CN111117952A - 一种修复妊娠纹的细胞混悬液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修复妊娠纹的细胞混悬液及其制备方法，利用细胞培养的方法制备一种包含促进表皮再生的表皮细胞、促进肤色改善的黑色素细胞和具有促进胶原蛋白生成、补充粘连蛋白、促进弹性蛋白合成的真皮成纤维细胞的复合细胞混悬液。该混悬液通过表皮细胞、黑色素细胞和真皮成纤维细胞产生的协同增效作用，降低炎症反应、紧致皮肤、延缓皮肤衰老，提高皮肤防御能力，有效修复皮肤妊娠纹。

Description

一种修复妊娠纹的细胞混悬液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种修复妊娠纹的细胞混悬液及其制备方法，属于细胞培养领域。
背景技术
妊娠纹是膨胀纹的一种，发生于怀孕期间，表现为胸部、腹部、臀部和大腿的萎缩性条 索状皮肤改变。早期表现为暗红色或紫红色的条纹，然后色素脱失、萎缩，最后稳定后呈现 出一种白色或银色的皮肤损害。妊娠纹的形成原因是怀孕妊娠期受荷尔蒙影响，因子宫、腹 部的膨隆使皮肤的弹力纤维与胶原纤维因外力牵拉而受到不同程度的损伤或断裂，皮肤变薄 变细。
皮肤由外到内可分为三层，分别是表皮层、真皮层和皮下组织。真皮层位于表皮浅层， 表皮和皮下组织之间，主要由胶原纤维，弹力纤维，网状纤维和无定型基质等结蹄组织构成。 胶原纤维是真皮结缔组织中最为丰富的成分，是目前认为与皮肤老化关系最为密切的真皮有 形成分。弹性纤维在真皮部最粗，主要与皮肤弹性关系密切。
妊娠纹的出现严重破坏了女性的审美需求而被广泛关注，最新的治疗方法包括表层化学 脱皮术、皮肤磨削术和激光治疗等，甚至提出了很多的微创手术方法。一些新式的治疗方法 如蓖麻油、海藻成分，局部应用乙醇酸和果酸及一些包含多种成分的霜剂，局部应用0.1％维 A酸乳酸软膏治疗早期的膨胀纹。然而，医美方法具有一定的危险性，术后护理也比较复杂， 如果处理不当可能导致一些不可逆损伤，且恢复时间比较长；外用霜剂虽然使用比较方便和 安全但是效果却比较有限，不能达到理想的治疗状态。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种修复妊娠纹的细胞混悬液及其制备方法。 本申请利用细胞培养的方法制备一种包含促进表皮再生的表皮细胞、促进肤色改善的黑色素 细胞和具有促进胶原蛋白生成、补充粘连蛋白、促进弹性蛋白合成的真皮成纤维细胞的复合 细胞混悬液，该细胞混悬液通过表皮细胞、黑色素细胞和真皮成纤维细胞产生的协同增效作 用，降低炎症反应、紧致皮肤、延缓皮肤衰老，提高皮肤防御能力，有效修复皮肤妊娠纹。
一种修复妊娠纹的细胞混悬液的制备方法，包括如下步骤：
(1)在无妊娠纹部位切除一块2cm*2cm的组织，去除皮下脂肪和结缔组织，消毒后沥 净多余液体，称重并作好记录；
(2)步骤(1)中获得的处理后的组织加入10-20ml分散酶溶液，放入4℃冰箱消化过夜， 次日将消化后的组织分成表皮组织和真皮组织两部分；
(3)将步骤(2)获得的表皮组织剪碎，加入10-20ml的0.05％的胰蛋白酶溶液继续消 化25-30min，消化后在消化液中添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打，过滤，离心保留沉淀，在离心沉淀中加入含10mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的M254 培养基重悬细胞；
(4)将步骤(3)中获得的重悬细胞培养液移入到细胞培养瓶中，每2天换一次培养液， 当细胞生长达到在细胞培养瓶80-90％覆盖率就进行传代；细胞按100-200万/T75细胞培养瓶 的密度传代，传2-4代后获得表皮细胞和黑色素细胞共培养液；
(5)将步骤(2)获得的真皮组织剪碎，加入15-20ml的胶原酶溶液继续消化25-30min， 消化后在消化液中添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打，过滤， 离心保留沉淀，在离心沉淀中加入10-15ml真皮成纤维培养基(按照专利申请号为201610473348.1，专利名称为一种多功能无血清细胞培养基及其应用的专利所述方法制备) 重悬细胞；
(6)将步骤(5)中获得的重悬细胞培养液移入到细胞培养瓶中，每2天换一次培养液， 观察当细胞生长达到在培养器皿80-90％覆盖率就进行传代；细胞按100-200万/T75细胞培养 瓶的密度传代，传2-4代后获得真皮成纤维细胞培养液；
(7)将步骤(4)获得的表皮细胞和黑色素细胞共培养液和步骤(6)获得的真皮成纤维 细胞培养液按照一定比例混合，获得修复妊娠纹的细胞混悬液。
