ES2341729T3 - Metodo in vitro para identificar compuestos para terapia del cancer. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáner. La presente invención se refiere a un método in vitro para ientificar y evaluar compuestos útiles en el tratamiento de distitos tipos de cáncer, en especial cáncer de pulmón, de mama, colorectal y de vejiga, en un individuo, para determinar el estadio severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar e efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dcho cáncer; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluacin de la eficacia de compuestos para terapia de dicho cáncer, conel fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes qu inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quiasa Alfa y/o los efectos de esta expresión
Description
Método in vitro para identificar
compuestos para terapia del cáncer.
La presente invención se refiere a un método
para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la
terapia del cáncer, especialmente para el cáncer de pulmón, de mama
o colorrectal, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así
como agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la
proteína Colina Quinasa Alfa, y/o los efectos de esta expresión.
La Colina Quinasa (conocida también como CK, CHK
y ChoK) es la primera enzima de la ruta de Kennedy o de síntesis de
fosfatidilcolina (PC), y fosforila la colina a fosforilcolina
(PCho) en presencia de magnesio (Mg^{2+}), utilizando
adenosina 5'-trifosfato (ATP) como donante de grupos
fosfato. La transformación mediada por diversos oncogenes, induce
niveles elevados de actividad Colina Quinasa, dando lugar a un
incremento anormal en los niveles intracelulares de su producto,
PCho, lo que apoya indirectamente el papel de la Colina
Quinasa en la generación de tumores humanos. Sin embargo, existen
mecanismos alternativos de generación de PCho que no
implican la activación de la Colina Quinasa y que podrían explicar
los niveles elevados de este metabolito en las células
tumorales.
Si bien existe evidencia del incremento de la
actividad de la enzima Colina Quinasa en tumores y células
transformadas, su relación con el proceso carcinogénico no está
suficientemente demostrada al no haberse establecido una clara
relación causa-efecto entre el incremento de
actividad y la transformación tumoral. Por otra parte, todavía no se
ha identificado la molécula responsable de este efecto.
Se han identificado cerca de 200 secuencias
génicas que codifican para polipéptidos con estructura primaria
homóloga a la Colina Quinasa designadas como Colina Quinasa alfa a,
Colina Quinasa alfa b, Colina Quinasa alfa 3, Colina Quinasa beta
1, Colina Quinasa beta 2, Colina Quinasa CKB-1
Colina/etanolamina quinasa Colina Quinasa-like
Etanolamina quinasa, Cots, Duff227, Cog3173, CPT1B, SF1,SHOX2,
FHOD2, FLJ12242, KRT5,FBL, ARL6IP4, etc. (ver
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi#219541) tanto en
humanos como en otros mamíferos y roedores (rata, ratón, vaca,
cobaya, conejo, mono). De hecho, desde 1982 existe evidencia
bioquímica de que en diferentes tejidos aislados de rata, ratón y
de humanos hay al menos tres isoenzimas con actividad Colina Quinasa
que manifiestan propiedades físico-químicas
diferentes.
Recientemente, se han identificado en el genoma
humano al menos 3 genes que codifican para proteínas con actividad
Colina Quinasa demostrada, designados como
ck-alfa, ck-beta, y
HCEKV (USA Patent US2003186241), y varios genes cuyas proteínas
codificadas presentan homología de entre un 30-65%
con las codificadas por los genes ck, como por ejemplo los genes
CAI16602, CHKL, CAI16600, CAI16599, CAH56371, CAI16603, BAA91793,
CAI16598 descritos en
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), y los genes
CPT1B, EKI2, SF1, SHOX2, FHOD2, FLJ12242, KRT5, FBL,
ARI61p\textdollar, TOMM40, MLL, descritos en
(http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sumtab?tool=
asdblast&jobid=blast-20050412-18072127). Una característica muy relevante de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa es que presentan propiedades bioquímicas diferentes, con importantes variaciones en su afinidad por el substrato colina o por el donante de fosfatos ATP, e incluso en su forma activa, que puede presentarse como dímeros o tetrámeros. Por tanto, es preciso definir si existe una relación directa entre alguna de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa identificadas y la capacidad tumorogénica atribuida por su sobreexpresión en tumores humanos.
asdblast&jobid=blast-20050412-18072127). Una característica muy relevante de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa es que presentan propiedades bioquímicas diferentes, con importantes variaciones en su afinidad por el substrato colina o por el donante de fosfatos ATP, e incluso en su forma activa, que puede presentarse como dímeros o tetrámeros. Por tanto, es preciso definir si existe una relación directa entre alguna de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa identificadas y la capacidad tumorogénica atribuida por su sobreexpresión en tumores humanos.
Por otra parte, la inhibición de la Colina
Quinasa ha demostrado ser una nueva y eficaz estrategia antitumoral
en células transformadas por oncogenes, lo que ha sido extrapolado a
ratones desnudos in vivo. Recientemente, se ha publicado el
aumento de actividad de la Colina Quinasa en diversos carcinomas de
mama humanos, y se ha visto que la alteración de la Colina Quinasa
es un acontecimiento frecuente en algunos tumores humanos tales como
los de pulmón, colorrectales y próstata.
A pesar de la correlación entre unos parámetros
y otros, en la actualidad no existe evidencia que establezca de
forma fehaciente que la sobreexpresión de Colina Quinasa tiene
actividad oncogénica y tumoral en células humanas. Sí existen
evidencias que indican que los inhibidores de la actividad colina
quinasa, como el hemicolinio-3 [Cuadrado A.,
Carnero A., Dolfi F., Jiménez B. and Lacal J.C. Oncogene 8,
2959-2968 (1993); Jiménez B., del Peso L., Montaner
S., Esteve P. and Lacal J.C. J. Cell Biochem. 57,
141-149 (1995); Hernández-Alcoceba,
R., Saniger, L., Campos, J., Núñez, M. C., Khaless, F., Gallo, M.
Á., Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15,
2289-2301 (1997)] o las metilenquinonas de toxicidad
reducida descritas en la solicitud de patente española ES200503263,
presentan actividad antitumorogénica. Sin embargo, no existe en los
mencionados documentos ni el resto de la técnica anterior evidencia
concluyente de cuál de las diversas isoenzimas con actividad Colina
Quinasa demostrada (ck-alfa,
ck-beta, HCEKV, etc) e identificadas en tejidos
humanos podría ser la responsable de la actividad enzimática
detectada, ni de cuál de las isoenzimas es sensible a la inhibición
por los inhibidores que han mostrado actividad antitumoral. Esta
identificación es necesaria para poder establecer su potencial
utilización como diana terapéutica en cáncer.
Aquí es divulgado un método in vitro para
buscar, identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la
terapia del cáncer, en especial para el cáncer de pulmón, mama o
colorrectal.
Es además divulgado el uso de secuencias
nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa
alfa en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y
evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer,
preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal.
Una divulgación adicional consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o
la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, para el tratamiento
del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o
colorrectal.
Es también divulgado una composición
farmacéutica que comprenda uno o varios agentes terapéuticos junto
con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento
del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o
colorrectal.
Es divulgado además un método in vitro de
monitorización del efecto de una terapia administrada a un paciente
de cáncer, caracterizado porque la evaluación del nivel de expresión
de la proteína colina quinasa alfa en una muestra de tejido
extraída del paciente al que se está suministrando un agente
anti-tumoral, preferiblemente un agente según las
reivindicaciones 3-5, mediante la determinación en
dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína
colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su ARN
mensajero, la concentración de dicha proteína o su actividad
enzimática, y la comparación del valor obtenido con el valor
correspondiente a una o más muestras de tejido normal no
canceroso.
Por último, es también divulgado un kit de
diagnóstico para llevar a cabo la presente invención.
Figura 1: A) Actividad Colina Quinasa (ChoK) en
extractos de células humanas Hek293T (Human embryonic kidney cells)
tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y Beta
(ensayo de actividad colina quinasa ex vivo). B) Niveles
intracelulares de fosforilcolina en las células vivas (ensayo de
actividad Colina Quinasa in vitro).
Figura 2: A) Actividad ChoK en células humanas
Chok293T tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y
Beta. B) Especificidad de los anticuerpos monoclonales generados
frente a Colina Quinasa Alfa en los mismos extractos que se muestran
en A.
Figura 3: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa
determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en NSCLC
(Non-small cell lung cancer).
Figura 4: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa
determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de
mama.
Figura 5: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa
determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de
colon. B) Pólipo en el que se observa la tinción progresiva desde
las lesiones pre-neoplásticas al alud del tumor.
Figura 6: Crecimiento independiente de anclaje
de células que sobre-expresan Colina Quinasa Alfa
humana. Se muestran tanto el número de colonias generados como el
tamaño relativo de las mismas en las dos líneas celulares
analizadas, Hek293 y MDCK.
Figura 7: Capacidad oncogénica in vivo en
ratones Nu/Nu de Colina Quinasa Alfa.
Figura 8: Expresión y actividad enzimática de
Colina Quinasa Alfa en los tumores inducidos in vivo.
