WO2005001089A1

WO2005001089A1 - 癌の検出方法

Info

Publication number: WO2005001089A1
Application number: PCT/JP2004/009126
Authority: WO
Inventors: Jun Nakayama; Satoshi Ishizone
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-28
Publication date: 2005-01-06
Also published as: JPWO2005001089A1; CA2530672A1

Abstract

　生体から採取された体液中のα１，４−N-アセチル-D-グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数70～139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づけることによって癌を検出する。

Description

明細書

癌の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、糖転移酵素をコードする遺伝子の特定領域の発現量を測定し、かかる測定値を癌の存否、進展、進行度、予後と関連づける癌の検出方法及び該方法を実施するための癌検出キットに関する。

^景技術

[0002] 本明細書においては、 N-ァセチル -D-ダルコサミンを「GlcNAc」と記載する。また、糖及び糖残基の表記に関しては、特記しない限り D体を示すものとする。

従来、癌の検出には各種腫瘍マーカなどが指標として使用されていたが、その感度は必ずしも十分とは言えなかった。そこで、一般に腫瘍マーカと呼ばれているもの以外に、遺伝子の発現の変化を癌検出に結びつける試みがなされている。特開 200 1一 46077号公報及び Lab. Invest., Vol.83, No.2(2003), 187-197には、 α 1,4結合で GlcNAcをムチン型糖鎖に転移する酵素及びその DNAが開示されており、かかる遺伝子の発現が胃癌や膝癌で変化することに基づき癌検出法に応用する技術が開示されている。しかし、このような技術は、その感度は十分とは言えず、実用レベルとするにはさらなる検討が必要な状態であった。

発明の開示

[0003] 上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討した結果、上記の従来技術に開示された、特定の癌の検出に使用できる遺伝子と同一の遺伝子に由来するものの、当該従来技術よりも狭い領域の発現量の検出を行うことで、従来と比して癌検出感度が格段に増加することを見い出し、本発明を完成した。

[0004] すなわち、本発明は以下のとおりである。

(1) 生体から採取された体液中の α 1 , 4-Ν-ァセチル -D-ダルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法。

(2) 前記領域が、配列番号 1における塩基番号 520— 628の塩基配列からなる領域であることを特徴とする（1)の癌の検出方法。

(3) 体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする（1)又は（2)の癌の検出方法

(4) 癌が、唾液腺癌、食道癌、胃癌、陴癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、及び直腸癌力なる群から選択される一以上の癌であることを特徴とする（1)一 (3)のいずれかの癌の検出方法。

(5) 癌が、膝癌であることを特徴とする（1)一（3)のいずれかの癌の検出方法。

(6) 生体力採取された体液中のひ 1 , 4一 N-ァセチル -D-ダルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と瞎癌の進行度とを関連づける膝癌の進行度の判定方法であって、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した塩基数 70 一 139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、膝癌の進行度の判定方法。

(7) 前記領域が、配列番号 1における塩基番号 520— 628の塩基配列からなる領域であることを特徴とする（6)の膝癌の進行度の判定方法。

(8) 体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする（6)又は（7)の膝癌の進行度の判定方法。

(9) 配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キット。

図面の簡単な説明

[0005] [図 1]健常人 (HV)、慢性陴炎患者 (CP)、及び膝癌患者 (PC)における _a 4GnT遺伝子の発現量 (縦軸）の分布を示す図である。星印は有意差が確認された組み合わせを示す。なお、ネ ίま P = 0. 015、 *ネ fま P = 0. 0046を表わす。

発明を実施するための最良の形態

[0006] 以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。

1.本発明の検出方法

本発明の検出方法は、生体力採取された体液中のひ 1 , 4_N_ァセチルー D—グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法である。

[0007] 本発明の検出方法における「体液」とは、唾液、血液、リンパ液、胃液、膝液、 S昜液が好ましぐ特に血液及びリンパ液が好ましぐ血液が最も好ましい。血液を「体液」として使用した場合には、血液から有核細胞成分を分画し、力かる画分から全 RNAを抽出した後に逆転写酵素等を用いて常法に従って cDNAを調製し、この cDNAを用いて定量を行うことが好ましい。

