CN111417855A - 用于治疗和诊断前列腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗和诊断前列腺癌的方法，以及相关的配置和试剂盒。

Description

用于治疗和诊断前列腺癌的方法
发明领域
本发明涉及前列腺癌的治疗和诊断方法。
发明背景
前列腺癌在美国男性中常见。预计发病率将随着人口老龄化而增长(Miller等人, CA:A Cancer J. Clin. 66(4):271-289, 2016)。前列腺癌中最常用的诊断工具为前列腺特异性抗原(PSA)测试、直肠指检和超声组合导向活检和组织病理学Gleason分级(Klotz等人,Nat. Rev. Clin. Oncol. 11(6):324-334, 2014)。其中，只有PSA可分类为生物标志物，但在预测预后方面受到限制，这会导致过度治疗或治疗不足(Barlow等人, Cancer Cell 24(3):e401, 2013; Barry, N. Engl. J. Med. 360(13):1351-1354, 2009; Schröder等人, N. Engl. J. Med. 360(13):1320-1328, 2009)。此外，PSA并非前列腺癌特有的生物标志物，因为其水平在前列腺炎和良性前列腺增生(BPH)中也会升高(Chang等人, Nat.Rev. Clin. Oncol. 11(6):308-323, 2014)。还发现了几种其他生物标志物，比如PSA衍生物和前列腺癌抗原3 (Prensner等人, Sci. Transl. Med. 4(127):127rv3, 2012)。然而，多项研究未能证实这些标志物预测癌症进展的独立价值(Hoffman, N. Engl. J. Med.365(21):2013-2019, 2011; Tosoian等人, J. Urol. 183(2):534-538, 2010)。因此，有必要鉴定可提供更高程度的特异性以检测前列腺癌的侵袭性和预测其进展的新的非侵入性生物标志物。
对于用于前列腺癌、尤其是用于患有晚期或侵袭性癌症的患者的新的治疗，还存在未满足的临床需求。前列腺癌死亡一般地为对雄激素剥夺治疗无反应的侵袭性转移的结果(Walsh等人, N. Engl. J. Med. 357(26):2696-2705, 2007)。
人类胰腺核糖核酸酶为具有多种功能的酶的大型超家族(Cho等人, Genomics 85(2):208-220, 2005)，这些功能包括生长和存活、血管生成、神经发生、免疫调控和宿主防御(Beintema等人, Cell Mol. Life Sci. 54(8):825-832, 1998; Di Liddo等人, Mol.Med. Rep. 3(1):127-132, 2010; Dyer等人, Mol. Divers. 10(4):585-597, 2006;Harder等人, J. Biol. Chem. 277(48):46779-46784, 2002; Hooper等人,Nat.Immunol. 4(3):269-273, 2003; D'Alessio等人, Trends Biochem. Sci. 16(3):104-106, 1991; Kishimoto等人, Oncogene 24(3):445-456, 2005)。在这个超家族的13个成员中，核糖核酸酶4 (RNASE4)为独特的，并具有两个不同特征。特别是，其在脊椎动物物种中具有最保守的氨基酸序列(在人类、牛、小鼠和猪物种中具有94%的同一性)(Rosenberg等人, Nucl. Acids Res. 23(21):4290-4295, 1995; Zhou等人, Eur. J.Biochem. 217(1):401-410, 1993; Hofsteenge等人, Cell Mol. Life Sci. 54(8):804-810, 1998; Seno等人, Biochim. Biophys. Acta Gene Struct. Expr. 1261(3):424-426, 1995), 和具有最严格的底物特异性(仅在尿苷的3’侧)(Terzyan等人, J. Mol.Biol. 285(1):205-214, 1999; Li等人, Angiogenesis 16(2):387-404, 2013)。这些特征表明RNASE4可能具有独特的生物学作用。
发明概述
本发明包括在受试者(比如人类患者)中治疗或预防前列腺癌的方法。这些方法包括给予受试者核糖核酸酶4 (RNASE4)的抑制剂(例如小分子、抗体或其抗原结合片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体)、反义RNA 或shRNA)。
本发明还包括用于鉴定患有前列腺癌或处于其风险下的受试者(比如人类受试者)的方法。这些方法包括确定从受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，样品中RNASE4的表达水平升高将受试者鉴定为患有前列腺癌。在一些实例中，可任选地进行该方法以区分受试者的良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌，并且这类方法中的参考水平可任选地为BPH的特征。在其他实例中，可任选地在确定是否对受试者进行穿刺活检中进行该方法。
本发明还包括用于评价患有前列腺癌的受试者的预后、在受试者中监测治疗功效或选择用于受试者的治疗的方法。这些方法可包括确定从受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，样品中RNASE4的表达水平升高分别表明受试者预后不良，治疗对受试者没有有益作用，或者用RNASE4抑制剂治疗受试者可为有益的。在各种实例中，进行该方法以评价受试者的预后，并且对预后的评价包括确定转移的风险、疾病侵袭性的水平、肿瘤等级或癌症期。
本发明还提供用于在受试者中确定前列腺癌的期、亚期或风险水平(例如TX、T0、T1 (T1a、T1b或T1c)、T2 (T2a、T2b或T2c)、T3 (T3a、T3b或T3c)、T4、NX、N0、N1、MX、M0、M1(M1a、M1b或M1c)、Gleason评分(6或更低、7、8、9或10)、Gleason分组(I、II、III、IV或V)、极低风险、低风险、中度风险、高风险或极高风险)的方法。这些方法包括确定从受试者获得的样品与一种或多种参考样品(例如如本文所述)中RNASE4的表达水平。
在上述诊断方法中，从受试者获得的样品可选自全血、血清、血浆和前列腺组织的样品。此外，所述方法可进一步包括确定样品中前列腺特异性抗原(PSA)和/或血管生成素(ANG)的表达水平。表达水平可通过评价蛋白表达水平(例如通过使用免疫测定，比如酶联免疫吸附测定(ELISA)，任选地使用对RNASE4特异性的抗体或其抗原结合片段(例如单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体))，或者通过评价mRNA表达水平(例如通过qPCR、RNA-Seq、微阵列分析、基因表达概况分析或全基因组测序)来确定。相对于参考水平，RNASE4的表达水平可任选地升高或降低例如约0.1、0.25、0.5、1、2、5或10倍，参考水平任选地为来自治疗之前的受试者的样品中的表达水平、参考群体中的水平、预先指定的水平、患有前列腺癌的受试者中的水平、患有特定期的前列腺癌的受试者中的水平或患有BPH的受试者中的水平。
本发明的诊断方法还可任选地包括治疗受试者前列腺癌的步骤，例如通过给予受试者用于前列腺癌的治疗。任选地，用于前列腺癌的治疗包括RNASE4的抑制剂(例如小分子、抗体或其抗原结合片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体)、反义RNA或shRNA)。
本发明还包括抑制前列腺癌细胞(例如受试者中的前列腺癌细胞)生长的方法，其包括使前列腺癌细胞与RNASE4抑制剂(例如抗体或其RNASE4结合片段)接触。
进一步地，本发明包括在患有前列腺癌的受试者中抑制血管生成的方法，其包括给予受试者RNASE4抑制剂(例如抗体或其RNASE4结合片段)。
本发明还包括用于鉴定患有前列腺癌或处于其风险下的受试者的试剂盒。所述试剂盒可包含(a)一种或多种可用于确定样品中RNASE4蛋白或核酸的水平的多肽(例如针对RNASE4的抗体或其RNASE4结合片段)或多核苷酸(例如对RNASE4核苷酸序列具有特异性的探针或者一种或多种引物)，以及任选地(b)关于在测定中使用所述一种或多种多肽或多核苷酸进行所述确定的说明书。所述试剂盒可进一步任选地包含一种或多种对照多肽或多核苷酸。
“拮抗剂”或“抑制剂”为抑制或降低靶分子(例如RNASE4)的生物学活性的化合物或试剂。拮抗剂包括例如抗体或其抗原结合片段、肽、核酸分子(例如反义分子、shRNA等)和小分子。“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体为抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。术语“RNASE4抑制剂”是指降低、阻断、抑制、防止、消除或干扰RNASE4的活性(例如RNASE4诱导的前列腺细胞增殖或血管生成)的分子。
本文中术语“抗体”广泛地用于涵盖各种抗体结构，包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体和呈现期望的抗原结合活性的抗体片段。抗体可任选地为嵌合的、人类或人源化的。也可使用DNA编码的单克隆抗体。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，比如抗体的抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。单链抗体也可称为抗体片段。
术语“小分子”是指分子量为约2000道尔顿或更小，例如约500道尔顿或更小的任何分子。
本文中RNASE4的“水平”可为样品中存在的RNASE4多核苷酸(例如mRNA)和/或氨基酸产物或蛋白的可检测量。RNASE4的水平可参考RNASE4多核苷酸或蛋白的表达量，其中“表达”通常是指其中将基因编码信息转录为RNA，再加工为mRNA，再翻译为蛋白的过程。“表达增加”、“表达水平升高”或“水平升高”是指相对于对照，比如来自未患前列腺癌的一个或多个个体的匹配样品、内部对照(例如管家生物标志物)或来自一组或一群个体(例如患者；也请参见下文)的样品中生物标志物的中位表达水平，来自测试受试者的样品中生物标志物的表达增加或水平升高。“表达减少”、“表达水平降低”或“水平降低”反过来是指相对于对照，比如来自未患前列腺癌的一个或多个个体的匹配样品、内部对照(例如管家生物标志物)或来自一组/一群个体(例如患者；也请参见下文)的样品中生物标志物的中位表达水平，来自测试受试者的样品中生物标志物的表达减少或水平降低。在某些情况下，表达减少为很少或没有表达。
本文使用的术语“样品”或“测试样品”是指得自或源自受试者(例如测试受试者)，并且含有或怀疑含有例如RNASE4多核苷酸和/或蛋白的组合物。样品包括例如血液(例如全血、血清、血浆或血小板)、细胞样品、组织样品(例如前列腺活检、前列腺肿瘤、转移性肿瘤以及前列腺局部的组织或流体)、原代或培养细胞、细胞上清液、细胞裂解物、淋巴液、滑液、精液、尿液、脑脊液、唾液、痰、眼泪、汗液、粘液、肿瘤裂解物和组织培养基、组织提取物(比如均质组织、肿瘤组织、细胞提取物)及其组合。
