CN113897333B - 一种软性免疫细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种软性免疫细胞的制备方法及应用。本发明通过提供一种通过3D培养基培养得到软性免疫细胞的方法，制备得到的软性免疫细胞，活性及杀伤与2D培养得到的免疫细胞没有显著性差异，并且相对于2D培养所得的免疫细胞，本发明通过3D培养得到的软性免疫细胞的肿瘤深部穿透效果提升，具备更好的抑瘤效果，并可显著提升小鼠的半数生存期。

Description

一种软性免疫细胞的制备方法及应用
技术领域：
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种软性免疫细胞的制备方法及应用。
背景技术：
肿瘤的免疫细胞治疗，是通过人工改造免疫细胞提升免疫细胞对肿瘤细胞的靶向性，提高其对肿瘤细胞的杀伤。例如CAR-T疗法，是通过基因工程技术，人工改造肿瘤患者的T细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性CAR-T细胞，再将其回输入患者体内，用以攻击癌细胞的一种疗法。自2010年开始，大量临床研究表明，CAR-T针对于急性淋巴性白血病、弥散性B淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、等其他的非霍奇金淋巴瘤有着良好的治疗效果，其中部分恶性B细胞淋巴瘤病人治愈率达到90％，目前已有五款CAR-T药物上市，比如吉利德(Gilead)生产的Yescarta，以及诺华的Kymriah等。
但是目前的肿瘤CAR-T治疗药物通常在细胞的2D培养物中筛选，在组织培养集上2D培养的细胞是扁平的，其50％的表面积暴露于组织培养基，在这些条件下，负责细胞间信号传导并导致组织特异性基因表达的细胞外基质(ECM)的产生非常有限或不存在，导致在2D培养基中培养的细胞与在包含细胞和基质分子的组织中发现的它们的体内对应物不是表型相似的，因此对药物筛选具有显著的限制。
专利申请号为WOCA20051505的专利提供了一种3D细胞培养系统，包括固体多孔聚合物载体，与固体多孔聚合物载体结合的第一种类型的细胞；和包含第二类细胞的生物相容性水凝胶，其中生物相容性水凝胶与固体多孔聚合物载体物理接触，还描述了制备该3D细胞培养系统的方法，以及该系统例如用于抗癌药物筛选的用途。可以更好地模拟体内肿瘤微环境，以进行3D细胞培养，更好地体现体内细胞-细胞外基质的相互作用。
实体瘤细胞的快速增殖容易导致肿瘤部位淋巴管和血管畸形，肿瘤部位血管的压缩进一步导致血液粘度增高、血液流速降低，而肿瘤部位淋巴管的缺失进一步导致间质高压。肿瘤细胞外存在大量基质，如胶原与透明质酸等，相互交联形成致密的屏障，阻碍免疫细胞浸润，从而影响免疫细胞的治疗实体瘤药效。因此，制备出更加柔软的免疫细胞细胞，有望提高免疫细胞的实体瘤治疗药效。
发明内容：
(一)解决的技术问题
针对上述背景，本发明的目的在于提供一种软性免疫细胞的制备方法及应用。与常规的免疫细胞相比，制备得到的软性免疫细胞，能够高效地蓄积于肿瘤组织、深部穿透进入肿瘤深部，显著提升免疫细胞抑制淋巴瘤的生长。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开第一方面，提供了一种软性免疫细胞的制备方法，该方法通过免疫细胞的3D培养基培养得到软性免疫细胞，所述软性免疫细胞的培养方法包括凝胶培养法，悬滴培养法。
进一步地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、K淋巴细胞、NK淋巴细胞、肥大细胞、或单核吞噬细胞、CAR-T细胞，CAR-NK细胞中的一种或者几种。
所述凝胶培养法中的凝胶，为琼脂糖凝胶、壳聚糖凝胶、纤维蛋白凝胶、海藻酸钠凝胶中的一种或者几种。
进一步地，所述3D培养基包括纤维蛋白原凝胶、悬滴法凝胶或琼脂糖凝胶体系。
所述纤维蛋白原凝胶的配置方法如下：
步骤一，配置T7缓冲液，所述T7缓冲液成分为pH 7.4，10-100mM Tris，50-200mMNaCl；步骤二，采用所述T7缓冲液将纤维蛋白原分别稀释至1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL；步骤三，将CAR-T细胞溶液与含有纤维蛋白原的所述T7缓冲液按照1:1混合，得到CAR-T细胞混悬液；步骤四，在预冷的24孔板中加入1-10μl浓度为0.1U/μl的纤维蛋白原，与步骤三得到的25-500μl的所述CAR-T细胞混悬液吹打混匀，37℃条件下孵育1-50min后，含有所述CAR-T细胞的所述纤维蛋白原凝胶形成。
所述悬滴法凝胶的配置方法如下：
