KR20110082584A - 트레할로스 화합물, 그의 제조방법 및 그 화합물을 함유하는 의약 - Google Patents
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Abstract
[과제] 본 발명은 면역 부활 활성이 높고, 독성이 낮은 트레할로스 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[해결수단] 상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 이하의 화학식 1[화학식 중, X 및 X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2- 등을 나타내고, R1 및 R2는 각각 C7-C21 알킬기 등을 나타내며, n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수를 나타낸다.]로 표시되고, 본 발명의 화합물은, 마크로파지, 호중구에 대해 높은 활성화작용을 나타내는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
[해결수단] 상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 이하의 화학식 1[화학식 중, X 및 X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2- 등을 나타내고, R1 및 R2는 각각 C7-C21 알킬기 등을 나타내며, n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수를 나타낸다.]로 표시되고, 본 발명의 화합물은, 마크로파지, 호중구에 대해 높은 활성화작용을 나타내는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Description
본 발명은 트레할로스 화합물, 그의 제조방법 및 그 화합물을 함유하는 의약에 관한 것이다.
감염증으로서, 세균, 바이러스, 진균에 의한 감염증 등 각종의 것이 알려져 있다. 세균에 의한 감염증에 대한 치료법으로서는, 항생물질의 투여가 행해지고 있으나, 항생물질에 대한 내성균의 출현이 문제가 되고, 또한, 내성균이 원내감염되는 문제도 발생하고 있다. 또한, HIV 감염이나, 항암제 치료, 노인·어린이 등의 면역력 저하 상황에 있어서의 감염증으로서, 기회 감염증(opportunistic infection)이 발생하는 문제도 있다.
또한, O-157 등의 병원성 대장균이나 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae)에 의한 감염의 경우에는, 체내에서 베로 독소가 생산되어, 특히 저항력이 약한 노인이나 어린이에게 있어서는, 용혈성 요독증증후군을 병발하는 등 심각한 증상을 나타내는 경우가 있다. 이와 같은 감염증에 대해서는, 항생물질의 투여가 행해지는 경우도 있으나, 항생물질을 투여하여 세균이 사멸되고, 세균 내부의 독소가 한번에 균 외부로 방출됨으로써, 도리어 상태가 악화될 위험성이 있는 것이 지적되고 있다. 그러나, 한편으로, O-157과 같이, 수백에서 수천 개의 세균을 섭취하는 것만으로 발증하는 전염성이 강한 감염증의 경우에는, 2차 감염을 예방하기 위해서라도, 항생물질의 투여를 선택해야만 하는 장면도 발생하고 있다. 기타 치료방법으로서, O-157에서는 약 10%의 케이스에서 용혈성 요독증증후군을 병발하는 경우가 있는 것으로 알려지고, 이 경우에는, 혈장 교환이나 투석요법 등이 행해지나, 모두 환자에게 부담이 큰 치료방법이라고 할 수 있다.
또한, 세균이 생산하는 독소로의 대처방법으로서는, 대증요법이 우선이고, 기타 방법으로서는, 독소 흡착제의 사용이나 독소에 대한 항체의 사용 등을 들 수 있으나, 활성탄 등에 의한 흡착의 방법에서는 변비가 되는 등의 부작용도 있고, 또한, 항체의 사용에 대해서는, 각 독소에 대해 항체를 개발해야만 한다는 점에서 불편하다.
이에, 이와 같은 병원균에 의한 감염증에 대한 치료 내지 발증 억제방법이 모색되고 있어, 최근에는, 항생물질의 투여가 아닌, 환자 자신의 면역력을 높임으로써, 감염증을 치료 내지 예방하는 시도도 이루어지고 있다.
환자의 면역력을 높이는 물질로서는, 각종 화합물이 모색되고 있으나, 천연물 유래 성분의 일례로서, 트레할로스의 디에스테르 화합물인, 트레할로스 디미콜레이트(trehalose dimycolate, TDM)와 트레할로스 디코리노미콜레이트(trehalose dicorynomycolate, TDCM)가 알려져 있다. TDM은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 세포 표층에 존재하는 당지질로서 발견되어, 면역 부활 활성 및 항암 활성을 나타내는 것이 알려져 있다. 또한, 동족의 디프테리아균(Corynebacterium spp)으로부터, TDM보다 탄소수가 짧은 동족체인 TDCM이 단리되어, TDCM과 그의 입체 이성체가, 각각 면역 부활 활성 및 항암 활성을 나타내는 것이 명확해져 있다.
그러나, TDM 및 TDCM은 독성이 강하여 의약으로서 사용할 수 없다. 따라서, 의약으로서 사용하기 위해서는, 활성을 유지 내지 증강시키면서, 독성을 저하시킨 화합물을 합성하는 것이 필요하였다.
이에, TDM 유도체로서, 트레할로스와 지방산의 에스테르인, 트레할로스 6,6'번 위치-디에스테르 화합물이 합성되어, 독성시험과 마크로파지 부활 작용 등의 시험이 이루어졌다(비특허문헌 1을 참조). 당해 문헌에 있어서는 β수산기의 유무나, 지질의 알킬부분의 길이가 탄소수 30, 32, 48인 화합물, 당과 지질 사이의 에스테르 결합을 아미드 결합으로 바꾼 화합물 등에 대해 검토되고, 독성 면에 있어서는, 에스테르 결합과 장쇄 지방산이 독성에 중요한 기여를 하고 있는 것으로 고찰되었다. 그러나, 당해 문헌에는, 측쇄 지방산부분의 탄소수가 30인 화합물 등도 기재되어 있으나, 당과 측쇄의 결합양식이나, 측쇄 지방산에 대한 치환기의 유무, 측쇄 지방산을 구성하는 알킬기의 길이 등에 대해서, 활성이 높고 독성이 낮은 화합물을 얻기 위해 망라적으로 검토하여 최적화가 이루어진 것은 아니다. 단, 상기한 바와 같은 몇 가지 화합물에 관해 산발적으로 시험이 이루어진 것이다. 또한, 면역 부활 작용에 관해서도, 그 내용이 상세히 검토된 것도 아니다.
한편으로, 본 발명자들은, TDM 유도체에 관하여, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 갖고, β위치 수산기를 수소원자나 메톡시기로 변경한 유도체 등을 합성하였다(특허문헌 1을 참조). 그러나, 당해 문헌 기재의 유도체는, 지방산의 알킬부분이 탄소원자 7개 정도의 비교적 짧은 것이고, 또한, 활성으로서도, 아데노신 A3 수용체 안타고니스트로서의 활성을 측정한 것에 지나지 않는다.
이에, 본 발명자들은, TDCM의 수산기를 수소원자로 바꾸고, 비대칭 탄소로 없애는 동시에, 에스테르 결합을 아미드 결합으로 바꾼 TDCM의 아미드 유도체를 합성하는 것에 성공하여, 이들 아미드 유도체의 면역 부활 작용을 확인하였다(특허문헌 2를 참조). 그러나, 이들 아미드 유도체는, 암을 유발하는 작용이 있는 것이 나중에 판명되어, 의약 화합물로서 사용하는 것은 단념할 수 밖에 없었다.
따라서, TDM 내지 TDCM 유도체로서, 병원균에 유래하는 모든 증상에 대해, 아직까지 충분히 유효하면서 안전성이 높은 치료 내지 발증 억제방법은 확립되어 있지 않아, 유효하고 또한 안전한 치료 내지 발증 억제방법의 확립이 요망되고 있다.
Numata et al., Chem.Pharm.Bull.(1985),33(10),4544-4555
TDM, TDCM의 유도체를 합성하는 경우, TDM, TDCM 그 자체는 독성이 강한 것이기 때문에, 활성을 갖고, 또한, 독성이 낮은 화합물을 합성하는 것이 필요해진다. 종래기술로서는, TDM 또는 TDCM의 개변체도 몇 가지 알려져 있기는 하였으나, TDM 및 TDCM이 당지질이고, 당쇄는 수산기가 많으며 극성도 높고, 합성에 있어서 곤란성을 수반하는 경우도 있어, 어떤 구조가 어떠한 활성으로 결부되는지에 대한 구조 활성 상관은, 아직까지 명확해졌다고는 할 수 없었다.
이에 본 발명은, TDM 및 TDCM의 유도체를 수많이 제조하여, 활성이 높고 독성이 낮은 화합물 및 당해 화합물을 함유하는 의약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 종래기술로서의 병원균에 대한 항생물질의 사용은, 대장균의 성장을 저해하고, 대장균을 사멸시키거나 하여, 대장균에 독소를 방출시키지 않게 하는 것을 목적으로 한 것으로서, 생산된 독소 자체에 대해 무독화하는 것은 불가능한 것인 바, 본 발명은, 세균이 증식하여 독소를 생산하는 상태에 도달한 경우에도, 독소의 독성을 저감시키는 것이 가능한 의약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 화학식 1로 표시되는 트레할로스 디에스테르 화합물이, 병원균에 의한 감염증에 대해 우수한 항균활성을 나타내고, 또한, 저독성인 것을 발견하였다. 또한, 화학식 1로 표시되는 트레할로스 디에스테르 화합물 중, X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-인 화합물로서, 지질부분의 분지의 형상으로서, 특히 n 및 n'가 0인 화합물(이하, α-분지형 화합물이라 한다.) 및 특히 n 및 n'가 1인 화합물(이하, β-분지형 화합물이라 한다.)이 특히 우수한 것인 것을 발견하였다. 또한, 화학식 1로 표시되는 트레할로스 디에스테르 화합물 중, 화학식 1에 있어서의 R1, R2, R1' 또는 R2'로 나타내어지는 알킬사슬부분에 있어서, 탄소수가 10 및 14 등의 특정 길이인 경우에 활성이 극대화되는 경향이 있는 것을 발견하였다. 또한, 트레할로스 디에스테르 화합물에 관하여, 상기 문헌 등에 있어서도, 균이 생산하는 독소 자체를 투여한 경우에 있어서도 항균제로서 유용한 것은 지금까지 알려져 있지 않았던 바, 본 발명자들은, 마우스의 인 비보(in vivo) 시험에 있어서, 균이 투여된 경우뿐 아니라, 균으로부터 생산되는 독소 자체가 투여된 경우에도 유효한 것을 발견하였다.
본 발명은, 이하의 화학식 1:
[화학식 중,
X는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고,
X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며,
여기에서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환(員環)을 형성하고 있어도 되며, 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고,
n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수이다.
단,
(1) X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-이며, R1, R1', R2 및 R2'가 각각 독립적으로, 수소원자, 또는 무치환이고 또한 직쇄의 C1-C6 알킬기이며, n 및 n'가 0인 화합물, 및,
(2) X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-이며, R1, R1', R2 및 R2'가 C14 직쇄 알킬기이고, n 및 n'가 0인 화합물
을 제외함]
로 표시되는 화합물을 제공한다.
또한 본 발명은, 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어를 함유하는 의약으로서, 면역 부활제, 마크로파지 부활제, 호중구 부활제, 탐식(貪食)세포의 식균작용 부활제, 항세균 감염증제 또는 균 생산 독소 중화제로서 사용되는 의약 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 면역 부활제, 마크로파지 부활제, 호중구 부활제, 탐식세포의 식균작용 부활제, 항세균 감염증제 또는 균 생산 독소 중화제로서 사용되는 의약 조성물의 제조를 위한, 화학식 1로 표시되는 화합물의 사용을 제공한다.
또한 본 발명은, 인간을 포함하는 포유동물의 감염증의 예방방법 또는 치료방법으로서,
치료상 유효량의 화학식 1로 표시되는 화합물을 당해 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 이하의 화학식 2:
[화학식 중,
X는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고,
X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며,
여기에서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되며, 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고,
n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수이다.]
로 표시되는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 균 생산 독소 중화제를 제공한다.
본 발명의 트레할로스 화합물은, 면역 부활 활성이 높고, 또한, 독성도 낮기 때문에, 병원균에 의한 감염증에 대해 우수한 의약품을 제공하기 위해 유용하다.
본 발명의 트레할로스 화합물은, 세포성 면역을 부활화하는 작용을 가져, 호중구나 마크로파지를 활성화하고, 그 탐식작용을 높임으로써, 항균작용을 발휘하는 것이다. 즉 본 발명의 화합물에 의하면, 세균 자체를 호중구나 마크로파지 내에 삽입하기 위해, 세포외로의 독소 방출이 적고, 항생물질 투여시의 대장균 파괴에 의한 독소 방출과 같은 위험성이 적은 의약을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 독소 자체에 대해서도 독성 저감작용을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 의하면, 대장균 등에 의한 감염증에 있어서, 감염의 정도가 진행되어, 대장균 등이 증식하고 균외로 독소가 생산되는 상황에 도달한 경우에 있어서도 유효한 의약을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물의 투여에 의한 호중구나 마크로파지의 활성화에 의해, 항생물질 투여에 의해 생성된 다제내성균도 비내성균과 마찬가지로 포식(捕食)하는 것이 가능하다. 따라서, 다제내성균에 의한 감염증에도 치료 효과가 있는 의약을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 세포성 면역을 부활화하나, 과잉의 면역 응답이 발생하기 어렵다. 따라서 본 발명에 의하면, 예를 들면, 항체 의약에 대해, 생체 내에 있어서, 의약으로서 투여된 항체에 대한 항체가 생산되어, 과잉의 면역 응답이 발생할 위험성이 적은 의약을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물에는, 비대칭 탄소원자를 포함하지 않는 화합물이 포함된다. 즉, 본 발명의 트레할로스 화합물의 제조방법에 의해, 비대칭 합성을 포함하지 않고, 본 발명의 트레할로스 화합물을 대량으로 효율 좋게 합성할 수 있다.
도 1은, 마우스 복강 마크로파지에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 마우스 복강 마크로파지로부터의 활성산소 유리량(遊離量)을 나타낸다.
도 2는, 마우스 복강 마크로파지에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 마우스 복강 마크로파지 탐식능을 나타낸다.
도 3은, 토끼 호중구에 TDCM, 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 토끼 호중구로부터의 활성산소 유리량을 나타낸다.
도 4는, 토끼 호중구에 TDCM, 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 토끼 호중구 탐식능을 나타낸다.
도 5는, 인간 유래의 THP-1 세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 THP-1 세포로부터의 IL-8 유리량을 나타낸다.
도 6은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 IL-6 농도를 나타낸다.
도 7은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 IFN-γ 농도를 나타낸다.
도 8은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 TNF-α 농도를 나타낸다.
도 9는, 인간 유래 세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 인간 유래 세포로부터의 MIP-1β 및 TNF-α 유리량을 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 10은, 인간 유래의 THP-1 세포에 있어서의, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 세포 독성을 나타낸다. 백색의 막대는 2시간, 흑색의 막대는 24시간, 시험 화합물로 처리한 경우의 결과를 각각 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 11은, Ames 시험에 의한, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 변이 원성의 측정결과를 나타낸다.
도 12는, 마우스 복강 내 침윤세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 세포 수 및 현미경상을 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 13은, 마우스 복강 내 침윤세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 김자염색(Giemsa stain)의 결과를 나타낸다.
도 14는, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 마우스 복강 내 침윤세포에 있어서의, 형광 현미경에 의한 CD-8 양성 세포상을 나타낸다.
도 15는, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 마우스 복강 내 침윤세포에 있어서의, 유세포분석기(flow cytometry)에 의한 CD-8 양성 세포의 측정결과를 나타낸다.
도 16은, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 웰치균(Welch bacillus)을 투여한 경우에 있어서의, 상기 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 17은, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 녹농균을 투여한 경우에 있어서의, 상기 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 18은, 마우스에 녹농균 투여 후에, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 19는, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 녹농균을 투여한 경우에 있어서의, 마우스의 혈중 녹농균 수를 나타낸다.
도 20은, 유방암 세포 접종 마우스에 있어서의, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 암전이에 대한 영향을 나타낸다.
도 2는, 마우스 복강 마크로파지에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 마우스 복강 마크로파지 탐식능을 나타낸다.
도 3은, 토끼 호중구에 TDCM, 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 토끼 호중구로부터의 활성산소 유리량을 나타낸다.
도 4는, 토끼 호중구에 TDCM, 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 토끼 호중구 탐식능을 나타낸다.
도 5는, 인간 유래의 THP-1 세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 THP-1 세포로부터의 IL-8 유리량을 나타낸다.
도 6은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 IL-6 농도를 나타낸다.
도 7은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 IFN-γ 농도를 나타낸다.
도 8은, 마우스에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 마우스 혈장 중의 TNF-α 농도를 나타낸다.
도 9는, 인간 유래 세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 인간 유래 세포로부터의 MIP-1β 및 TNF-α 유리량을 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 10은, 인간 유래의 THP-1 세포에 있어서의, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 세포 독성을 나타낸다. 백색의 막대는 2시간, 흑색의 막대는 24시간, 시험 화합물로 처리한 경우의 결과를 각각 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 11은, Ames 시험에 의한, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 변이 원성의 측정결과를 나타낸다.
도 12는, 마우스 복강 내 침윤세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 세포 수 및 현미경상을 나타낸다. 값은 mean±S.D.(n=5)로 나타내었다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다.
도 13은, 마우스 복강 내 침윤세포에 TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 경우의 김자염색(Giemsa stain)의 결과를 나타낸다.
도 14는, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 마우스 복강 내 침윤세포에 있어서의, 형광 현미경에 의한 CD-8 양성 세포상을 나타낸다.
도 15는, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 작용시킨 마우스 복강 내 침윤세포에 있어서의, 유세포분석기(flow cytometry)에 의한 CD-8 양성 세포의 측정결과를 나타낸다.
도 16은, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 웰치균(Welch bacillus)을 투여한 경우에 있어서의, 상기 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 17은, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 녹농균을 투여한 경우에 있어서의, 상기 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 18은, 마우스에 녹농균 투여 후에, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 경우에 있어서의, 화합물의 마우스 생존수에 대한 영향을 나타낸다. *는, 대조와 비교하여 P<0.01의 경우를 나타낸다. 시험을 8회 행한 것 중의, 표준적인 결과를 나타낸다.
도 19는, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물을 투여한 마우스에, 녹농균을 투여한 경우에 있어서의, 마우스의 혈중 녹농균 수를 나타낸다.
도 20은, 유방암 세포 접종 마우스에 있어서의, TDCM, vehicle 또는 본 발명의 시험 화합물의 암전이에 대한 영향을 나타낸다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다. 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물은, 그 약리학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 형태로 존재하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서, 「C1-C21 알킬기」란, 탄소수 1 내지 21의 직쇄상 또는 분지쇄상의 지방족 탄화수소기 외에, 지방족 탄화수소기의 전부 또는 일부가 4-8 원환을 형성하고 있는 지환식 탄화수소기도 포함한다. 바람직한 태양의 하나에 있어서, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 「C1-C21 알킬기」는, 직쇄상의 지방족 탄화수소기이다. 직쇄상의 지방족 탄화수소기인 「C1-C21 알킬기」의 예로서, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, n-헵틸기, n-옥틸기, n-노닐기, n-데실기, n-운데실기, n-도데실기, n-트리데실기, n-테트라데실기, n-펜타데실기, n-헥사데실기, n-헵타데실기, n-옥타데실기, n-노나데실기, n-이코실기, n-헨이코실기 등을 들 수 있다. 지방족 탄화수소기의 전부가 고리를 형성하고 있는 지환식 탄화수소기의 예로서는, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기 등을 들 수 있고, 지방족 탄화수소기의 일부가 고리를 형성하고 있는 지환식 탄화수소기의 예로서는, 시클로헥실-n-옥틸기, 시클로헥실-n-노닐기, 시클로헵틸-n-옥틸기 등을 들 수 있다. R1, R1', R2, 또는 R2'로서는, 직쇄상의 알킬기가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 탄소수 10 내지 16의 직쇄상 알킬기이며, 특히 바람직하게는, n이 0인 경우, 탄소수 10의 직쇄상의 알킬기인 n-데실기이고, n이 1인 경우, 탄소수 9의 직쇄상의 알킬기인 n-노닐기, 탄소수 13의 직쇄상의 알킬기인 n-트리데실기 또는 탄소수 14의 직쇄상의 알킬기인 n-테트라데실기이며, 가장 바람직하게는, n-데실기이다.
R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 된다. 여기에서, 알콕시기란, 탄소수 1 내지 21의 직쇄상 또는 분지쇄상의 지방족 탄화수소가 산소원자와 결합한 구조의 치환기이고, 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기, 헥실옥시기, 헵틸옥시기 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 직쇄 알콕시기이고, 알콕시기에 의해 치환된 알킬기로서, 예를 들면, 메톡시도데실기, 에톡시운데실기, 프로폭시데실기, 펜틸옥시노닐기, 헥실옥시옥틸기, 헥실옥시헵틸기, 펜틸옥시옥틸기 등을 들 수 있다. 각 알킬기 중의 수소원자가, 수산기 또는 알콕시기에 의해 치환되어 있는 경우, 치환의 위치는 각 알킬기 중 어느 것이어도 되나, 바람직하게는, 알킬기의 말단 탄소원자에 결합한 수소원자가, 수산기 또는 알콕시기에 의해 치환된 화합물이다. 알킬기의 말단 탄소원자에 알콕시기가 결합한 경우에는, 탄화수소기가 산소원자를 매개로 결합한 직쇄 에테르상의 구조가 되고, 개재하는 산소원자와 탄화수소기를 구성하는 탄소원자의 수의 총합이, 상기 탄화수소기의 알킬기의 길이와 마찬가지로, 알콕시알킬기를 구성하는 탄소 및 산소원자의 수가 2 내지 21인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, n이 0인 경우, 10 내지 16이며, n이 1인 경우, 9 내지 15이다.