“参考样品”或“对照样品”为用于与测试样品进行比较的目的的样品。在各种实例中，参考样品得自一个或多个未患前列腺癌的个体，或者得自治疗之前、期间或之后的测试受试者。RNASE4或其表达的“参考水平”或“对照水平”可任选地基于从“参考样品”或“对照样品”获得的水平。
本文使用的术语“约”是指本领域技术人员易于评价的相应值的通常误差范围。因此，本文中指涉“约”值或参数包括针对该值或参数以及误差范围内的值或参数的实例。
本发明提供几个优点。例如，尽管PSA筛查已导致减少前列腺癌相关的死亡，但也导致过度治疗，这不必要地影响许多患者的生活质量。根据本发明，RNASE4可用作前列腺癌的诊断和预后标志物，并有助于区分前列腺癌与良性前列腺增生(BPH)和预测疾病的侵袭性。因此，本发明可用于更准确地诊断前列腺癌，以避免不必要的治疗。另外，关于早期筛查，RNASE4筛查相对于PSA显示出改进，并且可与PSA筛查组合用于提高PSA筛查的准确性。本发明还提供RNASE4作为用于治疗和预防前列腺癌的新的治疗靶标。另外，本发明包括本文所述的治疗用于预防和/或治疗本文所述的疾病和病症的用途，以及这些治疗用于制备用于这些目的的药物的用途。
根据以下详述、附图和权利要求，本发明的其他特征和优点将为显而易见的。
附图简述
图1A-F. RNASE4多克隆抗体(pAb)和mAb的灵敏度和特异性. (A) 在免疫印迹中通过RNASE4 pAb检测人类RNASE4蛋白。RNASE4 pAb以0.5 μg/ml能够检测到低至50 pg RNASE4。(B) 在免疫印迹中通过RNASE4 mAb检测人类RNASE4蛋白。RNASE4 mAb以1 μg/ml能够检测到低至1 ng RNASE4。(C) 在斑点印迹中通过RNASE4 mAb检测人类和小鼠RNASE4蛋白。RNASE4 mAb以1 μg/ml能够在斑点印迹中检测到0.5 ng人类RNASE4，但不能检测到2 ng小鼠RNASE4。(D) 在免疫印迹中通过RNASE4 mAb检测人类和小鼠RNASE4蛋白。RNASE4 mAb以1μg/ml能够在免疫印迹中检测到1 ng人类RNASE4，但不能检测到10 ng小鼠RNASE4。(E) 在斑点印迹中通过RNASE4 mAb检测RNASEA、人类和小鼠ANG、人类和小鼠RNASE4、溶菌酶和BSA。RNASE4 mAb以1 μg/ml能够检测到1和10 ng人类RNASE4，但不能检测到别的东西。(F)使用以上RNASE4 pAb和mAb的RNASE4夹心ELISA的典型标准曲线。
图2A-E. 前列腺癌中RNASE4的上调. (A) 健康对照受试者(n=120)和前列腺癌(PC)患者(n=120)血浆中的RNASE4蛋白水平。通过ELISA确定RNASE4的量。每个圆点代表单个样品。线标示中位值和四分位距。(B) 接收操作特性(ROC)曲线分析。AUC，曲线下面积；+PV，阳性预测值；- PV，阴性预测值；+ LR，阳性似然比；-LR，阴性似然比。(C) 来自正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和前列腺癌细胞系DU145、PC-3和LNCaP的RNASE4的免疫印迹分析。上图，免疫印迹；下图，使用微管蛋白作为上样对照，通过Image J对RNASE4蛋白水平的量化。(D) 通过qRT-PCR测定的正常前列腺和癌细胞系的100 ng总RNA中的RNASE4 mRNA拷贝数。通过未配对双尾学生t检验，** P≤0.01和*** P≤0.001。(E) 组织微阵列中RNASE4的IHC分析。左图，前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)和正常前列腺组织的两组代表性图像，比例尺= 50 µm；右图，前列腺癌(n = 50)、BPH (n = 20)和正常前列腺(n = 10)组织中RNASE4的半定量评分。通过ANOVA使用Dunnett的多重比较检验对数据进行分析。每个圆点代表单个组织样品的评分。图中的水平线代表中位值和四分位距。
图3A-I. PSA水平在前列腺癌患者血浆中升高，但与预后不良无关。(A) 健康对照受试者(n = 120)和前列腺癌患者(n = 120)血浆样品中的PSA水平。每个圆点代表单个样品。线标示中位值和四分位距。(B) 操作特性曲线(ROC)分析。AUC，曲线下面积；+ PV，阳性预测值；- PV，阴性预测值；+ LR，阳性似然比；-LR，阴性似然比。(C) PSA和RNASE4的组合ROC曲线分析显示分别在2 ng/ml和117 ng/ml截断值的改善的灵敏度和特异性。所示数据为平均值±SEM。(D和E) PSA≤2 ng/ml (D)和PSA≤4 ng/ml (E)的患者的PSA和RNASE4的ROC曲线分析。(F-I) 血浆PSA水平与肿瘤手术T期(F)、临床期(G)、活检等级(H)和手术Gleason (I)缺乏相关性。通过单向ANOVA (F和G)和双尾学生t检验(A、H和I)分析未发现显著差异。
图4A-I. ANG水平在前列腺癌患者血浆中升高，并且仅与手术T期相关。(A) 健康对照受试者(n = 120)和前列腺癌患者(n = 120)血浆中的ANG蛋白水平。通过ELISA确定ANG的量。每个圆点代表单个样品。线标示中位值和四分位距。(B) 操作特性曲线(ROC)分析。AUC，曲线下面积；+ PV，阳性预测值；- PV，阴性预测值；+ LR，阳性似然比；-LR，阴性似然比。(C) 所有血浆样品(n = 240)中RNASE4和ANG之间的相关性。(D-G) 前列腺癌患者中的血浆ANG水平按手术T期(D)、临床期(E)、活检等级(F)和手术Gleason (G)分层。仅在pT1和pT3、pT2和pT3之间(D)以及在T1c和T2b之间(E)发现统计学显著差异。(H和I) PSA≤2ng/ml (H)和PSA≤4 ng/ml (I)的患者的ANG和PSA的ROC曲线分析。使用的统计分析为单向ANOVA(D和E)和双尾学生t检验(A、F和G)。ns=不显著。
图5. 组织微阵列中的RNASE4 IHC评分. 使用半定量评分量表对组织微阵列中RNASE4的染色密度进行评分。IHC评分如括号中所示。染色从1 (低)到4 (极高)排列。正常前列腺组织中的RNASE4染色为低。肝细胞肝癌组织用作阳性染色对照。比例尺= 50 µm。
图6A-C. 人类癌症中RNASE4表达水平的生物信息学分析. (A) 来自Bittner多癌症数据集的不同人类癌症中的RNASE4 mRNA水平。(B) 来自Su多癌症数据集的不同人类癌症中的RNASE4 mRNA水平。盒代表受第25个(Q1)和第75个(Q3)百分位数限制的中位数(黑色中线)。须为上和下邻近值，其分别是Q3+1.5 (Q3-Q1)和Q1-1.5 (Q3-Q1)内的最极端值。患者样品的数量如括号中所示。(C) 来自两个数据集的前列腺癌中的RNASE4过表达的P值和倍数变化。
图7A-D. RNASE4和AXL基因拷贝数的增加与前列腺癌的预后不良相关。(A和B) 在健康对照受试者和前列腺癌(PC)患者中来自TCGA数据集(Oncomine.org)的RNASE4 (A)和AXL (B) DNA拷贝数变化的生物信息学数据。(C和D) Kaplan-Meier存活曲线显示RNASE4(C)和AXL (D)的基因拷贝数增加与无复发前列腺癌患者存活呈反向相关。使用双尾学生t检验和对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计分析。
图8A-B. 正常人类器官中RNASE4 mRNA水平的生物信息学分析. (A) RNASE4mRNA水平高于所有人类器官平均水平的器官。盒代表受第25个(Q1)和第75个(Q3)百分位数限制的中位数(黑色中线)。须为上和下邻近值，其分别是Q3+1.5 (Q3-Q1)和Q1-1.5 (Q3-Q1)内的最极端值。患者样品的数量如括号中所示。0处的水平线标示所有器官的平均RNASE4 mRNA水平。前列腺中的RNASE4 mRNA水平为其他健康器官的4.33倍(p = 6.21x10-23)。(B) 表达水平最高的7个健康人类器官中RNASE4 mRNA的P值和倍数变化。
图9A-I. 前列腺癌患者血浆组织中的RNASE4蛋白水平与预后不良和高转移风险相关。(A-D) 血浆RNASE4蛋白水平与肿瘤手术T期(A)、临床期(B)、活检等级(C)和手术Gleason (D)的相关性。通过ELISA测定血浆中的RNASE4水平(E-I)。组织RNASE4水平与肿瘤组织学等级(E)、Gleason评分(F)、肿瘤期(G)、远端转移(H)和淋巴结转移(I)的相关性。通过半定量IHC测定组织RNASE4的水平。每个圆点代表单个样品。线表示中位值和四分位距。通过单向ANOVA(A和B)和双尾学生t检验(C-I)进行统计分析。
图10A-E. RNASE4诱导前列腺癌细胞增殖以及AKT和S6的磷酸化。(A和B)外源性RNASE4 (1 μg/ml)刺激在存在2% FBS的情况下培养的DU145细胞的细胞增殖(A)和细胞周期进程(B)。通过MTT测定确定细胞数量。与RNASE4一起温育24小时之后，通过流式细胞术确定细胞周期状态。(C) RNASE4 (1 µg/ml)对血清饥饿的DU145细胞进行的AKT和S6磷酸化的时间过程。左图，免疫印迹；右图，通过Image J分析针对总AKT和S6归一化的p-AKT和p-S6的量化。(D) AKT抑制剂MK-2206、PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002及mTOR抑制剂雷帕霉素对RNASE4诱导的AKT和S6磷酸化的影响。将细胞与所示浓度的抑制剂一起预温育1小时，之后用1 µg/ml RNASE4刺激5分钟。上图，免疫印迹；下图，针对总AKT和S6归一化的p-AKT和p-S6的Image J量化。(E) AKT抑制剂MK-2206、PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002及mTOR抑制剂雷帕霉素对RNASE4诱导的细胞增殖的影响。将DU145细胞血清饥饿过夜，与抑制剂一起温育1小时，并然后用RNASE4 (1 µg/ml)处理3天。通过MTT测定确定细胞数量。所示数据来自一式三份3个独立重复的代表性实验。误差线表示SEM。通过未配对双尾学生t检验，** P≤0.01。
