CN102203110A

CN102203110A - 海藻糖化合物、其制造方法以及含有该化合物的药品

Info

Publication number: CN102203110A
Application number: CN2009801436265A
Authority: CN
Inventors: 西沢麦夫; 今川洋; 山本博文; 樱井纯; 小田真隆
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Current assignee: Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2011-09-28
Also published as: US20110218171A1; US8741871B2; JPWO2010050178A1; KR20110082584A; EP2351764A4; TW201016221A; US20140248317A1; WO2010050178A1; JP5552056B2; EP2351764A1; EP2351764A8; EP2567963A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种免疫赋活活性高且毒性低的海藻糖化合物。本发明所述的海藻糖化合物由下式(1)表示[式中，X及X’表示苯基、萘基或R₁-CHR₂-等，R₁及R₂表示各种C₇-C₂₁烷基等，n及n’表示各自独立的0至3的整数]。本发明化合物对巨噬细胞及中性粒细胞显示出很高的活化作用。[化1]

Description

海藻糖化合物、其制造方法以及含有该化合物的药品

技术领域

本发明涉及一种海藻糖化合物、其制造方法以及含有该化合物的药品。

背景技术

作为感染性疾病，公知有由细菌、病毒或真菌引起的感染性疾病等各种病症。作为对由细菌引起的感染性疾病的治疗方法，虽然可施用抗生素，然而可耐受抗生素的病菌的出现已成为问题；此外，还产生耐药菌院内感染的问题。进一步，抗生素的施用还已产生机会性感染(opportunistic infection)的问题，此类感染普遍出现在HIV感染者、或以抗癌剂治疗的患者、老人、小孩等免疫力低下的患者中。

进一步地，在受到O-157等病原性大肠杆菌或痢疾志贺菌感染时，体内会产生Vero毒素(verotoxin)，尤其是抵抗力差的老人或小孩，有时还会呈现并发溶血性尿毒症综合征等严重症状。对于此类感染性疾病，有时也可施用抗生素，但有人指出，由于施用抗生素后细菌被杀死，细菌内部的毒素会立刻排放至细菌外部，反而会有情况恶化的危险性。然而，另一方面，如O-157这样，仅摄入数百至数千个细菌即可发病的传染性强的感染性疾病的情况下，为了预防二次感染，也有不得不选择施用抗生素的状况。作为其他治疗方法，一般认为约10％的O-157病例中会并发溶血性尿毒症综合征，此时虽然可以进行血浆交换或透析疗法等，但不论哪种都可以说是对患者负担很大的治疗方法。

此外，作为对细菌产生的毒素的处理方法，优选为对症疗法，作为其他方法，虽可列举毒素吸附剂的使用或抵抗毒素的抗体的使用等，但以活性炭等吸附的方法也会引起便秘等副作用，另外对于抗体的使用，从必须开发抵抗各种毒素的抗体的方面来说也是不便利的。

因此，正在摸索对由此类病原菌引起的感染性疾病的治疗或抑制其发病的方法，最近，在尝试不施用抗生素，而通过提高患者自身免疫力的方法来治疗或预防感染性疾病。

已对各种化合物进行了研究以找出提高患者免疫力的物质。作为来自天然物质的成份的一例，已知有海藻糖的二酯化合物，即海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate，TDM)与海藻糖二杆菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate，TDCM)。TDM被发现作为存在于结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细胞表层的糖脂质，已知其显示出免疫赋活活性及抗癌活性。另外，作为碳数少于TDM的同系物，TDCM已经自同族的棒状杆菌(Corynebacterium spp)中分离出，并且已明确TDCM及其立体异构体均显示出免疫赋活活性及抗癌活性。

然而，TDM及TDCM的毒性很强而无法作为药品使用。因此，为了作为药品使用，有必要合成维持或增强活性且使其毒性降低的化合物。

因此，作为TDM的衍生物，已经合成出海藻糖与脂肪酸的酯类，即海藻糖6，6’-二酯化合物，并完成了其毒性试验、巨噬细胞活化作用等试验(参照非专利文献1)。在该文献中，已就β-羟基的有无、其脂质的烷基部分的长度为碳数30、32、48的化合物、和将糖与脂质之间的酯键替换成酰胺键的化合物等进行研究。在毒性方面，已考证出酯键和长链脂肪酸对毒性有重要影响。然而在该文献中，虽然记载了侧链脂肪酸部分的碳数为30的化合物等，但并未为了获得活性高且毒性低的化合物，对糖与侧链的结合形式、侧链脂肪酸的取代基的有无、或构成侧链脂肪酸烷基的长度等进行全面性的研究和优化，而是仅对上述数个化合物偶发地进行试验。此外，对免疫赋活作用的内容也未进行详细研究。

另一方面，关于TDM衍生物，本发明的发明人等已合成出具有酯键或酰胺键，且将β位羟基换成氢原子或甲氧基的衍生物等(参照专利文献1)。然而，该文献所记载的衍生物，其脂肪酸的烷基部分为具有约7个碳原子的比较短的烷基，而且其活性也仅测定了作为A3腺苷受体拮抗剂(adenosine A3receptor antagonist)的活性。

因此，本发明的发明人等成功地合成了将TDCM的羟基换成氢原子，且在消去手性碳(asymmetric carbon)的同时，将酯键换成酰胺键的TDCM酰胺衍生物，并且已确认这些酰胺衍生物的免疫赋活作用(参照专利文献2)。然而，后来确定这些酰胺衍生物具有诱发癌症的作用，不得不放弃将其作为药品化合物来使用的意图。

因此，对于由病原菌引起的各种症状，至今仍未确立非常有效且安全性高的使用TDM或TDCM的衍生物来治疗或抑制发病的方法，因而期望确立有效且安全的治疗或抑制发病的方法。

[专利文献1]WO2007/111214

[专利文献2]WO2008/093700

[非专利文献1]Numata等，Chem.Pharm.Bull.(1985)，33(10)，4544-4555

发明内容

[发明要解决的问题]

在合成TDM、TDCM的衍生物时，由于TDM、TDCM其本身毒性很强，因而有必要合成具有活性且毒性低的化合物。现有技术中虽然已知有数个TDM或TDCM的变型，但TDM及TDCM是糖脂质，并且糖链中羟基多、极性也高，在合成时有时会有困难，因而至今仍无法确定何种构造与何种活性相关联的构造活性相关性。

因此，本发明的目的在于制造多个TDM及TDCM的衍生物，并提供活性高且毒性低的化合物及含有该化合物的药品。

此外，作为现有技术，使用抵抗病原菌的抗生素的目的是阻碍大肠杆菌的生长、杀灭大肠杆菌以不使大肠杆菌排放毒素，对产生的毒素本身并无法达到无毒化。而本发明的目的在于提供一种即使在细菌增殖而产生毒素的情况下，也可以降低毒素毒性的药品。

[解决问题所采用的手段]

本发明的发明人等发现，式(1)表示的海藻糖二酯化合物对病原菌引起的感染性疾病显示出优异的抗菌活性，并且毒性很低。此外，发现在式(1)表示的海藻糖二酯化合物中，X为R₁-CHR₂-、X’为R₁’-CHR₂’-的化合物，并且作为脂质部分的支链形式，特别是n及n’均为0的化合物(以下称为α-支链型化合物)，以及特别是n及n’均为1的化合物(以下称为β-支链型化合物)是特别优异的化合物。进一步地，发现式(1)表示的海藻糖二酯化合物中，在式(1)中R₁、R₂、R₁’或R₂’表示的烷基链部分，在碳数为10及14等特定的长度时，活性有呈现极大化的趋势。进一步地，在上述文献等中，此前一直未提及海藻糖二酯化合物即使是在给予由病菌产生的毒素本身的情况下也可作为抗菌剂使用，然而本发明的发明人等发现，在小鼠体内(in vivo)试验中，本发明的海藻糖二酯化合物不仅在施用病菌时，而且在施用由病菌产生的毒素本身时也有效。

本发明提供一种以下式(1)表示的化合物：

[化1]

[式中，X为苯基、萘基或以R₁-CHR₂-表示的基团，X’为苯基、萘基或以R₁’-CHR₂’-表示的基团，

此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或C₁-C₂₁烷基，就R₁、R₁’、R₂、R₂’而言，各烷基中的氢原子可以羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分也可形成4-8元环，此外，R₁及R₂、R₁’及R₂’可分别互相连接而形成4-8元环，且n及n’各自独立地是0至3的整数。

但排除以下化合物：

(1)X为R₁-CHR₂-，X’为R₁’-CHR₂’-，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或不具有取代基且直链的C₁-C₆烷基，且n及n’为0的化合物；以及

(2)X为R₁-CHR₂-，X’为R₁’-CHR₂’-，R₁、R₁’、R₂及R₂’为C₁₄直链烷基，且n及n’为0的化合物]。

本发明还提供一种含有式(1)表示的化合物及药理学上可容许的载体的药物组合物。

本发明还提供一种含有式(1)表示的化合物及药理学上可容许的载体的药物组合物，其中，该药物组合物用作免疫赋活剂、巨噬细胞活化剂、中性粒细胞活化剂、用于活化吞噬细胞的吞噬作用的试剂、抗细菌感染剂或细菌毒素中和剂。

本发明还提供一种式(1)表示的化合物的用途，该化合物用于制造以下药物组合物，该药物组合物用作免疫赋活剂、巨噬细胞活化剂、中性粒细胞活化剂、用于活化吞噬细胞的吞噬作用的试剂、抗细菌感染剂或细菌毒素中和剂。

本发明还提供一种用于预防或治疗哺乳动物的感染性疾病的方法，所述哺乳动物包括人，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的以式(1)表示的化合物。

本发明还提供一种细菌毒素中和剂，其特征在于，所述中和剂含有以下式(2)表示的化合物：

[化2]

此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或C₁-C₂₁烷基，就R₁、R₁’、R₂、R₂’而言，各烷基中的氢原子可以羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分也可形成4-8元环，此外，R₁及R₂、R₁’及R₂’可分别互相连接而形成4-8元环，且n及n’各自独立地是0至3的整数]。

[发明的效果]

本发明的海藻糖化合物由于免疫赋活活性高且毒性低，可用于提供对由病原菌引起的感染性疾病具有优异效果的药品。

本发明的海藻糖化合物具有活化细胞免疫的作用，并通过活化中性粒细胞或巨噬细胞，提高其吞噬作用而发挥抗菌作用。即，根据本发明的化合物，可提供一种药品，由于细菌本身被摄入中性粒细胞或巨噬细胞内，因此向细菌外部排放的毒素较少，产生例如由施用抗生素时大肠杆菌被破坏而引起的毒素排放的危险性较少。

此外，本发明的海藻糖化合物对毒素本身也显示出降低毒性的作用。因此，根据本发明，可提供一种药品，其在由大肠杆菌等引起的感染性疾病中，即使在随着感染程度增加、大肠杆菌等增殖而向菌外产生毒素的情况下也有效。

此外，通过施用本发明的海藻糖化合物引起的中性粒细胞或巨噬细胞的活化，中性粒细胞或巨噬细胞可以像吞噬非耐药菌那样，也同样吞噬由于施用抗生素而产生的多重耐药菌。因此，本发明可提供对由多重耐药菌引起的感染性疾病也有治疗效果的药品。

此外，本发明的海藻糖化合物可以活化细胞免疫，但很难产生过度免疫应答。因此，根据本发明，可提供一种药品，其难以导致过度免疫应答而不会使生物体内可能产生抵抗药品抗体的抗体。

此外，在本发明的海藻糖化合物中，包括不含手性碳原子的化合物。即，根据本发明的海藻糖化合物的制造方法，无需不对称合成(asymmetric synthesis)，即可大量且有效率地合成与本发明相关的海藻糖化合物。

附图说明

图1表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔巨噬细胞时该小鼠腹腔巨噬细胞的活性氧释放量；

图2表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔巨噬细胞时该小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力；

图3表示使TDCM或本发明的试验化合物作用于兔子中性粒细胞时该兔子中性粒细胞的活性氧释放量；

图4表示使TDCM或本发明的试验化合物作用于兔子中性粒细胞时该兔子中性粒细胞的吞噬能力；

图5表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于人源THP-1细胞时该人源THP-1细胞的IL-8释放量；

图6表示对小鼠施用TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物时小鼠血浆中的IL-6浓度；

图7表示对小鼠施用TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物时小鼠血浆中的IFN-γ浓度；

图8表示对小鼠施用TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物时小鼠血浆中的TNF-α浓度；

图9表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于人源细胞时该细胞的MIP-1β及TNF-α释放量。数值以平均值±标准偏差(n＝5)表示。*表示与对照相比P＜0.01的情形；

图10表示TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物在人源THP-1细胞中的细胞毒性。白色长条、黑色长条分别表示用试验化合物处理2小时及24小时情况下的结果。数值以平均值±标准偏差(n＝5)表示。*表示与对照相比P＜0.01的情形；

图11表示TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物根据AMES试验得到的致突变性测定结果；

图12表示在使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔内浸润细胞的情况下获得的细胞数及显微镜影像。数值以平均值±标准偏差(n＝5)表示。*表示与对照相比P＜0.01的情形；

图13表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔内浸润细胞而获得的吉姆萨(Giemsa)染色的结果；

图14表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔内浸润细胞后，该小鼠腹腔内浸润细胞内的通过荧光显微镜得到的CD-8阳性细胞影像；

图15表示使TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物作用于小鼠腹腔内浸润细胞后，该小鼠腹腔内浸润细胞内的通过流式细胞术得到的CD-8阳性细胞的测定结果；

图16表示对施用过TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物的小鼠施用产气荚膜梭菌时，上述化合物对小鼠生存数的影响。*表示与对照相比P＜0.01的情形。该试验进行8次，所显示的为标准结果；

图17表示对施用过TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物的小鼠施用绿脓杆菌时，上述化合物对小鼠生存数的影响。*表示与对照相比P＜0.01的情形。该试验进行8次，所显示的为标准结果；

图18表示在对小鼠施用绿脓杆菌后，施用TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物时，上述化合物对小鼠生存数的影响。*表示与对照相比P＜0.01的情形。该试验进行8次，所显示的为标准结果；

图19表示对施用赋形剂或本发明的试验化合物的小鼠施用绿脓杆菌时小鼠血中的绿脓杆菌数；

图20表示在接种乳腺癌细胞的小鼠中TDCM、赋形剂或本发明的试验化合物对癌转移的影响。

具体实施方式

[用于实施发明的方式]

以下对本发明的优选实施方式进行说明。需要说明的是，以式(1)表示的化合物也可以其药理学上容许的盐或溶剂化物的形式存在。

在本说明书中，“C₁-C₂₁烷基”除了指碳数为1至21的直链状或支链状的脂肪烃基之外，还包括脂肪烃基的全部或一部分形成4-8元环的脂环式烃基。在一个优选实施方式中，本发明的式(1)表示的化合物的“C₁-C₂₁烷基”是直链状的脂肪烃基。作为直链状的脂肪烃基的“C₁-C₂₁烷基”的实例，可列举甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基及正二十一烷基等。作为脂肪烃基全部形成环的脂环式烃基的实例，可列举环丁基、环戊基、环己基、环庚基及环辛基等，而作为脂肪烃基一部分形成环的脂环式烃基的实例，可列举环己基-正辛基、环己基-正壬基及环庚基-正辛基等。R₁、R₁’、R₂或R₂’优选为直链状烷基，更优选为碳数为10至16的直链状烷基，特别优选为n为0时，碳数为10的直链状烷基正癸基，n为1时，碳数为9的直链状烷基正壬基、碳数为13的直链状烷基正十三烷基或碳数为14的直链状烷基正十四烷基，最优选为正癸基。

对于R₁、R₁’、R₂及R₂’，各烷基中的氢原子可用羟基和烷氧基来取代。此处，烷氧基是指具有碳数为1至21的直链状或支链状脂肪烃与氧原子结合的构造的取代基，可列举例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基及庚氧基等。优选为直链烷氧基，作为取代有烷氧基的烷基，可列举例如，甲氧基十二烷基、乙氧基十一烷基、丙氧基癸基、戊氧基壬基、己氧基辛基、己氧基庚基、戊氧基辛基等。在各烷基中氢原子由羟基或烷氧基取代时，取代位置可为烷基中的任一个位置，但优选为与烷基末端碳原子键合的氢原子由羟基或烷氧基来取代的化合物。当烷氧基键合于烷基末端的碳原子时，烃基成为经由氧原子键合的直链醚状构造，介于其中的氧原子与构成烃基的碳原子的数目总和，与烃基的烷基的上述长度相同，优选的是构成烷氧基烷基的碳及氧原子的数目为2至21，更优选为n为0时，构成烷氧基烷基的碳及氧原子的数目为10至16，n为1时，构成烷氧基烷基的碳及氧原子的数目为9至15。

R₁及R₂、R₁’及R₂’可各自互相连接以形成4-8元环，X为R₁-CHR₂-时，R₁及R₂键合的碳原子与R₁及R₂，均成为该4-8元环的组成原子。此外，由于构成R₁及R₂的烷基可为支链状烷基，此时支链状烷基的一部分可以构成4-8元环，也可形成具有烷基取代基的环烷基的构造。而且，即使形成环时，也包含具有与上述相同的取代基作为取代基的情况。上述情况不仅是对X适用，对X’也同样适用。作为4-8元环的实例，可列举环丁基、环戊基、环己基、环庚基及环辛基等。从化合物构造上的稳定性观点来说，优选为环己基或环庚基。

R₁和R₁’、R₂和R₂’可相同也可不同，从合成效率的观点来说，优选为R₁和R₁’相同，且R₂和R₂’相同。

此外，就R₁与R₂之间的关系而言，R₁与R₂可相同也可不同，作为一个优选实施方式，优选R₁的碳数与R₂的碳数相同、R₁的碳数比R₂的碳数多1个或2个或是比R₂的碳数少1个或2个的化合物。例如，可列举R₁为碳数14，且R₂为碳数16的化合物等。此外，除上述以外，还优选为R₁为碳数1～5的短链烷基且R₂为碳数10～16的长链烷基的化合物，或是相反，R₁为碳数10～16的长链烷基且R₂为碳数1～5的短链烷基的化合物。需要说明的是，R₁’与R₂’之间的关系也与上述R₁与R₂之间的关系相同，在上述R₁与R₂的关系中，可以将R₁看成R₁’，R₂看成R₂’。

n与n’可相同也可不同，从合成效率的观点来说，优选n与n’相同。此外，从活性的观点来说，优选为n或n’为0的化合物，及n或n’为1的化合物。

此外，海藻糖存在有α，α’体、α，β’体与β，β’体三种异构体。作为本发明的海藻糖化合物，优选为α，α’体。

式(1)化合物及其盐类可作为溶剂化物而存在，其也处于本发明的范围内。此外，在本发明范围内，还包含式(1)化合物的放射性标记化合物，这些化合物可用于生物学研究。

本发明的优选化合物为上述式(1)表示的化合物，式中的各取代基具有以下特征。以下特征只要在不互相矛盾的范围内，可各自独立地选择单独一个或彼此组合。

(A)X为以R₁-CHR₂-表示的基团。

(B)X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团。

(C)R₁及R₁’各自独立地是不具有取代基的C₁-C₂₁烷基。

(D)R₂及R₂’各自独立地是氢原子或不具有取代基的C₁-C₂₁烷基。

(E)R₁及R₁’各自独立地是直链C₁-C₂₁烷基。

(F)R₂及R₂’各自独立地是氢原子或直链C₁-C₂₁烷基。

(G)R₁及R₁’各自独立地是不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基。

(H)R₂及R₂’各自独立地是氢原子或不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基。

(I)R₁及R₁’各自独立地是不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基。

(J)R₂及R₂’各自独立地是不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基。

(K)R₁与R₁’相同，并且为不具有取代基的C₁-C₂₁烷基。

(L)R₂与R₂’相同，并且为氢原子或不具有取代基的C₁-C₂₁烷基。

(M)R₁与R₁’相同，并且为直链C₁-C₂₁烷基。

(N)R₂与R₂’相同，并且为氢原子或直链C₁-C₂₁烷基。

(O)R₁与R₁’相同，并且为不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基。

(P)R₂与R₂’相同，并且为氢原子或不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基。

(Q)R₁与R₁’相同，并且为不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基。

(R)R₂与R₂’相同，并且为不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基。

(S)n及n’各自独立地是0或1。

(T)n及n’均为0。

(U)n及n’均为1。

本发明优选的化合物为具有以下构造的上述式(1)表示的化合物，或是其药理学上可容许的盐类或溶剂化物：

(V)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团，此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或C₁-C₂₁烷基，关于R₁、R₁’、R₂、R₂’，各烷基中的氢原子可由羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分也可形成4-8元环，此外，R₁及R₂、R₁’及R₂’也可互相独立连接以形成4-8元环；n及n’各自独立地是0至3的整数。

(W)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团，此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₇-C₂₁烷基，关于R₁、R₁’、R₂、R₂’，各烷基中的氢原子可由羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分可形成4-8元环；n及n’各自独立地是0或1。

(X)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团，此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₈-C₁₆烷基，关于R₁、R₁’、R₂、R₂’，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代，各烷基的全部或一部分可形成4-8元环；n及n’为0。

(Y)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团，此处，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₈-C₁₄烷基，关于R₁、R₁’R₂、R₂’，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代，各烷基的全部或一部分可形成4-8元环；n及n’为1。

