CN104818239A - 一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)暗色唇鱼肝脏的获取：亚甲基蓝和酒精联合对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有硫酸卡那霉素和硫酸链霉素的高糖DMEM培养液进行培养；3)传代培养：传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，所述暗色唇鱼肝脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的暗色唇鱼肝脏细胞系形态为不规则多角形，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对暗色唇鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。

Description

一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及一种利用暗色唇鱼肝脏组织建立细胞系的方法，属于淡水水生生物细胞培养的技术领域。

背景技术

暗色唇鱼Semilabeo obscurus Lin，隶属于鲤科(Cyprinidae)野鲮亚科(Labeoninae)唇鱼属(Semilabeo)。由于该鱼体肥、肉嫩、味美，成了捕捞的首选目标。又因其具有群居岩洞的生活习性，便成为不法分子电、毒、炸的最大受害者，随着鱼类资源的利用强度加大和捕捞技术的更新，鱼类生物多样性呈下降趋势，暗色唇鱼已成为李仙江流域珍稀濒危物种。且暗色唇鱼1989年被列入云南省II级保护动物，1998年被列入《中国濒危动物红皮书》。为了保护、开发利用这一珍稀的土著鱼类资源，2007年由云南省环保局批准立项，云南大唐国际李仙江流域水电开发有限公司委托中国科学院昆明动物研究所开展了暗色唇鱼的人工增殖放流研究，最终于2010年突破了暗色唇鱼的人工繁殖技术，并于2012年将暗色唇鱼鱼苗放流回李仙江流域，完成了这一土著珍稀鱼类人工增殖放流的全过程。

暗色唇鱼野外生存环境的不断恶劣，尽管已实现了暗色唇鱼的人工增殖放流，但野外种群数量仍在锐减，因此，除加强野外引种，使更多的野外种群在保育研究基地得以存活外，暗色唇鱼野外种群的种质资源保存已刻不容缓。细胞培养和冻存是种质资源保存中应用最为广泛的一种技术，但此技术在淡水鱼类尤其是云南土著珍稀鱼类种质资源保存的应用很少，暗色唇鱼的细胞研究亦是一片空白。

另外，由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养以用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量，保证放流个体的成活率和繁殖率。而对于暗色唇鱼这种幼体生长较慢，个体较小，血液量较少的鱼类而言，传统的血液短期培养不能满足核型分析的需要，因此有必要寻找能快速获得细胞的方法，以满足暗色唇鱼细胞的短期培养用于核型分析。

鱼类肝脏组织含有较多的胶原和纤维组织，而因鱼类肝脏组织不同鱼哺乳动物肝脏，无法使用目前构建哺乳动物肝脏细胞系常用的灌注消化法进行细胞系建立。现有的专利或发表文章中的鱼类细胞系的构建方法中，酶消化法处理后，肝脏细胞的获得量少且不易贴壁，而采用酶消化法和机械剪碎法联合作用，操作较为复杂，因此，需要研究一种快速有效的暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，以建立暗色唇鱼的肝脏细胞系。在暗色唇鱼细胞系建立实践中，细胞系能否建立成功除与建立方法密切相关外，暗色唇鱼的生活状态也是决定其成功与否的关键，这是很多专利或文章中并未提及或忽略的一环，因此，暗色唇鱼肝脏细胞系的构建是建立在对野生和塘养暗色唇鱼生态习性极度熟悉的基础之上。经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便易行的暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，以满足对暗色唇鱼快速核型分析、种质资源保存和理论研究的需要。

本发明提供了一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)暗色唇鱼肝脏的获取：先用10-20mg/L亚甲基蓝浸泡暗色唇鱼10-30分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除鱼体表粘液；再以75％酒精消毒鱼体后，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织；浸泡15-20分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗；

2)原代培养：将所述肝脏组织剪成约100mm³的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在24-30℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在24-30℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第5-7天细胞开始从组织块中迁移，15天长成细胞单层；

3)传代培养：原代肝脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于24-30℃培养箱中继续培养；每4-5天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，所述暗色唇鱼肝脏细胞系建立成功。

