명하기 위하여 Affymetrix GeneChip HG U133을 사용한 cDNA 마이크로어레이를 수행하였다. 이후 본 발명자들이 이미 보유하고 있는 인체 담도계암 조직의 cDNA 마이크로어레이 데이터와 통합 분석하여, 스피어 세포와 인체 담도암 조직에서 모두 증가되어 있는 TAGLN2 및 TMEM165를 발굴하였다(표 3).

Gene symbol	Gene name	RefSeq Transcript ID	Sphere_Fold change		기보유한 인체 담도암조직의 Chip data_Fold change
TAGLN2	Transgelin 2	NM_003564	SNU245	1.7	6.6
			SNU1196	1.5
TMEM165	Transmembrane165	NM_018475	SNU245	1.4	3.3
			SNU1196	1.2

인체 담도계암 조직에서 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자 TAGLN2 의 발현 분석

본 발명에서 도출한 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자인 TAGLN2의 발현을 인체 담도암 조직에서 확인하였다. 인체 정상 담도 상피조직과 담도암 조직에서 TAGLN2의 발현을 확인한 결과, 정상조직에서는 발현이 현저히 낮은 반면 담도암 조직에서 강하게 발현하고 있음을 검증하였다(도 7a). 또한 총 33종의 담도암 환자 조직이 올라간 TMA에서 TAGLN2의 발현을 확인한 결과, 96.5%의 담도암 환자 조직에서 발현하고 있음을 확인하였다(도 7b-e).

인체 담도계암 조직에서 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자 TMEM165 의 발현 분석

본 발명에서 도출한 담도암 암 줄기세포 관련 신규 표지자인 TMEM165의 발현을 인체 담도암 조직에서 확인하였다. 인체 정상 담도 상피조직과 담도암 조직에서 TMEM165의 발현을 확인한 결과, 정상 조직에서는 발현이 현저히 낮은 반면 담도암 조직에서 강하게 발현하고 있음을 검증하였다(도 8a). 또한 총 33종의 담도암 환자 조직이 올라간 TMA에서 TMEM165의 발현을 확인한 결과, 88.9%의 담도암 환자의 조직에서 발현하고 있음을 확인하였다(도 8b-e).

TAGLN2 발현 억제에 따른 다양한 특성 분석

siRNA에 의한 TAGLN2 발현 억제 전에 인체 담도계암 세포주들에서의 TAGLN2발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과, 6개의 담도계암 세포주 모두가 TAGLN2를 강하게 발현하고 있음을 알 수 있었다(도 9). SNU1196 세포주에 TAGLN2 siRNA를 형질주입한 경우, 48시간부터 96시간까지 TAGLN2의 발현이 확연하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 10a-b).

TAGLN2 siRNA 형질주입 후 48시간 되었을 때에 암세포 전이능력 및 항암제 감수성을 분석하였고, 72시간 되었을 때에 다양한 단백질들의 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

도 11과 12는 암세포 전이능력 및 항암제 감수성 분석의 결과로, TAGLN2의 발현이 저해되었을 때 암세포의 전이능력이 현저히 감소하고 항암제에 대한 감수성 또한 높아지는 것을 알 수 있다. 또한 최근 췌장암 줄기세포 마커이자 암 줄기세포의 다양한 특성과 관련되어 있다고 알려진 c-met의 발현이 TAGLN2의 발현 저해와 함께 감소되었으며, 암 줄기세포 관련 Wnt 신호체계의 b-카테닌도 감소됨을 확인하였다(도 13a). 뿐만 아니라 인산화된 AKT 및 ERK의 발현 감소, pro-apoptotic 마커인 BAX의 증가와 anti-apoptotic 마커인 BCLxL의 발현이 감소되어 TAGLN2가 세포사멸과도 관련이 있음을 확인할 수 있었다(도 13b).

TMEM165 발현 저해(넉-다운, k/d) 세포주 구축 및 특성 분석

TMEM165발현 저해 세포주를 구축하기 전에 인체 담도계암 세포주들에서의 TMEM165 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과, 6개의 담도계암 세포주 모두가 TMEM165를 강하게 발현하고 있음을 알 수 있었다(도 14). TMEM165의 발현 억제시 나타나는 다양한 특성을 분석하기 위하여, TMEM165에 대한 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드를 SNU1196 세포에 영구 주입하여 TMEM165 넉-다운(k/d) 세포주를 수립하였다. 확립된 TMEM165 넉-다운(k/d) 세포주는 대조군에 비해 TMEM165 단백질의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 15).

TMEM165의 발현 억제 시 대조군에 비해 세포 증식속도가 현저히 느려지는 것을 확인하였으며(도 16a), 스피어 세포의 형성 능력 또한 저해되어 암 줄기세포의 중요 특성인 자가재생 능력이 감소됨을 확인하였다(도 16b). 뿐만 아니라 암세포 전이능력(도 16c) 및 암세포 침윤능력(도 16d)이 대조군에 비해 현저히 감소되는 결과를 나타냈다. 더불어 TMEM165의 발현이 억제되었을 때, 항암제 젬싸이타빈에 대한 감수성이 증가하는 양상을 나타내었다(도 16e).