Figura 9: Especificidad del inhibidor MN58b
sobre Colina Quinasa Alfa. Extractos de E. coli en que se
expresan las proteínas recombinantes Colina Quinasa Alfa o Colina
Quinasa Beta humanas fueron analizados en ausencia (0) o en
presencia de concentraciones crecientes de MN58b.
Figura 10: Efecto antitumoral del inhibidor
MN58b en los tumores inducidos por sobreexpresión de Colina Quinasa
Alfa
Figura 11: Bloqueo de la expresión de Colina
Quinasa Alfa por la técnica de siARN en células humanas HeK293T.
Figura 12: Bloqueo de la expresión de Colina
Quinasa Alfa mediante siARN en células tumorales derivadas de un
carcinoma de mama humano, determinada tanto por Western Blotting A)
y B) como por actividad enzimática C).
\newpage
Figura 13: Muerte por apoptosis inducida por el
ARN interferente específico de Colina Quinasa Alfa en células
humanas tumorales de mama
MDA-MB-231. A) Análisis por
citometría de flujo con yoduro de propidio. B) Digestión de PARP
asociada a la muerte por apoptosis.
Figura 14: ARN interferente específico de Colina
Quinasa Alfa en células humanas primarias epiteliales de mama HMEC.
A) Niveles basales de expresión de Colina Quinasa Alfa en células
normales HMEC respecto a las células tumorales
MDA-MB-231. B) Interferencia con
Colina Quinasa Alfa en HMEC. C) La interferencia de Colina Quinasa
Alfa no induce muerte celular en células primarias humanas de
HMEC.
Figura 15: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa
en tejido de cáncer de mama. Figura 15a: ARN mensajero de Colina
Quinasa Alfa en tejidos de pacientes aquejados de cáncer de mama
detectado por PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el
logaritmo en base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la
presente en una muestra de tejido normal. Figura 15b: valor medio de
la expresión de Colina Quinasa Alfa, representado como las unidades
relativas de expresión del gen calculadas a partir del nivel de ARNm
con el método de 2^{-\Delta\Delta Ct}), en individuos sin
metástasis (primera barra, marcada como "NO") o con metástasis
(segunda barra, marcada como "SÍ"). Figura 15c: evolución de la
probabilidad de supervivencia sin enfermedad según el número de
meses transcurridos, entre los pacientes con nódulos linfáticos
(línea inferior, marcada con trazos grises, 100 ) o
sin nódulos linfáticos (línea superior, marcada con trazos negros,
101 ).
Figura 16: Expresión de Colina Quinasa Alfa en
líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón. Figura 16a: ARN
mensajero de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de
cáncer tipo NSCLC (H1299 y H460) o SCLC (H510 y H82), detectado por
PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en
base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en
células normales primarias de epitelio bronquial (BEC). Figura 16b:
proteína Colina Quinasa Alfa detectada por inmunoensayo con un
anticuerpo monoclonal en células normales de epitelio bronquial
(BEC) y en líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón H460,
H1299, H510 y H82; inmediatamente debajo se representa la señal
obtenida para la tubulina en las mismas muestras. Figura 16c:
actividad Colina Quinasa, representada por la señal de PCho marcada
radiactivamente, detectada por microgramo de proteína, al cabo de 30
minutos, generada a partir de colina marcada en cada una de las
líneas celulares indicadas bajo las barras correspondientes.
Figura 17: Expresión del ARN mensajero de Colina
Quinasa Alfa, en tejido de tumores extraídos de pacientes aquejados
de cáncer de pulmón NSCLC en estadios tempranos, detectado por PCR
cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base
10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en una
muestra de tejido normal.
Figura 18: Evolución de la probabilidad de
supervivencia de pacientes aquejados de cáncer de pulmón con el
transcurso del tiempo, representado en meses, en el caso de que se
detecte o expresión de Colina Quinasa Alfa (líneas discontinuas,
102 ) o no se detecte (líneas continuas,
101 ). Se representan la supervivencia global de
pacientes en estadios I a IV (gráfico situado en la parte superior
izquierda), la supervivencia libre de enfermedad de pacientes en
estadios I a IV (tiempo que transcurre desde que los pacientes son
operados hasta que sufren una recaída) (gráfico situado en la parte
inferior izquierda), la supervivencia en el caso de cáncer de los
estadios IA-IIIA (gráfico situado en la parte
superior derecha) y la supervivencia libre de enfermedad en el caso
de los estadios IA-IIIA (gráfico situado en la parte
inferior derecha).
Figura 19: Expresión de Colina Quinasa Alfa en
líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga. Figura 19a: ARN
mensajero de Colina Quinasa Alfa en líneas celulares derivadas de
cáncer de vejiga detectado por PCR cuantitativa a tiempo real,
representado como el logaritmo en base 10 de la relación entre la
cantidad detectada y la presente en células normales de vejiga
inmortalizadas UrotSa; las barras corresponden, de izquierda a
derecha, a las líneas HT1376, J82, SW780, TCCSup y UMVC3. Figura
19b: proteína Colina Quinasa Alfa detectada por inmunoensayo con un
anticuerpo monoclonal en células normales de vejiga inmortalizadas
(UrotSa) y en las líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga
TCCsup, J82, UMVC3, SW789 y HT1376, así como en un control negativo
(células Hek293T) y en un control positivo (células
Hek-ChoK, transfectadas con un plásmido que expresa
Colina Quinasa Alfa); inmediatamente debajo se representa la señal
obtenida para la tubulina en las mismas muestras. Figura 16c:
actividad Colina Quinasa, representada por la señal de PCho marcada
radiactivamente, detectada por microgramo de proteína, al cabo de 30
minutos, generada a partir de colina marcada en cada una de las
líneas celulares indicadas bajo las barras correspondientes.
Figura 20: Expresión de Colina Quinasa Alfa en
pacientes aquejados de cáncer de vejiga. Figura 20a: Valores medios
de expresión obtenidos a partir de tejidos tumorales de 90 pacientes
mediante el microarray U133 Plus 2.0 de Affymetrix, obtenidos en los
distintos grupos clasificados según el valor del factor de
inducción: una inducción de 1 a 3 veces (primera barra), una
inducción de 3 a 8 veces o una inducción de 8 a 24 veces (tercera
barra). Figura 20 b: ARN mensajero de Colina Quinasa Alfa en 20
pacientes aquejados de cáncer de vejiga, detectado por PCR
cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en base
10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en
células normales de vejiga inmortalizadas UrotSa; la línea
horizontal representa el nivel a partir del cual hay una asociación
con peor pronóstico de evolución del paciente.
Figura 21: Relación entre la expresión de Colina
Quinasa Alfa y la presencia de nódulos y/o metástasis. Figura 21a:
Niveles medios de expresión de Colina Quinasa Alfa en los pacientes
negativos y positivos respecto a la presencia de nódulos linfáticos
(valores marcados con cuadrados sin relleno, \boxempty) o de
metástasis (valores marcados con círculos rellenos, \medbullet);
las líneas rectas unen los valores medios correspondientes a los
individuos positivos o negativos respecto a la característica
considerada para ayudar a apreciar la diferencia de nivel entre uno
y otro grupo). Figura 21b: proporción de pacientes con metástasis
(barras con relleno oscuro continuo, 103 ) y sin
metástasis (barras rellenas con líneas inclinadas, //), en grupos de
pacientes clasificados según el nivel de expresión de Colina Quinasa
Alfa: baja (pareja de barras de la izquierda), intermedia (pareja de
barras situadas en la parte intermedia de la gráfica) o alta (pareja
de barras situadas en la parte derecha de la gráfica).
Figura 22: Esquema de funcionamiento de la
construcción a partir de la cual puede sintetizarse un ARN
interferente. En presencia de represor (zona izquierda, "No
Expresión", se une a la construcción e impide la síntesis del
ARN); en presencia de un inductor (doxociclina), él mismo se une al
represor, impidiendo su unión a la construcción interferente y
permitiendo la síntesis del ARN interferente (zona derecha,
"Expresión").
Figura 23: Proliferación de células
MDA-MB-231 (fila superior de placas)
y Ch-ind-1 (fila inferior de placas)
en condiciones permisivas de crecimiento (columna "Control") o
en presencia de los inhibidores químicos de Colina Quinasa MN58b
(columna intermedia) o RSM936 (columna de la derecha).
Figura 24: Comportamiento de las células
MDA-MB-231 (barras marcadas como
"MDA") y Ch-ind-1 (barras
marcadas como "Chind1") en ausencia ("-") o presencia
"+" de 10 \mug/ml de doxociclina, transcurridos 10 días
("10d") ó 20 días ("20d"). A: Influencia en la inhibición
genética de Colina Quinasa Alfa según la relación entre los niveles
de Colina Quinasa Alfa y GAPDH; B: Influencia en la proliferación
celular, según la relación entre los niveles de pCNA y GAPDH; C:
Viabilidad celular de las células
Ch-ind-1 en ausencia (línea
punteada) o en presencia (línea de trazo continuo) de inductor,
deducida de los valores de absorbancia a 500 nm observados a
distintos tiempos; D: Influencia sobre la inducción de apoptosis,
según la relación entre los niveles de proteína PARP degradada
respecto al total de proteína PARP (PARPdig/PARPtotal).
