PT1889920E - Método para a identificação in vitro de compostos para terapia do cancro - Google Patents

Description

7961

DESCRIÇÃO

MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO IN VITRO DE COMPOSTOS PARA

TERAPIA DO CANCRO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para identificar e avaliar a eficácia de compostos para terapia do cancro, especialmente para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, com o objectivo de desenvolver novos produtos medicinais; assim, como agentes que inibem a expressão e/ou a actividade da proteína cinase alfa de colina e/ou os efeitos desta expressão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A cinase de colina (também conhecida como CK, CHK e ChoK) é a enzima inicial da via da síntese de Kennedy ou fosfatidilcolina (PC) e fosforila a colina em f osf orilcolina (PCho) na presença de magnésio (Mg2+) utilizando trifosfato de adenosina 5' (ATP) como um grupo dador de fosfato. A transformação mediada por vários oncogenes induz níveis elevados de actividade de cinase de colina, dando origem a um aumento anormal nos níveis intracelulares deste produto, PCho, que suporta indirectamente o papel da cinase de colina na criação de tumores humanos. Todavia, não existem mecanismos alternativos da criação de PCho que não envolvam a activação da cinase de colina e pode explicar os níveis elevados deste metabolito em células tumorais. 7961

Embora existam provas do aumento na actividade da enzima cinase de colina em tumores e em células transformadas, a sua relação com o processo carcinogénico não está suficientemente demonstrada, na medida em que não foi estabelecida uma relação causa-efeito clara entre o aumento na actividade e a transformação tumoral. Por outro lado, a molécula responsável por este efeito ainda não foi identificada.

Foram identificadas cerca de 200 sequências de genes que codificam para polipéptidos com uma estrutura primária homóloga à cinase de colina e são designadas como cinase de colina alfa a, cinase de colina alfa b, cinase de colina alfa 3, cinase de colina beta 1, cinase de colina beta 2, cinase de colina CKB-1 Colina/cinase de etanolamina, cinase de etanolamina de tipo cinase de colina, Cots, Duff227, Cog3173 CPT1B, SF1, SHOX2, FHOD2, FLJ12242, KRT5, FBL, ARL6IP4, etc. (ver http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi#219541) tanto em humanos como em outros mamíferos e roedores (ratos, murganhos, vacas, porquinhos-da-índia, coelhos, macacos). De facto, desde 1982 tem havido provas bioquímicas de que em diferentes tecidos isolados a partir de ratos, murganhos e humanos existem pelo menos três isoenzimas com actividade de cinase de colina apresentando diferentes propriedades físico-químicas.

Pelo menos 3 genes que codificam para proteínas com actividade de cinase de colina demonstrada foram identificados recentemente no genoma humano, designados como ck-alfa, ck-beta, e HCEKV (Patente USA US2003186241) , 2 7961 e vários genes, cujas proteínas codificadas têm 30-65% de homologia com aquelas codificadas pelos genes ck, tais como por exemplo os genes CAI16602, CHKL, CAI16600, CAI16599, CAH56371, CAI16603, BAA91793, CAI16598 descritos em (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) , e os genes CPT1B, EKI2, SF1, SHOX2, FHOD2, FLJ12242, KRT 5, FBL, ARl61p$, TOMM40, MLL, descritos em (http://www.ebi.ac.uk/cgi- bin/sumtab?tool=asdblast&jobid=blast-20050412-18072127).

Uma característica muito relevante das diferentes isoenzimas de cinase de colina é que elas possuem diferentes propriedades bioquímicas, com variações importantes na sua afinidade para o substrato colina ou para o dador de fosfato ATP, e ainda na sua forma activa, que pode ser apresentada como dímeros ou tetrâmeros. Por isso, é necessário definir se existe uma relação directa entre qualquer uma das diferentes isoenzimas de cinase de colina identificadas e a capacidade tumorigénica atribuída devido á sua sobre-expressão em tumores humanos.

Por outro lado, a inibição da cinase de colina demonstrou ser uma estratégia anti-tumoral nova e eficaz em células transformadas por oncogenes, que foi extrapolada para murganhos sem pêlo in vivo. O aumento na actividade de cinase de colina em vários carcinomas da mama humanos foi publicado recentemente, e foi observado que a alteração da cinase de colina é um evento frequente em alguns tumores humanos, tais como tumores do pulmão, colo-rectal e da próstata. 3 7961

Apesar da correlação entre alguns parâmetros e outros, não existe presentemente qualquer prova que estabeleça em definitivo que a sobre-expressão da cinase de colina possui actividade oncogénica e tumoral em células humanas. Há provas que indicam que os inibidores da actividade da cinase de colina, tais como hemicolínio-3 [Cuadrado A., Carnero A., Dolfi F., Jiménez B. e Lacal J.C. Oncogene 8, 2959-2968 (1993); Jiménez B., del Peso L., Montaner S., Esteve P. e Lacal J.C. J. Cell Biochem. 57, 141-149 (1995); Hernández-Alcoceba, R., Saniger, L., Campos, J., Núnez, M. C., Khaless, F., Gallo, M. Á., Espinosa, A, Lacal, J. C. Oncogene, 15, 2289-2301 (1997)] ou as metilenoquinonas de baixa toxicidade no Pedido de Patente Espanhola ES200503263, apresentam actividade anti-tumoral. Todavia, não existe prova conclusiva nos documentos acima mencionados ou no resto da técnica anterior, em relação às várias isoenzimas com actividade de cinase de colina demonstrada (ck-alfa, ck-beta, HCEKV, etc.) e identificadas em tecidos humanos poderem ser responsáveis pela actividade enzimática detectada, nem é indicado quais das isoenzimas são sensíveis à inibição através de inibidores que apresentaram actividade anti-tumoral. Esta identificação é necessária de modo a ser capaz de estabelecer a sua utilização potencial como um alvo terapêutico no cancro.

OBJECTO DA INVENÇÃO É aqui revelado um método in vitro para descobrir, identificar e avaliar a eficácia de compostos para terapia do cancro, especialmente para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal. 4 7961 É ainda revelada a utilização de sequências nucleotidicas ou peptídicas derivadas do gene alfa da cinase de colina em métodos para descobrir, identificar, desenvolver e avaliar a eficácia de compostos para terapia do cancro, de um modo preferido para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal.

Uma outra revelação consiste em proporcionar agentes caracterizados por inibirem a expressão e/ou a actividade da proteína alfa da cinase de colina para o tratamento de cancro, de um modo preferido cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal. É ainda revelada uma composição farmacêutica que compreende um ou vários agentes terapêuticos juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de cancro, de um modo preferido cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal. É também revelado um método in vitro para monitorizar o efeito de uma terapia administrada a um doente com cancro, caracterizada por a avaliação do nível de expressão da proteína alfa da cinase de colina numa amostra de tecido extraída de um doente ao qual está a ser administrado um agente anti-tumoral, de um modo preferido um agente de acordo com as reivindicações 3-5, através da determinação na referida amostra de pelo menos um parâmetro relacionado com a proteína alfa da cinase de colina que é seleccionada a partir do nível do seu RNA mensageiro, da concentração da referida proteína ou da sua actividade enzimática, e da 5 7961 comparação do valor obtido com o valor correspondente a uma ou mais amostras de tecido normal, não canceroso.

Finalmente, é também revelado um kit de diagnóstico para realizar a presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: A) Actividade de cinase de colina (ChoK) em extractos de células humanas Hek293T (Células de rim embrionário humano) após sobre-expressar cinase de colina alfa e beta (ensaio ex vivo da actividade de cinase de colina). B) Níveis intracelulares de fosforilcolina em células vivas (ensaio in vitro da actividade de cinase de colina).

Figura 2: A) Actividade ChoK em células Chok293T humanas após sobre-expressão da cinase de colina alfa e beta. B) A especificidade dos anticorpos monoclonais criados contra a cinase de colina alfa nos mesmos extractos apresentados em A.

Figura 3: Sobre-expressão da cinase de colina alfa determinada por meio de técnicas de imuno-histoquímica em NSCLC (cancro do pulmão de não pequenas células).

Figura 4: Sobre-expressão da cinase de colina alfa determinada por meio de técnicas de imuno-histoquímica em cancro da mama. 6 7961

Figura 5: Sobre-expressão da cinase de colina alfa determinadas por meio de técnicas de imuno-histoquímica em cancro do cólon. B) Polipo no qual a coloração progressiva é observada desde as lesões pré-neoplásicas até à massa do tumor.

Figura 6: Crescimento independente da ligação de células que sobre-expressam cinase de colina alfa humana. Tanto o número de colónias criadas como o seu tamanho relativo nas duas linhas celulares analisadas, são conhecidas Hek293 e MDCK.

Figura 7: Actividade oncogénica in vivo de cinase de colina alfa em murganhos Nu/Nu.

Figura 8: Expressão e actividade enzimática de cinase de colina alfa em tumores induzidos in vivo.

Figura 9: Especificidade do inibidor MN58b em cinase de colina alfa. Os extractos de E. coli nos quais são expressas as proteínas de cinase de colina alfa ou cinase de colina beta recombinantes humanas são analisados na ausência (0) ou na presença de concentrações crescentes de MN58b.

Figura 10: Efeito anti-tumoral do inibidor MN58b em tumores induzidos por sobre-expressão de cinase de colina alfa. 7 7961

Figura 11: Bloqueamento de expressão de cinase de colina alfa pela técnica siRNA em células HeK293T humanas.

Figura 12: Bloqueamento de expressão de cinase de colina alfa por meio de siRNA em células tumorais derivadas de um carcinoma da mama humano, determinada tanto por Transferência de Western A) e B) e por actividade enzimática C).

Figura 13: Morte devida a apoptose induzida por RNA de interferência especifico de cinase de colina alfa em células tumorais de cancro humanas MDA-MB-231. A) Análise de citometria de fluxo com iodeto de propidio. B) Digestão de PARP associada à morte devida a apoptose.