进一步的，上述步骤(1)中的消毒指先使用酒精处理组织1-3min，再使用15ml的PBS 缓冲液处理两次，每次1-3min，所述的PBS缓冲液含有200单位/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。
进一步的，上述步骤(2)中所述分散酶溶液的浓度为2.5g/L。
进一步的，上述步骤(3)中所述消化液和所述含有10％胎牛血清的DMEM培养基按照 体积比为1:1的比例混合。
进一步的，上述步骤(5)中所述胶原酶溶液的浓度为2.5g/L。
进一步的，上述步骤(5)中所述消化液和所述含有10％胎牛血清的DMEM培养基按照 体积比为1:1的比例混合。
进一步的，上述步骤(7)中所述的一定比例混合指表皮细胞和黑色素细胞共培养液和真 皮成纤维细胞培养液按照体积比为1:2-3混合。
本申请还保护使用上述制备方法制备的细胞混悬液。
本申请还保护上述细胞混悬液在制备用于修复妊娠纹的注射液中的应用。
本申请还保护上述细胞混悬液在修复妊娠纹中的应用。
有益效果：
(1)本申请的细胞混悬液包含促进表皮再生的表皮细胞、促进肤色改善的黑色素细胞 和具有促进胶原蛋白生成、补充粘连蛋白、促进弹性蛋白合成的真皮成纤维细胞，具有促进 表皮细胞和真皮细胞再生长，促进皮肤色素改善，可以修复皮肤表皮层、基底膜、真皮层、 抗炎、促进结缔组织生长、增加胶原蛋白及弹性蛋白生成，能够用于产前预防和产后修复妊 娠纹。
(2)本申请的细胞混悬液在注射使用后所包含的大量细胞可以分泌大量的细胞因子， 可以降低炎症反应、紧致皮肤、延缓皮肤衰老，提高皮肤防御能力。
(3)本申请的细胞混悬液所使用的细胞来源于人体自身，因此没有免疫排斥反应，对 人体安全，无刺激及毒副作用。
附图说明
图1A表皮细胞和黑色素细胞共培养3天的生长状态；B为表皮细胞和黑色素细胞共培 养14天的生长状态。
图2C为真皮成纤维细胞培养3天的生长状态；D为真皮成纤维细胞培养14天的生长状态。
图3细胞大小分布情况。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进 一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例 的限制。
实施例1细胞混悬液的制备
一、实验材料
青霉素-链霉素、Ⅰ型胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、DMEM培养基、F12培养基、真皮成纤维细胞培养基、M254培养基(gibco公司)、PBS、胎牛血清FBS、组织保存液、T75 细胞培养瓶、6孔细胞培养板、100μm细胞过滤器。
二、实验方法
(1)组织的获取：与患者充分沟通，告知本项目实施的目的、方法和预期治疗效果，并 告知其可能存在的风险签订知情同意书。从身体无妊娠纹位置切除一块2cm*2cm的组织，随 后放入含组织保存液的容器中，运至细胞培养实验室。
(2)组织的处理：剪去皮肤组织附带的皮下组织中的脂肪和结缔组织，将采集的新鲜组 织样本用酒精消毒处理3min，然后用含双抗的PBS处理两次，每次3分钟以达到灭菌消毒的 目的。将处理好的组织沥净多余液体，称重并作好记录后将组织平铺在100mm细胞培养皿中。
(3)酶消化并收集表皮和黑色素细胞：处理好的组织加入2.5g/L分散酶4℃冰箱消化过 夜。第2天用小镊子拨开表皮将组织分成表皮和真皮两部分。表皮用于表皮和黑色素细胞的 分离，真皮用于真皮细胞的分离。将表皮剪碎并加入0.05％的胰蛋白酶继续消化30min；将真 皮剪碎后加入2.5g/L胶原酶继续消化30min。
(4)表皮和黑色素细胞共培养：经步骤(3)的表皮组织消化好后加相同体积的含有10％ 胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打。用100μm细胞过滤器过滤。1000×g离心5min，弃上清。用含10mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的含M254培养基重悬细胞，接种 到细胞培养瓶(每T75细胞培养瓶细胞数大约在300万～500万)中。显微镜下观察细胞， 待细胞长满时进行传代或后续研究。每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90％ 覆盖率就进行传代；细胞按1：2-4的比例传代，传2-4代后注射。
(5)真皮成纤维细胞的培养：经步骤(3)的真皮组织消化好后加相同体积的含有10％ 胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打。用100μm细胞过滤器过滤。1000×g离心5min，弃上清。用真皮成纤维培养基重悬细胞，接种到细胞培养瓶(每T75细胞培养瓶 细胞数大约在300万～500万)中。显微镜下观察细胞，待细胞长满时进行传代或后续研究。 当细胞生长达到在培养器皿80-90％覆盖率就进行传代；按1：3-6比例传代，传2-4代。