图11A-F. RNASE4诱导PC-3细胞增殖以及AKT和S6的磷酸化。(A) 在存在2% FBS的情况下，外源性RNASE4 (1 μg/ml)刺激PC-3细胞增殖。通过MTT测定确定细胞数量。(B)RNASE4 (1 µg/ml)对血清饥饿的PC-3细胞进行的AKT和S6磷酸化的时间过程。左图，免疫印迹；右图，通过Image J针对总AKT和S6归一化的p-AKT和p-S6的量化。(C) AKT抑制剂MK-2206、PI3K抑制剂LY294002和渥曼青霉素及mTOR抑制剂雷帕霉素对RNASE4诱导的PC-3细胞增殖的影响。将细胞与所示浓度的抑制剂一起预温育1小时，之后用RNASE4 (1 µg/ml)刺激3天。通过MTT测定确定细胞数量。(D) 用或不用1 µg/ml RNASE4处理5分钟的饥饿的PC-3细胞的人类磷酸化RTK抗体阵列分析。(E) PC-3细胞中RNASE4刺激的AXL磷酸化的时间过程。血清饥饿的PC-3细胞用1 μg/ml RNASE4处理不同的时间。通过免疫印迹分析细胞裂解物的总AXL和磷酸化AXL。左图，免疫印迹；右图，通过Image J分析针对总AXL归一化的磷酸化AXL的量化。(F) AXL抑制剂R428对RNASE4诱导的PC-3细胞增殖的影响。将血清饥饿的PC-3细胞与1或3 μM R428一起温育3小时，并然后用1 μg/ml RNASE4刺激3天。通过MTT测定确定细胞数量。所示数据为一式三份3个独立重复的代表性实验的平均值±SEM。通过未配对双尾学生t检验，** P≤0.01和*** P≤0.001。
图12A-F. RNASE4诱导AXL磷酸化。(A) 人类磷酸化受体酪氨酸激酶(RTK)抗体阵列分析。用或不用1 µg/ml RNASE4处理血清饥饿的DU145细胞5分钟。在每个阵列膜上印迹总共1.5 mg细胞裂解物蛋白。右图显示p-AXL的平均像素强度。(B) RNASE4刺激的AXL磷酸化的免疫印迹分析。将DU145细胞血清饥饿过夜，并用1 µg/ml RNASE4处理指定时间。通过针对总AXL和磷酸化AXL的抗体分析细胞裂解物，用β-肌动蛋白作为上样对照。左图，免疫印迹；右图，针对总AXL归一化的p-AXL的Image J量化。(C) 响应ANG、RNase A和RNASE4刺激的磷酸化AXL的免疫印迹分析。将DU145细胞血清饥饿过夜，并用1 µg/ml ANG、RNase A或RNASE4处理15分钟。左图，免疫印迹；右图，量化。(D) AXL抑制剂R428对RNASE4诱导的细胞增殖的影响。将血清饥饿的DU145细胞与1或3 μM R428一起温育3小时，并然后用1 μg/mlRNASE4刺激3天。通过MTT测定确定细胞数量。所示数据为(一式三份)3个独立重复的代表性实验的平均值±SEM。通过未配对双尾学生t检验，** P≤0.01和*** P≤0.001。(E) AXL抑制剂R428对RNASE4诱导的AKT和P6磷酸化的影响。将血清饥饿的DU145细胞与1或3 μM R428一起温育3小时，并然后用1 μg/ml RNASE4刺激5分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物的AKT和P6磷酸化。上图，免疫印迹；下图，分别针对总AKT和P6归一化的磷酸化AKT和磷酸化S6通过Image J分析的量化。(F) 提议的AXL参与RNASE4刺激的细胞事件的示意图。
图13A-D. RNASE4敲减减少前列腺癌细胞的体外增殖和软琼脂中的集落形成。(A)用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的PC-3细胞中RNASE4的免疫印迹分析。(B) 在用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的PC-3细胞中针对GAPDH归一化的RNASE4 mRNA的qRT-PCR分析。(C) RNASE4敲减对细胞增殖的影响。细胞数量通过Coulter计数器计数。当存在时，外源性RNASE4的浓度为1 µg/ml。所示数据来自(一式三份)3个独立重复的代表性实验。(D) RNASE4敲减对软琼脂中PC-3细胞的集落形成和生长的影响。将相同数量的对照和RNASE4敲减细胞接种于软琼脂中，并在不存在或存在1 µg/ml RNASE4的情况下生长14天。在Nikon Eclipse ti显微镜上计数集落和测量大小。左图，集落的代表性图像；比例尺= 100 μm。右图，集落数量和大小的量化。所示数据为来自代表性实验的每个培养皿中5个随机选定视野的平均值±SEM。通过双尾学生t检验，*P≤0.05，** P≤0.01和***P≤0.001。
图14A-D. RNASE4敲减抑制DU145细胞的体外增殖和软琼脂中的集落形成。(A) 用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的DU145细胞中RNASE4的免疫印迹分析。(B)在用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的DU145细胞中针对GAPDH归一化的RNASE4 mRNA的qRT-PCR分析。(C) RNASE4敲减对细胞增殖的影响。细胞数量通过Coulter计数器计数。当存在时，外源性RNASE4的浓度为1 µg/ml。所示数据来自一式三份3个独立实验的代表性实验。(D) RNASE4敲减对软琼脂中DU145细胞的集落形成和生长的影响。将相同数量的对照和RNASE4敲减细胞接种于软琼脂中，并在不存在或存在1 µg/ml RNASE4的情况下生长14天。在Nikon Eclipse ti显微镜上计数集落和测量大小。上图，集落的代表性图像；比例尺= 100 μm。下图，软琼脂中DU145细胞集落和大小的量化。所示数据为来自代表性实验的每个培养皿中5个随机选定视野的平均值±SEM。通过双尾学生t检验，** P≤0.01和*** P≤0.001。
图15A-D. RNASE4敲减抑制LNCaP细胞的体外增殖和软琼脂中的集落形成。(A) 用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的LNCaP细胞中RNASE4的免疫印迹分析。(B)在用shControl、shRNASE4-1和shRNASE4-2稳定转染的LNCaP细胞中针对GAPDH归一化的RNASE4 mRNA的qRT-PCR分析。(C) RNASE4敲减对LNCaP细胞增殖的影响。细胞数量通过Coulter计数器计数。当存在时，外源性RNASE4的浓度为1 µg/ml。所示数据来自一式三份3个独立重复的代表性实验。(D) RNASE4敲减对软琼脂中LNCaP细胞的集落形成和生长的影响。将相同数量的对照和RNASE4敲减细胞接种于软琼脂中，并在不存在或存在1 µg/mlRNASE4的情况下生长14天。在Nikon Eclipse ti显微镜上计数集落和测量大小。上图，集落的代表性图像；比例尺= 100 μm。下图，软琼脂中LMCaP细胞集落和大小的量化。所示数据为来自代表性实验的每个培养皿中5个随机选定视野的平均值±SEM。通过双尾学生t检验，**P≤0.01和*** P≤0.001。
图16A-D. RNASE4敲减减慢无胸腺小鼠中人类前列腺癌细胞肿瘤的异种移植物生长。(A) 无胸腺小鼠中PC-3对照和RNASE4敲减细胞的生长曲线。将相同数量的shControl和shRNASE4-1转染的PC3细胞(每只小鼠1x106)皮下接种于裸小鼠的右下背部(每组n = 6)。每周两次测量肿瘤体积。(B) 源自对照和RNASE4敲减PC-3细胞的肿瘤重量。在第24天处死小鼠，并将其肿瘤解剖和称重。(C) 源自对照和RNASE4敲减PC-3细胞的肿瘤切片中RNASE4、Ki-67和CD31的IHC分析。Ki-67阳性细胞和CD31阳性新生血管的量化来自5个随机选定的显微镜视野。比例尺= 100 μm。所示数据为平均值±SEM。(D) 源自对照和RNASE4敲减PC-3细胞的肿瘤切片中总AXL和磷酸化AXL (p-AXL)的IHC分析。比例尺= 100 μm。通过双尾学生t检验，* P≤0.05，** P≤0.01和*** P≤0.001。
图17A-C. RNASE4 mAb抑制前列腺癌细胞的增殖和RNASE4诱导的血管生成。(A)RNASE4 mAb对细胞增殖的影响。在存在2% FBS的情况下培养DU145、PC-3和LNCaP细胞。以所示浓度添加RNASE4 mAb或同种型对照IgG2bκ。细胞数量通过Coulter计数器计数。(B)RNASE4 mAb对DU145细胞的细胞周期分布的影响。将细胞在2% FBS和RNASE4 mAb (30 µg/ml)或同种型对照IgG2bκ (30 µg/ml)中培养3天。细胞周期状态通过流式细胞术确定。(C)RNASE4 mAb对内皮细胞管形成的影响。HUVEC在Matrigel包被的孔中进行培养，并在不存在或存在1 µg/m RNASE4与30 µg/ml RNASE4 mAb或同种型对照IgG2bκ的情况下温育4小时。上图，一式两份3个独立重复的代表性实验的内皮细胞管状结构的图像。比例尺= 50 μm。下图，从5个随机选定区域计算的管长和环数。所示数据为平均值±SEM。通过双尾学生t检验，* P≤0.05，** P≤0.01和*** P≤0.001。
图18. RNASE4 mAb不抑制碱性FGF (bFGF)诱导的血管生成。将HUVEC在Matrigel包被的孔中于基础内皮细胞培养基中进行培养，并在不存在或存在5 ng/ml bFGF与30 µg/ml RNASE4 mAb或同种型对照IgG2bκ的情况下温育4小时。未经处理的空白孔用作阴性对照。上图，一式两份3个独立重复的代表性实验的内皮细胞管状结构的图像。比例尺= 200 μm。下图，从5个随机选定区域计算的管长和环数。所示数据为平均值±SEM。通过双尾学生t检验，*** P≤0.001和ns=不显著。
图19. RNASE4 mAb以剂量依赖性方式抑制RNASE4介导的血管生成。将HUVEC在Matrigel包被的孔中于基础内皮细胞培养基中进行培养，并在不存在或存在各种浓度的RNASE4 mAb或同种型对照IgG2bκ的情况下用1 µg/ml RNASE4刺激4小时。未经处理的孔用作阴性对照，和经bFGF (5 ng/ml)处理的孔用作阳性对照。上图，一式两份3个独立重复的代表性实验的内皮细胞管状结构的图像。比例尺= 200 μm。下图，从5个随机选定区域计算的管长和环数。所示数据为平均值±SEM。通过双尾学生t检验，* P≤0.05，** P≤0.01和*** P≤0.001。
图20A-E. RNASE4 mAb抑制无胸腺小鼠中异种移植人类前列腺细胞肿瘤的建立。将PC-3细胞(每只小鼠1x106)皮下接种于雄性无胸腺小鼠的背部。接种后一天，通过每3天一次腹膜内注射PBS (n=6)或RNASE4 mAb (10 mg/kg, n=6)治疗小鼠。(A) 每3天一次测量的肿瘤体积。(B) 在第64天处死动物，将肿瘤解剖并称重。左图，肿瘤重量；右图，来自PBS和RANSE4 mAb治疗组的肿瘤的代表性图像。(C) 经PBS和RNASE4 mAb治疗动物的体重。(D) 来自经PBS和RNASE4 mAb治疗动物的肿瘤切片中Ki-67、CD31、总AXL和磷酸化AXL (p-AXL)的IHC分析。左图，代表性图像；右图，来自5个随机选定的显微镜视野中Ki-67阳性细胞和CD31阳性新生血管的量化。(E) 凋亡细胞的TUNEL染色。细胞核用DAPI染色。右图，代表性图像；右图，在5个随机选定区域中计数的TUNEL阳性细胞百分比。所示数据为平均值±SEM。比例尺= 100 μm。通过双尾学生t检验，** P≤0.01，*** P≤0.001和n.s. =不显著。