Figura 14: RNA de interferência especifico da cinase de colina alfa em células epiteliais mamárias humana primárias HMEC. A) Níveis de expressão basal de cinase de colina alfa em células HMEC normais com respeito às células tumorais MDA-MB-231. B) Interferência com cinase de colina alfa em HMEC. C) A interferência da cinase de colina alfa não induz a morte celular em células HMEC humanas primárias.

Figura 15: Sobre-expressão de cinase de colina alfa em tecido do cancro da mama. Figura 15a: RNA mensageiro de cinase de colina alfa em tecidos de doentes com cancro da mama detectado por PCR em tempo real quantitativo, representado como o logaritmo na base 10 8 7961 entre a quantidade detectada e a quantidade presente numa amostra de tecido normal. Figura 15b: valor médio da expressão de cinase de colina alfa, representado como as unidades de expressão relativa do gene calculada a partir do nível de mRNA com o método 2-AAct) em indivíduos sem metástases (primeira barra, marcada como "NÃO") ou com metástases (segunda barra, marcada como "SIM"). Figura 15c: evolução da probabilidade de sobrevivência sem doença de acordo com o número de meses decorridos nos doentes com nódulos linfáticos (linha inferior, marcada com traços cinzentos, t) ou sem nódulos linfáticos (linha superior, marcada com traços negros, t).

Figura 16: Expressão de cinase de colina alfa em linhas celulares derivadas do cancro do pulmão. Figura 16a: RNA mensageiro da cinase de colina alfa em linhas celulares derivadas de NSCLC (H1299 e H460) ou SCLC (H510 e H82) tipo cancro, detectada por PCR quantitativa em tempo real, representada como o logaritmo de base 10 da proporção entre a quantidade detectada e a quantidade presente em células epiteliais brônquicas primárias normais (BEC). Figura 16b: proteína alfa da cinase de colina detectada por imunoensaio com um anticorpo monoclonal em células epiteliais brônquicas normais (BEC) e em linhas celulares derivadas de cancro do pulmão H460, H1299, H510 e H82; o sinal obtido para a tubulina nestas mesmas amostras é representado imediatamente sob esta. Figura 16c: actividade de cinase de colina representada pelo sinal de PCho marcado 9 7961 radioactivamente, detectado por micrograma de proteína após 30 minutos, criado a partir de colina marcada em cada uma das linhas celulares indicadas sob as barras correspondentes.

Figura 17: Expressão do RNA mensageiro de cinase de colina alfa em tecido de tumores extraídos a partir de doentes com cancro do pulmão NSCLC em estádios precoces, detectada por PCR quantitativo em tempo real, representado como o logaritmo de base 10 da proporção entre a quantidade detectada e a quantidade presente numa amostra de tecido normal.

Figura 18: Evolução da probabilidade de sobrevivência de doentes com cancro do pulmão ao longo do tempo, representada em meses, no evento de a expressão de cinase de colina alfa ser detectada (linhas a tracejado, - t -) ou não detectada (linhas contínuas, t) . A sobrevivência global de doentes nos estádios I até IV (gráfico localizado na parte esquerda superior), sobrevivência de doentes sem doença nos estádios I até IV (tempo que decorre desde o momento em que os doentes são operados até sofrerem uma recaída) (gráfico localizado na parte esquerda inferior), sobrevivência no caso de cancro nos estádios IA-IIIA (gráfico localizado na parte direita superior) e sobrevivência livre de doença no caso dos estádios IA-IIIA (gráfico localizado na parte direita inferior). 10 7961

Figura 19: Expressão de cinase de colina alfa em linhas celulares derivadas do cancro da bexiga. Figura 19a: RNA mensageiro da cinase de colina alfa em linhas celulares derivadas de cancro da bexiga detectada por PCR quantitativo em tempo real, representado como o logaritmo de base 10 da proporção entre a quantidade detectada e a quantidade presente em células UrotSa da bexiga imortalizadas normais; da esquerda para a direita, as barras correspondem a linhas HT1376, J82, SW780, TCCSup e UMVC3. Figura 19b: proteína alfa da cinase de colina detectada por imunoensaio com um anticorpo monoclonal em células da bexiga imortalizadas normais (UrotSa) e em linhas celulares derivadas de cancro da bexiga TCCsup, J82, UMVC3, SW789 e HT1376, assim como num controlo negativo (células Hek293T) e num controlo positivo (células Hek-ChoK, transfectadas com um plasmídeo que expressa a cinase de colina alfa); o sinal obtido para a tubulina nas mesmas amostras é representado imediatamente sob esta. Figura 16c: actividade de cinase de colina representada pelo sinal de PCho marcado radioactivamente detectado por micrograma de proteína após 30 minutos, criados a partir de colina, marcada em cada uma das linhas celulares indicada sob as barras correspondentes.

Figura 20: Expressão de cinase de colina alfa em doentes com cancro da bexiga. Figura 20a: Valores médios da expressão obtidos a partir de tecidos tumorais em 90 doentes por meio de "microarray" U133 Plus 2.0 da Affymetrix, obtido nos diferentes grupos 11 7961 classificados de acordo com o valor do factor de indução: uma indução de 1 até 3 vezes (primeira barra), uma indução de 3 até 8 vezes ou uma indução de 8 até 24 vezes (terceira barra). Figura 20b: RNA mensageiro da cinase de colina alfa em 20 doentes com cancro da bexiga, detectado por PCR guantitativo em tempo real, representado como logaritmo de base 10 da proporção entre a guantidade detectada e a guantidade presente em células UrotSa da bexiga normais imortalizadas; a linha horizontal representa o nível a partir do qual existe uma associação com um prognóstico de evolução pior para o doente.

Figura 21: Relação entre a expressão de cinase de colina alfa e a presença de nódulos e/ou metástases.

Figura 21a: Expressão media dos níveis de cinase de colina alfa em doentes negativos e positivos em relação à presença de nódulos linfáticos (valores marcados com caixas em branco), ou metástases (valores marcados com círculos a preto, ·); as linhas direitas unem os valores médios que correspondem a indivíduos positivos ou negativos com respeito às características consideradas como auxiliares na observação da diferença no nível entre os grupos). Figura 21b: proporção dos doentes com metástases (barras com cor escura contínua,|) e sem metástases (barras com marcas de barras, //) em grupos de doentes classificados de acordo com o nível de expressão de cinase de colina alfa: baixo (par de barras na esquerda), intermédio (par de barras localizada no meio do gráfico) ou 12 7961 elevado (par de barras localizadas no lado direito do gráfico).

Figura 22: Esquema operacional da construção com base no qual o RNA de interferência pode ser sintetizado. Na presença de repressor (área esquerda, "Sem Expressão", liga-se à construção e previne a síntese de RNA); na presença de um indutor (doxociclina), liga-se ao repressor, prevenindo a sua ligação à construção de interferência e permitindo a síntese do RNA de interferência (área direita, "Expressão").

Figura 23: Proliferação de células MDA-MB-231 (linha superior das placas) e Ch-ind-1 (linha inferior das placas) em condições que permitem o crescimento (coluna de "Controlo") ou na presença dos inibidores químicos da cinase de colina MN58b (coluna do meio) ou RSM936 (coluna da direita).

Figura 24: Comportamento de células MDA-MB-231 (barras marcadas como "MDA") e Ch-ind-1 (barras marcadas como "Chindl") na ausência ("-") ou presença " + " de 10 yg/mL de doxociclina, após 10 dias ("10d") ou 20 dias ("20d"). A: Efeito na inibição genética da cinase de colina alfa de acordo com a proporção entre os níveis de cinase de colina alfa e GAPDH; B: Efeito na proliferação celular, de acordo com a proporção entre os níveis de pCNA e GAPDH; C: Viabilidade celular das células Ch-ind-1 na ausência (linha pontilhada) ou na presença (linha contínua) de um indutor, deduzido a partir dos valores de absorvência a 500 nm observado 13 7961 em diferentes tempos; D: Efeito na indução da apoptose, de acordo com a proporção entre o nível da proteína PARP degradado em relação ao nível total de proteína PARP (PARPdig/PARPtotal).

Figura 25: Especificidade do anticorpo policlonal contra a cinase de colina beta. A: Imunoensaio no qual um anti-soro policlonal anti-cinase de colina beta interage com amostras de células transfectadas com um vector vazio (pista denominada "vazia"), um vector de expressão de cinase de colina alfa (pista denominada "ChoKA"), um vector de expressão de cinase de colina beta (pista denominada "ChoKB") e uma proteína quimérica, cinase de colina beta-proteína verde fluorescente, vector de expressão (pista denominada "ChoKB5'GFP"). As setas indicam a altura das bandas de cinase de colina beta e da proteína quimérica. B: Imunoensaio no qual um anticorpo policlonal anti-cinase de colina alfa interactua com amostras de células transfectadas com um vector vazio (pista denominada "vazia"), um vector de expressão de cinase de colina alfa (pista denominada "ChoKA"), um vector de expressão da cinase de colina beta (pista denominada "ChoKB") e um vector de expressão de proteína quimérica, cinase de colina beta - proteína verde fluorescente (pista denominada "ChoKB5' GFP"). As setas indicam a altura da banda da cinase de colina alfa.

Figura 26: Comparação da capacidade tumorigénica das cinases de colina alfa e beta. Evolução do volume do 14 7961 tumor, medido em centímetros quadrados; de acordo com as semanas indicadas no eixo dos X, que decorrem a partir da injecção em murganhos, de células transfectadas com: um vector vazio (resultados indicados com losangos "♦"), um vector de expressão de cinase de colina alfa (resultados indicados com quadrados, ""), um vector de expressão de cinase de colina beta (resultados indicados com triângulos, "A") e um vector de expressão de cinase de colina alfa + um vector de expressão de cinase de colina beta (resultados indicados com um x, "X").

