TW201016221A - Trehalose compound, manufacturing method thereof, and pharmaceuticals containing said compound - Google Patents

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Mugio Nishizawa
Hiroshi Imagawa
Hirofumi Yamamoto
Jun Sakurai
Masataka Oda
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Otsuka Chemical Co Ltd
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Description

201016221 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 以及含有該化 本發明係有關於一種海藻糖化合物及其製造 合物之醫藥。 ’ 【先前技術】 e ❹ 作為感染症，周知有由細菌、病毒及真菌所 。而作為對於由細菌所引發之感染症的治丄ϋ爹 在r受到〇:157等病原性大腸菌或赤病菌感染時，體内會產 毒素（ver〇t〇xm)，尤其是抵抗力差的老人m 況。作為其他治療方法’一般認為在〇·157，約‘ 等，^論何者對患者可說皆是負擔甚大的治療方ί 析療法 而作ίΐΐ/ϋ對纟1菌所產生之4素的對應方法，優*為對症療法， 等作，雖可列料素吸賴的使用或對毒素抗體的使用 使用^活附的方法亦有引發便秘等的副作用，又對抗體的 便用，δ ’對各毒素必須開發抗體的方面說來係為不便。 力指本Ϊ丄對由此類病原菌所引發之感染症的治療或發病抑制方法仍 最近，非投予抗生素即可提高患者自身的免疫力，藉此 亦疋成治，苎預防感染症的試行。 兔本Ϊ為提高患者免疫力的物質’雖仍在摸索各種化合物當中，但作 更天然物成份的一例，已知有海藻糖之二酯（diester)化合物， 酸枝^酸海藻糖酯（trehalose dimycolate，TDM)與二桿菌分枝菌 藻糖酯（trehalose dicorynomycolate，TDCM) 〇 TDM 被發現作為 子於結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)之細胞表層的糖脂 3/106 201016221 巧，已知其顯示出免疫賦活活性及抗癌活性。又，自同族之白喉桿菌 (Corynebacterium spp)單獨分離出碳數短於TDM之同系物 fM ’且TDCM及其立體異獅細顯齡自顯示丨減賦活 及抗癌活性。 故的毒性甚強而紐作為醫藥使用。因此， 土了作為醫樂使用則必須合成維持或增強活性、且毒性降低的化合 物0 ，作為TDM之衍生物，業已合成出海藻糖與脂肪酸之酯類
❹ ί，6^ί·二醋化合物」’並完成了其毒性試驗或巨嗟細胞賦 用等$驗（參照非專利文獻1〕。*該文獻巾，已就β經基的有 無或脂質之烷基部分的長度為碳數30、32、48的化合物、和將 脂質之間的酯鍵取代成醯胺鍵之化合物等進行研討。以毒性方面而 ίι已ί證出，旨鍵和?鏈脂肪酸對毒性有著重要的關聯。然而在該文 ，中I獲得活性高且毒性低之化合物，雖亦記載有側鏈脂肪酸部 1之碳數為30之化合物等，但並未就糖與側鏈之鍵結形式、對側鏈 ^肪酸之取代基的有無、或構成側鏈脂肪酸之烷基的長度等進全面 ，，了#和最佳化；其僅就上述數個化合物分散地完成試驗。此 就免疫賦活作用之内容亦無詳細研討。 切fi—方面’該發明者等人就tdm衍生物，已合成出具有醋鍵 土醯^鍵(且將β位羥基變更成氫原子或烷氧基之衍生物等（參照專 2乏a 1)。然而，該文獻所記載的衍生物為脂肪酸之貌基部分‘碳 f ，左右者，即使以活性而言，也僅有測定作為A3腺普酸受 體抬抗物（adenosine A3 receptor antagonist)的活性。 此，5亥發明者等人將的羥基換成氳原子，且在消去非對 Cafb〇n)的同時，成功地合成出將酯鍵換成醯胺鍵 物’且已證料料雜衍生物的免疫賦活作用 利獻）ϋ而，後來已明白該等酿胺衍生物具有誘發癌 症的反應，而不得不放棄其作為醫藥化合物來使用的意圖。 ^此，作為TDM或TDCM的衍生物，對於由病原菌所引發的各 Ιίί:至今仍未碟立非常有效且安全性高的治療或發病抑制方法， 因而且安全之治療或發病抑制方法的確立係受到很大的期待。 【專利文獻1】國際公開第2007/111214號公報 【專利文獻2】國際公開第2008/093700號公報 【#專利文獻 1 】Numata et al.，Chem. Pharm. Bull. (1985) 33(10) 4544-4555 ’ 5 4/106 201016221 【發明内容】 【發明所欲解決之課題】 在合成TDM、TDCM之衍生物時，由於TDM、TDCM其本身之 毒性甚強’因而必須合成具有活性且毒性低的化合物。習知技術雖已 知有數個TDM或TDCM的變體，但TDM及TDCM係糖脂質，且糖 鏈之經基多、極性亦高，在合成之際有時會伴隨著困難而至，因而至 今仍無法說是已瞭解：何種構造與何種活性連結的構造-活性相關性。 因此，本發明係以製造多數TDM及TDCM之衍生物，以及提供 活性高、毒性低之化合物及含有該化合物之醫藥為目的。