在本发明的一些实施例中，所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300μg/ml的硫酸卡那霉素和浓度为100-300μg/ml的硫酸链霉素的Hanks平衡盐溶液。优选地，硫酸卡那霉素的浓度为200μg/ml，硫酸链霉素的浓度为200μg/ml。

在本发明的一些实施例中，所述基础培养液为含有占总体积的10-15％的胎牛血清的高糖DMEM培养液。

在本发明的一些实施例中，所述原代培养液为含有占总体积的20％的胎牛血清、浓度为150-200μg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为50-150μg/ml的硫酸链霉素的高糖DMEM培养液。优选地，硫酸卡那霉素的浓度为150μg/ml，硫酸链霉素的浓度为100μg/ml。

在本发明的一些实施例中，所述传代培养液为含有占总体积的20％的胎牛血清、浓度为50-150μg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为30-60μg/ml的硫酸链霉素的高糖DMEM培养液。优选地，硫酸卡那霉素的浓度为100μg/ml，硫酸链霉素的浓度为50μg/ml。

在本发明的一些实施例中，所述消毒液或者培养液的pH值为7.0-7.4。

本发明又提供了一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法还可以包括如下细胞冻存与复苏的步骤：

1)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO，按13:1的体积比混合，现用现配；

2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000-1200rpm离心7-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×106个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；

3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用所述基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，24-30℃培养箱中培养，5-7天细胞即长成单层。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明的有益效果在于：

1.本发明的构建方法操作简便易行，并且构建方法重复性，构建的细胞系稳定性好。

2.相对于用于核型分析的血液短期培养，采用本发明的构建方法获得的肝脏组织块中刚迁移出来的细胞具有活性，且细胞量大，可用于染色体分析。

3.本发明的构建方法所获得的肝脏细胞系原代培养耗时短，且不需要生长因子。

4.本发明构建的暗色唇鱼肝脏细胞系形态为不规则多角形，能够连续传代，迄今已传代50代，因此能够提供大量的暗色唇鱼肝脏细胞。此外，本发明构建的暗色唇鱼肝脏细胞能够直接应用于生物学特性研究，满足了对暗色唇鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。

5.本发明的构建方法也适用于其他鱼类构建肝脏的细胞系。

附图说明

图1是示出不同培养基液对暗色唇鱼肝脏细胞生长的影响的图。

具体实施方式

从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。

实施例1

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向Hanks平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的浓度为100μg/ml，硫酸链霉素浓度为100μg/ml。

基础培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的10％。

原代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为150μg/ml，硫酸链霉素浓度为50μg/ml。

传代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为50μg/ml，硫酸链霉素浓度为30μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.0，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用10mg/L亚甲基蓝浸泡鲜活暗色唇鱼30分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除体表粘液；再次以75％酒精消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肝脏，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织。浸泡20分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成约100mm³的组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在24℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3ml，在24℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第7天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层。

3.传代培养

原代肝脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA溶液1ml，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液1.5ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于24℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至50代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按13:1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000rpm离心10分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液，800rpm离心8分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，24℃培养箱中培养，7天细胞即长成单层。

实施例2

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向Hanks平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的浓度为200μg/ml，硫酸链霉素浓度为200μg/ml。

基础培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的10％。

原代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为180μg/ml，硫酸链霉素浓度为100μg/ml。

传代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为100μg/ml，硫酸链霉素浓度为50μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.2，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用15mg/L亚甲基蓝浸泡鲜活暗色唇鱼15分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除体表粘液；再次以75％酒精消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肝脏，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织。浸泡15分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成约100mm³的组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在28℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3ml，在28℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第6天细胞开始从组织块中迁移，18天长成细胞单层。

3.传代培养

原代肝脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA溶液1ml，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液1.8ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于28℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至50代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按13:1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心7分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液，1000rpm离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养，6天细胞即长成单层。

实施例3

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向Hanks平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的浓度为300μg/ml，硫酸链霉素浓度为300μg/ml。

基础培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的15％。

原代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为200μg/ml，硫酸链霉素浓度为150μg/ml。

传代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的20％，硫酸卡那霉素的浓度为200μg/ml，硫酸链霉素浓度为150μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.4，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用20mg/L亚甲基蓝浸泡鲜活暗色唇鱼10分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除体表粘液；再次以75％酒精消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肝脏，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织。浸泡15分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成约100mm³的组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在30℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液4ml，在30℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第5天细胞开始从组织块中迁移，15天长成细胞单层。