R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고, X가 R1-CHR2-인 경우에, R1 및 R2가 결합하고 있는 탄소원자와, R1 및 R2는, 모두 4-8 원환의 구성원자가 된다. 또한, R1 및 R2를 구성하는 알킬기는, 분지상 알킬기여도 되기 때문에, 그 경우에는, 분지상 알킬기의 일부가 4-8 원환을 구성하고, 알킬기로 치환된 시클로알킬과 같은 구조가 되어도 된다. 또한, 고리를 형성하고 있는 경우에도, 상기와 동일한 치환기에 의해 치환되어 있는 경우도 포함한다. 이들은, X뿐 아니라 X'에 대해서도 동일하다. 4-8 원환의 예로서는, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기 등을 들 수 있다. 화합물의 구조상의 안정성의 관점에서, 바람직하게는, 시클로헥실기 또는 시클로헵틸기이다.
R1과 R1', R2와 R2'는 동일해도 되고 상이해도 되며, 합성 효율의 관점에서는, 바람직하게는, R1이 R1'와 동일하고, R2가 R2'와 동일하다.
또한, R1과 R2의 관계에 대해서는, R1과 R2는 동일해도 되고 상이해도 되며, 하나의 바람직한 태양으로서는, R1의 탄소수가 R2의 탄소수와 비교하여 동일, R2의 탄소수보다도 탄소수가 1 또는 2 많거나 또는 1 또는 2 적은 화합물이다. 예를 들면, R1이 탄소수 14이고, R2가 탄소수 16인 화합물 등을 들 수 있다. 또한, 상기 이외에도, R1이 탄소수 1~5와 같은 단쇄 알킬기이고, R2가 탄소수 10~16과 같은 장쇄 알킬기인 것이나, 그와 반대로, R1이 10~16과 같은 장쇄 알킬기이고, R2가 탄소수 1~5와 같은 단쇄 알킬기인 것도 바람직하다. 또한, R1'와 R2'의 관계도, 상기 R1과 R2의 관계와 동일하여, 상기 R1과 R2의 관계에 있어서, R1을 R1'로, R2를 R2'로 대체하는 것이 가능하다.
n과 n'는 동일해도 되고 상이해도 되며, 합성 효율의 관점에서는, n과 n'가 동일한 것이 바람직하다. 또한, 활성의 관점에서는, n 내지 n'가 0인 화합물 및 n 내지 n'가 1인 화합물이 바람직하다.
또한, 트레할로스에는, α,α'체, α,β'체, β,β'체라는 3개의 이성체가 존재한다. 본 발명의 트레할로스 화합물로서는, α,α'체가 바람직하다.
화학식 1의 화합물과 그의 염은 용매화물로서 존재할 수 있으나, 이것도 본 발명의 범위 내이다. 또한, 본 발명 범위에는, 생물학 연구에 유용한 화학식 1의 화합물의 방사성 표지 화합물도 포함된다.
본 발명의 바람직한 화합물은, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물이고, 화학식 중의 각 치환기가 이하의 특징을 갖는 것이다. 이하의 특징은, 모순되지 않는 한, 각각 독립적으로, 1개만 또는 조합해서 선택할 수 있다.
(A) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이다.
(B) X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이다.
(C) R1 및 R1'는 각각 독립적으로, 무치환의 C1-C21 알킬기이다.
(D) R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 무치환의 C1-C21 알킬기이다.
(E) R1 및 R1'는 각각 독립적으로, 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(F) R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(G) R1 및 R1'는 각각 독립적으로, 무치환이고 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(H) R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자, 또는 무치환이고 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(I) R1 및 R1'는 각각 독립적으로, 무치환이고 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이다.
(J) R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 무치환이고 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이다.
(K) R1 및 R1'는 동일하고, 무치환의 C1-C21 알킬기이다.
(L) R2 및 R2'는 동일하고, 수소원자 또는 무치환의 C1-C21 알킬기이다.
(M) R1 및 R1'는 동일하고, 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(N) R2 및 R2'는 동일하고, 수소원자 또는 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(O) R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(P) R2 및 R2'는 동일하고, 수소원자, 또는 무치환이며 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이다.
(Q) R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이다.
(R) R2 및 R2'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이다.
(S) n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 또는 1이다.
(T) n 및 n'는 0이다.
(U) n 및 n'는 1이다.
본 발명의 바람직한 화합물은, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 그의 약리학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물로, 이하의 구조를 갖는 것이다.
(V) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며, 여기에서, R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고, 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되며; n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수이다.
(W) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며, 여기에서, R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄의 C7-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고; n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 또는 1이다.
(X) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; 여기에서, R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄의 C8-C16 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고; n 및 n'는 0이다.
(Y) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며, 여기에서, R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄의 C8-C14 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고; n 및 n'는 1이다.
(Z) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; 여기에서, R1 및 R1'는 동일하고, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이며, R1, R1'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되며; R2 및 R2'는 동일하고, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되며; 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고; n 및 n'는 동일하며, 0 내지 3의 정수이다.
(AA) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, C1-C21 알킬기이며, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고; R2 및 R2'는 동일하며, C7-C21 알킬기이고, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(BB) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, C7-C21 알킬기이며, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고; R2 및 R2'는 동일하며, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(CC) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 직쇄의 C7-C21 알킬기이며, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고; R2 및 R2'는 동일하며, 직쇄의 C7-C21 알킬기이고, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(DD) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 수소원자, 또는 무치환이고 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(EE) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 수소원자, 또는 무치환이고 또한 직쇄의 C1-C21 알킬기이며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(FF) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 무치환이고 또한 직쇄의 C7-C21 알킬기이며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(GG) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C8-C16 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 무치환이고 또한 직쇄의 C8-C16 알킬기이며; n 및 n'는 동일하고, 0 또는 1이다.
(HH) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C8-C16 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 무치환이고 또한 직쇄의 C8-C16 알킬기이며; n 및 n'는 0이다.
(II) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1 및 R1'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C9-C14 알킬기이고; R2 및 R2'는 동일하며, 무치환이고 또한 직쇄의 C9-C14 알킬기이며; n 및 n'는 1이다.
(JJ) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1, R1', R2 및 R2'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C10 알킬기이고; n 및 n'는 0이다.
(KK) X는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고; X'는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며; R1, R1', R2 및 R2'는 동일하고, 무치환이며 또한 직쇄의 C9, C13 또는 C14 알킬기이고; n 및 n'는 1이다.
본 발명의 트레할로스 화합물의 구체예로서, 이하의 화합물을 예시할 수 있다.
6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(벤조일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-나프틸카르보닐)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(시클로헥산카르보닐)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(시클로헵탄카르보닐)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-테트라데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(14-메톡시-2-(12-메톡시도데실)-테트라데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(15-히드록시-2-(13-히드록시트리데실)-펜타데카노일)-α,α'-트레할로스.
본 발명의 트레할로스 화합물로 바람직한 화합물로서, 이하의 것을 예시할 수 있다.
6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물로 바람직한 화합물로서, 이하의 것을 예시할 수 있다.
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물로 보다 바람직한 화합물로서, 이하의 것을 예시할 수 있다.
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스.
또한, 본 발명의 바람직한 균 생산 독소 중화제로서, 이하의 어느 하나의 화합물:
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-테트라데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스
를 함유하는 것을 특징으로 하는 균 생산 독소 중화제를 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 및 면역 부활제 등은, 상기 트레할로스 화합물을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 트레할로스 화합물은, 마크로파지나 호중구에 대한 높은 활성화작용을 갖는 면역 부활제이다. 따라서, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 세균 감염증, 바이러스 감염증, 진균 감염증 등의 감염증, 기회 감염증, 다제내성 감염증 등, 면역에 의한 생체 방어반응에 관련한 질환의 예방제 또는 치료제로서 유용하다.
<제조방법>
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이하의 (a) 및 (b)로 나타내어지는 2개의 공정에 의해 합성할 수 있다.
(a) 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 또는 순차적으로 작용시키고, 에스테르화 반응을 행하는 공정.
(b) 상기 공정 (a)에서 얻어지는 화학식 5로 표시되는 트레할로스 화합물의 수산기의 보호기를 탈보호하는 공정.
공정 (a)에 있어서, 「화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 또는 순차적으로 작용시키고」란, 이하의 합성 스킴 1에 나타내어지는 바와 같이, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 순차 작용시켜도 되고, 또한, 이하의 합성 스킴 2에 나타내어지는 바와 같이, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 작용시켜도 되며, 또한, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물이 동일한 경우에는, 이것을 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물로서, 이하의 합성 스킴 3에 나타내어지는 바와 같이, 동시에, 즉 1단계의 반응에 있어서 작용시켜도 되는 것을 의미한다. 또한, 화학식 2로 표시되는 화합물도 화학식 1로 표시되는 화합물과 동일하게 하여 합성할 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이하의 합성 스킴 1에 나타내어지는 방법에 의해 제조할 수 있다.
<합성 스킴 1>
상기 합성 스킴 중, R1, R1', R2, R2', n 및 n'는 상기와 동일하다. R3 및 R3'는 당의 수산기의 보호기를 나타낸다. Y 및 Y'는 각각 독립적으로, 수산기 또는 할로겐원자를 나타낸다. 또한, 상기 스킴에 있어서, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물은 α,α'체이나, α,β'체와 β,β'체도 동일하게 합성할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서는, α,α'체가 바람직하다.
여기에서, R3 및 R3'로서는, 수산기의 보호기로서 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, Protecting groups in Organic chemistry(John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6)에 기재된 수산기의 보호기를 들 수 있다. 구체적으로는, 벤질기, p-메톡시벤질기, 비페닐메틸기 등의 아릴알킬기; 아세틸기 등의 아실기; 메톡시카르보닐기, tert-부톡시카르보닐기 등의 알콕시카르보닐기; 트리메틸실릴기 등의 트리알킬실릴기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 벤질기이다. R3 및 R3'는 동일해도 되고 상이해도 되며, 바람직하게는 동일하다.
또한, Y 및 Y'는 각각 독립적으로, 수산기 또는 할로겐원자이고, 할로겐원자로서는, 불소원자, 염소원자, 요오드원자 등을 들 수 있다. Y 및 Y'는 바람직하게는 수산기이다.
<공정 (a): 에스테르화 반응>
화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 순차 작용시키고, 트레할로스 화합물과 카르보닐 화합물의 에스테르화 반응을 행하는 공정이다.
화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물은, 트레할로스의 6번 위치 및 6'번 위치 이외의 수산기가 보호기에 의해 보호된 화합물로, 시판의 것을 사용하거나, 또는 트레할로스 등으로부터 공지의 방법에 의해 합성한 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 보호기가 벤질기인 2,3,4,2',3',4'-헥사벤족시-α,α'-트레할로스는 시판되고 있어, 이것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 트레할로스의 α,α'체는 천연에 존재하는 것으로 입수 용이하다. 트레할로스에 있어서 6번 위치 및 6'번 위치의 수산기와 다른 수산기는 반응성이 상이하기 때문에, 천연의 트레할로스에 대해, 공지의 방법에 의해, 수산기의 보호기를 도입함으로써, 6번 위치 및 6'번 위치 이외의 수산기가 보호된 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물을 비교적 용이하게 합성할 수 있다.
또한, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물은, 시판의 것을 사용하거나, 후술하는 합성 스킴 4, 5, 또는 6에 의해 합성한 것 외에, 공지의 방법에 의해 합성한 것을 사용할 수 있다.
화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을 작용시키는 공정에 있어서, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에 있어서의 6번 위치 및 6'번 위치의 수산기 모두 에스테르화될 가능성이 있다. 6번 위치 및 6'번 위치의 수산기 모두 에스테르화된 화합물을 디에스테르체, 어느 한쪽만이 에스테르화된 중간 화합물을 모노에스테르체라고 부른다. 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에 대해, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을 1 당량 정도 사용하는 경우에는, 입체장애에 의해, 모노에스테르체가 다량 생성된다. 목적하는 화합물의 반응 수율을 높이기 위해서는, 반응 후에 목적하는 6번 위치 수산기가 에스테르화된 모노에스테르체를 분리 정제하면 된다. 또는, 반응 수율을 높이기 위해, 원료인 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물의 6번 위치 및 6'번 위치의 수산기 중, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물과의 에스테르화를 바라지 않는 한쪽의 수산기를 선택적으로 보호해 두고, 다른 쪽 수산기의 에스테르화 반응 후에, 선택적으로 탈보호해도 된다. 수산기를 에스테르화하는 순서로서는, 6번 위치 수산기를 먼저 에스테르화하는 경우 외에, 6'번 위치 수산기를 먼저 에스테르화해도 된다.
당해 에스테르화 반응은, 일반적인 에스테르화 반응으로서 통상 사용되는 방법 및 당업자 등에게 공지의 방법을 널리 사용할 수 있다.
화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물에 대해, Y 또는 Y'가 수산기인 경우에는, 카르복실산과 알코올의 공지의 에스테르화 반응을 널리 적용할 수 있다. 예를 들면, 탈수법(카르보디이미드법을 포함한다), 혼합 산무수물법, 활성 에스테르화법 등을 들 수 있다. 이들 방법은, 바람직하게는, 불활성 용매 중, 축합제를 사용해서 행할 수 있다.
이들 방법에 사용되는 축합제로서는, 탈수제를 포함하고, 알코올과 카르복실산의 에스테르화 반응에 있어서 통상 사용되는 것을 널리 사용할 수 있다. 축합제의 예로서는, 염화수소, 황산, 염산 등의 무기산; 파라톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산 등의 유기산; 플루오르화붕소에테라이트 등의 루이스산 등의 탈수제; 삼염화인, 삼브롬화인, 오염화인, 옥시염화인, 염화티오닐 등의 산할로겐화물 생성제; 클로로포름산에틸, 염화메탄설포닐 등의 혼합 산무수물 생성제; N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드, 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드 등의 카르보디이미드; 또는 기타 축합제, 예를 들면 N,N-카르보닐디이미다졸, 2-에톡시-N-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린(EEDQ), 트리페닐포스핀-사염화탄소(착체) 등을 들 수 있다. 이들 축합제는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다. 원료 화합물과 축합제의 사용 비율도 특별히 한정되지 않고, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다.
당해 에스테르화 반응은, 적당한 용매 중에서 행할 수 있다. 용매로서는, 원료 화합물에 대해 적당한 용해성을 갖고, 에스테르화 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성 용매이면 되어, 공지의 용매를 널리 사용할 수 있다. 상기 에스테르화 반응에 사용되는 용매의 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소; 클로로벤젠, 디클로로벤젠 등의 할로겐화 방향족 탄화수소: n-헥산, 시클로헥산, 석유 에테르 등의 지방족 탄화수소; 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소 등의 지방족 할로겐화 탄화수소; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등의 에테르; 아세톤, 2-부타논, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤; 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 벤조니트릴 등의 니트릴; N,N-디메틸포름아미드, 헥사메틸포스포릭 트리아미드(HMPA) 등의 아미드; 디메틸설폭시드 등의 설폭시드 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
또한, 당해 에스테르화 반응에 있어서, 공지의 반응 촉진제를 널리 사용할 수 있다. 반응 촉진제의 예로서는, 디메틸포름아미드, 디메틸아미도피리딘, 4-피롤리디노피리딘 등의 촉매, 무수 황산마그네슘, 몰레큘러시브(Molecular sieve)(4A, 5A) 등의 건조제를 들 수 있다. 이들 반응 촉진제는, 반응계 내에 첨가하면 된다. 또한, 에스테르화 반응을 촉진하기 위해, 딘-스타크의 수분리장치, 속슬렛 추출기 등의 장치를 사용해도 된다. 이들 반응 촉진제 내지 장치는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 되며, 촉매와 건조제를 합쳐서 사용해도 된다. 원료 화합물과 반응 촉진제의 사용 비율도 특별히 한정되지 않고, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다.
본 반응에 제공되는 원료 화합물의 사용량은, 특별히 한정되지 않고 넓은 범위 내에서 적절히 선택된다. 화학식 4로 표시되는 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 화합물을 순차 반응시키는 경우에는, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물 1 몰에 대해, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용한다. 또한, 화학식 5로 표시되는 모노에스테르체 1 몰에 대해, 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용한다.
또한, 당해 에스테르화 반응의 반응 온도도 특별히 한정되지 않으나, 통상 -10℃에서 사용하는 용매의 비점온도 이하의 범위 내로 하면 된다. 통상 0~200℃, 바람직하게는 실온에서 100℃에서 행해진다.
반응시간은, 원료 화합물의 종류 및 그 사용량, 반응온도 등의 반응조건에 따라 상이하나, 통상 1시간에서 1주간의 범위에서 적절히 조절할 수 있고, 바람직하게는 1~24시간, 보다 바람직하게는 3~10시간이다.
반응 종료 후는, 반응 혼합액에 대해 부생물의 분리 제거, 건조, 용매의 증류 제거 등의 일반적인 처리를 행한 후, 실리카겔 칼럼크로마토그래피 등의 일반적인 방법에 의해 정제한다.
화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물에 대해, Y 또는 Y'가 할로겐원자인 경우에는, 에스테르화 반응은 적당한 용매 중, 필요에 따라 염기의 존재하에서 행할 수 있다.
용매는, 상기 에스테르화 반응에서 사용되는 불활성 용매와 동일한 것을 사용할 수 있다.
염기로서는, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속의 수산화물; 수산화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수산화물; 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리금속의 탄산염; 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 알칼리금속의 탄산수소염; 초산나트륨, 초산칼륨 등의 알칼리금속의 초산염; 초산칼슘 등의 알칼리토류금속의 초산염; 수소화나트륨, 수소화칼륨 등의 알칼리금속의 수소화물; 수소화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수소화물; 수산화암모늄, 탄산암모늄, 초산암모늄 등의 암모늄염; 트리메틸아민, 트리에틸아민, N,N-디메틸아닐린, 피리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘, 디아자비시클로옥탄(DABCO), 디아자비시클로노넨(DBN), 디아자비시클로운데센(DBU) 등의 제3급 아민을 들 수 있다. 이들 염기는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
본 반응에 제공되는 원료 화합물 및 염기의 사용량도, 특별히 한정되지 않고 넓은 범위 내에서 적절히 선택된다. 화학식 4로 표시되는 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 화합물을 순차 반응시키는 경우에는, 화학식 2로 표시되는 트레할로스 화합물 1 몰에 대해, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용하고, 염기를, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용한다. 또한, 화학식 5로 표시되는 모노에스테르체 1 몰에 대해, 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용하고, 염기를, 통상 0.5~1.8 몰, 바람직하게는 0.8~1.2 몰 사용한다.
반응온도는, 상기 에스테르화 반응과 마찬가지로, 통상 -10℃부터 사용하는 용매의 비점온도 이하의 범위 내로 하면 된다. 반응시간은, 상기 에스테르화 반응과 마찬가지로, 상기의 농도, 온도 등에 따라 변화하나, 통상 0.1~10시간의 범위에서 적절히 조정할 수 있다.
화학식 4로 표시되는 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 화합물로서, X가 수산기인 카르보닐 화합물과 X'가 할로겐원자인 카르보닐 화합물을 사용하는 경우 및 X가 할로겐원자인 카르보닐 화합물과 X'가 수산기인 화합물을 사용하는 경우에도, 상기 반응조건 중에서 적절히 선택함으로써, 마찬가지로, 화학식 7로 표시되는 화합물을 합성할 수 있다.
<공정 (b)>
상기 공정 (a)에 있어서 얻어진, 트레할로스의 6번 위치 및 6'번 위치가 에스테르화되고, 당의 수산기가 보호된, 화학식 7로 표시되는 화합물에 대해, 당의 수산기의 탈보호를 행함으로써, 목적으로 하는, 화학식 1로 표시되는 트레할로스 디에스테르 화합물을 얻는다.
화학식 7로 표시되는 화합물에 있어서의 보호된 수산기로부터 보호기를 이탈하는 데는, 예를 들면, 상기 문헌에 기재된 당해 보호기에 적합한 탈보호방법을 적절히 적용할 수 있다.
예를 들면, R3의 보호기가 벤질기인 경우에는, 접촉 수소첨가반응을 적용할 수 있다. 접촉 수소첨가반응은, 수소 분위기하, 촉매의 존재하에서 행해진다.
촉매는, 접촉 수소첨가반응에 사용되는 것인 한 공지의 촉매를 널리 사용할 수 있고, 예를 들면, 산화백금, 백금탄소, 수산화팔라듐, 팔라듐탄소, 레이니 니켈 등을 들 수 있다.
촉매의 사용량은, 화학식 7로 표시되는 화합물에 대해, 통상 0.001~50 중량% 정도, 바람직하게는 0.01~10 중량% 정도이다.
수소압은 특별히 제한되지 않고, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다. 수소압은 통상 0.8~100 기압 정도이고, 바람직하게는 1~3 기압 정도이다.