[0008] a 1，4_N—ァセチル— D_ダルコサミン転移酵素（以下、「ひ 4GnT」とも記載する）遺伝子としては、例えば、配列番号 1に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、人種によって遺伝子に塩基置換が生じることも考えられるため、ひ 4GnT遺伝子は、 GlcNAc転移活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする遺伝子であってもよい。なお、ストリンジェントな条件としては、例えば、 60°C、 1 X SSC, 0. 1 %SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSに申目当する塩濃度で、 1回より好ましくは 2— 3回洗浄する条件が挙げられる。

本発明の検出方法において、 a 4GnT遺伝子の発現量の測定は、配列番号 1の塩基配列のうち、任意の連続した塩基数 70— 139bpの領域を検出することによって行うことが好ましぐ任意の連続した塩基数 80— 129bpの領域を検出することによって行うことがより好ましぐ任意の連続した塩基数 90— 119bpの領域を検出することによって行うことが更に好ましぐ任意の連続した塩基数 100 108bpの領域を検出することによって行うことが最も好ましい。本発明の検出方法に使用する、上記の領域としては、例えば配列番号 1記載の塩基配列における塩基番号 520 628からなる領域が例示される。

[0009] 本発明検出方法における「 a 4GnT遺伝子の発現量の測定」とは、体液中に存在する細胞におけるひ 4GnT遺伝子の発現量、すなわち、ひ 4GnTの mRNAの量を測定することをいう。測定法として、具体的には、例えば、体液から常法により抽出された mRNAまたは totalRNAを用いて cDNAを合成した後に、ポリメラーゼチェインリアクシヨン法 (PCR法）などを用いて前記領域を増幅して検出する方法、または、前記領域に対応するプローブを使用して、 DNAチップなどにより前記領域を検出する方法などが挙げられる。この中でも PCR法が好ましぐ蛍光プローブを用いた定量 PCR法を使用してもよい。ただし、これらに限定はされず、上記遺伝子の発現量の測定 (定量）が可能な限り他の方法も使用することができる。

上記定量方法を用いて測定した生体から採取された体液におけるひ 4GnT遺伝子の発現量と、癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づけることで、癌の検出を容易に行うことが可能である。

[0010] 本発明検出方法における「測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後との関連づけ」とは、ひ 4GnT遺伝子の発現量を、癌の有無、転移の有無、進行度、治癒の程度などの癌に関する定性的又は定量的な指標とすることを意味する。

また、上記関連付けにより健常な状態の測定値と比して測定値が変化した状態を意味し、例えば、「癌が存在する、進展している、癌が II期以上に進行している、又は癌が進展又は退縮しており予後が悪化或いは良好」と判定することができる。

ここで「測定値」とは、例えば、 PCR法における DNAの複製数またはハイブリダィズ法におけるハイブリダィズした DNAの量などの絶対量であってもよいが、これに限らず、例えば内部標準を設け、内部標準との比を測定値として使用しても良い。内部標準としては一般的に用いられているダリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「GAPDH」とも記載する）の遺伝子を用いることができる。

[0011] 本発明検出方法における「変化」とは、測定値の「増カロ」であることが好ましい。健常人におけるひ 4GnT遺伝子と GAPDH遺伝子の発現量の比（ひ 4GnT遺伝子の測定値 /GAPDH遺伝子の測定値）は 12 X 10— ⁷未満となるため、この値が力、かる比の値（12 X 10— ⁷) (臨界値)よりも高い場合に「癌が存在する」とすることができる。かかる臨界値は検出感度など必要に応じて調整することが可能である。また、例えば同一患者の異なる時点のサンプノレを比較して、上記比の値が大きくなつている場合に癌が進展（進行）し、減少している場合に癌が治癒に向かっている、予後が悪化或いは良好などとすることも可能である。 [0012] 本発明検出方法で検出される「癌」は、消化器及びその付随器官の「癌」であることが好ましぐ特に唾液腺癌、食道癌、胃癌、膝癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌のいずれかであることが好ましい。この中でも特に胃癌、膝癌、小腸癌、大腸癌であることが好ましぐ特に胃癌、膝癌であることが好ましぐ膝癌であることが極めて好ましい。

[0013] ところで、従来癌の検出に用いられてレ、た癌胎児抗原（以下「CEA」とも記載する）ゃシァリルルイス A (以下、「CA19_9」とも記載する）等の癌マーカーは、早期癌（Π期以前）の検出には不向きで、早期癌の検出は、これらの癌マーカーと血清エラスターゼの測定との併用でスクリーニングを行っていた。