3.传代培养

原代肝脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA溶液2ml，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于30℃培养箱中继续培养；每4天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至50代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按13:1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心7分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液，1000rpm离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，30℃培养箱中培养，5天细胞即长成单层。

实施例4

对实施例2的暗色唇鱼的鱼体采用不同消毒方法进行比较。

将实施例2中的暗色唇鱼分别采用最常见的高锰酸钾浸泡消毒、亚甲基蓝浸泡消毒和直接酒精消毒，其他步骤与实施例2中的步骤相同。结果表明(参见表1)，高锰酸钾对其毒性太强，组织块不易迁出细胞，且迁出细胞不易贴壁，而单独的亚甲基蓝或者酒精浸泡消毒，细胞的迁出效果不甚理想，易发生污染。当亚甲基蓝浸泡和酒精消毒联合作用时，结果显示这样处理后的鱼体所得到的肝脏细胞系污染率下降，

对细胞的迁出也影响不大。

表1.采用不同消毒方式的情况下组织块细胞迁出情况

实施例5

对实施例2中细胞培养所采用不同的抗生素进行比较。

在实施例2中的细胞培养液中分别添加青霉素、链霉素、两性霉素B、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、庆大霉素，其他步骤与实施例2中的步骤相同。对比这些种抗生素对暗色唇鱼肝脏细胞的影响(参见表2)，发现抗生素对暗色唇鱼肝脏细胞的影响很大，而暗色唇鱼肝脏细胞对硫酸卡那霉素、硫酸链霉素更敏感，更适合将硫酸卡那霉素和硫酸链霉素加入到消毒液和培养液中。

表2.采用不同抗生素的情况下组织块细胞迁出情况

实施例6

对实施例2中细胞培养液的基液所采用不同的培养液进行比较。

将实施例2中的培养基液替换成鱼类细胞培养常用的几种培养基DMEM、高糖DMEM、DMEM/F12、L-15、M199、M1640，对比这些不同培养基液对暗色唇鱼肝脏细胞生长的影响(参见图1)，发现对于暗色唇鱼肝脏细胞来说，不同的培养基液对细胞影响很大。暗色唇鱼肝脏细胞在高糖DMEM中的生长速度是DMEM/F12和L-15培养基中的2倍，是DMEM培养基中的5倍，是M199和M1640培养基中的10倍。因此，暗色唇鱼肝脏细胞在高糖DMEM这一培养基中的生长状态要优于其他几种培养基。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (7)

1.一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)暗色唇鱼肝脏的获取：先用10-20mg/L亚甲基蓝浸泡暗色唇鱼10-30分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除鱼体表粘液；再以75％酒精消毒鱼体后，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织；浸泡15-20分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗；

2)原代培养：将所述肝脏组织剪成约100mm³的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在24-30℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在24-30℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第5-7天细胞开始从组织块中迁移，15天长成细胞单层；

3)传代培养：原代肝脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于24-30℃培养箱中继续培养；每4-5天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，所述暗色唇鱼肝脏细胞系建立成功。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300μg/ml的硫酸卡那霉素和浓度为100-300μg/ml的硫酸链霉素的Hanks平衡盐溶液。

3.如权利要求1所述的构建方法，其中所述基础培养液为含有占总体积的10-15％的胎牛血清的高糖DMEM培养液。

4.如权利要求1所述的构建方法，其中所述原代培养液为含有占总体积的20％的胎牛血清、浓度为150-200μg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为50-150μg/ml的硫酸链霉素的高糖DMEM培养液。

5.如权利要求1所述的构建方法，其中所述传代培养液为含有占总体积的20％的胎牛血清、浓度为50-150μg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为30-60μg/ml的硫酸链霉素的高糖DMEM培养液。

6.如权利要求1-5所述的构建方法，其中溶液的pH值为7.0-7.4。

7.如权利要求1-5所述的构建方法，该构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：

1)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO，按13:1的体积比混合，现用现配；

2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000-1200rpm离心7-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；

3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用所述基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，24-30℃培养箱中培养，5-7天细胞即长成单层。