도 17은 TMEM165 발현 저해에 따른 다양한 단백질들의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. TMEM165 발현 저해시, 최근 암 줄기세포로 대두되고 있는 c-met의 발현이 함께 감소하였고, 줄기세포 관련 Wnt 신호체계의 b-카테닌 및 Hedgehog 신호체계의 Ihh의 발현 또한 감소되어 TMEM165가 암 줄기세포와 관련되어 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 17a). 또한 pGSK3-베타와 p-MEK의 발현이 현저히 감소하여 TMEM165의 발현을 인위적으로 억제하였을 때 PI3K와 MAPK 신호체계를 함께 조절할 수 있음을 알 수 있었다(도 17b).

고찰

담도암의 예후는 매우 나빠서 유병율과 사망률이 비슷한 수준으로 아직까지 정립된 치료가 없으며, 재발이나 전이가 흔하기 때문에 5년 생존률은 5% 미만이다. 또한 특별한 조기진단법이 없어서 발견되었을 때는 이미 병이 진행되어 치료가 늦어지는 경우가 대부분이다.

본 발명에서는 암의 최초 시작으로 여겨지며, 재발이나 전이 및 항암치료 내성을 유발하는 것으로 알려진 암 줄기세포(cancer stem cell or tumor initiating cell)에 초점을 맞춰 담도암에서 암 줄기세포를 표적으로 한 새로운 진단 및 치료법을 개발하기 위하여 담도암 암 줄기세포 관련 표지자들을 도출하였다.

인체 담도계암 세포주로부터 암 줄기세포 특성을 가지는 스피어 세포를 배양하였고, 스피어 세포가 암 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 검증하였다. 이들 스피어 세포에서 암 발생 및 줄기세포 특성 유지에 관여하는 Notch, Hedgehog 및 Wnt 시그널 등 잘 알려진 줄기세포 관련 신호체계(T. Reya et al., Nature,414:105-111,2001)가 활성화되어 있었으며, 췌장암 암 줄기세포로도 보고된 c-met(Li C. et al., Gastroenterology,141(6):2218-2227,2011),중간엽 세포 마커인 vimentin 등이 증가되어 있음을 확인하였다.

또한 암 줄기세포의 가장 중요한 특성을 나타내는 자가재생 능력이 담도계암 세포주의 스피어 세포에서 높게 나타났으며, 인 비보 실험결과 스피어 세포의 암화능력이 대조군인 부착세포에 비해 높게 나타나 스피어 세포가 다량의 암 줄기세포를 포함하고 있다는 기존의 보고와 일치하는 결과를 보여주었다(J. Zhou et al., Proc Natl Acad Sci USA,104:16158-16163(2007)).

이 결과들을 토대로 인체 담도계암 세포주로부터 형성된 스피어에서 cDNA 어레이를 통해 담도암 암 줄기세포 관련 표지자인 TAGLN2와 TMEM165를 도출하였다. TAGLN2와 TMEM165 모두 인체 담도계암 세포주 6주 모두에서 강하게 발현하고 있었고, 인체 담도 정상 조직에서는 발현하지 않는 반면, 담도계암 조직에서 강하게 발현하고 있어 담도계암의 진단 마커로서의 가능성을 보여주고 있다.

그리고 이들 마커들의 발현을 인위적으로 억제시켰을 때, 암세포 전이, 침윤 능력 감소 및 항암제 감수성이 증가되어 치료용 타겟의 가능성을 보여주었으며, c-met, b-카테닌, PI3K 및 MAPK 신호체계 활성 또한 감소하는 결과를 보여주었다. 다양한 암세포에서 c-met의 활성화를 통해 PI3K나 MAPK 신호체계가 활성화됨은 이미 알려진 바 있다(Joseph Paul Eder et al., Clin Caner Res., 15(7) 2207-2214, (2009)). 또한 c-met 은 암 줄기세포와 관련된 상피 중간엽 세포이행, 침윤 성장에 중요한 단백질이며, 최근 췌장암 암 줄기세포 마커 및 치료용 타겟으로 보고된 바 있다(Li C. et al., Gastroenterology, 141(6):2218-2227(2011)).

위의 결과들을 바탕으로, TAGLN2 와 TMEM165가 암 줄기세포를 기반으로 한 담도암의 진단 마커 및 치료용 타겟 가능성이 있음을 확인하였다.

참고문헌

1. A. Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci U S A.: 106, 268-273, 2009.

2. BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery:8,806-823,2009)

3. M. Al-Hajj et al., Proc Natl Acad SciUSA.:100(7),3983-3988,2003.

4. ZF Yang et al., Cancercell;13,153-166,2008.

5. P. Dalerba et al., Proc Natl Acad Sci USA.:104(24),10158-63,2007.

6. C. Li et al. Cancer Res:67(3)1030-1037,2007.

7. MJ Son et al., Cellstemcells:4,440-452,2009.

8. D. Ponti et. al, Cancer Res:65(13),5506-5511,2005.

9. T. Reya et al., Nature, 414:105-111,2001

10. Li C. et al., Gastroenterology, 141(6):2218-2227,2011

11. J. Zhou et al., Proc Natl Acad Sci USA,104:16158-16163,2007

12. Joseph Paul Eder et al., Clin Caner Res., 15(7) 2207-2214, 2009

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음의 단계를 포함하는 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 담도암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
다음의 단계를 포함하는 담도암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;
(b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 담도암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
삭제
삭제
제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 세포 표면, 바이러스 표면 또는 분리된 형태(isolated form)로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 암 줄기세포 검출용 키트.
삭제
서열목록 제1서열의 단백질 및 서열목록 제3서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단 또는 예후 분석용 키트.
삭제
제 6 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 또는 마이크로어레이용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.