此外’作為習知技術’即對病原菌之抗生素的使用係以阻礙大腸 捍菌的成長、殲滅大腸桿菌，且勿於大腸桿菌排放毒素為目的。對產 生的毒素本身而言並無法達成無毒化’本發明之目的即為提供一種即 ，在達到細菌增殖而產生毒素的情況下，亦可減低毒素之毒性的醫 藥0 【用於解決課題之方式】 本發明者等人發現：以式（1)所表示之海藻糖二酯化合物對病原 _所引發之感染，顯示出優異的抗菌活性，且其為低毒性。此外，^ f式（,1)所表示之海藻糖二酯化合物中發現：X為Rl — CHR2 為Ri’-CHR2’ -之化合物，而作為脂質部分之支鏈形 ，巧疋η及η’為〇之化合物（以下稱為α_支鏈型化合物） 為合物以下_ 支鏈型化合物）係為特優 ri。、更u且，以式（1)所表示之海藻糖二酯化合物中發現：在以式 ^ )中之Ri、R2、RT或R2’所表示之烷基鏈部分，在碳數 ϋϊ定之長度時，活性有呈現極大化之傾向。更且，就 ，’然而本發明者等人在小鼠之活體内（in 試驗中發n 在技予菌種時，而且在投予由菌種所產生的毒素本身不僅 本發明提供一種以下式（1)所表示的化合物： 【化1】 5/106 201016221 ο
〔式中X為以苯基、萘基或1^ —CHR2—所表示之基團，χ，為以菜 基、萘基或Ri’一 C HRV—所表示之基團， 在此，R!、R!’、R2及R2’係各肩獨立的氫原子或匕一C21燒基， 就Ri、Ri’、R2、R2’而言，各烷基中之氫原子可以羥基、烷£美 取代，而各烷基的全部或一部份亦可形成4 —8元環，此外， 只2、111’及112’可個別互相連結而形成4-8元環，且11及11，係夂 自獨立之0至3的整數， 乐各 然而，排除 (1) XgRi — CHRs—，又’為!^，—CHR2, _，Ri、、 今K為各，獨立之氳原子或未取代且直鏈的c i 一 c 二 及η，為〇之化合物；以及 几签且η (2) X^Ri-CHR2- > X,^,R1,-cHR2, - » R, > p > R2及為Ci4直鏈燒基’且n&n，為〇之化合物。〕 1 係提供「種以式⑴所表示之化合物及含有藥理學上可 容許之載體（earner)的醫藥組成物。 < 3另衆垤学上可 又本發明係提供一種醫藥址 ， _ 及含有藥理學上可容許之載體的之化合物 胞賦活劑、中性白企球賦活_、巨嚨細 感染症劑或g產生毒素中和胞之滅作賊活劑、抗細菌 又本發明係提供一種以式m私生一 使用係為了製造作為免疫賦活1 之化合物的使用，其中該 劑、吞嗤細胞之吞猶用賦活^3 活劑、中性白血球賦活 劑所使用之醫藥組成物。 和抗'、，田函感染症劑或菌產生毒素中和 6/106 201016221 乳動物的感染錢癌症的預防方 治ί上⑴絲峨合物之 所表示又的ttr：提供—種衫生毒素中和劑，其中含有以下式⑵
【化2】 0
ίί中关基r、if，Rl_CHR2—所表示之基團，X，為以 本暴$基或Rl ~cHR2 —所表示之基團，
Rr1 ,Ri?、R^及R2’係各自獨立的氫原子或Cl_C21院基， 、Ri、R2、r2’而言，各烷基中之氫原子可以美、 ❹ ^代RH基,的全部或—部份亦可形成4」8元環，此 【發明之效果】 供-合=於賦活活性高且毒性亦低，用於提 中性ίϊ 合齡具紐細驗驗賦活化的個，且使 血嗟細严λ而減“細菌外部排吴毒素’孟在投 =。.、牙'’由破壞大腸桿菌所引發之毒素排放之類的危險性較 7/106 201016221 因此又紐化合物即便對毒素本身亦顯示毒性降低作用。 =在種在由大腸桿菌等所引發之感染3， 的情況時，以以=|增加’大腸桿解增__外產生毒素 2醫:可柃供-種即使是對由抗性菌所引發之感染症亦有治ji 糖化合物雖使細胞性免疫賦活化，然、而並不容易 I /、. I 饮_ (asymmetric synthesis) 藻糖化合物 【實施方式】 【用於實施發明之型熊】 ❹ ，几環的，環式烴基。在較佳的形式之—中，以本 ，4 iltmmt Γ〇；：〇；：ί^ r,；Tf -ίί^Ιίί^ 二f、正十三基、正十四基、正十五基，正3 ί式S例ί庚ί;ίίί等正= ίί ί ?i f 6'Λi^2Λ^2, ： 狀絲的正癸基，而n為’碳|| 8/106 201016221 基的正十三基或碳料14之直鏈基的正十 其^^广卜及^’而言’各垸基中之氫原子可由絲和燒氣 t f數為1 i21之直鏈狀或支鏈狀脂肪 ip® 二ί氧基、己氧基及庚氧基等。較佳為直鏈院氧基，作為 ^圭ίίϊϊ貌基末端碳原子的氫原子由經基或燒氧基^取代s化t it 基之錄的長度_ ’較佳為構狀魏基的碳= ί 至21 ’更佳為η為0時，為10至16，而 尺1及112、111’及只2’可各自互相連接以形成4 — 8元 ^一°„ΗΚ2一時，Rl&R2所鍵結之礙原子與R1及R2，皆形成 成原子。此外，由於構成RlAR2之烧基可為支 二二支，狀烧基的一部份構成4 —8元環，亦可形成以烧基所取 院之類的構造。再者’即使形成環時’也包含由與上述同Ζ 取代基取代的情況。此等不單是X，且X，亦相同。作為4 — =子，可列舉環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基等。 ❹ 物構造上之安定性的觀點而言，較佳為環己基或環庚基。 c 丄和Ri’、R2和R2’可相同亦可相異，而自合成效率的 吕’較佳為RjoRr相同，且R2和R2,相同。 规,‘ 此外’就1^與112之間的關係而言，RAR2可相同亦可相異， 做為一較佳之型態，係為1^的碳數與R2的碳數相比，相同、較、 的碳數多1個或2個碳，或是少1個或2個碳的化合物。