图21A-D. RNASE4 mAb抑制无胸腺小鼠中已建立的异种移植人类前列腺细胞肿瘤的生长。将PC-3细胞(1x106)皮下接种于雄性无胸腺小鼠的背部。在肿瘤体积达到~100 mm3之后(第21天)，将小鼠分组并经每周3次腹膜内注射PBS (n=12)或RNASE4 mAb (10 mg/kg或30 mg/kg, 每组n=6)进行治疗。(A) 每3天测量的肿瘤体积。(B) 肿瘤重量。在第39天处死小鼠，将肿瘤解剖并称重。左图，平均肿瘤重量；右图，来自3组的代表性肿瘤图像。(C)ki-67、CD31、总AXL和磷酸化AXL (p-AXL)的IHC分析。左图，代表性图像；右图，来自5个随机选定的显微镜视野的Ki-67阳性细胞和CD31阳性新生血管的量化。(D) 凋亡细胞的TUNEL染色。细胞核用DAPI染色。右图，代表性图像；右图，5个随机选定区域中的TUNEL阳性细胞百分比。所示数据为平均值±SEM。比例尺= 100 μm。通过双尾学生t检验，* P≤0.05和** P≤0.01。
详述
本发明提供用于诊断、预防和治疗前列腺癌的方法和试剂盒。本发明至少部分地基于我们的发现，即RNASE4在前列腺癌中上调，并因此具有诊断、预后和治疗应用。特别是，并且如以下进一步讨论的，我们发现RNASE4表达水平在前列腺癌中逐渐升高，与疾病的侵袭性相关，并可准确地区分健康受试者与患有前列腺癌的受试者以及患有BPH的受试者与患有前列腺癌的受试者。此外，我们发现RNASE4水平可用于独立地预测活检结果。我们还发现，RNASE4的抑制在体外和体内减少前列腺癌细胞的增殖以及RNASE4诱导的血管生成，从而为治疗方法提供基础。本发明的方法和试剂盒在以下进一步描述。
诊断和预后方法
我们发现RNASE4的水平在前列腺癌中上调。例如，我们发现前列腺癌患者血浆中的RNASE4蛋白水平升高，并且其水平与疾病期、等级和Gleason评分呈正相关。此外，我们发现血浆RNASE4水平可用于预测活检结果并提高诊断的准确性，以及前列腺癌组织中的RNASE4蛋白水平提高并可区分前列腺癌与BPH。因此，在许多不同情况下，RNASE4水平的检测可用于诊断和预后方法(下文统称为诊断方法)。
最基本地，RNASE4水平的检测可用于确定受试者(比如人类患者)是否患有前列腺癌。在这些方法中，确定来自受试者的样品中RNASE4的水平，并与参考水平进行比较，参考水平可由本领域技术人员设定。在一个实例中，参考水平为确定为代表以下受试者(例如年龄匹配受试者)的量或范围，所述受试者未患前列腺癌，如例如通过特定类型的测定(参见例如下述测定类型)确定的。因此，例如，与未患前列腺癌的健康受试者特有的水平或范围相比较，检测到来自测试受试者的样品中RNASE4的水平升高可表明该测试受试者患有前列腺癌。或者，检测到来自测试受试者的样品中RNASE4的水平处于正常范围内或者处于或低于正常水平，可表明该测试受试者未患前列腺癌。在另一个实例中，参考水平为代表患有前列腺癌的受试者的量或范围。与该参考水平相比较，检测到来自测试受试者的样品中RNASE4的水平较低可表明测试受试者未患前列腺癌，而检测到水平较高或相似可表明测试受试者患有前列腺癌。任选地，可使用多种类型的参考(例如正常/健康参考水平或范围，和/或前列腺癌特有的水平或范围)。在一个实例中，在受试者的血浆样品中检测到大于100ng/ml (例如大于110、120、130、140或150 ng/ml)可用于诊断前列腺癌。
RNASE4水平的检测也可用于区分前列腺癌与良性前列腺增生(BPH)。这特别有用，因为例如PSA不仅在前列腺癌中升高，而且在BPH和前列腺炎中也升高。因此，检测到PSA水平升高可能导致不必要的治疗并给可能实际上未患前列腺癌的患者带来困扰。由于RNASE4水平在前列腺癌和BPH之间不同，因此本发明的方法可有助于减少假阳性，从而减少不必要的治疗和患者担忧。在这些方法中，所用的参考水平可为例如确定代表患有BPH的受试者(例如年龄匹配受试者)的量或范围。因此，例如，与BPH特有的水平或范围相比较，检测到来自测试受试者的样品中RNASE4的水平升高可表明测试受试者患有前列腺癌。或者，检测到RNASE4的水平处于正常范围内或者处于或低于与BPH相关的水平，可表明受试者未患前列腺癌。而是，取决于检测到的RNASE4水平和任选地其他特征(例如临床特征)，可确定受试者患有BPH。代替BPH相关参考水平或范围或除了BPH相关参考水平或范围之外，可使用前列腺癌和/或正常/健康受试者特有的水平或范围。
我们已经观察到，RNASE4水平的升高与前列腺癌的各种临床特征(包括例如手术T期、临床期、活检等级和手术Gleason评分)相关。在具有远端或淋巴结转移的受试者中也检测到RNASE4的水平较高。因此，本发明的方法可用于评价受试者的预后以及确定其前列腺癌可能进展的程度(或没有进展)。特别是，可确定来自测试受试者的样品中RNASE4的水平，并与特定临床特征、预后、期、等级和/或转移风险水平特有的水平或范围进行比较。这些方法的益处在于，其可用于促进基于其病况的特定特征选择适当的用于受试者的治疗方法。这可确保受试者不会受到比需要的更严重的治疗，并且还可确保在患者的特定病况情况下使用足够的治疗水平。本发明的方法可类似地用于在患者中确定前列腺癌转移或复发的可能性。在一个特定实例中，这些方法可用于区分侵袭性与惰性肿瘤，这是使用基于PSA的测试无法分辨的重要区别。
更详细地，RNASE4水平可与癌症的期或等级的多种不同指标相关。例如，可与TNM分期系统的不同方面进行关联，如本领域已知的，TNM分期系统包括以下期和亚期：TX、T0、T1 (T1a、T1b和T1c)、T2 (T2a、T2b和T2c)、T3 (T3a、T3b和T3c)、T4、NX、N0、N1、MX、M0和M1(M1a、M1b和M1c)。也可与组织病理学Gleason评分或分组(比如Gleason评分为6或更低(细胞分化良好)、Gleason 7 (细胞中度分化)、Gleason 8-10 (细胞分化不良或未分化)、Gleason I组(Gleason评分为6)、Gleason II组(Gleason评分为3 + 4 = 7)、Gleason III组(Gleason评分为4 + 3 = 7)、Gleason IV组(Gleason评分为8)和Gleason V组(Gleason评分为9或10))或风险类别进行关联。关于风险类别，测试受试者可处于极低风险(肿瘤通过DRE未感觉到并且通过成像未见，但通过穿刺活检发现(T1c)；PSA小于10 ng/ml；Gleason评分6或更低；核心活检中在少于3个样品中发现癌症；在任何核心的一半或更少中发现癌症)、低风险(肿瘤特征为T1a、T1b、T1c或T2a；PSA小于10 ng/ml；Gleason评分6或更低)、中度风险(肿瘤具有两个或更多个以下特征：T2b或T2c；PSA在10-20 ng/ml之间；Gleason评分为7)、高风险(肿瘤具有两个或更多个以下特征：T3a；PSA高于20 ng/ml；Gleason评分在8-10之间)或极高风险(T3b或T4；主要细胞生长模式的组织学等级为5，或超过4个活检核心Gleason评分在8-10之间)下。RNASE4水平可进一步与转移和死亡的0-2 (低)、3-5 (中度)或6-10 (高)风险的UCSF-CAPRA评分相关。
本发明的方法也可用于监测治疗过程。例如，如果例如使用本文所述的方法确定受试者患有前列腺癌，则可监测其治疗过程以评价其进展。在这些方法中，可例如在治疗之前、期间和/或之后确定RNASE4水平。例如，如果RNASE4水平在治疗过程中降低至本领域技术人员确定为有益的水平和/或以本领域技术人员确定为有益的速率降低，则可认为治疗是成功的。或者，与对有效结果的期望相比较，如果水平没有降低或者如果其仅小量或缓慢地降低，则可认为治疗不成功。在这种情况下，可确定最好进行不同的治疗过程。可根据本发明的这些方法监测的治疗包括例如用RNASE4抑制剂(例如针对RNASE4的抗体或其RNASE4结合片段；参见下文)治疗。治疗还包括例如放射、手术(例如前列腺切除术或睾丸切除术)、冷冻疗法、超声治疗、激素治疗(例如促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂(例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林或组氨瑞林)或LHRH拮抗剂(例如地加瑞克)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿比特龙或恩杂鲁胺)或其组合)、化学治疗(例如多西他赛，任选地与泼尼松组合；米托蒽醌；或卡巴他赛)或免疫治疗(例如普列威)。
包括RNASE4水平的检测的本发明方法可作为所使用的唯一诊断方法来进行。就包括效率和成本在内的特征而言，这提供实质性益处。或者，这些方法可与其他诊断方法组合进行。因此，例如，本发明的方法可与一种或多种其他生物标志物(例如PSA、PSA衍生物、ANG和/或前列腺癌抗原3)的检测、直肠指检、超声、活检、MRI融合、PET扫描和基因组测试组合进行。然而，在一些情况下可进行本发明的方法，以避免需要更加侵入性的程序，比如穿刺活检。在本发明的特定组合方法的一个实例中，通过确定来自测试受死者的样品中PSA和RNASE4两者的水平，来增强基于PSA的诊断测试的性能。这些方法在PSA水平低(例如小于4、3或2 ng/ml)的受试者的情况下特别有益，其中发现RNASE4检测更准确(参见以下实施例)。鉴于这些结果，RNASE4检测可有利地用于诊断PSA低(例如小于2 ng/ml)的患者的较早疾病状态。除了标准PSA水平分析(例如血液测试中的PSA水平)之外，其他与PSA相关的测试也可与RNASE4检测方法组合进行，包括例如分析游离PSA百分比、PSA速度和PSA密度以及前列腺健康指数(phi)的确定或4Kscore测试。
RNASE4的量可使用标准方法以例如蛋白或mRNA的水平确定。因此，例如，在蛋白的情况下，水平可使用多种已知免疫测定和其他方法中的任何一种来确定，所述方法包括例如酶联免疫测定(ELISA)、免疫组织化学(IHC)、免疫沉淀、蛋白质印迹、流式细胞术(例如荧光激活细胞分选)、斑点印迹、放射免疫测定、光谱法(例如质谱法)、色谱法(例如HPLC)、肿瘤微阵列和蛋白质组学分析。在mRNA的情况下，可使用包括例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA-Seq、原位杂交、Northern分析、微阵列分析、RNase保护、基因表达概况分析以及这些测定中任何一种的多重形式在内的方法。此处列出的测定仅为示例性的，因为可使用广泛种类的众所周知的测定中的任何一种来评价表达，如本领域已知的。特定测定的选择可能受到例如测试样品的类型、可用的对照以及可用的测试设备和设施的影响。可使用本发明的方法测试的样品包括例如基于血液的样品(例如全血、血清和血浆样品)、其他生物流体(例如尿液)和组织样品(例如前列腺组织活检样品，其可能包含前列腺癌细胞)。在具体实例中，可测试组织样品(例如前列腺活检)以区分BPH与前列腺癌。
如本文所述，诊断前列腺癌(或其特定期或特征或BPH)或参考特有的特定RNASE4表达水平可由本领域技术人员确定。这可例如通过评价来自正常/健康受试者的数据或样品(例如来自未受影响个体的合并样品)或来自患者群体的数据或样品(例如来自受影响个体的合并样品)来完成。患者群体可包括例如患有特定病况(例如前列腺癌或BPH)或特定病况的特定期或等级(例如特征在于特定期或其他临床特征的前列腺癌；参见以上)的患者。