Figura 27: RNA mensageiro da cinase de colina beta em tecido de doentes com cancro do pulmão, detectados por PCR quantitativo em tempo real, representado como o logaritmo de base 10 da proporção entre a quantidade detectada e a quantidade presente no tecido normal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para facilitar o entendimento da presente invenção, o significado de alguns termos e expressões será definida abaixo no contexto da invenção:

Os termos "sujeito" ou "indivíduo" referem-se a membros de uma espécie animal de mamífero e inclui, mas não está limitado a animais domésticos, primatas e humanos; o sujeito é, de um modo preferido, um humano masculino ou feminino, que será de qualquer idade ou raça. 15 7961 0 termo "cancro" refere-se à doença que é caracterizada por um crescimento de células anormal ou descontrolado, capaz de invadir tecidos adjacentes e disseminando a órgãos distantes. 0 termo "carcinoma" refere-se ao tecido que resulta do crescimento celular anormal ou descontrolado. "carcinoma da mama", de célula mamária 0 termo "cancro da mama" ou refere-se a qualquer distúrbio proliferativa maligna. do cólon" do cólon 0 termo refere-se a proliferativa "cancro do cólon" ou "carcinoma qualquer distúrbio de célula maligna. 0 termo "cancro rectal" ou "carcinoma rectal" refere-se a qualquer distúrbio de célula rectal proliferativa maligna. 0 termo "tumor" refere-se a qualquer massa de tecido anormal que resulte de um processo neoplásico benigno (não canceroso) ou maligno (canceroso). 0 termo "gene" refere-se a uma cadeia molecular de desoxirribonucleótido que codifica uma proteína. 0 termo "DNA" refere-se a ácido desoxirribonucleico. Uma sequência de DNA é uma sequência de desoxirribonucleótidos. 16 7961 0 termo "cDNA" refere-se a uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de mRNA. 0 termo "RNA" refere-se a ácido ribonucleico. Uma sequência de RNA é uma sequência de ribonucleótidos. 0 termo "mRNA" refere-se a ácido ribonucleico mensageiro, que é a fracção do RNA total que traduz proteínas. 0 termo "mRNA transcrito a partir de" refere-se à transcrição do gene (DNA) em mRNA como um primeiro passo de modo que o gene é expresso e traduzido numa proteína. 0 termo "sequência de nucleótidos" ou "sequência nucleotídica" indistintamente refere-se a uma sequência de ribonucleótidos (RNA) ou uma sequência de desoxirribonucleótidos (DNA). 0 termo "proteína" refere-se a uma cadeia de aminoácidos molecular, ligada através de ligações covalentes ou não covalentes. 0 termo inclui todas as formas de modificações pós-tradução, por exemplo glicosilação, fosforilação ou acetilação.

Os termos "péptido" e "polipéptido" referem-se a cadeias de aminoácidos moleculares que representam um fragmento de proteína. Os termos "proteína" e "péptido" são utilizados indistintamente. 17 7961 0 termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que apresenta actividade de ligação especifica para uma molécula alvo, que é referida como um "antigénio". 0 termo "anticorpo" compreende anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais, quer intactos ou fragmentos destes; e inclui anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos de origem não humana. Os "anticorpos monoclonais" são populações homogéneas de anticorpos altamente específicos que são dirigidos contra um único sítio de antigénio "determinante". Os "anticorpos policlonais" incluem populações heterogéneas de anticorpos que são dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. 0 termo "epitopo", como é aqui utilizado na presente invenção, refere-se a um determinante antigénico de uma proteína, que é a sequência de aminoácidos da proteína que um anticorpo específico reconhece. 0 termo "alvo terapêutico" refere-se a sequências de nucleótidos ou péptidos contra as quais pode ser concebido um fármaco ou composto terapêutico e clinicamente aplicado. 0 termo "antagonista" refere-se a qualquer molécula inibindo a actividade biológica da molécula antagonizada. Exemplos de moléculas antagonistas incluem, entre outras, proteínas, péptidos, variações de sequência peptídica natural e moléculas orgânicas pequenas (com peso molecular inferior a 500 Daltons). 0 termo "valores de referência normais" utilizado na presente invenção refere-se ao nível de certas proteínas, 18 7961 mRNA ou outros metabolitos do corpo presentes num indivíduo saudável. 0 termo tecido normal utilizado na presente invenção refere-se a um tecido não canceroso, incluindo culturas de células comerciais. A presente invenção baseia-se na descoberta de a expressão da proteína alfa da cinase de colina aumentar em processos tumorais, e especialmente no cancro do pulmão, mama e colo-rectal. Assim como na descoberta surpreendente de que a sobre-expressão da referida proteína induz tumores in vivo e consequentemente que a inibição da expressão e/ou actividade desta enzima é um método excelente para o tratamento de cancro, especialmente para cancro do pulmão, mama e colo-rectal. A cinase de colina alfa, por isso, é um bom alvo terapêutico potencial em tumorigénese humano.

Neste sentido, é revelado em primeiro lugar um método in vitro para detectar a presença de cancro num indivíduo, de um modo preferido cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, para determinar o estádio ou severidade do referido cancro no indivíduo, ou para monitorizar o efeito da terapia administrada a um indivíduo que possui o referido cancro, compreendendo: a) a detecção e/ou quantificação da proteína alfa da cinase de colina, do mRNA do gene da cinase de colina alfa ou o cDNA correspondente numa amostra do referido indivíduo, e 19 7961

b) a comparação da quantidade de proteína alfa da cinase de colina, í a quantidade de mRNA do gene da cinase de colina alfa ou a quantidade do cDNA correspondente detectado numa amostra de um indivíduo; com a quantidade de proteína alfa da cinase de colina, com a quantidade do mRNA do gene da cinase de colina alfa ou com a quantidade do cDNA correspondente detectada nas amostras de indivíduos de controlo, ou em amostras anteriores do mesmo indivíduo ou com os valores de referência normais. 0 método proporcionado aqui revelado possui sensibilidade e especificidade elevadas, e baseia-se em sujeitos ou indivíduos diagnosticados com cancros, de um modo preferido cancro do pulmão, mama e colo-rectal, possuindo níveis de mRNA transcrito elevados do gene da cinase de colina alfa, ou concentrações elevadas da proteína codificada pelo gene da cinase de colina alfa (proteína alfa da cinase de colina), em comparação com os níveis correspondentes em amostras de sujeitos sem história médica destes carcinomas. Todavia, a expressão em humanos do gene da cinase de colina beta não está correlacionado com qualquer um dos tipos de cancro previamente mencionados.

0 presente método compreende um passo para obter a amostra do indivíduo. Podem ser processadas diferentes amostras de fluido, tais como por exemplo: urina, sangue, plasma, soro, fluido da pleura, líquido ascítico, fluido sinovial, bílis, suco gástrico, fluido cerebrospinal, fezes, saliva, fluidos de amostra de broncoscopia, etc. A 20 7961 amostra pode ser obtida através de qualquer método convencional, de um modo preferido ressecção cirúrgica.

As amostras podem ser obtidas a partir de sujeitos previamente diagnosticados ou não diagnosticados, com um certo tipo de cancro; ou também a partir de um sujeito que sofre tratamento, ou foi previamente tratado para um cancro, particularmente para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal. 0 presente método compreende ainda um passo de extracção de amostra, quer para obter o extracto de proteína da amostra ou para obter o extracto de RNA total. Um destes dois extractos representa o material de trabalho para a fase seguinte. Os protocolos para extrair a proteína total ou RNA total são bem conhecidos do especialista na arte (Chornczynski P. et al., Anal. Biochem., 1997, 162: 156; Chornczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532; Molina, M.A., et al., Câncer Res.r 1999, 59: 4356-4362).

Pode ser utilizado qualquer ensaio convencional no quadro da invenção para detectar um cancro, desde que possa medir os níveis de mRNA transcrito in vitro do gene da cinase de colina alfa ou do seu cDNA complementar, a concentração da proteína alfa da cinase de colina em amostras recolhidas a partir dos indivíduos a serem analisados e de indivíduos de controlo.

Por isso, é revelado um método para detectar a presença de cancro, especialmente cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, para determinar o estádio ou gravidade do 21 7961 referido cancro no indivíduo, ou para monitorizar o efeito da terapia administrada a um indivíduo que possui os referidos cancros, quer com base na medição da concentração da proteína alfa da cinase de colina, ou na medição do nível de expressão do gene da cinase de colina alfa.

No caso de a intenção ser detectar a Proteína alfa da cinase de colina, o método da invenção compreende um primeiro passo para colocar o extracto de proteína a partir da amostra em contacto com uma composição de um ou mais anticorpos específicos contra um ou mais epitopos da proteína alfa da cinase de colina, e um segundo passo para quantificar os complexos formados por anticorpos e a proteína alfa da cinase de colina.

Existe uma vasta variedade de ensaios imunológicos disponível para detectar e quantificar a formação de complexos de antigénio-anticorpo específicos; foram previamente descritos vários ensaios de ligação à proteína competitivos e não competitivos, e um vasto número desses ensaios estão disponíveis comercialmente.

Por isso, a proteína alfa da cinase de colina pode ser quantificada com anticorpos tais como, por exemplo: anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, quer intactos ou seus fragmentos, "combi-corpos" e fragmentos Fab ou scFv de anticorpos específicos contra a proteína alfa da cinase de colina; sendo estes anticorpos humanos, humanizados ou de uma origem não humana. Os anticorpos utilizados nestes ensaios podem estar marcados ou não marcados; os anticorpos não marcados podem ser utilizados 22 7961 em ensaios de aglutinação; os anticorpos marcados podem ser utilizados numa vasta variedade de ensaios. As moléculas de marcação que podem ser utilizadas para marcar os anticorpos incluem radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reagentes quimioluminescentes, substratos enzimáticos ou cofactores, inibidores enzimáticos, partículas, corantes e derivados.