步骤一，离心收集CAR-T细胞溶液，用1640/IL-2完全培养基稀释CAR-T细胞溶液，得到60万/mL的CAR-T细胞混悬液；步骤二，将未处理的培养皿翻转皿盖，按38毫升每滴，将所述CAR-T细胞混悬液间隔一定距离将滴于皿盖上，然后按照一定弧度翻转皿盖，让所述CAR-T细胞混悬液悬滴倒挂于皿盖，皿底加入适量生理盐水防止挥发，24小时后可以看到所述CAR-T细胞形成于所述悬滴法凝胶中。
所述琼脂糖凝胶体系的配置方法如下：
称取一定量的低熔点琼脂糖粉末，按2-10％质量体积比加入到无血清的培养基中，高压灭菌后趁热取出并按每孔200μl迅速平铺到48孔板中，待其自然冷却凝固后，取所述CAR-T细胞按2000个/孔接种于48孔板中，得到含有所述CAR-T细胞的所述琼脂糖凝胶体系。进一步地，所述悬滴培养法培养所述软性免疫细胞的步骤包括：将所述CAR-T细胞在2D培养基中培养至所述CAR-T细胞生长至1w-100w/mL时，吸出培养上清，用PBS洗2次后离心获取细胞沉淀，吸除离心后的上清液，用新鲜的培养基重悬细胞沉淀计数，按照50w-100w细胞每毫升的密度配置所述CAR-T细胞的溶液，将未处理的培养皿翻转皿盖，按照10-50微升每滴，将所述CAR-T细胞的溶液间隔一定距离滴于皿盖上，然后以一定弧度翻转皿盖，让所述CAR-T细胞悬滴倒挂于皿盖上，皿底加入适量生理盐水防止细胞悬液挥发，12-48小时后，可明显看到所述软性免疫细胞沉于液滴中
本发明提出了利用3D培养法对所述CAR-T细胞进行软化，所述CAR-T细胞包括CD19-CAR-T，CD-22-CAR-T，BCMA-CAR-T等任何不同CAR结构的CAR-T细胞。
作为本发明的另一方面，本发明提供了一种软性免疫细胞的制备方法，具体步骤如下：
步骤一，将所述免疫细胞置于所述琼脂糖凝胶体系中培养1-15天，培养结束后，分散凝胶体系；
步骤二，离心除去分散的所述琼脂糖凝胶体系，加入PBS溶液，离心重悬得到所述软性免疫细胞。
本发明还提供一种所述软性免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明可以用于治疗多种类型的肿瘤，所述肿瘤包括急性白血病、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌、骨癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、子宫体癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌、结肠癌或直肠癌中的一种或者几种。
本发明所制备的所述软性免疫细胞的肿瘤浸润效果及抑瘤效果通过体内荷瘤小鼠药效评价得到。
(三)有益效果
本发明产生的有益效果是：
本发明通过对免疫细胞进行3D培养，所得的软性免疫细胞活性及杀伤与2D培养得到的免疫细胞没有显著性差异，并且相对于2D培养所得的免疫细胞，本发明通过3D培养得到的软性免疫细胞的肿瘤深部穿透效果提升，具备更好的抑瘤效果，并可显著提升小鼠的半数生存期。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞的光学显微镜图；
图2为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞的肌动蛋白(actin)的western blot及Q-PCR图；其中，图A为不同纤维蛋白原浓度下f-actin浓度表达Western结果，图B为不同纤维蛋白原浓度下f-actin的QPCR测试结果；
图3为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞的肌动蛋白(actin)的鬼笔环肽染色图；其中图A为不同纤维蛋白原浓度下鬼笔环肽对细胞骨架染色，图B为不同纤维蛋白原浓度下鬼笔环肽荧光定量分析，图C为不同的CAR-T尺寸统计；
图4为渗透压法对本发明所得的3D培养的CAR-T细胞软硬度表征；
图5为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞小鼠肿瘤摄取的流式图；
图6为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞活性评价；
图7为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞因子分泌图；
图8为本发明所得的3D培养的CAR-T细胞小鼠淋巴瘤药效评价图；其中图A为不同纤维蛋白原浓度培养下CAR-T的肿瘤药效，图B为不同纤维蛋白原浓度培养下CAR-T治疗小鼠生存期。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未够成冲突可以相互结合。
