CN110501483B - 一种中草药活性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中草药活性的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：提供培养板；在所述培养板上接种靶细胞；将经过所述中草药作用后的中性粒细胞作用于所述靶细胞；向所述培养板中添加检测试剂；检测所述培养板中吸光度的变化；根据所述吸光度的变化判断所述中草药活性大小。本发明能根据中草药活性来合理利用中草药。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种中草药活性的检测方法。
背景技术
中性粒细胞是机体抗癌免疫监控系统不可或缺的重要组成。中草药对不同来源的中性粒细胞的活性影响较大。利用固定的中草药配方，很难使不同来源的中性粒细胞活性都提升至理想水平，本发明提出一种中草药活性的检测方法，能根据中草药活性来合理利用中草药。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种中草药活性的检测方法，能根据中草药活性来合理利用中草药。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的，一种中草药活性的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：
提供培养板；
在所述培养板上接种靶细胞；
将经过所述中草药作用后的中性粒细胞作用于所述靶细胞；
向所述培养板中添加检测试剂；
检测所述培养板中吸光度的变化；
根据所述吸光度的变化判断所述中草药活性大小。
在一实施例中，所述中草药包括人参、灵芝、蘑菇、党参、太子参、西洋参、黄芪、白术、山药、黄精、甘草、淫羊藿、肉苁蓉、冬虫夏草、巴戟天、杜仲、菟丝子、沙苑子、锁阳、仙茅、熟地黄、何首乌、当归、白芍、龙眼肉、枸杞子、女贞子、麦门冬、玉竹、紫苏、防风、柴胡、牛蒡子、升麻、知母、天花粉、决明子、生地黄、牡丹皮、黄芩、黄连、龙胆草、金银花、连翘、大青叶、鱼腥草、牛黄、青蒿、川穹、益母草、桃仁、红花、牛膝、鸡血藤、三七、茜草、蒲黄、天麻、酸枣仁、大黄、芦荟、茯苓、猪苓和薏苡仁。
在一实施例中，所述靶细胞的密度为100-1000000细胞/孔。所述靶细胞包括癌细胞。
在一实施例中，所述中草药的提取液的制备步骤包括，
称取所述中草药，加入超纯水；
将所述中草药粉碎或破壁30秒–10小时，获得中草药水溶液；
吸取所述中草药水溶液进行离心，获得上层液；
吸取所述上层液再次进行离心，所得上清液为所述中草药的提取液。
在一实施例中，获得所述中性粒细胞的步骤包括，
将所述中草药的提取液加入到外周血中，进行体外孵育；
提供若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液于离心管中；
利用所述若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过分离提取获得所述中性粒细胞。
在一实施例中，所述淋巴细胞分离液的组数为2-10组。
在一实施例中，将中性粒细胞作用于所述靶细胞的步骤包括，将所述中性粒细胞以1:3-100:1的效靶比加入到所述靶细胞中，进行培养。
在一实施例中，所述培养板包括96孔细胞培养板。
在一实施例中，所述检测试剂包括细胞增殖/毒性检测试剂、噻唑蓝试剂、台盼蓝试剂、乳酸脱氢酶活性检测试剂和细胞凋亡检测试剂。
在一实施例中，所述培养板上还包括与接种所述靶细胞相同面积的若干区域。
附图说明
图1为本发明一实施例的实验流程图；
图2为本发明一实施例中葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药对肺癌细胞A549存活率的影响；
图3为本发明一实施例中葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图4为本发明一实施例中针对第一种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图5为本发明一实施例中针对第一种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图6为本发明一实施例中针对第二种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图7为本发明一实施例中针对第二种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图8为本发明一实施例中针对第三种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图9为本发明一实施例中针对第三种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图10为本发明一实施例中针对第四种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图11为本发明一实施例中针对第四种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图12为本发明一实施例中针对第五种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图13为本发明一实施例中针对第五种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响；