(6)细胞混悬液制备：培养后经质控合格的表皮细胞、黑色素细胞共培养液和真皮成纤 维细胞培养液按照体积比1：2-3制备成细胞混悬液。
三、实验结果1、表皮细胞和黑色素细胞共培养的生长状态
如图1所示A为共培养3天时，原代(P0代)表皮细胞和黑色素细胞共培养的生长状态， 图1中的B为共培养14天时，传代(P3代)表皮细胞和黑色素细胞共培养的生长状态。表皮细胞表皮细胞和黑色素细胞共培养生长迅速，并且细胞可以聚团生长。
2、真皮成纤维细胞的生长状态
如图2所示，C为培养3天时，原代(P0代)真皮成纤维细胞的生长状态；图2中的D 为培养14天时，P3代真皮成纤维细胞的生长状态。由图可以看出，使用本发明培养的传代 真皮成纤维细胞扩增速度快，细胞体积小。
3、细胞混悬液
使用用细胞计数仪测定细胞活性在95％以上，图3中可见细胞混悬液中细胞直径在12-18 μm比例超过90％。
实施例2细胞混悬液动物实验治疗评价
一、动物与设备
1、实验动物：健康10周裸鼠，雄性，体重20g左右。
2、试剂与设备
皮肤羟脯胺酸测定试剂盒，悬液一(表皮细胞和黑色素细胞混悬液：细胞浓度为5.0*106/ml，代次为P3)、悬液二(真皮成纤维细胞混悬液：真皮成纤维细胞数量为2.0*107/ml， 代次为P4)、悬液三(注射用细胞混悬液：含5.0*106/ml代次为P3表皮细胞和黑色素细胞， 含2.0*107/ml代次为P4真皮成纤维细胞)，悬液四(F12培养基)，市售宣称妊娠纹去除的 乳膏，分光光度计。
二、实验方法
(1)实验动物处理：选取15只裸鼠，分成五个实验组，每组动物数量为3只。分别在实验组1-4的小鼠的右侧耳背注射悬液一至悬液四，用量为25微升，实验组5用市售宣称妊娠纹去除的乳膏涂抹作为对照品；每组小鼠的左侧耳背不用处理，作为空白对照组。在清洁、 通风、干燥、室温22±2℃条件下，相同饲料喂养。30天后各取3只，处死，取其悬液作用部位及对侧相应部位皮肤。
(2)促进胶原蛋白生成实验：用天平称45mg组织放入洁净试管中，加入2ml组织提取液， 置于110℃烘箱，水解6-12小时，16000rpm，25℃，离心20min，用提取液定容至2ml，取上清待测。取上清于560nm波长下测定吸光度值。样品经水解产生游离的羟脯胺酸，进一步被氧化，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值， 可计算羟脯胺酸含量。
三、结果测定与分析
羟脯胺酸是胶原蛋白的一种特有氨基酸，胶原蛋白大多分布于皮肤、肌腱、软骨和血管 等，因此，羟脯胺酸的含量是反应胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。采用分光光 度计测定羟脯胺酸的含量，按胶原蛋白中14％的羟脯胺酸换算小鼠皮肤中的胶原蛋白含量。
采用分光光度计测定羟脯胺酸的含量，按胶原蛋白中14％的羟脯胺酸换算小鼠皮肤中的 胶原蛋白含量，结果如表1所示。
表1皮肤中蛋白含量
Figure BDA0002251109140000051
Figure BDA0002251109140000061
由表中数据可知，悬液一(含表皮细胞和黑色素细胞)、悬液二(含真皮成纤维细胞)、 悬液三(含表皮细胞、黑色素细胞和真皮成纤维细胞)均可促进胶原蛋白生成，且作用效果： 悬液三＞悬液二＞悬液一，市售妊娠纹去除产品没有促进胶原蛋白生成的作用。
实验数据表明表皮细胞和黑色素细胞以及真皮细胞均可促进胶原蛋白合成，混悬液组合 效果后增强，悬液三在促进皮肤的胶原蛋白生产的效果最佳，胶原蛋白含量的百分比增大最 明显，证明各细胞成分具有显著的协同作用。
实施例3细胞混悬液临床治疗评价
一、实验对象和试剂
1、实验对象：50名25-45岁患有妊娠纹一年以上，其他身体指标健康的女性
2、试剂
悬液一：自体表皮细胞和黑色素细胞混悬液，细胞浓度为5.0*106/ml，代次为P3
悬液二：真皮成纤维细胞混悬液，真皮成纤维细胞数量为2.0*107/ml，代次为P4
悬液三：注射用细胞混悬液，含5.0*106/ml代次为P3表皮细胞和黑色素细胞，含2.0*107/ml 代次为P4真皮成纤维细胞
悬液四：F12培养基
市售宣称妊娠纹去除的乳膏
二、实验步骤
1、实验设计：
50名25-45岁患有妊娠纹一年以上，其他身体指标健康的女性，随机分为5组，每组10人。 实验组1-4分别注射四种悬液(即上述悬液一到悬液四)，实验组5涂抹市售宣称妊娠纹去 除的乳膏。