下述实施例中使用的各种细胞及实验动物：
CD-19-CAR-T细胞、人淋巴瘤Raji细胞由武汉思安医疗技术有限公司提供，高度免疫缺陷鼠NSG小鼠从上海南模生物科技有限公司购买得到。
实施例一：3D凝胶体系培养CAR-T细胞
(1)将CAR-T细胞采用预配培养基稀释为1×102-1×105个/mL；
(2)配置T7缓冲液(pH 7.4，10-100mM Tris，50-200mM NaCl)；
(3)采用T7缓冲液将纤维蛋白原稀释至(1、2、4mg/mL)；
(4)将CAR-T细胞混悬液与含有纤维蛋白原的T7缓冲液按照1:1混合，此时纤维蛋白原浓度为(2、4、8mg/mL)；
(5)在预冷的24孔板中加入1-10μl浓度为0.1U/μl的纤维蛋白原，与上述步骤得到的25-500μl的CAR-T细胞混悬液吹打混匀，37℃条件下孵育1-50min后，加入1-5mL预配完全培养基；
(6)待细胞克隆生长至第4-15天，加入80-1000μg/ml I型胶原酶及1-5mg/ml分散酶将CAR-T细胞团消化成单个细胞后，搜集进一步实验。
实验结果发现，随着纤维蛋白浓度增加，培养所得的CAR-T细胞生长逐渐聚集成球状，其中，8μg/ml的纤维蛋白原条件下，CAR-T细胞团聚程度最高，而2D培养所得CAR-T细胞为分散的细胞，2D培养与3D培养的CAR-T细胞在明场下，大小无显著变化。如图1所示。
实施例二：
对本发明所制备的2D与3D的CAR-T细胞f-actin蛋白利用western blot测定其含量，具体操作步骤如下：
(1)配置f-actin提取液：1％Triton X-100,20mM Tris,5mM EGTA，20mM氯化钠，25mM焦磷酸纳，10mMβ巯基乙醇，提取液使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)。
(2)对f-actin的提取：取一定密度的细胞种植于六孔板，培养一定时间或试剂处理一定时间后，吸除培养基上清，将孔板置于冰上并用预冷的PBS洗2次，然后加入500微升f-actin的蛋白提取液，冰上处理10分钟后，将细胞裂解物吸出至EP管中，获得f-actin蛋白提取物。
(3)对得到的f-actin以20μl蛋白/孔上样。电泳结束后，使用半干细胞进行半干电泳转移，转移条件为30mA/100min。使用封闭液封闭转印膜,4℃过夜，第二天用1×TBST洗涤3次，每次15min。
(4)所得的样品加入稀释好的一抗(1:500)，37℃温育2h。用1×TBST洗涤4次，每次10min。加入稀释好的二抗(1:2000)，37℃温育2h。用1×TBST洗涤4次，每次10min。用超强力胶水超敏发光液进行化学发光检测，并对X光片曝光。经显影定影处理后，晾干的胶片最后用凝胶成像分析系统拍照，并采用Gel-Pro Analyzer软件进行分析。
(5)对上述操作所得的f-actin样品进行Q-PCR测试。
实验结果发现，随着纤维蛋白浓度增加，CAR-T细胞的f-actin表达降低，Q-PCR结果同样说明了这一结果，CAR-T细胞的f-actin表达随着纤维蛋白原的浓度增加而降低。如图2所示。
实施例三：
(1)取2D与3D培养得到的CAR-T细胞种于24孔板中，加适量完全培养基重悬并计数，将盖玻片置于其中，将细胞悬液按适当的浓度接种于孔板中的盖玻片上。
(2)培养一段时间，对细胞采用PBS轻轻轻洗2次，再加入2％多聚甲醛(PFA)溶液4℃固定过夜。吸除固定液，PBS漂洗2次。加入0.1％ Triton X-100室温透膜2-5分钟。
(3)吸出透膜剂，PBS漂洗1次，然后加入5％BSA室温封闭1小时。完成后，加入荧光偶联的鬼笔环胎抗体(Phalloidin,染肌动蛋白F-actin),室温孵育3小时，然后PBS清洗3次，最后加入核染料DAPI，室温染色20分钟后，PBS清洗3次，将玻片轻轻取出，晾干后采用共聚焦显微镜拍照。
实验结果发现，随着纤维蛋白浓度增加，鬼笔环胎荧光定量减少增加，同样说明，CAR-T的f-actin表达随着纤维蛋白原的浓度增加而降低。利用共聚焦显微镜观察了2D与3D的CAR-T细胞大小，发现2D培养与3D培养所得的CAR-T细胞大小没有显著差异。如图3所示。
实施例四：
(1)对NSG小鼠淋巴瘤(Raji细胞)皮下瘤模型尾静脉分别注射取2D与3D培养得到的CAR-T细胞(各500w)，48小时后处死小鼠。
(2)取上述各组分离的肿瘤组织，切碎，采用胶原酶将肿瘤分散至细胞单体，通过流式细胞仪检测经上述治疗后不同肿瘤组织中CAR-T细胞的数量。