例如，可列 舉R1為碳數1 4，而R 2為礙數1 6的化合物等。再者，除上述以 外，較佳亦為Ri為碳數1〜5之類的短鏈烷基、為碳數^ 6之類的長鍵烧基’或是相反’ R 1為被數1 〇〜1 6之類的長鏈、产 基、Rs為碳數1〜5之類的短鏈烷基。又、Ri，與R2,之間的關係;^ 與上述1^與112之間的關係相同’在上述!^與112的關係中，可^R 1看成Ri，，且R2看成R2,。 ’ 9/106 201016221 可相異’自合成效率的觀點而言，讀11，相同 ；β，；ί β * ° (1)之化合物的放射性標記化合物。k3 f生物學研九有用之式 Ο 各取物為以上述式⑴所表示之化合物，而式中的 ΐίίίίίϋίί此=特徵只要在不互相矛盾的範_，可各 (A) X為以R2 — CHR2—所表示之基團。 (Β) X，為以Rl，一 CHR2，—所表*之基團。 $士^1:1^?立之未取代<：1_(：21燒基。 ⑸之ί原子或直鏈Ci—“烧基。 ^)) m，w自白獨^之未取代且直鏈Ci—&烷基。
^ ) 2及2為各自獨立之氫原子絲取代且直鍵CrCW j 1 之ί取代且直鏈C7—。烧基。 Εκ； Ο (L) RdR2,相同，為氫原$或夫二1，基。 (M) Rih，相同’為直以m〜C2i烷基。 (Τ) η及η’為〇。 ~ 1 (U) η及η’為 1。 理學述化合物’或是其藥 10/106 201016221 為以Ri-CHRs —所表示之基團；χ，為以Rl，一 chR2, —所表示之基團，此處R〗、Rr、R2&R2，為各自獨立之氫原子或 Cu烷基，關於Ri、Rr、R2、R2，，各烷基中之氫原子可由 羥基和烷氧基取代，而，各烷基之全部或一部份亦可形成4_§元環， 此外，Ri及R2、Ri’及R2’亦可互相獨立連接以形成4 一 8元環； η及η’為各自獨立之〇至3的整數。 (W) X為以Ri-CHRs—所表示之基團；X，為以Ri，_chr2, —所表示之基團，此處Ri、：Rr、尺2及尺2，為各自獨立之直鏈C7_ Cu烷基，關於Ri、Rr、r2、R2，，各烷基中的氫原子可由羥基 和烷氧基取代，而各烷基的全部或一部份可形成4_8元環；n及n， 為各自獨立的〇或1。 © (X) $為以R1-CHR2 —所表示之基團；X，為以Ri，_chR2, 一所表示之基團，此處Ri、R!，、R2及R2,為各自獨立之直鏈Cs — Cie烷基，關於Ri、Rr、R2、R2,，各烷基中的氫原子可由羥基 和烷氧基取代，而各烷基的全部或一部份可形成4 — 8元環；n及n， 為0。 (Υ)=為以Ri — CHRz —所表示之基團；X，為以 -所表示之基團，此處R!、Ri，、R2及R2,為各自獨立之直鏈C8_ C 14烧基，關於Ri、Ri’、R2、R2’，各院基中的氫原子可由經基 和烷氧基取代，而各烷基的全部或一部份可形成4 —8元環；n及n， 為1。 (Z) X為以Ri-CHRa—所表示之基團；X，為以Rr-CfiRz， 一所表示之基團；此處R1&R1，相同，為氫原子或Cl —烷基， 0 關於Rl、Ri’ ’各烷基中的氫原子可由羥基和烷氧基取代，而各烷
基的全部或一部份可形成4 —8元環；R2及R2,相同，為氫原子或C
1 — Cu烷基’關於R2、R2’ ’各烷基中之氫原子可由羥基和烷氧基 取代’而各烧基的全部或一部份可形成4 一 8元環；此外，R 2、Ri’及R2’可各自互相連接而形成4 — 8元環；η及η，相同，為 0至3的整數。
(ΑΑ) X為以Ri —CHR2—所表示之基團；X’為以Rr—chR 2 所表不之基團，R1及R1’相同’為C1 ~~ C21烧基，各院基中之 氫原子可由羥基和烷氧基取代；R 2及R2’相同，為C?—C 2 i烧基， 各院基中之氫原子可由幾基和烧氧基取代；η及η’相同，為q或1。 (ΒΒ) X為以Ri —CHR2—所表示之基團；X’為以Rr—chR 2’ 一所表示之基團；^及!^’相同，為Ο —Cu烷基，各院基中之 氫原子可由羥基和烷氧基取代；R2及R2,相同，為氫原子或C 1一 c 11/106 201016221 21烷基，各烷基中的氫原子可由羥基和烷氧基取代；n及η，相同，為 0或1。
(CC) X為以CHR2—所表示之基團；X’為以Ri，一 c HR 2’ 一所表示之基團；RH’相同，為直鏈〇7-(：21烧基，各烷基 中的氫原子可由羥基和烷氧基取代；尺2及1^2，相同，為直鏈C7_C 2ι院基，各烷基中的氫原子可由羥基和烷氧基取代；η及η，相同，為 0或1。 ❹ ❹ $DD) $為以R〗一CHR2—所表示之基團；χ，為以Ri，_CHR k Hi之相同’為未取代且直鏈之Cl_C21烧 相ΐ Ιίίΐ 或未取代且直鏈之C7 —C21燒基；n 了所表示之基團；χ，為以w-chr 基;RdR2，相同，為1氳原4 取忠=鏈—之c?J2·: 及η，相同，為〇或1。 个％八且且叇之Cl —c21烷基，η
2，一所矣干之美圃· p H2 ,所表不之基團；X，為以Rr_CHR 基；RdR2，S同，為1未取2m取代f直鏈之〇7一〇：21炫 同，為0或1。 直鍵之C 7 — C 21燒基；η及η ’相 (GG) X為以Ri —chr2〜所矣千|
2’ -所表示之基團；不^土基團；X’為以Rr-CHR 基；RdR2，相同，為未取代4 代且直鏈之C8-C16^ 同，為0或1。 n直鍵之C8〜Ci6烷基；η及η，相 (ΗΗ)Χ 為以 Ri — CHR2~~ 所矣 _