Existe uma vasta variedade de ensaios bem conhecidos que podem ser utilizados na presente invenção utilizando anticorpos não marcados (anticorpo primário) e anticorpos marcados (anticorpo secundário) ; estas técnicas incluem Transferência de Western, ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima), RIA (Radioimunoensaio) , EIA competitiva (Imunoensaio de enzima competitiva), DAS-ELISA (ELISA de sanduíche de anticorpo duplo) , imunocitoquimica e técnicas de imuno-histoquímica, técnicas baseadas na utilização de biochips de proteína ou "microarrays" incluindo anticorpos específicos ou ensaios baseados na precipitação coloidal em formatos tais como testes de tira. Outros meios de detectar e quantificar a proteína EFNB2 ou a proteína EDNRA incluem técnicas de cromatografia de afinidade, ensaios de ligação de ligando ou ensaios de ligação de lectina. 0 imunoensaio preferido no método aqui revelado é um ensaio de ELISA de sanduíche de anticorpo duplo (DAS-ELISA) . Qualquer anticorpo ou combinação de anticorpos, específicos contra um ou mais epitopos da proteína alfa da cinase de colina pode ser utilizado neste imunoensaio. Como um exemplo de um dos muitos formatos possíveis deste ensaio, um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou um fragmento deste anticorpo, ou uma combinação de anticorpos, 23 7961 que revestem uma fase sólida estão colocados em contacto com a amostra a ser analisada e são incubados durante um tempo adequado e em condições adequadas para formar os complexos antiqénio-anticorpo. Após uma lavagem em condições adequadas para eliminar os complexos não específicos, um reagente indicador, compreendendo um anticorpo monoclonal ou policlonal ou um fragmento deste anticorpo, ou uma combinação destes anticorpos, ligados a um composto gerador de sinal, é incubado com os complexos antigénio-anticorpo em condições adequadas e durante um tempo adequado. A presença da proteína alfa da cinase de colina na amostra a ser analisada é detectada e quantificada, caso exista, através da medição do sinal gerado. A quantidade de proteína alfa da cinase de colina presente na amostra a ser analisada é proporcional a esse sinal.

No caso de a intenção ser detectar o mRNA ou cDNA correspondente ao gene da cinase de colina alfa, e não as proteínas que eles codificam, o método da invenção para detectar o carcinoma in vitro possui vários passos. Por isso, uma vez que a amostra é obtida e o RNA total é extraído, o método da invenção, a detecção de mRNA ou do seu cDNA correspondente do gene da cinase de colina alfa, compreende um primeiro passo de amplificação do mRNA presente no extracto de RNA total, ou o cDNA correspondente sintetizado através de transcrição reversa do mRNA, e um segundo passo de quantificação do produto de amplificação do mRNA ou cDNA do gene da cinase de colina alfa. 24 7961

Um exemplo de amplificação do mRNA consiste na retrotranscrição do mRNA em cDNA (RT), seguido por reacção em cadeia da polimerase (PCR); a PCR é uma técnica para a amplificação de uma certa sequência de nucleótidos (alvo) contida numa mistura de sequências de nucleótidos. Um par em excesso de iniciadores oligonucleotidicos que hibridam com as cadeias complementares da sequência de nucleótidos alvo é utilizado na PCR. Depois, uma enzima com actividade de polimerase (polimerase de DNA Taq) estende cada iniciador utilizando como um molde a sequência de nucleótidos alvo. Os produtos de extensão são então convertidos em sequências alvo após dissociação da cadeia alvo original. Novas moléculas de iniciador hibridam e a polimerase estende-os; o ciclo é repetido para aumentar exponencialmente o número de sequências alvo. Esta técnica é descrita nas patentes US 4 683 195 e US 4 683 202. Foram previamente descritos muitos métodos para detectar e quantificar os produtos de amplificação da PCR e qualquer um destes pode ser utilizado nesta invenção. Num método preferido da invenção, o produto amplificado é detectado por electroforese em gel de agarose.

Noutro exemplo, a detecção do mRNA é realizado transferindo o mRNA para uma membrana de nylon por meio de técnicas de transferência, tais como por exemplo Transferência de Northern, e detecção deste com sondas especificas do mRNA ou do cDNA correspondente do gene das cinases de colina alfa.

Numa forma de realização particular, a amplificação e quantificação do mRNA correspondente ao gene da cinase de 25 7961 colina alfa é realizada ao mesmo tempo por meio de RT-PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR). 0 último passo do método aqui revelado para detectar os carcinomas em questão, in vitro, numa amostra a partir de um indivíduo compreende comparar a quantidade de proteína alfa da cinase de colina, a quantidade de mRNA do gene da cinase de colina alfa ou a quantidade do cDNA correspondente da amostra de um indivíduo, com a quantidade de proteína alfa da cinase de colina, a quantidade de mRNA do gene da cinase de colina alfa ou a quantidade do cDNA correspondente detectado nas amostras de sujeitos de controlo ou em amostras anteriores do mesmo indivíduo, ou com os valores de referência normais. É também revelado um método in vitro para identificar e avaliar a eficácia dos compostos para terapia do cancro; de um modo preferido para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, compreendendo: a) colocar uma cultura de células tumorais, de um modo preferido células tumorais do pulmão, mama, cólon ou rectal, em contacto com o composto candidato, nas condições adequadas e durante o tempo adequado para permitir que interactuem, b) detectar e quantificar os níveis de expressão do gene da cinase de colina alfa ou a proteína alfa da cinase de colina, e 26 7961 c) comparar os referidos níveis de expressão com aqueles das culturas de células tumorais de controlo não tratadas com o composto candidato. A quantificação dos níveis de expressão do gene da cinase de colina alfa ou a proteína alfa da cinase de colina é realizada de modo semelhante ao indicado no método da invenção para detectar a presença in vitro de cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal num indivíduo.

Quando um agente reduz os níveis de expressão do gene da cinase de colina alfa ou reverte os efeitos da expressão elevada do referido gene, de um modo preferido reduzindo os níveis de proliferação celular, este agente torna-se um candidato para terapia do cancro.

Por isso, é também revelada a utilização de sequências de nucleótidos ou de péptidos derivadas do gene da cinase de colina alfa em métodos de descoberta, identificação, desenvolvimento e avaliação da eficácia de compostos para a terapia do cancro, especialmente para cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal. É essencial salientar a importância que foi recentemente adquirida através de métodos de rastreio de fármacos com base na ligação competitiva ou não competitiva da molécula de fármaco potencial para o alvo terapêutico. É também aqui revelado a utilização de sequências de nucleótidos ou de péptidos derivadas do gene da cinase de colina alfa para detectar a presença de cancro, especialmente cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, 27 7961 para determinar o estágio ou a gravidade dos referidos cancros no indivíduo, ou para monitorizar o efeito da terapia administrada a um indivíduo que possui qualquer um destes cancros. São também aqui proporcionados agentes caracterizados por inibirem a expressão e/ou actividade da proteína alfa da cinase de colina. Estes agentes, que podem ser identificados e avaliados de acordo com a presente invenção, podem ser seleccionados a partir do grupo formado por: a) um anticorpo, ou combinação de anticorpos, específicos contra um ou mais epitopos presentes na proteína alfa da cinase de colina, de um modo preferido um anticorpo monoclonal humano ou humanizado; sendo também capaz de ser um fragmento do anticorpo, um anticorpo de cadeia simples ou um anticorpo anti-idiotipo, b) agentes citotóxicos, tais como toxinas, moléculas com átomos radioactivos, ou agentes quimioterapêuticos, incluindo mas não limitados a pequenas moléculas orgânicas e inorgânicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas anti-sentido, ribozimas, siRNAs, moléculas de hélice tripla, etc., que inibem a expressão e/ou actividade da proteína alfa da cinase de colina, e 28 7961 c) compostos antagonistas da proteína alfa da cinase de colina, inibindo uma ou mais das funções da proteína alfa da cinase de colina.

Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou vários doa agentes previamente mencionados juntamente com um ou mais excipientes e/ou substâncias transportadoras é também aqui revelado. Para além disso, a referida composição pode conter qualquer outro ingrediente activo que não inibe a função da proteína alfa da cinase de colina.

Os excipientes, substâncias transportadoras e substâncias auxiliares devem ser farmaceuticamente e farmacologicamente toleráveis, de modo a que possam ser combinados com outros compostos da formulação ou preparação e não possuem efeitos adversos no organismo tratado. As composições ou formulações farmacêuticas incluem aquelas que são adequadas para administração oral ou parentérica (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), embora a melhor via de administração dependa do estado do doente. As formulações podem estar na forma de doses únicas. As formulações são preparadas de acordo com métodos conhecidos na área da farmacologia. As quantidades de substâncias activas a serem administradas podem variar de acordo com as particularidades da terapia. É também aqui revelado um kit de diagnóstico para realizar a presente invenção. Por isso, numa forma de realização particular, a presente invenção inclui um kit compreendendo um anticorpo que reconhece especialmente a 29 7961 proteína alfa da cinase de colina e um transportador num recipiente adequado. Noutra forma de realização particular, este kit é utilizado para detectar a presença de cancro num indivíduo, de um modo preferido cancro do pulmão, da mama ou colo-rectal, para determinar o estádio ou gravidade do referido cancro no indivíduo, ou para monitorizar o efeito da terapia administrada a um indivíduo que possuía o referido cancro.