实验结果发现，随着通过3D培养的CAR-T细胞，在肿瘤内比例更高，为2D培养的CAR-T细胞的1.5倍，说明3D培养可以软化CAR-T细胞，提升CAR-T细胞的肿瘤浸润效果。如图5所示。
实施例五：
(1)取2D与3D培养(纤维蛋白原浓度8ug/mL)得到的CAR-T细胞，重悬除去培养基，离心分离CAR-T细胞，所得的CAR-T细胞采用超纯水稀释为2w个/mL；
(2)将所得的CAR-T细胞分别采用一定浓度的PBS溶液稀释，得到CAR-T浓度分别为1w个/mL，稀释介质为不同质量浓度的PBS溶液(0％、5％、10％、20％)的CAR-T溶液，采用达尔文粒度仪测量不同PBS介质中CAR-T细胞的尺寸大小。
实验结果发现，随着CAR-T细胞的溶液渗透压增加(PBS浓度增加)，2D培养的CAR-T与3D培养的CAR-T细胞尺寸均有一定程度减小，3D培养的CAR-T细胞尺寸减小比例更大，说明3D培养的CAR-T细胞更为柔软。
实施例六：
(1)按照实施例一的方法对CAR-T细胞进行3D培养，纤维蛋白原浓度分别为4ug/mL及8ug/mL，培养4-15天后，加入80-1000μg/ml I型胶原酶及1-5mg/ml分散酶将CAR-T细胞团消化成单个细胞后，搜集进一步实验。
(2)取2D及不同纤维蛋白原浓度3D培养的CAR-T细胞置于24孔板中，加入适量的含有10％血清的1640培养基培养，分别于第1、2、3、4、5天取出部分CAR-T细胞通过CCK8、及LDH测量CAR-T细胞活性。
(3)取2D及不同纤维蛋白原浓度3D培养的CAR-T细胞置于24孔板中，加入适量的含有10％血清的1640培养基培养，分别于第1、2、3、4、5天取出部分CAR-T细胞通过ELISA测量其IL-2及IFN-γ，测其CAR-T的杀伤效果。
实验结果发现，2D及3D培养所得的CAR-T细胞，在5天内，细胞的活性没有显著差异，CAR-T分泌的IL-2及IFN-γ均没有显著性差异。说明3D培养不会影响CAR-T的活性及肿瘤杀伤效果。如图6所示。
实施例七：
(1)在NSG鼠后背种植淋巴瘤Raji细胞(1×107细胞/只)。当肿瘤体积长到0.1cm3,NSG鼠被平均分为5组(每组8只)进行尾静脉注射，5组分别为PBS组、2D的CAR-T组、2ug/mL纤维蛋白原培养CAR-T组，4ug/mL纤维蛋白原培养的CAR-T组，8ug/mL纤维蛋白原培养的CAR-T组。
(2)对小鼠给药后，每3天测量一次肿瘤体积，得到不同组别CAR-T细胞治疗小鼠的药效曲线。治疗14天后，记录每天不同组别的NSG鼠的死亡状况，得到不同组别CAR-T治疗小鼠的半数生存期。如图7所示。
实验结果发现，4ug/mL纤维蛋白原培养的CAR-T组及8ug/mL纤维蛋白原培养的CAR-T组相对于2D的CAR-T组，具备更好药效。
随着纤维蛋白浓度增加，肿瘤内CAR-T细胞比例随之增加，说明3D培养可以软化CAR-T细胞，提升CAR-T细胞的肿瘤浸润效果。
综上所述，本发明提供的通过3D培养基得到的软性免疫细胞，与常规的免疫细胞相比，能够高效地蓄积于肿瘤组织、深部穿透进入肿瘤深部，显著提升免疫细胞抑制淋巴瘤的生长效果。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种软性免疫细胞的制备方法，其特征在于：通过免疫细胞的3D培养基培养得到软性免疫细胞，所述软性免疫细胞的培养方法为凝胶培养法，所述免疫细胞为CAR-T细胞，所述凝胶培养法中的凝胶为纤维蛋白原凝胶，所述3D培养基包括纤维蛋白原凝胶，所述纤维蛋白原凝胶的制备方法如下：
步骤一，配置T7缓冲液，所述T7缓冲液成分为pH 7.4，10-100 mM Tris，50-200 mMNaCl；步骤二，采用所述T7缓冲液将纤维蛋白原分别稀释至1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL；步骤三，将CAR-T细胞溶液与含有纤维蛋白原的所述T7缓冲液按照1:1混合，得到CAR-T细胞混悬液；步骤四，在预冷的24孔板中加入1-10 µl 浓度为0.1 U/µl的纤维蛋白原，与步骤三得到的25-500 µl的所述CAR-T细胞混悬液吹打混匀，37 ℃条件下孵育1-50 min后，含有所述CAR-T细胞的所述纤维蛋白原凝胶形成。
2.根据权利要求1所述一种软性免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-T细胞包括CD19-CAR-T，CD-22-CAR-T，BCMA-CAR-T。
3.权利要求1或2所述的软性免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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