당해 반응은 통상 적당한 용매 중에서 행해지고, 용매로서는, 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성의 것이면 널리 사용할 수 있다. 사용하는 용매로서는, 예를 들면, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소 등의 지방족 할로겐화 탄화수소; 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올; 포름산메틸, 초산메틸, 초산에틸 등의 에스테르; 포름산, 초산 등의 카르복실산 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
본 반응의 온도는 통상 0~100℃ 정도이고, 바람직하게는 10~40℃ 정도이다. 반응시간은 기질량, 온도, 촉매의 종류 등에 따라 상이하나, 수소 소비의 이론량을 기준으로 반응을 종결시키면 된다. 통상 1~50시간 정도이고, 바람직하게는 1~30시간이다.
반응 종료 후는, 촉매의 여과 분별, 용매의 증류 제거 등의 일반적인 처리를 행한 후, 용매 추출, 실리카겔 칼럼크로마토그래피 등의 일반적인 방법에 의해 정제한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이하의 합성 스킴 2 또는 합성 스킴 스킴 3에 나타내어지는 방법에 의해 제조하는 것도 가능하다.
<합성 스킴 2>
상기 합성 스킴 중, R1, R1', R2, R2', R3, R3', n 및 n'는 상기와 동일하다.
합성 스킴 2는, 에스테르화 반응인 공정 (a)에 있어서, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 작용시키는 스킴이고, 탈보호반응인 공정 (b)는 합성 스킴 1과 동일하다.
에스테르화 반응 및 탈보호반응은, 공정 (a)에 있어서, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에, 화학식 4 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 작용시키는 것 이외에는, 합성 스킴 1과 동일하게 하여 행할 수 있다.
화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물을 동시에 작용시킨 경우에는, 생성물 중에서, 목적 화합물을 분리 정제함으로써 얻을 수 있다.
화학식 1로 표시되는 화합물에 있어서, R1 및 R1', R2 및 R2', n 및 n'가 각각 동일한 경우에는, 상기 합성 스킴 2는, 특히 이하의 합성 스킴 3과 같이 나타낼 수 있다. 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물이, R1 및 R1', R2 및 R2', n 및 n'가 각각 동일한 화합물이 아닌 경우에는, 반응 수율을 높이는 관점에서는, 합성 스킴 1로 표시되는 방법에 의해 합성하는 것이 바람직하다.
<합성 스킴 3>
상기 합성 스킴 중, R1, R2, R3, R3' 및 n은, 상기와 동일하다.
합성 스킴 3은, 에스테르화 반응인 공정 (a)에 있어서, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물에 대해, 작용시키는 카르보닐 화합물(4)은 1종류뿐이기 때문에, 에스테르화 반응을 동시에, 즉, 1단계의 반응에 의해 행하는 스킴으로, 탈보호반응인 공정 (b)는 합성 스킴 1과 동일하다.
합성 스킴 3에 있어서의 에스테르화 반응 및 탈보호반응은, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물의 사용량을 늘리는 것 이외에는, 상기 합성 스킴 1의 반응과 동일하게 하여 행할 수 있다. 사용량에 관해서는, 구체적으로는, 화학식 3으로 표시되는 트레할로스 화합물 1 몰에 대해, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을 통상 1.8~5 몰, 바람직하게는 2~3 몰, 축합제를 통상 1.8~5 몰, 바람직하게는 2~4 몰, 염기를 통상 1.8~8 몰, 바람직하게는 2~6 몰 사용한다.
또한, 화학식 7로 표시되는 화합물은, 단리 정제하지 않고 다음 반응에 사용하는 것도 가능하나, 에스테르화 반응에 사용한 시약 및 부생성물을 제거해 두는 것이 바람직하다.
<원료가 되는 카르보닐 화합물>
상기 합성 스킴 1, 2, 또는 3에 있어서, 원료 화합물인 화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물은, 시판의 것을 사용하는 것 외에, 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 화학식 4 또는 화학식 6에 있어서, X 내지 X'가 페닐기이고, n 내지 n'가 0인 화합물로서는, 안식향산 또는 안식향산의 할로겐화물을 사용할 수 있다.
화학식 4로 표시되는 화합물 중, X가 R1-CHR2-이고, n이 0인 화합물은, 이하의 합성 스킴 4 또는 5에 의해 제조하는 것도 가능하다.
이하에서는, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물이 목적 화합물로서 기재되어 있으나, 화학식 6으로 표시되는 카르보닐 화합물도, 동일하게 제조할 수 있다.
<합성 스킴 4>
상기 합성 스킴 중, R1 및 R2는 상기와 동일하다. R4는 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내고, Hal은 할로겐원자를 나타낸다.
합성 스킴 4는, 화학식 8로 표시되는 화합물을, 통상의 알킬화 반응 처리하여, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을 얻는 공정이다. 원료 화합물인 화학식 8로 표시되는 화합물은, 시판의 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, R1이 탄소수 10의 직쇄 알킬기인 경우에는, 도데칸산에틸 등을 사용할 수 있다. 목적 화합물의 측쇄 알킬로서 목적하는 길이를 갖는 산의 에스테르를 사용하면 된다.
알킬화 반응에는, 예를 들면, Creger, J. Am. Chem. Soc., 92권, 1397-98페이지, 1970년에 기재된 방법 등의 각종 방법을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 화학식 8로 표시되는 화합물의 용액에 강염기를 첨가하여 2번 위치의 수소원자를 뽑아 낸 후, 할로겐화 알킬을 반응시키면 된다. 예로서, 이하와 같은 반응에 의해 알킬화를 행할 수 있다.
먼저, 화학식 8로 표시되는 화합물과 강염기를 반응시킨다. 강염기로서는, 수소원자를 뽑아 내는 작용이 있는 것이면 되고, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속의 수산화물; 수산화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수산화물 등을 들 수 있다. 이들 염기는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다. 또한, 리튬디이소프로필아미드를 병용하여, 양자-리튬 교환반응을 행해도 된다. 용매로서는, 원료 화합물에 대해 적당한 용해성을 갖고, 에스테르화 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성 용매이면 되고, 공지의 용매를 널리 사용할 수 있다. 상기 알킬화 반응에 사용되는 용매의 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소; n-헥산, 시클로헥산, 석유 에테르 등의 지방족 탄화수소; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등의 에테르 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
당해 반응에 있어서, 화학식 8로 표시되는 화합물과 강염기의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 8로 표시되는 화합물에 대해 강염기 등을 0.9~5배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는 통상 -80~60℃ 정도, 바람직하게는 0℃~60℃ 정도이다. 반응시간은 5분~6시간 정도로 하고, 바람직하게는 5분~1시간 정도이다.
이어서, 반응 혼합액에 할로겐화 알킬을 첨가한다. 할로겐화 알킬로서는, 예를 들면, 1-요오도옥탄, 1-요오도헵탄, 1-요오도데칸, 1-요오도운데칸, 1-요오도도데칸, 1-요오도트리데칸 등, 목적 화합물의 측쇄의 알킬기로서, 탄소사슬부분이 목적하는 길이를 갖는 알칸의 할로겐화물을 사용하면 된다. 할로겐화물로서는, 염소화물, 요오드화물, 브롬화물 등을 들 수 있으나, 바람직하게는, 요오드화물이다. 당해 반응에 있어서, 화학식 8로 표시되는 화합물과 할로겐화 알킬의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 8로 표시되는 화합물에 대해 할로겐화 알킬을 1.1~3배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는, 통상은 실온 정도로 하면 된다. 또한, 반응시간은 통상 2~12시간 정도로 한다.
반응 종료 후에 있어서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용함으로써, 목적 화합물을 단리하고, 정제한다.
화학식 4로 표시되는 화합물 중, X가 R1-CHR2-이고, n이 0인 화합물은, 이하의 합성 스킴 5에 의해 제조하는 것도 가능하다.
<합성 스킴 5>
상기 합성 스킴 중, R1, R2, R4 및 Hal은 상기와 동일하다.
합성 스킴 5는, 화학식 11로 표시되는 화합물을, 통상의 알킬화 반응 처리하여, 화학식 4로 표시되는 카르보닐 화합물을 얻는 공정이다. 원료 화합물인 화학식 11로 표시되는 화합물은, 시판의 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, 말론산디에틸, 말론산디메틸, 말론산디프로필, 말론산디부틸, 말론산디이소프로필, 말론산디-tert-부틸, 말론산디시클로헥실, 말론산디페닐, 말론산디벤질 등을 들 수 있다.
알킬화 반응은, 상기와 마찬가지로, 원료 화합물인 화학식 11로 표시되는 화합물에 강염기를 반응시키고, 이어서, 할로겐화 알킬을 작용시켜서 행할 수 있다.
화학식 11로 표시되는 화합물에 강염기를 반응시키는 공정에 있어서, 화학식 11로 표시되는 화합물과 강염기의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 11로 표시되는 화합물에 대해 강염기 등을 0.9~5배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는 통상 -80~60℃ 정도, 바람직하게는 0℃~60℃ 정도이다. 반응시간은 5분~6시간 정도로 하고, 바람직하게는 5분~1시간 정도이다.
이어서, 할로겐화 알킬을 첨가하는 공정에 있어서, 화학식 11로 표시되는 화합물과 할로겐화 알킬의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 11로 표시되는 화합물에 대해, 화학식 12로 표시되는 할로겐화 알킬 및 화학식 9로 표시되는 할로겐화 알킬을, 각각, 0.8~1.2배 몰 정도 사용한다. 목적 화합물이, R1 및 R2가 동일한 화합물인 경우에는, 할로겐화 알킬은 1종류이면 되고, 통상은 화학식 11로 표시되는 화합물에 대해, 할로겐화 알킬을 2.2~4배 몰 정도 사용한다. 목적 화합물에 있어서, R1 및 R2가 동일하지 않은 경우에는, 상기한 바와 같이, 화학식 12로 표시되는 할로겐화 알킬 및 화학식 9로 표시되는 할로겐화 알킬을 동시에 작용시켜서 목적 화합물만을 단리 정제하는 경우 외에, 상이한 할로겐화 알킬을 순차 작용시키는 것으로 하고, 한쪽의 할로겐화 알킬을 작용시킨 후, 단리 정제하여, 다른 쪽의 할로겐화 알킬을 작용시키고, 목적 화합물을 단리 정제해도 된다. 단리 정제의 방법으로서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용할 수 있다.
화학식 4로 표시되는 화합물 중, X가 R1-CHR2-이고, n이 1인 화합물은, 이하의 합성 스킴 6에 의해 제조하는 것도 가능하다.
<합성 스킴 6>
합성 스킴 6은, 이하의 합성 스킴 6-1 내지 6-5로서 설명할 수 있다.
<합성 스킴 6-1>
상기 합성 스킴 중, R1은 상기와 동일하다.
합성 스킴 6-1은, 원료 화합물인 카르복실산에 N,O-디메틸히드록시아민을 탈수 결합하는 반응이다.
화학식 13으로 표시되는 카르복실산에, 염기성 축합제를 작용시킨다. 공지의 염기성 축합제이면 널리 사용할 수 있고, 염기성 축합제의 예로서는, 카르보닐디이미다졸 외에, 4-디메틸아미노피리딘, 피페리딘, 피롤리딘, 피리딘, 이미다졸, N,N,N',N'-테트라메틸우레아, 비스(펜타메틸렌)우레아, 1,1-카르보닐디피롤 등을 들 수 있다. 원료 화합물인 카르복실산은, 시판의 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, 헵탄산, 옥탄산, 데칸산, 운데칸산 등을 들 수 있다. 목적 화합물의 측쇄 알킬로서 목적하는 길이를 갖는 산을 사용하면 된다. 용매로서는, 원료 화합물에 대해 적당한 용해성을 갖고, 에스테르화 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성 용매이면 되며, 공지의 용매를 널리 사용할 수 있다. 상기 에스테르화 반응에 사용되는 용매의 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소; 클로로벤젠, 디클로로벤젠 등의 할로겐화 방향족 탄화수소: n-헥산, 시클로헥산, 석유 에테르 등의 지방족 탄화수소; 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소 등의 지방족 할로겐화 탄화수소; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등의 에테르 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
당해 반응에 있어서, 화학식 13으로 표시되는 카르복실산과 카르보닐디이미다졸 등의 사용 비율은, 넓은 범위에서 적절히 선택할 수 있고, 통상 0.8~2.0 몰 정도이다. 이때의 반응온도는 통상 -80~60℃ 정도, 바람직하게는 0℃~60℃ 정도이다. 반응시간은 5분~6시간 정도로 하고, 바람직하게는 30분~3시간 정도이다.
이어서, 화학식 14로 표시되는 N,O-디메틸히드록시아민을 반응시킨다. N,O-디메틸히드록시아민 대신에, 1-히드록시벤조트리아졸 등도 사용할 수 있다. 화학식 13으로 표시되는 카르복실산과 N,O-디메틸히드록시아민의 비율은, 넓은 범위에서 적절히 선택할 수 있고, 통상 화학식 13으로 표시되는 카르복실산에 대해, N,O-디메틸히드록시아민을 0.8~1.5 몰 정도 사용하면 된다. 반응은, 통상 -80~60℃ 정도, 바람직하게는 0℃~60℃ 정도이다. 반응시간은, 10분에서 10시간 정도로 하면 된다.
반응 종료 후에 있어서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용함으로써, 목적 화합물을 단리하고, 정제한다.
<합성 스킴 6-2>
상기 합성 스킴 중, R1, R2 및 Hal은 상기와 동일하다.
합성 스킴 6-2는, 화학식 15로 표시되는 화합물에 할로겐화 알킬을 작용시켜서 케톤체를 합성하는 반응이다.
당해 반응에 있어서, 화학식 9로 표시되는 할로겐화 알킬을 에테르계 용매 중에 있어서 금속 마그네슘과 작용시키고, 그리냐르 시약(Grignard reagent)을 조제하여 반응에 사용할 수 있다. 금속 마그네슘으로서는, 연마한 삭상(削狀) 마그네슘이 바람직하게 사용되는 것 외에, 리튬, 나트륨, 아연, 인듐 등도 사용할 수 있다.
화학식 9로 표시되는 할로겐화 알킬은, 상기와 동일한 것을 사용할 수 있다.
당해 반응은, 에테르 용매계에 있어서 행해지고, 에테르 용매계로서는, 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
당해 반응에 있어서, 화학식 15로 표시되는 화합물과 할로겐화 알킬의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 15로 표시되는 화합물에 대해 할로겐화 알킬을 0.8~5배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는 통상 0℃~80℃ 정도이다. 반응시간은 5분~6시간 정도이다.
반응 종료 후에 있어서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용함으로써, 목적 화합물을 단리하고, 정제한다.
<합성 스킴 6-3>
상기 합성 스킴 중, R1, R2 및 R4는 상기와 동일하다. R5 및 R6는 알킬기, 알콕시기, 아릴기 또는 아릴옥시기를 나타내고, 이들은 할로겐원자 등에 의해 치환되어 있어도 된다.
합성 스킴 6-3은, 화학식 16으로 표시되는 케톤화합물에 강염기의 존재하에 있어서, 비티히 시약(Wittig reagent) 또는 호르너-에몬스 시약(Horner-Emmons reagent)을 반응시켜, 탄소-탄소 이중결합을 형성하는 반응이다. 상기 합성 스킴에 기재된, 화학식 17로 표시되는 화합물은, 호르너-에몬스 시약(Horner-Emmons reagent)이나, 대신에 비티히 시약(Wittig reagent)을 사용해도 된다.
강염기로서는, 수소원자를 뽑아 내는 작용이 있는 것이면 되고, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속의 수산화물; 수산화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수산화물 등을 들 수 있다. 이들 염기는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다. 용매로서는, 원료 화합물에 대해 적당한 용해성을 갖고, 에스테르화 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성 용매이면 되며, 공지의 용매를 널리 사용할 수 있다. 당해 반응에 사용되는 용매의 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소; n-헥산, 시클로헥산, 석유 에테르 등의 지방족 탄화수소; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등의 에테르 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
당해 반응에 있어서, 화학식 16으로 표시되는 화합물과 강염기의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 16으로 표시되는 화합물에 대해 강염기 등을 1.1~8배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는 통상 -80~60℃ 정도이다. 반응시간은 통상 5분~3시간 정도로 한다.
이어서, 반응 혼합액에, 비티히 시약 또는 호르너-에몬스 시약을 반응시킨다. 비티히 시약 또는 호르너-에몬스 시약으로서는, 공지의 것을 널리 사용할 수 있다. 당해 공정에 있어서는, 화학식 16으로 표시되는 케톤화합물과, 초산에스테르의 사이에서 탄소-탄소 이중결합을 형성시키는 것이면 되고, 비티히 시약의 예로서는, 에톡시카르보닐메틸(트리페닐)포스포늄브로마이드나, 에틸(트리페닐포스포라닐리덴)아세테이트, 호르너-에몬스 시약의 예로서는, 에틸디페닐포스포노아세테이트 등의 에틸(디아릴)포스포노아세테이트나, 에틸디에틸포스포노아세테이트 등의 에틸(디알킬)포스포노아세테이트 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 에틸디에틸포스포노아세테이트이다.
당해 반응에 있어서, 화학식 16으로 표시되는 화합물과 에틸디에틸포스포노아세테이트의 비율은, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상은 화학식 16으로 표시되는 화합물에 대해 에틸디에틸포스포노아세테이트를 1.1~10배 몰 정도 사용한다. 이때의 반응온도는, 통상은 실온 정도로 하면 된다. 또한, 반응시간은 통상 2~30시간 정도로 한다.
반응 종료 후에 있어서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용함으로써, 목적 화합물을 단리하고, 정제한다.
<합성 스킴 6-4>
상기 합성 스킴 중, R1, R2 및 R4는 상기와 동일하다.
합성 스킴 6-4는, 화학식 18로 표시되는 불포화 결합을 갖는 카르복실산 에스테르에 대해, 접촉 수소첨가반응을 행하여, 포화 카르복실산 에스테르로 하는 반응이다.
접촉 수소첨가반응은, 수소 분위기하, 촉매의 존재하에서 행해진다.
촉매는, 접촉 수소첨가반응에 사용되는 것인 한 공지의 촉매를 널리 사용할 수 있고, 예를 들면, 산화백금, 백금탄소, 수산화팔라듐, 팔라듐탄소, 레이니 니켈 등을 들 수 있다.
촉매의 사용량은, 화학식 18로 표시되는 화합물에 대해, 통상 0.001~50 중량% 정도, 바람직하게는 0.01~10 중량% 정도이다.
수소압은 특별히 제한되지 않고, 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다. 수소압은 통상 0.8~100기압 정도이고, 바람직하게는 1~3기압 정도이다.
당해 반응은 통상 적당한 용매 중에서 행해지고, 용매로서는 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성의 것이면 널리 사용할 수 있다. 사용하는 용매로서는, 예를 들면, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소 등의 지방족 할로겐화 탄화수소; 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올; 포름산메틸, 초산메틸, 초산에틸 등의 에스테르; 포름산, 초산 등의 카르복실산 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
본 반응의 온도는 통상 0~100℃ 정도이고, 바람직하게는 10~40℃ 정도이다. 반응시간은, 기질량, 온도, 촉매의 종류 등에 따라 상이하나, 수소 소비의 이론량을 기준으로 반응을 종결시키면 된다. 통상 1~50시간 정도이고, 바람직하게는 1~30시간 정도이다.
반응 종료 후는, 촉매의 여과 분별, 용매의 증류 제거 등의 일반적인 처리를 행한 후, 용매 추출, 실리카겔 칼럼크로마토그래피 등의 일반적인 방법에 의해 정제한다.
<합성 스킴 6-5>
상기 합성 스킴 중, R1, R2 및 R4는 상기와 동일하다.
합성 스킴 6-5는, 화학식 19로 표시되는 카르복실산 에스테르의 가수분해를 행하여, 목적하는 카르복실산을 얻는 공정이다.
가수분해반응으로서는, 공지의 각종 반응을 사용할 수 있다. 산성 조건하 또는 염기성 조건하에서 행해지거나, 또는 효소반응으로서 행해져도 된다.
염기성 조건은, 염기를 용매에 첨가하면 되고, 염기로서 수소화물 이온을 배출하는 물질이면 널리 사용할 수 있으며, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속의 수산화물; 수산화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수산화물; 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리금속의 탄산염; 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 알칼리금속의 탄산수소염; 초산나트륨, 초산칼륨 등의 알칼리금속의 초산염; 초산칼슘 등의 알칼리토류금속의 초산염; 수소화나트륨, 수소화칼륨 등의 알칼리금속의 수소화물; 수소화칼슘 등의 알칼리토류금속의 수소화물; 수산화암모늄, 탄산암모늄, 초산암모늄 등의 암모늄염; 트리메틸아민, 트리에틸아민, N,N-디메틸아닐린, 피리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘, 디아자비시클로옥탄(DABCO), 디아자비시클로노넨(DBN), 디아자비시클로운데센(DBU) 등의 제3급 아민을 들 수 있다. 이들 염기는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
용매로서는, 원료 화합물에 대해 적당한 용해성을 갖고, 에스테르화 반응에 악영향을 미치지 않는 불활성 용매이면 되고, 공지의 용매를 널리 사용할 수 있다. 상기 에스테르화 반응에 사용되는 용매의 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소; 클로로벤젠, 디클로로벤젠 등의 할로겐화 방향족 탄화수소: n-헥산, 시클로헥산, 석유 에테르 등의 지방족 탄화수소; 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소 등의 지방족 할로겐화 탄화수소; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르 등의 에테르; 아세톤, 2-부타논, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤; 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 벤조니트릴 등의 니트릴; N,N-디메틸포름아미드, 헥사메틸포스포릭 트리아미드(HMPA) 등의 아미드; 디메틸설폭시드 등의 설폭시드 등을 들 수 있다. 이들 용매는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상 혼합해서 사용해도 된다.