Figura 25: Especificidad del anticuerpo
policlonal contra Colina Quinasa Beta. A: Inmunoensayo en el que se
hace interaccionar un antisuero policlonal
anti-Colina Quinasa beta con muestras de células
transfectadas con un vector vacío (calle marcada "Vacío"), un
vector de expresión de Colina Quinasa Alfa (calle marcada
"ChoKA"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta (calle
marcada "ChoKB") y un vector de expresión de una proteína
quimérica Colina Quinasa Beta - Proteína Verde Fluorescente (calle
marcada "ChoKB5'GFP"). Las flechas indican al altura de bandeo
de la Colina Quinasa Beta y de la proteína quimérica. B:
Inmunoensayo en el que se hace interaccionar un anticuerpo
policlonal anti-Colina Quinasa Alfa con muestras de
células transfectadas con un vector vacío (calle marcada
"Vacío"), un vector de expresión de Colina Quinasa Alfa (calle
marcada "ChoKA"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta
(calle marcada "ChoKB") y un vector de expresión de una
proteína quimérica Colina Quinasa Beta - Proteína Verde Fluorescente
(calle marcada "ChoKB5'GFP"). Las flechas indican al altura de
bandeo de la Colina Quinasa Alfa.
Figura 26: Comparación de la capacidad
tumorogénica de las Colina Quinasas Alfa y Beta. Evolución del
volumen tumoral, medido en centímetros cuadrados, según las semanas
que se indican en abscisas, transcurridas desde la inyección a
ratones de células transfectadas con: un vector vacío (datos
indicados con rombos, "\ding{117}"), un vector de expresión
de Colina Quinasa Alfa (datos indicados con cuadrados, "\ding{110}"), un vector de expresión de Colina Quinasa Beta
(datos indicados con triángulos, 104 ) y un vector de
expresión de Colina Quinasa Alfa + un vector de expresión de Colina
Quinasa Beta (datos indicados con aspas, 105 ).
Figura 27: ARN mensajero de Colina Quinasa Beta
en tejido de pacientes aquejados de cáncer de pulmón, detectado por
PCR cuantitativa a tiempo real, representado como el logaritmo en
base 10 de la relación entre la cantidad detectada y la presente en
tejido normal.
\vskip1.000000\baselineskip
Para facilitar la comprensión de la presente
invención, exponemos a continuación el significado de algunos
términos y expresiones en el contexto de la invención:
Los términos "sujeto" o "individuo" se
refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye,
pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el
sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de
cualquier edad o raza.
El término "cáncer" se refiere a la
enfermedad que se caracteriza por un crecimiento anormal o
descontrolado de las células, capaces de invadir tejidos adyacentes
y diseminarse a órganos lejanos.
El término "carcinoma" se refiere al tejido
que resulta del crecimiento celular anormal o descontrolado.
\newpage
El término "cáncer de mama" o "carcinoma
de mama" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de
células de la mama.
El término "cáncer de colon" o "carcinoma
de colon" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno
de células del colon.
El término "cáncer de recto" o "carcinoma
de recto" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno
de células del recto.
El término "tumor" se refiere a cualquier
masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno
(no canceroso) o maligno (canceroso).
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "ADN" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de ADN es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "ADNc" se refiere a una
secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de
ARNm.
El término "ARN" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de ARN es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "ARNm" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del ARN total que se
traduce a proteínas.
La frase "ARNm transcrito de" se refiere a
la transcripción del gen (ADN) en ARNm, como primer paso para que el
gen se exprese y traduzca a proteína.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (ARN) o de desoxirribonucleótidos
(ADN).
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no
covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones
post-traduccionales, por ejemplo glicosilación,
fosforilación o acetilación.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un
fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido",
se usan indistintamente.
El término "anticuerpo" se refiere a una
glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una
molécula diana, a la que se denomina "antígeno". El término
"anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos
policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos
humanos, humanizados y de origen no humano. Los "anticuerpos
monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos,
altamente específicos, que están dirigidos contra un único sitio o
"determinante" antigénico. Los "anticuerpos policlonales"
incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos, que están
dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.
El término "epítopo", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico de
una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína que
un anticuerpo específico reconoce.
El término "diana terapéutica" se refiere a
secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede
diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto
terapéutico.
El término "antagonista" se refiere a
cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula
antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre
otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos
naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior
a 500 daltons).
El término "valores normales de
referencia", usado en la presente invención se refiere al nivel
de ciertas proteínas, ARNm u otros metabolitos del cuerpo presenta
un individuo sano.
El término tejido normal usado en la presente
invención se refiere a un tejido no canceroso, incluyendo cultivos
celulares comerciales.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la expresión de la proteína Colina Quinasa
Alfa se ve incrementada en los procesos tumorales, y especialmente
en los cánceres de pulmón, mama y colorrectal. Así como en el
sorprendente descubrimiento de que la sobreexpresión de dicha
proteína induce tumores in vivo y que consecuentemente la
inhibición de la expresión y/o la actividad de esta enzima es un
excelente método para el tratamiento del cáncer, especialmente para
el cáncer de pulmón, de mama y colorrectal. La Colina Quinasa Alfa
es, por tanto, una buena diana terapéutica potencial en
tumorogénesis humana.
\newpage
En este sentido, se divulga en primer lugar, un
método in vitro para detectar la presencia de cáncer en un
individuo, preferiblemente cáncer de pulmón, mama o colorrectal,
para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dicho cáncer, que comprende:
- a)
- la detección y/o cuantificación de la proteína Colina Quinasa Alfa, del ARNm del gen colina quinasa alfa o el correspondiente ADNc en una muestra de dicho individuo, y
- b)
- la comparación de la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, de la cantidad de ARNm del gen colina quinasa alfa o de la cantidad del correspondiente ADNc detectada en una muestra de un individuo; con la cantidad de proteína Colina Quinasa Alfa, con la cantidad del ARNm del gen colina quinasa alfa o con la cantidad del correspondiente ADNc detectada en las muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
El método proporcionado aquí divulgado es de
alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que sujetos o
individuos diagnosticados de cánceres, preferiblemente de pulmón,
mama y colorrectal, presentan niveles elevados de ARNm transcrito
del gen colina quinasa alfa, o concentraciones elevadas de la
proteína codificada por el gen colina quinasa alfa
(Proteína Colina Quinasa Alfa), en comparación con los
correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin
historial clínico de estos carcinomas. Sin embargo, la expresión en
humanos del gen colina quinasa beta no se correlaciona con
ninguno de los tipo de cáncer anteriormente mencionados.
El presente método comprende una etapa de
obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con
distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre,
plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial,
bilis, jugo gástrico, líquido cefalorraquídeo, heces, saliva,
broncoscopias, etc. La muestra se puede obtener por cualquier método
convencional, preferiblemente resección quirúrgica.
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado
tipo de cáncer; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha sido
tratado previamente contra un cáncer, en particular contra cáncer de
pulmón, mama o colorrectal.
El presente método comprende además una etapa de
extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de
proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de ARN total. Uno
de estos dos extractos representa el material de trabajo para la
siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o
del ARN total son bien conocidos por el experto en la materia
(Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156;
Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532; Molina, M.A., et
al., Cancer Res., 1999, 59: 4356-4362).
Cualquier ensayo convencional se puede utilizar
en el marco de la invención para detectar un cáncer, siempre que
mida in vitro los niveles de ARNm transcrito del gen
colina quinasa alfa o su cADNc complementario, la
concentración de Proteína Colina Quinasa Alfa en muestras recogidas
de los individuos a analizar y de individuos control.
Así pues, se describe un método para detectar la
presencia de cáncer, en especial de cáncer de pulmón, mama o
colorrectal, para determinar el estadio o la severidad de dicho
cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un individuo que presenten dichos cánceres, basado
bien en la medida de la concentración de la proteína Colina Quinasa
Alfa, o bien en la medida del nivel de expresión del gen colina
quinasa alfa.
En el caso de que lo que se pretenda detectar
sea la proteína Colina Quinasa Alfa, el método de la invención
comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de
proteínas de la muestra con una composición de uno o más
anticuerpos específicos contra uno o más epítopos de la proteína
Colina Quinasa Alfa, y una segunda etapa de cuantificación de los
complejos formados por anticuerpos y la proteína Colina Quinasa
Alfa.
Existe una amplia variedad de ensayos
inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación
de complejos específicos antígeno-anticuerpo;
numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no
competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de
estos ensayos está disponible comercialmente.
Así, la proteína Colina Quinasa Alfa se puede
cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos
monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de
ellos, "combibodies" y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos,
específicos contra la proteína Colina Quinasa Alfa; siendo estos
anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los
anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o
no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de
aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una
amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden
utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos,
enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos
enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas,
colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos
marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen
el Western-blot o transferencia Western, ELISA
(Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sándwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la
Proteína EFNB2 o la proteína EDNRA, incluyen técnicas de
cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de
unión a lectina.