2,一所表示之基團；尺：及只了/^不之基图；X，為以Ri，一 CHR 费；Rar2，相同，為未取代4 取代且直鏈之C8-C16^ 0。 置鍵之C8〜C16烧基；n及n，為 (II)X 為以 Ri — C H _
2,-所表示之基團；Rl及示$基圏；Χ，為以Rl，- CHR 予，R2及R2,相同’為未取 為未取代且直鏈之C9_Cl4烧 1； 代且直鏈之C卜c14烧基；n及Π，為 (JJ)X 為以 Ri — CHR _ 2: 一之基團3、R2巧矛巧 ;X，為以Ri’一CHR Ci〇烷基；n及η’為〇。 尺2及尺2’相同，為未取代且直鏈之 12/106 201016221 ❹
G (ΚΚ) X為以Ri — CHRs —所表示之基團.y, 2,一所表示之基團；R!、Rr、R2&R2，相同々Rr-CHR C9、C 13或C i4烧基；n及n’為1。 馬禾取代且直鏈之6作為巧，⑵從6 ’ 6，一雙—0- (2-壬基十一酿基）糠、 β，6’一雙一〇— ( 2 —癸基十二醯基）—α ^藻糖、 ，6’一雙一0— (2—十一基十三醯基）—藻糖、 ，6’~雙—〇— (2_十二基十四醯基）— 〜海藻糖、 6’一雙一0_ (2—十三基十五醯基）—α，=，〜海藻糖、 6’一雙一 0— (2—十五基十七醯基）〜α，=，〜海藻糖、 6’一雙一〇一（2—十六基十八醯基）〜 〜海藻糖、 雙一0—（3—壬基十二酿基）—α，α，〜二，藥糖、 6’一雙一0—（3—癸基十三醯基）__α，α搪、 6’一雙一 〇— (3 — Η—基十四醯基）~_α，，海，糖、 6’一雙一〇— ( 3 —十二基十五醯基）—α， 海藻糖、 6，一雙一0— (3—十三基十六醯基）—α，=，〜海藻糖、 6’一雙—〇_( 3 _十四基十七醯基）—α 〜海藻糖、 6’一雙一〇—（苯曱醯基）—α，α，—海蓬α〜海藻糖、 ，—雙一〇一（2_萘基幾基）一α，α，__'海薄 6 —雙_〇 —(環己幾基）一α ’ α’一海蕩擁·：、 庚？基 i—α，α’—海▲糖、 6 —雙一〇— (2—十四基十八醯基）—α，-6’—雙—〇—（14 —甲氧基一2 — (12一甲〜备海藻糠、 —十四醯基）一α，α，—海藻糖，或 氧基十二義） 6，6，-雙-〇-(工5-幾基-2 - (1 3~越其丄 ^ 五醯基）一α , α，一海藻糖。 盔基十三基） 作為本發明之海藻糖化合物的較佳化合物， 6’-雙-〇- (2-辛基癸醯基）— e · 6，-雙-〇- (2-壬基十一醯基）—α，α，ί|$、6，一雙一〇 —（2—癸基十二醯基）—a，a，〜J5糙、 6’一雙一〇— ( 2_十一基十三醯基）—a，a，，掩、 6’一雙一〇 —（2_十二基十四醯基）—a，a,:j藻糠、 6’一雙一〇— (2—十三基十五醯基）〜α，α，:ί藻糖、 6 —雙一〇一（2_十五基十七醯基）一α，α，〜$綠糠、 6’一雙一〇 —（ 2_十六基十八醯基）—a，a，二=藻糠，或 13/106 藻糠。 6 6 6 6 6 201016221 下再者’作為本發明之海藻糖化合物的較佳化合物’可舉例如以 g，6’一雙一〇— (3—壬基十二醯基）—α，α，—海藻糖、 g —雙一〇_ (3—癸基十三醯基）_α,α，_海藻糖、 « β，雙一〇一（3 h 一基十四釀基）一a，a’一海藻糖、 η 5雙〇 —（ 3 h—基十五酿基）一α, α’一海藻糖、 β，β, 〇一（3—十二基十六酿基）—α,α’一海藻糖，或 ^ —雙一〇一（3 _十四基十七醜基）—α , α，一海藻糖。 下·丹者，作為本發明之海藻糖化合物的更佳之化合物，可舉例如以 ❹ g，’ —雙—〇一（2—癸基十二醯基）一α，α，一海藻糖、 g，^，’一雙一〇_ (3—壬基十二醯基）_α，α，一海藻糖、 6，2—十二基十六醯基）—α，α_海藻糖，或 再者，作^ —ΐ四基十七醯基）_α ’ α’—海藻糖。 化ii，ϊϊίΐτ之較佳囷產生毒素#和劑，可例示如以下任一之 ^癸基十二醯基）_α，α—海藻糖、 6，十四基十二酿基）—α，α，—海藻糖、 6 UH3—壬基十二酿基）—α，α，-海藻糖、 6，6’-雙三fi六酿基）—α，α’—海藻糖’或 撝或ss!;等“諡2騮 <製造方法> 表示表示的化合物，可由町⑷及（b)所 示的4么化所表示的絲化合物與式(3)所表 物之i基)的保ίϋίϊίϋ)。所得的式⑴所表示之海藻糖化合 14/106 201016221 在步驟（a )中，「使式（4)及式（6)所表示的羰基化合物同 時或依次反應」係指：如以下之合成簡圖（scheme) 1所示，可使式 (4)及式（6)所表示的幾基化合物依序反應，或者是如以下之合成 簡圖2所示，亦可使式（4)及式（6)所表示的羰基化合物同時反 f ;再者，當式（4)及式（6)所表示的羰基化合物相同時，將其作 為式（4)所表示羰基化合物，且如以下的合成簡圖3所示，可使其 時’亦即於一階段反應中反應。此外，以式（2)所表示的化合 物亦可與式⑴所表示的化合触烟财式來合成。 方法式（1)所表示的化合物可經由以下合成簡圖1所表示的 ❹ <合成簡圖1> 【化3】