图14为本发明一实施例中针对第六种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对肺癌细胞A549存活率的影响；
图15为本发明一实施例中针对第六种中性粒细胞，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对宫颈癌细胞HeLa存活率的影响。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明在体外做了中草药活性的检测，根据中草药活性来合理利用中草药，针对不同种类的中性粒细胞，使中草药的使用效率达到最大化。
如图1所述，本发明提供一种中草药活性的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：
S1、提供培养板；
S2、在所述培养板上接种靶细胞；
S3、将经过所述中草药作用后的中性粒细胞作用于所述靶细胞；
S4、向所述培养板中添加检测试剂；
S5、检测所述培养板中吸光度的变化；
S6、根据所述吸光度的变化判断所述中草药活性大小。
具体的，在S1中，所述培养板包括96孔细胞培养板。
具体的，在S2中，在所述培养板上接种靶细胞的步骤包括，将靶细胞以100-1000000细胞/孔的密度，接种于所述培养板，在恒温条件下培养4-72小时，所述培养板包括若干组个面积相同的区域，例如，在所述培养板的一个区域接种靶细胞例如癌细胞，在与人体温度相同的恒温条件下培养4-72小时。
具体的，在S3中，将经过所述中草药作用后的中性粒细胞作用于所述靶细胞的步骤包括，将所述中性粒细胞以1:3-100:1的效靶比加入到所述靶细胞中，进行培养。该范围内的效靶比，能更加真实地模拟中性粒细胞在体内作用靶细胞的情况，从而对中草药的活性进行正确的检测分析。
获得所述中性粒细胞的步骤包括，将所述中草药的提取液加入到外周血中，进行体外孵育；提供若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液于离心管中；利用所述若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过离心分离提取获得所述中性粒细胞。
所述中草药的提取液的制备步骤包括，称取所述中草药，加入超纯水；将所述中草药粉碎或破壁30秒–10小时，获得中草药水溶液；吸取所述中草药水溶液进行离心，获得上层液；吸取所述上层液再次进行离心，所得上清液为所述中草药的提取液。制备中草药提取液的方法在常温下操作，能避免中草药中的有效成分经加热而失活，此外，该方法操作简便，本发明利用该方法制备中草药提取液，能够对中草药中的多种活性成分同时进行整体检测分析。
具体的，在S4中，所述检测试剂还包括细胞增殖/毒性检测试剂、噻唑蓝试剂、台盼蓝试剂、乳酸脱氢酶活性检测试剂和细胞凋亡检测试剂，目的是方便后续测量吸光度。向所述培养板中添加检测试剂包括向接种所述靶细胞的区域添加检测试剂和向培养板的其他区域添加检测试剂。
具体的，所述培养板包括若干个面积相同的区域，例如包括接种靶细胞和所述中性粒细胞的区域，标记为A，只接种了靶细胞的区域，标记为B，只接种了中性粒细胞的区域，标记为C，空白区域标记为D。对于A、B、C和D区域的操作条件均相同，例如在A、B、C和D区域同时加培养基，同时洗弃。设置C和D区域的目的是为了使测量结果更准确。A、B、C和D区域包含若干个小组。检测中，设置对照组，可确保检测结果更加准确。
具体的，在S5中，检测所述培养板中吸光度的变化，包括检测A、B、C和D区域的吸光度变化。
在一个实施例中，本发明利用湿法粉碎提取法制备葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液过程如下：称取1-10000g新鲜葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药，加入1-100倍重量超纯水，用细胞破壁机，粉碎破壁30秒–10小时，功率为100-5000W，转速为1000-100000转/分钟，获得葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药水溶液；吸取葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药水溶液，以1000-8000rpm的转速离心1-60分钟，该范围内的转速，可将体积较大的中草药颗粒离心下来；吸取上层液以8000-30000rpm的转速，再次离心1-60分钟，该范围内的转速，可将体积较小的中草药颗粒离心下来，上清为释放入水中的中草药成分；吸取上清液即为葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液。