El inmunoensayo preferido en el método aquí
divulgadoes un ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo
(DAS-ELISA). En este inmunoensayo se puede
utilizar cualquier anticuerpo o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos de la Proteína Colina Quinasa
Alfa. Como ejemplo de uno de los muchos posibles formatos de este
ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o un fragmento de
este anticuerpo, o una combinación de anticuerpos, que recubren una
fase sólida, se ponen en contacto con la muestra a analizar, y se
incuban durante un tiempo y en condiciones apropiados para formar
los complejos antígeno-anticuerpo. Después de un
lavado en condiciones apropiadas para eliminar los complejos no
específicos, se incuba con los complejos
antígeno-anticuerpo, en condiciones y tiempo
apropiados, un reactivo indicador, que comprende un anticuerpo
monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una
combinación de estos anticuerpos, unidos a un compuesto generador
de una señal. La presencia de la proteína Colina Quinasa Alfa en la
muestra a analizar, se detecta y cuantifica, en caso de que exista,
midiendo la señal generada. La cantidad de proteína Colina Quinasa
Alfa presente en la muestra analizar es proporcional a esa
señal.
En el caso de que se pretenda detectar el ARNm o
el ADNc correspondiente al gen colina quinasa alfa, y no las
proteínas que codifican, el método de la invención para detectar
in vitro el carcinoma posee etapas diferentes. Así, una vez
obtenida la muestra y extraído el ARN total, el método de la
invención, la detección del ARNm o del correspondiente ADNc del gen
colina quinasa alfa, comprende una primera etapa de
amplificación del ARNm presente en el extracto de ARN total, o del
correspondiente ADNc sintetizado por transcripción inversa del
ARNm, y una se-
gunda etapa de cuantificación del producto de la amplificación del ARNm o del ADNc del gen colina quinasa alfa.
gunda etapa de cuantificación del producto de la amplificación del ARNm o del ADNc del gen colina quinasa alfa.
Un ejemplo de amplificación del ARNm, consiste
en retrotranscribir el ARNm en ADNc (RT), seguido de la Reacción en
Cadena de la polimerasa (PCR); la PCR es una técnica de
amplificación de una determinada secuencia nucleotídica (diana)
contenida en una mezcla de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se
utiliza un exceso de una pareja de cebadores de oligonucleótidos,
que hibridan con las hebras complementarias de la secuencia
nucleotídica diana. A continuación, una enzima con actividad
polimerasa (ADN Taq Polimerasa) extiende cada cebador, utilizando
como molde la secuencia nucleotídica diana. Los productos de la
extensión se convierten entonces en secuencias dianas, tras la
disociación de la hebra diana original. Nuevas moléculas de cebador
hibridan y la polimerasa las extiende; el ciclo se repite para
aumentar exponencialmente el número de secuencias diana. Esta
técnica está descrita en las patentes US 4683195 y US 4683202. Se
han descrito previamente muchos métodos para detectar y cuantificar
los productos de la amplificación por PCR, de los que cualquiera
puede ser usado en esta invención. En un método preferido de la
invención, el producto amplificado se detecta por electroforesis en
gel de agarosa.
En otro ejemplo la detección del ARNm se realiza
transfiriendo el ARNm a una membrana de nailon, mediante técnicas de
transferencia como por ejemplo Northern-blot o
transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del
ARNm o del correspondiente ADNc del gen colina quinasa
alfa.
En una realización particular la amplificación y
cuantificación del ARNm correspondiente al gen colina quinasa
alfa, se realiza a la vez mediante RT-PCR
cuantitativa a tiempo real (Q-PCR).
El paso final del método aquí divulgado para
detectar in vitro los carcinomas en cuestión, en una muestra
procedente de un individuo, comprende comparar la cantidad de
proteína Colina Quinasa Alfa, la cantidad de ARNm del gen colina
quinasa alfa o la cantidad del correspondiente ADNc de la
muestra proveniente de un individuo, con la cantidad de proteína
Colina Quinasa Alfa, la cantidad de ARNm del gen colina quinasa
alfa o la cantidad del correspondiente ADNc detectada en las
muestras de sujetos control o en muestras anteriores del mismo
individuo, o con los valores normales de referencia.
También se divulga un método in vitro
para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para terapia
del cáncer; preferiblemente para el cáncer de pulmón, de mama o
colorrectal, que comprende:
- a)
- poner en contacto un cultivo de células tumorales; preferiblemente de pulmón, mama, colon o recto, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
- b)
- detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen colina quinasa alfa o la proteína Colina Quinasa Alfa, y
- c)
- comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato.
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La cuantificación de los niveles de expresión
del gen colina quinasa alfa o la proteína Colina Quinasa Alfa
se realizan de modo semejante a como se indica en el método de la
invención para detectar in vitro la presencia de cáncer de
pulmón, mama o colorrectal en un individuo.
Cuando un agente disminuye los niveles de
expresión del gen colina quinasa alfa o revierte los efectos
de la expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo
los niveles de proliferación celular, este agente se convierte en
candidato para la terapia del cáncer.
Por tanto, se divulga también el uso de
secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina
quinasa alfa, en métodos de búsqueda, identificación,
desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia
del cáncer, en especial para el cáncer de pulmón, de mama o
colorectal. Resaltar la importancia adquirida últimamente por los
métodos de screening de fármacos basados en el binding, competitivo
o no, de la molécula potencial fármaco a la diana terapéutica.
Es también divulgado aquí el uso de secuencias
nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa
alfa para detectar la presencia de cáncer, en especial de cáncer
de pulmón, de mama o colorrectal, para determinar el estadio o la
severidad de dichos cánceres en el individuo, o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente alguno
de estos cánceres.
También se divulgan aquí agentes caracterizados
porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina
Quinasa Alfa. Estos agentes, que se pueden identificar y evaluar
según la presente invención, pueden ser seleccionados del grupo
formado por:
- a)
- un anticuerpo, o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína Colina Quinasa Alfa, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado; pudiendo ser también un fragmento del anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo anti-idiotipo,
- b)
- agentes citotóxicos, tales como toxinas, moléculas con átomos radiactivos, o agentes quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siARNs, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, y
- c)
- compuestos antagonistas de la proteína Colina Quinasa Alfa, que inhiben una o más de las funciones de la proteína Colina Quinasa Alfa.
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También se divulga aquí una composición
farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de
uno o varios agentes de los mencionados anteriormente junto con uno
o más excipientes y/o sustancias transportadoras. Además dicha
composición puede contener cualquier otro ingrediente activo que no
inhiba la función de la proteína Colina Quinasa Alfa.
Los excipientes, sustancias transportadoras y
sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y
farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados
con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan
efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones
farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas
para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea,
intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de
administración depende del estado del paciente. Las formulaciones
pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se
preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la
farmacología. Las cantidades de sustancias activas para
administrarse pueden variar en función de las particularidades de la
terapia.
Un aspecto más de la presente solicitud consiste
en un kit de diagnóstico para llevar a cabo la presente invención.
Así, en una realización particular la presente invención incluye un
kit que comprende un anticuerpo que reconoce especialmente la
proteína Colina Quinasa Alfa y un carrier en un envase adecuado. En
otra realización particular este kit se emplea para detectar la
presencia de cáncer en un individuo, preferiblemente cáncer de
pulmón, mama o colorrectal, para determinar el estadio o la
severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
cáncer.
Un aspecto final de la presente invención
consiste en un método in vitro para diagnosticar el tiempo de
supervivencia de un paciente aquejado de cáncer de mama, pulmón o
vejiga que comprende la evaluación del nivel de expresión de la
proteína colina quinasa alfa en una muestra del de tejido
cancerígeno extraída del paciente, mediante la determinación en
dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína
colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su ARN
mensajero, la concentración de dicha proteína o la actividad
enzimática de dicha proteína, y la comparación del valor obtenido
con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal
no
canceroso.
canceroso.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
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Como se demuestra en la Figura 1, ambos enzimas
CK\alpha2 (52 kDa, 457 aminoácidos) y CK\beta1 (45 kDa, 395
aminoácidos) presentan una potente actividad Colina Quinasa,
determinada por su capacidad de producir fosforilcolina a partir de
colina en presencia de ATP y magnesio (Figura 1A). Esta actividad se
manifiesta tanto en su forma recombinante, expresada en E.
coli, como tras la transfección en células humanas HEK293. Sin
embargo, y a pesar de que ambos enzimas tienen actividad Colina
quinasa, los niveles intracelulares de fosforilcolina en células
vivas no se ven igualmente alterados, siendo prácticamente
indetectables en las células que sobre-expresan
Colina Quinasa Beta (Figura 1B). Estos resultados sugieren que tanto
la regulación fisiológica, como la función biológica de estas dos
proteínas, y por tanto, su comportamiento en tumorogénesis, puede
ser diferencial.