(Z)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；此处，R₁与R₁’相同，为氢原子或C₁-C₂₁烷基，关于R₁、R₁’，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代，各烷基的全部或一部分可形成4-8元环；R₂与R₂’相同，为氢原子或C₁-C₂₁烷基，关于R₂、R₂’，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代，各烷基的全部或一部分可形成4-8元环；此外，R₁及R₂、R₁’及R₂’可各自互相连接而形成4-8元环；n与n’相同，为0至3的整数。

(AA)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为C₁-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；R₂与R₂’相同，为C₇-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；n与n’相同，为0或1。

(BB)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为C₇-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；R₂与R₂’相同，为氢原子或C₁-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；n与n’相同，为0或1。

(CC)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为直链C₇-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；R₂与R₂’相同，为直链C₇-C₂₁烷基，各烷基中的氢原子可由羟基和烷氧基取代；n与n’相同，为0或1。

(DD)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基；R₂与R₂’相同，为氢原子或不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基；n与n’相同，为0或1。

(EE)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基；R₂与R₂’相同，为氢原子或不具有取代基且直链的C₁-C₂₁烷基；n与n’相同，为0或1。

(FF)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基；R₂与R₂’相同，为不具有取代基且直链的C₇-C₂₁烷基；n与n’相同，为0或1。

(GG)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₈-C₁₆烷基；R₂与R₂’相同，为不具有取代基且直链的C₈-C₁₆烷基；n与n’相同，为0或1。

(HH)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₈-C₁₆烷基；R₂与R₂’相同，为不具有取代基且直链的C₈-C₁₆烷基；n与n’为0。

(II)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁与R₁’相同，为不具有取代基且直链的C₉-C₁₄烷基；R₂与R₂’相同，为不具有取代基且直链的C₉-C₁₄烷基；n与n’为1。

(JJ)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁、R₁’、R₂与R₂’彼此相同，为不具有取代基且直链的C₁₀烷基；n与n’为0。

(KK)X为以R₁-CHR₂-表示的基团；X’为以R₁’-CHR₂’-表示的基团；R₁、R₁’、R₂与R₂’彼此相同，为不具有取代基且直链的C₉、C₁₃或C₁₄烷基；n与n’为1。

作为本发明海藻糖化合物的具体实例，可列举下述化合物：

6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(苯甲酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-萘基羰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(环己烷羰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(环庚烷羰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十四烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(14-甲氧基-2-(12-甲氧基十二烷基)-十四酰基)-α，α’-海藻糖，或

6，6’-双-O-(15-羟基-2-(13-羟基十三烷基)-十五酰基)-α，α’-海藻糖。

作为本发明海藻糖化合物的优选化合物，可列举以下化合物：

6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖，或

6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖。

此外，作为本发明海藻糖化合物的优选化合物，可列举以下化合物：

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖，或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

此外，作为本发明海藻糖化合物的更优选的化合物，可列举以下化合物：

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖，或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

此外，作为本发明优选的细菌毒素中和剂，可列举特征在于包含如下所述的任意一种化合物的细菌毒素中和剂：

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(2-十四烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖，

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖，或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

本发明的药物组合物及免疫赋活剂等的特征在于，含有上述海藻糖化合物。

本发明的海藻糖化合物可用作对巨噬细胞及中性粒细胞具有高活化作用的免疫赋活剂。因此，对于细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、真菌感染性疾病等感染性疾病，机会性感染性疾病及多重耐药菌感染性疾病、与由免疫引起的生物体防御反应相关的疾病，本发明的海藻糖化合物作为预防剂或治疗剂是有效的。

<制造方法>

本发明的式(1)表示的化合物，可通过下述(a)及(B)表示的二个步骤来合成。

步骤(a)：将式(4)及式(6)表示的羰基化合物同时或依次与式(3)表示的海藻糖化合物反应，以进行酯化反应。

步骤(b)：脱去上述步骤(a)得到的式(5)表示的海藻糖化合物的羟基的保护基。

在步骤(a)中，“使式(4)及式(6)所表示的羰基化合物同时或依次与......反应”是指，如下述合成简图1所示，可使式(4)及式(6)所表示的羰基化合物依次与海藻糖化合物反应，或者是如下述合成简图2所示，也可使式(4)及式(6)所表示的羰基化合物同时与海藻糖化合物反应；进一步地，当式(4)及式(6)所表示的羰基化合物相同时，将其作为式(4)所表示的羰基化合物，如下述合成简图3所示，可使其于同时(即在单步反应中)与海藻糖化合物反应。需要说明的是，式(2)所表示的化合物也可与式(1)所表示的化合物以相同的方式来合成。

本发明式(1)表示的化合物可通过下述合成简图1表示的方法来制造。

<合成简图1>

上述合成简图中、R₁、R₁’、R₂、R₂’、n及n’与上述相同。R₃及R₃’表示糖的羟基的保护基。Y及Y’各自独立地表示羟基或卤素原子。需要说明的是，在上述简图中，式(3)所表示的海藻糖化合物为α，α’体，但也可以相同方法合成α，β’体和β，β’体。只是在本发明中优选为α，α’体。

此处，作为R₃及R₃’，可使用公知的基团作为羟基的保护基。例如，可举出在“Protecting groups in organic chemistry”(John Wiley&Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)中所记载的羟基的保护基。具体而言，可列举苯甲基、对甲氧基苯甲基及二苯基甲基等芳烷基；乙酰基等酰基；甲氧基羰基和叔丁氧基羰基等烷氧基羰基；三甲基硅烷基(trimethyl silyl)等三烷基硅烷基(trialkyl silyl)等。优选为苯甲基。R₃与R₃’可相同也可不同，优选为相同。

此外，Y及Y’各自独立地是羟基或卤素原子，作为卤素原子，可举出氟原子、氯原子及碘原子等。Y及Y’优选为羟基。

<步骤(a)：酯化反应>

该步骤是将式(4)及式(6)所表示的羰基化合物与式(3)所表示的海藻糖化合物依次反应，以进行海藻糖化合物与羰基化合物的酯化反应。

式(3)所表示的海藻糖化合物是海藻糖的除6位及6’位以外的羟基用保护基保护的化合物，其可使用市售品，或可使用由海藻糖等采用公知的方法合成的化合物。例如，保护基为苯甲基的“2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲氧基-α，α’-海藻糖”有市售品，可优选使用其市售品。此外，由于海藻糖的α，α’体为天然存在，因此可容易地获得。由于海藻糖中6位及6’位的羟基与其他羟基的反应性不同，因此对于天然的海藻糖，可采用公知方法，并通过导入羟基的保护基，可较容易地合成除6位及6’位以外的羟基被保护的式(3)所表示的海藻糖化合物。

式(4)及式(6)所表示的羰基化合物，可使用市售品，或使用通过下述合成简图4、5或6合成的化合物，还有通过公知方法合成的化合物。

在将式(4)所表示的羰基化合物与式(3)所表示的海藻糖化合物反应的步骤中，式(3)表示的海藻糖化合物的6位及6’位的羟基均有可能被酯化。6位及6’位的羟基均被酯化的化合物称为“二酯体(diester)”，而仅有一方被酯化的中间化合物则称为“单酯体(monoester)”。相对于式(3)所表示的海藻糖化合物，使用式(4)所表示的羰基化合物1当量左右时，由于空间位阻而使单酯体大量生成。为了提高期望的化合物的反应产率，优选在反应后分离和精制所期望的6位羟基被酯化的单酯体。或者是，为了提高反应产率，作为原料的式(3)表示的海藻糖化合物的6位及6’位的羟基中，也可事先将不希望与式(4)所表示的羰基化合物酯化的一方的羟基有选择地保护，在另一方的羟基进行酯化反应后，再有选择地脱保护。作为将羟基酯化的顺序，除了可先将6位羟基酯化之外，也可先将6’位羟基酯化。

该酯化反应可广泛使用一般酯化反应所常用的方法及本领域技术人员公知的方法等。

对于式(4)或式(6)所表示的羰基化合物，当Y或Y’为羟基时，可广泛应用羧酸与醇类的公知酯化反应。例如，可列举脱水法(含碳二亚胺法)、混合酸酐法、活性酯化法等。所述方法优选为在惰性溶剂中使用缩合剂来进行。

作为用于所述方法的缩合剂，也包括脱水剂，或可广泛使用醇类与羧酸的酯化反应中常用的缩合剂。作为缩合剂的实例，可列举氯化氢、硫酸、盐酸等无机酸；对甲苯磺酸、樟脑磺酸等有机酸；氟化硼二乙醚等路易斯酸等脱水剂；三氯化磷、三溴化磷、五氯化磷、三氯氧化磷、亚硫酰二氯等卤氧化物生成剂；氯甲酸乙酯、甲烷磺酰氯等混合酸酐生成剂；N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺等碳二亚胺；或其他缩合剂，例如可列举N，N-羰基二咪唑、2-乙氧基-N-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、三苯基膦-四氯化碳(络合物)等。所述缩合剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。原料化合物与缩合剂的使用比例也无特殊限定，可从广泛的范围中适当选择。

该酯化反应可在适当的溶剂中进行。作为溶剂，只要是对原料化合物具有适度的溶解性，对酯化反应不会产生不良影响的惰性溶剂即可，可广泛使用公知的溶剂。作为用于上述酯化反应的溶剂的实例，可列举苯、甲苯、二甲苯等芳香烃；氯苯、二氯苯等卤化芳香烃；正己烷、环己烷、石油醚等脂肪烃；二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化脂肪烃；乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚等醚类；丙酮、2-丁酮、甲基异丁基酮等酮类；乙腈、丙腈、苯甲腈等腈类；N，N-二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺(HMPA)等酰胺类；二甲基亚砜等亚砜等。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述酯化反应中，可广泛使用公知的反应促进剂。作为反应促进剂的实例，可列举二甲基甲酰胺、二甲氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶(4-pyrrolidinopyridine)等催化剂；无水硫酸镁、分子筛(4A，5A)等干燥剂。所述反应促进剂可添加于反应系统内。此外，为了促进酯化反应，还可使用迪安-斯塔克装置(Dean-Stark apparatus)、索式萃取器(Soxhlet extractor)等装置。所述反应促进剂或装置，可单独使用一种，也可两种以上混合使用，还可以将催化剂与干燥剂组合使用。原料化合物及反应促进剂的使用比例也无特殊限定，可从广泛的范围中适当选择。

用于本反应的原料化合物的用量无特殊限定，可从广泛的范围中适当选择。使式(4)所表示的化合物及式(6)所表示的化合物依次反应时，相对于1摩尔式(3)所表示的海藻糖化合物，通常使用0.5～1.8摩尔式(4)所表示的羰基化合物，优选使用0.8～1.2摩尔。此外，相对于1摩尔式(5)所表示的单酯体，通常使用0.5～1.8摩尔式(6)所表示的羰基化合物，优选使用0.8～1.2摩尔。

所述酯化反应的反应温度也没有特殊限定，但通常优选设定于-10℃至使用的溶剂的沸点温度以下的范围内。通常于0～200℃，优选于室温至100℃的范围内进行。

反应时间根据原料化合物的种类及其用量、反应温度等反应条件而不同，但通常可适当调控在1小时至一周的范围内，优选为1～24小时，更优选为3～10小时。

反应结束后，对反应混合液进行副产物的分离除去、干燥、溶剂的蒸馏除去等一般处理之后，通过硅胶柱色谱法等一般方法来精制。

对于式(4)或式(6)所表示的羰基化合物，当Y或Y’为卤素原子时，酯化反应可在适当的溶剂中进行，必要时在碱的存在下进行。

溶剂可使用与上述酯化反应中所使用的惰性溶剂相同的物质。

作为碱，可列举例如氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物；氢氧化钙等碱土金属氢氧化物；碳酸钠、碳酸钾等碱金属碳酸盐；碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属碳酸氢盐；乙酸钠、乙酸钾等碱金属乙酸盐；乙酸钙等碱土金属乙酸盐；氢化钠、氢化钾等碱金属氢化物；氢化钙等碱土金属氢化物；氢氧化铵、碳酸铵、乙酸铵等铵盐；三甲胺、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶、二氮杂双环辛烷(DABCO)、二氮杂双环壬烷(DBN)、二氮杂双环十一碳烯(DBU)等三级胺。所述碱可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

用于本反应的原料化合物及碱的用量也没有特殊限定，可从广泛的范围中适当选择。使式(4)所表示的化合物及式(6)所表示的化合物依次反应时，相对于1摩尔式(2)所表示的海藻糖化合物，通常使用0.5～1.8摩尔式(4)所表示的羰基化合物，优选使用0.8～1.2摩尔，并通常使用碱0.5～1.8摩尔，优选使用0.8～1.2摩尔。此外，相对于1摩尔式(5)所表示的单酯体，通常使用式(6)所表示的羰基化合物0.5～1.8摩尔，优选为0.8～1.2摩尔，并通常使用碱0.5～1.8摩尔，优选为0.8～1.2摩尔。

反应温度与上述酯化反应相同，通常设定于-10℃至使用的溶剂的沸点温度的范围内即可。反应时间与上述酯化反应相同，依据上述浓度、温度等变化，但通常于0.1～10小时范围内适当调整。

作为式(4)所表示的化合物及式(6)所表示的化合物，当使用X为羟基的羰基化合物与X’为卤素原子的羰基化合物时，以及使用X为卤素原子的羰基化合物与X’为羟基的化合物时，通过在上述反应条件中进行适当选择，同样可合成式(7)所表示的化合物。

<步骤(b)>

对于上述步骤(a)中制得的、海藻糖的6位及6’位被酯化且糖的羟基被保护的式(7)所表示的化合物，通过进行糖的羟基的脱保护，即制得作为目标的由式(1)所表示的海藻糖二酯化合物。

对于从式(7)表示的化合物中被保护的羟基除脱保护基，例如，可适当应用上述文献中记载的适合于所述保护基的脱保护方法。

例如，当R₃的保护基是苯甲基时，可应用催化氢化反应(catalytic hydrogenation)。催化氢化反应是于氢气气氛及催化剂存在下进行的。

催化剂可广泛使用用于催化氢化反应的公知的催化剂，可列举例如氧化铂、铂碳、氢氧化钯、钯碳、拉尼镍(Raney nickle)等。

催化剂的用量，相对于式(7)所表示的化合物，通常为0.001～50重量％左右，优选为0.01～10重量％左右。

氢气压力无特殊限定，可从广泛范围内来适当选择。氢气压力通常为0.8～100大气压左右，优选为1～3大气压左右。

该反应通常于适当的溶剂中进行，作为溶剂，只要是对反应不产生不良影响的惰性物质均可广泛使用。作为使用的溶剂，可列举例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化脂肪烃；甲醇、乙醇、异丙醇等醇类；甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类；甲酸、乙酸等羧酸或它们的混合溶剂。

本反应的温度通常为0～100℃左右，优选为10～40℃左右。反应时间依据底物质量、温度、催化剂种类等不同，但优选使氢消耗的理论量达到标准后再结束反应。通常为1～50小时左右，优选为1～30小时。

反应结束后，进行催化剂过滤除去、溶剂蒸馏除去等一般处理之后，采用溶剂萃取、硅胶柱色谱法等一般方法来精制。

本发明的式(1)所表示的化合物，可通过下述合成简图2或合成简图3中所示的方法来制造。

<合成简图2>

[化4]

上述合成简图中，R₁、R₁’、R₂、R₂’、R₃、R₃’、n及n’与上述相同。

合成简图2是在酯化反应的步骤(a)中，将式(4)及式(6)所表示的羰基化合物同时与式(3)所表示的海藻糖化合物反应的简图，脱保护反应的步骤(b)与合成简图1相同。

酯化反应及脱保护反应除了步骤(a)中将式(4)及式(6)表示的羰基化合物同时与式(3)表示的海藻糖化合物反应之外，可使其与合成简图1同样地进行。

使式(4)所表示的羰基化合物及式(6)所表示的羰基化合物同时反应时，可从生成物中通过分离精制得到目标化合物。

式(1)所表示的化合物中，当R₁及R₁’、R₂及R₂’、n及n’分别彼此相同时，上述合成简图2可特别表示为下述合成简图3。需要说明的是，当式(1)所表示的化合物不是R₁及R₁’、R₂及R₂’、n及n’分别彼此相同的化合物时，从提高反应产率的观点来说，优选通过合成简图1所表示的方法来合成。

<合成简图3>

[化5]

上述合成简图中，R₁、R₂、R₃、R₃’及n与上述相同。

合成简图3中，作为酯化反应的步骤(a)中，相对于式(3)所表示的海藻糖化合物，由于反应的羰基化合物(4)仅为一种，因此是酯化反应同时进行，即是以单步反应进行的简图，脱保护反应的步骤(b)与合成简图1相同。

合成简图3中的酯化反应及脱保护反应，除了增加式(4)表示的羰基化合物的用量以外，可使其与上述合成简图1的反应同样地进行。关于用量，具体而言，相对于1摩尔式(3)所表示的海藻糖化合物，通常使用式(4)所表示的羰基化合物1.8～5摩尔，优选为2～3摩尔，缩合剂通常为1.8～5摩尔，优选为2～4摩尔，碱类通常为1.8～8摩尔，优选为2～6摩尔。

此外，式(7)所表示的化合物，可不经过分离精制用于下一个反应，但优选预先除去酯化反应中使用的试剂及副产物。

<作为原料的羰基化合物>

上述合成简图1、2或3中，作为原料化合物的式(4)或式(6)所表示的羰基化合物除了使用市售品之外，也可以通过本领域技术人员公知的方法来制造。例如式(4)或式(6)中，作为X或X’为苯基，且n或n’为0的化合物，可使用苯甲酸或苯甲酰卤。

式(4)所表示的化合物中，X为R₁-CHR₂-且n为0的化合物，可通过下述合成简图4或5来制造。

在下文中，式(4)所表示的羰基化合物是记载的目标化合物，但式(6)所表示的羰基化合物也可以相同方法来制造。

<合成简图4>

[化6]

上述合成简图中，R₁及R₂与上述相同。R₄表示碳数为1～6的烷基，Hal则表示卤素原子。

合成简图4为使式(8)所表示的化合物接着进行一般的烷基化反应而制得式(4)表示的羰基化合物的步骤。作为原料化合物的式(8)所表示的化合物，可使用市售品，例如R₁是碳数为10的直链烷基时，可使用十二烷酸乙酯等。作为目标化合物的侧链烷基，则优选使用具有期望长度的酸的酯类。

在烷基化反应中，可使用如“Creger，J.Am.Chem.Soc.，92卷，1397-98页，1970年”中所述的方法等各种方法。更具体而言，优选将强碱加入到式(8)表示的化合物的溶液中以脱去2位的氢原子后，再使之与卤化烷反应。举例而言，可通过下述反应来进行烷基化。

首先，使强碱与式(8)所表示的化合物反应。作为强碱，优选为具有脱去氢原子作用的强碱，可列举如氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物；氢氧化钙等碱土金属氢氧化物等。所述碱类可单独使用一种，也可两种以上混合使用。还可与二异丙基酰胺锂合用进行质子-锂交换反应。作为溶剂，只要是对原料化合物具有适度的溶解性，并对酯化反应不产生不良影响的惰性溶剂均可，可广泛使用公知的溶剂。作为用于上述烷基化反应的溶剂的实例，可列举苯、甲苯、二甲苯等芳香烃；正己烷、环己烷、石油醚等脂肪烃；乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚等醚类。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述反应中，式(8)表示的化合物与强碱的比例可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于式(8)所表示的化合物，使用0.9～5倍左右的摩尔数的强碱等。此时的反应温度通常为-80～60℃左右，优选为0℃～60℃左右。反应时间设为5分钟～6小时左右，优选为5分钟～1小时左右。

接着，将卤化烷添加至反应混合液中。作为卤化烷，优选使用例如1-碘辛烷、1-碘庚烷、1-碘癸烷、1-碘十一烷、1-碘十二烷、1-碘十三烷等，作为目标化合物的侧链烷基的碳链部分具有期望长度的烷烃的卤化物。作为卤化物，可列举氯化物、碘化物、溴化物等，但优选为碘化物。在所述反应中，式(8)所表示的化合物与卤化烷的比例可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于式(8)表示的化合物，使用1.1～3倍左右摩尔数的卤化烷。此时的反应温度通常优选为室温左右。此外，反应时间通常设为2～12小时左右。

反应结束后，通过采用硅胶柱色谱法、减压蒸馏等公知的分离及精制方法来分离、精制目标化合物。

式(4)所表示的化合物中，X为R₁-CHR₂-、n为0的化合物可通过下述合成简图5来制造。

<合成简图5>

[化7]

上述合成简图中，R₁、R₂、R₄及Hal与上述相同。

合成简图5是使式(11)所表示的化合物接着进行一般的烷基化反应而制得式(4)表示的羰基化合物的步骤。作为原料化合物的式(11)所表示的化合物可使用市售品，可列举例如丙二酸二乙酯、丙二酸二甲酯、丙二酸二丙酯、丙二酸二丁酯、丙二酸二异丙酯、丙二酸二叔丁酯、丙二酸二环己酯、丙二酸二苯酯、丙二酸二苯甲酯等。