3及圖中：Rl、Rl’、R2、R2,、η及n，與上述相同。R 屌子R 3 λγ 護基。yay ’表示各自獨立的羥基或鹵素 原子。此外’於上補圖巾’喊⑴騎稍絲糖化合物為α， 15/106 201016221 α’體’然而亦可同樣合成α，β，體暨β，β，體。惟，在本 α，α’體。 此處^為及R3,，可使用周知作為羥基的保護基者。例如，可 舉出在「Protecting groups in organic chemistry」（John wilev =C.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6) t所記載的羥^之保護 基。具體而言，可列舉苯甲基、對—甲氧苯甲基及二苯基甲基 今；乙醯基等醯基；甲氧羰基和叔丁氧羰基等烷氧羰基；三甲 (trimethyl silyl)等三烷矽烷基silyi)等’較佳為苯甲美。 R3及R3’可相同亦可相異，較佳為相同。 ’’ 土 ❹ ❹ ㈣ϋ及Γί各自獨立的羥基或鹵素原子，而作為函素原子， 了牛出乱原子、氯原子及峨原子等。Υ及Υ’較佳為經基。 <步驟（a):酯化反應> 此為將式（4)及式（6)所表示的幾基化合物與式（3)所表示的 ίίΐϊ合物依次反應，以進行海藻糖化合物與幾基化合物之醋:反 應的步驟。 « ϋ(«3)所表示的海藻糖化合物係海藻糖之6位及6,位以外之經 合f雄^用市售品，或可使❹海藻糖 方(去所合成^"。例如，保護基為苯甲基之γ2,3,4,2,，3，， 一己基苯氧基~α，α，_海藻糖」係於市售而可適宜使用 =，由於海藻糖的α ’ α，體為天然存在，而便於購得。 Ϊ萍:位之與’由於反應性皆相*，對於天然之 6位=，位^^基所^^之式⑴所表示土的海了藻較糖f合地物'成 以式（4)及式（6)所表示的羰基化合物，可使用市售 ί合S町述合賴圖4、5或6所合成者，還可以使 从(4)所表示的幾基化合物與式（3)所表示的海藻糖化合 f式（3!所表示之海藻糖化合物的6位及、6,位之 ，岁气可严sa化。6位及6 ’位之經基皆被醋化的化合物稱為「二醋體 (Chester:」，，有一方被醋化的中間化合物則稱為「單醋| jmonoeg ^目^^式所表示的海雜化合物，使用以 以量)生所成表，為的^ 體分離f製。献是，為了提高反應 手作為原科之式（3)所表不之海絲合 祕之t，亦可先將不錢與喊⑷所絲= 16/106 201016221 性，在另-方馳基進行S旨化反應後，再選擇 先f ί ii&it _旨化的順序，先將6健基驗之外，亦可 領域方:f泛使用作為-般酯化反應所常用的方法及該 可紐献轉。鱗綠較佳為， ❹
的法亦含去水劑’可廣泛使用醇類與叛酸 酸等無機酸.•甲i 為2°劑的例子，可列舉氣化氫、硫酸、鹽 士酸“水劑:三SS: S2S等ίί;;氟=謎S 乙胺（Dcc)、二異丙基碳二亞胺、？ 列舉如N，N -‘二W 2:亞乙胺氧等二亞一胺乙;丄可 的使用Si S殊物及縮合劑 合物ΐϊΐίίζ適ί 為溶劑，係、具有對原料化 基異丁細等_貞;乙腈、丙腈:苯㉟:類甲： s基亞⑼ 反應促進齊，的g子，可列舉L甲用促f劑。作為 ntL ^ ( 4-pyrrolidinop^^^^^^ , ：^'}f 17/106 201016221 裝置，可—種單獨使用，可兩種以上混合使用，亦 乾_來使用。而原料化合物及反應促進綱使用比例 亦無特殊限疋’可自廣泛的範圍中來適當選擇。 本反應的原料化合物用量無特殊限定，係自廣泛的範圍中 If if ΐ I使以式（4)所表示的化合物及以式（6)所表示的化合 ίίί ，相對於以式（3)所表示的海藻糖化合物1莫耳，通 承使用式（4)所表示的羰基化合物◦.己〜工8蕈耳，鮫佳#用η 〇 再者，相對於以式⑴所表示的^醋體1莫耳，通常 ί )所表示的羰基化合物〇 ·5〜1 · 8莫耳，較佳使用0.8 〜丄· Ζ冥耳。
再者，該酯化反應的反應溫度亦無特殊限定，但通常較佳設定於 一 1 0°C起所使用之溶劑的沸點溫度以下的範圍。通常於〇〜2 〇〇 °c，而較佳於室溫起1 〇 〇°c來進行。 反應時間係依據原料化合物的種類及其用量、反應溫度等反應條 件而相異，但通常可適當調控於丄小時至一週的範圍，較佳為丄〜' 4小時，更佳為3〜10小時。 反應結束後，對反應混合液進行副產物的分離除去、乾燥、溶劑 的蒸餾除去等一般處理之後，以氧化矽膠透層析法等一般方法來精 製。 就以式（4)或以式（6)所表示的幾基化合物而言，當γ或γ，係 鹵素原子時’酯化反應可於適當的溶劑中，並視需求於鹼的存在下來 進行。 溶劑可使用與上述酯化反應中所使用之惰性溶劑相同的物質。 作為鹼可列舉如氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬氫氧化物；氫氧化 約等驗土金屬虱氧化物；碳酸納、碳酸_等驗金屬碳酸鹽；碳酸氫 納、碳酸氫钟等驗金屬碳酸氬鹽；乙酸納、乙酸卸等驗金屬乙酸鹽； 乙酸鈣等鹼土金屬乙酸鹽；氫化鈉、氫化鉀等鹼金屬氫化物；氫化約 等驗土金屬氫化物；氫氧化錢、碳酸按、乙酸鐘等錢鹽；三甲胺、三 乙胺、N，N —二甲基苯胺、0比咬、4 一二甲胺0比咬、二眷ft勢援妾 烷（DABCO)、二疊氮雙環壬烷（DBN)、二疊氮雙環十 烯（D B U)等三級胺。此等鹼類可一種單獨使用，亦可兩種以上混 合使用。 供給至本反應的原料化合物及鹼用量亦無特殊限定，係自廣泛的 範圍中來適當選擇。使以式（4)所表示的化合物及以式（6)所表示 的化合物依序反應時’相對於以式（2)所表示的海藻糖化合物1莫 耳，通常使用式（4)所表示的羰基化合物〇.5〜1.8莫耳，較佳^ 18/106 201016221 ，〜1·2莫耳’而通常使用鹼〇·5〜1.8莫耳，較佳為0.8〜 工，2莫耳。再者，相對於以式（5)所表示的單酯體1莫耳，通常使 式（6)所表示的羰基化合物〇 5〜1 8莫耳，較佳為〇·8〜ι. 2莫耳，而通常使用鹼0.5〜ι·8莫耳，較佳為〇·8〜1.2莫耳。 反應溫度係與上述酯化反應相同，通常較佳設定於一1 〇。(：起至 所使用之溶劑的彿點溫度以下的範圍。反應時間係與上述酯化反應相 同’依據上述濃度、溫度等而變更，但通常可適當調整於〇 J〜1 〇 小時的範圍内。