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Se han desarrollado anticuerpos policlonales y
monoclonales que reconocen el enzima Colina Quinasa Alfa, proteína
que ha sido semi-purificada y expresada como
antígeno en la fase de generación, y como control de producción en
las fases restantes del proceso. A pesar de haber sido desarrollados
frente a Colina Quinasa Alfa, debido a que las dos enzimas
(CK\alpha y CK\beta) presentan un 65% de homología global a lo
largo de su secuencia, y en algunas regiones conservadas como los
dominios de unión a colina y de actividad catalítica la homología
alcanza hasta un 75%, es necesario comprobar qué isoenzimas son
capaces de reconocer los anticuerpos policlonales y monoclonales
generados. Hemos verificado que tanto los anticuerpos policlonal
como monoclonales utilizados son específicos de la Colina Quinasa
Alfa, y que no reconocen Colina quinasa Beta. Para ello, hemos
sobre-expresado ambas proteínas Colina quinasa Alfa
y Beta en células humanas Hek293T, y tras comprobar que las dos
proteínas están presentes y son activas (Figura 2A) se ha realizado
su análisis por técnicas de inmunodetección ("Western blot")
tanto con el anticuerpo policlonal con el que se realizaron estudios
previos [Ramírez de Molina, A., Gutiérrez, R., Ramos, M. A., Silva,
J. M., Silva, J., Sánchez, J. J., Bonilla, F., Lacal, J. C.
Oncogene 21, 4317-4322 (2002);
Ramírez de Molina, A., Rodríguez-González, A.,
Gutiérrez, R., Martínez-Piñero, L., Sánchez, J. J.,
Bonilla, F., Rosell, R., Lacal, J. C. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 296, 580-583 (2002)], como con
los nuevos anticuerpos monoclonales generados frente a Colina
Quinasa Alfa. Como se muestra en la Figura 2B, en la que se
presenta un ejemplo con dos de estos anticuerpos, incluso
sobre-expresando Colina Quinasa Beta en condiciones
en que la actividad está incrementada 80 veces, ninguno de los
anticuerpos reconoce esta isoforma, siendo Colina quinasa Alfa
fuertemente reconocida tanto en las mismas condiciones, como los
niveles endógenos del control, en todos casos. Estos resultados
indican que los estudios previos de nuestro grupo en el que se
utilizó el anticuerpo policlonal definen a la Colina Quinasa Alfa
como el isoenzima sobreexpresada en líneas celulares derivadas de
tumores humanos y en los propios tumores analizados.
Estos resultados no eran esperables, dado que
los anticuerpos policlonales reconocen por definición diferentes
epítopos en la molécula y las secuencias de las Colina Quinasas Alfa
y Beta son un 65% homólogas, llegando en algunas regiones hasta un
75%, especialmente en las regiones de dominios consenso donde
residen la región catalítica y la de unión al sustrato y ATP.
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La disponibilidad de anticuerpos de probada
especificidad frente a Colina Quinasa Alfa ha permitido estudiar la
posible alteración en la expresión de Colina Quinasa Alfa en algunos
de los tumores más importantes en la actualidad en países
desarrollados, como son el cáncer de mama, colon, y pulmón. Para
llevar a cabo este estudio, se han realizado cortes de parafina de
muestras de entre 38 y 50 pacientes distintos con cada uno de
estos tipos de cáncer, y se ha analizado la expresión de Colina
Quinasa Alfa mediante inmunohistoquímica (IHQ), técnica que permite
la detección e identificación "in situ" de componentes
biomoleculares que son parte integral de células y tejidos, y que
se puede realizar de forma automatizada en los Servicios de Anatomía
Patológica de cualquier hospital. En las muestras de estos
pacientes, tanto de mama, colon o pulmón, hemos encontrado que:
- -
- En todos los casos la tinción del tumor con el anticuerpo que reconoce Colina Quinasa Alfa es altamente especifica, permitiendo la distinción clara entre el tejido tumoral y el tejido normal adyacente.
- -
- No hay ningún caso en el que se produzca tinción del tejido normal.
- -
- El enzima Colina Quinasa Alfa se encuentra sobre-expresada con una incidencia que oscila entre el 62% y el 100% en este tipo de tumores, demostrando la alta implicación de esta isoforma, Colina Quinasa Alfa , en tumorogénesis humana.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 3 se puede observar un ejemplo de
los resultados obtenidos para cáncer de pulmón de células grandes
(NSCLC), que en la actualidad supone el 80% por ciento de los casos
de cáncer de pulmón. Como se puede observar, se produce una tinción
citoplasmática de Colina Quinasa Alfa, específica de los nudos
tumorales y que como se indica anteriormente tiñe de forma
específica un 62% de las muestras.
Siguiendo esta línea, se ha realizado un estudio
similar en 38 pacientes con cáncer de mama, observándose de nuevo la
sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa de forma específica en el
tejido tumoral en un 97% de los casos (Figura 4).
Por último, se ha realizado también el estudio
de expresión de Colina Quinasa Alfa en cáncer de colon, para lo
cual se han realizado cortes de parafina de 40 muestras de pacientes
distintos con cáncer de colon con más de 4 años de seguimiento. El
análisis se inició con carcinomas in situ en estadios I, II,
III y IV. De manera similar al caso anterior, como tejido normal se
ha utilizado el tejido normal de cada preparación adyacente al
tejido tumoral. En ningún caso se obtuvo una tinción positiva en los
tejidos normales de ninguna de las 40 muestras, confirmando la alta
especificidad de la tinción de Colina Quinasa Alfa en el tejido
tumoral, en el que de nuevo se observó sobreexpresión del enzima en
todos los casos (Figura 5A). Estos resultados avalan la alta
implicación de esta isoforma de este enzima en cáncer de colon. Mas
aún, este resultado nos llevó al análisis de lesiones
pre-neoplásicas, ACFs y pólipos con distintos grados
de displasia, donde los resultados muestran claramente que la
sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa es un evento temprano en el
proceso de tumoración del tejido de colon que se produce ya desde
la displasia, sugiriendo su potencial comportamiento como gen
"gate-keeper" en estos tumores y por tanto su
relevancia como una nueva diana terapéutica potencial . En la
Figura 5B se muestra un pólipo donde se puede observar cómo la
tinción en el tejido normal es prácticamente indetectable, y a
medida que comienza a aparecer la displasia (células binucleares) la
tinción aumenta, haciéndose muy intensa en el alud del tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Dada la altísima incidencia de desregulación de
Colina Quinasa Alfa en algunos de los tumores humanos más
importantes en la actualidad, hemos estudiado si esta proteína por
sí misma tiene capacidad oncogénica, es decir, si Colina Quinasa
Alfa presenta actividad oncogénica. Para llevar a cabo este estudio,
en primer lugar estudiamos si este gen confiere la capacidad de
crecimiento en medio independiente de anclaje, lo que supone una
medida de su capacidad transformante. Se transfectaron células
humanas HEK293T con un vector vacío como control y con un vector de
expresión de Colina Quinasa Alfa, y se sembraron en agar blando.
Como se puede observar en la Figura 6, la sobreexpresión de esta
proteína es suficiente para inducir la transformación oncogénica
tanto de células humanas HEK293T, como de células epiteliales de
perro MDCK.
Dado que la Colina Quinasa Alfa tiene actividad
transformante en células humanas HEK293T, hemos analizado su
potencial oncogénico in vivo. Para ello, ratones
inmunodeprimidos (Nu/Nu) fueron inyectados con un millón de células
humanas HEK293T que sobre-expresaban bien el vector
vacío como control, o bien el vector de expresión de la Colina
Quinasa Alfa. El crecimiento tumoral se monitorizó al menos dos
veces por semana durante 50 días después de la inyección. Mientras
que las células control no indujeron ningún tumor en ninguno de los
ratones inyectados, las células que sobre-expresaban
Colina Quinasa Alfa indujeron tumores en 8 de los 30 ratones
inyectados (26%), que alcanzaron una media de 0.6 cm^{3} después
de 45 días (Figura 7). Estos resultados demuestran que la
sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa es suficiente para inducir
tumores in vivo, y es, por tanto, una buena diana
terapéutica potencial en tumorogénesis humana. Para verificar si
los tumores generados por Colina Quinasa Alfa mantenían incrementada
su expresión y actividad, se extrajeron quirúrgicamente los
tumores, se lisaron, y se determinaron los niveles de expresión y
actividad de este enzima con respecto a los de sus células
parentales HEK293T como control. Como se puede observar en la Figura
8, todos los tumores analizados mantienen elevados los niveles de
expresión y actividad enzimática de manera similar a la que se
obtuvo antes de la inoculación, demostrando que es la sobreexpresión
de Colina Quinasa Alfa la que induce la tumorogénesis in
vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez comprobada la actividad oncogénica de la
isoforma Alfa de la Colina Quinasa, así como su alta incidencia de
sobreexpresión en tumores humanos, hemos estudiado si el efecto
antitumoral del inhibidor MN58b [Hernández-Alcoceba,
R., Saniger, L., Campos, J., Núñez, M. C., Khaless, F., Gallo, M.
Á., Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15,
2289-2301 (1997);
Hernández-Alcoceba, R., Fernández, F., Lacal, J. C.