烷基化反应与上述相同，可使作为原料化合物的式(11)所表示的化合物与强碱反应，继而使其与卤化烷反应。

在式(11)所表示的化合物与强碱反应的步骤中，式(11)表示的化合物与强碱类的比例，可从广泛的范围内适当选择，但通常情况下，相对于式(11)所表示的化合物，使用0.9～5倍左右摩尔数的强碱等。此时的反应温度，通常为-80～60℃左右，优选为0℃～60℃左右。反应时间设为5分钟～6小时左右，优选为5分钟～1小时左右。

接着，在添加卤化烷的步骤中，式(11)表示的化合物与卤化烷的比例，可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于式(11)所表示的化合物，分别使用0.8～1.2倍左右摩尔数的式(12)表示的卤化烷及式(9)所表示的卤化烷。当目标化合物为R₁及R₂彼此相同的化合物时，可以仅使用一种卤化烷，通常情况下，相对于式(11)所表示的化合物，使用2.2～4倍左右摩尔数的卤化烷。当目标化合物中R₁及R₂不同时，如上所述，在使式(12)表示的卤化烷及式(9)所表示的卤化烷同时反应，并仅分离精制目标化合物，除此之外也可使不同的卤化烷依次反应，使其中一方的卤化烷反应后分离精制，再使另一方的卤化烷反应，然后分离精制目标化合物。作为分离精制方法，可采用硅胶柱色谱法、减压蒸馏等公知的分离及精制方法。

式(4)所表示的化合物中，X为R₁-CHR₂-且n为1的化合物可通过下述合成简图6来制造。

<合成简图6>

合成简图6可由下述合成简图6-1至6-5来说明。

<合成简图6-1>

[化8]

上述合成简图中、R₁与上述相同。

合成简图6-1是将N，O-二甲基羟基胺(N，O-dimethylhydroxyamine)与作为原料化合物的羧酸进行脱水结合的反应。

使式(13)表示的羧酸与碱性缩合剂反应。可广泛使用公知的碱性缩合剂，作为碱性缩合剂的实例，除羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)之外，还可列举4-二甲氨基吡啶、哌啶、吡咯烷、吡啶、咪唑、N，N，N’，N’-四甲基脲、双(五亚甲基)脲(bis(pentamethylene)urea)、1，1-羰基二吡咯等。作为原料化合物的羧酸可使用市售品，可列举例如庚酸、辛酸、癸酸、十一烷酸等。优选使用具有目标化合物侧链烷基的期望长度的酸。作为溶剂，只要是对原料化合物具有适度的溶解性，并对酯化反应不产生不良影响的惰性溶剂均可，可广泛使用公知的溶剂。作为用于上述酯化反应的溶剂的实例，可列举苯、甲苯、二甲苯等芳香烃；氯苯、二氯苯等卤化芳香烃：正己烷、环己烷、石油醚等脂肪烃；二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化脂肪烃；乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚等醚类。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述反应中，式(13)表示的羧酸与羰基二咪唑等的使用比例，可从广泛的范围中适当选择，通常为0.8～2.0摩尔左右。此时的反应温度通常为-80～60℃左右，优选为0℃～60℃左右。反应时间设为5分钟～6小时左右，优选为30分钟～3小时左右。

接着，使式(14)所表示的N，O-二甲基羟基胺反应。也可使用1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole)等来取代N，O-二甲基羟基胺。式(13)表示的羧酸与N，O-二甲基羟基胺的比例，可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于1摩尔式(13)表示的羧酸，优选使用0.8～1.5摩尔左右的N，O-二甲基羟基胺。反应温度通常为-80～60℃左右，优选为0℃～60℃左右。反应时间优选设为10分钟至10小时左右。

<合成简图6-2>

[化9]

上述合成简图中，R₁、R₂及Hal与上述相同。

合成简图6-2是使式(15)表示的化合物与卤化烷反应以合成酮体的反应。

在所述反应中，使式(9)所表示的卤化烷在醚类溶剂中与金属镁反应，可配制格氏(Grignard)试剂以用于所述反应。作为金属镁，优选使用已研磨的镁屑，除此之外，还可使用锂、钠、锌、铟等。

式(9)所表示的卤化烷，可使用与上述相同的物质。

该反应是在醚类溶剂系统进行的，作为醚类溶剂系统，可列举乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚等。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述反应中，式(15)表示的化合物与卤化烷的比例，可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于式(15)所表示的化合物，使用0.8～5倍左右摩尔数的卤化烷。此时的反应温度通常为0℃～80℃左右，反应时间为5分钟～6小时左右。

<合成简图6-3>

[化10]

上述合成简图中，R₁、R₂及R₄与上述相同。R₅及R₆各自表示烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，所述基团也可用卤素原子等来取代。

合成简图6-3是在强碱的存在下，使式(16)所表示的酮化合物与维蒂希(Wittig)试剂或霍纳尔试剂(Horner-Emmons)试剂反应，以形成碳碳双键的反应。上述合成简图中记载的式(17)所表示的化合物为霍纳尔试剂，但可使用维蒂希试剂代替。

作为强碱，只要是具有脱去氢原子的作用的碱均可，可列举如氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物；氢氧化钙等碱土金属氢氧化物等。所述碱类可单独使用一种，也可两种以上混合使用。作为溶剂，只要是对原料化合物具有适度的溶解性，且不会对酯化反应产生不良影响的惰性溶剂均可，可广泛使用公知的溶剂。作为用于该反应的溶剂的实例，可列举苯、甲苯、二甲苯等芳香烃；正己烷、环己烷、石油醚等脂肪烃；乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚等醚类。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述反应中，式(16)表示的化合物与强碱的比例，可从广泛的范围中适当选择，但通常情况下，相对于式(16)所表示的化合物，使用碱类等1.1～8倍左右的摩尔数。此时的反应温度通常为-80～60℃左右。反应时间通常设为5分钟～3小时左右。

接着，在反应混合液中使维蒂希试剂或霍纳尔试剂反应。作为维蒂希试剂或霍纳尔试剂，可广泛使用公知的物质。在该步骤中，能使式(16)所表示的酮化合物与酸酯之间形成碳碳双键的物质均可，作为维蒂希试剂的实例，可列举乙氧羰基甲基(三苯基)溴化膦(Ethoxycarbonylmethyl--(triphenyl)phosphonium bromide)或(三苯基亚正膦基)乙酸乙酯(ethyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)；作为霍纳尔试剂的实例，则可列举二苯基磷酰乙酸乙酯(ethyl diphenyl phosphonoacetate)等二芳基磷酰乙酸乙酯(ethyl diaryl phosphonoacetate)，或二乙基磷酰基乙酸乙酯(ethyl diethyl phosphonoacetate)等二烷基磷酰基乙酸乙酯等，优选为二乙基磷酰基乙酸乙酯。

在所述反应中，式(16)表示的化合物与二乙基磷酰基乙酸乙酯的比例，可从广泛的范围中适当选择，但通常相对于式(16)所表示的化合物，使用二乙基磷酰基乙酸乙酯1.1～10倍左右的摩尔数。此时的反应温度，通常设为室温附近即可。此外，反应时间通常设为2～30小时左右。

<合成简图6-4>

[化11]

上述合成简图中，R₁、R₂及R₄与上述相同。

合成简图6-4是对式(18)表示的具有不饱和键的羧酸酯，进行催化氢化反应而形成饱和羧酸酯的反应。

该催化氢化反应在氢气气氛、催化剂的存在下进行。

催化剂可广泛使用在催化氢化反应中使用的公知的催化剂，可列举例如氧化铂、铂碳、氢氧化钯、钯碳、拉尼镍(Raney nickle)等。

催化剂的用量相对于式(18)所表示的化合物，通常为0.001重量％～50重量％左右，优选为0.01重量％～10重量％左右。

氢气压力无特殊限制，可从广泛的范围中适当选择。氢气压力通常为0.8～100大气压左右，优选为1～3大气压左右。

该反应通常在适当的溶剂中进行，作为溶剂，只要是对反应不产生不良影响的惰性物质均可广泛使用。作为使用的溶剂，可列举例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化脂肪烃；甲醇、乙醇、异丙醇等醇类；甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯；甲酸、乙酸等羧酸或它们的混合溶剂。

<合成简图6-5>

[化12]

上述合成简图中，R₁、R₂及R₄与上述相同。

合成简图6-5是对式(19)表示的羧酸酯进行水解以制得期望的羧酸的步骤。

作为水解反应，可使用公知的各种反应。于酸性条件下或碱性条件下进行，或者也可以酶反应来进行。

碱性条件只要将碱类添加至溶剂即可，所述碱可广泛使用释放氢氧根离子的物质，可列举如氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物；氢氧化钙等碱土金属氢氧化物；碳酸钠、碳酸钾等碱金属碳酸盐；碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属碳酸氢盐；乙酸钠、乙酸钾等碱金属乙酸盐；乙酸钙等碱土金属乙酸盐；氢化钠、氢化钾等碱金属氢化物；氢化钙等碱土金属氢化物；氢氧化铵、碳酸铵、乙酸铵等铵盐；三甲胺、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、吡啶、4-二甲胺吡啶、二氮杂双环辛烷(DABCO)、二氮杂双环壬烷(DBN)、二氮杂双环十一碳烯(DBU)等三级胺。所述碱类可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

作为溶剂，只要是对原料化合物具有适度的溶解性，并对酯化反应不产生不良影响的惰性溶剂均可，可广泛使用公知的溶剂。作为用于上述酯化反应的溶剂的实例，可列举苯、甲苯、二甲苯等芳香烃；氯苯、二氯苯等卤化芳香烃；正己烷、环己烷、石油醚等脂肪烃；二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化脂肪烃；乙醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚等醚类；丙酮、2-丁酮、甲基异丁基酮等酮类；乙腈、丙腈、苯甲腈等腈类；N，N-二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺(HMPA)等酰胺类；二甲基亚砜等亚砜等。所述溶剂可单独使用一种，也可两种以上混合使用。

在所述反应中，反应温度与反应时间等可从广泛的范围中适当选择，反应温度通常设为0℃至100℃左右，反应时间通常可设为30分钟至20小时左右。

式(4)表示的化合物中，X为R₁-CHR₂-且n为2的化合物，也可通过例如下述合成简图7表示的反应来合成。

<合成简图7>

[化13]

上述合成简图中，R₁及R₂与上述相同。

合成简图7为下述的反应：使式(21)所表示的3-羟基丙酰基膦酸二乙基酯作为霍纳尔试剂与式(16)所表示的酮化合物反应形成碳碳双键，而制得式(22)所表示的化合物；再进行催化氢化反应，制得式(23)所表示的化合物，其后进行醇的氧化反应，制得作为羰基化合物的式(24)所表示的化合物。需要说明的是，在上述合成简图中，关于式(22)所表示的化合物，虽仅记载了其双键的顺(cis)-反(trans)立体异构体中的一种，但不局限于该立体异构体。

使用霍纳尔试剂的反应及催化氢化反应，可分别参照合成简图6-3、合成简图6-4同样地进行。此外，醇的氧化反应可通过使用强氧化剂将醇氧化来进行，可使用铬酸氧化、琼斯(Jones)氧化等公知的方法来适当进行。举例而言，在铬酸氧化中，可使用铬酸酐、铬酸、二铬酸等盐类或络合物来进行。

本说明书中，免疫赋活是指使细胞免疫、体液免疫等各种免疫作用活化，而免疫赋活剂可指显示出所述免疫活化作用中任意一种作用的制剂。本发明的海藻糖化合物被认为在免疫系统中，可至少活化被称为“细胞免疫”的巨噬细胞及中性粒细胞等的免疫作用，但也广泛包含通过使细胞免疫活化之后，所述细胞释放出细胞因子(cytokine)等，而进一步使体液免疫活化的情况等。

原本巨噬细胞对来自外界的异物具有吞噬作用，本说明书中，巨噬细胞活化是指，通过提高巨噬细胞的吞噬作用，提高巨噬细胞对组织的附着性及运动性，而吞噬自外部侵入的细菌或变性后的自身成分的状态。已知在巨噬细胞活化的状态下，一氧化氮(NO)的释放和活性氧的释放会增加。测定所述释放物质的释放量可作为巨噬细胞活化的指标；此外，测定吞噬作用其本身的增加，也可将其作为巨噬细胞活化的指标。

原本中性粒细胞本身也具有与巨噬细胞相同的对异物的吞噬作用，本说明书中，中性粒细胞活化是指，使中性粒细胞的吞噬作用增加而吞噬细菌等的状态。已知在中性粒细胞活化的状态下，一氧化氮(NO)的释放和活性氧的释放会增加。此外，还已知通过中性粒细胞的活化，可发现由微小颗粒或嗜苯胺蓝粒(azurophilic granule)的脱颗粒(degranulation)产生的生理活性物质的释放。测定所述释放物质的释放量可作为中性粒细胞活化的指标，此外，测定吞噬作用其本身的增加，也可将其作为中性粒细胞活化的指标。

本说明书中，作为吞噬细胞可列举巨噬细胞、单核细胞、多核白细胞及树状细胞等，其吞噬作用是指这样的作用：作为免疫系统细胞，通过将病原菌等来自外界的异物噬入该细胞内的小胞中，并使该小胞与细胞内的溶酶体(lysosome)融合，将所述异物消化。吞噬细胞的吞噬作用活化是指，使任一个所述的吞噬细胞活化，而提高其吞噬作用即可，并无特殊限定。优选为使巨噬细胞及中性粒细胞中的一方或双方的吞噬作用增加。

本说明书中，抗细菌感染剂是指，减轻细菌引起的感染性疾病(即因细菌存在于体内而引起的各种症状)的制剂。所述细菌包括例如产气荚膜梭菌等，除此之外还包括绿脓杆菌、致肠病的大肠杆菌等。

本说明书中，细菌毒素中和剂是指，减轻细菌所产生的毒素的作用的制剂。在提到抗细菌感染剂时，也包括通过抑制细菌的增殖或从细菌释放毒素，而减轻细菌所引起的各种症状的制剂，与此相对，在提到毒素中和剂时，是指即便在仅有毒素对生物体产生作用的情况下，也可降低毒素的作用，并吸附毒素或使毒素转变成非活性物质，将毒素摄入于吞噬细胞中，进一步消化被摄入的毒素等作用。

本发明中，抗癌剂意指具有抗肿瘤活性，并用于癌症的预防或治疗的药剂。本发明中抗癌剂所作用的肿瘤，不局限为原发性肿瘤或转移肿瘤。因此，本发明的抗癌剂，不仅可用于原发性癌及转移肿瘤的治疗，还可用于在治疗原发性癌的同时或之后转移肿瘤的预防。此外，作为本发明中抗癌剂所作用的肿瘤，可列举如乳腺癌、睾丸癌、睾丸肿瘤、胰腺癌、横膈膜肿瘤、肺癌、卵巢癌、胃癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、口腔癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、子宫癌、胆管癌、胰岛细胞癌、肾上腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、皮肤癌、恶性类癌肿瘤、黑素瘤(melanoma)、神经胶质瘤、骨肉瘤、骨髓瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、恶性淋巴瘤或白血病等，但其中可优选例示为乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌或横膈膜肿瘤。

本说明书中，可将本发明的海藻糖化合物或含有该化合物与药理学上可容许的载体的药物组合物用作例如免疫赋活剂、细菌毒素中和剂、抗癌剂等药品。

本说明书中，药理学上可容许的载体，只要是药理学上及制剂学上所容许的载体均可，并无特别限制。例如，除了赋形剂、结合剂、分散剂、增稠剂、润滑剂、pH调整剂、增溶剂等一般使用于制剂制造的载体之外，还包含抗生素、抗菌剂、杀菌剂、防腐剂、增效剂(builder)、漂白剂、酶、螯合剂、消泡剂、着色料(染料、颜料)等、软化剂、保湿剂、表面活性剂、抗氧化剂、香料、矫味剂、增香剂、溶剂等。药理学上可容许的载体可在不妨碍本发明的海藻糖化合物(1)的活性的范围内配合使用，通过配合载体，也可对本发明的海藻糖化合物(1)的吸收性或血药浓度产生影响，而使体内配置产生变化。

本说明书中，施用本案化合物的方法是指对人或动物施用本发明的海藻糖化合物本身或含有该化合物的药物组合物的方法，而本案化合物或药物组合物可制成普通的医疗制剂的形式。所述医疗制剂可使用上述药理学上的载体来适当配制。剂型无特殊限定，依据治疗目的来适当选择使用。作为其代表性实例，可列举片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂(溶液剂、混悬剂、乳剂)等。所述制剂均可采用常用的方法来制造。

上述医疗制剂的给药量可依据用法、患者年龄、性别、疾病程度及其他条件来适宜选择，通常，以每日每1KG体重，一次或分成数次施用作为有效成分的海藻糖化合物(1)0.01～100mg，优选为0.1～50mg。

上述给药量根据各种条件而变动，因此不仅有少于上述范围的给药量即足够的场合，也有必须超过上述范围的给药量的场合。

需要说明的是，本说明书中所使用的术语是用于说明特定的实施方式，并非意图限定发明。

此外，除了上下文中应该具有明显不同的理解的场合之外，本说明书中所使用的术语“包括(包含)”意指记载的事项(部件、步骤、要素、数字等)均存在，并且不排除除此以外的事项(部件、步骤、要素、数字等)存在。

除非另有定义，此处所使用的所有术语(含技术术语及科学术语)均具有与本发明所属技术领域的技术人员所普遍理解的含义相同的含义。此处所使用的术语除非另有定义，均应被解释为具有与本说明书及相关技术领域中的含义相一致的含义，不应被解释为理想化的或过于正式的含义。

本发明的实施方式虽有参照附图来进行说明的场合，但采用附图时，为使说明明确，有夸张表达的场合。

“第一”、”第二”等术语是为了表达各种要素而使用，但应理解所述要素不应受到所述术语的限定。所述术语仅仅是为了将一个要素与其他要素区分而使用，例如，将第一要素作为“第二要素”，同样将“第二要素”作为”第一要素”时，并未脱离本发明的范围。

以下，将列举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不应受到下述实施例的限制，也可在符合上述/下述宗旨的范围内，进行适当变更来实施本发明，并且所述变更均包括在本发明的技术范围内。

实施例

<实施例海藻糖二酯化合物的化学合成>

将合成简图1中所示的式(3)表示的糖的羟基被保护的海藻糖化合物与式(4)或式(6)表示的各自期望的羰基化合物进行酯化反应，合成式(7)表示的化合物后，再进行糖的羟基的脱保护，即制得期望的海藻糖二酯化合物。

以下示出其一部分的制造例，但本发明并不局限于下述制造例。

制造例A-1

[6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化14]

将根据制造例C-1中记载的方法得到的羧酸(2-癸基十二烷酸)(145mg，425μmol)与海藻糖衍生物(2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖)(150mg，170μmol)溶解于无水二氯甲烷溶液(2ml)中，依次添加粉末分子筛4A(0.3g)、4-二甲氨基吡啶(20.8mg，170μmol)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[以下简称为EDCI](97.8mg，510μmol)，进行加热回流反应4小时。使用硅藻土-535(celite-535)过滤，加入蒸馏水用二氯甲烷萃取3次。向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。将残余物用柱色谱法(column chromatography)(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)精制，制得作为二酯体的6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖(242mg，93％)的无色、无定形固体。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+57.7°(c 0.9 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2941，2862，1946，1869，1804，1741cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.87(12H，t，J＝6.9Hz)，1.14-1.32(64H，m)，1.43(4H，m)，1.55(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，3.56(2H，t，J＝9.0Hz)，4.04(2H，t，J＝9.0Hz)，4.10(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.8Hz)，4.67(2H，d，J＝11.7Hz)，4.72(2H，d，J＝11.7Hz)，4.85(2H，d，J＝10.8Hz)，4.87(2H，d，J＝10.8Hz)，4.99(2H，d，J＝10.8Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.13，22.69，27.41，27.45，29.33，29.35，29.51，29.53，29.63，31.90，32.32，45.70，62.07，69.16，73.04，75.28，75.71，77.82，79.68，81.55，93.78，127.38，127.61，127.73，127.86，127.92，128.34，128.43，137.79，137.94，138.59，176.16.

制造例A-2

[6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化15]

羧酸使用根据制造例C-2中记载的方法得到的2-辛基癸酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁶+62.3°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2927，2855，1947，1868，1808，1737cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.85(6H，t，J＝6.9Hz)，0.86(6H，t，J＝6.9Hz)，1.12-1.34(48H，m)，1.43(4H，m)，1.55(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，3.57(2H，t，J＝9.3Hz)，4.04(2H，t，J＝9.6Hz)，4.10(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝11.7Hz)，4.71(2H，d，J＝11.7Hz)，4.85(2H，d，J＝10.5Hz)，4.87(2H，d，J＝10.5Hz)，4.99(2H，d，J＝10.5Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.38(30H，m)；¹³CNMR(75MHz，CDCl₃)δ14.12，22.64，22.67，27.40，27.45，29.27，29.45，29.48，29.62，31.83，31.85，32.34，45.71，62.06，69.15，73.04，75.27，75.71，77.24，77.82，79.68，81.55，93.75，127.37，127.61，127.72，127.84，127.91，127.93，128.38，128.44，137.80，137.95，138.59，176.15；FABMS m/z(％)1438(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z：C₉₀H₁₂₆O₁₃Na(M⁺+Na)计算值1437.9096，实测值1437.9126.