Um aspecto final da presente invenção consiste num método in vitro para diagnosticar o tempo de sobrevivência de um doente com cancro da mama, pulmão ou da bexiga, compreendendo a avaliação do nível de expressão da proteína alfa da cinase de colina numa amostra do tecido canceroso extraído a partir do doente por meio da determinação na referida amostra de pelo menos um parâmetro relacionado com a proteína alfa da cinase de colina que é seleccionada a partir do nível do seu RNA mensageiro, da concentração da referida proteína ou da actividade enzimática da referida proteína, e da comparação do valor obtido com o valor correspondente a uma ou mais amostras de tecido não canceroso normal.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1

Actividade de cinase de colina das isoformas

Como ilustrado na Figura 1, ambas as enzimas CKK2 (52 kDa, 457 aminoácidos) e CKK1 (45 kDa, 395 aminoácidos) 30 7961 possuem actividade potente de cinase de colina, determinada pela sua capacidade de produzir fosforilcolina a partir de colina na presença de ATP e magnésio (Figura IA) . Esta actividade é apresentada na sua forma recombinante, expressa em E. coli, e após a transfecção em células HEK293 humanas. Todavia, e apesar do facto de ambas as enzimas possuírem actividade de cinase de colina, os níveis intracelulares de fosforilcolina em células vivas não são alteradas igualmente, sendo virtualmente indetectáveis nas células que sobre-expressam cinase de colina beta (Figura 1B). Estes resultados sugerem que tanto a função de regulação fisiológica como a função biológica destas duas proteínas, e por isso, o seu comportamento em tumorigénese, pode ser diferencial.

Exemplo 2

Especificidade do anticorpo

Foram desenvolvidos anticorpos monoclonais e policlonais que reconhecem uma enzima de cinase de colina alfa, uma proteína que foi semi-purificada e expressa como um antigénio na fase de criação e como controlo da produção nas restantes fases do processo. Apesar de terem sido desenvolvidos contra a cinase de colina alfa, devido ao facto de ambas as enzimas (CKa e ΟΚβ) possuírem uma homologia global de 65% ao longo da sua sequência, e em algumas regiões conservadas, tais como os domínios da ligação a colina e actividade catalítica, a homologia atinge 75%, é necessário verificar que isoenzimas são capazes de reconhecer os anticorpos monoclonais e 31 7961 policlonais criados. Os autores verificaram que ambos os anticorpos monoclonais e policlonais utilizados são específicos para a cinase de colina alfa e que eles não reconhecem cinase de colina beta. Com essa finalidade ambas as proteínas cinase de colina alfa e beta foram sobre-expressas em células HEK293T humanas, e após verificar que as duas proteínas estão presentes e activas (Figura 2A) , a sua análise foi realizada através de técnicas de imunodetecção (Transferência de Western) com ambos os anticorpos policlonais com os quais foram realizados os estudos anteriores [Ramirez de Molina, A., Gutiérrez, R., Ramos, Μ. A., Silva, J. M., Silva, J., Sánchez, J. J., Bonilla, F., Lacal, J. C. Oncogene 21, 4317-4322 (2002); Ramirez de Molina, A., Rodriguez-González, A., Gutiérrez, R., Martinez-Pinero, L., Sánchez, J. J., Bonilla, F., Roseli, R., Lacal, J. C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 580-583 (2002)], e com os novos anticorpos monoclonais criados contra cinase de colina alfa. Como é conhecido na Figura 2B, que apresenta um exemplo com dois destes anticorpos, mesmo através de sobre-expressão da cinase de colina beta em condições nas quais a actividade é aumentada 80 vezes, nenhum dos anticorpos reconhece esta isoforma, sendo a cinase de colina alfa altamente reconhecida tanto nas mesmas condições como nos níveis de controlo endógeno em todos os casos. Estes resultados indicam que os estudos anteriores do grupo no qual o anticorpo policlonal foi utilizado definem a cinase de colina alfa como a isoenzima sobre-expressa em linhas celulares derivadas de tumores humanos e nos próprios tumores analisados. 32 7961

Estes resultados não eram esperados uma vez que, por definição, os anticorpos policlonais reconhecem diferentes epitopos na molécula e as sequências das cinases de colina alfa e beta têm 65% de homologia, em algumas regiões que atingem até 75%, especialmente nas regiões de domínio de consenso nas quais a região catalítica e o substrato e a região de ligação do ATP estão localizados.

Exemplo 3

Especificidade para os tumores: Alteração da cinase de colina alfa em diferentes tumores humanos. A disponibilidade dos anticorpos com especificidade comprovada contra a cinase de colina alfa permitiu estudar a possível alteração na expressão de cinase de colina alfa em alguns dos tumores mais importantes hoje em dia nos países desenvolvidos, tais como cancro da mama, cólon, e do pulmão. Para realizar este estudo, foram realizados cortes de parafina em secções de amostras a partir de entre 38 e 50 doentes diferentes, cada um dos quais teve um destes tipos de cancro, e a expressão da cinase de colina alfa foi analisada por meio de imuno-histoquímica (IHQ), uma técnica que permite detectar e identificar " in situ" componentes biomoleculares que são uma parte integral de células e tecidos e que podem ser realizados de um modo automatizado no Departamento de Anatomia Patológica de qualquer hospital. Nas amostras da mama, cólon ou pulmão destes doentes, foi descoberto que: 33 7961 - em todos os casos, a coloração do tumor com o anticorpo que reconhece a cinase de colina alfa é altamente especifica, permitindo uma distinção clara entre o tecido tumor e o tecido normal adjacente. - não há caso em que o tecido normal core. - a enzima cinase de colina alfa é sobre-expressa com uma incidência que varia entre 62% e 100% neste tipo de tumor, demonstrando o envolvimento elevado desta isoforma, cinase de colina alfa, em tumorigénese humana.

Na Figura 3, pode ser observado um exemplo dos resultados obtidos para cancro do pulmão de célula grande (NSCLC), que hoje envolve 80% dos casos de cancro do pulmão. Como pode ser observado, ocorre a coloração do citoplasma da cinase de colina alfa, especifica para os nódulos tumorais e que, como previamente indicado cora especificamente 62% das amostras.

Segundo este conceito, foi realizado um estudo semelhante em 38 doentes com cancro da mama, a sobre-expressão da cinase de colina alfa especificamente em tecido tumoral em 97% dos casos novamente a serem observados (Figura 4) .

Finalmente, o estudo da expressão da cinase de colina alfa em cancro do cólon também foi realizado, para o qual foram realizados cortes em parafina de secções de 40 34 7961 amostras a partir de diferentes doentes com cancro do cólon com mais de 4 anos de monitorização. A análise começou com carcinomas in situ nos estágios I, II, III e IV. De um modo semelhante ao caso anterior, o tecido normal de cada preparação adjacente ao tecido tumor foi utilizado como tecido normal. A coloração positiva nos tecidos normais não foi obtida em nenhum caso em qualquer uma das 40 amostras, confirmando a elevada especificidade da coloração da cinase de colina alfa no tecido tumoral, na qual a sobre-expressão da enzima foi novamente observada em todos os casos (Figura 5A). Estes resultados apoiam o envolvimento elevado desta isoforma desta enzima no cancro do cólon. Para além disso, este resultado conduziu à análise de lesões pré- neoplásicas, ACFs e pólipos com diferentes graus de displasia, em que os resultados demonstram claramente que a sobre-expressão de cinase de colina alfa é um evento precoce no processo de tumor to tecido do cólon que ocorre no momento da displasia, sugerindo o seu potencial comportamento como um gene "guarda-portão" nestes tumores e por isso a sua relevância como um potencial novo alvo terapêutico. A Figura 5B apresenta um polipo no qual pode ser observado como a coloração no tecido normal é virtualmente indetectável, e como a displasia começa a ocorrer (células binucleares) a coloração aumenta, tornando-se mais intensa na massa do tumor.

Exemplo 4

Especificidade para tumores: Comportamento oncogénico da enzima cinase de colina alfa. 35 7961

Dada a incidência muito elevada de desregulação da cinase de colina alfa em alguns dos tumores humanos hoje em dia mais importantes, foi realizado um estudo para determinar se esta proteína isoladamente possui capacidade oncogénica, i. e., se a cinase de colina alfa possui actividade oncogénica. Para realizar este estudo, foi primeiro estudado se este gene confere capacidade de crescimento num meio independente da ligação, que envolve a medição da sua capacidade de transformação. As células HEK293T humanas foram transfectadas com um vector vazio como controlo e com uma expressão de cinase de colina alfa vector, e foram semeadas em agar mole. Como pode ser observado na Figura 6, a sobre-expressão desta proteína é suficiente para induzir a transformação oncogénica de ambas as células HEK293T humanas e de células MDCK de cão epiteliais.

Dado que a cinase de colina alfa possui actividade de transformação em células HEK293T humanas, o seu potencial oncogénico foi analisado in vivo. Com essa finalidade, os murganhos imunodeprimidos (Nu/Nu) foram injectados com um milhão de células HEK293T humanas que sobre-expressam quer o vector vazio como um controlo, ou um vector de expressão de cinase de colina alfa. 0 crescimento tumoral foi monitorizado pelo menos duas vezes por semana durante 50 dias após a injecção. Embora as células de controlo não tenham induzido qualquer tumor em qualquer um dos murganhos injectados, as células que sobre-expressam cinase de colina alfa induziram tumores em 8 dos 30 murganhos injectados (26%), que atingiram uma média de 0,6 cm3 após 45 dias (Figura 7). Estes resultados demonstram que a sobre- 36 7961 expressão de cinase de colina alfa é suficiente para induzir tumores in vivo, e por isso é um bom alvo terapêutico potencial em tumorigénese humana. Para verificar se os tumores criados por cinase de colina alfa mantiveram a sua expressão e actividade aumentadas, os tumores foram extraídos cirurgicamente, lisados e os níveis de actividade e expressão desta enzima foram determinados em relação aos níveis das suas células HEK293T parentais como controlo. Como pode ser observado na Figura 8, todos os tumores analisados mantêm níveis de expressão e actividade enzimática elevados de um modo semelhante àquele que foi obtido antes da inoculação, demonstrando que a sobre-expressão de cinase de colina alfa induz tumorigénese in vivo.