诊断特定病况的表达水平的差异可由本领域技术人员确定。例如，可使用标准方法来确定将被设置为诊断的RNASE4水平，包括例如接收者操作特性(ROC)曲线分析(参见例如以下实施例)。通常，例如，相对于参考表达水平，表达水平的诊断差异可任选地为例如升高或降低约1%或更多(例如约5%或更多、10%或更多、约20%或更多、约30%或更多、约40%或更多、约50%或更多、约60%或更多、约70%或更多、约80%或更多、约90%或更多、约100%或更多等)，例如约1%-约5%、约5%-约10%、约10%-约20%、约20%-约30%、约30%-约40%、约40%-约50%、约50%-60%、约60%-约70%、约70%-约80%、约80%-约90%、约90%-约100%或更多。
在其他情况下，相对于参考表达水平，水平升高或降低约0.01倍、0.05倍、0.10倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍、约1倍、约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍或约10倍或者更大，例如约0.01倍-约0.05倍、约0.05倍-约0.10倍、约0.10倍-约0.20倍、约0.20倍-约0.4倍、约0.5倍-约0.7倍、约0.7倍-约1倍、约1倍-约1.5倍、约1.5倍-约2倍、约2倍-约3倍、约3倍-约4倍、约4倍-约5倍、约5倍-约6倍、约6倍-约7倍、约7倍-约8倍或约9倍-约10倍或者更大。
根据本发明诊断的受试者包括患有或怀疑患有前列腺癌的人类受试者，特别是男性受试者。这些受试者可能尚未接受任何前列腺癌治疗，或者可能正处于治疗中或已完成治疗。此外，如上所述，可根据本发明的方法在治疗之前、期间和/或之后对受试者进行监测，以评价预后和确定治疗功效，以及确定复发或转移的可能性。
治疗方法
除了发现前列腺癌受试者的RNASE4水平升高之外，我们还发现阻断或抑制RNASE4抑制前列腺癌细胞的增殖以及RNASE4诱导的血管生成。因此，本发明提供用于治疗、预防、抑制或减少前列腺癌的一个或多个症状的方法。本发明的方法包括给予受试者一种或多种RNASE4抑制剂。抑制剂可任选地通过阻断RNASE4的活性而起作用。因此，例如，抑制剂比如抗体可与RNASE4结合，从而抑制RNASE4活性。在其他实例中，抑制剂可通过阻断RNASE4mRNA和/或蛋白的表达而起作用。
可根据本发明的方法治疗的受试者包括使用本文所述的方法诊断为患有前列腺癌的受试者，以及通过其他方法诊断的受试者。受试者可患有任何期或等级的前列腺癌、处于发展其的风险下或者处于其复发或转移的风险下。此外，受试者可能先前未曾进行前列腺癌的治疗，可能正同时经受不同类型的前列腺癌治疗，或者可能先前已接受不同类型的前列腺癌。
在一个实例中，抑制剂为针对RNASE4的抗体或其RNASE4结合片段。因此，例如，抑制剂可为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体、抗体片段(例如Fab或F(ab’)2片段)。用于产生这些和其他类型抗体的方法为本领域众所周知的。抑制剂的其他实例包括其他基于多肽的试剂、核酸分子(例如基于反义和RNAi的方法，后者使用shRNA和siRNA分子)、小的有机或无机分子以及天然产物或提取物。
根据本发明方法的治疗包括任选地与其他治疗剂或方法(参见以下)组合给予一种或多种RNASE4抑制剂。这种治疗可导致例如与不包含RNASE4抑制剂的治疗相比较，减少或延迟前列腺癌的进展(例如达数天、数周、数月或数年，例如2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或者1年或更长时间)。该治疗还可导致减轻可能会持续存在的症状。或者，该治疗可导致疾病和症状的完全消退。
RNASE4抑制剂以本领域技术人员确定为合适的方式配制、给药和给予。在该背景中考虑的因素包括受试者的前列腺癌的期和/或等级、受试者的临床状况、可能的副作用、抑制剂类型、给予方式、给予时间表、给予RNASE4抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前治疗、患者的临床病史和对RNASE4抑制剂的反应以及治疗医师的自由裁量及本领域已知的其他因素。如下所述，RNASE4抑制剂可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗前列腺癌的另外试剂一起配制和/或同时给予。
治疗的持续时间可为医学上指示的那么长的时间，或者直至达到期望的治疗效果(例如本文所述的那些)。因此，例如，治疗可任选地基于每天、每周、每两周、每月、每两个月或每年，持续1天、1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年或长达受试者寿命的数年时间段，或者落在这些时间点之间范围内的时间长度进行。可通过例如本文所述的方法监测治疗的进展。
可使用基于抑制剂性质选择的标准方法将抑制剂给予受试者，比如人类受试者。例如，给予可为全身性的(例如口服、静脉内或皮下)或局部的(例如通过注射、病灶内应用或局部应用)。例如，抗体一般地静脉内给予。
本发明的治疗方法可进一步包括与一种或多种另外的治疗剂组合和/或与一种或多种另外的治疗方法一起给予受试者有效量的RNASE4抑制剂(例如抗体或其抗原结合片段)。另外的治疗剂可为第二或其他RNASE4抑制剂或者用于治疗前列腺癌的不同试剂。因此，例如，另外的治疗剂可基于激素治疗(例如促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂(例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林或组氨瑞林)或LHRH拮抗剂(例如地加瑞克)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿比特龙或恩杂鲁胺)或其组合)、化学治疗(例如多西他赛)或免疫治疗(例如普列威)。另外的治疗方法还可包括例如放射(例如外线束放射治疗、强度调节的放射治疗、质子治疗或近距离放射疗法)、手术(例如前列腺切除术(根治性、机器人或腹腔镜前列腺切除术)或睾丸切除术)、局部治疗(例如冷冻疗法)或超声治疗中的任一种或多种。可以本领域技术人员确定为合适的方式将另外的治疗剂和/或方法与一种或多种RNASE4抑制剂组合用于治疗方案。因此，例如，治疗剂可依序或同时组合给予。此外，一种或多种RNASE4抑制剂的治疗组合，或RNASE4抑制剂与其他试剂或方法的组合，可有益地为患者带来累加或协同的治疗益处。
诊断试剂盒和组合物
本发明提供诊断试剂盒和组合物，其包含一种或多种用于确定来自测试受试者(例如怀疑患有前列腺癌或处于患有前列腺癌风险下的人类受试者)的样品中的RNASE4和任选地其他生物标志物(例如PSA、PSA衍生物、ANG和/或前列腺癌抗原3)的表达水平的试剂(例如多肽(比如抗体或其抗原结合片段)或多核苷酸(例如探针或引物))。试剂盒可任选地包含一种或多种可如本文所述测定并与测试样品进行比较的对照或参考样品。而且，试剂盒可任选地包含标记和/或检测方法中使用的试剂所需的材料。此外，试剂盒可任选地包含用于实施本发明方法的器皿、底物和/或其他材料或工具(例如容器、小瓶、试管、缓冲液、稀释剂和标签)。试剂盒的每个组成部分可任选地封闭在单个容器内，和所有各种容器可任选地在单个包装内，任选地与说明书一起。
任选地包含在本发明试剂盒中的说明书可例如提供有关如何使用试剂盒以通过例如本文所述的任何方法来诊断受试者患有前列腺癌的信息。在其他实例中，试剂盒可进一步包含使用试剂盒为受试者选择适当的治疗过程或评估治疗过程的说明书。此外，说明书可提供有关如何制备在方法中使用的样品的信息和/或有关如何解释结果的信息。
实施例
本发明部分地基于以下描述的实验结果。这些实施例不应以任何方式解释为对本发明的限制。
结果
前列腺癌患者的血浆RNASE4水平升高
通过内部制备的ELISA测定健康对照受试者(n=120)和前列腺癌患者(n=120)血浆样品中的RNASE4水平。研究群体的人口统计学和临床特征如表1所示。在RNASE4的量和患者的人口统计学(比如年龄和种族)之间无明显关系(表2)。内部ELISA的批内和批间测定精确度分别显示为95.1-98.2%和90.7-94.1% (表3)。RNASE4的多克隆抗体(pAb)和mAb两者的特异性和灵敏度以及代表性的ELISA标准曲线如图1所示。还评估了血浆基质中在整个测定范围内掺加至各水平的RNASE4的回收率，并且显示回收率范围在113-126% (表4)。前列腺癌患者血浆中的RNASE4量中位数(155.4 ± 2.8 ng/ml)显著高于健康对照受试者(101.5 ± 1.9ng/ml) (P <0.0001) (图2A)。使用接收者操作特性(ROC)曲线分析(图2B)探索RNASE4的预测值，该曲线显示在95% CI下AUC为0.94 (0.91-0.97)。RNASE4的诊断准确性取决于所应用的截断值而不同(表5)。在最佳截断值为117 ng/ml时，RNASE4的诊断准确性为86%，灵敏度为94%，特异性为80%，阳性预测值(+PV)为83%，阴性预测值(-PV)为93%，阳性似然比(+LR)为4.71，和阴性似然比(-LR)为0.07 (图2B和表5)。
在该队列中，前列腺癌患者血浆中的PSA水平(5.4 ± 0.2 ng/ml)也高于对照受试者(1.0 ± 0.1 ng/ml) (P <0.0001)，并且显示AUC为0.98 (0.96-1.00)和诊断准确性为93% (图3，A和B)。在截断值为2 ng/ml时，PSA灵敏度为95%和特异性为99%。在对照受试者中PSA的量显示与年龄呈显著正相关，但与种族则不然，然而在前列腺癌患者中与年龄或种族无关(表6)。
RNASE4增强PSA在前列腺癌诊断中的性能
RNASE4 + PSA的ROC曲线分析显示出极佳的诊断性能，AUC为0.99 (0.98-1.00) (图3C)，表明将RNASE4与PSA组合可对前列腺癌得出最准确的诊断。进一步地，ROC曲线分析显示，RNASE4和PSA在PSA值≤2 ng/ml的患者组中分别具有0.72和0.64的AUC，在PSA值≤4ng/ml的患者中分别具有0.91和0.94的AUC (图3，D和E)。PSA值为4 ng/ml和更高被认为怀疑存在前列腺癌，但是对于PSA结果低于2 ng/ml的患者，目前尚无可用的生物标志物。这些结果表明，在预测PSA水平低于2 ng/ml的患者的较早疾病状态时，RNASE4的性能优于PSA。