Cancer Res. 59, 3112-3118 (1999); Ramírez de
Molina A., Báñez-Coronel M., Gutiérrez R.,
Rodríguez-González A., Olmeda D., Megías D.,
Lacal J.C. Cancer Res. 64:6732-6739 (2004)]
es específico de la isoforma Colina Quinasa Alfa o si por el
contrario también podría atribuirse a su posible interacción con la
isoforma Colina Quinasa Beta. Esta comprobación es necesaria,
puesto que las dos isoformas Colina Quinasa Alfa y Colina Quinasa
Beta comparten hasta un 75% de homología en los dominios de unión
al sustrato y en la región catalítica. Para ello, se han expresado
las dos isoformas de Colina Quinasa (CK\alpha y CK\beta) en la
cepa de bacterias E. Coli, que carecen de actividad Colina
Quinasa, y por tanto, toda la actividad enzimática observada es
debida exclusivamente a la isoforma de Colina Quinasa expresada de
forma recombinante. Como se puede observar en la Figura 9, la
actividad enzimática de Colina Quinasa Alfa se ve afectada por el
tratamiento con MN58b, con un efecto más acusado que el ejercido
por el mismo inhibidor sobre la isoforma \beta. De hecho MN58b es
20 veces más activo frente a colina quinasa alfa que frente a colina
quinasa beta.
Dado que se han generado tumores in vivo
sobre-expresando Colina Quinasa Alfa y que MN58b es
específico de esta isoforma, se ha verificado si el crecimiento de
los tumores inducidos por ChoK\alpha es susceptible a la
inhibición por MN58b. Para ello, un millón de células humanas
HEK293T transfectadas con el gen ck\alpha y que mostraron
una alta sobreexpresión del enzima Colina Quinasa Alfa fueron
inyectadas subcutáneamente en ratones inmunodeprimidos nu/nu.
Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral de 0,1 cm^{3} ,
se inició el tratamiento con el inhibidor específico de Colina
Quinasa Alfa, MN58b, que se administró intraperitonealmente en
suero fisiológico estéril durante 5 días consecutivos y 9 de
descanso, a una dosis de 5 mg/Kg. Los ratones control recibieron
dosis equivalentes de vehículo, siguiendo el mismo calendario, y los
tumores fueron monitorizados un mínimo de dos veces por semana.
Como se muestra en la Figura 10, la inhibición de Colina Quinasa
Alfa resulta en una fuerte inhibición del crecimiento tumoral,
alcanzando una reducción del crecimiento tumoral de un 80%. Estos
resultados demuestran no solo que la sobreexpresión de Colina
Quinasa Alfa es suficiente para la inducción de tumores in
vivo, sino que la proliferación de las células tumorales es
dependiente de la actividad de Colina Quinasa Alfa.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos estos resultados avalan el potencial de
Colina Quinasa Alfa como nueva diana terapéutica para el diseño de
una nueva estrategia antitumoral. Sin embargo, los inhibidores
químicos pueden ejecutar su acción antiproliferativa mediante
efectos ocultos al investigador, incluso aunque estén diseñados de
forma específica contra un enzima determinado, como es el caso del
inhibidor MN58b. Existen numerosos casos en la literatura en el que
se demuestra que inhibidores diseñados frente a una quinasa de
forma específica, también afectan a otras quinasas que incluso no
está estrechamente relacionadas entre sí. Existe una aproximación de
reciente desarrollo en los últimos años que permite establecer de
forma más precisa los efectos de interferencia con una enzima en
particular, mediante el uso de siARN (small interference ARN) que
son capaces de eliminar de forma precisa y selectiva el ARNm para
una determinada proteína sin afectar al resto de proteínas
celulares. En nuestro caso, hemos verificado que la interferencia
farmacológica mediante el uso del inhibidor MN58b, específico frente
a Colina Quinasa Alfa, tiene una confirmación a nivel genético
mediante la inhibición específica de Colina Quinasa Alfa por la
técnica de siARN. Esta técnica permitiría validar definitivamente a
ChoK\alpha como nueva diana terapéutica en cáncer. Con este fin,
hemos generado un oligonucleótido capaz de hibridar con el ARN
mensajero de Colina Quinasa Alfa (al que henos denominado siCHKA) y
por tanto de bloquear de forma específica la expresión de esta
proteína. En primer lugar hemos comprobado que nuestro siARN bloquea
de forma eficiente la expresión de Colina Quinasa Alfa en células
humanas HEK293T, tanto la proteína endógena, como una ChoK\alpha
fusionada a GST y transfectada en las mismas células (Figura
11).
Una vez verificado que nuestro ARN interferente
específico de Colina Quinasa Alfa es verdaderamente capaz de
bloquear de forma eficiente la expresión de esta proteína, se ha
pasado a verificar su efecto en las células tumorales derivadas de
un carcinoma de mama humano,
MDA-MB-231, en las que previamente
se había descrito que la inhibición farmacológica de Colina Quinasa
con MN58b inducía un fuerte efecto antitumoral por inducción de
apoptosis. Como se muestra en la Figura 12, a pesar de la menor
eficiencia de transfección que se obtiene en estas células,
observamos que la transfección de siCHKA en
MDA-MB-231, lleva consigo una
inhibición tanto de la expresión de Colina Quinasa Alfa como de su
actividad enzimática. Para verificar que el efecto de la inhibición
genética de Colina Quinasa Alfa mediante siARN es similar al que
obtenemos mediante la inhibición farmacológica con MN58b,
demostrando así de manera inequívoca la especificidad del efecto
sobre Colina Quinasa Alfa, se ha determinado la viabilidad celular
tras la transfección con el interferente siCHKA. Al igual que
ocurre tras el tratamiento de las células tumorales con MN58b, se
observa una disminución en la viabilidad celular, asociada a una
muerte por apoptosis que es específica de las células transfectadas
con el interferente de Colina Quinasa Alfa (Figura 13).
Por último, al igual que ocurre con MN58b, se ha
verificado que la expresión del interferente siCHKA, específico de
Colina Quinasa Alfa, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad de
células normales primarias humanas de mama HMEC (human mammary
epithelial cells). En estas células la expresión basal de esta
proteína es muy baja, ya que, como hemos descrito anteriormente,
las células tumorales sobre-expresan de manera
constitutiva Colina Quinasa Alfa. Sin embargo, a pesar de esta baja
expresión basal de Colina Quinasa Alfa en las células primarias
HMEC, se consigue una clara interferencia de la expresión del enzima
Colina Quinasa Alfa, y se observa cómo estas células, al contrario
de lo que ocurren las células tumorales, no mueren por apoptosis,
sino que son arrestadas en ciclo (Figura 14), un resultado idéntico
al observado el las mismas células tratadas con el inhibidor PAN58b
[Rodríguez-González A., Ramírez de Molina A,
Fernández F., Ramos M.A., Nuñez, M. del C., Campos, J. M, Lacal
J.C. Oncogene 22:8803-8812 (2003);
Rodríguez-González A, Ramírez de Molina A, Fernández
F., Lacal JC., Oncogene 23:8247-8259 (2004);
Rodríguez-González A., Ramirez de Molina A.,
Bañez-Coronel M., Megias D., Núñez M.C and Lacal
J.C Int. J. Oncol 26:999-1008 (2005)].
\vskip1.000000\baselineskip
Para disponer de datos cuantitativos que
confirmaran la implicación de la colina quinasa \alpha en la
generación y en la evolución de tumores, se procedió a realizar
ensayos adicionales de cuantificación de su expresión en pacientes
aquejados por los tipos de cáncer con los que la colina quinasa
\alpha parece estar específicamente relacionada (mama, pulmón y
vejiga) y de su posible relación con el pronóstico de la evolución
de dicho paciente.
Por un lado, se procedió a realizar el análisis
cuantitativo de la expresión de la colina quinasa \alpha aislando
el ARN mensajero de muestras de pacientes. Para ello, se llevaron a
cabo reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con
sondas Taqman específicas que sólo reconocen el ARN mensajero objeto
del estudio, el correspondiente a ChoK\alpha. Los datos obtenidos
se representan en escala logarítmica en base 10 respecto a una
muestra control de tejido normal.
En el caso de los datos obtenidos referentes al
cáncer de mama, los resultados obtenidos se muestran en la Figura
15a. Se observa que las muestras con niveles por encima de la
mediana de activación de ChoK\alpha corresponden a aquellos
pacientes con peor pronóstico (presencia de nódulos linfáticos,
desarrollo de metástasis, menor supervivencia). Estos datos se
confirman con los que aparecen en las Figuras 15b y 15c. En la
Figura 15b, elaborada a partir de los datos obtenidos de 63
pacientes con cáncer de mama, se observa como el valor medio de la
expresión de ChoK\alpha (calculado como unidades relativas de
expresión del gen, calculadas a partir del nivel de ARNm con el
método de 2^{-\Delta\Delta Ct} (Livak, K.J. y Schmitttgen, T. D.
(2001) Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta
C(T)) Method. Methods 25, 402-408)) es muy
superior en los pacientes que presentan metástasis en comparación
con los que no la presentan. Si se representa la probabilidad de
supervivencia de estos pacientes en función de la presencia de
nódulos linfáticos, la cual está asociada significativamente a un
aumento de expresión de ChoK\alpha respecto a los controles
(p< 0,001), se observa en una curva clásica de Kaplan Meier
(Kaplan EL, Meier P. Nonparametric estimation from incomplete
observations. J. Am. Stat. Assoc., 53:457-481
(1958)) cómo la probabilidad de supervivencia disminuye
significativamente a medida que aumenta la presencia de nódulos
linfáticos positivos (p=0,046) (Figura 15c), observándose la misma
tendencia cuando se representa la supervivencia de los pacientes en
función de la expresión de ChoK\alpha (p=0,059).