Exemplo 5

Especificidade farmacológica

Uma vez que a actividade oncogénica da isoforma da cinase de colina alfa, assim como a sua incidência elevada de sobre-expressão em tumores humanos se verificaram, foi então estudado se o efeito anti-tumoral do inibidor MN58b [Hernández-Alcoceba, R., Saniger, L., Campos, J., Núnez, M. C., Khaless, F., Gallo, M. Á., Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15, 2289-2301 (1997); Hernández-Alcoceba, R.,

Fernández, F., Lacal J. C. Câncer Res. 59, 3112-3118 (1999); Ramirez de Molina A., Banez-Coronel M., Gutiérrez R., Rodriguez González A., Olmeda D., Megias D., Lacal J. C. Câncer Res. 64:6732-6739 (2004)] é específico para esta isoforma da cinase de colina alfa ou se, em contraste, pode 37 7961 também ser atribuído à sua possível interacção com a isoforma de cinase de colina beta. Esta verificação é necessária porque as duas isoformas de cinase de colina alfa e cinase de colina beta partilham até 75% de homologia nos domínios de ligação ao substrato e na região catalítica. Com esse fim, as duas isoformas da cinase de colina (CKa e ΟΚβ) foram expressas na estirpe da bactéria E. coli, que não tem actividade de cinase de colina, e por isso qualquer actividade enzimática observada é exclusivamente devida à isoforma da cinase de colina expressa de forma recombinante. Como pode ser observado na Figura 9, a actividade enzimática da cinase de colina alfa é afectada pelo tratamento com MN58b, com um efeito mais pronunciado do que o efeito exercido pelo mesmo inibidor na isoforma β. De facto, MN58b é 20 vezes mais activo contra a cinase de colina alfa do que é contra a cinase de colina beta.

Uma vez que os tumores foram gerados in vivo através de sobre-expressão da cinase de colina alfa e que MN58b é específico para esta isoforma, verificou-se se o crescimento dos tumores induzidos por ChoKcx é susceptível de inibição por MN58b. Com essa finalidade, um milhão de células HEK293T humanas transfectadas com o gene cka que apresentou uma sobre-expressão elevada da enzima cinase de colina alfa enzima foram injectadas subcutaneamente em murganhos imunodeprimidos Nu/Nu. Quando os tumores atingiram um volume de tumor de 0,1 cm3, foi iniciado o tratamento com o inibidor específico da cinase de colina alfa, MN58b, que foi administrado intraperitonealmente em soro fisiológico estéril durante 5 dias consecutivos com 9 38 7961 dias de repouso a uma dose de 5 mg/Kg. Os murganhos de controlo receberam doses de transportador equivalentes, seguindo o mesmo calendário e os tumores foram monitorizados pelo menos duas vezes por semana. Como apresentado na Figura 10, a inibição da cinase de colina alfa resulta numa forte inibição de crescimento tumoral, alcançando 80% de redução do crescimento tumoral. Estes resultados demonstram que não apenas é a sobre-expressão de cinase de colina alfa suficiente para induzir tumores in vivo, mas a proliferação de células tumorais depende da actividade da cinase de colina alfa.

Exemplo 6

Especificidade genética

Todos estes resultados suportam o potencial de cinase de colina alfa como um novo alvo terapêutico para a concepção de uma nova estratégia anti-tumoral. Todavia, os inibidores químicos podem realizar a sua acção antiproliferativa por meio de efeitos que não são do conhecimento do investigador, mesmo se eles são concebidos especificamente contra uma certa enzima, como é o caso do inibidor MN 5 8b. Existem vários casos na literatura nos quais é demonstrado que os inibidores concebidos especificamente contra uma cinase também afectam outras cinases que não estão nem de perto relacionadas uma com a outra. Existe uma abordagem desenvolvida recentemente nos últimos anos, que permite estabelecer mais precisamente os efeitos da interferência com uma particular enzima por meio da utilização de siRNA (RNA pequeno de interferência) que 39 7961 são capazes de eliminar com precisão e selectivamente o mRNA de uma certa proteína sem afectar as restantes proteínas celulares. Neste caso i verificou-se que a interferência farmacológica por meio da utilização do inibidor MN58b, específico contra a cinase de colina alfa, possui confirmação ao nível genético por meio da inibição específica de cinase de colina alfa através da técnica de siRNA. Esta técnica iria permitir validar definitivamente ChoKa como um novo alvo terapêutico no cancro. Para este objectivo, foi criado um oligonucleótido capaz de hibridar com o RN A mensageiro da cinase de colina alfa (que foi denominado siCHKA), e por isso é capaz de bloquear especificamente a expressão desta proteína. Foi primeiro verificado que este siRNA bloqueia eficientemente a expressão da cinase de colina alfa em células HEK293T humanas, ambas a proteína endógena e uma ChoKa fundidas a GST e transfectadas nas mesmas células (Figura 11).

Uma vez que foi verificado que este RNA de interferência específico para a cinase de colina alfa é verdadeiramente capaz de bloquear eficientemente a expressão desta proteína, o seu efeito nas células tumorais derivadas de um carcinoma da mama humano, MIDAMI3-231, no qual foi previamente descrito que a inibição farmacológica da cinase de colina com MN58b induziu um forte efeito anti-tumoral devido à indução de apoptose, foi então verificado. Como pode ser observado na Figura 12, apesar da baixa eficiência de transfecção obtida nestas células, observou-se que a transfecção de siCHKA em MDA-MB-231 implica a inibição de ambas, a expressão de cinase de colina alfa e da sua actividade enzimática. Para verificar que o efeito 40 7961 da inibição genética da cinase de colina alfa por meio de siRNA é semelhante à obtida aquela obtida por meio de inibição farmacológica com MN58b, demonstrando assim inequivocamente a especificidade do efeito na cinase de colina alfa, foi determinada a viabilidade celular após transfecção com siCHKA interferência. Como ocorre após tratamento das células tumorais com MN58b, uma redução na viabilidade celular é observada associada à morte devido à apoptose que é especifica para as células transfectadas com o agente de interferência da cinase de colina alfa (Figura 13) .

Finalmente, como ocorre com RMN58b, foi verificado que a expressão de siCHKA de interferência, especifica para a cinase de colina alfa, não possui nenhum efeito sobre a viabilidade das células mamárias humanas primárias normais HMEC (células epiteliais mamárias humanas). Nestas células, a expressão da linha de base desta proteína é muito baixa, dado que, como previamente descrito, as células tumorais sobre-expressam constitutivamente a cinase de colina alfa. Todavia, apesar de a sua linha de base de expressão baixa de cinase de colina alfa nas células HMEC primárias, é obtida uma interferência clara da expressão da enzima da cinase de colina alfa, e pode ser observado como estas células, contrariamente ao que ocorre nas células tumorais, não morrem devido à apoptose, mas o seu ciclo é interrompido (Figura 14) , um resultado que é idêntico ao observado nas mesmas células tratadas com o inibidor PAN58b [Rodriguez-González A., Ramirez de Molina A, Fernández F., Ramos M.A., Nunez, M. del C., Campos, J. M, Lacal J.C. Oncogene 22:8803-8812 (2003); Rodriguez-González A; Ramirez 41 7961 de Molina A, Fernández F., Lacal JC. Oncogene 23: 8247-8259 (2004); Rodriguez-González A., Ramirez de Molina A., Banez-Coronel M., Megias D., Núnez M.C e Lacal J.C Int. J. Oncol 26:999-1008 (2005)].

Exemplo 7

Efeito da cinase de colina ot em cancro da mama: Incidência da sobrevivência

Para se poderem obter resultados quantitativos que confirmem o envolvimento da cinase de colina α na criação e evolução de tumores, foram realizados ensaios adicionais que quantificam a sua expressão em doentes com os tipos de cancro com os quais a cinase de colina α parece estar especificamente relacionada (cancro da mama, pulmão e bexiga) e a sua possível relação com o prognóstico da evolução do referido doente.

Por um lado, a análise quantitativa da expressão da cinase de colina α foi realizada através do isolamento do RN A mensageiro a partir de amostras de doentes. Com essa finalidade, foram realizadas reacções de PCR quantitativo em tempo real automatizadas, com sondas Taqman específicas que apenas reconhecem o objecto de estudo do RNA mensageiro, o RNA mensageiro correspondente a ChoKa. Os resultados obtidos são representados numa escala logarítmica de base 10 em relação a uma amostra de controlo de tecido normal. 42 7961

No caso de resultados obtidos em relação ao cancro da mama, os resultados obtidos são apresentados na Figura 15a. Pode ser observado que as amostras com níveis acima da activação mediana de ChoKa correspondem aos doentes com um prognóstico pior (presença de nódulos linfáticos, desenvolvimento de metástases, sobrevivência inferior). Estes resultados estão confirmados com os dados nas Figuras 15b e 15c. Na Figura 15b, preparada com os resultados obtidos em 63 doentes com cancro da mama, pode ser observado como o valor médio da expressão de ChoKa (calculado como unidades de expressão relativa do gene, calculados a partir do nível de mRNA com o método 2-AAct (Livak, K.J. e Schmitttgen, T. D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402- 408)) é muito superior em doentes que apresentam metástases em comparação com os doentes que não apresentam. Se a probabilidade de sobrevivência destes doentes é representada de acordo com a presença de nódulos linfáticos, que está significativamente associada com um aumento na expressão de ChoKa em relação aos controlos (p < 0,001), pode ser observado numa curva de Kaplan Meier clássica (Kaplan EL, Meier P, Nonparametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoe., 53:457-481 (1958) ) como a probabilidade de sobrevivência diminui significativamente à medida que a presença de nódulos linfáticos positivos aumenta (p=0, 046) (Figura 15c), sendo a mesma tendência observada quando a sobrevivência do doente é representada de acordo com a expressão de ChoKa (p=0, 059) . 43 7961

Exemplo δ

Efeito da cinase de colina ot em cancro do pulmão: nível de sobre-expressão e incidência na sobrevivência

Foram realizados vários testes para complementar o estudo sobre a importância da sobre-expressão da cinase de colina a em cancro do pulmão.