血管生成素(ANG，也称为核糖核酸酶5 (RNASE5))为胰腺核糖核酸酶超家族的另一成员，并且已显示可促进前列腺癌的进展(Dyer等人, Nucl. Acids Res. 33(3):1077-1086, 2005; Sheng等人, Cancer Res. 74(19):1401-1041, 2014; Li等人, Mol.Cancer Res. 11(10):1203-1214, 2013; Katona等人, Clin. Cancer Res. 11(23):8358-8363, 2005; Yoshioka等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(39):14519-14524, 2006; Ibaragi等人, Clin. Cancer Res. 15(6):1981-1988, 2009)和与RNASE4共调控和共表达(Olson等人, Clin. Cancer Res. 7(11):3598-3605, 2001; Yamasaki等人, J. Cell. Biol. 185(1):35-42, 2009)。因此，我们还测量了该患者队列的血浆中的ANG水平，并且发现前列腺癌患者的血浆ANG量为475.1±8.6 ng/ml，明显高于对照受试者(379.3±6.3 ng/ml, P <0.0001) (图4A)。这些结果与以前报道一致，即ANG改善前列腺癌筛查的诊断性能(Pina等人, Eur. J. Cancer Prev. 23(3):166-172, 2014)。与RNASE4的情形一样，ANG水平与患者的人口统计学不相关(表7)。ANG的ROC曲线分析显示，在394 ng/ml的最佳截断值下AUC为0.79 (图4B)，证实其为前列腺癌的良好诊断标志物，但RNASE4明显更好，AUC值更高(0.94)。毫不奇怪，我们发现ANG和RNASE4正相关(Pearson r= 0.48, P<0.0001) (图4C)，因为已知它们共享相同的启动子并共表达(Sheng等人, J. Biol.Chem. 289 (18):12520-12534, 2014)。这些数据证实，RNASE4在前列腺癌诊断中为优于ANG的标志物。重要的是，当RNASE4与PSA组合时，可做出更准确的预测。
组织RNASE4水平区分前列腺癌与BPH
免疫印迹(图2C)和qRT-PCR (图2D)分析显示，前列腺癌细胞系PC-3、DU145和LNCaP中的RNASE4表达高于正常前列腺上皮细胞系RWPE-1。肿瘤微阵列(TMA)中RNASE4的IHC染色的半定量分析(图5)显示，前列腺癌(n=50)、BPH (n=20)和正常前列腺(n=10)组织中的平均RNASE4 IHC评分分别为2.9 ± 0.1、1.95 ± 0.2和1.7 ± 0.2 (图2E)。因此，前列腺癌组织中的RNASE4水平显著高于BPH (P =0.0006)和正常前列腺组织(P =0.0005)。重要的是，在正常前列腺和BPH样品之间无显著差异(P =0.3861)。这些结果表明，RNASE4可区分前列腺癌与BPH，这是PSA无法完成的任务(Chang等人, Nat. Rev. Clin. Oncol. 11(6):308-323, 2014)。
利用Oncomine人类多癌症数据集进行的RNASE4 mRNA的计算机模拟分析还揭示了在各种类型人类癌症中RNASE4 mRNA的显著上调，在前列腺癌中观察到上调最高(图6)。在癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)前列腺数据集中，前列腺癌组织(n=171)中的RNASE4 DNA拷贝数也显著高于健康组织(n=61) (P =1.94 x 10-07) (图7A)。Kaplan-Meier分析显示，RNASE4基因拷贝数与无复发存活呈负相关(n = 57，对数秩检验P =0.03)。计算机模拟分析还显示，前列腺在各种健康器官中具有第二高(仅次于尿道)的RNASE4 mRNA水平(图8，A和B)。这些数据表明，RNASE4在前列腺中高度表达，并且在前列腺癌中差异增强，但在BPH中则没有。
RNASE4预测前列腺活检结果并与预后不良相关
为了探索RNASE4的预后值，我们检查了RNASE4表达和前列腺癌侵袭性之间的相关性。为此目的，我们首先比较了各种临床特征的前列腺癌患者血浆中RNASE4蛋白的水平(表8)，并且发现RNASE4与前列腺癌患者的手术T期、临床期、活检等级和手术Gleason评分呈正相关(图9，A-D)，表明RNASE4与预后不良和高转移风险的临床特征相关。例如，患有延伸超出前列腺包膜的pT3肿瘤的患者中的血浆RNASE4水平为166.8±5.6 ng/ml (n=19)，明显高于患有局限于前列腺中的pT2肿瘤的那些患者(n=75, 149.5±2.7 ng/ml, P =0.01) (图9A)。处于T2临床T期的患者，代表侵袭前列腺叶的一半或更少(T2a, n=17, 166.6 ± 6.7ng/ml, P =0.006)或超过叶的一半(T2b, n=8, 178.5 ± 4.2 ng/ml, P =0.001)的肿瘤，血浆RNASE4水平明显高于患有较小的不可触及的T1肿瘤的那些患者(T1c, n=84, 148.0± 2.4 ng/ml) (图9B)。具有分化较低的癌组织(比如活检等级7 (n=26, 164.1 ± 3.9ng/ml, P =0.03)或手术Gleason 7 (n=32, 157.8 ± 3.3 ng/ml, P =0.05)的肿瘤)的患者的血浆RNASE4水平明显高于具有分化良好的癌组织(比如活检等级6 (n=89, 149.0 ±2.8 ng/ml)或手术Gleason 6 (n=84, 147.8 ± 3.1 ng/ml)的肿瘤)的那些患者(图9，C和D)。重要的是，PSA未能与肿瘤的侵袭性相关(图3，F-I)。值得注意的是，尽管ANG的血浆水平也与手术和临床期相关，但其与活检等级和手术Gleason评分无关(图4D-G)，表明ANG与肿瘤的侵袭性相关，而与其分化期无关。这些数据表明，RNASE4优于PSA和ANG作为前列腺癌的预后标志物。
使用逻辑回归算法评价RNASE4是否可单独和与PSA组合用于预测活检结果。单变量和多变量逻辑回归分析两者(表9)均显示RNASE4和PSA与活检状态显著相关，但只有RNASE4与手术T期、临床期、活检等级和手术Gleason显著相关。这些结果表明，前列腺癌患者血浆中的RNASE4水平与晚期疾病状态显著相关，证实RNASE4作为独立的生物标志物预测癌症和在活检之前确定疾病期的诊断和预后价值。
对前列腺癌TMA中RNASE4的IHC分析(图5)显示，RNASE4的组织水平也与前列腺癌患者的组织病理学特征呈正相关(表10)。前列腺癌中RNASE4的平均IHC评分明显更高，其临床特征很可能表明预后不良和高转移风险(图9，E-I)。例如，RNASE4在组织学等级3的分化不良肿瘤中明显高于组织学等级1和2的良好-中度分化肿瘤中(P =0.0003) (图9E)，在具有Gleason评分4和5的形成不良腺体组织中明显高于Gleason评分2和3的主要形成良好的腺体中(P <0.0001) (图9F)，在T3和T4期的晚期侵袭性肿瘤中明显高于T1和T2期的侵袭性较小的肿瘤中(P =0.005) (图9G)，和在具有远端或淋巴结转移的那些肿瘤中明显高于在无转移的那些肿瘤中(分别为P = 0.0041和0.0001) (图9，H和I)。这些结果强烈表明，RNASE4可预测前列腺活检的结果，并与预后不良和患者存活相关，因此可用作预后标志物。
RNASE4通过激活PI3K-AKT-mTOR途径诱导前列腺癌细胞增殖
为了研究RNASE4在前列腺癌中的功能作用，我们检查了外源性RNASE4对前列腺癌细胞的作用，并且发现RNASE4刺激DU145 (图10A)和PC-3细胞(图11A)的增殖。DU145细胞的细胞周期分析表明，用RNASE4处理3天减少G0/G1群体和增加G2/S/M期群体(图10B)，与存在RNASE4的情况下增殖增强一致。为了研究RNASE4刺激细胞增殖的机制，我们检查了外源性RNASE4对已知在前列腺癌中起关键作用的PI3K-AKT-mTOR途径的影响(Lee等人, J. Biol.Chem. 290(5):2759-2768, 2015)，并且发现DU145 (图10C)和PC-3细胞(图11B)中AKT和S6被RNASE4快速和连续地激活，这可被AKT抑制剂MK-2206和PI3K抑制剂LY294002和渥曼青霉素抑制(图10D和图11C)。值得注意的是，mTOR抑制剂雷帕霉素抑制S6磷酸化，但不抑制AKT磷酸化。一致地，所有这些抑制剂均消除了RNASE4诱导的细胞增殖(图10E和图11C)。这些数据表明，RNASE4通过激活PI3K-AKT-mTOR信号传导途径来刺激前列腺癌细胞的增殖。
RNASE4激活AXL以刺激前列腺癌细胞增殖
为了了解RNASE4诱导的前列腺癌细胞增殖是否受受体酪氨酸激酶介导，我们进行了人类磷酸化受体酪氨酸激酶 (RTK)抗体阵列筛查，并且发现RNASE4处理诱导DU145 (图12A)和PC-3 (图11D)细胞中AXL的磷酸化。AXL为细胞生长和存活的介体(Varnum等人, Nature372(6515):623-626, 1995)，并在几种癌症中上调(Zhang等人, Nat. Genet. 44(8):852-860, 2012; Gjerdrum等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(3):1124-1129,2010; Rankin等人, Cancer Res. 70(19):7570-7579, 2010)，包括前列腺癌(Paccez等人, Oncogene 32(6):689-698, 2013; Mishra等人, Mol. Cancer Res. 10(6):703-712,2012; Bansal等人, Oncotarget, 2015)。通过在DU145 (图12B)和PC-3细胞(图11E)中的免疫印迹分析证实了RNASE4诱导的AXL磷酸化。进一步地，我们发现胰腺核糖核酸酶超家族的其他成员(包括ANG和RNase A)不会诱导AXL磷酸化(图12C)，表明AXL被RNASE4特异性地激活。
接下来，我们检查了AXL激酶的选择性小分子抑制剂R428对RNASE4诱导的DU145和PC-3细胞增殖的影响，并且发现其抑制RNASE4诱导的细胞增殖(图12D和图11F)以及AKT和S6 磷酸化(图12E)。这些结果表明一种似乎合理的作用机制，其中RNASE4通过激活AXL激酶及其下游效应子AKT和S6诱导前列腺癌细胞增殖(图12F)。
RNASE4敲减抑制前列腺癌细胞增殖和肿瘤生长
接下来，我们通过用两个具有非靶向shRNA对照(shControl)的RNASE4特异性shRNA(shRNASE4-1和shRNASE4-2)敲减PC-3 (图13，A和B)、DU145 (图14，A和B)和LNCaP (图15，A和B)细胞中的RNASE4，检查了RNASE4在前列腺癌增殖中的细胞自主功能。敲减RNASE4减少前列腺癌细胞的增殖(图12C、图14C和15C)，并减小软琼脂中前列腺癌细胞集落的数量和大小两者(图13D、图14D和15D)。重要的是，外源性RNASE4能够在细胞增殖(图13C、图14C和15C)和集落形成(图13D、图14D和15D)测定两者中挽救RNASE4敲减的影响。
以PC-3细胞的异种移植动物模型检查了RNASE4敲减对肿瘤生长的影响。与注射shControl转染的细胞的小鼠相比较，接种shRNASE4转染的细胞的小鼠的肿瘤生长明显更慢，如在第23天处死动物并解剖肿瘤时肿瘤体积减小75 ± 6 % (图16A，P = 0.011)和肿瘤重量减少88 ± 3% (图16B，P =0.03)所反映的。IHC染色证实与源自shControl转染的细胞的肿瘤相比较，源自shRNASE4转染的细胞的肿瘤中RNASE4蛋白减少(图16C)。RNASE4敲减肿瘤中Ki-67和CD31阳性细胞的百分比也降低(图16C)，表明RNASE4敲减后细胞增殖和肿瘤血管生成减少。与AXL为RNASE4的介体一致，我们观察到RNASE4敲减肿瘤中磷酸化AXL的水平降低，而总AXL的水平没有明显变化(图16D)。
RNASE4 mAb抑制前列腺癌细胞增殖和RNASE4诱导的血管生成.