制造例A-3

[6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化16]

羧酸使用根据制造例C-3中记载的方法得到的2-壬基十一烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁶+64.8°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2926，2854，1946，1871，1806，1738cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(6H，t，J＝7.0Hz)，0.87(6H，t，J＝7.0Hz)，1.10-1.34(56H，m)，1.43(4H，m)，1.55(4H，m)，2.32(2H，m)，3.55(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，3.57(2H，t，J＝9.3Hz)，4.04(2H，t，J＝9.6Hz)，4.11(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.2Hz)，4.67(2H，d，J＝11.7Hz)，4.72(2H，d，J＝11.7Hz)，4.85(2H，d，J＝10.2Hz)，4.87(2H，d，J＝10.5Hz)，4.99(2H，d，J＝10.5Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³CNMR(75MHz，CDCl₃)δ14.11，22.67，27.39，27.45，29.28，29.30，29.48，29.51，29.56，29.57，29.61，31.85，31.88，32.33，45.69，62.06，69.15，73.03，75.26，75.70，77.23，77.82，79.68，81.54，93.75，127.36，127.59，127.71，127.83，127.90，127.91，128.37，128.42，137.79，137.93，138.58，176.12；FABMS m/z(％)1934(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₉₄H₁₃₄O₁₃Na(M⁺+Na)1493.9722，实测值1493.9701.

制造例A-4

[6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化17]

羧酸使用根据制造例C-4中记载的方法得到的2-十一烷基十三烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+60.0°(c 0.9 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2940，2862，1946，1869，1805，1740cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.87(12H，t，J＝6.9Hz)，1.14-1.34(72H，m)，1.43(4H，m)，1.56(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝10.2，3.6Hz)，3.56(2H，t，J＝8.7Hz)，4.04(2H，t，J＝10.2Hz)，4.12(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.85(2H，d，J＝10.8Hz)，4.88(2H，d，J＝10.5Hz)，4.99(2H，d，J＝10.8Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.12，22.67，27.40，27.44，29.34，29.50，29.52，29.62，31.90，32.30，45.68，62.05，69.14，73.03，75.25，75.69，77.80，79.66，81.52，93.76，127.35，127.58，127.70，127.82，127.90，128.36，128.40，137.76，137.92，138.57，176.12.

制造例A-5

[6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化18]

羧酸使用根据制造例C-5中记载的方法得到的2-十二烷基十四烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+60.8°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2940，2862，1946，1869，1804，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.14-1.34(80H，m)，1.43(4H，m)，1.56(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，3.57(2H，t，J＝8.4Hz)，4.04(2H，t，J＝9.6Hz)，4.12(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(2H，d，J＝10.8Hz)，4.87(2H，d，J＝10.5Hz)，4.99(2H，d，J＝10.8Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.24-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.12，22.69，27.41，27.46，29.36，29.53，29.66，31.92，32.32，45.70，62.09，69.19，73.07，75.27，75.71，77.86，79.72，81.56，93.78，127.71，127.62，127.74，127.86，127.94，128.40，128.45，137.83，138.00，138.64，176.17.

制造例A-6

[6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化19]

羧酸使用根据制造例C-6中记载的方法得到的2-十三烷基十五烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+50.2°(c 1.1 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2929，2855，1945，1868，1804，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.6Hz)，1.10-1.34(88H，m)，1.44(4H，m)，1.56(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝9.8，3.6Hz)，3.58(2H，t，J＝9.8Hz)，4.04(2H，t，J＝9.8Hz)，4.13(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.8Hz)，4.66(2H，d，J＝12.0Hz)，4.73(2H，d，J＝12.0Hz)，4.85(2H，d，J＝11.0Hz)，4.87(2H，d，J＝10.8Hz)，4.99(2H，d，J＝11.0Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.20-7.38(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.11，22.70，27.42，27.46，29.37，29.54，29.66，31.93，32.33，45.72，62.12，69.23，73.10，75.26，75.69，77.23，77.67，77.91，79.77，81.58，93.77，127.42，127.61，127.74，127.85，127.94，128.40，128.44，128.46，137.86，138.05，138.68，176.15.

制造例A-7

[6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化20]

羧酸使用根据制造例C-8中记载的方法得到的2-十五烷基十七烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+44.3°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2941，2861，1945，1868，1812，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝7.2Hz)，1.12-1.38(104H，m)，1.43(4H，m)，1.56(4H，m)，2.32(2H，m)，3.54(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，3.57(2H，t，J＝8.7Hz)，4.04(2H，t，J＝9.6Hz)，4.12(2H，m)，4.20(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(2H，d，J＝10.8Hz)，4.87(2H，d，J＝10.8Hz)，4.99(2H，d，J＝10.5Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.70，27.25，27.42，27.45，29.38，29.55，29.68，29.72，31.94，32.32，45.70，62.07，69.16，73.05，75.29，75.72，77.82，79.68，81.55，93.78，127.40，127.62，127.75，127.95，128.41，128.45，137.81，137.95，138.61，176.19.

制造例A-8

[6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化21]

羧酸使用根据制造例C-9中记载的方法得到的2-十六烷基十八烷酸，并采用与制造例A-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+48.8°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2938，2857，1944，1869，1808，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.10-1.36(112H，m)，1.43(4H，m)，1.56(4H，m)，2.32(2H，m)，3.55(2H，dd，J＝9.3，3.6Hz)，3.57(2H，t，J＝9.0Hz)，4.04(2H，t，J＝9.3Hz)，4.11(2H，m)，4.19(4H，m)，4.53(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(2H，d，J＝10.8Hz)，4.87(2H，d，J＝10.5Hz)，4.99(2H，d，J＝10.8Hz)，5.18(2H，d，J＝3.6Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.15，22.71，27.43，29.39，29.56，29.69，29.73，31.94，32.31，45.70，62.08，69.17，73.05，75.31，75.74，77.83，79.68，81.56，93.81，127.41，127.64，127.76，127.96，128.42，128.47，137.83，138.00，138.62，176.22.

实施例1：制造例α-1

[6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化22]

将根据制造例A-1中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖(200mg，131μmol)溶解于氯仿∶甲醇∶乙酸(1∶1∶0.05)的混合溶剂(4ml)中，加入氢氧化钯(20重量％，8mg，11.4μmol)，于氢气1大气压下搅拌6小时。将反应混合液过滤后浓缩，并将残余物用柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)精制，即制得6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖(125mg，97％)的无色、无定形固体。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+61.8°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3358，2940，2861，1746cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.25(56H，m)，1.45(8H，m)，1.58(4H，m)，1.83(4H，m)，2.58(2H，m)，4.18(2H，t，J＝9.3Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.3，3.6Hz)，4.73(2H，t，J＝9.3Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.7，5.1Hz)，5.07(4H，m)，5.87(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.29，22.95，27.75，27.80，29.62，29.80，29.90，29.95，32.14，32.82，46.16，63.93，71.54，71.94，73.31，74.81，95.69，176.26；FABMS m/z(％)1010(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₅₆H₁₀6O₁₃Na(M⁺+Na)1009.7532，实测值1009.7498.

实施例2：制造例α-2

[6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化23]

将根据制造例A-2中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁴+70.2°(c 0.6 CHCl₃)；FT IR(neat)3300，2929，2856，1743cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.86(12H，t，J＝6.9Hz)，1.21(40H，m)，1.46(8H，m)，1.57(4H，m)，1.80(4H，m)，2.56(2H，m)，4.19(2H，t，J＝9.6Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.6Hz)，4.88(2H，dd，J＝12.0，4.8Hz)，5.08(4H，m)，5.87(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ13.69，22.32，27.12，27.19，28.96，29.11，29.33，31.47，32.23，45.55，63.25，70.94，71.30，72.69，74.18，95.14，175.68；FABMS m/z(％)898(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₄₈H₉₀O₁₃Na(M⁺+Na)897.6279，实测值897.6249.

实施例3：制造例α-3

[6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化24]

将根据制造例A-3中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁴+64.9°(c 0.6 CHCl₃)；FT IR(neat)3306，2928，2855，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.87(12H，t，J＝6.9Hz)，1.22(48H，m)，1.42(8H，m)，1.54(4H，m)，1.79(4H，m)，2.56(2H，m)，4.19(2H，t，J＝9.0Hz)，4.39(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.0Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.7，4.8Hz)，5.08(4H，m)，5.88(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ13.69，22.32，27.14，27.20，28.97，29.17，29.27，29.34，31.51，32.22，45.55，63.28，70.94，71.31，72.69，74.18，95.13，175.67；FABMS m/z(％)954(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₅₂H₉₈O₁₃Na(M⁺+Na)953.6905，实测值953.6862.

实施例4：制造例α-4

[6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化25]

将根据制造例A-4中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁴+58.5°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3297，2934，2856，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.88(12H，t，J＝6.6Hz)，1.26(64H，m)，1.45(8H，m)，1.58(4H，m)，1.82(4H，m)，2.58(2H，m)，4.18(2H，t，J＝9.0Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，4.73(2H，t，J＝9.0Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.7，5.1Hz)，5.07(4H，m)，5.88(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.29，22.94，27.75，27.80，29.63，29.81，29.96，32.14，32.81，46.15，63.93，71.54，71.94，73.31，74.81，95.67，176.25；FABMS m/z(％)1066(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₆₀H₁₁₄O₁₃Na(M⁺+Na)1065.8157，实测值1065.8160.

实施例5：制造例α-5

[6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化26]

将根据制造例A-5中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁴+54.6°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3310，2937，2857，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.28(72H，m)，1.46(8H，m)，1.58(4H，m)，1.82(4H，m)，2.59(2H，m)，4.18(2H，t，J＝9.0Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，4.73(2H，t，J＝9.0Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.7，5.1Hz)，5.08(4H，m)，5.87(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.30，22.97，27.77，27.82，29.66，29.83，29.99，32.17，32.82，46.16，63.94，71.53，71.95，73.31，74.80，95.66，176.24；FABMS m/z(％)1122(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₆₄H₁₂₂O₁₃Na(M⁺+Na)1121.8784，实测值1121.8831.

实施例6：制造例α-6

[6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化27]

将根据制造例A-6中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁹+52.7°(c 0.6 CHCl₃)；FT IR(neat)3313，2927，2854，1741cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.29(80H，m)，1.46(8H，m)，1.58(4H，m)，1.83(4H，m)，2.59(2H，m)，4.19(2H，t，J＝9.6Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.6Hz)，4.89(2H，dd，J＝11.7，5.1Hz)，5.08(4H，m)，5.88(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.28，22.94，27.75，27.80，29.63，29.82，29.98，32.14，32.80，46.14，63.92，71.53，71.94，73.30，74.79，95.66，176.21；FABMS m/z(％)1178(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₆₈H₁₃₀O₁₃Na(M⁺+Na)1177.9409，实测值1177.9404.

实施例7：制造例α-7

[6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化28]

将根据制造例A-7中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁹+44.8°(c 0.5 CHCl₃)；FT IR(neat)3330，2925，2853，1741cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.87(12H，t，J＝7.2Hz)，1.31(96H，m)，1.47(8H，m)，1.58(4H，m)，1.83(4H，m)，2.59(2H，m)，4.19(2H，t，J＝9.0Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.0Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.4，4.8Hz)，5.08(4H，m)，5.87(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.23，22.89，27.73，27.79，29.58，29.80，29.91，29.97，32.09，32.78，46.13，63.92，71.55，71.95，73.32，74.80，95.67，176.21；FABMS m/z(％)1290(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₇₆H₁₄₆O₁₃Na(M⁺+Na)1290.0661，实测值1290.0677.

实施例8：制造例α-8

[6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化29]

将根据制造例A-8中记载的方法得到的6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例α-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ¹⁷+45.1°(c 0.5 CHCl₃)；FT IR(neat)3308，2937，2856，1741cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.87(12H，t，J＝6.9Hz)，1.31(104H，m)，1.46(8H，m)，1.57(4H，m)，1.80(4H，m)，2.56(2H，m)，4.19(2H，t，J＝9.3Hz)，4.29(2H，dd，J＝9.3，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.3Hz)，4.88(2H，dd，J＝11.4，4.8Hz)，5.08(4H，m)，5.87(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.25，22.90，27.75，27.80，29.60，29.82，29.91，29.99，32.10，32.80，46.14，63.91，71.55，71.95，73.32，74.80，95.66，176.24；FABMS m/z(％)1346(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₈₀H₁₅₄O₁₃Na(M⁺+Na)1346.1288，实测值1346.1287.

制造例B-1

[6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化30]

将根据制造例D-1中记载的方法得到的羧酸(3-壬基十二烷酸)(236mg，724μmol)与海藻糖衍生物(2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖)(256mg，290μmol)溶解于无水二氯甲烷溶液(10ml)中，依次添加粉末分子筛4A(1g)、4-二甲氨基吡啶(35.4mg，290μmol)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[以下简称为EDCI](222mg，1.16mmol)，加热回流反应10小时。使用硅藻土-535过滤，加入饱和食盐水以二氯甲烷萃取2次。向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。将残余物用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝15∶1)精制，即制得作为二酯体的6，6’-双-O-(3-壬基十二烷酸)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖(350mg，80％)的无色、无定形固体。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+65.3°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3063，3031，2925，2853，1944，1871，1806，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.87(12H，t，J＝5.1Hz)，1.20(64H，m)，1.81(2H，m)，2.20(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(2H，t，J＝9.3Hz)，3.56(2H，m)，4.04(2H，t，J＝9.3Hz)，4.09(4H，m)，4.23(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.00(2H，d，J＝10.5Hz)，5.17(2H，d，J＝3.6Hz)，7.23-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.13，22.68，26.51，29.33，29.56，29.64，29.92，31.89，33.65，33.76，34.89，39.08，62.35，69.12，72.94，75.30，75.70，77.60，79.38，81.56，94.02，127.44，127.63，127.78，127.92，128.09，128.41，128.47，137.78，137.84，138.60，173.24；FABMS m/z(％)1522(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₉₆H₁₃₈O₁₃Na(M⁺+Na)1522.0036，实测值1522.0020.

制造例B-2

[6，6’-双-O-(3-辛基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化31]

羧酸使用根据制造例D-2中记载的方法得到的3-辛基十一烷酸，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-辛基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+41.8°(c 2.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2932，2855，1947，1867，1806，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.86(6H，t，J＝6.9Hz)，δ0.87(6H，t，J＝6.9Hz)，1.20(56H，m)，1.81(2H，m)，2.20(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(2H，t，J＝8.4Hz)，3.56(2H，m)，4.04(2H，t，J＝9.3Hz)，4.09(4H，m)，4.23(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.00(2H，d，J＝10.5Hz)，5.17(2H，d，J＝3.6Hz)，7.23-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.69，26.52，29.32，29.61，29.94，31.89，33.69，33.80，34.91，39.10，62.38，69.14，72.96，75.29，75.70，77.62，79.40，81.58，93.95，94.04，127.44，127.62，127.77，127.91，128.07，128.41，128.46，137.78，137.85，138.59，173.23；FABMS m/z(％)1466(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₉₂H₁₃₀O₁₃Na(M⁺+Na)1465.9409，实测值1465.9392.

制造例B-3

[6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化32]

羧酸使用根据制造例D-3中记载的方法得到的3-癸基十三烷酸，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-癸基十三烷基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+53.6°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3063，3030，2926，2854，1946，1874，1804，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.87(12H，t，J＝6.9Hz)，1.21(72H，m)，1.81(2H，m)，2.19(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(2H，t，J＝8.4Hz)，3.56(2H，m)，4.04(2H，t，J＝8.4Hz)，4.11(4H，m)，4.21(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.00(2H，d，J＝10.5Hz)，5.17(2H，d，J＝3.6Hz)，7.23-7.36(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.70，26.51，29.36，29.66，29.95，31.93，33.67，77.23，77.62，79.40，81.58，94.04，127.46，127.65，127.80，127.93，128.10，128.43，128.49，137.80，137.87，138.62，173.27；FABMSm/z(％)1579(M⁺+H+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₁₀₀H₁₄₇O₁₃Na(M⁺+H+Na)1579.0787，实测值1579.0763.

制造例B-4

[6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化33]

羧酸使用根据制造例D-4中记载的方法得到的3-十一烷基十四烷酸，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+58.1°(c1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2926，2854，1946，1867，1806，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝7.2Hz)，1.21(80H，m)，1.81(2H，m)，2.19(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(2H，t，J＝8.4Hz)，3.55(2H，m)，4.04(2H，t，J＝6，9Hz)，4.10(4H，m)，4.20(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.71(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.00(2H，d，J＝10.5Hz)，5.17(2H，d，J＝3.6Hz)，7.19-7.36(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.71，26.53，29.38，29.67，29.95，31.93，33.68，33.79，34.91，39.10，62.37，69.14，72.96，75.31，75.71，77.63，79.40，81.58，94.04，127.46，127.64，127.80，127.93，128.10，128.43，128.49，137.80，137.87，138.62，173.27；FABMS m/z(％)1635(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₁₀₄H₁₅₄O₁₃Na(M⁺+Na)1634.1288，实测值1634.1298.

制造例B-5

[6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化34]

羧酸使用根据制造例D-5中记载的方法得到的3-十二烷基十五烷酸，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+68.9°(c 0.9 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3063，3031，2925，2853，1944，1867，1806，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.21(88H，m)，1.81(2H，m)，2.20(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(2H，t，J＝8.7Hz)，3.57(4H，m)，4.05(2H，t，J＝8.7Hz)，4.05(2H，t，J＝8.7Hz)，4.11(2H，m)，4.21(2H，m)，4.52(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.3Hz)，4.72(2H，d，J＝12.3Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.01(2H，d，J＝10.5Hz)，5.18(2H，d，J＝3.3Hz)，7.21-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.70，26.53，29.38，29.67，29.95，31.92，33.67，33.78，34.91，39.10，62.37，69.14，72.96，75.30，75.71，77.63，79.40，81.57，94.03，127.45，127.63，127.79，127.93，128.09，128.42，128.48，137.79，137.87，138.62，173.26；FABMS m/z(％)1691(M⁺+H+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₁₀₈H₁₆₃O₁₃Na(M⁺+H+Na)1691.1993，实测值1691.1992.

制造例B-6

[6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化35]

羧酸使用市售的3-十三烷基十六烷酸(和光纯药工业株式会社制)，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+49.5°(c 0.9 CHCl₃)；FT IR(neat)3088，3064，3031，2925，2853，1944，1871，1806，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.23(96H，m)，1.81(2H，m)，2.20(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(4H，m)，4.04(2H，t，J＝9.3Hz)，4.11(4H，m)，4.21(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.8Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.8Hz)，5.00(2H，d，J＝10.8Hz)，5.17(2H，d，J＝3.6Hz)，7.23-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.16，22.72，26.54，29.40，29.69，29.72，29.97，31.95，33.68，33.79，34.92，39.11，62.37，69.14，72.96，75.33，75.72，77.24，77.62，79.40，81.59，94.07，127.46，127.66，127.81，127.94，128.11，128.44，128.50，137.80，137.87，138.63，173.28；FABMS m/z(％)1691(M⁺+H+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₁₁₂H₁₇₁O₁₃Na(M⁺+H+Na)1747.2619，实测值1747.2618.

制造例B-7

[6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖的合成]

[化36]

羧酸使用根据制造例D-6中记载的方法得到的3-十四烷基十七烷酸，并采用与制造例B-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²⁰+43.7°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3087，3064，3032，2924，2853，1943，1871，1796，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(12H，t，J＝6.9Hz)，1.23(104H，m)，1.80(2H，m)，2.19(4H，d，J＝6.9Hz)，3.54(4H，m)，4.04(2H，t，J＝9.6Hz)，4.11(4H，m)，4.21(2H，m)，4.51(2H，d，J＝10.5Hz)，4.67(2H，d，J＝12.0Hz)，4.72(2H，d，J＝12.0Hz)，4.86(4H，d，J＝10.5Hz)，5.00(2H，d，J＝10.5Hz)，5.17(2H，d，J＝3.3Hz)，7.22-7.37(30H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.16，22.72，26.55，29.39，29.70，29.73，29.97，31.95，33.68，33.79，34.92，39.11，62.38，69.15，72.97，75.32，75.72，77.23，77.63，79.41，81.59，94.06，127.46，127.65，127.81，127.94，128.11，128.44，128.49，137.81，137.88，138.63，173.27；FABMS m/z(％)1802(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z：C₁₁₆H₁₇₈O₁₃Na(M⁺+Na)计算值1802.3185，实测值1802.3175.

实施例9：制造例β-1

[6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化37]

将根据制造例B-1中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖(350mg，233μmol)溶解于氯仿∶甲醇∶乙酸(5∶1∶0.5)的混合溶剂(5ml)中，加入氢氧化钯(3重量％，13mg，18.5μmol)，于氢气1大气压下搅拌27小时。将反应混合液过滤后浓缩，并将残余物用柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)精制，即制得6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖(135mg，61％)的无色、无定形固体。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+62.8°(c 0.7 CHCl₃)；FT IR(neat)3316，2926，2854，1743cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.81(12H，t，J＝6.9Hz)，1.23(64H，m)，1.99(2H，m)，2.33(4H，d，J＝6.6Hz)，4.13(2H，t，J＝9.6Hz)，4.25(2H，dd，J＝9.6，3.9Hz)，4.74(2H，t，J＝9.6Hz)，4.78(2H，d，J＝12.3Hz)，4.93(2H，d，J＝12.3Hz)，4.98(2H，m)，5.81(2H，d，J＝3.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.29，22.94，29.84，29.62，29.91，29.94，30.22，32.12，34.10，35.23，39.33，64.26，71.48，71.96，73.35，74.82，95.82，173.51；FABMS m/z(％)982(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₅₄H₁₀₂O₁₃Na(M⁺+Na)981.7218，实测值981.7198.