Primeiro, os níveis de mRNA correspondentes à referida enzima em linhas celulares derivadas de doentes com cancro do pulmão foram novamente detectados por meio de reacções automatizadas de PCR quantitativo em tempo real com sondas Taqman específicas. Elas foram realizadas tanto em linhas celulares correspondentes ao tipo de cancro do pulmão mais comum (75-85%), não microcítico ou NSCLC (cancro de pulmão não de célula pequena), representado pelas linhas H460 e H1299, e em linhas que correspondem a outro tipo de cancro, microcítico ou SCLC (cancro do pulmão de célula pequena), representadas pelas linhas H510 e H82, sendo os resultados representados numa escala logarítmica relacionados com células epiteliais brônquicas humanas primárias normais, BEC. Os resultados são apresentados na Figura 16a. Estes resultados foram complementados com os resultados sobre a detecção dos níveis de proteína em cada uma destas linhas celulares por meio de imunoensaio com um anticorpo monoclonal (Figura 16b) e os resultados na actividade enzimática detectável nas mesmas linhas através da medição do produto marcado radioactivamente (PCho) criado após 30 minutos a partir do substrato marcado (Cho) (Figura 16c) . Um aumento em relação aos controlos, que é particularmente 44 7961 considerável no caso de as linhas SCLC, especialmente H510, é observado em todos os casos. 0 efeito antiproliferativo da inibição de ChoK nas referidas linhas celulares provocado pela adição de MN58b foi também verificado, obtendo os resultados apresentados na Tabela seguinte, na qual os números entre parêntesis indicam a sensibilidade de cada célula comparados com as células primárias. As diferenças entre as células primárias e as quatro linhas celulares derivadas de tumores foram significativas (p:<0,001) em todos os períodos de tempo analisados.

Tabela 1.- Efeito antiproliferativo da inibição de ChoK contra as linhas celulares derivadas de tumores do pulmão humano Célula 1 48h IC50 (μΜ) 72h IC50 (μΜ) 114h IC50 (μΜ) Primárias BEC 40,5 ± 6,2 18,3 ± 4,8 4,2 ± 0,8 Primárias HMEC 44,7 ± 4,95 20,9 ± 2,7 3,4 ± 0,13 NSCLC H1299 10,3 ± 2,5 (4) 2,7+0,7 (8) 0,9 ± 0,1 (4) NSCLC H460 7,03 ± 2,03 (6) 2,6 ± 0,8 (8) 1,1 ± 0,1 (3) SCLC H510 1,1 ± 0,1 (41) 0,4 ± 0,05 (53) 0,1 ± 0,03 (27) SCLC H82 1,9 ± 0,2 (24) 0,7 ± 0,04 (27) 0,27 ± 0,01 (12)

Estes resultados foram complementados com estudos de sobre-expressão de ChoKa em amostras de tumor humano de doentes com cancro do pulmão, especificamente em tecido de doentes com NSCLC a partir dos quis o tumor foi extraído num estádio precoce. A Figura 17 apresenta os resultados obtidos na análise por PCR quantitativa em tempo real do 45 7961 RNA mensageiro correspondente a ChoKa nos referidos doentes que foram operados em estágios precoces, resultados que demonstram que nesse estágio precoce da doença, ChoKa é já sobre-expresso em relação ao tecido normal em 53% dos casos. Novamente, quando a relação entre a expressão de ChoKa e a gravidade do cancro (estágio e presença ou ausência de metástases) é analisada, foi observado que a expressão elevada de ChoKa está associada de malignidade tumoral mais elevada, como apresentado na Tabela 2:

Tabela 2.- Sobre-expressão de ChoKa de acordo com a gravidade do cancro do pulmão

ChoKa N °. e % de doentes com níveis normais N° . e % de doentes com sobre-expressão P Estágio IA-IIIAa 18 (60%) 12 (40%) 0, 019 11IB-I Vb 0 (0%) 6 (100%) Metástase Não 18 (69,2%) 8 (30,8%) 0,0015 Sim 0 (0%) 7 (100%) a Estágios nos quais o tumor é pequeno, há pouco ou nenhum envolvimento de nódulos e não há presença de metástases b Estágios com tumores maiores com envolvimento dos nódulos e presença de metástases

Tal como no caso de cancro da mama, nos estágios iniciais de NSCLC a sobre-expressão de ChoKa em cancro do pulmão está associada a um prognóstico pior, como pode ser observado nos gráficos apresentados na Figura 18. Pode ser observado nessas figuras como a probabilidade de sobrevivência é mantida no valor 1 ao longo do tempo nos doentes em que a expressão directa de ChoKa não é 46 7961 detectada, enquanto que nos doentes em que a sobre-expressão de ChoKa é detectada, a probabilidade diminui, apresentando um valor mediano de 9 meses quando a sobrevivência sem doença é avaliada, i. e., o tempo que decorre desde quando os doentes são operados até sofrerem uma recaída.

Exemplo 9

Efeito da cinase de colina num cancro da bexiga: nível de sobre-expressão e incidência na sobrevivência

Foram também realizados estudos análogos em doentes com cancro da bexiga. Primeiro, os níveis de mRNA que correspondem à referida enzima em linhas celulares derivadas dos doentes com cancro da bexiga foram detectados, novamente por meio de reacções automatizadas de PCR quantitativa em tempo real com sondas Taqman específicas, semelhantes às descritas no Exemplo 8 para o caso de cancro do pulmão. Foram utilizadas as linhas HT1376, J82, SW780, TCCSup e UMVC3, sendo os resultados representados numa escala logarítmica em relação a células da bexiga normais imortalizadas, UrotSa. Os resultados são apresentados na Figura 19a. Os dados são complementados com a detecção de dados relacionados com o nível de proteína em cada uma dessas linhas celulares por meio de imunoensaio com um anticorpo monoclonal (Figura 19b) e a avaliação da actividade enzimática detectável nessas células (Figura 19c). Pode ser observado que as diferentes linhas celulares apresentam níveis aumentados de ChoKa em relação a células UrotSa normais imortalizadas, assim como o aumento da 47 7961 expressão da proteína nas linhas celulares derivadas de cancro da bexiga é também acompanhado por um aumento semelhante na actividade da enzima cinase de colina.

Adicionalmente, o efeito antiproliferativo da inibição de ChoK nestas linhas celulares provocado pela adição de MN58b foi também verificado, obtendo-se os resultados apresentados na Tabela seguinte, na qual os números entre parêntesis indicam o factor de indução em relação à linha celular com mais baixos níveis de ChoK, TCCSup, na medida em que os resultados obtidos para UrotSA não foram considerados como sendo suficientemente fiáveis para realizar a comparação em relação a estes.

Tabela 3.- Efeito antiproliferativo da inibição de ChoK contra linhas celulares derivadas de cancro da bexiga humano

Linha celular TCCSup HT1376 UMUC3 J82 SW780 IC5 0 (μΜ) 3,7 (1) 2,49 (1,5) 1, 98 (1,86) 1, 08 0, 91 (96 h) (3,4) (4,1) Expressão de 2,5 (1) 5 (2) 5 (2) 12,6 (5) 12,6 (5) ChoK Actividade 3,6 (1) 7 (1,9) 9 (2,5) 14,5 (4) 15 (4,2) de ChoK

Além disso, para estabelecer paralelismos com os efeitos observados in vivo, a expressão de ChoKa em tecido tumoral em 90 doentes com cancro da bexiga foi analisada utilizando tecnologia de "microarray", especificamente o U133 Plus 2.0 chip da Affymetrix. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 20a. Na referida tabela pode ser observado como pouco mais de metade, 49 doentes, 48 7961 apresentaram um factor de indução de expressão entre 1 e 3 vezes; 25 doentes apresentaram um factor de indução de expressão entre 3 e 8, enquanto que em 12 deles, o factor de indução de expressão foi desde 8 até 24 vezes.

Os dados obtidos com o "microarray" foram validados por meio de um ensaio de PCR quantitativo em tempo real (ensaio com sondas Taqman), cujos resultados são apresentados na Figura 20b. No referido ensaio, foi utilizado RN A comercial de tecido de bexiga humana normal como uma referência, utilizando GAPDH como controlo endógeno. Em 18 das 20 amostras analisadas (10 das quais corresponderam aos 10 doentes com baixa expressão de ChoKa e as outras 10 corresponderam aos 10 doentes com a expressão mais elevada), os resultados da expressão de ChoK coincidiram em relação ao "microarray" Affymetrix e a análise com sondas Taqman. A incidência da sobre-expressão de ChoKa em tumores foi de 55%. Os doentes com sobre-expressão foram os mais metastáticos. A relação entre a sobre-expressão de ChoKa e a progressão de metástases foi confirmada com os resultados da expressão de ChoKa de todos os doentes obtidos a partir de "arrays", os resultados dos quais são apresentadas as Figuras 21a e 21b. A Figura 21a apresenta a variação nos niveis médios de expressão de ChoKa entre os doentes negativos e positivos em relação à presença de nódulos linfáticos (valores unidos pela linha com quadrados brancos nas extremidades) ou o desenvolvimento de metástases (valores unidos pela linha com círculos a cheio nas extremidades). A Figura 21b, contudo, apresenta uma 49 7961 representação gráfica, representando a variação na proporção de doentes com metástases (barras com cor escura continua |) , e sem metástases (barras com marcadores de barras, //) nos grupos de doentes com baixa expressão de ChoKa (baixa (par de barras à esquerda), expressão intermédia de ChoKa (par de barras localizadas no meio do gráfico) ou expressão elevada de ChoKa (par de barras localizadas no lado direito do gráfico) , em que pode ser observado como a percentagem de doentes com metástases (53%) no grupo de expressão baixa não é muito maior do que a dos doentes sem metástases (47%), enquanto que, no grupo de expressão de ChoKa elevada, a maioria deles, 72%, possui metástases e os restantes 28% não. A relação é observada entre a expressão de ChoKa e o desenvolvimento de metástases que não alcança o nivel de significância estatística.