당해 반응에 있어서, 반응온도, 반응시간 등은 넓은 범위에서 적절히 선택할 수 있고, 반응온도는 통상 0℃에서 100℃ 정도로 하며, 반응시간은 통상 30분에서 20시간 정도로 할 수 있다.
반응 종료 후에 있어서는, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 감압 증류 등의 공지의 단리 및 정제방법을 적용함으로써, 목적 화합물을 단리하고, 정제한다.
화학식 4로 표시되는 화합물 중, X가 R1-CHR2-이고, n이 2인 화합물은, 예를 들면, 이하의 합성 스킴 7로 표시되는 반응에 의해 합성하는 것도 가능하다.
<합성 스킴 7>
상기 합성 스킴 중, R1 및 R2는 상기와 동일하다.
합성 스킴 7은, 화학식 16으로 표시되는 케톤화합물에 대해, 화학식 21로 표시되는 디에틸3-히드록시프로파노일포스포네이트를 호르너-에몬스 시약으로서 반응시키고, 탄소-탄소 이중결합을 형성하여 화학식 22로 표시되는 화합물을 얻고, 접촉 수소첨가반응을 행하여 화학식 23으로 표시되는 화합물을 얻으며, 알코올의 산화 반응을 행하여, 카르보닐 화합물로서의 화학식 24로 표시되는 화합물을 얻는 반응이다. 또한, 상기 합성 스킴 중에는, 화학식 22로 표시되는 화합물에 대해, 이중결합의 시스-트랜스 입체 이성체의 한쪽만을 기재하고 있으나, 당해 입체 이성체에 한정되지는 않는다.
호르너-에몬스 시약을 사용한 반응 및 접촉 수소첨가반응은, 각각 합성 스킴 6-3, 합성 스킴 6-4를 참조하여 동일하게 행할 수 있다. 또한, 알코올의 산화 반응은, 알코올을 강한 산화제로 산화함으로써 행할 수 있고, 크롬산 산화, 존스 산화 등의 공지의 방법을 사용하여 적절히 행할 수 있다. 예로서, 크롬산 산화에 있어서는, 무수크롬산, 크롬산, 이크롬산 등의 염이나 착체를 사용해서 행할 수 있다.
반응 종료 후는, 촉매의 여과 분별, 용매의 증류 제거 등의 일반적인 처리를 행한 후, 용매 추출, 실리카겔 칼럼크로마토그래피 등의 일반적인 방법에 의해 정제한다.
본 명세서에 있어서, 면역 부활이란, 세포성 면역, 액성 면역 등, 각종 면역작용을 활성화하는 것을 가리키고, 면역 부활제란, 이들의 면역활성화작용 중 어느 하나를 나타내는 것이면 된다. 본 발명의 트레할로스 화합물은, 면역계 중에서도, 적어도, 세포성 면역으로 불리는, 마크로파지나 호중구 등의 면역작용의 활성화를 행하는 것이 상정되나, 세포성 면역이 활성화된 결과, 이들 세포가 사이토카인을 유리하거나 함으로써, 추가적으로 액성 면역도 활성화되는 상황 등도 넓게 포함하는 것이다.
본 명세서에 있어서, 마크로파지 부활이란, 원래 마크로파지는 외계로부터의 이물질에 대한 식작용을 갖는 것인 바, 마크로파지의 식작용을 높이도록 작용하는 것으로서, 마크로파지의 조직으로의 부착성, 및 운동성이 향상하여, 외부로부터 침입한 세균이나 변성된 자기(自己)성분을 탐식하는 상태를 가리킨다. 마크로파지가 활성화된 상태에 있어서는, 일산화질소(NO)의 방출, 활성산소의 유리가 증대되는 것이 알려져 있다. 이들 유리물질의 방출량을 측정하여 마크로파지 활성화의 지표로 할 수 있고, 또한, 식작용의 항진 그 자체를 측정하여, 이것을 마크로파지 활성화의 지표로 하는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서, 호중구 부활이란, 원래 호중구 자체도 마크로파지와 동일한 이물질에 대한 식작용을 갖는 것인 바, 호중구의 식작용을 항진시켜, 세균 등을 탐식하는 상태이다. 호중구가 활성화된 상태에 있어서도, 일산화질소(NO)의 방출, 활성산소의 유리가 증대되는 것이 알려져 있다. 또한, 호중구의 활성화에 의해, 미소 과립이나 아주르과립의 탈과립에 의한 생리활성물질의 유리가 보이는 것도 알려져 있다. 이들 유리물질의 방출량을 측정하여 호중구 활성화의 지표로 할 수 있고, 또한, 식작용의 항진 그 자체를 측정하여, 이것을 호중구 활성화의 지표로 하는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서, 탐식세포로서는, 마크로파지 및 단구, 다핵 백혈구, 수상 세포(dendritic cell) 등을 들 수 있고, 그 식균작용이란, 면역계 세포로서, 외계로부터의 이물질로서의 병원균 등을 그 세포내의 소포(小胞)에 삽입하고, 그 소포와 세포내의 리소좀을 융합시킴으로써, 당해 이물질을 소화하는 작용을 말한다. 탐식세포의 식균작용 부활이란, 이들 탐식세포의 어느 하나를 활성화하여 그 식균작용을 높이는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 마크로파지 및 호중구 중의 한쪽 내지 양쪽의 식균작용을 항진하는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, 항세균 감염증제란, 세균에 의한 감염증, 즉, 세균이 체내에 존재함으로써 일어나는 모든 증상을 경감하는 것이면 된다. 세균으로서는, 예를 들면, 웰치균 등 외에, 녹농균, 병원성 대장균 등을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 균 생산 독소 중화제란, 세균이 생산하는 독소의 작용을 경감하는 것을 말한다. 항세균 감염증제의 경우에는, 세균의 증식 내지 세균으로부터의 독소의 방출을 억제함으로써, 세균에 의한 모든 증상을 경감하는 것도 포함하는 것에 대해, 독소 중화제의 경우에는, 독소만이 생체에 작용하고자 하는 상황에 있어서도, 독소의 작용을 저감시키는 것으로, 독소를 흡착하거나, 또는, 독소를 불활성의 것으로 개변하는, 독소를 탐식세포에 삽입하고, 더 나아가서는 삽입한 독소를 소화하는 등의 작용을 말한다.
본 발명에 있어서, 항암제란, 항종양활성을 갖고, 암의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 약제를 의도한다. 본 발명에 있어서 항암제가 작용하는 종양은, 원발성 종양, 전이 종양을 불문한다. 따라서, 본 발명의 항암제는, 원발성 암 및 전이 종양의 치료뿐 아니라, 원발성 암의 치료와 동시 또는 치료 후에 전이 종양의 예방을 위해 사용되어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서 항암제가 작용하는 종양으로서, 예를 들면, 유방암, 정소암, 고환 종양, 췌장암, 횡격막 종양, 폐암, 난소암, 위암, 담낭암, 신장암, 전립선암, 식도암, 간장암, 구강암, 결장암, 대장암, 직장암, 자궁암, 담관암, 췌도세포암, 부신피질암, 방광암, 갑상선암, 피부암, 악성 카르시노이드 종양, 흑색종, 신경교종, 골육종, 골수종, 연부조직육종, 신경아세포종, 악성 림프종이나 백혈병 등을 들 수 있으나, 그 중에서도, 유방암, 정소암, 췌장암 또는 횡격막 종양을 바람직하게 예시할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 본 발명의 트레할로스 화합물, 또는 당해 화합물과 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어를 함유하는 의약 조성물을, 면역 부활제, 세포 독소 중화제, 항암제 등의 의약 용도로 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어란, 약리학적 및 제제학적으로 허용되는 것이면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 부형제, 결합제, 분산제, 증점제, 활택제, pH 조정제, 가용화제 등의 일반적으로 제제의 제조에 사용되는 담체 외에, 항생물질, 항균제, 살균제, 방부제, 빌더, 표백제, 효소, 킬레이트제, 소포제, 착색료(염료, 안료 등), 유연제, 보습제, 계면활성제, 산화방지제, 향료, 교미제, 교취제, 용매 등이 포함된다. 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어는, 본 발명의 트레할로스 화합물(1)의 활성을 방해하지 않는 범위에서 배합할 수 있고, 캐리어를 배합함으로써, 본 발명의 트레할로스 화합물(1)의 흡수성이나 혈중농도에 영향을 미쳐, 체내 동태의 변화를 초래하는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서, 본건 화합물을 투여하는 방법이란, 본 발명의 트레할로스 화합물 그 자체 또는 당해 화합물을 함유하는 의약 조성물을 인간 또는 동물에 투여하는 방법으로, 본건 화합물 또는 의약 조성물은, 통상의 의료 제제의 형태로 제제할 수 있다. 당해 의료 제제로서는, 상기 약리학적 캐리어를 사용하여 적절히 조제된다. 투여형태로서는 특별히 한정은 없고, 치료 목적에 따라 적절히 선택하여 사용된다. 그 대표적인 것으로서, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 주사제(액제, 현탁제, 유제) 등을 들 수 있다. 이들 제제는, 통상 사용되는 방법에 의해 제조하면 된다.
상기 의료 제제의 투여량은, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고, 통상 유효성분인 트레할로스 화합물(1)을, 1일당 체중 1 ㎏에 대해 0.01~100 ㎎, 바람직하게는 0.1~50 ㎎을 1회~수회에 나누어 투여된다.
상기 투여량은, 각종 조건으로 변동되기 때문에, 상기 범위보다 적은 투여량으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기 범위를 초과한 투여량이 필요한 경우도 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정 실시 태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로, 발명을 한정하는 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」라는 용어는, 문맥상 명백히 다르게 이해해야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것이고, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 하며, 이상화되거나, 또는, 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 실시형태는 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있으나, 모식도인 경우, 설명을 명확히 하기 위해, 과장되어 표현되어 있는 경우가 있다.
제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되나, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 표기하고, 마찬가지로, 제2 요소는 제1 요소로 표기하는 것은, 본 발명의 범위를 벗어나지 않아 가능하다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명은 물론 하기 실시예에 의해 제한을 받지 않고, 전·후 기재의 취지에 적합한 범위에서 적당히 변경을 가하여 실시하는 것도 가능하고, 그들은 모두 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예
<실시예 트레할로스 디에스테르 화합물의 화학 합성>
합성 스킴 1로 나타내어진 화학식 3으로 표시되는 당의 수산기가 보호된 트레할로스 화합물과, 화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 각각 목적하는 카르보닐 화합물의 에스테르화 반응을 행하여, 화학식 7로 표시되는 화합물을 합성한 후, 당의 수산기의 탈보호를 행하여, 목적하는 트레할로스 디에스테르 화합물을 얻었다.
이하에 그 일부의 제조예를 나타내나, 본 발명은, 이하의 제조예에 한정되지 않는다.
제조예 A-1
[6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 C-1에 기재된 방법에 의해 얻어진 카르복실산(2-데실도데칸산)(145 ㎎, 425 μ㏖)과 트레할로스 유도체(2,3,4,2',3',4'-헥사벤즈옥시-α,α'-트레할로스)(150 ㎎, 170 μ㏖)를 무수 디클로로메탄 용액(2 ㎖)에 녹여, 분말 몰레큘러시브 4A(0.3 g), 4-디메틸아미노피리딘(20.8 ㎎, 170 μ㏖), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염[이하, EDCI로 약칭함](97.8 ㎎, 510 μ㏖)을 순차 첨가하고 4시간 가열 환류 반응하였다. 셀라이트-535를 사용하여 여과하고, 증류수를 첨가하여 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하여 건조하고, 여과 후 농축하였다. 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:초산에틸=10:1)를 사용해서 정제하여, 디에스테르체인 6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스(242 ㎎, 93%)를 무색 무정형 고체로서 얻었다.
제조예 A-2
[6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-2에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-옥틸데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-3
[6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-3에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-노닐운데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-4
[6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-운데실트리데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-5
[6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-5에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-도데실테트라데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-6
[6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-6에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-트리데실펜타데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-7
[6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-8에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-펜타데실헵타데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 A-8
[6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 C-9에 기재된 방법에 의해 얻어진 2-헥사데실옥타데칸산을 사용하여, 제조예 A-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 1: 제조예 α-1
[6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-1에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스(200 ㎎, 131 μ㏖)를 클로로포름:메탄올:초산(1:1:0.05)의 혼합용매(4 ㎖)에 녹여, 수산화팔라듐(20 w/w%, 8 ㎎, 11.4 μ㏖)을 첨가하고 1기압 수소하, 6시간 교반하였다. 반응 혼합액을 여과 후 농축하고, 잔사를 칼럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하여, 6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스(125 ㎎, 97%)를 무색 무정형 고체로서 얻었다.
실시예 2: 제조예 α-2
[6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-2에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 3: 제조예 α-3
[6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-3에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 4: 제조예 α-4
[6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 5: 제조예 α-5
[6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-5에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 6: 제조예 α-6
[6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-6에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 7: 제조예 α-7
[6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-7에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 8: 제조예 α-8
[6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 A-8에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 α-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-1
[6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 D-1에 기재된 방법에 의해 얻어진 카르복실산(3-노닐도데칸산)(236 ㎎, 724 μ㏖)과 트레할로스 유도체(2,3,4,2',3',4'-헥사벤즈옥시-α,α'-트레할로스)(256 ㎎, 290 μ㏖)를 무수 디클로로메탄 용액(10 ㎖)에 녹여, 분말 몰레큘러시브 4A(1 g), 4-디메틸아미노피리딘(35.4 ㎎, 290 μ㏖), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염[이하, EDCI로 약칭함](222 ㎎, 1.16 m㏖)을 순차 첨가하고 10시간 가열 환류 반응하였다. 셀라이트-535를 사용하여 여과하고, 포화 식염수를 첨가하여 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하여 건조하고, 여과 후 농축하였다. 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:초산에틸=15:1)를 사용해서 정제하여, 디에스테르체인 6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스(350 ㎎, 80%)를 무색 무정형 고체로서 얻었다.
제조예 B-2
[6,6'-비스-O-(3-옥틸운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 D-2에 기재된 방법에 의해 얻어진 3-옥틸운데칸산을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-옥틸운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-3
[6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 D-3에 기재된 방법에 의해 얻어진 3-데실트리데칸산을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-4
[6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 D-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 3-운데실테트라데칸산을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-5
[6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 D-5에 기재된 방법에 의해 얻어진 3-도데실펜타데칸산을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-6
[6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 시판의 3-트리데실헥사데칸산(와코우 순약 공업주식회사 제조)을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
제조예 B-7
[6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스의 합성]
카르복실산으로서, 제조예 D-6에 기재된 방법에 의해 얻어진 3-테트라데실헵타데칸산을 사용하여, 제조예 B-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 9: 제조예 β-1
[6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-1에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스(350 ㎎, 233 μ㏖)를 클로로포름:메탄올:초산(5:1:0.5)의 혼합용매(5 ㎖)에 녹여, 수산화팔라듐(3 w/w%, 13 ㎎, 18.5 μ㏖)을 첨가하고 1기압 수소하, 27시간 교반하였다. 반응 혼합액을 여과 후 농축하고, 잔사를 칼럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=15:1)로 정제하여, 6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스(135 ㎎, 61%)를 무색 무정형 고체로서 얻었다.
실시예 15: 제조예 β-2
[6,6'-비스-O-(3-옥틸운데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-2에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-옥틸운데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-옥틸운데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 10: 제조예 β-3
[6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-3에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 11: 제조예 β-4
[6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 12: 제조예 β-5
[6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-5에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 13: 제조예 β-6
[6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-6에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
실시예 14: 제조예 β-7
[6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스의 합성]
제조예 B-7에 기재된 방법에 의해 얻어진 6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-2,3,4,2',3',4'-헥사벤질-α,α'-트레할로스를 원료 화합물로서 사용하여, 제조예 β-1과 동일한 방법에 의해, 6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스를 얻었다.
[원료가 되는 카르복실산화합물의 합성]
제조예 C-1
[2-데실도데칸산의 합성]
건조시킨 2구 플라스크에 무수 THF(11 ㎖)를 첨가하고, 거기에 수소화나트륨(60 w/w%, 397 ㎎, 9.93 m㏖)을 첨가하여, 0℃로 냉각하고, 말론산디에틸(530 ㎎, 3.31 m㏖)을 적하하였다. 0℃에서 10분 교반하고, 1-요오도데칸(2.22 g, 8.28 m㏖)을 첨가하여, 실온에서 6시간 교반하였다. 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 에테르로 3회 추출하고, 유기층을 무수 황산마그네슘을 사용하여 건조시키고, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 10 N 수산화나트륨 수용액(4 ㎖)과 n-부탄올(8 ㎖)의 혼합용매에 녹여, 6시간 가열 환류하였다. 그 후, 실온까지 냉각하고, 1 N 염산을 첨가하여, 에테르로 3회 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨을 사용하여 건조시키고, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 초산(3.3 ㎖)에 녹여, 18시간 가열 환류하였다. 냉각 후, 감압 농축하여 초산을 제거하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피(헥산:초산에틸=7:1)로 정제하여, 카르복실산(2-데실도데칸산)(710 ㎎, 63%)을 무정형 백색 분말로서 얻었다.
제조예 C-2
[2-옥틸데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도옥탄을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-옥틸데칸산을 얻었다.
제조예 C-3
[2-노닐운데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도노난을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-노닐운데칸산을 얻었다.
제조예 C-4
[2-운데실트리데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도운데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-운데실트리데칸산을 얻었다.
제조예 C-5
[2-도데실테트라데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도도데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-도데실테트라데칸산을 얻었다.
제조예 C-6
[2-트리데실펜타데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도트리데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-트리데실펜타데칸산을 얻었다.
제조예 C-7
[2-테트라데실헥사데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도테트라데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-테트라데실헥사데칸산을 얻었다.
제조예 C-8
[2-펜타데실헵타데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도펜타데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-펜타데실헵타데칸산을 얻었다.
제조예 C-9
[2-헥사데실옥타데칸산의 합성]
1-요오도데칸 대신에, 1-요오도헥사데칸을 사용하여, 제조예 C-1과 동일한 방법에 의해, 2-헥사데실옥타데칸산을 얻었다.
제조예 D-1
[3-노닐도데칸산의 합성]
이하의 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법에 의해, 3-노닐도데칸산을 합성하였다.
제조예 D-1-1
[N-메톡시-N-메틸데칸아미드의 합성]
데칸산(4 g, 23.2 m㏖)을 무수 디클로로메탄 용액(80 mL)에 녹여, 1,1-카르보닐디이미다졸(4.5 g, 27.9 m㏖)을 첨가하고 1.5시간 교반하였다. 이어서 N,O-디메틸히드록시아민 염산염(2.7 g, 27.9 m㏖)을 첨가하고, 추가적으로 3시간 교반하였다. 증류수를 첨가한 후, 디클로로메탄을 사용하여 2회 추출하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하여 건조하고, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:초산에틸=8:1)를 사용해서 정제하여, 아미드체인 N-메톡시-N-메틸데칸아미드(4.8 g, 97%)를 무색 투명한 액체로서 얻었다.
제조예 D-1-2
[10-노나데카논의 합성]
연마한 삭상(削狀) 마그네슘(3.2 g, 134 m㏖)을 가열하여, 1-브로모노난(12.9 ㎖, 67.5 m㏖)의 무수 THF 용액(68 ㎖)을 천천히 적하하였다. 1.5시간 가열 환류한 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 이것을 제조예 D-1-1에 기재된 방법에 의해 얻어진 N-메톡시-N-메틸데칸아미드(4.8 g, 22.5 m㏖)의 THF(80 mL) 용액 중에 적하하였다. 30분 교반한 후, 1 N 염산을 첨가하고 디에틸에테르로 2회 추출하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하여 건조하고, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:디클로로메탄=8:1)로 정제하여, 케톤체인 10-노나데카논(6.0 g, 95%)을 백색 무정형 고체로서 얻었다.
제조예 D-1-3
[에틸3-노닐-2-도데케노에이트의 합성]
수소화나트륨(60 w/w%, 6 g, 142 m㏖)을 무수 THF(200 ㎖)에 녹여, 0℃까지 냉각한 후, 에틸디에틸포스포노아세테이트(34 ㎖, 171 m㏖)를 적하하고, 30분 교반하였다. 실온까지 승온 후, 제조예 D-1-2에 기재된 방법에 의해 얻어진 10-노나데카논(6.0 g, 21.3 m㏖)을 첨가하고, 추가적으로 18시간 가열 환류하였다. 증류수를 첨가하고 디에틸에테르를 사용해서 2회 추출하여, 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하고 건조하여, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:디클로로메탄=6:1)로 정제하여, 에스테르체인 에틸3-노닐-2-도데케노에이트(7.6 g, 99%)를 무색 투명한 액체로서 얻었다.