实施例15：制造例β-2

[6，6’-双-O-(3-辛基十一酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化38]

将根据制造例B-2中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-辛基十一酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-辛基十一酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+70.7°(c 0.4 CHCl₃)；FT IR(neat)3275，2925，2854，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.86(12H，t，J＝7.2Hz)，1.24(56H，m)，2.03(2H，m)，2.37(4H，d，J＝6.6Hz)，4.19(2H，t，J＝9.3Hz)，4.31(2H，dd，J＝9.6，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.3Hz)，4.85(2H，dd，J＝11.7，5.7Hz)，5.01(2H，d，J＝11.7Hz)，5.11(2H，m)，5.89(2H，d，J＝3.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.28，22.93，26.83，26.87，29.59，29.87，30.21，32.11，34.10，35.23，39.32，64.26，71.48，71.95，73.35，74.83，95.82，173.52；FABMS m/z(％)926(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₅₀H₉₄O₁₃Na(M⁺+Na)925.6592，实测值925.6585.

实施例10：制造例β-3

[6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化39]

将根据制造例B-3中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+60.9°(c 0.9 CHCl₃)；FT IR(neat)3279，2924，2854，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.83(12H，t，J＝6.9Hz)，1.24(72H，m)，2.00(2H，m)，2.35(4H，d，J＝6.6Hz)，4.14(2H，t，J＝8.7Hz)，4.26(2H，dd，J＝9.6，3.3Hz)，4.74(2H，t，J＝9.0Hz)，4.78(2H，dd，J＝11.7，5.4Hz)，4.95(2H，d，J＝12.0Hz)，5.01(2H，m)，5.82(2H，d，J＝3.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.10，22.74，26.65，29.41，29.73，30.00，31.92，33.87，35.03，39.16，64.10，71.10，71.57，72.92，74.38，95.14，173.52；FABMS m/z(％)1037(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₅₈H₁₁₀O₁₃Na(M⁺+Na)1037.7903，实测值1037.7874.

实施例11：制造例β-4

[6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化40]

将根据制造例B-4中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+60.6°(c 0.5 CHCl₃)；FT IR(neat)3289，2925，2853，1743cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.86(12H，t，J＝6.9Hz)，1.28(80H，m)，2.04(2H，m)，2.38(4H，d，J＝6.6Hz)，4.19(2H，t，J＝9.0Hz)，4.31(2H，dd，J＝9.0，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.0Hz)，4.85(2H，dd，J＝11.7，5.1Hz)，5.05(2H，d，J＝11.7Hz)，5.01(2H，m)，5.89(2H，d，J＝3.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.30，22.96，26.92，29.64，30.00，30.27，32.14，34.14，35.26，39.37，64.30，71.52，72.00，73.40，74.87，95.86，173.53；FABMS m/z(％)1094(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₆₂H₁₁₈O₁₃Na(M⁺+Na)1093.8470，实测值1093.8458.

实施例12：制造例β-5

[6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化41]

将根据制造例B-5中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+52.5°(c 0.3 CHCl₃)；FT IR(neat)3271，2923，2853，1743cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.84(12H，t，J＝6.3Hz)，1.25(88H，m)，2.02(2H，m)，2.36(4H，d，J＝6.6Hz)，4.15(2H，t，J＝9.0Hz)，4.27(2H，dd，J＝9.9，3.6Hz)，4.74(2H，t，J＝9.6Hz)，4.81(2H，dd，J＝11.4，4.8Hz)，4.97(2H，d，J＝11.4Hz)，5.02(2H，m)，5.84(2H，d，J＝2.4Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.18，22.82，26.73，29.50，29.87，30.12，32.01，33.97，35.12，39.25，64.18，71.25，71.71，73.06，74.51，95.38，173.52；FABMS m/z(％)1150(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₆₆H₁₂₆O₁₃Na(M⁺+Na)1149.9110，实测值1149.9103.

实施例13：制造例β-6

[6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化42]

将根据制造例B-6中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+42.3°(c 0.5 CHCl₃)；FT IR(neat)3321，2925，2853，1742cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.83(12H，t，J＝6.6Hz)，1.27(96H，m)，2.02(2H，m)，2.36(4H，d，J＝6.9Hz)，4.15(2H，t，J＝9.3Hz)，4.27(2H，dd，J＝9.3，3.3Hz)，4.75(2H，t，J＝9.3Hz)，4.80(2H，dd，J＝12.0，5.4Hz)，4.97(2H，d，J＝12.0Hz)，5.02(2H，m)，5.84(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.30，22.96，26.91，29.65，30.03，30.28，32.15，34.12，35.25，39.36，64.28，71.51，71.99，73.38，74.85，95.83，173.51；FABMS m/z(％)1206(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₇₀H₁₃₄O₁₃Na(M⁺+Na)1205.9770，实测值1205.9746.

实施例14：制造例β-7

[6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖的合成]

[化43]

将根据制造例B-7中记载的方法得到的6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-2，3，4，2’，3’，4’-六苯甲酸基-α，α’-海藻糖作为原料化合物使用，并采用与制造例β-1相同的方法，制得6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

无色糖浆状液体；[α]_D ²¹+55.7°(c 1.0 CHCl₃)；FT IR(neat)3310，2925，2853，1743cm^-1；¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)δ0.84(12H，t，J＝6.9Hz)，1.26(104H，m)，2.03(2H，m)，2.37(4H，d，J＝6.6Hz)，4.15(2H，t，J＝9.9Hz)，4.28(2H，dd，J＝9.6，3.9Hz)，4.74(2H，t，J＝9.9Hz)，4.81(2H，dd，J＝11.7，5.4Hz)，4.97(2H，d，J＝11.7Hz)，5.03(2H，m)，5.84(2H，d，J＝3.6Hz)；¹³C NMR(75MHz，C₅D₅N)δ14.05，22.67，26.55，29.36，29.67，29.74，29.94，31.87，33.74，34.95，39.14，64.02，70.91，71.46，72.77，74.20，94.69，173.45；FABMS m/z(％)1262(M⁺+Na)；HRMS(FAB⁺)m/z计算为C₇₄H₁₄₂O₁₃Na(M⁺+Na)1262.0348，实测值1262.0348.

[作为原料的羧酸化合物的合成]

制造例C-1

[2-癸基十二烷酸的合成]

[化44]

将无水THF(11ml)添加至干燥后的双颈烧瓶，并向瓶内加入氢化钠(60重量％，397mg，9.93mmol)，冷却至0℃，滴入丙二酸二乙酯(530mg，3.31mmol)。于0℃搅拌10分钟，添加1-碘癸烷(2.22g，8.28mmol)于室温搅拌6小时。加入饱和氯化铵水溶液，并用乙醚萃取3次，使用无水硫酸镁干燥有机层，过滤后浓缩。将得到的残余物溶解于10N氢氧化钠水溶液(4ml)与正丁醇(8ml)的混合溶剂，加热回流6小时。然后，冷却至室温，加入1N盐酸，再用乙醚萃取3次，使用无水硫酸镁干燥有机层，过滤后浓缩。将得到的残余物溶解于乙酸(3.3ml)，加热回流18小时。冷却后，减压浓缩以去除乙酸。将残余物用硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝7∶1)精制，即制得羧酸(2-癸基十二烷酸)(710mg，63％)的无定形白色粉末。

白色粉末；FT IR(neat)3041，2943，2857，2689，1714cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝7.6Hz)，1.21(32H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.34(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.13，22.72，27.40，29.37，29.50，29.64，31.95，32.19，45.61，183.22；CIMS m/z(％)341(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₂H₄₅O₂(M⁺+H)341.3420，实测值341.3421.

制造例C-2

[2-辛基癸酸的合成]

[化45]

使用1-碘辛烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-辛基癸酸。

白色粉末；FT IR(neat)3032，2927，2856，1707^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.26(24H，m)，1.48(2H，m)，1.63(2H，m)，2.34(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.12，22.70，27.40，29.30，29.45，29.60，31.90，32.20，45.66，183.50；CIMS m/z(％)285(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₁₈H₃₇O₂(M⁺+H)285.2794，实测值285.2772.

制造例C-3

[2-壬基十一烷酸的合成]

[化46]

使用1-碘壬烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-壬基十一烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3019，2934，2858，1712 cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.26(28H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.33(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.72，27.40，29.34，29.50，29.60，31.92，32.20，45.60，183.11；CIMS m/z(％)313(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₀H₄₁O₂(M⁺+H)313.3106，实测值313.3111.

制造例C-4

[2-十一烷基十三烷酸的合成]

[化47]

使用1-碘十一烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十一烷基十三烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3028，2941，2858，1712cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.25(36H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.35(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.17，22.74，27.41，29.40，29.51，29.61，29.65，29.69，29.72，31.97，32.20，45.55，182.81；CIMS m/z(％)369(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₄H₄₉O₂(M⁺+H)369.3732，实测值369.3731.

制造例C-5

[2-十二烷基十四烷酸的合成]

[化48]

使用1-碘十二烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十二烷基十四烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3028，2943，2860，2691，1714cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝7.1Hz)，1.25(40H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.34(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.16，22.76，27.43，29.43，29.54，29.64，29.68，29.71，29.72，31.99，32.22，45.68，183.46；CIMS m/z(％)397(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₆H₅₃O₂(M⁺+H)397.4045，实测值397.4043.

制造例C-6

[2-十三烷基十五烷酸的合成]

[化49]

使用1-碘十三烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十三烷基十五烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3032，2922，2851，2691，1712cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.25(44H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.35(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.72，27.40，29.39，29.50，29.60，29.64，29.69，31.96，32.19，45.54，182.79；CIMS m/z(％)425(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₈H₅₇O₂(M⁺+H)425.4358，实测值425.4341.

制造例C-7

[2-十四烷基十六烷酸的合成]

[化50]

使用1-碘十四烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十四烷基十六烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3028，2928，2854，2684，1706cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝7.2Hz)，1.25(48H，m)，1.48(2H，m)，1.60(2H，m)，2.34(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.13，22.72，27.40，29.40，29.50，29.60，29.64，29.73，31.96，32.19，45.57，182.87；CIMS m/z(％)453(100M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₃₀H₆₁O₂(M⁺+H)453.4671，实测值453.4677.

制造例C-8

[2-十五烷基十七烷酸的合成]

[化51]

使用1-碘十五烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十五烷基十七烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3028，2911，2848，2650，1703cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.25(52H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.35(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.05，22.65，27.33，29.33，29.43，29.53，29.57，29.66，31.90，32.14，45.43，182.41；CIMS m/z(％)481(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₃₂H₆₅O₂(M⁺+H)481.4984，实测值481.4977.

制造例C-9

[2-十六烷基十八烷酸的合成]

[化52]

使用1-碘十六烷代替1-碘癸烷，并采用与制造例C-1相同的方法制得2-十六烷基十八烷酸。

白色粉末；FT IR(neat)3028，2914，2848，2691，1705cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.25(56H，m)，1.48(2H，m)，1.61(2H，m)，2.35(1H，m)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，22.72，27.40，29.40，29.50，29.60，29.64，29.73，31.96，32.20，45.51，182.51；CIMS m/z(％)509(M⁺+H)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₃₄H₆₉O₂(M⁺+H)509.5297，实测值509.5298.

制造例D-1

[3-壬基十二烷酸的合成]

根据下述制造例D-1-1至D-1-5中记载的方法合成3-壬基十二烷酸。

制造例D-1-1

[N-甲氧基-N-甲基癸酰胺的合成]

[化53]

将癸酸(4g，23.2mmol)溶解于无水二氯甲烷溶液(80ml)，添加1，1-羰基二咪唑(1，1-carbonyldiimidazole)(4.5g，27.9mmol)，搅拌1.5小时。接着，加入N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(2.7g，27.9mmol)，再搅拌3小时。加入蒸馏水后，以二氯甲烷萃取2次。向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝8∶1)精制所得的残余物，即制得作为酰胺的N-甲氧基-N-甲基癸酰胺(4.8g，97％)的无色透明液体。

无色油状物；FT IR(neat)2927，2854，1731cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(3H，t，J＝6.9Hz)，1.27(12H，m)，1.63(2H，m)，2.41(2H，t，J＝7.8Hz)，3.18(3H，s)，3.68(3H，s)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.09，22.65，24.65，29.28，29.45，31.86，61.17，174.77；CIMS m/z(％)215(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₁₂H₂₅NO₂(M⁺)215.1921，实测值215.1903.

制造例D-1-2

[10-十九烷酮的合成]

[化54]

加热已研磨的镁屑(3.2g，134mmol)，缓缓滴入1-溴壬烷(12.9ml，67.5mmol)的无水THF溶液(68ml)。加热回流1.5小时后，将反应液冷却至室温，并将其滴入至根据制造例D-1-1记载的方法得到的N-甲氧基-N-甲基癸酰胺(4.8g，22.5mmol)的THF(80ml)溶液中。搅拌30分钟后，加入1N盐酸，用乙醚萃取2次。向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝8∶1)精制得到的残余物，即制得作为酮体的10-十九烷酮(6.0g，95％)的白色无定形固体。

无色固体；FT IR(neat)2953，2916，2847，1698cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.26(24H，m)，1.55(4H，m)，2.38(4H，t，J＝7.5Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.03，22.63，23.84，29.24，29.41，31.84，42.74，211.49；CIMS m/z(％)282(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₁₉H₃₈O(M⁺)282.2882，实测值282.2902.

制造例D-1-3

[3-壬基-2-十二碳烯酸乙酯(ethyl 3-nonyl-2-dodecenoate)的合成]

[化55]

将氢化钠(60重量％，6g，142mmol)溶解于无水THF(200ml)，冷却至0℃后，滴入二乙基磷酰基乙酸乙酯(34ml，171mmol)，搅拌30分钟。升温至室温后，添加根据制造例D-1-2记载的方法得到的10-十九烷酮(6.0g，21.3mmol)，再加热回流18小时。加入蒸馏水并用乙醚萃取2次，向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。用柱色谱法(己烷∶二氯甲烷＝6∶1)精制得到的残余物，即制得作为酯的3-壬基-2-十二碳烯酸乙酯(7.6g，99％)的无色透明液体。

无色油状物；FT IR(neat)2928，2855，1718cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.27(27H，m)，1.44(4H，m)，2.12(2H，t，J＝7.8Hz)，2.58(2H，t，J＝8.1Hz)，4.14(2H，q，J＝7.2Hz)，5.61(1H，br s)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.14，14.35，22.70，27.68，28.75，29.34，29.49，29.52，29.60，30.01，31.92，32.19，38.44，59.42，114.98，165.07，166.66；CIMS m/z(％)352(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₃H₄₄O₂(M⁺)352.3349，实测值352.3345.

制造例D-1-4

[3-壬基十二烷酸乙酯(ethyl 3-nonyldodecanoate)的合成]

[化56]

将根据制造例D-1-3记载的方法得到的3-壬基-2-十二碳烯酸乙酯(7.6g，21.7mmol)溶于氯仿∶甲醇(5∶1)的混合溶剂(100ml)，加入PtO₂催化剂(3重量％，223mg，983μmo l)于氢气1大气压下搅拌23小时。用滤纸滤去PtO₂催化剂并浓缩。用柱色谱法(己烷∶乙醚＝50∶1)精制得到的残余物，即制得3-壬基十二烷酸乙酯(7.1g，92％)的无色透明液体。

无色油状物；FT IR(neat)2929，2855，1739cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.6Hz)，1.26(35H，m)，1.84(1H，m)，2.21(2H，d，J＝6.6Hz)，4.12(2H，q，J＝7.2Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.16，14.32，22.73，26.55，29.38，29.64，29.66，29.93，31.95，33.91，35.10，39.40，60.07，173.73；CIMSm/z(％)354(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₃H₄₆O₂(M⁺)354.3508，实测值354.3503.

制造例D-1-5

[3-壬基十二烷酸的合成]

[化57]

将根据制造例D-1-4记载的方法得到的3-壬基十二烷酸乙酯(6.3g，17.7mmol)溶于水饱和的丁醇溶液(80ml)，添加KOH(10g，177mmol)加热回流4.5小时。加入1N盐酸并用乙醚萃取2次。向有机层中加入无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩。用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)精制得到的残余物，即制得3-壬基十二烷酸(6.3g，99％)的无色透明液体。

无色油状物；FT IR(neat)2925，2854，1709cm^-1；¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.6Hz)，1.26(32H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.16，22.73，26.52，29.38，29.65，29.89，31.95，33.79，34.87，39.00，179.94；CIMS m/z(％)326(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₁H₄₂O₂(M⁺)326.3129，实测值326.3157.

制造例D-2

[3-辛基十一烷酸的合成]

[化58]

起始化合物使用辛酸代替制造例D-1-1记载的癸酸，并使用1-溴辛烷代替制造例D-1-2记载的1-溴壬烷，各步骤中制造的化合物用于后续步骤，采用与制造例D-1-1至D-1-5记载的方法相同的方法来合成，制得3-辛基十一烷酸。

无色油状物；FT IR(neat)2926，2855，1712cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)d 0.88(6H，t，J＝6.6Hz)，1.26(28H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)d 14.16，22.71，26.52，29.34，29.61，29.89，31.93，33.80，34.88，38.94，179.58；CIMS m/z(％)298(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₁₉H₃₈O₂(M⁺)298.2876，实测值298.2874.

制造例D-3

[3-癸基十三烷酸的合成]

[化59]

起始化合物使用十一烷酸代替制造例D-1-1记载的癸酸，并使用1-溴癸烷代替制造例D-1-2记载的1-溴壬烷，各步骤中制造的化合物用于后续步骤，采用与制造例D-1-1至D-1-5记载的方法相同的方法来合成，制得3-癸基十三烷酸。

无色油状物；FT IR(neat)2935，2857，1711cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.6Hz)，1.26(36H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.15，22.72，26.51，29.38，29.66，29.88，31.94，33.78，34.86，38.95，179.79；CIMS m/z(％)354(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₃H₄₆O₂(M⁺)354.3498，实测值354.3503.

制造例D-4

[3-十一烷基十四烷酸的合成]

[化60]

起始化合物使用十二烷酸代替制造例D-1-1记载的癸酸，并使用1-溴十一烷代替制造例D-1-2记载的1-溴壬烷，各步骤中制造的化合物用于后续步骤，采用与制造例D-1-1至D-1-5记载的方法相同的方法来合成，制得3-十一烷基十四烷酸。

无色固体；FT IR(neat)2923，2853，1707cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.26(40H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.17，22.74，26.53，29.40，29.69，29.72，29.89，31.96，33.79，34.88，38.98，179.82；CIMS m/z(％)382(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₅H₅₀O₂(M⁺)382.3811，实测值382.3816.

制造例D-5

[3-十二烷基十五烷酸的合成]

[化61]

使用根据制造例D-5-4记载的方法得到的3-十二烷基十五烷酸乙酯来代替制造例D-1-5记载的3-壬基十二烷酸乙酯，并采用与制造例D-1-5相同的方法制得3-十二烷基十五烷酸。

起始化合物使用十三烷酸代替制造例D-1-1记载的癸酸，并使用1-溴十二烷代替制造例D-1-2记载的1-溴壬烷，各步骤中制造的化合物用于后续步骤，采用与制造例D-1-1至D-1-5记载的方法相同的方法来合成，制得3-十二烷基十五烷酸。

无色固体；FT IR(neat)2928，2854，1709cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.6Hz)，1.26(44H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.15，22.72，26.51，29.39，29.68，29.71，29.88，31.96，33.78，34.86，39.00，180.00；CIMS m/z(％)410(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₂₇H₅₄O₂(M⁺)410.4066，实测值410.4095.

制造例D-6

[3-十四烷基十七烷酸的合成]

[化62]

起始化合物使用十五烷酸代替制造例D-1-1记载的癸酸，并使用1-溴十四烷代替制造例D-1-2记载的1-溴壬烷，各步骤中制造的化合物用于后续步骤，采用与制造例D-1-1至D-1-5记载的方法相同的方法来合成，制得3-十四烷基十七烷酸。

无色固体；FT IR(neat)2915，2849，1704cm^-1；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.88(6H，t，J＝6.9Hz)，1.26(52H，m)，1.85(1H，m)，2.27(2H，d，J＝6.9Hz)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ14.15，22.73，26.52，29.41，29.73，29.90，31.96，33.78，34.88，38.99，179.72；CIMS m/z(％)466(M⁺)；HRMS(CI⁺)m/z计算为C₃₁H₆₂O₂(M⁺)466.4685，实测值466.4717.