作為以式（4)所表示的化合物及以式（6)所表示的化合物，當 使用X為羥基的羰基化合物與X，為齒素原子的羰基化合物時，以及使 用X為齒素原子的羰基化合物與X，為羥基的化合物時，經由自上述反 應條件來適當選擇，同樣可合成式（7)所表示的化合物。 <步驟（b ) > 相對於上述步驟（a )中所製得的海藻糖6位及6,位被醋化，且 ^的羥基被保護之式（7)所表示的化合物，經由進行糖羥基的去保 護，即製得作為標的气式（1)所表示的海藻糖二酯化合物。 對從式（7)所表示之化合物中所被保護的羥基除去保護基而言， 巧如，可適當應用適合於上述文獻中所記載之該保護基的去保護方 法0 例如當R3之保護基係苯甲基時，可應用「催化氫化」（catal hydrogenatum)。催化氫化係於氫氣氣氛及觸媒之存在下進行。 觸媒只要疋用於催化氫化者，可廣泛使用周知之觸媒，可列舉例 如氧^始、始-碳、氫氧化纪、纪-碳、拉尼鎳（Ran “ i 為0.0 0 常為左:自右氫氣壓力通 該反應通常於適當的溶劑中進行，而作為溶劑， 酵、乙醇、異丙醇等醇類；甲酸甲酯、乙酸甲酯1月曰甲 甲酸、乙酸等舰或鱗混合溶劑。 ， 本反應的溫度通常為0〜1〇左右，較佳為 右。反應時間係依據基質量、溫度、觸媒種類蓉夸 消耗的理論量達到標準後再結束反應。通常使^ 佳為1〜3 0小時。 DUJBf左右’較 19/106 201016221 反應結束後進行觸媒過遽除去、溶劑蒸德除去等·一般處理之 後，以溶劑萃取、氧化矽膠透層析法等一般方g來^製。 以本發明式（1)所表示的化合物，可藉由以下合成簡圖2或合成 簡圖3中所示的方法來製造。 <合成簡圖2> 【化4】
上述合成簡圖中，Ri、Ri，、r2、R2,、r3、r3,、η及η，係 與上述相同。 _合成簡圖2為酯化反應的步驟（a )中，將式（4)及式（6)所 ，示的羰基化合物同時與式（3)所表示的海藻糖化合物反應之簡 圖’去保護反應的步驟（b)係與合成簡圖1相同。 酯化反應及去保護反應為步驟（a )中’將式（4)及式（6)所 表示之羰基化合物同時與式（3)所表示之海藻糖化合物反應之外， 可使其與合成簡圖1同樣地進行。 私使以式（4)所表示的幾基化合物及以式（6)所表示的幾基化合 物同時反應時，可藉由自生成物中分離精製標的化合物來製得。 以式（1)所表示的化合物中，當、R2及r2,、n 為個別相同時，上述合成簡圖2可特別如以下合成簡圖3來表示。再 20/106 201016221 η由 及_ η佳 較 、 Λβι ? 1. 2·· R之 及觀 2點 R觀 ,、的 1率 R收 及回 R1應 當反<，高α.' 物提人 Inf 匕，'J--不1 表 h的张 1同1 C相圖 式別簡 以個成 ，^合 者非以 <合成簡圓3> 【化5】
(4、 0
❹ 上述合成簡圖中’1^1、1^2、1^3、1^3’及11係與上述相同。 合成簡圖3為酯化反應的步驟（a )中，相對於以式（3)所表 的海藻糖化合物，由於所反應之羰基化合物（4)僅為一種，因此 ”時，亦即是以-階段反應進行的_，*去 j C b )係與合成簡圖i相同。 合成簡圖3中的酯化反應及去保護反應，除了增加气（4) $羰基化合物的用量以外，可使其與上述合成簡圖 ' 的"反 關於用量，具體而言相對於以式（3)所表示的海藻糖化八物3 莫耳’通常使用以式（4)所表示的羰基化合物1 8〜5、装耳， 4 2〜3莫耳，縮合劑通常為：L _ 8〜5莫耳，較佳為2〜2 2耳平，. 類通常為1.8〜8莫耳，較佳為2〜6莫耳。 4吴斗 21/106 201016221 個反5者但=£㉝⑶ <作為原料之羰基化合物> 所矣3中’作為原料化合物之式⑷或式⑷ Αΐϊ了，市售品之外，亦可藉由該領域人士周知 例如式⑷或式（6)中，作為χ或χ，為苯基，4 η為〇的化^物，可使用安息香酸或安息香酸齒化物。 入妝化合物中’ 乂為尺1 一 CHR2一、η為〇的化 合物可藉由以下合成簡圖4或5來製造。 ❹ 相以H 示的·化合物係作為標的化合物而記載， 仁以式（6)所表不的幾基化合物亦可同樣地製造。 <合成簡圖4> 【化6】 or4 (δ) R2—Hal ⑼
❹ R4表示碳數為1〜6 上述合成簡圖中，Ri及R2係與上述相同 之烷基，H a 1則表示鹵素原子。 c； /為，使式（8)所表示的化合物接著進行一般之烷美化 六' (4)所表示之幾基化合物的步驟。作為原料化合‘之 表不的化合物，可使用市售品，例如Rl係碳數為1 ◦的 ίϊΐϊΐ:可使用十二酸乙醋等。作為標的化合物的側鍵t，則 較佳使用具有雌望長度之酸的醋類。 ’鍵坑基則 22/106 201016221 Ο 〇 於烧基化反應中，可使用如「Creger，J.Am.Chem.Soc·，92卷，1397-98頁，1970年」中所述的之方法等各種方法。更具體而言，較佳將強 ，加入於以式（8)所表示之化合物的溶液中以脫去2位之氫原子 後，再使之與齒统反應。舉例而言，可由如下反應來進行烷基化。 首先，使以式（8)所表示的化合物與強鹼反應。作為強鹼，較佳 有脫去手原子的反應者，可列舉如氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬 氫氧化物；氫氧化鈣等鹼土金屬氫氧化物等。此等驗類可一種單獨使 用，亦可兩種以上混合使用。其又可併用二異丙基胺基鋰、並進行質 子7鋰交換反應。