しかし、本発明検出方法は II期の癌においても極めて優れた検出感度を示すことが明かであり、本発明検出方法単独の実施で早期の癌の検出が可能である。

このこと力、ら、本発明検出方法は早期癌 (Π期）の検出に極めて有用であることが明力となり、早期癌の検出方法に使用することも可能である。

[0014] 更に、特に膝癌の患者において、本発明の検出方法による測定で、 II期、 III期、 IV 期の癌の進行時期毎に測定値が変化することが明力となり、力かる変化に基づき、本発明検出方法を膝癌の進行度を判定する方法として使用することも可能であることが明かとなった。すなわち体液、特に好ましくは末梢血を用いて、 a 4GnT遺伝子と内部標準遺伝子としての GAPDH遺伝子の発現量を測定し、これらの比を 10⁷倍した値を算出した場合に、測定値が例えば 35以上の場合を IV期、 15— 35の場合を III期、 13 一 15の場合を II期とすることが可能である。力かる比の数値範囲（臨界値）は必要に応じて適宜調整することが可能である。

[0015] なお、一般的に臨床において膝炎と膝癌の鑑別診断は困難であることが知られている力本発明検出方法を用いると、膝炎患者と膝癌 (癌)患者との間では明らかに測定値が相違するため、本発明検出方法は陴炎と陴癌との鑑別に用いることも可能である。

[0016] 2.本発明キット

本発明キットは、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数 70 一 139bpの核酸（ポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キットである。プライマーの長さは上記核酸を増幅できる長さであれば特に制限されないが

、例えば、 20— 26塩基が好ましぐ 22— 25塩基がより好ましい。

本発明キットは、本発明の検出方法を実施するためのキットである。

本発明キットにおける「塩基数 70 139bpの核酸」は、配列番号 1記載の核酸の一部であって連続した塩基数 70— 139bpからなる核酸である限りにおいて特に限定はされないが、その中でも特に配列番号 1における塩基番号 520— 628からなる塩基配列の核酸であることが好ましレ、。

[0017] 本発明キットにおける「プライマー」は、上記「塩基数 70 139bp」の塩基配列」を増幅することができる限りにおいて特に限定はされなレ、が、例えば上記好ましい例の一つである「配列番号 1における塩基番号 520 628からなる塩基配列の核酸」を増幅するためのプライマーとしては配列番号 3の 5'プライマー及び配列番号 4の 3'プライマ一が挙げられる。

[0018] 本発明キットは、上記「プライマー」以外に、力かるプライマーを用いて増幅して得られる増幅産物を検出するためのプローブ (例えば配列番号 5記載の塩基配列からなる DNA)、逆転写酵素や DNAポリメラーゼなどの試薬、測定値を入力すると疾病の検出結果を表示するソフトウェアなどを更に含んでいても良い。

実施例

[0019] 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例 1

インフォームドコンセントの得られた膝癌患者 55名（総合的な診断により膝癌と診断された患者)、慢性膝炎患者 10名（総合的な診断により慢性膝炎と診断された患者）及び健常人 70名について、採取した 5mlの末梢血から有核細胞成分を分画し、常法に従って全 RNAを抽出して、 DNasel (アンビィオン社製） 2Uを添カ卩した後、逆転写酵素（インビトロゲン社製） 200Uを加えて 55分間インキュベートして cDNAの合成を行なつた。

[0020] かかる cDNAと、配列番号 3の 5'プライマー、配列番号 4の 3'プライマー、及び配列番号 5のプローブ（TaqManプローブ：蛍光色素（5'_FAM)とクェンチヤ一（

3'-TAMURA)とが結合している（アプライドバイオシステムズジャパン社製））を用いて Quantative-PCR法を ABI PRISM 7700 (アプライドバイオシステムズジャパン社製）で行なった。

[0021] 定量は上記プライマー及びプローブを用いて増幅される a 4GnT遺伝子の一部分と共に内部標準遺伝子としてダリセルアルデヒド-三リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「 GAPDHJとも記載する）の cDNAも増幅して測定を行う multiplex PCR法によって行い、「ひ 4GnTの増幅産物のコピー数 ZGAPDHのコピー数」を 10⁷倍した数値を「ひ 4GnT の発現量」と定義づけた（以下単に「発現量」と記載する）。