为了评估靶向RNASE4在前列腺癌治疗中的治疗价值，我们生成了人类RNASE4特异性mAb (图1)并检查了其对前列腺癌细胞增殖的影响。如图17A所示，RNASE4 mAb以剂量依赖性方式抑制DU145、PC-3和LNCaP细胞的增殖。一致地，其显著减少处于G2/S/M期的细胞群，并相应地增加G0/G1群(图17B)。已知RNASE4具有血管生成作用(Li等人, Angiogenesis 16(2):387-404, 2013)。因此，我们通过体外内皮细胞管形成测定检查了RNASE4 mAb对RNASE4诱导的血管生成的影响，并且发现其对bFGF诱导的内皮细胞管形成无影响(图18)，但是以剂量依赖性方式(图19)抑制RNASE4诱导的内皮细胞管形成(图17C)。这些结果证实RNASE4 mAb在抑制RNASE4介导的细胞增殖和血管生成方面的有效性和特异性。
RNASE4 mAb在体内抑制前列腺肿瘤的生长
首先在预防性环境下，以异种移植动物模型检查了RNASE4 mAb的抗肿瘤活性，其中将PC-3细胞接种到无胸腺小鼠中并在第二天开始治疗。通过以10 mg/kg每3天一次腹膜内注射给予抗体，持续63天。如图20A和20B所示，该治疗方案导致肿瘤重量90 ± 3%的抑制(P =0.05)和肿瘤体积的80 ± 5%抑制(P =0.0014)。在mAb治疗后动物的体重没有变化(图20C)，表明抑制RNASE4没有毒性或毒性低。Ki-67和CD31的IHC分析表明，癌细胞增殖和肿瘤血管生成显著减少(图20D)，而TUNEL染色显示，mAb治疗后细胞凋亡得到增强(图20E)。在RNASE4 mAb治疗的肿瘤中还观察到磷酸化AXL的减少(图20D)。这些结果表明，RNASE4 mAb抑制了无胸腺小鼠中PC-3异种移植肿瘤的建立和生长，并伴随着肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成的减少和肿瘤细胞凋亡的增加以及这些过程中AXL的参与。
接下来，我们评估了RNASE4 mAb对已建立肿瘤的有效性。将PC-3细胞接种到无胸腺小鼠中，并等待21天，直至异种移植肿瘤的大小达到约100 mm3。根据肿瘤大小将荷瘤动物分为3组，使得每组动物的肿瘤大小匹配，并分别用PBS (n =12)或用10 mg/kg (n=6)和30 mg/kg (n=6)的RNASE4 mAb，通过每3天一次腹膜内注射进行治疗，持续39天。图21显示，RNASE4 mAb剂量依赖性地抑制无胸腺小鼠中建立的PC-3异种移植肿瘤的生长。用30 mg/kg治疗导致肿瘤体积减小72.7± 6% (图21A)和肿瘤重量减少70.0± 3% (图21B)。再次地，IHC分析表明，RNASE4 mAb治疗的肿瘤显示Ki67、CD31和磷酸化AXL的染色减少(图21C)和TUNEL染色增加(图21D)。综上所述，这些结果提供了RNASE4为用于前列腺癌治疗的治疗靶标的体内证据。
方法
人类血浆样品
按照如经塔夫茨医学中心(Tufts Medical Center)/塔夫茨医学院(Tufts MedicalSchool)和约翰霍普金斯大学医学院(Johns Hopkins University School of Medicine)的机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)批准的机构指南，在约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)收集和从前列腺癌生物储备网络(Prostate CancerBiorepository Network，PCBN)获得总共240份血浆样品(120份健康，120份前列腺腺癌)。在进行RNASE4 ELISA之前，将血浆样品在PBS中按1:10稀释。
肿瘤异种移植实验
从Taconic Biosciences获得6-8周龄的雄性无胸腺裸小鼠(CrTac: NCr-Foxn1nu背景)。将7-8周龄小鼠的右胁腹皮下注射100 μl HBSS中的1 × 106个活细胞。使用每组6只小鼠。用数显卡尺监测肿瘤大小。肿瘤体积通过V = (L × W 2)/2计算，其中L为肿瘤最宽处的长度，和W为垂直于L的最大宽度。对于RNASE4 mAb的预防性治疗，在接种PC-3细胞之后一天，将小鼠随机分入治疗组，并且每3天一次通过腹膜内注射给予RNASE4 mAb (10 mg/kg)或PBS。对于治疗性治疗，一旦肿瘤达到∼100 mm3，将小鼠随机分入治疗组，并且每3天一次腹膜内注射PBS或者10或30 mg/kg的RNASE4 mAb进行治疗。
重组人类RNASE4蛋白和RNASE4抗体
如先前所述(Li等人, Angiogenesis 16(2):387-404, 2013)，使用pET11表达系统在大肠杆菌(E.coli)中产生重组人类RNASE4蛋白，并通过反相HPLC纯化。使用RNASE4重组蛋白作为抗原产生RNASE4 pAb，并使用RNASE4-Sepharose柱进行亲和纯化。通过使BALB/c小鼠免疫，然后与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，产生RNASE4 mAb。通过来自适合于无血清条件的杂交瘤细胞培养物的蛋白G亲和层析纯化本研究中使用的mAb。
RNASE4 ELISA
将ELISA板在100 mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中于4℃下用10 μg/ml RNASE4mAb (每孔100 μl)包被过夜。在室温下以PBS中的5 mg/ml BSA (300 μl/孔)封闭1小时并用PBST (10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、150 mM NaCl、0.025% Tween-20)洗涤4次之后，添加标准品和样品(100 μl/孔)并在室温下温育过夜。在用PBST洗涤4次之后，将100 μl 0.75μg/ml兔RNASE4 pAb添加到每孔中，并在室温下温育2小时。再洗涤4次后，将缀合碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体(1:1000)添加到孔中，并在室温下温育1小时。洗涤4次后，将在10 mM二乙醇胺、0.5 mM MgCl2 (pH 9.5)中的100 μl 0.5 mg/ml磷酸对硝基苯酯添加到每孔中，并在室温下温育1-4小时，且在平板读取器上测量450 nm处的吸光度。人类RNASE4的最小可检测剂量(MDD)一般地为0.5 ng/ml。通过向12个零标准品重复的平均光密度值加上两个标准偏差并计算相应的浓度来确定MDD。用1 μg/ml的ANG没有观察到明显的交叉反应性。用小鼠RNASE4没有观察到跨物种反应性。在一块板上测试3个已知浓度的样品12次，以评价批内测定的精确度。以12个单独测定测试3个已知浓度的样品，以评价批间测定的精确度。评估了人类血浆中在整个测定范围内掺加至各水平的人类RNASE4的回收率。
前列腺组织阵列
从US Biomax (PR807a)购买了含有50例前列腺腺癌、20例BPH和10例正常前列腺组织的TMA。阵列中包括恶性组织标志物(肝细胞肝癌)的核心。每个阵列点的直径为1.5 mm和厚度为5 μm。对于每个阵列，由制造商供给组织学诊断、使用Gleason评分系统的分级和TNM分级。有关阵列的详细信息，可访问www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/PR807a (前列腺癌、增生和正常组织阵列)。
抑制剂
AXL抑制剂R428购自ApexBio。MK-2206来自Selleckchem。渥曼青霉素来自Sigma。雷帕霉素和LY294002购自Cell Signaling Technology。
RNA提取和qRT-PCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总细胞RNA，并通过M-MLV逆转录酶(Promega)用随机和寡聚(dT)18引物逆转录(1 μg)为cDNA。为了估算RNASE4拷贝数，将样品与标准cRNA样品系列(每个反应109-103个拷贝)同时进行逆转录，并使用SYBER Green PCR混合物(Roche)在Light Cycler 480 II (Roche)上扩增cDNA。GAPDH用作内部对照。引物为RNASE4正向：5’- AGAAGCGGGTGAGAAACAA-3’，反向：5’-AGTAGCGATCACTGCCACCT-3’；GAPDH正向：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，反向：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。
细胞周期分析
对于流式细胞术分析，使用Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒(BD)固定并透化1×106个细胞。直接在分析之前，将细胞用Ki67 FITC (BD，在BD Perm/Wash缓冲液中1:10)染色，洗涤并然后用DAPI (2 μg/ml)染色10分钟。使用Cyan ADP LX7 Analyzer流式细胞仪。
生物信息学
在公共癌症微阵列数据库Oncomine (www.oncomine.org)中对Bittner多癌症(n=1911)、Su多癌症(n=174)和Roth Normal 2 (n=504)数据集的RNASE4 mRNA表达进行计算机模拟分析。在Bittner多癌症数据集中，将癌组织中的RNASE4针对相应的健康组织进行归一化。在Roth Normal 2数据中，将前列腺组织中的RNASE4与所有其他组织进行比较，以得出特定正常组织中的较高/较低RNASE4表达。通过从每个数值中减去中位值，将所有微阵列数据集缩放为零。该步骤由Oncomine进行，以消除样品之间信号强度的偏差。Oncomine™平台(Thermo Fisher)用于统计分析和可视化。在Oncomine中于(DNA) TCGA前列腺数据集(n=308)中分析RNASE4和AXL DNA的拷贝数增加及具有RNASE4和AXL拷贝数变化的患者的存活概率。在TCGA前列腺数据集(n=232)中仅对组织样本(血液样本除外)中的RNASE4和AXL拷贝数进行分析。
免疫组织化学
将石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡，然后用一系列分级醇(100%、95%、70%和50%乙醇)处理并在PBS (pH 7.5)中再水化。为了回收抗原，将切片浸入10 mM枸橼酸钠、0.05%Tween 20 (pH 6.0)中，并以微波加热20分钟。以PBS洗涤之后，用TBS中的0.3%羟基过氧化物将内源性过氧化物酶封闭15分钟，然后以TBS洗涤2次。将切片在室温下，于加湿室中用TBS中的10%山羊血清与1% BSA封闭2小时，并然后在4℃下与以含有1% BSA的TBS稀释的第一抗体一起温育过夜。对于RNASE4染色，将2 μg/ml亲和纯化的人类RNASE4 pAb在室温下温育3小时。山羊抗小鼠或兔IgG的HRP缀合物用作第二抗体。DAB用于显色。载玻片用改良的Mayer苏木精复染色。
RNASE4敲减细胞系
慢病毒介导的shRNA系统(pGIPZ, Open Biosystems)用于产生对照和RNASE4敲减细胞系。序列为：shControl，5’-ATCTCGCTTGGGCGAGAGTAAGTA-3’, shRNASE4-1, 5’-ACCTGTCAGGGAGGCATTAAA-3’; shRNASE4-2, 5’-CAAAGAGATATGGAGACATAA-3’。
体外血管生成测定
将50 μl内皮细胞基础培养基(Invitrogen)中的1x105个细胞HUVEC铺板在Matrigel(BD Biosciences)处理的μ-载玻片上(μ-载玻片血管生成，Ibidi)，并与1 μg/ml RNASE4和30 μg/ml RNASE4 mAb或30 μg/ml同种型对照IgG一起温育。在4-5小时的时间段内于显微镜下检查管的形成。通过ImageJ软件和WimTube图像分析工具进行图像分析以量化环数和总管长。
人类磷酸化RTK阵列
人类磷酸化RTK阵列购自R＆D Systems。将细胞饥饿过夜，并在样品收集之前用1 μg/ml RNASE4处理5分钟。通过Bradford测定量化蛋白浓度，每个阵列使用1.5 mg细胞裂解物。通过ImageJ分析像素密度。在数据分析期间，使用PBS阴性对照点从每个阵列减去平均背景信号。
统计学