\vskip1.000000\baselineskip
Para complementar el estudio sobre la
importancia de la sobreexpresión de la colina quinasa \alpha en el
cáncer de pulmón, se realizaron varias pruebas.
En primer lugar, se detectaron los niveles de
ARNm correspondientes a dicha enzima en líneas celulares derivadas
de pacientes con cáncer de pulmón, de nuevo mediante reacciones
automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman
específicas. Se realizaron tanto sobre líneas celulares
correspondientes al cáncer del pulmón más corriente
(75-85%), el no microcrítico o NSCLC (non small
cell lung cancer), representado por las líneas H460 y H1299,
así como sobre líneas correspondiente al otro tipo de cáncer, el
microcítico o SCLC (small cell lung cancer), representado
por las líneas H510 y H82, representándose los datos en escala
logarítmica referidos a células normales humanas primarias de
epitelio bronquial, BEC. Los resultados se muestran en la Figura
16a. Estos datos se complementaron con los de la detección de los
niveles de proteína en cada una de estas líneas celulares mediante
inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal (Figura 16b) y los de la
actividad enzimática detectable en las mismas líneas midiendo el
producto (PCho) marcado radiactivamente generado al cabo de 30
minutos a partir de sustrato (Cho) marcado (Figura 16c). Se observa
en todos los casos un incremento respecto a los controles,
particularmente acusado en el caso de las líneas SCLC, especialmente
H510.
Adicionalmente, se comprobó el efecto
antiproliferativo de la inhibición de ChoK en dichas líneas
celulares provocado por la adición de MN58b, obteniéndose los
resultados que se muestran en la Tabla siguiente, en la que los
números entre paréntesis indican la sensibilidad de cada célula
comparada con células primarias. En todos los períodos de tiempo
analizados, las diferencias entre las células primarias y las cuatro
líneas celulares derivadas de tumores resultaron ser significativas
(p: \leq0,001).
Estos resultados se complementaron con estudios
de sobreexpresión de ChoK\alpha en muestras de tumores humanos de
pacientes con cáncer de pulmón, concretamente en tejido de pacientes
con NSCLC a los que se les ha extraído el tumor en estadio
temprano. La Figura 17 muestra los resultados obtenidos en el
análisis de PCR cuantitativa a tiempo real del ARN mensajero
correspondiente a ChoK\alpha en dichos pacientes operados en
estadios tempranos, resultados en los que se aprecia que ya en un
estado tan temprano de la enfermedad ChoK\alpha está
sobre-expresada respecto al tejido normal en un 53%
de los casos. De nuevo, al analizar la relación entre la expresión
de Chok\alpha con la gravedad del cáncer (estadio y presencia o
ausencia de metástasis), se observó que la expresión de ChoK\alpha
elevada está asociada a una mayor malignidad del tumor, como se
muestran en la Tabla 2:
Como en el caso del cáncer de mama, en estadios
iniciales de NSCLC la sobreexpresión de ChoK\alpha en cáncer de
pulmón está asociada a peor pronóstico, tal como puede observarse en
las gráficas que se presentan en la Fig. 18. En ellas puede
observarse cómo, en los pacientes en los que no se detecta expresión
de ChoK\alpha, la probabilidad de supervivencia se mantiene en el
valor de 1 a lo largo del tiempo, mientras que en los pacientes en
los que se detecta sobreexpresión de ChoK\alpha la probabilidad va
disminuyendo, presentando un valor mediano de 9 meses cuando lo que
se evalúa es la supervivencia libre de enfermedad, es decir, el
tiempo que transcurre desde que los pacientes son operados hasta que
sufren una recaída.
\vskip1.000000\baselineskip
También se realizaron estudios análogos en
pacientes aquejados de cáncer de vejiga. En primer lugar, se
detectaron los niveles de ARNm correspondientes a dicha enzima en
líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de vejiga, de
nuevo mediante reacciones automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo
real con sondas Taqman específicas, de manera similar a como se
describió en el Ejemplo 8 para el caso del cáncer de pulmón. Se
utilizaron las líneas HT1376, J82, SW780, TCCSup y UMVC3,
representándose los datos en escala logarítmica referidos a células
normales de vejiga inmortalizadas, UrotSa. Los resultados se
muestran en la Figura 19a. Estos datos se complementaron con los de
la detección de los niveles de proteína en cada una de estas líneas
celulares mediante inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal
(Figura 19b) y la valoración de la actividad enzimática detectable
en las mismas (Figura 19c). Puede observarse que las diferentes
líneas celulares muestran niveles incrementados de ChoK\alpha
respecto a las células normales inmortalizadas UrotSa, así como que
el incremento de la expresión de la proteína en las líneas
celulares derivadas de cáncer de vejiga viene también acompañado por
un incremento similar en la actividad de la enzima colina
quinasa.
Adicionalmente, se comprobó el efecto
antiproliferativo de la inhibición de ChoK en estas líneas celulares
provocado por la adición de MN58b, obteniéndose los resultados que
se muestran en la Tabla siguiente, en la que los números entre
paréntesis indican el factor de inducción con respecto a la línea
celular con niveles menores de ChoK, TCCSup, pues los datos
obtenidos para UrotSA no se consideraron suficientemente fiables
para realizar la comparación con respecto a ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para establecer paralelismos con
los efectos observados in vivo, se procedió a analizar la
expresión de ChoK\alpha en tejidos tumorales de 90 pacientes con
cáncer de vejiga, utilizando la tecnología de los microarrays,
concretamente el chip U133 Plus 2.0 de Affymetrix. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 20a. En ella puede observarse
como algo más de la mitad, 49 pacientes, mostraban un factor de
inducción de la expresión de entre 1 y 3 veces; 25 pacientes
mostraban un factor de inducción de la expresión de entre 3 y 8
mientras que en 12 de ellos el factor de inducción de la expresión
fue de 8 a 24 veces.
Los datos obtenidos con el microarray se
validaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa a tiempo real
(ensayo con sondas Taqman), del cual se muestran los resultados en
la Figura 20b. En dicho ensayo, se utilizó como referencia ARN
comercial de tejido normal de vejiga humana, utilizándose como
control endógeno GAPDH. En 18 de las 20 muestras analizadas (de las
que 10 de ellas correspondían a los 10 pacientes con menor expresión
de ChoK\alpha y las otras 10 a los 10 pacientes con expresión más
elevada) hubo una coincidencia de resultados en la expresión de
ChoK entre el microarray de Affymetrix y el análisis son sondas
Taqman. La incidencia de sobreexpresión de ChoK\alpha en tumores
fue del 55%. Los pacientes con sobreexpresión resultaron ser los más
metastásicos.
La relación entre la sobreexpresión de
ChoK\alpha y la progresión de metástasis se confirmó con los datos
de expresión de ChoK\alpha de todos los pacientes obtenidos de
los arrays, cuyos resultados se muestran en las Figuras 21a y 21b.
La Figura 21a muestra la variación en los niveles medios de
expresión de ChoK\alpha entre los pacientes negativos y los
positivos respecto a la presencia de nódulos linfáticos (valores
unidos por la recta que presenta cuadrados sin relleno en los
extremos) o el desarrollo de metástasis (valores unidos por la
recta que presenta círculos rellenos en sus extremos). La Figura
21b, por su parte, muestra una gráfica que representa la variación
en la proporción de pacientes con metástasis (barras con relleno
oscuro continuo, 103 ) y sin metástasis (barras
rellenas con líneas inclinadas, //) en los grupos de pacientes con
expresión de ChoK\alpha baja (pareja de barras de la izquierda),
intermedia (pareja de barras situada en el medio de la gráfica) o
alta (pareja de barras situada en la parte derecha de la gráfica),
en la que se ve como, en el grupo de baja expresión, el porcentaje
de pacientes con metástasis (53%) no es muy superior a la de
pacientes sin metástasis (47%), mientras que en el grupo de alta
expresión de ChoK\alpha la mayoría, el 72%, tiene metástasis y el
28% restante no la presenta. Se observa una relación entre la
expresión de ChoK\alpha y el desarrollo de metástasis que no
alcanza el nivel de significación estadística.
Para demostrar in vivo la relevancia de
la sobreexpresión de ChoK\alpha en cáncer de vejiga, se utilizó
también un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, que
fisiológicamente es muy semejante a lo que ocurre cuando se genera
un tumor en la vejiga, utilizando células tumorales
MBT-2 (mouse bladder tumour). En estas
células, que ya tienen sobreexpresada ChoK\alpha con respecto a
las células normales de ratón, se sobre-expresa aún
más esta proteína con el fin de evaluar si una mayor expresión de
ChoK\alpha potencia la agresividad o la invasividad de estos
tumores. Para ello, se inocularon directamente en la vejiga de los
ratones mediante un catéter células MBT-2 que
contenían un vector vacío, carente de secuencias que permitieran
expresar el gen de la ChoK\alpha (grupo de ratones control,
compuesto por tres ratones) o células MBT-2 que
sobre-expresan ChoK\alpha por habérseles
transfectado un vector con la secuencia codificante de dicha enzima
(grupo de ratones ChoK\alpha, compuesto por tres ratones). En
ambos grupos, se monitorizó la generación de tumores mediante
resonancia magnético nuclear con contraste de gadolinio, así como la
evolución de la enfermedad en los ratones (estado físico,
supervivencia, estudio histológico de los tumores, análisis de la
posible invasión de riñón y otros órganos...). 19 días después de
la inoculación de las células, los ratones ChoK\alpha se
encontraban en mal estado, 2 de ellos con un tumor muy grande,
mientras que los ratones que recibieron el vector vacío (grupo
control) empezaron a estar en mal estado 50 días después de la
inoculación de las células.