[其他化合物的合成]

与上述制造例相同，制得实施例16至22的化合物。这些化合物是本发明的式(1)所表示的化合物中，X、X’、n及n’为下述表1所示的化合物。

[化63]

[表1]

	X	n	X’	n’
					实施例16	苯基	0	苯基	0
实施例17	萘基	0	萘基	0
					实施例18	环己基	0	环己基	0

实施例19	环庚基	0	环庚基	0
					实施例20	CH(C₁₄H₂₉C₁₆H₃₃)	0	CH(C₁₄H₂₉C₁₆H₃₃)	0
实施例21	C₁₄H₂₉	0	C₁₄H₂₉	0
					实施例22	C₁₆H₃₃	0	C₁₆H₃₃	0
实施例23	CH(C₁₂H₂₄OCH₃)₂	0	CH(C₁₂H₂₄OCH₃)₂	0
					实施例24	CH(C₁₃H₂₆OH)₂	0	CH(C₁₃H₂₆OH)₂	0

[生理活性的测定]

对本发明的化合物进行以下试验以测定活性。

在下述表2中示出本发明的实施例化合物的实施例编号、制造例编号及其化学结构式。实施例化合物是在本发明式(1)所表示的化合物中，X、X’、R₁、R₁’、R₂、R₂’、n及n’表示如下的化合物。

[化64]

[表2]

此外，在试验中，将来源于结核菌的已知天然化合物TDCM作为阳性对照(positive control)使用。需要说明的是，TDCM以下述化学结构式表示。

[化65]

试验例1(活化巨噬细胞的能力的测定)

试验例1(1)<使用荧光强度测定装置测定小鼠腹腔巨噬细胞释放的活性氧>

<磷酸缓冲液(PBS)的配制>

将氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g、磷酸二氢钾0.2g用1000ml蒸馏水(D.W.)溶解。

<小鼠腹腔巨噬细胞的配制>

将5％硫代乙醇酸(thioglycolic acid)培养基(DIFCO，BD，CODE.225640，LOT.6192372)3ml施用至小鼠(ICR小鼠(SPF)、5周龄、雄性)腹腔。施用4日后，用乙醚使小鼠致死。在腹部中央的表皮处用剪刀剪出小缺口，抓住腹部以剥去腹部表皮。用装有26G针的10ml针筒，将含有0.05％EDTA的PBS(-)(EDTA 2Na，已测核酸酶(Nuclease)及蛋白酶(Protease)，Nacalai Tesque(公司名))5ml全部注入其腹腔内。然后，抓住腹部侧边，按摩40～50次左右，并用23G针筒将腹腔内部的液体缓缓采集至小离心管内，重复该操作2次。将采集的巨噬细胞以1000rpm离心8分钟，倒去上清液，并用RPMI1640培养基(RPMI-1640、含L-谷氨酰胺及酚红(phenol red)、和光制造、189-02025、LOT.WRM8043，其中含有10.61％灭活血清(Bio West)和1％青霉素链霉素(penicillin streptomycin)(GIBCO))使沉淀物混悬。用RPMI1640培养基装满离心管，再次以1000rpm离心8分钟。倒去上清液，并用RPMI1640培养基混悬后，用One Cell Counter(和研药制)计数巨噬细胞的数目。使用RPMI-1640培养基，稀释至任意的预定浓度，并将得到的小鼠腹腔巨噬细胞用于以下的试验。

<40mM试验化合物溶液的配制>

40mM试验化合物溶液以下述方式配制。

在大试管中称量BSA0.7g。加入灭菌PBS(-)10ml，充分搅拌后，使用LPS去除柱(Endo Trap(商标)red 1/1(Proofs))除去BSA溶液中含有的杂质。然后，将处理的BSA溶液用灭菌过滤器(0.2μm)过滤。接着，使用Nano Drop ND-1000进行蛋白定量，用灭菌PBS(-)稀释至使最终浓度为2％。将称量的试验化合物与2％BSA(将2％BSA溶于PBS(-)形成的溶液)250μL一并加入至均质机(homogenizer)内，并在加入于均质机的状态下采用水浴式(bath type)超声波装置处理150秒。将根据所述方式配制的溶液移至微离心管(Eppendorf tube)，用于以下试验。作为阳性对照，使用TDCM作为试验化合物，采用同样方法配制；此外，作为阴性对照(negative control)则不加入任何试验化合物并采用同样方法配制。不含试验化合物的配制液，以下称为“赋形剂”(vehicle)。

<汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt，HBS)的配制>

将氯化钾0.4g、磷酸二氢钾0.06g、磷酸氢二钠0.107g及氯化钠8g用蒸馏水(D.W.)溶解后，用1N氢氧化钠调节至pH7.4，再用蒸馏水(D.W.)使溶液总量达到1000ml，配制成汉克平衡盐溶液(HBS)。

<含有葡萄糖及BSA的汉克平衡盐溶液(HBSG-BSA)的配制>

将葡萄糖0.1g及BSA(Sigma)0.03g溶于上述配制的HBS 100ml，配制成含有葡萄糖及BSA的汉克平衡盐溶液(HBSG-BSA)(用时配制)。

<测定巨噬细胞释放的活性氧>

小鼠腹腔巨噬细胞、40mM试验化合物溶液及含有BSA的汉克平衡盐溶液(HBSG-BSA)采用与上述相同的方法配制。

用HBSG-BSA将巨噬细胞清洗后，用5ml左右的HBSG-BSA将其混悬，然后以每孔100μL分别注入至96孔的胶原质孔板(collagen well，TC-PLATE 96WELL，无菌，有盖，IND PACKED)中，于37℃培养1小时，使细胞布满加样孔。倒去上清液，加入HBSG-BSA 100μL，再添加10mM的H₂DCFDA(2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate、Invitrogen)1μL。于37℃培养1小时，倒去上清液后，添加含有试验化合物的HBSG-BSA或作为阴性对照的赋形剂，使试验化合物的最终浓度为50μM，1小时后用Genios荧光强度测定装置测定活性氧量。

需要说明的是，上述H₂DCFDA为荧光探针，其在过氧化氢(H₂O₂)的存在下荧光强度增加，因此可通过测定荧光强度来测定过氧化氢(H₂O₂)的产量。过氧化氢(H₂O₂)为巨噬细胞产生的超氧化物(O^2-)所衍生的物质，可将过氧化氢(H₂O₂)产量作为指标来表示巨噬细胞的活化度。

测定结果示于图1。

图1<小鼠腹腔巨噬细胞的活性氧释放量>

如图1所示，本发明的所有试验化合物均显示出与TDCM同等或更高的促进小鼠腹腔巨噬细胞产生活性氧的作用。尤其是，在本发明化合物中，实施例1的化合物及实施例9的化合物显示出超过TDCM 2倍的高活性。

试验例1(2)<小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定>

小鼠腹腔巨噬细胞、40mM试验化合物溶液及RPMI 1640培养基采用与上述相同的方法来配制。

以下，荧光微珠(fluorescent beads)使用Fluoresbrite(商标)羧酸盐微球(Carboxylate Microspheres，2.58％，固体乳胶)YG(Polysciences公司)。

在TC板(细胞培养板，TC-PLATE 24孔，无菌，有盖，IND PACKED，greiner bio-one)上添加巨噬细胞，以使其80％汇合(80％confluent)。于37℃培养2小时后，倒去上清液，并用500μL的RPMI 1640培养基再次清洗细胞。将下述表3表示的各组合物加至TC板上，于37℃培养2小时后，倒去上清液后，用300μL的灭菌PBS(-)清洗细胞。为了除去未植入的荧光微珠，重复该清洗操作2次。用200μL的灭菌PBS(-)剥去巨噬细胞，并将巨噬细胞移至微离心管。以1,500rpm离心8分钟后，除去上清液，用100μL的灭菌PBS(-)使其充分混悬。再次以1,500rpm离心8分钟后，倒去上清液，用100μL的灭菌PBS(-)使其充分混悬。

使用FUJIFILM FLA-2000来测定混入至细胞内的荧光微珠的数量[荧光强度(Fluor 473nm，Y520 Filter)]，分析则使用Image Reader V1.4J。

[表3]

	1	2
			试验化合物(最终浓度50μM)	-	0.45
LPS(-)2％BSA的PBS溶液	0.45	-
			荧光微珠(2.0×10⁷个/mL)	100	100
RPMI 1640培养基	199.5	199.5

测定结果示于图2。

图2<小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力>

如图2所示，本发明的所有试验化合物均显示出与TDCM同等或更高的活化小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的作用。尤其是，在本发明化合物中，实施例1的化合物及实施例9的化合物显示出相当于TDCM活性约2倍的高活性。

试验例2(中性粒细胞活化能力的测定)

<兔子中性粒细胞混悬液的配制>

汉克平衡盐溶液(HBS)、含有葡萄糖及BSA的汉克平衡盐溶液(HBSG-BSA)采用与试验例1(1)相同的方法来配制。

<柠檬酸-葡萄糖溶液(ACD液)的配制>

将柠檬酸钠6.25g、柠檬酸3.125g及葡萄糖5g用蒸馏水(D.W.)250ml溶解，使用前于4℃条件下保存。

<红细胞溶解溶液(LYSIS液)的配制>

将EDTA 0.037g、碳酸氢钠1g及氯化铵8.3g用蒸馏水(D.W.)1000ml溶解，使用前于4℃条件下保存。

<磷酸缓冲液(PBS)的配制>

采用与试验例1(1)相同的方法来配制。

<1.2％葡聚糖(dextran)-PBS溶液的配制>

将葡聚糖T500(Pharmacia)1.2g用蒸馏水(D.W.)100ml溶解，用灭菌釜(autoclave)(121℃、20分钟)灭菌，使用前于4℃条件下保存。

<兔子中性粒细胞混悬液的配制方法>

取5ml ACD液置于20ml针筒(注射针筒[NIPRO])，将针筒内均匀润湿。用针筒从兔子耳廓(ear auricle)中心动脉采集血液20ml，徐徐倒转混合后，分别注入3支离心管(15ml型：Falcon)内，于4℃下以1,500rpm离心5分钟后，将上清液回收至离心管(50ml型：Falcon)中。添加与回收的上清液等量的1.2％葡聚糖-PBS溶液并缓缓倒转混合后，于室温下放置30分钟以上。确认界面，将上清液倒入至新的离心管(50ml型：Falcon)。向剩余溶液中加入等量的1.2％葡聚糖-PBS溶液并缓缓倒转混合后，于室温下放置30分钟以上。确认界面，将上清液倒入至离心管(50ml型：Falcon)。将回收的上清液于4℃下以2,000rpm离心10分钟后，除去上清液。在沉淀物中加入LYSIS液15ml，静静地使其混悬后，再加入LYSIS液5ml倒转混合，放置于冰中5分钟。用HBSG-BSA使全部液量成为50ml，于4℃下以2,000rpm离心10分钟后，倒去上清液。用HBSG-BSA2ml使沉淀物混悬，并将该细胞混悬液稳稳地叠层于Lymphoprep[Nycomed，808068]2ml(离心管、15ml型)的上层，以1200rpm离心20分钟后(离心机条件：accel 0.5、break Off)，用抽吸器(aspirator)抽去上清液。为了除去残留的Lyphoprep，使沉淀物(中性粒细胞)混悬于HBSG-BSA中，再次以1,500rpm离心5分钟后，倒去上清液。用HBSG-BSA使中性粒细胞混悬，并使用细胞数计测装置“celltac”[日本光电]来测定细胞数目。

<试验化合物的乳液(emulsion)的配制>

试验化合物及TDCM的乳液采用与试验例1(1)相同的方法来配制。

<10mM H₂DCFDA(2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(分子探针)的配制>

将4.86mg H₂DCFDA用1ml DMSO溶解。

试验例2(1)

<兔子中性粒细胞的活性氧释放量的测定>

按照下述步骤来测定对兔子中性粒细胞释放活性氧的影响。

于96孔的培养板(Falcon)上接种中性粒细胞(1.0×10⁵个/100μL)。向其中添加10mM H₂DCFDA 1μL，于37℃下培养1小时。为了除去多余的H₂DCFDA，加入HBS 300μL并使其混悬后，以8,000rpm离心5分钟。倒去上清液并用HBS使其混悬后，再添加HBS使最终浓度成为50μM。将其于37℃下培养2小时后，用荧光测定装置测定活性氧释放量(Ex：485nm，Em：535nm)。

结果示于图3。

图3<兔子中性粒细胞的活性氧释放量>

如图3所示，本发明化合物大致显示出与TDCM相同或更高的活化兔子中性粒细胞释放活性氧的作用。尤其是，在本发明化合物中，实施例1的化合物显示出相当于TDCM活性约2倍的活性。

试验例2(2)

<兔子中性粒细胞吞噬能力的测定>

(2)耐氨苄青霉素(ampicillin)大肠杆菌及调理化(opsonization)大肠杆菌的制作方法

<L-BROTH的配制>

将色氨酸(tryptophan)10g、NaCl 5g、酵母提取物5g及MgSO₄ 1ml溶于1L蒸馏水(D.W.)。

<调理化试剂的配制>

将10mg的调理化试剂(BioParticles Opsonizing Reagent(分子探针))用500μL超纯水溶解。

<耐氨苄青霉素大肠杆菌的制作>

将电穿孔(electroporation)用细胞(JM109)用冰溶解，为了将氨苄青霉素抗性基因(ampicilin resistance gene)导入至大肠杆菌，在JM109中加入2μL氨苄青霉素抗性质粒(plasmid)(pT7BLUE，Novagen，100ng/μL)并使其混悬，将该混悬液移至电穿孔用液槽(cuvette)，施加脉冲(2.5kV，200Ω，25mF)。将施加脉冲后的菌液移至添加有1ml L-broth培养基的5ml试管中，于37℃培养3小时。将该溶液涂布在含0.005％氨苄青霉素的L-broth琼脂培养基上，于37℃下培养过夜(分散于培养基上之前，以3,500rpm进行离心5分钟后，倒去上清液800μL，并使沉淀物混悬后，分散于培养皿上)。次日将培养皿上生成的菌取下少量，溶解于2ml的L-broth培养基，进行搅拌培养约4小时。

<调理化大肠杆菌制作方法>

将上述制作的耐氨苄青霉素大肠杆菌溶液100μL与已溶解的调理化试剂100μL混悬于微离心管内。将所得的混悬液于37℃培养1小时，用300μL PBS将该混悬液混悬后，以1200G离心15分钟，除去上清液。然后，用300μL PBS将所得的液体混悬后，再以1200G离心15分钟并除去上清液，重复2次。将1μL菌液加入至100μL L-broth，使其充分混悬后稀释100倍。将稀释100倍的菌液添加至10μL的细胞计数器(onecell counter)，利用显微镜计数菌数。

<兔子中性粒细胞吞噬能力的测定>

将根据上述方法配制的中性粒细胞1.0×10⁵个分别取至微离心管内并用HBS混悬后，用50μM试验化合物的乳液或TDCM的乳液处理1小时。对照样品采用2％BSA溶液以同样方式进行。加入300μL的HBS混悬，以1200G离心10分钟后，除去上清液。然后，将300μL的HBS加入至所得的液体中混悬，以1200G离心10分钟后，除去上清液。将1.0×10⁷个细胞的调理化耐氨苄青霉素大肠杆菌充分混悬于处理的中性粒细胞后，于37℃培养1小时。除去多余的大肠杆菌后，添加0.5％Triton X-100(生理盐水中)100μL，充分混悬，于37℃培养30分钟。接着，为了确定已混入因Triton X-100处理而破坏的中性粒细胞内部的大肠杆菌的数量以进行比较，将Triton X-100处理溶液全部洒在含有0.005％氨苄青霉素的普通琼脂培养基上，用菌液涂抹棒(bacteria spreader)使其全部分散。于37℃培养24小时，计数混入中性粒细胞内部的大肠杆菌的菌落数。

结果示于图4。

图4<兔子中性粒细胞的吞噬活性>

如图4所示，本发明化合物均显示出使兔子中性粒细胞的吞噬能力活化的作用。尤其是，在本发明化合物中，实施例1的化合物显示出相当于TDCM活性约2倍的活性。

试验例3

<测定经试验化合物处理的小鼠腹腔巨噬细胞释放的细胞因子>

小鼠腹腔巨噬细胞、40mM试验化合物溶液及RPMI 1640培养基采用与上述相同的方法配制。

于TC板上添加巨噬细胞，以使其80％汇合(80％confluent)。于37℃培养2小时后，倒去上清液，用500μL的RPMI 1640培养基清洗细胞，并重复该清洗操作2次。将试验化合物(最终浓度100μM)的乳液与巨噬细胞反应，2小时后将培养基移至其他的微离心管。以10,000rpm离心10分钟后，再将上清液移至其他的微离心管，并以该上清液为样品，使用ELISA试剂盒(IL-6，TNF-α Quantikine Immunoassay(R&D Systems(商标))分析释放的细胞因子。

对于从小鼠腹腔巨噬细胞释放的IL-6而言，在使用作为阴性对照的赋形剂情况下，IL-6的释放约为15pg/ml的值。与之相比，本发明化合物中，特别是据认为活性高的实施例1的化合物显示出约200pg/ml的活性。此外，对于从小鼠腹腔巨噬细胞释放的TNF-α而言，在使用作为阴性对照的赋形剂时约为80pg/ml，实施例1的化合物则显示出约1000pg/ml的活性。

试验例4

<测定经试验化合物处理的THP-1细胞释放的IL-8的方法>

RPMI培养基溶液采用与上述相同的方法配制，并使用该溶液，按下述方法配制试验化合物的RPMI培养基溶液。

通过超声波处理约1分钟将试验化合物1.0mg溶于25μL的DMSO中。将得到的40mM试验化合物原液添加至100μL的RPMI培养基中，以使其成为50μM(最终浓度)，并以超声波处理5秒钟。作为对照的赋形剂则仅用溶剂代替40mM的试验化合物原液以相同的量添加至RPMI培养基中，并以超声波处理5秒钟。

将THP-1细胞(购自理研BioResource Center细胞库)添加至RPMI培养基，使其密度达到1.0×10⁶个/100μL，并各以100μL分配至无菌微离心管。将如上所配制的试验化合物的RPMI培养基溶液100μL进行超声波处理5秒钟后，将全部溶液添加至已分注细胞的微离心管中。2小时后，将反应完的微离心管以5,000rpm离心5分钟，利用ELISA试剂盒(人IL-8 ELISA试剂盒(R&D Systems(商标))测定上清液中IL-8的释放量。

试验结果示于图5。

对本发明化合物中特别是据认为免疫赋活活性很高的化合物进行了测定，发现，如图5所示，实施例1的化合物及实施例9的化合物显示出相对于TDCM活性约0.6倍、约0.8倍的活性。

试验例5

<测定被施用过试验化合物的小鼠的末梢血中的释放的IL-6、TNF-α、IFN-γ>

按下述方法配制试验化合物的乳液。

以下，试验化合物是指制造例α-1至8中合成的化合物、制造例β-1至7中合成的化合物及作为比较例的TDCM。

称量试验化合物(100μg/小鼠)，并使用微量匙(microspatula)将全部量置于均质机(WEATON USA，10ml)的底部。滴入1滴矿物油(Nacalai Tesque)，均质化后以水浴式超声波进行处理150秒。接着，将含有1.1％吐温80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯，Nacalai Tesque)与5.6％甘露醇(mannitol)的生理盐水1.0ml添加至均质机内。进行均质化数次，将溶解有试验化合物的矿物油与溶剂充分混合，再将制得的溶液移至微离心管，于62℃进行巴氏杀菌30分钟。

将均质机预先浸渍于冰中3分钟。将各为1.0mg的试验化合物分别取至均质机内，添加矿物油并以超声波进行处理150秒。确认油变黏稠后，向其中加入1.0ml生理盐水(含有1.1％吐温及5.6％甘露醇)，进行均质化约1分钟。将样品移至微离心管，于62℃巴氏杀菌30分钟。

通过静脉注射对小鼠施用如上所配制的试验化合物乳液(100μg/小鼠)，每组2只，2小时后进行心脏采血(肝素采血)。以10,000rpm离心10分钟后，仅使用血浆，用ELISA试剂盒(IL-6、TNF-α、IFN-γ Quantikine Immunoassay(R&D Systems(商标))测定各种细胞因子的量。

测定结果示于图6、图7、图8。

图6<小鼠血浆中IL-6浓度(PG/ml)>

图7<小鼠血浆中IFN-γ浓度(PG/ml)>

图8<小鼠血浆中TNF-α浓度(PG/ml)>

由图6可见，在被施用了本发明试验化合物的小鼠中可观察到血浆中IL-6浓度增加。特别是，本发明化合物中实施例1的化合物、实施例9的化合物，分别显示出相对于作为阳性对照的来自天然的公知海藻糖二酯化合物的TDCM约1.2倍、约1.5倍左右的高IL-6释放活性。实施例13的化合物及实施例14的化合物也分别显示出相对于TDCM约一半或是大约相同的活性。

由图7可见，在被施用了本发明试验化合物的小鼠中可观察到血浆中IFN-γ浓度增加。特别是，本发明化合物中实施例1的化合物及实施例9的化合物，均显示出相对于作为阳性对照的TDCM约1.5倍左右的IFN-γ释放活性，实施例13的化合物及实施例14的化合物也分别显示出相对于TDCM约一半或是大约相同的活性。

由图8可见，在被施用了本发明试验化合物的小鼠中可观察到血浆中TNF-α浓度增加。然而，与作为阳性对照的TDCM相比，即使是实施例1的化合物也只是显示出与TDCM相同程度的活性，而其他的本发明化合物基本上显示出相当于TDCM 1/2左右的活性。