作為溶劑係具有對原料化合物之適度的溶解性，只 要疋對自曰化反應不產生不良影響的惰性溶劑（jnert s〇lvent)即可，可 ^泛使用周知之溶劑》作為用於上述烷基化反應之溶劑的例子，可列 ^苯、甲勞、二曱笨等芳香烴；正己烷、環己烷、石油醚等脂肪烴； 一甲醚、二異丙喊、二噁燒、四氫咬喃、乙二醇二甲喊、乙二醇二乙 醚等類。此等溶劑可一種單獨使用，亦可兩種以上混合使用。 該反應中’以式（8)所表示之化合物與強鹼的比例可自廣泛的 ，巧中來適當選擇，但通常相對於以式（8)所表示的化合物，使用 ^ 〜5倍左右之莫耳數的強鹼等。此刻之反應溫度通常為—8 〇〜 ^ C左右，較佳為〇。〇〜6 〇〇c左右。反應時間設為5分鐘〜6小 時左右，較佳為5分鐘〜1小時左右。 次之，將_烷添加至反應混合液中。作為齒烷，為例如丄一碘辛 王—峨庚院、1一峨癸烧、1 —峨十一烧、1 —蛾十二院、1 — 烷等，而作為標的化合物之側鏈烷基，較佳使用碳鏈部分具有 ^期f之長度的由烷。作為_化物，可列舉氣化物、碘化物、溴化物 二巧較佳為碘化物。於該反應中’以式（8)所表示的化合物與鹵 ，之比例可自廣泛的範圍中來適當選擇，但通常相對於式（8)所表 物，使用11〜3倍左右之莫耳數的_烧。此刻之反應溫度 較佳使之於室溫左右。再者，反應時間通常設為2〜i 2小時左 應結束後，以使用氧化矽膠透層析法、減壓蒸餾等周知之分離 及積製方法來將標的化合物分離、精製。 、 人私(4)所表示的化合物中’ X為Rl —CHR2—、η為〇的化 〇物可藉由以下合成簡圖5來製造。 <合成簡圖5> 【化7】 23/106 201016221
上述合成簡圖中，Ri、R2、R4及Ha 1與上述相同。 合成簡圖5為，使式（11)所表示的化合物接著進行—般之烧基 化反應而製得式（4)所表示之羰基化合物的步驟《作為原料化合^ 之式（11)所表示的化合物可使用市售品，可列舉如丙二酸二乙晶、 丙二酸二甲酯、丙二酸二丙酯、丙二酸二丁酯、丙二酸二異丙醋、丙 二酸二叔丁酯、丙二酸二環己酯、丙二酸二苯酯、丙二^二笨甲醋 等。 烷基化反應與上述相同，可使作為原料化合物之式所表示 的化合物與強鹼反應，繼而使其與齒烷反應。 於以式（11)所表示的化合物與強驗反應的步驟中，以式（U) 所表示之化合物與強鹼類的比例，可自廣泛的範圍中來適當選擇，但 通常相對於式（Π)所表示的化合物，使用0.9〜5倍左右莫耳數^ 強驗等。此刻之反應溫度，通常為一 8 0〜6 〇。(3左右，較‘為〇 〜6 0 °C左右。反應時間設為5分鐘〜6小時左右，較佳為5分鐘〜 1小時左右。 " 次之，於添加齒烷的步驟中，式（11)所表示之化合物與齒烷的 比例，可自廣泛的範圍中來適當選擇，但通常相對於式（11)所裊 的化合物，分別使用0:8〜1.2倍左右之莫耳數的式（12)所表^ 之鹵烷及式（9)所表示的鹵烷。當標的化合*Ri&R2為相同的化 合物時，鹵烷為一種即可，而通常相對於式（11)所表示的化合物， 使用2.2〜4倍左右之莫耳數的鹵烷。就標的化合物而言，當^及 24/106 201016221 R2不同時’如上所述’在使式（12)所表示之鹵烷及式（9)所表示 的鹵烧同時反應’並僅分離精製標的化合物的情況之外，亦可使相異 的鹵烷依序反應，並使其中一方的歯烷反應後分離精製，再使另—方 的鹵烷反應，而分離精製標的化合物。作為分離精製方法而言，可應 用氧化矽膠透層析法、減壓蒸餾等周知分離及精製方法。 以式（4)所表示的化合物中，xaRi-CHR2—，且11為1的 化合物可藉由以下合成簡圖6來製造。 <合成簡圖6> 合成簡圖6可由以下合成簡圖6 — 1至6 — 5來說明。 ❹ <合成簡圖6—1> 【化8】 0
(13) ΌΗ (14) 0
Me (15) 上述合成簡圖中、Ri係與上述相同。 合成簡圖6 — 1係將N，〇 —二甲基羥基 gthylhydroxyamine )與作為原料化合物之羧酸經去水後|生&
使式（13)所表示之羧酸與鹼性縮合劑反應。只要 劑即可廣泛使用，而作為鹼性縮合劑之例 (carbonyldmmdazole)之外，可列舉4_二甲胺基吡1 烷、吡啶、咪唑、N，N，N，，N，一四甲基尿素、二（五 γ (b1S(pentamethylene)urea)、U—幾基二啦嘻等。 笠 叛酸可使用市售品，可列舉如庚酸、辛酸、癸酸 的化合物側鏈烷基，較佳使用具有所期望之長度 言，較佳為含有對原料化合物之適度的溶解性，且 ^為浴劑 生不良影響之惰性溶劑，可廣泛使用周知之溶劑化反應 反應之溶劑的例子，可列舉苯、甲苯、二曱苯等务巷於上述酯 苯等函化芳香烴：正己烷、環己烷、石油醚等脂肪炉、广」苯、二 一二氣乙烧、氣仿、四氯化碳等齒化脂肪烴；二二’二哿甲烧、1 哪一異丙醚、 25/106 201016221 噁烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙謎蓉 一種單獨使用，亦可兩種以上混合使用。 ，貢。此等溶劑可 於該反應中，以式（13)所表示之羧酸與羰基二 例，可自廣泛的範圍中來適當選擇，通常為〇 使用比 此刻之反應溫度通常為一8 0〜6 (TC左右，較佳為ϋ其二 $:反應時間設為5分鐘〜6小時左右’較佳為3 二3 =盒 次之，使以式（14)所表示的N，0 —二甲基羥基 用 1 —羥基苯三氮（1-hydroxybenzotriazole)等來取# 使 φ 基胺。以式（1 3 )所表示之舰與Ν，0-基# 自廣泛的範财來適當選擇，但通常相對於式酿可 為-80〜60 °C左右，較佳為〇。。