将所述葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液加入到外周血中，具体为，取外周血例如为0.5-100mL，加入所述葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液，进行吹打混匀操作，将加入葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液的肺癌细胞外周血，在与人体温度相同的环境下，孵育1-24小时。其中，所述葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液的加入量根据中草药的种类及实际操作中的情况确定，，例如，葛根的提取液0.1-1000μL，丹参的提取液0.1-1000μL，黄芪的提取液0.1-1000μL，桔梗的提取液0.1-1000μL；人参的提取液0.1-1000μL；茯苓的提取液0.1-1000μL；山药的提取液0.1-1000μL。本发明外周血用量少、操作简单、重复性好、可批量操作。利用全血共培养的方法，将中草药提取液加入全血中，并与人体温度相同的环境下进行孵育，该方法能更加真实地模拟体内环境，从而对中草药的活性进行检测分析。
从加入葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液的肺癌细胞外周血中提取中性粒细胞，具体为，配制若干组例如2-10组不同密度的淋巴细胞分离液，例如为Percoll淋巴细胞分离液，以配制5组为例，分别为：第一组的密度>第二组的密度>第三组的密度>第四组的密度>第五组的密度，第一组密度为70％-99％的Percoll淋巴细胞分离液，第二组密度为60％-69％的Percoll淋巴细胞分离液，第三组密度为45％-59％的Percoll淋巴细胞分离液，第四组密度为36％-44％的Percoll淋巴细胞分离液，第五组密度为1％-35％的Percoll淋巴细胞分离液；分别吸取第一组、第二组、第三组、第四组、第五组各0.5-10mL，依次加入离心管中，将所述加入葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药的提取液的肺癌细胞外周血用磷酸缓冲盐溶液PBS稀释1-10倍；吸取1-10mL稀释后的血液，加于第五组之上，离心10-120分钟，本次离心，能将Percoll淋巴细胞分离液与中性粒细胞分离，获得中性粒细胞层，吸取所述中性粒细胞层并加入体积为所述中性粒细胞层5-50倍的细胞培养基例如为高糖细胞培养基，离心1-120分钟，去掉离心后的上层溶液，在下层沉淀中加入0.5-50ml细胞培养基例如含体积分数5-20％的胎牛血清的高糖细胞培养基，使中性粒细胞处于悬浮状态，在悬浮状态下，利用自动细胞计数仪计数经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞，计数的目的是根据效靶比计算效应细胞的数目。
将靶细胞例如为癌细胞以100-1000000细胞/孔的密度，接种于培养板中例如96孔细胞培养板，在与人体温度相同的恒温条件下培养4-72小时；吸弃培养癌细胞的细胞培养基，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗1-5次；将获得的中性粒细胞以1:3-100:1的效靶比加入癌细胞中，在与人体温度相同的恒温条件下培养4-72小时。
吸弃96孔细胞培养板中的细胞培养基及中性粒细胞，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗1-5次，可将细胞培养基及悬浮的中性粒细胞洗掉，96孔细胞培养板底只剩下存活的癌细胞；将检测试剂加入到细胞培养基中，例如将细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8试剂以1:5-1:20的比例加入到例如含体积分数5-20％的胎牛血清的高糖细胞培养基中，吹打混匀后，以每孔50-300μL的体积加入96孔细胞培养板中，在与人体温度相同的恒温条件下避光孵育20分钟-24小时；在波长400-480nm处，检测吸光度值，记为A1。
在96孔细胞培养板上的B区域接种相同数量的所述靶细胞，不加入中性粒细胞，吸弃96孔细胞培养板中B区域的细胞培养基，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗1-5次；将检测试剂加入到细胞培养基中，例如将细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8试剂以1:5-1:20的比例，吹打混匀后，以每孔50-300μL的体积加入96孔细胞培养板中，在与人体温度相同的恒温条件下避光孵育20分钟-24小时；在波长400-480nm处，检测吸光度值，记为B1。
在96孔细胞培养板上的C区域不接种所述靶细胞，加入相同数量的中性粒细胞，吸弃96孔细胞培养板中C区域的细胞培养基及中性粒细胞，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗1-5次；将检测试剂加入到细胞培养基中，例如将细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8试剂以1:5-1:20的比例，吹打混匀后，以每孔50-300μL的体积加入96孔细胞培养板中，在与人体温度相同的恒温条件下避光孵育20分钟-24小时；在波长400-480nm处，检测吸光度值，记为C1。