以受试者腹部中线为分界，将其腹部分为左右两个区域，在每个区域选取纹路、颜色类 似的一处妊娠纹(面积为20cm2)，随机选取其中一侧注射自体细胞混悬液(注射量为0.5ml/cm2)或涂抹去除妊娠纹的乳膏，另一侧作为空白对照部位。八周后评价各组修复妊娠 纹的效果。
注射悬液时，将细胞混悬液使用前混合均匀，吸取入注射器中，分20次均匀注射到妊娠 纹修复区域。根据皮肤反应调节吸力、深度、注射剂量；按照由内向外、由下向上的顺序进 行全面部治疗。打完之后，会看见小小的出血小针眼，属于正常现象。
2、评价指标
妊娠纹修复效果评价标准如下：
1)显效：腹部妊娠纹消失或明显改善，范围缩小在60％(含)以上；
2)有效：腹部妊娠纹改善，范围缩小在30％(含)以上；
3)无效：腹部妊娠纹改善不明显，范围缩小没有达到30％或没有缩小。
总有效率＝(显效例数+有效例数)/总实验例数×100％
三、实验结果
治疗8周后，比较各组的总有效率情况，结果见表2。
表2各组受试者治疗8周后妊娠纹修复情况
分组 n 显效例数 有效例数 无效例数 总有效率(％)
实验组1 10 4 4 2 80
实验组2 10 6 3 1 90
实验组3 10 8 2 0 100
实验组4 10 0 1 9 10
实验组5 10 0 2 8 20

Claims (10)

1.一种修复妊娠纹的细胞混悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在无妊娠纹部位取一块组织，去除皮下脂肪和结缔组织，消毒后沥净多余液体，称重并作好记录；
(2)步骤(1)中处理后的组织加入分散酶溶液，放入4℃冰箱消化过夜，次日将消化后的组织分成表皮组织和真皮组织两部分；
(3)将步骤(2)获得的表皮组织剪碎，加入0.05％的胰蛋白酶溶液继续消化25-30min，消化后在消化液中添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打，过滤，离心保留沉淀，在离心沉淀中加入含10mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的M254培养基重悬细胞；
(4)将步骤(3)中获得的重悬细胞培养液移入细胞培养瓶中，当细胞生长达到在细胞培养瓶80-90％覆盖率就进行传代；细胞按100-200万/T75细胞培养瓶的密度传代，传2-4代后获得表皮细胞和黑色素细胞共培养液；
(5)将步骤(2)获得的真皮组织剪碎，加入胶原酶溶液继续消化25-30min，消化后在消化液中添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基中和消化液，反复吸打，过滤，离心保留沉淀，在离心沉淀中加入真皮成纤维培养基重悬细胞；
(6)将步骤(5)中获得的重悬细胞培养液移入细胞培养瓶中，当细胞生长达到在培养器皿80-90％覆盖率就进行传代；细胞按100-200万/T75细胞培养瓶的密度传代，传2-4代后获得真皮成纤维细胞培养液；
(7)将步骤(4)获得的表皮细胞和黑色素细胞共培养液和步骤(6)获得的真皮成纤维细胞培养液混合，获得修复妊娠纹的细胞混悬液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的所述的消毒指先使用酒精处理组织1-3min，再使用PBS缓冲液处理两次，每次1-3min，所述的PBS缓冲液含有200单位/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述分散酶溶液的浓度为2.5g/L。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述消化液和所述含有10％胎牛血清的DMEM培养基按照体积比为1:1的比例混合。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述胶原酶溶液的浓度为2.5g/L。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述消化液和所述含有10％胎牛血清的DMEM培养基按照体积比为1:1的比例混合。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中表皮细胞和黑色素细胞共培养液和真皮成纤维细胞培养液按照体积比为1:2-3混合。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的细胞混悬液。
9.权利要求8所述的细胞混悬液在制备用于修复妊娠纹的注射液中的应用。
10.权利要求8所述的细胞混悬液在修复妊娠纹中的应用。
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