[0022] 上己発量を用レヽて receiver operating characteristics curveを作成したところ、膝癌患者群と健常人群とがカット'オフ値 12で明確に区別されることが明力、となった。そこで、 12以下を健常人、それよりも高値の者を膝癌の疑いのある群として、分析を行なった。

[0023] その結果、膝癌患者群全体の陽性率は 76.4であり、その発現量は 35.7 ±4.9であつた。更に膝癌における各病期別の陽性患者数は、 0期（癌細胞が上皮内に限局している状態（上皮内癌） ) 0/1例（0%)、 II期 2/3例（66.7%)、 III期 6/8例（75.0%)、 IV期 34/43 (79.1%)であり、また発現量は II期 24.8± 12.5、 III期 29.9±9.2、 IV期 38·3± 5·9と、病期の進行と共に増加の傾向にあった（表 1)。また、同時に血清中の CEA及び CA19-9も測定し、膝癌患者群全体ではそれぞれ 44.4%、 74.6%が陽性となったが、 II 期膝癌患者では CEA及び CA19-9のいずれの方法でも陰性となった（表 1)。このことから、従来の膝癌マーカによる膝癌の検出と比して、本発明検出方法を用いるとより早期に膝癌を検出できることが明力となった。

[0024] [表 1]

病期発現量 CEA (>2. 5ng. ml) CA19-9 (>37U/ml)

0 0/1 (0%) 0/1 (0%) 0/1 (0%)

II 2/3 (66. 7%) 0/3 (0%) 0/3 (Q%)

III 6/8 (75. 0%) 3/8 (37. 5%) 6/8 (75. 0%)

IV 34/43 (79. 1%) 21/42 (50. 0%) 34/42 (80. 9%)

Total 42/55 (76. 4%) 24/54 (44. 4%) 40/54 (74. 6%)

[0025] 一方、陴内における腫瘍の占拠部位別の検討を行ったところ、膝頭部癌と膝体尾部癌の両群間で有意な差は見られなかった。また更に、切除可能な膝癌症例 24例に対する病理組織学的な検討では、発現量と、脈管侵襲の有無、リンパ節転移の有無及び癌細胞の分化度との間にいずれも有意な差は認められなかった。

[0026] 健常人における発現量は 7.2 ± 0.9であり、膝癌患者に比較して有意に低値であつた（Bonferroni検定によると P=0.0046)。また慢性陴炎患者群における発現量は 17.8 ± 6.9であり、陴癌に比較して有意に低値であった（Bonferroni検定によると P=0.015) (図 1)。従って、本発明検出方法により、膝癌の検出を行うことができると共に、陴癌と慢性膝炎との鑑別診断を行うことができることが判明した。

産業上の利用の可能性

[0027] 本発明により、新たな癌検出方法、膝癌の進行度を検出する方法、及び癌検出キットが提供される。

Claims

請求の範囲

[1] 生体力、ら採取された体液中のひ 1 , 4一 N-ァセチル -D-ダルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法。

[2] 前記領域が、配列番号 1における塩基番号 520— 628の塩基配列からなる領域であることを特徴とする請求項 1記載の癌の検出方法。

[3] 体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の癌の検出方法。

[4] 癌が、唾液腺癌、食道癌、胃癌、膝癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、及び直腸癌からなる群から選択される一以上の癌であることを特徴とする請求項 1一 3のいずれか一項記載の癌の検出方法。

[5] 癌が、膝癌であることを特徴とする請求項 1一 3のいずれか一項記載の癌の検出方法。

[6] 生体力、ら採取された体液中のひ 1 , 4一 N-ァセチル -D-ダルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と陴癌の進行度とを関連づける膝癌の進行度の判定方法であって、配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、膝癌の進行度の判定方法。

[7] 前記領域が、配列番号 1における塩基番号 520 628の塩基配列からなる領域であることを特徴とする請求項 6に記載の膝癌の進行度の判定方法。

[8] 体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする請求項 6又は 7に記載の陴癌の進行度の判定方法。

[9] 配列番号 1記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数 70— 139bpの塩基配列からなる領域を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キット。