在96孔细胞培养板上的D区域不接种所述靶细胞，也不加入中性粒细胞，吸弃96孔细胞培养板中D区域的细胞培养基，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗1-5次；将检测试剂加入到细胞培养基中，例如将细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8试剂以1:5-1:20的比例，吹打混匀后，以每孔：50-300μL的体积加入96孔细胞培养板中，在与人体温度相同的恒温条件下避光孵育20分钟-24小时；在波长400-480nm处，检测吸光度值，记为D1。
根据公式[(A1–C1)/(B1–D1)]×100％计算经过所述中草药作用后的中性粒细胞的活性即癌细胞存活率，癌细胞存活率也反映出中性粒细胞消灭癌细胞的效率。
根据经过所述中草药作用后的中性粒细胞的活性，判断如何合理利用中草药以使中草药的使用效率达到最大化。
所述中草药包括葛根、丹参、桔梗、人参、灵芝、蘑菇、党参、太子参、西洋参、黄芪、白术、山药、黄精、甘草、淫羊藿、肉苁蓉、冬虫夏草、巴戟天、杜仲、菟丝子、沙苑子、锁阳、仙茅、熟地黄、何首乌、当归、白芍、龙眼肉、枸杞子、女贞子、麦门冬、玉竹、紫苏、防风、柴胡、牛蒡子、升麻、知母、天花粉、决明子、生地黄、牡丹皮、黄芩、黄连、龙胆草、金银花、连翘、大青叶、鱼腥草、牛黄、青蒿、川穹、益母草、桃仁、红花、牛膝、鸡血藤、三七、茜草、蒲黄、天麻、酸枣仁、大黄、芦荟、茯苓、猪苓和薏苡仁。以上所列，为常用的中草药。筛查的中草药越多，越有利于筛选出最适用的中草药，最终达到使中草药的使用效率达到最大化。但以上仅为举例，本发明能检测所有中草药的活性。
所述靶细胞包括癌细胞，所述癌细胞例如为肺癌细胞A549或宫颈癌细胞HeLa。所述癌细胞还包括肝癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、胰腺癌细胞、骨癌细胞、黑色素瘤细胞和白血病细胞。用不同种类的癌细胞作为靶细胞，可以判断针对不同种类的癌症靶细胞时，中草药对中性粒细胞活性的影响，有助于对中草药活性的详细检测分析，能为后续针对不同情况合理使用中草药提供参考。下面以肺癌细胞A549或宫颈癌细胞HeLa为例进行说明。
如图2-图3所示为葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药对靶细胞例如肺癌细胞A549和宫颈癌细胞HeLa存活率的影响，图中对照组只有癌细胞，不加入葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药。实验结果显示，7种中草药的提取液对靶细胞例如肺癌细胞A549及宫颈癌细胞HeLa存活率的影响不同。该实验，有助于在考察中性粒细胞活性时，排除中草药自身对癌细胞存活率的影响。
本发明对6种中性粒细胞进行了考察，这6种中性粒细胞来源于6个不同的受试者，本发明的检测方法同样适用于更多来源的中性粒细胞。如图4-15所示，考察经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞对两种癌细胞的存活率例如肺癌细胞A549和宫颈癌细胞HeLa。图中对照组为未经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞A549或宫颈癌细胞HeLa的实验，对照组的实验操作流程与经过葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药作用后的中性粒细胞作用于肺癌细胞A549或宫颈癌细胞HeLa的实验操作流程相同。癌细胞存活率也反映出中性粒细胞活性的变化，图中粒细胞指中性粒细胞，A549+粒细胞表示中性粒细胞作用于肺癌细胞A549，小时ela+粒细胞表示中性粒细胞作用于宫颈癌细胞Hela。结果显示，不同中草药对同一来源的中性粒细胞活性的影响不同；相同中草药对不同来源的中性粒细胞活性的影响也不同；针对不同种类的癌细胞，提升中性粒细胞活性的中草药也不同。图中的标号星号*代表统计学上的显著性差异，一个星号*代表差异P<0.05；两个星号**代表差异P<0.01；三个星号***代表差异P<0.001，星号*个数越多，证明差异越显著。
从图4-图5得出，第一种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药，第一种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，7种中草药中，没有中草药有显著的活性。
从图6-图7得出，第二种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，葛根、丹参、桔梗、茯苓的活性显著，其中，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药；第二种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，黄芪、桔梗、茯苓的活性显著，其中茯苓是7种中草药中活性最强中草药。