数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software)进行统计分析。通过2尾学生t检验分析2组之间的比较和通过单向ANOVA、事后组间比较和Tukey检验进行多组比较。使用对数秩检验分析Kaplan-Meier存活曲线。ROC曲线由MedCalc和Prism生成。回归分析由MedCalc和Stata软件进行。p值由星号表示如下：* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
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其他实施方案
尽管本发明已结合其特定实施方案进行描述，但是应当理解，其能够进行进一步修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或改编，所述变化、用途或改编通常遵循本发明原理，并且包括落在本发明所属领域内的已知或惯用实践内并且可应用于本文阐述的基本特征的与本公开的这种偏离。
本说明书中提及的所有公开和专利申请在本文通过参考结合至如同每个独立公开或专利申请被具体地和单独地表示为通过参考以其全部结合的相同程度。
应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由其组成”和“基本上由其组成”。而且，除非上下文相反地表示，否则本文使用的单数形式，比如“一个(a)”和“该(the)”，不排除表示相应的复数形式。类似地，使用复数术语并不排除表示相应的单数形式。
本发明的一些实施方案在以下编号段落的范围内。
1. 一种在受试者中治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予受试者核糖核酸酶4 (RNASE4)的抑制剂。
2. 段落1的方法，其中RNASE4抑制剂选自小分子、抗体或其抗原结合片段、反义RNA或shRNA。
3. 段落2的方法，其中抗体或其抗原结合片段为多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体。
4. 一种用于鉴定患有前列腺癌或处于其风险下的受试者的方法，所述方法包括确定从受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，样品中RNASE4的表达水平升高将受试者鉴定为患有前列腺癌。
5. 段落4的方法，其中进行所述方法以在受试者中区分良性前列腺增生(BPH)与前列腺癌，并且参考水平为BPH所特有的。
6. 段落4的方法，其中在确定是否对受试者进行穿刺活检中进行该方法。
7. 一种用于评价患有前列腺癌的受试者的预后、在受试者中监测治疗功效或选择用于受试者的治疗的方法，所述方法包括确定从受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，样品中RNASE4的表达水平升高分别表明受试者预后不良，治疗对受试者没有有益作用或者用RNASE4抑制剂治疗受试者可为有益的。
8. 段落7的方法，其中进行所述方法以评价受试者的预后，并且对预后的评价包括确定转移的风险、疾病侵袭性的水平、肿瘤等级或癌症期。
9. 一种用于在受试者中确定前列腺癌的期、亚期或风险水平的方法，所述方法包括确定从受试者获得的样品与一种或多种参考样品中RNASE4的表达水平。
10. 段落9的方法，其中前列腺癌的期、亚期或风险水平选自TX、T0、T1 (T1a、T1b或T1c)、T2 (T2a、T2b或T2c)、T3 (T3a、T3b或T3c)、T4、NX、N0、N1、MX、M0、M1 (M1a、M1b或M1c)、Gleason评分(6或更低、7、8、9或10)、Gleason分组(I、II、III、IV或V)、极低风险、低风险、中度风险、高风险或极高风险。
11. 段落4-10中任何一段的方法，其中从受试者获得的样品选自全血、血清、血浆和前列腺组织的样品。
12. 段落4-11中任何一段的方法，其进一步包括确定样品中前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平。
13. 段落4-12中任何一段的方法，其进一步包括确定样品中血管生成素(ANG)的表达水平。
14. 段落4-13中任何一段的方法，其中表达水平通过评价蛋白表达水平来确定。
15. 段落14 的方法，其中蛋白表达水平使用免疫测定来确定。
16. 段落15 的方法，其中免疫测定为酶联免疫吸附测定(ELISA)。
17. 段落15 或16的方法，其中免疫测定采用对RNASE4特异性的抗体或其抗原结合片段。
18. 段落17的方法，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。
19. 段落4-13中任何一段的方法，其中表达水平通过评价mRNA表达水平来确定。
20. 段落19的方法，其中mRNA表达水平通过qPCR、RNA-Seq、微阵列分析、基因表达概况分析或全基因组测序来确定。
21. 段落4-20中任何一段的方法，其中相对于参考水平，RNASE4的表达水平升高或降低约0.1、0.25、0.5、1、2、5或10倍。
22. 段落4-21中任何一段的方法，其中参考水平为来自治疗之前的受试者的样品中的表达水平、参考群体中的水平、预先指定的水平、患有前列腺癌的受试者中的水平、患有特定期的前列腺癌的受试者中的水平或患有BPH的受试者中的水平。
23. 段落4-22中任何一段的方法，其进一步包括给予受试者用于前列腺癌的治疗。
24. 段落23的方法，其中所述用于前列腺癌的治疗包括RNASE4的抑制剂。
25. 段落24的方法，其中RNASE4的抑制剂选自小分子、抗体或其抗原结合片段、反义RNA或shRNA。
26. 段落25的方法，其中抗体或其抗原结合片段为多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体。
27. 一种抑制前列腺癌细胞生长的方法，所述方法包括使前列腺癌细胞与RNASE4抑制剂接触。
28. 一种在患有前列腺癌的受试者中抑制血管生成的方法，所述方法包括给予受试者RNASE4抑制剂。
29. 段落27或28的方法，其中RNASE4抑制剂为抗体或其RNASE4结合片段。
30. 段落27的方法，其中前列腺癌细胞存在于患有前列腺癌、怀疑患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试者中。
31. 一种用于鉴定患有前列腺癌或处于其风险下的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含(a)一种或多种可用于确定样品中RNASE4蛋白或核酸的水平的多肽或多核苷酸，以及任选地(b)关于在测定中使用所述一种或多种多肽或多核苷酸进行所述确定的说明书。
32. 段落31的试剂盒，其中所述试剂盒中的一种或多种多肽为针对RNASE4的抗体或其RNASE4结合片段。
33. 段落31的试剂盒，其中所述一种或多种多核苷酸为对RNASE4核苷酸序列具有特异性的探针或者一种或多种引物。
34. 段落31-33中任何一段的试剂盒，其进一步包含一种或多种对照多肽或多核苷酸。
其他实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (34)

1.一种在受试者中治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括给予所述受试者核糖核酸酶4 (RNASE4)的抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述RNASE4的抑制剂选自小分子、抗体或其抗原结合片段、反义RNA或shRNA。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体。
4.一种用于鉴定患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试者的方法，所述方法包括确定从所述受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，所述样品中RNASE4的表达水平升高将所述受试者鉴定为患有前列腺癌。
5.权利要求4的方法，其中进行所述方法以在所述受试者中区分良性前列腺增生(BPH)与前列腺癌，并且所述参考水平为BPH所特有的。
6.权利要求4的方法，其中在确定是否对所述受试者进行穿刺活检中进行所述方法。
7.一种用于评价患有前列腺癌的受试者的预后、在所述受试者中监测治疗功效或选择用于所述受试者的治疗的方法，所述方法包括确定从所述受试者获得的样品中RNASE4的表达水平，其中与参考水平相比较，所述样品中RNASE4的表达水平升高分别表明受试者预后不良、所述治疗对所述受试者没有有益作用或者用RNASE4抑制剂治疗所述受试者可为有益的。
8.权利要求7的方法，其中进行所述方法以评价所述受试者的预后，并且对所述预后的评价包括确定转移的风险、疾病侵袭性的水平、肿瘤等级或癌症期。
9.一种用于在受试者中确定前列腺癌的期、亚期或风险水平的方法，所述方法包括确定从所述受试者获得的样品与一种或多种参考样品中RNASE4的表达水平。
10.权利要求9的方法，其中所述前列腺癌的期、亚期或风险水平选自TX、T0、T1 (T1a、T1b或T1c)、T2 (T2a、T2b或T2c)、T3 (T3a、T3b或T3c)、T4、NX、N0、N1、MX、M0、M1 (M1a、M1b或M1c)、Gleason评分(6或更低、7、8、9或10)、Gleason分组(I、II、III、IV或V)、极低风险、低风险、中度风险、高风险或极高风险。
11.权利要求4的方法，其中从所述受试者获得的样品选自全血、血清、血浆和前列腺组织的样品。
12.权利要求4的方法，其进一步包括确定所述样品中前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平。
13.权利要求4的方法，其进一步包括确定所述样品中血管生成素(ANG)的表达水平。
14.权利要求4的方法，其中所述表达水平通过评价蛋白表达水平来确定。
15.权利要求14 的方法，其中所述蛋白表达水平使用免疫测定来确定。
16.权利要求15 的方法，其中所述免疫测定为酶联免疫吸附测定(ELISA)。
17.权利要求15的方法，其中所述免疫测定采用对RNASE4特异性的抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求17的方法，其中所述抗体为单克隆抗体、 多克隆抗体或单链抗体。
19.权利要求4的方法，其中所述表达水平通过评价mRNA表达水平来确定。
20.权利要求19的方法，其中所述mRNA表达水平通过qPCR、RNA-Seq、微阵列分析、基因表达概况分析或全基因组测序来确定。
21.权利要求4的方法，其中相对于所述参考水平，所述RNASE4的表达水平升高或降低约0.1、0.25、0.5、1、2、5或10倍。
22.权利要求4的方法，其中所述参考水平为来自治疗之前的所述受试者的样品中的表达水平、参考群体中的水平、预先指定的水平、患有前列腺癌的受试者中的水平、患有特定期的前列腺癌的受试者中的水平或患有BPH的受试者中的水平。
23.权利要求4的方法，其进一步包括给予所述受试者用于前列腺癌的治疗。
24.权利要求23的方法，其中所述用于前列腺癌的治疗包括RNASE4的抑制剂。
25.权利要求24的方法，其中RNASE4的抑制剂选自小分子、抗体或其抗原结合片段、反义RNA或shRNA。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体。
27.一种抑制前列腺癌细胞生长的方法，所述方法包括使所述前列腺癌细胞与RNASE4抑制剂接触。
28.一种在患有前列腺癌的受试者中抑制血管生成的方法，所述方法包括给予所述受试者RNASE4抑制剂。
29.权利要求27的方法，其中所述RNASE4抑制剂为抗体或其RNASE4结合片段。
30.权利要求27的方法，其中所述前列腺癌细胞存在于患有前列腺癌、怀疑患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试者中。
31.一种用于鉴定患有前列腺癌或处于其风险下的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含(a)一种或多种可用于确定样品中RNASE4蛋白或核酸的水平的多肽或多核苷酸，以及任选地(b)关于在测定中使用所述一种或多种多肽或多核苷酸进行所述确定的说明书。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述试剂盒中的一种或多种多肽为针对RNASE4的抗体或其RNASE4结合片段。
33.权利要求31的试剂盒，其中所述一种或多种多核苷酸为对RNASE4核苷酸序列具有特异性的探针或者一种或多种引物。
34.权利要求31的试剂盒，其进一步包含一种或多种对照多肽或多核苷酸。
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