제조예 D-1-4
[에틸3-노닐도데카노에이트의 합성]
제조예 D-1-3에 기재된 방법에 의해 얻어진 에틸3-노닐-2-도데케노에이트(7.6 g, 21.7 m㏖)를 클로로포름:메탄올(5:1)의 혼합용매(100 ㎖)에 녹여, PtO2 촉매(3 w/w%, 223 ㎎, 983 μ㏖)를 첨가하여 1기압 수소하, 23시간 교반하였다. PtO2 촉매를 여과지를 사용하여 제거하고, 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:디에틸에테르=50:1)로 정제하여, 에틸3-노닐도데카노에이트(7.1 g, 92%)를 무색 투명한 액체로서 얻었다.
제조예 D-1-5
[3-노닐도데칸산의 합성]
제조예 D-1-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 에틸3-노닐도데카노에이트(6.3 g, 17.7 m㏖)를 수포화 부탄올 용액(80 ㎖)에 녹여, KOH(10 g, 177 m㏖)를 첨가하고 4.5시간 가열 환류하였다. 1 N 염산을 첨가하고 디에틸에테르로 2회 추출하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 첨가하여 건조하고, 여과 후 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(헥산:초산에틸=10:1)로 정제하여, 3-노닐도데칸산(6.3 g, 99%)을 무색 투명한 액체로서 얻었다.
제조예 D-2
[3-옥틸운데칸산의 합성]
출발 화합물로서, 제조예 D-1-1에 기재된 데칸산 대신에 옥탄산을 사용하고, 제조예 D-1-2에 기재된 1-브로모노난 대신에 1-브로모옥탄을 사용하며, 각 공정에 있어서 제조한 화합물을 다음의 공정에 사용하고, 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법과 동일하게 해서 합성하여, 3-옥틸운데칸산을 얻었다.
제조예 D-3
[3-데실트리데칸산의 합성]
출발 화합물로서, 제조예 D-1-1에 기재된 데칸산 대신에 운데칸산을 사용하고, 제조예 D-1-2에 기재된 1-브로모노난 대신에 1-브로모데칸을 사용하며, 각 공정에 있어서 제조한 화합물을 다음의 공정에 사용하고, 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법과 동일하게 해서 합성하여, 3-데실트리데칸산을 얻었다.
제조예 D-4
[3-운데실테트라데칸산의 합성]
출발 화합물로서, 제조예 D-1-1에 기재된 데칸산 대신에 도데칸산을 사용하고, 제조예 D-1-2에 기재된 1-브로모노난 대신에 1-브로모운데칸을 사용하며, 각 공정에 있어서 제조한 화합물을 다음의 공정에 사용하고, 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법과 동일하게 해서 합성하여, 3-운데실테트라데칸산을 얻었다.
제조예 D-5
[3-도데실펜타데칸산의 합성]
제조예 D-1-5에 기재된 에틸3-노닐도데카노에이트 대신에, 제조예 D-5-4에 기재된 방법에 의해 얻어진 에틸3-도데실펜타데카노에이트를 사용하여, 제조예 D-1-5와 동일한 방법에 의해, 3-도데실펜타데칸산을 얻었다.
출발 화합물로서, 제조예 D-1-1에 기재된 데칸산 대신에 트리데칸산을 사용하고, 제조예 D-1-2에 기재된 1-브로모노난 대신에 1-브로모도데칸을 사용하며, 각 공정에 있어서 제조한 화합물을 다음의 공정에 사용하고, 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법과 동일하게 해서 합성하여, 3-도데실펜타데칸산을 얻었다.
제조예 D-6
[3-테트라데실헵타데칸산의 합성]
출발 화합물로서, 제조예 D-1-1에 기재된 데칸산 대신에 펜타데칸산을 사용하고, 제조예 D-1-2에 기재된 1-브로모노난 대신에 1-브로모테트라데칸을 사용하며, 각 공정에 있어서 제조한 화합물을 다음의 공정에 사용하고, 제조예 D-1-1 내지 D-1-5에 기재된 방법과 동일하게 해서 합성하여, 3-테트라데실헵타데칸산을 얻었다.
[기타 화합물의 합성]
상기 제조예와 동일하게 하여, 실시예 16 내지 22의 화합물을 얻었다. 당해 화합물은, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해, 화학식 중, X, X', n 및 n'가, 이하의 표 1에 나타내어지는 것이다.
[화학식 1]
[생리활성의 측정]
본 발명의 화합물에 대해, 이하의 시험을 행하여, 활성을 측정하였다.
본 발명의 실시예 화합물에 대해, 실시예 번호, 제조예 번호 및 그 화학 구조식을, 이하의 표 2에 나타낸다. 실시예 화합물은, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물이고, 화학식 중, X, X', R1, R1', R2, R2', n 및 n'는 이하의 것을 가리킨다.
[화학식 1]
또한, 시험에는 결핵균 유래의 공지의 천연 화합물인 TDCM을 양성 대조로서 사용하였다. 또한, TDCM은 이하의 화학 구조식으로 표시된다.
시험예 1(마크로파지 활성화능의 측정)
시험예 1(1)<형광강도 측정장치를 사용한 마우스 복강 마크로파지로부터의 활성산소 유리 측정>
<인산 버퍼(PBS)의 조제>
염화나트륨 8.0 g, 염화칼륨 0.2 g, 인산수소이나트륨 1.15 g, 인산이수소칼륨 0.2 g을 1,000 ㎖의 증류수(D. W.)로 용해하였다.
<마우스 복강 마크로파지의 조제>
5% 티오글리콜산 배지(Difco, BD, code. 225640, Lot. 6192372) 3 ㎖를 마우스(ICR 마우스(SPF), 5주령, 수컷) 복강에 투여하였다. 투여 4일 후, 디에틸에테르를 사용하여 마우스를 사망시켰다. 복부 중앙의 표피를 가위로 조금 자르고, 복부를 잡아 복부 표피를 벗겨 내었다. 26G의 바늘을 장착한 10 ㎖의 시린지로 0.05% EDTA 함유 PBS(-)(EDTA 2 Na, 뉴클레아제 및 프로테아제 tested, 나칼라이 테스크) 5 ㎖를 복강 내에 전량 주입하였다. 그 후, 복부의 옆을 잡듯이 하여 40~50회 정도 마사지하였다. 복강 내부의 액을 23G 주사바늘로 천천히 작은 원침관에 채취한다. 이 조작을 2회 반복하였다. 채취한 마크로파지를 1,000 rpm으로 8분간 원심하였다. 상청을 버리고, RPMI1640 배지(RPMI-1640, L-글루타민 및 페놀 레드 함유, 와코우, 189-02025, Lot. WRM8043에 10.61% 불활성화 혈청(Bio West), 1% 페니실린 스트렙토마이신(GIBCO)을 포함한다)로 침전을 현탁하였다. 원침관을 RPMI1640 배지로 채우고, 재차 1,000 rpm으로 8분간 원심하였다. 상청을 버리고, RPMI1640 배지로 현탁 후, One Cell Counter(와켄야쿠)로 마크로파지의 수를 계측하였다. RPMI-1640 배지를 사용하여, 임의의 농도로 희석하였다. 이와 같이 하여 얻어진 마우스 복강 마크로파지를 이하의 시험에 사용하였다.
<40 mM 시험 화합물 용액의 조제>
40 mM 시험 화합물 용액을 이하와 같이 하여 조제하였다.
BSA 0.7 g을 대시험관에 칭량(稱量)하였다. 멸균 PBS(-) 10 ㎖를 첨가하고, 잘 교반 후, LPS 제거 칼럼(Endo Trap(상표) red 1/1(proofs))을 사용하여, BSA 용액에 함유되어 있는 불순물을 제거하였다. 그 후, 처리 BSA 용액을 멸균 필터(0.2 ㎛)로 여과하였다. 다음으로, Nano Drop ND-1000을 사용하여 단백 정량하고, 최종적인 농도가 2%가 되도록 멸균 PBS(-)로 희석하였다. 칭량한 시험 화합물을, 2% BSA(PBS(-) 중에 BSA 2%를 용해한 것) 250 ㎕와 함께 호모지나이저에 넣고, 호모지나이저에 넣은 채로 배스 타입 초음파장치로 150초간 처리하였다. 이와 같이 하여 조제한 용액을 에펜도르프 튜브로 옮기고, 이하의 시험에 사용하였다. 양성 대조로서는, 시험 화합물로서, TDCM을 사용하여 동일하게 조제하고, 또한, 음성 대조로서는, 시험 화합물을 아무것도 첨가하지 않고, 동일하게 조제하였다. 시험 화합물을 포함하지 않는 조제액에 대해서, 이하, 「vehicle」이라 한다.
<행크스 평형화염 용액(Hanks' balanced salt solution, HBS)의 조제>
염화칼륨 0.4 g, 인산이수소칼륨 0.06 g, 인산수소이나트륨 0.107 g, 염화나트륨 8 g을 증류수(D. W.)로 용해 후, 1 N 수산화나트륨으로 pH 7.4로 조정하고, 증류수(D. W.)로 전량 1,000 ㎖로 하여, 행크스 평형화염 용액(HBS)을 조제하였다.
<글루코오스 및 BSA 함유 행크스 평형화염 용액(HBSG-BSA)의 조제>
글루코오스 0.1 g 및 BSA(sigma) 0.03 g을, 상기에서 조제한 HBS 100 ㎖에 용해하고, 글루코오스 및 BSA 함유 행크스 평형화염 용액(HBSG-BSA)을 조제하였다(사용시 조제).
<마크로파지로부터의 활성산소 유리의 측정>
마우스 복강 마크로파지, 40 mM 시험 화합물 용액 및 BSA 함유 행크스 평형화염 용액(HBSG-BSA)은, 상기와 동일하게 해서 조제하였다.
HBSG-BSA로 마크로파지를 세정 후, 5 mL 정도의 HBSG-BSA로 현탁하고, 96웰의 콜라겐 웰(TC-PLATE 96 WELL, STERILE WITH LID, IND PACKED)에 100 ㎕씩 분주(分注)하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트를 행하여, 세포를 웰에 부착시켰다. 상청을 제거하고, HBSG-BSA를 100 ㎕ 첨가하며, 10 mM의 H2DCFDA(2',7'-디클로로디히드로플루오레세인디아세테이트, invitrogen)를 1 ㎕ 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이트를 행하고, 상청을 제거 후, 시험 화합물을 포함한 HBSG-BSA 또는 음성 대조로서의 vehicle을, 시험 화합물의 최종 농도가 50 μM가 되도록 첨가하고, 1시간 후 Genios 형광강도 측정장치로 측정하였다.
또한, 상기 H2DCFDA는 형광 프로브로, 과산화수소(H2O2)의 존재하에 있어서, 형광강도가 증대되기 때문에, 형광강도를 측정함으로써, 과산화수소(H2O2)의 생산량을 측정할 수 있다. 과산화수소(H2O2)는, 마크로파지가 생산하는 슈퍼옥사이드(O2-)로부터 파생된 것으로, 과산화수소(H2O2) 생산량을 지표로 하여, 마크로파지의 활성화도를 나타낼 수 있다.
측정결과를 도 1에 나타낸다.
도 1 <마우스 복강 마크로파지로부터의 활성산소 유리량>
도 1에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 시험 화합물은 모두, TDCM과 동등 또는 그 이상으로, 마우스 복강 마크로파지로부터의 활성산소의 생산을 촉진하는 작용을 나타내었다. 특히, 본 발명의 화합물 중, 실시예 1의 화합물 및 실시예 9의 화합물은, TDCM의 2배를 초과하는 고활성을 나타내었다.
시험예 1(2)
<마우스 복강 마크로파지 탐식능의 측정>
마우스 복강 마크로파지, 40 mM 시험 화합물 용액 및 RPMI1640 배지는, 상기와 동일하게 해서 조제하였다.
이하에서는, 형광 비드로서, Fluoresbrite(상표) Carboxylate Microspheres(2.58% Solids-Latex) YG(Polysciences, Inc.)를 사용하였다.
TC-플레이트(TC-PLATE 24 WELL, STERILE WITH LID, IND PACKED, greiner bio-one)에 80% confluent가 되도록 마크로파지를 첨가하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 상청을 버리고, 500 ㎕의 RPMI1640 배지로 두번 세포를 세정하였다. 하기의 표 3에 나타내어지는 조성을 TC-플레이트에 구성하여, 37℃에서 2시간 인큐베이션하고, 상청을 제거 후, 300 ㎕의 멸균 PBS(-)로 세포를 세정하였다. 삽입되어 있지 않은 형광 비드의 제거를 위해, 이 세정조작을 2회 반복하였다. 200 ㎕의 멸균 PBS(-)로 마크로파지를 벗겨 내고, 마크로파지를 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 1,500 rpm으로 8분간 원심 후, 상청을 제거하고, 100 ㎕의 멸균 PBS(-)로 잘 현탁하였다. 재차, 1,500 rpm으로 8분간 원심 후, 상청을 제거하고, 100 ㎕의 멸균 PBS(-)로 잘 현탁하였다.
FUJIFILM FLA-2000을 사용하여, 세포내에 삽입된 형광 비드량을 측정하였다[형광강도(Fluor473 nm, Y520Filter)]. 해석은 Image Reader V1.4J를 사용하였다.
측정결과를 도 2에 나타낸다.
도 2 <마우스 복강 마크로파지 탐식능>
도 2에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 시험 화합물은 모두, TDCM과 동등 또는 그 이상으로, 마우스 복강 마크로파지의 탐식작용을 활성화하는 작용을 나타내었다. 특히, 본 발명 화합물 중, 실시예 1의 화합물 및 실시예 9의 화합물은, TDCM의 약 2배의 고활성을 나타내었다.
시험예 2(호중구 활성화능의 측정)
<토끼 호중구 현탁액의 조제>
행크스 평형화염 용액(HBS), 글루코오스 및 BSA 함유 행크스 평형화염 용액(HBSG-BSA)은, 시험예 1(1)과 동일하게 해서 조제하였다.
<구연산-글루코오스 용액(ACD액)의 조제>
구연산나트륨 6.25 g, 구연산 3.125 g 및 글루코오스 5 g을 증류수(D. W.) 250 ㎖로 용해하고, 사용할 때까지 4℃에서 보존하였다.
<적혈구 용해 용액(Lysis액)의 조제>
EDTA 0.037 g, 탄산수소칼륨 1 g 및 염화암모늄 8.3 g을 증류수(D. W.) 1,000 ㎖로 용해하고, 사용할 때까지 4℃에서 보존하였다.
<인산 버퍼(PBS)의 조제>
시험예 1(1)과 동일하게 해서 조제하였다.
<1.2% 덱스트란-PBS 용액의 조제>
덱스트란 T500(파마시아) 1.2 g을 증류수(D. W.) 100 ㎖로 용해하고, 오토클레이브(121℃, 20분간)로 멸균하여, 사용할 때까지 4℃에서 보존하였다.
<토끼 호중구 현탁액의 조제방법>
5 ㎖의 ACD액을 20 ㎖의 시린지(주사바늘[Nipro])에 취하고, 시린지 내를 일률적으로 린스하였다. 토끼의 귓바퀴 중심 동맥으로부터 혈액을 시린지로 20 ㎖ 채취하고, 조용히 전도혼화(轉倒混和) 후, 원침관(15 ㎖ 타입: Falcon) 3개에 분주하고, 4℃, 1,500 rpm으로 5분간 원심 후, 상청을 원침관(50 ㎖ 타입: Falcon)에 회수하였다. 회수한 상청과 등량의 1.2% 덱스트란-PBS 용액을 첨가하여 완만하게 전도혼화한 후, 실온에서 30분간 이상 방치하였다. 경계면을 확인하고, 상청을 새로운 원침관(50 ㎖ 타입: Falcon)에 넣었다. 나머지 용액에 등량의 1.2% 덱스트란-PBS 용액을 첨가하여 완만하게 전도혼화한 후, 실온에서 30분간 이상 방치하였다. 경계면을 확인하고, 상청을 원침관(50 ㎖ 타입: Falcon)에 넣었다. 회수한 상청을 4℃, 2,000 rpm으로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 침사(沈渣)에 Lysis액 15 ㎖를 첨가하고, 조용히 현탁 후, 추가로, Lysis액 5 ㎖를 첨가하여 전도혼화하고, 얼음 속에서 5분간 방치하였다. HBSG-BSA로 전량을 50 ㎖로 하고, 4℃, 2,000 rpm으로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 침사를 HBSG-BSA 2 ㎖로 현탁하고, 이 세포 현탁액을 Lymphoprep[Nycomed, 808068] 2 ㎖(원침관, 15 ㎖ 타입)의 상층에 조용히 중층하고, 1,200 rpm으로 20분간 원심 후(원심기의 조건: accel 0.5, break Off), 상청을 아스피레이터로 제거하였다. 잔존하는 Lyphoprep를 제거하기 위해, 침사(호중구)를 HBSG-BSA에 현탁하고, 재차, 1,500 rpm으로 5분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 호중구를 HBSG-BSA로 현탁하고, 세포 수 계측장치「celltac」[니혼코우덴]로 세포 수를 측정하였다.
<시험 화합물의 에멀젼 용액의 조제>
시험 화합물 및 TDCM의 에멀젼 용액을 시험예 1(1)과 동일하게 해서 조제하였다.
<10 mM H2DCFDA(2',7'-디클로로디히드로플루오레세인디아세테이트(Molecular Probes)의 조제>
4.86 ㎎의 H2DCFDA를 1 ㎖의 DMSO로 용해하였다.
시험예 2(1)
<토끼 호중구로부터의 활성산소 유리량의 측정>
토끼 호중구로부터의 활성산소 유리에 대한 영향을 이하의 순서로 측정하였다.
96 웰 플레이트(Falcon)에 호중구(1.0×105개/100 ㎕)를 파종하였다. 이것에 10 mM H2DCFDA를 1 ㎕ 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 여분의 H2DCFDA를 제거하기 위해, HBS를 300 ㎕ 첨가하여 현탁 후, 8,000 rpm으로 5분간 원심하였다. 상청을 제거하고 HBS로 현탁 후, 종농도가 50 μM가 되도록 HBS를 첨가하였다. 이것을 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 형광측정장치로 활성산소 유리량을 측정하였다(Ex: 485 nm, Em: 535 nm).
결과를 도 3에 나타낸다.
도 3 <토끼 호중구로부터의 활성산소 유리량>
도 3에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 화합물은 대략 TDCM과 동일 정도 또는 그 이상으로, 토끼 호중구로부터의 활성산소 유리를 활성화하는 작용을 나타내었다. 특히, 본 발명 화합물 중, 실시예 1의 화합물은, TDCM의 약 2배의 활성을 나타내었다.
시험예 2(2)
<토끼 호중구 탐식능의 측정>
(2) 암피실린 내성 대장균 및 옵소닌화 대장균 제작법
<L-broth의 조제>
증류수(D. W.) 1 L에 대해 트립토판 10 g, NaCl 5 g, Yeast Extract 5 g 및 MgSO4 1 ㎖를 용해하였다.
<옵소닌화제의 조제>
10 ㎎의 옵소닌화제(BioParticles Opsonizing Reagent(Molucular Probes))를 500 ㎕의 초순수로 용해하였다.
<암피실린 내성 대장균의 제작>
일렉트로포레이션용 셀(JM109)을 얼음 속에서 용해하고, 암피실린 내성의 유전자를 대장균에 도입하기 위해, JM109에 2 ㎕의 암피실린 내성 플라스미드(pT7Blue, Novagen, 100 ng/㎕)를 첨가하여 현탁하고, 그 현탁액을 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겨 펄스(2.5 kV, 200 Ω, 25 mF)를 걸었다. 펄스를 건 균액을, L-broth 배지 1 ㎖를 넣은 5 ㎖ 튜브에 옮기고, 37℃에서 3시간 배양하였다. 그 용액을 0.005% 암피실린을 포함하는 L-broth의 한천배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다(배지에 뿌릴 때에, 3,500 rpm으로 5분간 원심을 행한 후, 상청을 800 ㎕ 제거하고, 침사를 현탁 후, 샬레에 뿌렸다). 다음 날 샬레에 자란 균을 소량 긁어 내고, 2 ㎖의 L-broth 배지에 용해하여, 약 4시간 교반 배양을 행하였다.
<옵소닌화 대장균 제작법>
상기에서 제작한 암피실린 내성 대장균 용액 100 ㎕와 용해한 옵소닌화제 100 ㎕를 에펜도르프 튜브 내에서 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 37℃에서 1시간 인큐베이션하고, 그 현탁액을 300 ㎕의 PBS로 현탁 후, 1200G, 15분간 원심하고 상청을 제거하였다. 추가적으로, 얻어진 액을 300 ㎕의 PBS로 현탁 후, 1200G, 15분간 원심하고 상청을 제거하였다. 2회 반복하였다. 100 ㎕의 L-broth에 1 ㎕의 균액을 첨가하고 잘 현탁하여 100배 희석하였다. 100배 희석한 균액을 10 ㎕ 원셀 카운터에 첨가하고, 현미경으로 균수를 계수하였다.