试验例6

<施用产气荚膜梭菌(Welch bacillus)的小鼠的生存试验(实施例1的化合物)>

分别称量作为试验化合物的根据制造例α-1中记载的方法合成的化合物及TDCM各1mg，采用与上述相同的方法来配制试验化合物的乳液(1mg/ml)。

产气荚膜梭菌(Type A；NTCT8237)按下述方法配制。

<产气荚膜梭菌配制方法>

将脑心浸液(brain heart infusion，BHI)(DIFCO)粉末7.4mg溶于200ml蒸馏水中。用移液管(transfer pipette)吸取得到的溶液(以下将该溶液称为“BHI培养基”)40ml，加入至200ml烧瓶内进行高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。此外，将5ml BHI培养基加入至2支螺口试管，进行高压蒸汽灭菌，接着将附玻璃管橡皮塞(附绵塞)及玻璃管进行高压蒸汽灭菌。在超净工作台(clean bench)内，用灭菌的巴氏吸管(Pasteur pipette)采集庖肉培养基(cooked meat medium)上生成的保存用菌适量，将细菌接种于上述灭菌的螺口试管内的BHI培养基。然后，于37℃培养过夜。

在超净工作台内，将螺口试管内生成的菌(菌生长的超净工作台内变污浊并产生气体)移至已加入40ml BHI培养基的200ml三角烧瓶中，将玻璃管插入培养基内，进行氮气置换10分钟。接着，将附玻璃管橡皮塞(附绵塞)安装于三角烧瓶后(由于产气荚膜梭菌产生气体，有必要设置气孔)，于37℃培养4-5小时。将培养后的产气荚膜梭菌移至离心用试管，进行离心分离(9,000rpm，15分钟)，倒去上清液。在沉淀物中加入灭菌生理盐水20ml使菌混悬后，离心分离(9,000rpm，15分钟)，倒去上清液。向得到的沉淀物中添加灭菌螺口试管内的BHI培养基，用细胞计数器(One Cell公司制)计数菌数。

<施用产气荚膜梭菌的生存试验方法>

将小鼠(ICR、6周龄)分成3组，进行以下试验。

对每组4只的小鼠以各100μg/小鼠分别腹腔内施用含有试验化合物的乳液、含有TDCM的乳液或作为对照的乳液本身(仅为乳液时，以各100μL/小鼠)。3小时后，将产气荚膜梭菌(2.4×10⁷个细胞/小鼠)施用至小鼠腹腔内。之后，进行过程观察。

结果示于表4。

[表4]

施用产气荚膜梭菌后的小鼠生存率

如表4所示，对于施用作为本发明化合物的实施例1的化合物的小鼠，在产气荚膜梭菌致死模型(model)中，给药组的4只中有3只免于死亡。

试验例7

<施用产气荚膜梭菌毒素的小鼠生存试验(实施例1的化合物)>

采用与上述相同的方法配制试验化合物的乳液(1mg/ml)。

产气荚膜梭菌毒素按下述方法配制。

<产气荚膜梭菌毒素的配制方法>

将枯草菌α毒素基因转化体(transformant)在L-broth中搅拌的同时，于37℃培养14小时。随后，于4℃以8,000rpm离心20分钟，将培养上清液于冰冷却下搅拌，同时定时添加少量硫酸铵(硫安)(Nacalai Tesque)后，制成最终浓度为70％的饱和硫酸铵(472g/L)，并静置过夜。之后，于4℃以9,500rpm离心30分钟，将生成的沉淀物溶于0.02M TB(pH7.5)，用相同缓冲液于4℃透析过夜。透析后，于4℃以15,000rpm离心30分钟，将该上清液作为粗毒素(硫酸铵毒素)标准品。用1M NaCl-TB(pH 7.5)稀释所述粗毒素标品，使其最终浓度成为0.5M NaCl后，将粗毒素标准品施加至预先以0.5M NaCl-TB(pH7.5)平衡的铜螯合亲和柱(copper chelate affinity column)(1.5×9cm)内，接着，依次用各100ml的0.5M NaCl-TB(pH7.5)、0.5M NaCl-0.1M PB(pH6.5)、0.5M NaCl-0.02M乙酸盐缓冲液(pH4.5)，以及0.5M NaCl-0.1M PB(pH6.5)冲洗。接下来，用15mM L-组氨酸(histidine)(Nacalai Tesque)-0.5M NaCl-0.1MPB(pH6.5)100ml将柱中结合的毒素洗脱后，用针筒过滤器(DISMIC-ADVANTEC)过滤该洗脱液，然后，用超滤过滤器Amicon(商标)Ultra-15-3OK(Millipore)离心浓缩，并用0.02M TB(pH8.0)于4℃透析该浓缩液过夜，以15,000rpm离心30分钟后，施加至UNO(商标)Q-1 R COLUMn(BIO-RAD)中。在使0.02M TB(pH8.0)中的氯化钠浓度由0至0.05M呈线性变化，并且流速为1.0ml/min的条件下进行洗脱。在各洗脱(0.5ml)级分(fraction)中，收集在对抗α毒素血清的奥脱洛尼(Ouchterlony)反应中观察到沉降线，并在SDS-PAGE中含有相当于α毒素的约43KDa的单一谱带(band)的级分，并将其浓缩至约1.0ml。用0.02MTB(pH7.5)于4℃透析该浓缩液过夜后，再于4℃以15,000rpm离心30分钟，分取该上清液(重组α毒素)。所得的重组毒素用SDS-PAGE确认有无杂质后，使用前于-80℃下保存。

<施用产气荚膜梭菌毒素的生存试验方法>

将小鼠分成(ICR、6周龄)3组，进行以下试验。

对每组4只的小鼠以各100μg/小鼠分别腹腔内施用含有试验化合物的乳液、含有TDCM的乳液或作为对照的乳液本身(仅为乳液时，以各100μL/小鼠施用)。3小时后，将产气荚膜梭菌毒素(200ng/小鼠)施用至小鼠腹腔内。之后，进行过程观察。

结果示于表5。

[表5]

施用产气荚膜梭菌毒素后的小鼠生存率

如表5所示，对于施用作为本发明化合物的实施例1的化合物的小鼠，在产气荚膜梭菌毒素致死模型中，给药组的4只中有3只免于死亡。

试验例8

<施用绿脓杆菌的小鼠生存试验(实施例1的化合物)>

称量作为试验化合物的根据制造例α-1记载的方法合成的化合物1mg，采用与上述相同的方法来配制试验化合物的乳液。

使用来源于患者的绿脓杆菌(Fhu-071115菌株)，按下述方法配制绿脓杆菌。

<绿脓杆菌配制方法>

用移液管吸取L-broth 40ml，置于一200ml烧瓶中，塞上海棉塞。另外将5ml L-broth加入至其他2支螺口试管中。将该烧瓶及螺口试管在121℃置于灭菌釜20分钟。L-broth培养基冷却至室温后，在超净工作台内向40mlL-broth中加入保管于超低温冷藏库的绿脓杆菌，在培养室进行振荡(shaking)过夜。以9000rpm进行离心15分钟，倒去上清液。添加灭菌生理盐水20ml，利用涡流(vortex)混合器混合后，以9000rpm离心15分钟、倒去上清液，重复进行3次。添加灭菌生理盐水4.5ml，再使用涡流混合器混合，将其作为菌原液。使用稀释1000倍的菌液，用细胞计数器计数菌数后，将菌原液稀释至期望的浓度，以用于以下试验。

<施用绿脓杆菌的生存试验方法>

将小鼠分成2组，进行以下两种实验。

(A)对每组3只的小鼠(ICR、5周龄)腹腔内施用上述试验化合物的乳液(100μg/小鼠)，经过3小时后，再腹腔内施用绿脓杆菌(5.0×10⁷个细胞/小鼠)。之后，进行过程观察。(B)对每组3只的小鼠(ICR、5周齢)腹腔内施用绿脓杆菌(2.0×10⁷个细胞/小鼠)，经过3小时后，再腹腔内施用上述试验化合物的乳液(100μg/小鼠)。之后，进行过程观察。

结果示于表6及表7。

[表6]

(A组)预先施用试验化合物后，再施用绿脓杆菌时的小鼠生存率

如表6所示，在施用绿脓杆菌前预先施用试验化合物的A组中，3只中有2只免于由绿脓杆菌引起的死亡。感染初期未观察到与对照组之间有太大的变化，但约8小时后开始小鼠呈现逐渐可以行走的状态。

[表7]

(B组)施用绿脓杆菌后施用试验化合物时的小鼠生存率

如表7所示，在施用绿脓杆菌后施用试验化合物的B组中，3只中有1只免于由绿脓杆菌引起的死亡。

试验例9

<THP-1细胞的细胞因子释放>

通过ELI SA法测定用实施例9得到的试验化合物处理的、来自人单核细胞白血病(monocytic leukemia)细胞的THP-1细胞的各类细胞因子及趋化因子(chemokine)的释放量。此外，使用来自人肺癌细胞的A549细胞及来自人结肠癌细胞的DLD-1细胞，进行相同的分析。

<THP-1细胞的培养方法>

(1)血清的批量核对(lot check)

在超净工作台内将培养的THP-1细胞移至15ml离心管内。将细胞以1,000rpm于20℃离心5分钟后，倒去上清液。将该沉淀物分别混悬于RPMI1640(含10％批量核对用FBS)培养基1ml中，使用血球计(hemocytometer)(萱垣医理科工业)与盖玻片(cover glass)(三商)计数细胞数后，用培养基稀释至2.5×10⁵个细胞/ml。将细胞混悬液各0.5ml分别注入至用于悬浮培养的多孔细胞培养板(MULTI WELL PLATE)(SUMILON)的24孔中，每日1次观察细胞的增殖或形态。2～3日后用培养基将培养液稀释100倍，取4μL用计数板计数细胞数，并比较增殖的优劣。将增殖及形态良好的细胞从加样孔回收，并用相同培养基清洗后，再稀释至2.5×10⁵个细胞/ml，加入1ml至用于悬浮培养的多孔细胞培养板(SUMILON)的六孔，于37℃、5％CO₂的条件下培养。每隔24小时更换培养基，将每个培养板以1,800rpm离心(TOMY)5分钟后，徐徐倒去培养基，重新添加培养基1ml。更换培养基的操作进行2次。自第3天以后，更换培养基后，将细胞稀释100倍，用计数板计数，测定增殖程度。之后，进行此操作数日，选择增殖或形态良好的培养基。

(2)血清的灭活与分别注入

将在4℃解冻的胎牛血清(Fetal bovine serum)(FBS)(Biowest)500ml于56℃一边持续搅拌，一边培养30分钟，进行灭活。然后，在超净工作台内，将血清不经过滤，以各30ml分别注入至50ml离心管，并保存于-80℃。使用前预先于4℃解冻。

(3)RPMI 1640培养基(10％灭活FBS+1％青霉素链霉素(Penicillin Streptomycin))

在超净工作台内，向RPMI 1640液体培养基(Wako)500ml中添加灭活的FBS 60ml与用Acrodisc 25mM针筒过滤器(Pall公司)过滤的青霉素链霉素(GIBCO)5.6ml，并混合以使其均匀。制作完成的培养基不经过滤直接使用。于4℃进行保存，使用前预先使其恢复至室温。

(4)细胞的继代培养(subculture)

将THP-1细胞在75cm²的悬浮培养用烧瓶(SUMILON)(增殖90％以上)内培养，观察形态及增殖。在细胞形状良好、增殖快速的情况下，将细胞混悬液移至新烧瓶、或在使用中的烧瓶中添加约2倍量的新培养基，进行继代培养。而在增殖迟缓的情况下，则原封不动观察其过程或添加等量的新培养基，进行继代培养。

(5)细胞的保存

将在75cm²的悬浮培养用烧瓶(增殖90％以上)内培养的细胞10～15ml移至离心管，以1,000rpm离心5分钟，倒去上清液。向该沉淀物中加入细胞冷冻保存液(Cell banker，日本全药工业)1ml，使其混悬，并分别注入至血清管(serum tube)，保存于-80℃。

(6)保存细胞的再培养

将于-80℃下冷冻的细胞用37℃水浴快速解冻。立即将细胞保存液添加至预先加有9～10ml的RPMI 1640培养基的15ml离心管中，倒转混合。以1,000rpm离心5分钟后，倒去上清液，用10ml新培养基再使其混悬，将细胞混悬液移至75cm²的悬浮培养用烧瓶中。然后，加入新的培养基使其全部量成为20～30ml，于37℃、5％CO₂的条件下进行培养。

<ELISA试剂盒的试剂配制>

清洗液的配制

用超纯水(S.D.W.)将清洗液稀释25倍，于室温下使用。

标准底物液的配制

事先将标准底物液用稀释液600μL添加至2支微离心管(microtube)。将标准底物(2450pg/ml)用1ml标准底物液用稀释液溶解，转移100μL至微离心管中，溶解(350pg/ml)，再将其100μL添加至其他的微离心管，溶解(50pg/ml)，进行稀释。将标准底物液用稀释液作为对照使用(0pg/ml)。

显色液的配制

将显色试剂(color reagent)A与显色试剂B等量混合，并向其添加“100μL/孔×待测的加样孔数”的量的显色液。所述显色液在使用前15分钟以内预先配制。

<样品测定>

将使用的ELISA试剂盒的试剂回升至常温，于各加样孔中加入各种浓度的标准底物液及分析缓冲液(assay buffer)50μL，再进一步添加样品50μL。轻敲培养板1分钟，覆盖罩子于培养板上，于室温培养2小时。之后，用清洗液清洗5次(可使用抽吸器)，将配制的结合(conjugate)液向各孔内各添加100μL，覆盖罩子于培养板上，于室温培养2小时。之后，以清洗液清洗5次后，遮光的同时各添加显色试剂(color reagent)溶液A与B的混合液100μL，并将培养板于室温、暗处培养30分钟。最后各添加反应停止液100μL，于30分钟以内用酶标仪(microplate reader)(Molecular Devices spectra MAX 340PC)测定吸光度(450nm-550nm)。从标准底物液的直线图算出各样品的细胞因子释放量。

<实验方法>

在超净工作台内将培养的THP-1细胞移至50ml离心管，以1,000rpm于20℃离心5分钟后，倒去上清液。将该沉淀物混悬于新的无血清RPMI 1640培养基(Wako)1ml，并将10μL细胞混悬液加入至事先添加有无血清RPMI 1640培养基990μL的灭菌微离心管内，稀释100倍。用细胞计数板计数100倍稀释液4μL的细胞数，并用无血清RPMI 1640培养基将细胞混悬液稀释成1×10⁷个细胞/ml。取100μL的RPMI培养基至微离心管，添加40mM的试验化合物(实施例9)/DMSO溶液，以配成200μM，并施加超声波5秒钟。添加100μL的THP-1细胞(试验化合物的最终浓度为100μM)。于37℃培养2小时后，以5000rpm离心10分钟，将上清液取至其他的微离心管内，用ELASA试剂盒进行样品测定。

需要说明的是，作为阳性对照，使用6，6’-双-O-(2-十四烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖(以下称为“对照化合物A”)及TDCM作为试验化合物并进行相同测定。此外，作为阴性对照则不加入任何试验化合物，采用相同方法进行配制(赋形剂)。

<实验结果>

与阳性对照相比较，用实施例9的化合物处理的THP-1细胞的MIP-1β的释放很明显高出约8～10倍。此外，TNF-α的释放，与阴性对照细胞相比较几乎相等。结果示于图9。此外，对于实施例1所得的化合物，MIP-1β的释放与阳性对照相比可得更好的结果，但另一方面，TNF-α的释放与阴性对照相比则几乎相等(未显示数据)。

试验例10

<对THP-1细胞的细胞毒性研究及致突变性(mutagenicity)试验>

<使用台盼蓝(trypan blue)研究THP-1细胞的细胞毒性>

试剂的配制

0.3％台盼蓝/PBS(-)的配制

用PBS(-)100ml溶解0.3g台盼蓝(Nacalai)。

THP-1细胞的配制

在超净工作台内将培养的THP-1细胞移至50ml离心管，以1,000rpm于20℃离心5分钟后，除去上清液。将其沉淀物混悬于新的无血清RPMI 1640培养基(Wako)1ml内。将该细胞混悬液10μL加入至预先添加无血清RPMI1640培养基990μL的灭菌微离心管，稀释100倍。用血球计数板计数100倍稀释液10μL的细胞数，再用无血清RPMI 1640培养基将细胞混悬液稀释成1×10⁷个细胞/ml。

<实验方法>

向RPMI培养基100μL中添加试验化合物(实施例9)/DMSO溶液或DMSO，以配成200μM，进行超声波处理5秒钟。需要说明的是，作为阳性对照，使用6-O-(2-癸基十二酰基)-α-葡萄糖(以下称为“对照化合物B”)作为试验化合物并采用相同方法进行配制。此外，作为阴性对照则不添加任何试验化合物，采用相同方法进行配制(赋形剂)。向1.0×10⁷个细胞/ml中添加配制的THP-1细胞100μL，于37℃培养2小时或24小时。之后，加入0.3％台盼蓝/PBS(-)20μL并使其混悬后，立即用细胞数测定装置(CYRORECON)分析细胞的生存率。

<致突变性试验(AMES试验)>

试剂的配制

0.1M磷酸钠缓冲液的配制

将Na₂HPO₄ 5.68g溶解于200ml蒸馏水中，慢慢加入用蒸馏水100ml溶解NaH₂HPO₄·2H₂O的溶液，调节至pH7.4，进行高压蒸汽灭菌。

最小葡萄糖琼脂培养基的制作

(1)VB培养基将MgSO₄·7H₂O 0.4g、含水柠檬酸4g、K₂HPO₄ 20g、NaNH₄HPO₄·4H₂O 7g溶解于200ml蒸馏水中，进行高压蒸汽灭菌。

(2)将葡萄糖40g溶解于200ml蒸馏水中，进行高压蒸汽灭菌。

(3)将琼脂粉末30g混悬于1600ml蒸馏水中，进行高压蒸汽灭菌。

将(3)的试剂冷却至约60℃后，混合(1)与(2)的试剂，并以各约30ml洒于培养皿中。

上层琼脂培养基的制作

将琼脂粉末1.2g与NaCl 1g混悬于200ml水中，并进行高压蒸汽灭菌，然后移至50ml试管中。使用前混合20ml 0.5mM组氨酸/维生素H(biotin)溶液，于47℃保温。

用于培养伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的Oxoid营养肉汤(Nutrient Broth)培养基的配制

将Oxoid营养肉汤(Difco)2.5g溶于100ml蒸馏水，取5ml加入至螺口试管并进行灭菌。之后，接种TA98(伤寒沙门氏菌TA98)的菌液约10μL，于37℃振荡培养过夜，配制成菌混悬液。

S9MIX的配制

向1ml的S9中加入辅因子A mix(ORIENTAL YEAST)9ml。

标准致突变性物质的配制

4-NQO/DMSO的配制

将4-硝基喹啉N-氧化物(4-Nitroquinoline N-oxide)(4-NQO)(东京化成工业株式会社)0.3mg溶于10ml DMSO。

2-氨基蒽/DMSO的配制

将2-氨基蒽(ALDRICH)0.5mg溶于30ml DMSO中。

<实验方法>

对于要添加的化合物均准备2个微离心管，分别添加10μL的标准致突变性物质、实施例9的试验化合物、对照化合物B或TDCM。添加S9MIX或100mM磷酸缓冲液0.5ml后，加入菌混悬液100μL进行预先培养(preincubation)(37℃、振荡20分钟)。添加含组氨酸/维生素H的软琼脂(soft agar)(于47℃保温)2ml并轻轻混悬，将其洒于最小葡萄糖琼脂培养基上，进行培养(37℃、2天)。之后，计数His⁺的菌落数。

<实验结果>

为了研究对THP-1细胞的细胞毒性，通过台盼蓝染色对用实施例9所得的试验化合物处理2小时及24小时的THP-1细胞的生存率进行分析，结果，在用对照化合物B处理的细胞中观察到细胞毒性，但在用实施例9所得的化合物处理的细胞中，未观察到细胞毒性。结果示于图10。此外，对于实施例1所得的化合物，也得到同样显著的结果(未显示数据)。

进一步地，对实施例9所得的试验化合物在S9MIX的存在下及未存在下，进行了AMES试验，但所有试验化合物均未显示出致突变性。此外，在本分析条件下，标准物质(2-氨基蒽，4NQO)的致突变性为阳性(图11)。此外，对于实施例1所得的化合物，也得到同样显著的结果(未显示数据)。

试验例11

<向小鼠腹腔内的细胞浸润>

<PBS(-)溶液的配制>

将NaCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g、KH₂PO₄ 0.1g、KCl 0.1g溶于蒸馏水500ml，于121℃进行高压蒸汽灭菌20分钟。

<0.05％EDTA/PBS(-)溶液的配制>

将EDTA(Nacalai Tesque CODE.151-30)50mg溶于PBS(-)100ml后，使用0.2μm过滤器进行过滤灭菌。

<1mg/ml乳液的配制>

将NaCl 0.9g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)1.1ml及D(-)-甘露醇(Mannitol)5.6g溶于蒸馏水100ml，用0.2μm过滤器进行灭菌过滤。取实施例9所得的试验化合物1mg置于均质机(WEATON USA 10ml、As One(公司名))的底部，添加1滴矿物油，施加超声波2分钟，同时进行均质化。之后，加入1ml的1.1％吐温-5.6％甘露醇盐水，均质化直至液体呈白浊且均匀。将全部量的试验化合物溶液移至微离心管，于62℃处理30分钟进行低温杀菌。作为阳性对照，使用对照化合物A及TDCM作为试验化合物并采用相同方法配制。此外，作为阴性对照，则不添加任何试验化合物，采用相同方法进行配制(赋形剂)。