Para demonstrar a relevância da sobre-expressão de ChoKa no cancro da bexiga in vivo, foi também utilizado um modelo de cancro da bexiga ortotópico que é fisiologicamente muito semelhante ao que ocorre quando é gerado um tumor na bexiga, utilizando células MBT-2 (tumor da bexiga de murganho). Nestas células, que já sobre-expressaram ChoKa em relação a células de murganho normais, esta proteína é ainda mais sobre-expressa com o objectivo de avaliar se uma expressão superior de ChoKa aumenta a agressividade ou capacidade invasiva destes tumores. Com essa finalidade, células MBT-2 que contêm um vector vazio, sem sequências que permitiram expressar o gene de ChoKa (grupos de murganho de controlo, que consistem em três murganhos) , ou células MBT-2 que sobre-expressam ChoKa por 50 7961 terem sido transfectadas com um vector com a sequência que codifica para a referida enzima (grupo de murganhos ChoKa, que consistem em três murganhos), foram inoculados directamente na bexiga dos murganhos por meio de um cateter. A criação de tumores foi monitorizada em ambos os grupos por meio de ressonância magnética nuclear com contraste com gadolinio, assim como a evolução da doença nos murganhos (condição física, sobrevivência, estudo histológico dos tumores, análise da invasão possível do rim e outros órgãos...)· 19 dias após inocular as células, os murganhos ChoKa estavam numa condição fraca, 2 deles com um tumor muito grande, enquanto que os murganhos que receberam o vector vazio (grupo de controlo) começaram por ter uma condição fraca 50 dias após a inoculação das células.

Os resultados dos Exemplos 7, 8 e 9 confirmam que ChoKa é sobre-expressa com uma incidência elevada me tumores humanos da mama, pulmão e bexiga. A sua sobre-expressão está associada com parâmetros cínicos que indicam malignidade superior: presença de nódulos linfáticos, metástase e baixa sobrevivência do doente.

Exemplo 10

Especificidade genética: modelo de interferência indutível

Considerando que a interferência de ChoKa em células tumorais é letal induzindo a morte celular por apoptose, como demonstrado nos ensaios descritos no Exemplo 6, realizado num ensaio transiente, não é possível possuir uma população celular estável que expresse a construção de 51 7961 interferência neste tipo de estudo. Uma percentagem da população celular variável é afectada em ensaios transientes, a população total nunca tendo sido afectada, o que mascara os resultados. Seria melhor estudar o efeito da construção numa população que o expressou de forma homogénea, de modo que não seria necessário possuir um modelo constitucional estável. Isto torna possível possuir um modelo de interferência indutível que permite obter uma população interferida homogeneamente na expressão de ChoKa.

Para obter isto, a sequência de interferência é expressa numa construção na qual está sob um repressor que previne a sua expressão. É realizada a co-transfecção da construção indutível de interesse juntamente com um repressor que previne a sua expressão, e uma vez que é seleccionada uma população homogénea com esta construção, as células são tratadas com um indutor, que permite a expressão da interferência da construção e por isso a interferência da expressão da proteína.

No modelo indutível concebido para este ensaio, a construção de interferência para ChoKa é expressa no vector pSUPERIOR-pure (Oligoengine) e o repressor no vector pcDNA6/TR (Invitrogen). 0 indutor utilizado é doxociclina que, quando se liga ao repressor, previne-o de se ligar à sequência correspondente, por isso a expressão da sequência de interferência já não é prevenida. Um esquema deste sistema pode ser observado na Figura 22.

As Figuras 23 e 24 apresentam os resultados obtidos em células Ch-ind-1, uma linha celular derivada de MDA-MB-231, 52 7961 capaz de expressar a construção da interferência após tratamento com o agente de indução doxociclina. A Figura 23 demonstra gue esta linha indutivel ainda é sensível à inibição guímica de ChoKa de um modo semelhante ao que ocorre em MDA-MB-231 (a linha de controlo parentérico derivada de adenocarcinoma da mama a partir do qual é generado Ch-ind-1), como os resultados obtidos após tratamento com os inibidores da cinase de colina MN58b ou RSM936 são análogos em ambas as linhas. A Figura 24, todavia, demonstra como a inibição genética de ChoKa ocorre apenas em Ch-ind-1 quando se tratam ambas as linhas celulares com 10 yg/mL de doxociclina, na medida em que a indução do modelo de interferência com doxociclina pode ocorrer apenas na linha Ch-ind-1, porque é aquela que possui uma construção a partir da qual a síntese do RNA de interferência pode ocorrer quando a ligação do repressor é prevenida. A inibição genética de ChoKa está correlacionada com uma redução da proliferação celular (determinada por pCNA) e um aumento da morte celular devido a apoptose (determinada por PARPdig, proteína PARP degradada, que é um indicador de apoptose). O efeito começa a ser observado após 10 dias, embora ainda seja muito inicial, e é muito mais pronunciado 20 dias após o início da experiência (no qual a população possui muito pouca expressão de ChoKa).

Os resultados obtidos com o modelo indutivel corroboram com os resultados previamente obtidos em transientes, demonstrando que os efeitos observados são devidos à inibição específica em ChoKa. 53 7961

Exemplo 12

Avaliação do possível efeito da sobre-expressão de Chokp em carcinogénese

Foram realizados vários ensaios para avaliar o possível efeito que a sobre-expressão da cinase de colina beta (ΟϊιοΚβ) pode possuir na carcinogénese e para confirmar se o aumento da actividade de cinase de colina observado em diferentes tecidos cancerosos e linhas celulares derivadas de tecidos cancerosos pode ser atribuído exclusivamente à cinase de colina alfa ou se a cinase de colina beta também participou.

Primeiro foi criado um anticorpo policlonal anti-Chokpi. A sua especificidade foi verificada em três grupos de células Hek293T transfectadas, uma das quais foi transfectada com uma construção a partir da qual foi produzida a expressão de ChoKa, uma segunda foi transfectada com uma construção que permitiu a expressão de □οοΚβ nestas, e uma terceira com uma construção na qual uma proteína quimérica ChoKa-GFP foi expressa, assim como num grupo de células controlo transfectadas com um vector vazio. Com pode ser observado na parte A da Figura 25, os ensaios de imunodetecção demonstrou a especificidade do referido anticorpo, que deu origem a um sinal tanto nas células que expressaram ΟηοΚβ como nas células que expressaram a proteína quimérica ChoK^-GFP, sem que ocorresse um sinal na pista correspondente às células transfectadas com a construção para a expressão de ChoKa; nestas últimas células, todavia, um anticorpo monoclonal 54 7961 dirigido contra ChoKa deu origem a um sinal numa banda que ocorreu a uma altura correspondente a ChoKa.

Para verificar o possível efeito de ΟϊιοΚβ na carcinogénese, a sua possível actividade de transformação foi ensaiada in vivo. Com essa finalidade, foram novamente utilizados murganhos atímicos (Nu/Nu) que foram injectados com um milhão de células humanas transfectadas HEK293T, quer com um vector vazio como um controlo, com um vector de expressão de cinase de colina alfa, ou com um vector expressão de cinase de colina beta e, foi produzido um último grupo, a co-transfecção dos vectores que expressaram cada uma isoenzimas das cinase de colina alfa e beta. 0 crescimento tumoral foi monitorizado pelo menos duas vezes por semana durante 13 semanas após a injecção. Com pode ser observado na Figura 26, foi observada uma indução clara de tumores nos animais que tinham recebido as células transfectadas com o vector de expressão de ChoKa, sem indução de tumores a ser observada nos murganhos que receberam as células transfectadas com o vector de expressão ΟοοΚβ. É surpreendente observar que nos murganhos que receberam células transfectadas com ambos os vectores, os vectores de expressão ChoKa e ChoKP, foi observada uma ligeira indução de tumores com uma magnitude que foi muito menor que a observada com a expressão de ChoKa isoladamente e observada mais do que 11 semanas após a injecção das células transf ectadas, que pode ser indicador que ο □ιοΚβ pode estar directamente ou indirectamente a regular ChoKa de modo que inibe a sua actividade oncogénica. 55 7961

Estes dados foram complementados observando de existia sobre-expressão da enzima cinase de colina beta em tecidos extraídos a partir de doentes com cancro. A Figura 27 apresenta os resultados obtidos em amostras de pulmão de doentes operados após o isolamento de RNA mensageiro a partir destes, e realizando reacções de automatizadas de PCR quantitativa em tempo real com sondas Taqman específicas, representando os resultados obtidos numa escala logarítmica de base 10 em relação a uma amostra de tecido controlo normal. Na referida figura pode ser observado como a expressão de ΟϊιοΚβ diminui em relação à obtida em tecido normal na maioria das amostras analisadas, contrariamente ao que ocorre com ChoKa.

Estes dados não sugerem que existisse uma correlação entre a sobre-expressão da cinase de colina beta e o surgimento e o desenvolvimento de tumores.

Todos os resultados indicados nos exemplos apoiam especificamente a cinase de colina alfa como um novo alvo terapêutico no tratamento de doenças neoplásicas.

Lisboa, 6 de Abril de 2010 56

Claims (5)

1. 7961 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para determinar o prognóstico de um doente com cancro compreendendo a avaliação do nível de expressão da proteína alfa da cinase de colina numa amostra de tecido canceroso extraído do doente por meio da determinação na referida amostra de pelo menos um parâmetro relacionado com a proteína alfa da cinase de colina seleccionada a partir do nível do seu RNA mensageiro e a concentração da referida proteína, e a comparação do valor obtido com o valor correspondente a uma ou mais amostras de tecido normal não canceroso.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que é determinado o prognóstico de um doente com cancro do pulmão ou da bexiga.
3. 3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que o nível de RNA mensageiro é determinado por amplificação o mRNA presente no extracto de RNA total e depois quantificação do produto de amplificação do mRNA.
4. 4. Método da reivindicação 3, que é realizado através de PCR quantitativa em tempo real.
5. 5. Método de uma ou mais das reivindicações anteriores, em que o tempo de sobrevivência do doente é diagnosticado. Lisboa, 6 de Abril de 2010 1