<토끼 호중구 탐식능의 측정>
상기 방법에 의해 조제한 호중구 1.0×105개를 에펜도르프 튜브에 분취하고, HBS로 현탁 후, 50 μM의 시험 화합물의 에멀젼 용액 또는 TDCM의 에멀젼 용액으로 1시간 처리를 행하였다. 대조는 2% BSA 용액을 사용해서 동일하게 행하였다. 300 ㎕의 HBS를 첨가하여 현탁하고, 1200G로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 추가적으로, 얻어진 액에 300 ㎕의 HBS를 첨가하여 현탁하고, 1200G로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 처리 호중구에 1.0×107 cells의 옵소닌화한 암피실린 내성 대장균을 잘 현탁 후, 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 여분의 대장균을 제거 후, 0.5% TritonX-100(생리식염수 중)을 100 ㎕ 첨가하고, 잘 현탁하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션을 행하였다. TritonX-100 처리에 의해 호중구를 파괴함으로써, 호중구 내부에 삽입되어 있던 대장균의 양을 비교 정량하기 위해, 다음으로, TritonX-100 처리 용액 전량을 0.005% 암피실린 함유 보통 한천배지에 뿌리고, 콘라디봉으로 전체로 펼쳤다. 24시간, 37℃에서 인큐베이션을 행하고, 호중구 내부에 삽입되어 있던 대장균의 콜로니 수를 계수하였다.
결과를 도 4에 나타낸다.
도 4 <토끼 호중구 탐식 활성>
도 4에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 화합물은 모두 토끼 호중구의 탐식능을 활성화하는 작용을 나타내었다. 특히, 본 발명 화합물 중, 실시예 1의 화합물은 TDCM의 약 2배의 활성을 나타내었다.
시험예 3
<시험 화합물 처리에 의한 마우스 복강 마크로파지로부터의 사이토카인 유리 측정>
마우스 복강 마크로파지, 40 mM 시험 화합물 용액 및 RPMI1640 배지는, 상기와 동일하게 해서 조제하였다.
TC-플레이트에 80% confluent가 되도록 마크로파지를 첨가하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 상청을 버리고, 500 ㎕의 RPMI1640 배지로 세포를 세정하였다. 이 세정조작을 2회 반복하였다. 시험 화합물(최종농도 100 μM)의 에멀젼 용액을 마크로파지에 작용시키고, 2시간 후, 배지를 별도의 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 10,000 rpm으로 10분간 원심 후, 상청을 추가적으로 별도의 에펜도르프 튜브에 옮기고, 당해 상청을 샘플로 하여, 유리된 사이토카인을 ELISA kit(IL-6, TNF-α Quantikine Immnoassay(R&D Systems(상표))를 사용해서 해석하였다.
마우스 복강 마크로파지로부터의 IL-6 유리에 대해서, 음성 대조로서의 vehicle의 값은, IL-6 유리에 대해서 약 15 pg/㎖였던 것에 반하여, 본 발명 화합물 중, 특히 활성이 높다고 생각되는 실시예 1의 화합물은, 약 200 pg/㎖의 활성을 나타내었다. 또한, 마우스 복강 마크로파지로부터의 TNF-α 유리에 대해서, 음성 대조로서의 vehicle의 값은, 약 80 pg/㎖였던 것에 반하여, 실시예 1의 화합물은 약 1,000 pg/㎖의 활성을 나타내었다.
시험예 4
<시험 화합물 처리에 의한 THP-1 세포로부터의 IL-8 유리 측정법>
RPMI 배지 용액은 상기와 동일하게 해서 조제하고, 이를 사용하여, 시험 화합물의 RPMI 배지 용액을 이하와 같이 하여 조제하였다.
시험 화합물 1.0 ㎎을 25 ㎕의 DMSO 중에 약 1분간 초음파처리하여 용해시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 40 mM의 시험 화합물 원액을 100 ㎕의 RPMI 배지에 50 μM(종농도)가 되도록 첨가하고, 초음파로 5초간 처리하였다. 대조가 되는 Vehicle은, 40 mM의 시험 화합물 원액 대신에 용매만을 RPMI 배지에 동일한 양을 첨가하고, 초음파로 5초간 처리하였다.
THP-1 세포(리켄 세포 BANK로부터 구입)를 RPMI 배지에서 1.0×106 cells/100 ㎕가 되도록 조제하고, 멸균 에펜도르프 튜브에 100 ㎕씩 분주하였다. 상기와 같이 조제한 시험 화합물의 RPMI 배지 용액 100 ㎕를 5초간 초음파 처리 후, 세포를 분주한 에펜도르프 튜브에 전량 첨가하였다. 2시간 후, 반응 에펜도르프 튜브를 5,000 rpm으로 5분간 원심하고, 상청 중의 IL-8 유리량을 ELISA kit(human IL-8 ELISA kit(R&D Systems(상표)))를 사용해서 측정하였다.
시험결과를 도 5에 나타낸다.
본 발명 화합물 중, 특히 면역 부활 활성이 높다고 생각되는 화합물에 대해서 측정한 바, 도 5에 나타내어지는 바와 같이, 실시예 1의 화합물 및 실시예 9의 화합물은, TDCM의 약 0.6배, 약 0.8배의 활성을 나타내었다.
시험예 5
<시험 화합물 투여 마우스에 있어서의 말초혈 중으로의 IL-6, TNF-α, IFN-γ의 유리 측정>
시험 화합물의 에멀젼 용액을 이하와 같이 해서 조제하였다.
이하에 있어서, 시험 화합물은 제조예 α-1~8에 있어서 합성한 화합물, 제조예 β-1~7에 있어서 합성한 화합물 및 비교예로서의 TDCM을 말한다.
시험 화합물을 칭량하고(100 ㎍/마우스), 미크로스파텔(microspatel)을 사용하여, 전량을 호모지나이저(WEATON USA 10 ㎖)의 바닥부에 넣었다. 한 방울의 미네랄 오일(나칼라이 테스크)을 적하하고, 호모지나이즈 후, 배스 타입 초음파로 150초간 처리하였다. 추가적으로, 1.1% Tween80(폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트, 나칼라이 테스크)과 5.6% 만니톨을 함유한 생리식염수 1.0 ㎖를 호모지나이저에 첨가하였다. 수회 호모지나이즈하고, 시험 화합물 용해 미네랄 오일과 용매를 잘 융합시켰다. 완성한 용액을 에펜도르프 튜브에 옮기고, 62℃에서 30분간 저온 살균을 행하였다.
호모지나이저를 사전에 3분간 얼음 속에 담가 두었다. 1.0 ㎎의 각종 시험 화합물을 각각 호모지나이저에 취하고, 미네랄 오일을 첨가하여 초음파로 150초간 처리하였다. 오일이 끈적끈적해진 것을 확인하고, 거기에 1.0 ㎖의 생리식염수(1.1% Tween 및 5.6% 만니톨 함유)를 첨가하고 약 1분간 호모지나이즈하였다. 샘플을 에펜도르프 튜브에 옮기고, 62℃에서 30분간 저온 살균하였다.
1군 2마리의 마우스에, 상기와 같이 조제한 시험 화합물 에멀젼 용액(100 ㎍/마우스)을 정맥주사에 의해 투여하고, 2시간 후 심장 채혈(헤파린 채혈)을 행하였다. 10,000 rpm으로 10분간 원심 후, 혈장만을 사용하여, ELISA 키트(IL-6, TNF-α, IFN-γ Quantikine Immunoassay(R&D Systems(상표))로 각종 사이토카인량을 측정하였다.
측정결과를 도 6, 도 7, 도 8에 나타낸다.
도 6 <마우스 혈장 중 IL-6 농도(pg/㎖)>
도 7 <마우스 혈장 중 IFN-γ 농도(pg/㎖)>
도 8 <마우스 혈장 중 TNF-α 농도(pg/㎖)>
도 6에 보여지는 바와 같이, 본 발명 시험 화합물을 투여한 마우스에 있어서, 혈장 중 IL-6 농도의 증가가 보였다. 특히, 본 발명 화합물 중, 실시예 1의 화합물, 실시예 9의 화합물은 모두, 양성 대조로 한 천연 유래의 공지의 트레할로스 디에스테르화합물인 TDCM에 대해, 각각 약 1.2배, 약 1.5배 정도의 높은 IL-6 유리 활성을 나타내었다. 실시예 13의 화합물 및 실시예 14의 화합물도, TDCM에 대해 각각 약 절반, 동일 정도의 활성을 나타내었다.
도 7에 보여지는 바와 같이, 본 발명 시험 화합물을 투여한 마우스에 있어서, 혈장 중 IFN-γ 농도의 증가가 보였다. 특히, 본 발명 화합물 중, 실시예 1의 화합물 및 실시예 9의 화합물은 모두, 양성 대조로 한 TDCM에 대해, 약 1.5배 정도의 IFN-γ 유리 활성을 나타내고, 실시예 13의 화합물 및 실시예 14의 화합물도, TDCM에 대해 각각 약 절반, 동일 정도의 활성을 나타내었다.
도 8에 보여지는 바와 같이, 본 발명 시험 화합물을 투여한 마우스에 있어서, 혈장 중 TNF-α 농도의 증가가 보였다. 그러나, 양성 대조로 한 TDCM과 대비하여, 실시예 1의 화합물에 있어서도, TDCM과 동일 정도이고, 그 밖의 본 발명의 화합물은 전체적으로 TDCM의 1/2 정도의 활성을 나타내었다.
시험예 6
<웰치균 투여에 따른 마우스 생존시험(실시예 1의 화합물)>
시험 화합물로서, 제조예 α-1에 기재된 방법에 의해 합성한 화합물, 및 TDCM을 각각 1 ㎎ 칭량하고, 상기와 동일하게 해서, 시험 화합물의 에멀젼 용액(1 ㎎/㎖)을 조제하였다.
웰치균(Type A NTCT8237)은, 이하와 같이 조제하였다.
<웰치균 조제방법>
브레인 하트 인퓨젼(BHI)(Difco)의 분말 7.4 ㎎을 증류수 200 ㎖에 녹였다). 얻어진 용액(이하, 이 용액을 「BHI 배지」라 한다.) 40 ㎖를 메스피펫으로 취해, 200 ㎖의 플라스크에 첨가하고, 고압 증기 멸균(121℃, 20분간)을 행하였다. 또한, 마개를 돌려 막는 시험관 2개에 5 ㎖의 BHI 배지를 넣고, 고압 증기 멸균을 행하였다. 추가적으로 유리관 부착 고무 마개(면 마개 부착) 및 유리관을 고압 증기 멸균하였다. 클린벤치 내에서, 가열 육즙 배지(coocked meat medium)에 자란 보존용 균을 멸균한 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)으로 적량 채취하고, 상기 마개를 돌려 막는 멸균 시험관 내의 BHI 배지에 식균하였다. 이어서, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
마개를 돌려 막는 시험관 내에 자란 균(균이 자라는 클린벤치 내는 탁해지고, 가스가 발생한다)을 클린벤치 내에서, 40 ㎖의 BHI 배지가 든 200 ㎖의 삼각 플라스크에 옮기고, 배지 내에 유리관을 삽입하여, 10분간 질소 치환을 행하였다. 다음으로, 유리관 부착 고무 마개(면 마개 부착)를 삼각 플라스크에 장착 후(웰치균은 가스를 생산하기 때문에, 공기 구멍이 필요하다.), 37℃, 4-5시간 인큐베이션하였다. 배양한 웰치균을 원심용 튜브로 옮기고, 원심분리(9,000 rpm, 15분간)를 행하고, 상청을 제거하였다. 잔사에 멸균 생리식염수 20 ㎖를 첨가하여 균을 현탁 후, 원심분리(9,000 rpm, 15분간)하고, 상청을 제거하였다. 얻어진 침사를 마개를 돌려 막는 멸균한 시험관 내의 BHI 배지를 첨가하고, 원셀 카운터(원셀사 제조)로 균수를 계수하였다.
<웰치균 투여에 있어서의 생존시험방법>
마우스(ICR, 6주령)를 3군으로 나누고, 이하의 시험을 행하였다.
시험 화합물의 에멀젼 용액, TDCM의 에멀젼 용액, 또는, 대조로서의 에멀젼 용액만을, 1군 4마리의 마우스에 대해 100 ㎍/마우스씩(에멀젼 용액만의 경우는, 100 ㎕/마우스씩) 복강 내 투여하였다. 3시간 후, 웰치균(2.4×107 cells/마우스)을 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 후, 경과 관찰을 행하였다.
결과를 표 4에 나타낸다.
표 4에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 화합물인 실시예 1의 화합물을 투여한 마우스는, 웰치균의 치사 모델에 있어서, 투여군 4마리 중 3마리가 치사를 면했다.
시험예 7
<웰치균 독소 투여에 따른 마우스 생존시험(실시예 1의 화합물)>
시험 화합물의 에멀젼 용액(1 ㎎/㎖)을 상기와 동일하게 해서 조제하였다.
웰치균 독소는 이하와 같이 해서 조제하였다.
<웰치균 독소의 조제방법>
길초균 α독소 유전자 형질전환체를 L-Broth 중에서 교반하면서 37℃, 14시간 배양 후, 4℃, 8,000 rpm으로 20분간 원심하고, 배양상청을 빙랭하에서 교반하면서, 황산암모늄(황안)(나칼라이 테스크)을 정기적으로 소량 첨가 후, 종농도 70% 포화 황안(472 g/L)으로 하여, 하룻밤 방치하였다. 그 후, 4℃, 9,500 rpm으로 30분간 원심하고, 생성된 침사를 0.02 M TB(pH 7.5)에 용해시켜, 동완충액으로 4℃, 하룻밤 투석하였다. 투석 후, 4℃, 15,000 rpm으로 30분간 원심하고, 이 상청을 조(粗)독소(황안 독소) 표품으로 하였다. 이 조독소 표품을 종농도 0.5 M NaCl이 되도록, 1 M NaCl-TB(pH 7.5)로 희석 후, 사전에 0.5 M NaCl-TB(pH 7.5)로 평형화한 구리 킬레이트 친화성 칼럼(1.5×9 ㎝)에 조독소 표품을 어플라이하고, 계속해서, 0.5 M NaCl-TB(pH 7.5), 0.5 M NaCl-0.1 MPB(pH 6.5), 0.5 M NaCl-0.02 M 초산완충액(pH 4.5), 그리고 0.5 M NaCl-0.1 M PB(pH 6.5)를 순차적으로 100 ㎖씩 흘렸다. 다음으로, 칼럼 중에 결합한 독소를 15 mM L-히스티딘(나칼라이 테스크)-0.5 M NaCl-0.1 M PB(pH 6.5) 100 ㎖로 용출시킨 후, 이 용출액을 시린지 필터(DISMIC-ADVANTEC)로 여과 후, 한외여과 필터 Amicon(상표) Ultra-15-30K(MILLIPORE)로 원심농축하고, 이 농축액을 0.02 M TB(pH 8.0)로 4℃, 하룻밤 투석하고, 15,000 rpm으로 30분간 원심 후, UNO(상표) Q-1 R Column(BIO-RAD)에 어플라이하였다. 용출은 0.02 M TB(pH 8.0) 중의 염화나트륨농도를 0~0.05 M까지 직선적으로 변화시키고, 유량 1.0 ㎖/min로 행하였다. 각 용출(0.5 ㎖) 분획에 있어서, 항α독소 혈청에 대한 오우크테를로니 반응(Ouchterlony reaction)에서 침강선이 확인되고, 또한, SDS-PAGE로, α독소에 상당하는 약 43 kDa의 단일 밴드를 포함하는 분획을 모아, 약 1.0 ㎖까지 농축하였다. 이 농축액을 0.02 M TB(pH 7.5)로 4℃, 하룻밤 투석한 후, 4℃, 15,000 rpm으로 30분간 원심하고, 그 상청(재조합 α독소)을 분취하였다. 얻어진 재조합 α독소는, SDS-PAGE로 불순물의 유무를 확인 후, 사용까지 -80℃에서 보존하였다.
<웰치균 독소 투여에 있어서의 생존시험방법>
마우스(ICR, 6주령)를 3군으로 나누고, 이하의 시험을 행하였다.
시험 화합물의 에멀젼 용액, TDCM의 에멀젼 용액, 또는 대조로서의 에멀젼 용액만을, 1군 4마리의 마우스에 대해 100 ㎍/마우스씩(에멀젼 용액만의 경우는, 100 ㎕/마우스씩) 복강 내 투여하였다. 3시간 후, 웰치균 독소(200 ng/마우스)를 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 후, 경과 관찰을 행하였다.
결과를 표 5에 나타낸다.
표 5에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명 화합물인 실시예 1의 화합물을 투여한 마우스는, 웰치균 독소의 치사 모델에 있어서, 투여군 4마리 중 3마리가 치사를 면하였다.
시험예 8
<녹농균 투여에 따른 마우스 생존시험(실시예 1의 화합물)>
시험 화합물로서, 제조예 α-1에 기재된 방법에 의해 합성한 화합물을 1 ㎎ 칭량하고, 상기와 동일하게 해서, 시험 화합물의 에멀젼 용액을 조제하였다.
녹농균(Fhu-071115strain)은 환자 유래의 것을 사용하고, 이하와 같이 해서 조제하였다.
<녹농균 조제방법>
L-broth를 40 ㎖ 메스피펫으로 취하여, 200 ㎖의 플라스크 1개에 넣고, 스폰지 마개를 하였다. 또한, 별도의 마개를 돌려 막는 시험관 2개에 5 ㎖의 L-broth를 넣었다. 당해 플라스크 및 마개를 돌려 막는 시험관을 121℃에서 20분간 오토클레이브에 걸었다. L-broth 배지가 실온까지 식은 후, 클린벤치 내에서 40 ㎖의 L-broth에 초저온 냉동고에서 보관하고 있던 녹농균을 첨가하였다. 배양실에 있어서, 하룻밤 진탕을 행하였다. 9,000 rpm으로 15분간 원심을 행하고, 상청을 제거하였다. 멸균 생리식염수 20 ㎖를 첨가하고 볼텍스를 사용해서 혼화한 후, 9,000 rpm으로 15분간 원심을 행하고, 상청을 제거한다는 공정을 3회 행하였다. 멸균 생리식염수 4.5 ㎖를 첨가하고, 볼텍스를 사용해서 혼화하여, 이를 멸균액으로 하였다. 1000배로 희석한 균액을 사용하여, 원셀 카운터로 균수를 계수한 후, 목적하는 농도로 균 원액을 희석하여, 이하의 시험에 사용하였다.
<녹농균 투여에 있어서의 생존시험방법>
마우스를 2군으로 나누고, 이하의 2가지 시험을 행하였다.
(A) 1군 3마리의 마우스(ICR, 5주령)에 대해, 상기 시험 화합물의 에멀젼 용액(100 ㎍/마우스)을 복강 내 투여하고, 3시간 경과 후, 녹농균(5.0×107 cells/마우스)을 복강 내 투여하였다. 그 후, 경과 관찰을 행하였다. (B) 1군 3마리의 마우스(ICR, 5주령)에 대해, 녹농균(2.0×107 cells/마우스)을 복강 내 투여하고, 상기 시험 화합물의 에멀젼 용액(100 ㎍/마우스)을 복강 내 투여하여, 3시간 경과 후, 상기 시험 화합물의 에멀젼 용액(100 ㎍/마우스)을 복강 내 투여하였다. 그 후, 경과 관찰을 행하였다.
결과를 표 6 및 표 7에 나타낸다.
표 6에 나타내어지는 바와 같이, 녹농균 투여 전에 시험 화합물을 사전에 투여한 A군에 있어서, 3마리 중 2마리가 녹농균에 의한 치사를 면하였다. 감염 당초는, 대조군과 그다지 변화가 확인되지 않았으나, 약 8시간 후부터 점차 걸을 수 있는 상태가 되었다.
표 7에 나타내어지는 바와 같이, 녹농균 투여 후에 시험 화합물을 투여한 B군에 있어서, 3마리 중 1마리가 녹농균에 의한 치사를 면하였다.
시험예 9
<THP-1 세포로부터의 사이토카인 유리>
실시예 9에서 얻어진 시험 화합물로 처리한, 인간 단구성 백혈병 세포 유래의 THP-1 세포로부터의 각각의 사이토카인 및 케모카인 유리량을 ELISA법에 의해 측정하였다. 또한, 인간 폐암 세포 유래 A549 세포, 및 인간 대장암 세포 유래 DLD-1 세포를 사용하여, 동일한 해석을 행하였다.