<腹腔内浸润细胞的回收>

将1mg/ml的试验化合物(实施例9)溶液施用至小鼠(ICR小鼠(SPF)(4周龄、雄性、体重：20～22g))腹腔内，施用量为100μg/小鼠。

2小时后或24小时后，用乙醚将腹腔施用试验化合物的小鼠致死。在腹部中央的表皮处用剪刀剪出小缺口，抓住腹部以剥去腹部表皮。用镊子将腹膜轻轻夹起，在不使针刺入内脏的前提下，将0.05％EDTA的PBS(-)溶液5ml用装有26G针的10ml针筒全部注入至腹腔内。之后，抓住腹部侧边，按摩40～50回左右。将腹腔内部的液体缓缓采集至小尺寸的离心管。再次重复该操作。将采集的细胞以1,000rpm离心10分钟。倒去上清液，用RPMI 1640培养基使沉淀物混悬。用RPMI 1640培养基装满离心管，再次以1,000rpm离心10分钟。倒去上清液，用RPMI 1640培养基使其混悬后，利用细胞计数盘计测细胞数。使用RPMI-1640培养基，稀释至任意浓度。

<细胞的吉姆萨染色(Giemsa staining)>

<1/15M磷酸钠缓冲液(pH6.4)的配制>

用250ml蒸馏水分别溶解NaH₂PO₄ 6.0g、Na₂HPO₄ 7.06g，测定磷酸氢二钠溶液的pH的同时添加磷酸二氢钠溶液，使其pH等于6.4，在灭菌釜中于121℃灭菌20分钟。

将1mg/ml试验化合物溶液施用至小鼠腹腔，施用量为100μg/小鼠，24小时后使用0.05％EDTA/PBS(-)回收浸润于腹腔内的细胞。之后，以1000rpm进行离心8分钟，倒去上清液。用100μL磷酸缓冲液使细胞混悬，载置于染色用载玻片上。确认水分蒸发后，在染色缸(staining vat)上滴梅-格二氏染色液(May-Grunwald stain solution)10～15滴，静置2～3分钟。不使梅-格二氏染色液流动的情况下，滴入磷酸缓冲液10～15滴，静置2～3分钟。添加适当量的吉姆萨染色液，静置30分钟。将载玻片翻面并用水冲过后干燥载玻片，并用显微镜进行观察。

<根据流式细胞术(flow cytometry)对小鼠腹腔内中CD8阳性细胞进行的分析>

试剂的配制

PBS(-)溶液的配制

采用与试验例11相同的方法来配制。

1mg/ml试验化合物(乳液)的配制

采用与试验例11相同的方法来配制。

0.05％EDTA/PBS(-)溶液的配制

将EDTA 2Na 50mg溶于100ml PBS(-)，在灭菌釜中于121℃进行灭菌20分钟。

0.5％BSA-0.05％EDTA/PBS(-)溶液的配制

将EDTA 2Na 50mg溶于100ml PBS(-)，在灭菌釜中于121℃进行灭菌20分钟。然后，在使用时将0.5％的BSA溶解于其中。

<实验方法>

对小鼠腹腔施用1mg/ml的试验化合物乳液(100μg/小鼠)，24小时后使用0.05％EDTA/PBS(-)以回收浸润于腹腔内的细胞。然后，将采集的腹腔细胞以300g离心10分钟后，倒去上清液，并用1ml 0.05％EDTA(用0.5％BSA/PBS溶解)使配制的腹腔细胞混悬。用流式细胞用筛(mesh)将细胞混悬液过滤，用100倍稀释的细胞混悬液测定细胞数。将各个样品的细胞调节至10⁷个细胞/样品后，以300g进行离心10分钟，倒去上清液。用100μL的0.05％EDTA(用0.5％BSA/PBS溶解)混悬，添加10μL的CD11B、CD4、CD8抗体(分别为FITC抗小鼠CD11B/Mac-1(BECKMAN)、FITC抗小鼠CD4(BECKMAN COULTER)、PE抗小鼠CD8a(BD Pharmingen))。于2-8℃、暗处，培养10分钟后，用1-2ml的0.05％EDTA(以0.5％BSA/PBS溶解)将细胞混悬，以300g离心10分钟后，倒去上清液。用1ml的0.05％EDTA(用0.5％BSA/PBS溶解)混悬后，使用流式细胞术分析。

<实验结果>

用PBS(-)1ml使细胞混悬。将Hemolynac(商品名)(溶血血红素试剂)100μL添加至细胞混悬液以破坏红细胞。之后，通过细胞测定装置(CYTORECON、GE Healthcare)来测定细胞数。

此外，将配制的细胞接种于24孔的胶原板(Greiner)上，培养2小时。然后，吸去上清液，重复用RPMI培养基来进行细胞清洗2次。加入RPMI培养基300μL，通过倒立显微镜来观察细胞。

结果，施用实施例9得到的试验化合物的小鼠的腹腔内，可观察到时间依赖性的浸润细胞增加，并且在处理24小时后，与赋形剂处理相比增加了15～20倍(图12)。

此外，为了进行浸润细胞的分析，采用根据吉姆萨染色的细胞形态观察及用单核细胞(monocyte)与巨噬细胞的抗原(CD11B)、淋巴细胞的抗原(CD4)、以及NK细胞的抗原(CD8)等各种抗体处理细胞，通过流式细胞术来进行分析。结果，施用实施例9所得的试验化合物24小时后，CD11B阳性细胞、CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的总数目，与赋形剂处理细胞相比，增加了15～20倍。然而，CD11B阳性细胞及CD4阳性细胞的存在比率，与赋形剂处理条件下相比，却几乎未观察到变化。另一方面，CD8阳性细胞的存在比率与赋形剂处理的小鼠相比，则增加了约2～3倍(图13～15)。

综上，通过实施例9的试验化合物的作用，发现在小鼠腹腔内吞噬细胞系的细胞聚集，其中，显示出NK细胞的比例较大。

试验例12

<对产气荚膜梭菌感染小鼠或绿脓杆菌感染小鼠的影响(实施例9的化合物)>

<产气荚膜梭菌配制方法>

庖肉(COOKED MEAT)培养基的配制(以下有时简称为“CM培养基”)

向螺口试管添加CM培养基(125mg/ml，D.W.)，煮沸15分钟以除去CM培养基内的空气。利用灭菌釜(121℃，20分钟)进行高压蒸汽灭菌，并冷却至室温。

脑心浸液(Brain Heart Infusion)(以下略称“BHI”)培养基的配制

将37mg的BHI培养基溶于100ml蒸馏水，加4.5ml至螺口试管，并加40ml至三角烧瓶，塞上海棉塞，用灭菌釜(121℃，20分钟)进行高压蒸汽灭菌后，冷却至室温。

菌的保存

将产气荚膜梭菌TYPE-A NCTC8237(PLC+)添加至制作完成的CM培养基中，于37℃培养2天，作为保存菌液于室温下保存。

菌的培养及菌液的制作

自各保存菌液中取出0.2ml的菌液并添加至4.5ml的前培养用BHI培养基内，于37℃培养过夜。将该培养液全部量添加至40mlBHI培养基内，进行氮气置换(10分钟)后，再次于37℃培养5小时。然后，将培养液移至50ml管内，进行离心分离(4℃，9000rpm，15分钟)。倒去上清液，添加生理盐水并充分清洗后，再进行离心分离(4℃，9000rpm，15分钟)以收集菌。重复该清洗2次。向其沉淀物中加入BHI培养基4.5ml，使其混悬。将该混悬液作为原液。将原液稀释1000倍，用灭菌釜(121℃，20分钟)进行高压蒸汽灭菌后，使用细胞计数器计测菌数。制作菌浓度为1×10⁸个细胞/ml的菌液，并用于实验。

<绿脓杆菌配制方法>

Luria-Bertani Broth培养基(L-Broth)的配制

将Bacto^TM胰蛋白胨(Tryptone)(Difco)10.0g、Bacto^TM酵母提取物(Yeast Extract)(Difco)5.0g及氯化钠(NaCl)(nacalai tesque)5.0g溶于蒸馏水，添加1M MgSO₄ 1.0ml，用1N NaOH调节至pH7.5，再用蒸馏水使全部液量为1,000ml后，用灭菌釜121℃高压蒸汽灭菌20分钟，并冷却至室温。

菌的保存

将绿脓杆菌(P.aeruginosa)0.2ml添加至L-broth 10ml中，于37℃培养过夜。向该培养液中添加灭菌丙三醇1ml，以涡流混合器进行混合。将菌液各300μL分别添加至灭菌微离心管中，于-80℃保存。

取各保存菌液0.2ml添加至40ml L-broth培养基内，于37℃培养一晚。然后，移至50ml管内，进行离心分离(4℃，9000rpm，15分钟)。倒去上清液，添加生理盐水并充分清洗后，再次进行离心分离(4℃，9000rpm，15分钟)以收集菌。重复该清洗2次。向该沉淀物中添加生理盐水4.5ml并使其混悬。将该混悬液作为原液，将原液稀释10000倍后的菌液用灭菌釜(121℃，20分钟)进行高压蒸汽灭菌后，使用细胞计数器计测菌数。制作菌浓度为1×10⁸个细胞/ml的菌液并用于实验中。

<实验方法：预先施用试验化合物>

对小鼠腹腔施用100μg/小鼠的试验化合物(实施例9)乳液，24小时后，再腹腔施用3.0×10¹⁰CFU/ml的绿脓杆菌或5.0×10⁷CFU/ml的产气荚膜梭菌，每隔2小时对小鼠进行观察。

<实验方法：后施用试验化合物>

对小鼠腹腔施用3.0×10¹⁰CFU/ml的绿脓杆菌，3小时后，再腹腔施用100μg/小鼠的试验化合物(实施例9)乳液。然后，每隔2小时对小鼠进行观察。

<实验结果>

如图16及17所示，用实施例9的试验化合物处理的小鼠的死亡很明显受到抑制。此外，感染绿脓杆菌3小时后再施用实施例9的试验化合物，结果，小鼠的死亡明显受到抑制(图18)。

试验例13

<败血症观察>

对小鼠腹腔施用100μg/小鼠的试验化合物(实施例9)乳液，24小时后，使其感染3.0×10¹⁰CFU/ml的绿脓杆菌。施用菌15小时后，用针尖添加有少许肝素的注射器进行心脏采血，将全血200μL接种于普通琼脂培养基上，在培养器内培养16小时。计数培养基上的菌落数。

菌数过多时，将全血用生理盐水稀释成10倍、100倍、1000倍及10000倍，并接种于普通琼脂培养基上。

结果，如图19所示，仅施用菌时、或施用菌及赋形剂时，在小鼠血液内检测出菌，但施用实施例9的试验化合物时，血液内未检测出菌。

试验例14

<抗肿瘤效果>

对小鼠腹腔施用实施例9中所得的试验化合物(乳液)100μg/小鼠，24小时后，在腹腔内接种乳腺癌细胞(FM3A细胞)。19日后测定小鼠的体重。此外，将横膈膜、胰脏及睾丸的组织切片进行苏木精-伊红染色(HE staining)后，利用显微镜进行观察。结果，接种乳腺癌细胞的小鼠与对照小鼠相比，体重增加约10g，并观察到大量的腹水。此外，在接种乳腺癌细胞的小鼠的横膈膜、胰脏及睾丸中，可观察到明显的癌细胞浸润及转移。另一方面，用实施例的试验化合物处理后再接种乳腺癌细胞的小鼠，其体重与对照小鼠相同，而且，完全未观察到癌细胞向各器官的浸润及转移(图20)。

本发明的海藻糖化合物具有优于TDCM或与TDCM相同程度的免疫赋活作用，同时，与TDCM相比，其毒性明显降低，可适宜作为药品使用。本发明化合物的毒性之降低，不仅是显示在模型小鼠中，也显示在人源细胞中。此外，也显示出本发明化合物的致突变性较低。

此外，将β羟基替换成氢原子，使用α-支链型或β-支链型脂肪酸(其中，支化的碳链(以式(1)的R₁、R₂、R₁′或R₂′表示的部分)碳数为7至20左右)，通过这样逐一合成这些化合物并进行试验，结果发现，在具有各种构造的海藻糖化合物中，碳数为10的α-支链型化合物以及碳数为9、13或14的β-支链型化合物的活性非常大。另外发现，通过将现有技术的酰胺键转化为酯键，也可抑制酰胺键所具有的诱发癌症的活性。

进一步地，本发明的海藻糖化合物在腹腔施用产气荚膜梭菌的小鼠中，降低了其致死率，从这点来看，该化合物即使在体内试验中也非常有用。此外，本发明的海藻糖化合物在腹腔施用由产气荚膜梭菌产生的毒素的小鼠中，也降低了其致死率，这个发现也是具有划时代意义的。进一步地，本发明的海藻糖化合物对小鼠腹腔内施用绿脓杆菌也具有优异的抗菌活性，由此发现其可降低所述细菌的致死率。

另外，关于其作用机理，当施用本发明的海藻糖化合物时，显示出增强中性粒细胞H₂O₂活性、中性粒细胞吞噬能力、巨噬细胞吞噬能力的效果，其暗示了所述抗感染性疾病作用是由巨噬细胞或中性粒细胞等细胞免疫的活化所赋予的。

上述试验结果暗示，本发明的海藻糖化合物活化了巨噬细胞或中性粒细胞等的细胞免疫，并且对由作为巨噬细胞或中性粒细胞的吞噬作用对象的细菌、病毒或真菌等引起的感染性疾病可普遍有效。在感染性疾病治疗中，使用抗生素时，必须明确作为对象的病原菌并选择适当的对所述病原菌具有抗菌作用的抗生素，而且，在会有耐药菌出现的风险并且已经出现耐药菌的情况下，必须另外选择适当的对所述病原菌具有抗菌作用的其他抗生素，与所述现有方法相比，本发明的方法具有简便并且可靠的优点。

进一步地，在现有技术的现状下，在抗生素对病毒并无效用，而只能施用疫苗(vaccine)来预防病毒感染时，本发明的海藻糖化合物也可能在提供对病毒的治疗药方面有用。

其中，在本发明的海藻糖二酯化合物中，特别是活性高的化合物具有约2倍于TDCM的活性，并且活性特别高的化合物具有约8倍～10倍的活性，并且毒性很低，该方面也显示出本发明的化合物特别有用。

进一步地，测定施用本发明的海藻糖化合物后的细胞因子应答，结果发现，IL-6、IFN-γ、TNF-α的释放均有增加的趋势。此外，进行体外(in vitro)试验与体内(in vivo)试验发现，本发明的化合物中，活性特别高的化合物在体外试验中可使所述细胞因子明显增加，但在体内试验中未使TNF-α的释放有大量增加。此外，在人源THP-1细胞的IL-8释放活性中，也发现本发明化合物中活性特别高的化合物，其活化能力不如TDCM强。而且，作为使用人源THP-1细胞、A549细胞、DLD-1细胞进行测定的结果，发现本发明化合物中活性特别高的化合物，显示出对THP-1细胞中释放MIP-1β具有显著的活性，但另一方面，未特别提高TNF-α的释放活性。

一直以来免疫活化都被视为非常重要，并且细胞因子或趋化因子的诱导对免疫活化是有用的。另一方面，如果使免疫过度活化，反而会有以过敏性休克(anaphylaxis shock)或变态反应(allergy)等为代表的过多的弊病。对于可成为引起所述过度活化炎症反应的因素的炎症性TNF-α或IL-8(已知为趋化因子)的释放，本发明的海藻糖化合物可在不使其活化过度的情况下，发挥其免疫赋活作用，因此导致免疫反应过度而产生炎症等副作用的可能性很低。另一方面，在免疫反应的一个过程中，会出现同时释放趋化因子等而使免疫细胞活化的必要情形，也存在根据感染的状况或被感染对象的身体状况等各种情况，需要有效释放大量细胞因子或趋化因子的情形。

如上所述，细胞因子或趋化因子根据其性质，会有优选大量释放的情形、不优选此类释放的情形、此类释放不是特别重要的情形，根据情况会有各种可能。但是，在优选释放IL-8或TNF-α的情形或是此类释放不是特别重要的情形下，可以以期望用量使用本发明的海藻糖化合物的特定种类以促进IL-8或TNF-α等的释放，或不有意抑制它们的释放。此类使用均在本发明的范围内。

进一步地，在施用本发明海藻糖化合物的接种乳腺癌细胞的小鼠中，发现可显著抑制癌细胞的增殖，并抑制其向其他器官的浸润或转移。显示出本发明化合物具有抗肿瘤活性。

因此，更明确地显示出本发明海藻糖化合物作为抗感染性疾病治疗剂及抗癌剂的有效性与安全性。

[工业上利用的可能性]

本发明提供的海藻糖化合物，其免疫赋活活性高且毒性低，因此可用于治疗由病原菌引起的感染性疾病。具体而言，通过使用本发明的海藻糖化合物，产生由施用抗生素时菌体破坏引起的毒素释放等的副作用的危险性较低，并可以提供对病原菌毒素本身具有毒性降低作用的药品。此外，通过使用本发明的海藻糖化合物，可以提供对多重耐药菌引起的感染性疾病也有治疗效果的药品。更进一步，本发明的化合物也可用于制造产生过度免疫应答等的危险性较低的药品。

此外，根据本发明的海藻糖化合物的制造方法，无需不对称合成，即可大量且有效率地合成本发明相关的海藻糖化合物。

Claims

1.一种由下式(1)表示的化合物，

[化1]

式(1)中，X为苯基、萘基或以R₁-CHR₂-表示的基团，X’为苯基、萘基或以R₁’-CHR₂’-表示的基团，

其中，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或C₁-C₂₁烷基；就R₁、R₁’、R₂和R₂’而言，各烷基中的氢原子可以被羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分也可形成4-8元环，而且，R₁及R₂、R₁’及R₂’可分别互相连接而形成4-8元环，且n及n’各自独立地是0至3的整数，

但排除以下化合物：

(1)X为R₁-CHR₂-，X’为R₁’-CHR₂’-，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或不具有取代基且直链的C₁-C₆烷基，且n及n’为0的化合物，以及，

(2)X为R₁-CHR₂-，X’为R₁’-CHR₂’-，R₁、R₁’、R₂及R₂’为C₁₄直链烷基，且n及n’为0的化合物。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，X为R₁-CHR₂-，且X’为R₁’CHR₂’-。

3.如权利要求2所述的化合物，其中，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₇-C₂₁烷基，且n及n’各自独立地是0或1。

4.如权利要求2所述的化合物，其中，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₈-C₁₆烷基，且n及n’为0。

5.如权利要求2所述的化合物，其中，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是直链C₉-C₁₄烷基，且n及n’为1。

6.如权利要求1所述的化合物，其中，R₁与R₁’相同，R₂与R₂’相同，且n与n’相同。

7.如权利要求1所述的化合物，其为下述化合物中的任一种化合物：

6，6’-双-O-(2-辛基癸酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-壬基十一酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-十一烷基十三酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-十二烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-十三烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-十五烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖或

6，6’-双-O-(2-十六烷基十八酰基)-α，α’-海藻糖。

8.如权利要求1所述的化合物，其为下述化合物中的任一种化合物：

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-癸基十三酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-十一烷基十四酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-十二烷基十五酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

9.如权利要求1所述的化合物，其为下述化合物中的任一种化合物：

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。

10.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-9中任一项所述的化合物及药理学上可容许的载体。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述药物组合物作为免疫赋活剂、巨噬细胞活化剂、中性粒细胞活化剂、用于活化吞噬细胞的吞噬作用的试剂、抗细菌感染剂、细菌毒素中和剂或抗癌剂使用。

12.权利要求1-9中任一项所述的化合物的用途，所述用途是用于制造作为免疫赋活剂、巨噬细胞活化剂、中性粒细胞活化剂、用于活化吞噬细胞的吞噬作用的试剂、抗细菌感染剂、细菌毒素中和剂或抗癌剂使用的药物组合物。

13.一种预防或治疗哺乳动物的感染性疾病或癌症的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的化合物，所述哺乳动物包括人。

14.一种细菌毒素中和剂，所述中和剂含有由下式(2)表示的化合物：

[化2]

式(2)中，X为苯基、萘基或以R₁-CHR₂-表示的基团，X’为苯基、萘基或以R₁’-CHR₂’-表示的基团，

其中，R₁、R₁’、R₂及R₂’各自独立地是氢原子或C₁-C₂₁烷基；就R₁、R₁’R₂、R₂’而言，各烷基中的氢原子可以被羟基或烷氧基取代，各烷基的全部或一部分也可形成4-8元环，而且，R₁及R₂、R₁’及R₂’可分别互相连接而形成4-8元环，且n及n’各自独立地是0至3的整数。

15.一种细菌毒素中和剂，所述中和剂含有下述任一化合物：

6，6’-双-O-(2-癸基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(2-十四烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-壬基十二酰基)-α，α’-海藻糖、

6，6’-双-O-(3-十三烷基十六酰基)-α，α’-海藻糖、或

6，6’-双-O-(3-十四烷基十七酰基)-α，α’-海藻糖。