Los resultados de los Ejemplos 7, 8 y 9
confirman que ChoK\alpha está sobre-expresada con
alta incidencia en tumores humanos de mama, pulmón y vejiga. Su
sobreexpresión se asocia con parámetros clínicos indicadores de
mayor malignidad: presencia de nódulos linfáticos, metástasis y baja
supervivencia de los pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que la interferencia de Chok\alpha en
células tumorales es letal, al inducir la muerte celular por
apoptosis, tal como se demostró en los ensayos descritos en el
Ejemplo 6, realizados de manera transitoria, no se puede disponer
en ese tipo de estudios de una población estable de células que
exprese la construcción interferente. En los ensayos en
transient, resulta afectado un porcentaje de la población
celular variable, no afectando nunca a la población total, lo que
enmascara los resultados. Sería mejor estudiar el efecto de la
construcción en una población que la expresara de forma homogénea,
para lo que sería necesario poder disponer de un modelo estable
constitutivo. Ello hace necesario disponer de un modelo de
interferencia inducible que permita obtener una población
homogéneamente interferida en la expresión de ChoK\alpha.
Para lograr esto, se expresa la secuencia
interferente en una construcción en la cual se encuentra bajo un
represor que evita su expresión. Se efectúa la cotransfección de la
construcción de interés inducible junto con un represor, que evita
su expresión y, una vez seleccionada una población homogénea con
esta construcción, las células son tratadas con un inductor, que
permite la expresión de la construcción interferente y, por tanto,
la interferencia de la expresión de la proteína.
En el modelo inducible diseñado para este
ensayo, la construcción interferente para ChoK\alpha se expresa
en el vector pSUPERIOR-puro (Oligoengine) y el
represor en el vector pcDNA6/TR (Invitrogen). El inductor utilizado
es la doxociclina que, al unirse al represor, impide que éste se una
a la secuencia correspondiente, con lo que la expresión de la
secuencia interferente deja de estar impedida. Un esquema de este
sistema puede observarse en la Figura 22.
En las Figuras 23 y 24 se muestran los
resultados obtenidos en células
Ch-ind-1, una línea celular derivada
de MDA-MB-231, capaz de expresar la
construcción interferente tras el tratamiento con el agente inductor
doxociclina. La Figura 23 demuestra que esta línea inducible sigue
siendo sensible a la inhibición química de ChoK\alpha de manera
similar a lo que sucede en
MDA-MB-231 (la línea parental
control derivada de adenocarcinoma de mama a partir de la cual se
genera Ch-ind-1), pues los
resultados obtenidos tras el tratamiento con los inhibidores de
colina quinasa MN58b o RSM936 son análogos en ambas líneas. La
Figura 24, en cambio, muestra como la inhibición genética de
ChoK\alpha se produce sólo en
Ch-ind-1 al tratar ambas líneas
celulares con 10 \mug/ml de doxociclina, pues la inducción del
modelo interferente con doxociclina sólo puede producirse en la
línea Ch-ind-1, por ser la que
posee una construcción a partir de la cual puede producirse la
síntesis del ARN interferente cuando se impide la unión del
represor). La inhibición genética de ChoK\alpha se correlaciona
con una disminución de la proliferación celular (determinada por
pCNA) y un aumento de la muerte celular por apoptosis (determinada
por PARPdig, proteína PARP degradada, que es un indicador de
apoptosis). El efecto empieza ya a verse a los 10 días, aunque es
aún muy inicial, y es mucho más acusado a los 20 días del inicio del
experimento (donde la población tiene ya muy poca expresión de
ChoK\alpha).
Los resultados obtenidos con el modelo inducible
corroboran los datos obtenidos previamente en transient,
demostrando que los efectos observados son debidos a la inhibición
específica sobre ChoK\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la posible influencia en la
carcinogénesis que pudiera tener una sobreexpresión de colina
quinasa beta (ChoK\beta) y confirmar si el aumento de actividad
colina quinasa observada en distintos tejidos cancerosos y líneas
celulares derivadas de tejidos cancerosos era atribuible
exclusivamente a la colina quinasa alfa o existía también una
participación de la colina quinasa beta, se llevaron a cabo varios
ensayos.
En primer lugar, se generó un anticuerpo
policlonal anti-ChoK\beta1. La especificidad del
mismo se comprobó en tres grupos de células Hek293T transfectadas,
uno con una construcción a partir de la cual se producía la
expresión de ChoK\alpha, un segundo con una construcción que
permitía la expresión en las mismas de ChoK\beta y el tercera con
una construcción en la que se expresaba una proteína quimérica
ChoK\alpha-GFP, así como en un grupo de células
control, transfectadas con un vector vacío. Tal como se muestra en
la parte A de la Figura 25, los ensayos de inmunodetección
demostraron la especificidad de dicho anticuerpo, que dieron lugar
a señal tanto en las células que expresaban ChoK\beta como en las
que expresaban la proteína quimérica
ChoK\beta-GFP, sin que aparecieran señal en la
calle correspondiente a las células transfectadas con la
construcción para la expresión de ChoK\alpha; en estas últimas
células, sin embargo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra
ChoK\alpha dio lugar a señal en una banda que aparecía a la altura
correspondiente a ChoK\alpha.
Para comprobar el posible efecto de ChoK\beta
en carcinogénesis, se ensayó su posible actividad transformante
in vivo. Para ello, se utilizaron de nuevo ratones atímicos
(Nu/Nu) a los que se inyectaron un millón de células humanas
HEK293T transfectadas, bien con un vector vacío como control, con un
vector de expresión de colina quinasa alfa, con un vector de
expresión de colina quinasa beta y, en un último grupo, se produjo
la cotransfección de los vectores que expresaban cada una de las
isoenzimas, colina quinasa alfa y beta. El crecimiento tumoral se
monitorizó al menos dos veces por semana durante 13 semanas después
de la inyección. Como puede observarse en la Figura 26, se observó
una clara inducción de tumores en los animales que habían recibido
las células transfectadas con el vector de expresión de
ChoK\alpha, no observándose inducción de tumores en los ratones
que recibieron las células transfectadas con el vector de expresión
de ChoK\beta. Es llamativo observar que en los ratones que
recibieron células transfectadas con ambos vectores, los de
expresión de ChoK\alpha y ChoK\beta, se observó una ligera
inducción de tumores, de magnitud muy inferior a la observada con
la expresión de ChoK\alpha sólo y observable transcurridas más de
11 semanas desde la inyección de las células transfectadas, lo que
podría indicar que ChoK\beta podría estar regulando ChoK\alpha
de manera directa o indirecta, de forma que inhiba su actividad
oncogénica.
Estos datos se complementaron viendo si existía
una sobreexpresión de la enzima colina quinasa beta en tejidos
extraídos de pacientes aquejados de cáncer. La Figura 27 muestra los
datos obtenidos en muestras de pulmón de pacientes operados tras
aislar el ARN mensajero de las mismas y llevar a cabo reacciones
automatizadas de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas Taqman
específicas, representando los datos obtenidos en escala
logarítmica en base 10 respecto a una muestra control de tejido
normal. En dicha Figura puede observarse como, al contrario de lo
que sucede con la ChoK\alpha, la expresión de ChoK\beta
disminuye con respecto a la obtenida en tejido normal en la mayor
parte de las muestras analizadas.
Estos datos no sugieren que exista una
correlación entre la sobreexpresión de colina quinasa beta y la
generación y desarrollo de tumores.
Todos los resultados indicados en los ejemplos
avalan específicamente a la Colina Quinasa Alfa como una nueva diana
terapéutica en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas.
Claims (5)
1. Un método in vitro para determinar el
pronóstico de un paciente con cáncer que comprende la evaluación del
nivel de expresión de la proteína Colina Quinasa Alfa en una muestra
de tejido canceroso extraído de un paciente mediante la
determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado
con la proteína Colina Quinasa Alfa seleccionado del nivel de su ARN
mensajero y la concentración de dicha proteína, y la comparación del
valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de
tejido normal no-canceroso.
2. El método de la reivindicación 1, en donde se
determina el pronóstico de un paciente con cáncer de pulmón o
vejiga.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en
donde el nivel de ARN mensajero es determinado mediante la
amplificación del ARN mensajero presente en el extracto de ARN total
y cuantificación de la amplificación del producto de ARNm.
4. El método de la reivindicación 3, el cual es
llevado a cabo mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
5. El método según una o más reivindicaciones
anteriores, en donde se diagnostica el tiempo de supervivencia de un
paciente.
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