<THP-1 세포의 배양방법>
(1) 혈청의 로트 체크
배양한 THP-1 세포를 클린벤치 내에서 15 ㎖의 원침관에 옮겼다. 세포를 1,000 rpm으로 5분간, 20℃에서 원심 후, 상청을 제거하였다. 그 침사를, 각각 RPMI 1640(10% 로트 체크용 FBS를 포함한다) 배지 1 ㎖에 현탁하고, 혈구계산기(hemocytometer)(가야카키 의이과공업)와 커버글래스(산쇼)를 사용해서 세포 수를 계수한 후, 배지로 2.5×105 cells/㎖로 희석하였다. 부유 배양용 MULTI WELL PLATE 24 wells(SUMILON)에 세포현탁액을 0.5 ㎖씩 분주하고, 1일 1회 세포의 증식과 형태를 관찰하였다. 2~3일 후에 배양액을 배지로 100배 희석하고, 4 ㎕를 취하여 계수판으로 세포 수를 계수하여, 증식의 좋고 나쁨을 비교하였다. 증식 및 형태가 좋은 세포를 well로부터 회수하여 동일 배지로 세정 후, 재차 2.5×105 cells/㎖가 되도록 희석하고, 부유 배양용 MULTI WELL PLATE 6 wells(SUMILON)에 1 ㎖ 넣고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 인큐베이션하였다. 24시간 간격으로 배지교환을 행하고, 플레이트째로 1,800 rpm으로 5분간 원심(TOMY)한 후, 천천히 배지를 제거하고, 새로 배지를 1 ㎖ 첨가하였다. 배지의 교환작업을 2회 행하였다. 3일째 이후는, 배지를 교환 후, 세포를 100배 희석하고, 계수판으로 계수하여, 증식의 정도를 측정하였다. 그 후, 수일간 이 조작을 행하고, 증식과 형태가 좋은 배지를 선택하였다.
(2) 혈청의 불활성화와 분주
4℃에서 해동한 Fetal bovine serum(FBS)(Biowest) 500 ㎖를 56℃에서 때때로 교반하면서 30분간 인큐베이션하여, 불활성화를 행하였다. 그 후, 혈청은 여과하지 않고, 클린벤치 내에서 50 ㎖의 원침관에 30 ㎖씩 분주하고, -80℃에서 보존하였다. 사용 전에는 사전에 4℃에서 해동하였다.
(3) RPMI 1640 배지(10% 불활성화 FBS+1% Penicillin Streptomycin)
클린벤치 내에서, RPMI 1640 액체 배지(Wako) 500 ㎖에, 불활성화한 FBS 60 ㎖와, Acrodisc 25 mm Syringe Filter(Pall Corporation)로 여과한 Penicillin Streptoycin(GIBCO) 5.6 ㎖를 첨가하고, 균일해지도록 혼화하였다. 제작한 배지는, 여과하지 않고 그대로 사용하였다. 보존은 4℃에서 행하고, 사용 전에는 사전에 실온으로 되돌렸다.
(4) 세포의 계대배양(subculture)
THP-1 세포를 75 ㎠의 부유 배양용 플라스크(SUMILON)(90% 증식 이상)에서 배양하고, 형태 및 증식을 관찰하였다. 세포의 형태가 좋고, 증식이 빠른 경우에는, 세포 현탁액을 새로운 플라스크에 옮기거나, 또는, 사용 중의 플라스크에 새로운 배지를 약 2배량 첨가하여 계대배양을 행하였다. 증식이 느린 경우는, 그대로 경과를 관찰하거나, 새로운 배지를 등량 첨가하여 계대배양을 행하였다.
(5) 세포의 보존
75 ㎠의 부유 배양용 플라스크(90% 증식 이상)에서 배양한 세포 10~15 ㎖를 원침관에 옮겨, 1,000 rpm, 5분간 원심하고, 상청을 제거하였다. 그 침사에, 세포 동결 보존액 Cell banker(닛폰 젠야쿠 고교) 1 ㎖를 첨가하고, 현탁하여, 세럼 튜브에 분주하고, -80℃에서 보존하였다.
(6) 보존 세포의 재배양
-80℃에서 동결한 세포를, 37℃의 수욕(水浴)에서 급속하게 해동하였다. 바로, 세포 보존액을 사전에 RPMI 1640 배지를 9~10 ㎖ 첨가해 둔 15 ㎖ 원침관에 첨가하고 전도혼화하였다. 1,000 rpm으로 5분간 원심 후, 상청을 제거하고 10 ㎖의 새로운 배지로 재현탁하여, 세포 현탁액을 75 ㎠의 부유 배양용 플라스크에 옮겼다. 그 후, 새로운 배지를 첨가하여 전량을 20~30 ㎖로 하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양하였다.
<ELISA 키트의 시약 조제>
세정액의 조제
세정액을 초순수(S. D. W.)로 25배로 희석해서, 실온에서 사용하였다.
표준
기질액의
조제
2개의 마이크로 튜브에 표준 기질액용 희석액을 600 μL 넣어 둔다. 스탠다드한 기질을 표준 기질액용 희석액 1 mL로 용해하고(2450 pg/mL), 그것을 100 μL, 마이크로 튜브에 옮기고, 용해하여(350 pg/mL), 이것을 추가적으로, 100 μL를 별도의 마이크로 튜브에 첨가하여 용해하고(50 pg/mL) 희석을 행하였다. 표준 기질액용 희석액을 대조로서 사용하였다(0 pg/mL).
정색액(呈色液)의
조제
color reagent A와 color reagent B를 등량씩 혼합하고, 100 ㎕/well×측정하는 well의 정색액을 첨가하였다. 이것은 사용 전 15분 이내에 조제해 두었다.
<샘플 측정>
사용하는 ELISA 키트의 시약을 상온으로 되돌리고, 각 웰에, 각종 농도의 표준 기질액 및 assay buffer를 50 μL 넣고, 추가로 샘플을 50 μL씩 첨가하였다. 플레이트를 1분간 가볍게 톡톡 두드리고, 플레이트에 커버를 씌워, 실온에서 2시간 인큐베이트하였다. 그 후, 세정액으로 5회 세정하고(아스피레이터 사용 가능), 조제한 conjugate액을 100 μL씩 첨가하고, 플레이트에 커버를 씌워, 실온에서 2시간 인큐베이트하였다. 그 후, 세정액으로 5회 세정 후, 차광하면서, color reagent 용액 A와 B의 혼합액을 100 μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온, 암소에서 30분간 인큐베이트하였다. 마지막으로, 반응 정지액을 100 μL씩 첨가하고, 30분간 이내에 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices spectra MAX 340PC)로 흡광도를 측정하였다(450 nm-550 nm). 표준 기질액의 직선 그래프로부터, 각 샘플의 사이토카인 유리량을 산출하였다.
<실험방법>
배양한 THP-1 세포를 클린벤치 내에서 50 ㎖의 원침관에 옮기고, 1,000 rpm으로 5분간, 20℃에서 원심 후, 상청을 제거하였다. 그 침사를, 새로운 무혈청 RPMI 1640 배지(Wako) 1 ㎖에 현탁하고, 세포 현탁액을 사전에 무혈청 RPMI 1640 배지를 990 ㎕ 첨가해 둔 멸균 에펜도르프 튜브에 10 ㎕ 첨가하고 100배 희석하였다. 100배 희석액 4 ㎕를 혈구 계수판으로 세포 수를 계수하고, 세포 현탁액을 무혈청 RPMI 1640 배지로 1×107 cells/㎖로 희석하였다. 100 μL의 RPMI 배지를 에펜도르프 튜브에 취하고, 200 μM가 되도록 40 mM의 시험 화합물(실시예 9)/DMSO 용액을 첨가하고, 초음파에 5초간 걸었다. 100 ㎕의 THP-1 세포를 첨가하였다(시험 화합물의 최종농도 100 μM). 37℃, 2시간 인큐베이션 후, 5,000 rpm으로 10분간 원심하고, 상청을 별도의 에펜도르프 튜브에 취하여 ELISA 키트에 의해 샘플 측정을 행하였다.
또한, 양성 대조로서는, 시험 화합물로서 6,6'-비스-O-(2-테트라데실헥사노일)-α,α'-트레할로스(이하「대조 화합물 A」라 한다), 및 TDCM을 사용하여 동일하게 측정을 행하였다. 또한, 음성 대조로서는, 시험 화합물을 아무것도 첨가하지 않고, 동일하게 조제하였다(vehicle).
<실험결과>
양성 대조와 비교하여, 실험예 9의 화합물로 처리한 THP-1 세포로부터의 MIP-1β의 유리가, 약 8~10배 높은 것이 명확해졌다. 또한, TNF-α의 유리는, 음성 대조 세포와 비교하여 거의 동등하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 또한, 실시예 1에서 얻어진 화합물에 대해서는, MIP-1β의 유리에 대해서는 양성 대조에 비해 바람직한 결과가 얻어진 한편으로, TNF-α의 유리는 음성 대조 세포와 비교하여 거의 동등하였다(데이터 나타내지 않음).
시험예 10
<THP-1 세포에 대한 세포 독성 검토 및 변이 원성 시험>
<
THP
-1 세포의
트리판블루를
사용한 세포 독성의 검토>
시약의 조제
0.3%
트리판블루
/
PBS
(-)의 조제
0.3 g의 트리판블루(nacarai)를 PBS(-) 100 ㎖로 용해하였다.
THP
-1 세포의 조제
배양한 THP-1 세포를 클린벤치 내에서 50 ㎖의 원침관에 옮기고, 1,000 rpm으로 5분간, 20℃에서 원심 후, 상청을 제거하였다. 그 침사를 새로운 무혈청 RPMI 1640 배지(Wako) 1 ㎖에 현탁하였다. 이 세포 현탁액을, 사전에 무혈청 RPMI 1640 배지를 990 ㎕ 첨가한 멸균 에펜도르프 튜브에 10 ㎕ 첨가하고, 100배 희석하였다. 100배 희석액 10 ㎕를 혈구계수판으로 세포 수를 계수하고, 세포 현탁액을 무혈청 RPMI 1640 배지로 1×107 cells/㎖가 되도록 희석하였다.
<실험방법>
RPMI 배지 100 ㎕에 200 μM가 되도록 시험 화합물(실시예 9)/DMSO 용액, 또는 DMSO를 첨가하고, 5초간 초음파를 행하였다. 또한, 양성 대조로서는, 시험 화합물로서 6-O-(2-데실도카노일)-α-글루코오스(이하「대조 화합물 B」라 한다), 및 TDCM을 사용해서 동일하게 조제하였다. 또한, 음성 대조로서는, 시험 화합물을 아무것도 첨가하지 않고, 동일하게 조제하였다(Vehicle). 1.0×107 cells/㎖로 조제한 THP-1 세포 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간, 또는 24시간 인큐베이션하였다. 그 후, 0.3% 트리판블루/PBS(-)를 20 ㎕ 첨가하고 현탁한 후, 바로 세포 수 측정장치(CYRORECON)로 세포의 생존율을 해석하였다.
<변이 원성 시험(Ames 시험)>
시약의 조제
0.1 M
인산나트륨완충액의
조제
Na2HPO4 5.68 g을 증류수 200 mL에 용해하여, Na2H2HPO4·2H2O를 증류수 100 mL에 용해한 것을 서서히 첨가하고 pH 7.4로 조정하여, 고압 증기 멸균하였다.
최소 글루코오스
한천배지의
제작
(1) VB 배지: MgSO4·7H2O 0.4 g, 구연산 H2O 4 g, K2HPO4 20 g, NaNH4HPO4·4H2O 7 g을 증류수 200 mL에 용해하여 고압 증기 멸균하였다.
(2) 글루코오스 40 g을 증류수 200 mL에 용해하여 고압 증기 멸균하였다.
(3) 분말 한천 30 g을 증류수 1600 mL에 현탁하여 고압 증기 멸균하였다.
(3)의 시약이 약 60℃로 식은 후, (1)과 (2)의 시약을 혼합하여, 약 30 mL씩 샬레에 뿌렸다.
상층
한천배지의
제작
분말 한천 1.2 g과 NaCl 1 g을 물 200 mL에 현탁하여 고압 증기 멸균하고, 50 ㎖의 튜브에 옮겼다. 사용 전에 0.5 mM의 히스티딘/비오틴 용액을 20 mL 혼합하여 47℃에 보온하였다.
티프스균
배양용
Oxoid
Nutrient
Broth
배지의 조제
Oxoid Nutrient Broth(Difco) 2.5 g을 증류수 100 ㎖에 용해하고, 그 중 5 ㎖를 마개를 돌려 막는 시험관에 넣고 멸균하였다. 그 후, TA98(Salmonella typhimurium TA98)의 균액 약 10 μL를 접종하고 37℃에서 하룻밤, 진탕 배양하여 균 현탁액을 조제하였다.
S9mix
의 조제
S9 1 ㎖에 Co factorA mix(ORIENTAL YEAST) 9 ㎖를 첨가하였다.
표준 변이
원성물질의
조제
4-
NQO
/
DMSO
의 조제
4-Nitroquinoline N-oxide(4-NQO)(도쿄 화성 공업주식회사) 0.3 ㎎을 10 ㎖의 DMSO에 용해하였다.
2-
aminoanthrathen
/
DMSO
의 조제
2-aminoanthracen(ALDRICH) 0.5 ㎎을 30 ㎖의 DMSO에 용해하였다.
<실험방법>
에펜도르프 튜브에 표준 변이 원성물질, 실시예 9의 시험 화합물, 대조 화합물 B, 또는 TDCM 10 μL를 각 2개씩 2조(組) 준비하였다. S9mix 또는 100 mM 인산완충액 0.5 mL를 첨가한 후, 균 현탁액 100 μL를 첨가하고, 프리인큐베이션하였다(37℃, 20분 진탕). 히스티딘-비오틴을 포함하는 소프트 아가(47℃에 보온한 것) 2 mL를 첨가하여 가볍게 현탁하고, 최소 글루코오스 한천배지에 뿌려, 인큐베이션하였다(37℃, 2일간). 그 후, His+의 콜로니 수를 계수하였다.
<실험결과>
THP-1 세포에 대한 세포 독성을 검토하기 위해, 실시예 9에서 얻어진 시험 화합물로 2시간, 및 24시간 처리한 THP-1 세포의 생존율을 트리판블루 염색에 의해 분석한 결과, 대조 화합물 B 처리 세포에서는 세포 독성이 확인되었으나, 실시예 9에서 얻어진 화합물로 처리한 세포에서는, 세포 독성이 관찰되지 않았다. 결과를 도 10에 나타낸다. 또한 실시예 1에서 얻어진 화합물에 대해서도 동일하게 유의한 결과가 얻어졌다(데이터 나타내지 않음).
또한, 실시예 9에서 얻어진 시험 화합물에 관하여 S9mix 존재하, 및 비존재하에 있어서 Ames 시험을 행하였으나, 어느 시험 화합물도 변이 원성을 나타내지 않았다. 또한, 본 해석조건하에 있어서의 표준물질(2-amino anthracene, 4NQO)의 변이 원성은, 양성이었다(도 11). 또한 실시예 1에서 얻어진 화합물에 대해서도 동일하게 유의한 결과가 얻어졌다(데이터 나타내지 않음).
시험예 11
<마우스 복강 내로의 세포 침윤>
<PBS(-) 용액의 조제>
NaCl 4 g, Na2HPO4·12H2O 1.45 g, KH2PO4 0.1 g, KCl 0.1 g을 증류수 500 ㎖에 용해하고, 121℃에서 20분간 고압 증기 멸균을 행하였다.
<0.05% EDTA/PBS(-) 용액의 조제>
EDTA(nacalai tesque code. 151-30) 50 ㎎을 PBS(-) 100 ㎖에 용해 후, 0.2 ㎛의 필터를 사용해서 여과 멸균하였다.
<1 ㎎/mL 에멀젼 용액의 조제>
NaCl 0.9 g, Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate(Tween80) 1.1 ㎖, D(-)-Mannitol 5.6 g을 증류수 100 ㎖에 용해하고, 0.2 ㎛의 필터로 멸균 여과를 행하였다. 실시예 9에서 얻어진 시험 화합물 1 ㎎을 호모지나이저(WEATON USA 10 mL, 아즈완)의 바닥부에 덜어, 한 방울의 Mineral Oil을 첨가하여, 2분간 초음파에 쬐면서 호모지나이즈하였다. 그 후, 1 mL의 1.1% Tween-5.6% Mannitol Saline을 첨가하고, 액이 백탁하여, 균일해질 때까지 호모지나이즈하였다. 에펜도르프 튜브에 시험 화합물의 용액을 전량 옮기고, 저온 살균을 위해 62℃에서 30분간 처리하였다. 양성 대조로서는, 시험 화합물로서, 대조 화합물 A 및 TDCM을 사용해서 동일하게 조제하였다. 또한, 음성 대조로서는, 시험 화합물을 아무 것도 첨가하지 않고, 동일하게 조제하였다(vehicle).
<복강 내 침윤세포의 회수>
1 ㎎/mL의 시험 화합물(실시예 9) 용액을 100 ㎍/마우스가 되도록, 마우스(ICR 마우스(SPF)(4주령, 수컷, 체중: 20~22 g))에 복강 투여하였다.
시험 화합물을 복강 투여한 마우스를, 2시간 후 또는 24시간 후, 디에틸에테르를 사용하여 사망시켰다. 복부 중앙의 표피를 가위로 조금 자르고, 복부를 잡아 복부 표피를 벗겨 내었다. 핀셋으로 복막을 가볍에 들어 올리고, 내장에 바늘이 찔리지 않도록 26G의 바늘을 장착한 10 mL의 시린지로 0.05% EDTA in PBS(-) 5 mL를 복강 내에 전량 주입하였다. 그 후, 복부의 옆을 잡듯이 하여 40~50회 정도 마사지하였다. 복강 내부의 액을 천천히 작은 사이즈의 원침관에 채취하였다. 이 조작을 재차 반복하였다. 채취한 세포를 1,000 rpm으로 10분간 원심하였다. 상청을 제거하고, RPMI1640 배지로 침전을 현탁하였다. 침전관을 RPMI1640 배지로 채우고, 재차 1,000 rpm으로 10분간 원심하였다. 상청을 버리고, RPMI1640 배지로 현탁 후, 세포계수반을 사용하여 세포 수를 계측한다. RPMI-1640 배지를 사용하여, 임의의 농도로 희석하였다.
<세포의 김자염색(Giemsa stain)>
<1/15 M 인산나트륨 버퍼(
pH
6.4)의 조제>
NaH2PO4 6.0 g, Na2HPO4 7.06 g을 각각 250 ㎖의 증류수로 용해하고, 인산수소이나트륨 용액에 pH를 측정하면서 인산이수소나트륨 용액을 첨가하여 pH 6.4로 맞추고, 오토클레이브로 121℃, 20분간 멸균하였다.
1 ㎎/mL의 시험 화합물 용액을 100 ㎍/마우스가 되도록 마우스에 복강 투여하고, 24시간 후에 0.05% EDTA/PBS(-)를 사용하여 복강 내에 침윤된 세포를 회수하였다. 그 후, 1,000 rpm으로 8분간 원심을 행하고, 상청을 제거하였다. 세포를 100 μL의 인산완충액으로 현탁하고, 염색용 슬라이드글래스 위에 올렸다. 수분이 증발된 것을 확인하고, 염색용 밴드 위에서 메이 그룬월드액(May-Grunwald solution)을 10~15방울 적하하고, 2~3분간 방치하였다. 메이 그룬월드액을 흘리지 않고, 인산완충액을 10~15방울 적하하고, 2~3분간 방치하였다. 적당한 양의 김자염색액을 첨가하고, 30분간 방치하였다. 슬라이드글래스를 이면(裏面)으로 하여 유수 후, 슬라이드글래스를 건조시키고, 현미경으로 관찰하였다.
<마우스 복강 내에 있어서의 CD8 양성 세포의 유세포분석기에 의한 해석>
시약의 조제
PBS
(-) 용액의 조제
시험예 11과 동일한 방법으로 조제하였다.
1 ㎎/
mL
시험 화합물(
에멀젼
용액)의 조제
시험예 11과 동일한 방법으로 조제하였다.
0.05%
EDTA
/
PBS
(-) 용액의 조제
EDTA 2 Na 50 ㎎을 100 ㎖의 PBS(-)에 용해하고, 오토클레이브로 121℃, 20분간 멸균을 행하였다.
0.5%
BSA
-0.05%
EDTA
/
PBS
(-) 용액의 조제
EDTA 2 Na 50 ㎎을 100 ㎖의 PBS(-)에 용해하고, 오토클레이브로 121℃, 20분간 멸균을 행한다. 그 후, 사용시 조제로 0.5%의 BSA를 용해하였다.
<실험방법>
1 ㎎/mL의 시험 화합물 에멀젼 용액을 마우스(100 ㎍/마우스)에 복강 투여하고, 24시간 후에 0.05% EDTA/PBS(-)를 사용하여 복강 내에 침윤된 세포를 회수하였다. 그 후, 채취한 복강 세포를 300 g으로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 조제한 복강 세포를 1 ㎖의 0.05% EDTA(0.5% BSA/PBS로 용해)로 현탁하였다. 세포 현탁액을 유세포분석용 메쉬로 여과를 행하고, 100배 희석한 세포 현탁액으로 세포 수를 측정하였다. 각각의 샘플의 세포를 107 cells/sample로 조제 후, 300 g으로 10분간 원심을 행하고, 상청을 제거하였다. 100 ㎕의 0.05% EDTA(0.5% BSA/PBS로 용해)로 현탁하고, 10 ㎕의 CD11b, CD4, CD8의 항체(각각, FITC anti-mouse CD11b/Mac-1(BECKMAN), FITC anti-mouse CD4(BECKMAN COULTER), PE anti-mouse CD8a(BD Pharmingen))를 첨가하였다. 2-8℃, 암소, 10분간 인큐베이트 후, 1-2 ㎖의 0.05% EDTA(0.5% BSA/PBS로 용해)로 세포를 현탁하고, 300 g으로 10분간 원심 후, 상청을 제거하였다. 1 ㎖의 0.05% EDTA(0.5% BSA/PBS로 용해)로 현탁 후, 유세포분석기로 해석하였다.