从图8-图9得出，第三种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，葛根、丹参、黄芪、桔梗的活性显著，其中，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药；第三种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，黄芪是7种中草药中活性最强的中草药。
从图10-图11得出，第四种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，葛根、丹参、黄芪、桔梗、茯苓的活性显著，其中，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药；第四种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，葛根、黄芪、桔梗的活性显著，其中，桔梗7种中草药中是活性最强的中草药。
从图12-图13得出，第五种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，葛根、桔梗的活性显著，其中，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药；第五种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，黄芪、桔梗、茯苓的活性显著，其中，桔梗是7种中草药中活性最强的中草药。
从图14-图15得出，第六种中性粒细胞作用于靶细胞例如肺癌细胞时，7种中草药中，没有中草药的活性显著，第六种中性粒细胞作用于靶细胞例如宫颈癌细胞HeLa时，茯苓7种中草药中是活性最强的中草药。
根据图2-图15的结果，针对葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓或山药对不同中性粒细胞的活性影响，根据中草药活性来合理利用中草药。
葛根、丹参、黄芪、桔梗、人参、茯苓和山药是较为常见的七种中草药，其他种类的中草药同样适用于本发明。本发明利用全血体外共培养的方法，可详细检测不同中草药的提取液对中性粒细胞的活性的影响，进而判断出哪些中草药可显著提升中性粒细胞的活性、哪些中草药对中性粒细胞的活性影响甚微，最终根据中草药活性来合理利用中草药。
在本发明中，中性粒细胞只是一个例子，还可以利用本发明的方法检测其他种类的免疫细胞，从而对中草药活性进行检测，如：T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞等。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种中草药活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法至少包括如下步骤：提供培养板；
在所述培养板上接种靶细胞；
将经过所述中草药作用后的中性粒细胞作用于所述靶细胞；
向所述培养板中添加检测试剂；
检测所述培养板中吸光度的变化；
根据所述吸光度的变化判断所述中草药活性大小；
其中，所述中草药包括人参、灵芝、蘑菇、党参、太子参、西洋参、黄芪、白术、山药、黄精、甘草、淫羊藿、肉苁蓉、冬虫夏草、巴戟天、杜仲、菟丝子、沙苑子、锁阳、仙茅、熟地黄、何首乌、当归、白芍、龙眼肉、枸杞子、女贞子、麦门冬、玉竹、紫苏、防风、柴胡、牛蒡子、升麻、知母、天花粉、决明子、生地黄、牡丹皮、黄芩、黄连、龙胆草、金银花、连翘、大青叶、鱼腥草、牛黄、青蒿、川穹、益母草、桃仁、红花、牛膝、鸡血藤、三七、茜草、蒲黄、天麻、酸枣仁、大黄、芦荟、茯苓、猪苓和薏苡仁；
其中，所述靶细胞为癌细胞；
其中，获得所述中性粒细胞的步骤包括，
将所述中草药的提取液加入到外周血中，进行体外孵育；
提供2-10组浓度梯度的淋巴细胞分离液于离心管中；
利用2-10组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过分离提取获得所述中性粒细胞；
其中，将中性粒细胞作用于所述靶细胞的步骤包括，将所述中性粒细胞以1:3-100:1的效靶比加入到所述靶细胞中，进行培养；
其中，所述培养板上包括接种靶细胞和所述中性粒细胞的区域，标记为A，只接种了靶细胞的区域，标记为B，只接种了中性粒细胞的区域，标记为C，空白区域标记为D。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述靶细胞的密度为100-1000000细胞/孔。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中草药的提取液的制备步骤包括，
称取所述中草药，加入超纯水；
将所述中草药粉碎或破壁30秒–10小时，获得中草药水溶液；
吸取所述中草药水溶液进行离心，获得上层液；
吸取所述上层液再次进行离心，所得上清液为所述中草药的提取液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养板为96孔细胞培养板。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测试剂包括细胞增殖/毒性检测试剂、噻唑蓝试剂、台盼蓝试剂、乳酸脱氢酶活性检测试剂和细胞凋亡检测试剂。
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