<실험결과>
PBS(-) 1 mL로 세포를 현탁하였다. 헤모라이낙(용혈 헤모글로빈 시약) 100 μL를 세포 현탁액에 첨가하여 적혈구를 파괴하였다. 그 후, 세포 측정장치(CYTORECON, GE healthcare)에 의해 세포 수를 측정하였다.
또한, 조제한 세포를 24 well의 콜라겐 웰(greiner)에 파종하고, 2시간 인큐베이션하였다. 그 후, 상청을 흡인하고, RPMI 배지에 의한 세포의 세정을 2회 반복하였다. RPMI 배지 300 ㎕를 첨가하고 도립(倒立)현미경에 의해 세포를 관찰하였다.
그 결과, 실시예 9에서 얻어진 시험 화합물을 투여한 마우스 복강 내에서는, 시간 의존적으로 침윤 세포의 증가가 확인되고, 24시간 처리 후에는 Vehicle 처리와 비교하여 15~20배 증가되어 있었다(도 12).
또한, 침윤 세포의 해석을 행하기 위해, 김자염색에 의한 세포의 형태 관찰, 및 단구 및 마크로파지의 항원(CD11b), 림프구의 항원(CD4), 그리고 NK 세포의 항원(CD8)에 대한 각종 항체로 세포를 처리하고, 유세포분석기에 의해 해석하였다. 그 결과, 실시예 9에서 얻어진 시험 화합물의 투여 24시간 후에서는, CD11b 양성 세포, CD4 양성 세포, CD8 양성 세포의 전체 수는, Vehicle 처리 세포와 비교하여 15~20배 증가되어 있었다. 그러나, CD11b 양성 세포, 및 CD4 양성 세포의 존재비율은, Vehicle 처리 조건하와 비교하여, 거의 변화가 확인되지 않았다. 한편, CD8 양성 세포의 존재비율은, Vehicle 처리 마우스와 비교하여, 약 2~3배 증가되어 있었다(도 13~15).
이상으로부터, 실시예 9의 시험 화합물에 의해, 마우스 복강 내에서 식세포계의 세포가 집적되는 것이 나타내어지고, 그 중에서도 NK 세포의 비율이 큰 것이 나타내어졌다.
시험예 12
<웰치균 감염 마우스 또는 녹농균 감염 마우스에 대한 영향(실시예 9의 화합물)>
<웰치균 조제방법>
COOKED MEAT 배지의 조제 (이하 CM 배지로 생략하는 경우도 있다)
CM 배지(125 ㎎/㎖ in D. W.)를 마개를 돌려 막는 시험관에 첨가하고, 15분간 자비(煮沸)하여 CM 배지 내의 공기를 탈기하였다. 오토클레이브(121℃, 20분)에 의한 고압 증기 멸균을 행하고, 실온까지 냉각하였다.
Brain
Heart
Infusion
(이하
BHI
로 생략한다) 배지의 조제
37 ㎎의 BHI 배지를 100 ㎖의 증류수에 용해하고, 마개를 돌려 막는 시험관에 4.5 mL, 삼각 플라스크에 40 mL 첨가하여 스폰지 마개를 하고, 오토클레이브(121℃, 20분)로 고압 증기 멸균을 행한 후, 실온까지 냉각하였다.
균의 보존
제작한 CM 배지에 C. perfringens Type-A NCTC8237(PLC+)을 첨가하고, 37℃에서 2일간 배양하고, 보존 균액으로서 실온에서 보관하였다.
균의 배양과
균액의
제작
각 보존 균액으로부터 균액을 0.2 mL 취하여, 전배양용 4.5 mL BHI 배지 내에 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액 전량을 40 mL BHI 배지 내에 첨가하고, 질소 치환(10분간)을 행한 후, 재차 37℃에서 5시간 배양하였다. 그 후, 배양액 50 mL를 튜브에 옮기고, 원심분리(4℃, 9,000 rpm, 15분)를 행하였다. 상청을 제거하고, 생리식염수를 첨가하여 잘 세정한 후, 재차 원심분리(4℃, 9,000 rpm, 15분)를 행하고 집균하였다. 이 세정을 2회 반복하였다. 그 침전에 BHI 배지를 4.5 mL 첨가하고 현탁하였다. 이 현탁액을 원액으로 하였다. 원액을 1000배로 희석하고, 오토클레이브(121℃, 20분)에 의해 고압 증기 멸균을 행한 후, 원셀 카운터를 사용하여 균수를 계측하였다. 균 농도가 1×108 cells/mL인 균액을 제작하여, 실험에 사용하였다.
<녹농균 조제방법>
Luria
-
Bertani
Broth
배지(L-
Broth
)의 조제
BactoTM Tryptone(Difco) 10.0 g, BactoTM Yeast Extract(Difco) 5.0 g, 및 염화나트륨(NaCl)(nacalai tesque) 5.0 g을 증류수에 용해하고, 1 M MgSO4를 1.0 mL 첨가하며, 1 N NaOH로 pH 7.5로 조정하고, 증류수로 전량을 1,000 mL로 한 후, 오토클레이브로 121℃, 20분간, 고압 증기 멸균하고, 실온까지 냉각하였다.
균의 보존
녹농균(P. aeruginosa) 0.2 mL를 L-Broth 10 mL에 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 이 배양액에 멸균 글리세린 1 mL(글리세린)를 첨가하고, 볼텍스를 행하였다. 균액을 300 μL씩 멸균 에펜도르프 튜브에 분주하고, -80℃에서 보존하였다.
각 보존 균액 0.2 mL을 취하여, 40 mL L-Broth 배지 내에 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 그 후, 50 mL 튜브에 옮기고, 원심분리(4℃, 9,000 rpm, 15분)를 행하였다. 상청을 제거하고, 생리식염수를 첨가하여 잘 세정한 후, 재차 원심분리(4℃, 9,000 rpm, 15분)를 행하고 집균하였다. 이 세정을 2회 반복한다. 그 침전에 생리식염수를 4.5 mL 첨가하고 현탁하였다. 이 현탁액을 원액으로 하고, 원액을 10000배로 희석한 균액을 오토클레이브(121℃, 20분)로 고압 증기 멸균을 행한 후, 원셀 카운터를 사용하여 균수를 계측하였다. 균 농도가 1×108 cells/mL의 균액을 제작하여, 실험에 사용하였다.
<실험방법: 시험 화합물의 전투여>
100 ㎍/마우스의 시험 화합물(실시예 9) 에멀젼 용액을 복강 투여하고, 24시간 후, 3.0×1010 CFU/mL의 녹농균 또는 5.0×107 CFU/mL의 웰치균을 복강에 투여하고, 마우스를 2시간 간격으로 관찰하였다.
<실험방법: 시험 화합물의 후투여>
3.0×1010 CFU/mL의 녹농균을 복강에 투여하고 3시간 후, 100 ㎍/마우스의 시험 화합물(실시예 9) 에멀젼 용액을 복강 투여하였다. 그 후, 마우스를 2시간 간격으로 관찰하였다.
<실험결과>
도 16 및 17에 나타내는 바와 같이, 실시예 9의 시험 화합물로 처리한 마우스의 치사는, 현저히 억제되었다. 또한, 녹농균 감염 3시간 후에 실시예 9의 시험 화합물을 투여한 결과, 마우스의 치사는, 유의하게 억제되었다(도 18).
시험예 13
<패혈증 관찰>
100 ㎍/마우스의 시험 화합물(실시예 9) 에멀젼 용액을 복강 투여하고, 24시간 후, 3.0×1010 CFU/mL의 녹농균을 감염시켰다. 균 투여 15시간 후에 헤파린을 바늘 끝에 조금 넣은 주사기로 심장 채혈을 행하고, 전혈 200 μL를 보통 한천배지 상에 파종하고, 16시간, 배양기로 인큐베이션하였다. 배지 상의 콜로니 수를 계수하였다.
균수가 많은 경우는, 전혈을 생리식염수로 10배, 100배, 1000배, 10000배로 희석하고, 보통 한천배지에 파종하였다.
그 결과, 도 19에 나타내는 바와 같이, 균만을 투여한 경우, 또는, 균 및 Vehicle을 투여한 경우에는 마우스 혈액 내에 균이 검출되었으나, 실시예 9의 시험 화합물을 투여한 경우에는, 혈액 내에서 균이 검출되지 않았다.
시험예 14
<항종양 효과>
실시예 9에서 얻어진 시험 화합물(에멀젼 용액) 100 ㎍/마우스를 마우스에 복강 내로 투여하고, 24시간 후에 유방암 세포(FM3A 세포)를 복강 내에 접종하였다. 19일 후에 마우스의 체중 측정을 행하였다. 또한, 횡격막, 췌장, 그리고 정소의 조직 절편을 HE 염색 후, 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 유방암 세포 접종 마우스는, 대조 마우스와 비교하여 체중이 약 10 g 증가되어 있고, 다량의 복수가 확인되었다. 또한, 유방암 세포 접종 마우스의 횡격막, 췌장, 그리고 정소에 현저한 암세포의 침윤, 및 전이가 관찰되었다. 한편, 실시예의 시험 화합물로 처리한 후에 유방암 세포를 접종한 마우스는, 대조 마우스와 동일한 체중이며, 또한, 각 장기로의 암세포의 침윤, 및 전이는 전혀 확인되지 않았다(도 20).
본 발명의 트레할로스 화합물은, TDCM보다 우수하거나 TDCM과 동등 정도의 면역 부활 작용을 갖는 것이면서, TDCM에 비해 독성이 현저히 저감되어 있어, 의약품으로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본원 화합물의 독성은, 모델 마우스뿐 아니라, 인간 유래 세포에 있어서도 저감하는 것이 발견되었다. 또한, 본원 화합물은 변이 원성도 낮은 것이 나타내어졌다.
또한, 각종의 구조를 갖는 트레할로스 화합물 중에서, β 수산기를 수소원자로 바꾸고, 지방산을 α-분지형 또는 β-분지형으로 하여, 분지된 탄소쇄(화학식 1에 있어서의 R1, R2, R1', 또는 R2'로 표시되는 부분)가 각각 탄소수 7~20 정도의 지방산에 대해서 축일(逐一) 합성하여 시험을 행함으로써, α-분지형에 대해서는 탄소수 10, β-분지형에 대해서는 탄소수 9, 13 또는 14인 화합물에 있어서, 활성이 극대가 되는 것을 발견한 것이다. 또한, 종래기술의 아미드 결합을 에스테르 결합으로 함으로써, 아미드 결합이 갖는 암 유발 활성도 억제할 수 있는 것을 발견한 것이다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 웰치균이 복강 내 투여된 마우스에 있어서, 그 치사성을 저감하는 것인 점에서, 당해 화합물이 인 비보 시험에 있어서도 대단히 유용한 것이 나타내어졌다. 또한, 웰치균이 생산한 독소가 복강 내 투여된 마우스에 있어서도, 그 치사성을 저감하는 것인 점은 획기적이다. 또한, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 녹농균의 복강 내 투여에 대해서도 우수한 항균 활성에 의해 당해 세균의 치사성을 저감시키는 것을 발견하였다.
또한, 그 작용 메커니즘에 관하여, 본 발명의 트레할로스 화합물을 투여한 경우에, 호중구 H2O2 활성, 호중구 탐식능, 마크로파지 탐식능이 증강되는 것을 나타낸 점에서, 이들 항감염증 작용은, 마크로파지나 호중구 등의 세포성 면역의 활성화에 의해 초래되는 것인 것을 시사하는 것이다.
이들의 시험 결과로부터, 본 발명의 트레할로스 화합물은, 마크로파지나 호중구 등의 세포성 면역의 활성화를 초래하는 것으로, 마크로파지나 호중구의 식작용의 대상이 되는 세균, 바이러스, 진균 등에 의한 감염증에 대해 넓은 범위에 있어서 유용한 것을 시사하는 것이다. 이는, 감염증 치료에 있어서, 항생물질을 사용할 때, 대상이 되는 원인균을 확인하고, 그것에 대해 항균 스펙트럼을 갖는 항생물질을 적절히 선택해야만 할뿐 아니라, 내성균 출현 리스크를 안고, 게다가 내성균이 출현했을 때에는, 또한 당해 내성균에 대해 항균 스펙트럼을 갖는 다른 항생물질을 적절히 선택해야만 하는 종래의 방법에 비해, 간편하고 확실한 방법이라고 하는 이점을 갖는다.
또한, 바이러스에 대해서는 항생물질이 듣지 않고, 오히려 백신을 투여하여 예방할 수 밖에 없다고 하는 종래기술의 현재 상태에 있어서, 바이러스에 대한 치료약도 제공할 수 있는 점에서 유용할 수 있다.
그리고, 그 중에서도, 본 발명의 트레할로스 디에스테르 화합물 중, 특히 활성이 높은 화합물은, TDCM의 약 2배, 특히 활성이 높은 것의 경우는 약 8배~10배의 활성을 가지며, 또한, 독성이 낮은 점에서, 특히 유용한 것인 것이 나타내어졌다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물 투여 후의 사이토카인 응답을 측정한 바, IL-6, IFN-γ, TNF-α 유리에 대해서, 모두 증가 경향이 보였다. 또한, 인 비트로(in vitro) 시험과 인 비보 시험을 행하여, 본 발명의 화합물 중, 특히 활성이 높은 화합물은, 인 비트로 시험에 있어서는, 이들 사이토카인의 현저한 증대를 초래하는 면도 있지만, 인 비보 시험에 있어서는, TNF-α의 유리를 너무 크게 증대시키는 것이 아닌 것을 발견하였다. 또한, 인간 유래의 THP-1 세포로부터의 IL-8 유리 활성에 있어서도, 본 발명 화합물 중 특히 활성이 높은 화합물에 대해서, TDCM만큼 강하게 활성화되는 것이 아닌 것을 발견하였다. 또한, 인간 유래의 THP-1 세포, A549 세포, DLD-1 세포를 사용해서 측정한 결과, 발명 화합물 중의 특히 활성이 높은 화합물은, THP-1 세포에 있어서 MIP-1β에 대한 현저한 유리활성을 나타내는 한편으로, TNF-α의 유리활성을 특히 높이는 것이 아닌 것을 발견하였다.
면역 부활화는 종래부터 중요시되고 있어, 사이토카인이나 케모카인의 유도는, 면역을 활성화하기 위해 유용하다. 한편으로, 면역을 지나치게 활성화하면, 아나필락시 쇼크나 알레르기 등으로 대표되는 바와 같이, 오히려 폐해가 많은 것으로 되는 것이 알려져 있다. 본 발명의 트레할로스 화합물은, 이들의 과도한 염증반응을 일으키는 팩터가 될 수 있는 염증성 TNF-α나, 케모카인으로서 알려지는 IL-8의 유리에 대한 활성화가 과도해지지 않고, 면역 부활 작용은 있지만, 면역반응이 과잉으로 작용하여 염증 등의 부작용이 생길 가능성이 낮은 것을 나타낸 것이다. 그 한편으로, 면역반응의 일과정에 있어서, 한번에 케모카인 등이 방출되어 면역세포를 활성화하는 것이 중요한 국면도 있어, 감염의 상태나, 피감염체의 신체의 상태 등의 각종 사정에 따라, 사이토카인이나 케모카인이 다량으로 유리되는 것이 유용해지는 면도 존재한다.
이상과 같이, 사이토카인이나 케모카인은 그 성질에 따라, 다량으로 유리되는 것이 바람직한 경우, 그렇지 않은 경우, 특히 문제가 되지 않는 경우가 있어, 상황에 따라 다양할 수 있으나, 본 발명의 트레할로스 화합물을, IL-8이나 TNF-α의 유리를 목적으로 하는 경우나, 특별히 문제가 되지 않는 경우에는, IL-8이나 TNF-α 등의 유리를 항진시키도록, 또는, 이들 유리가 억제되는 것을 의도하지 않고, 특정 종류의 본 발명의 트레할로스 화합물을 목적하는 양으로 사용하는 것도, 본 발명의 범위 내이다.
또한, 본 발명 트레할로스 화합물을 투여한 유방암 세포 접종 마우스에 있어서, 암세포의 증식을 유의하게 억제하고, 다른 장기로의 침윤이나 전이도 억제하는 것을 발견하였다. 이는, 본원 화합물이 항종양 활성을 갖는 것을 나타낸 것이다.
따라서, 본 발명의 트레할로스 화합물의 항감염증 치료제 및 항암제로서의 유용성·안전성을 보다 명확하게 나타내는 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 트레할로스 화합물은, 면역 부활 활성이 높고, 또한, 독성도 낮은 것으로부터, 병원균에 의한 감염증의 치료에 유용하다. 구체적으로는, 본 발명의 트레할로스 화합물을 사용함으로써, 항생물질 투여시의 균체 파괴에 의한 독소 방출과 같은 부작용을 발생시킬 위험성이 적고, 병원균의 독소 자체에도 독소 저감작용을 갖는 의약품을 제공하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 트레할로스 화합물을 사용함으로써 다제내성균에 의한 감염증에도 치료 효과가 있는 의약을 제공하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 화합물은, 과잉의 면역응답이 생길 위험성이 적은 의약품의 제조에도 유용하다.
또한, 본 발명의 트레할로스 화합물의 제조방법에 의해, 비대칭 합성을 포함하지 않고, 본 발명의 트레할로스 화합물을 대량으로 효율적으로 합성할 수 있다.
Claims (15)
- 이하의 화학식 1:
[화학식 1]
[화학식 중,
X는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고,
X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며,
여기에서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환(員環)을 형성하고 있어도 되며, 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고,
n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수이다.
단,
(1) X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-이며, R1, R1', R2 및 R2'가 각각 독립적으로, 수소원자, 또는 무치환이고 또한 직쇄의 C1-C6 알킬기이며, n 및 n'가 0인 화합물, 및,
(2) X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-이며, R1, R1', R2 및 R2'가 C14 직쇄 알킬기이고, n 및 n'가 0인 화합물
을 제외함]
로 표시되는 화합물. - 제1항에 기재된 화합물로서,
X가 R1-CHR2-이고, X'가 R1'-CHR2'-인
화합물. - 제2항에 기재된 화합물로서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄 C7-C21 알킬기이고,
n 및 n'는 각각 독립적으로 0 또는 1인
화합물. - 제2항에 기재된 화합물로서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄 C8-C16 알킬기이고,
n 및 n'가 0인
화합물. - 제2항에 기재된 화합물로서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 직쇄 C9-C14 알킬기이고,
n 및 n'는 1인
화합물. - 제1항에 기재된 화합물로서,
R1이 R1'와 동일하고, R2가 R2'와 동일하며, n이 n'와 동일한
화합물. - 제1항에 기재된 화합물로서, 이하의 어느 하나의 화합물:
6,6'-비스-O-(2-옥틸데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-노닐운데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-운데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-도데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-트리데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-펜타데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(2-헥사데실옥타데카노일)-α,α'-트레할로스. - 제1항에 기재된 화합물로서, 이하의 어느 하나의 화합물:
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-데실트리데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-운데실테트라데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-도데실펜타데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스. - 제1항에 기재된 화합물로서, 이하의 어느 하나의 화합물:
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 및 약리학적으로 허용할 수 있는 캐리어를 함유하는 의약 조성물.
- 제10항에 기재된 의약으로서, 면역 부활제, 마크로파지 부활제, 호중구 부활제, 탐식세포의 식균작용 부활제, 항세균 감염증제, 균 생산 독소 중화제, 또는 항암제로서 사용되는 의약 조성물.
- 면역 부활제, 마크로파지 부활제, 호중구 부활제, 탐식세포의 식균작용 부활제, 항세균 감염증제, 균 생산 독소 중화제, 또는 항암제로서 사용되는 의약 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물의 사용.
- 인간을 포함하는 포유동물의 감염증, 또는 암의 예방방법 또는 치료방법으로서,
치료상 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 당해 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법. - 이하의 화학식 2:
[화학식 2]
[화학식 중,
X는 페닐, 나프틸, 또는 R1-CHR2-로 표시되는 기이고,
X'는 페닐, 나프틸, 또는 R1'-CHR2'-로 표시되는 기이며,
여기에서,
R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로, 수소원자 또는 C1-C21 알킬기이고, R1, R1', R2, R2'에 관하여, 각 알킬기 중의 수소원자는, 수산기, 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 되고, 각 알킬기의 전부 또는 일부는 4-8 원환을 형성하고 있어도 되며, 또한, R1 및 R2, R1' 및 R2'는, 각각 서로 연결하여 4-8 원환을 형성하고 있어도 되고,
n 및 n'는 각각 독립적으로, 0 내지 3의 정수이다.]
로 표시되는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 균 생산 독소 중화제. - 이하의 어느 하나의 화합물:
6,6'-비스-O-(2-데실도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(2-테트라데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-노닐도데카노일)-α,α'-트레할로스,
6,6'-비스-O-(3-트리데실헥사데카노일)-α,α'-트레할로스, 또는
6,6'-비스-O-(3-테트라데실헵타데카노일)-α,α'-트레할로스를 함유하는 것을 특징으로 하는 균 생산 독소 중화제.
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