〜6 含右;5 ϋ二if ΐ 為1 ο分鐘至1 〇小時左右。 b u eu °反應時間較佳設 反應結束後，以使用氧化矽膠透層析法咸壓暮 及精製方法來《的化合物分離、精製。⑨K解周知之刀離 <合成簡圈6-2> 【化9】 0 ,0、 ❹ N I Me r2- (9) (15) (16) 上述合成簡圖中’ Ri、R2及Ha 1係與上述相同。 酮，、6二1念’使式〇5)所表示之化合物與鹵烷反應以合成 明類（ketone)的反應。 於該反應中，使式（9)所表示的鹵燒於趟類溶劑中與金屬鎂反 應，可調製Grignard試劑以使用於反應。作為金屬鋒別g適當使用 已研磨的屑狀（turning)鎂之外’亦可使用鋰、鈉、銦等。 以式（9)所表示的鹵烷，可使用與上述相同者。 該反應係進行於醚類溶劑系統，而作為峻類溶劑系統，可列舉二 $醚、二異丙醚、二噁烷、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二醚、乙 二醇二乙鱗。此等溶劑可-種單獨使用，亦可兩種以上混合使用。 26/106 201016221 於該反應中，以式（15)所表示之化合物與鹵燒之比例，可自廣 泛的範圍中來適當選擇，但通常相對於以式（15)所表示的化合物，' 使用鹵烷0.8〜5倍左右的莫耳數。此刻之反應溫度通常為〇8 0°C左右，反應時間為5分鐘〜6小時左右。 反應結束後，以使用氧化矽膠透層析法、減壓蒸餾等周知之分離 及精製方法來將標的化合物分離、精製。 <合成簡圖6—3> 【化10】
(18) ❹
上述合成簡▼中，Ri、R2及R4係與上述相同。r5&R6 烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，該等可用_素原子等來取代。〃 合成簡圖ό一3為於強鹼的存在下，使式（16)所表示的_化人 W肋g試劑或Homer—Emmons試劑反應，以形成碳—碳及 ^應。上，合賴圖帽記載之式⑼所表示雜合物為 Emmons試劑，但可使用Wittig試劑代之。 強鹼松較佳為具有脫去氫原子的反應者，可列舉 f氧=;氫氧化解驗土金屬氫氡化^ I ΐίίϊ U泛使作為用於該反應之溶ί以 j夕】舉本ψ本一甲本等方香煙；正己烧、環己院、石油鍵等 27/106 201016221 脂肪烴；二乙_、二異丙謎、二嚼烧、四氫吱鳴、乙二醇二甲醚、乙 二醇二乙醚等醚類。此等溶劑可一種單獨使用，亦可兩種以上混合使 用。 於該反應中’以式（16)所表示之化合物與強驗的比例，可自廣 泛的範圍中來適當選擇，但通常相對於式（16)所表示的化合物，使 用鹼類等1.1〜8倍左右的莫耳數。此刻之反應溫度，通常為一 8 〇 〜6 0°C左右。反應時間通常設為5分鐘〜3小時左右。
次之’於反應混合液中使Wittig試劑或Homer—Emmons試劑反 應。作為Wittig試劑或Homer—Emmons試劑，可廣泛使用周知的物 質。而於該步驟中，只要是於式（16)所表示的酮類化合物與乙酸醋 之間形成碳一碳雙鍵者即可，作為Wittig試劑的例子，可列^乙氧甲 醯基三苯鱗溴（Ethoxycarbonylmethyl(triphenyl；)ph()sphDnium Bromide )或乙基三苯基膦乙酸酯（ethyl (triphenylphosphoranylideiie；) acetate);作為Homer—Emmons試藥的例子，則可列舉麟酿基乙酸 乙基二苯酯（ethyl diphenyl phosphonoacetate)等磷醯基乙酸乙基二芳 酯（ethyl diaryl phosphonoacetate)，或磷醯基乙酸乙基二乙醋 diethyl phosphonoacetate)等磷醯基乙酸乙基二炫酯等，較佳為碟酿基 乙酸乙基二乙酯。 ’土 於該反應中，以式（丨6)所表示之化合物與磷醯基乙酸乙芙二 酯的比例，可自廣泛的範圍中來適當選擇，但通常相對於式（GY*所 表示的化合物，使用磷醯基乙酸乙基二乙醋1.1〜1 〇倍左右的草耳 數。此刻之反應溫度’通常設為室溫附近即可。此外，反應時間^當 設為2〜30小時左右。 ’ 反應結束後，以使用氧化梦膠透層析法、 及精製方法來將標的化合物分離、精製。 減壓蒸餾等周知之分離 <合成簡圈6 — 4> 【化11】
(18)
(19) 上述合成簡圖中，Ri、R2及R4係與上述相同。 28/106 201016221 合成簡圖6_4為，對式（18)所表示之具有未飽和鍵的叛酸酯， 進行催化氫化，而形成飽和叛酸酯之反應。 催化氬化係於氫氣氣氛、觸媒的存在下進行。 #觸媒只要是用於催化氫化者，可廣泛使用周知之觸媒，可列舉例 如氧化鉑、鉑一碳、氫氧化鈀、鈀一碳、技尼鎳（Raneynickle)等。 觸媒用量相對於式（18)所表示的化合物，通常為〇 〇 〇丄〜5 0重量％左右’較佳為〇·〇 1〜1 〇重量％左右。 气力限制’可自廣泛的範圍中來a當選擇。氫氣壓力 通常為0_8〜1 0 0大氣壓左右，較佳為丄〜3大氣壓左右。
該反應通常於適當之溶劑中進行，而作為溶劑，只要是對反應不 ，生不良影響的惰性物質即可廣泛使用。作為所使用的溶劑，可歹^舉 $如二^甲$、ϋ三氣乙燒、氯仿、四氣化碳等齒化脂肪煙；甲 ^、乙醇、異丙酵等醇類；甲酸甲醋、乙酸甲g旨、乙酸乙§旨等甲 酸、乙酸等羧酸或該等混合溶劑。 + a T * 〜1〇〇t左右’較佳為10〜40。。左 f反應時間係依據基貝量、溫度、觸媒種類等相異，但較氮消 標準後再結束反應。通常為1〜5。树m念 反應結束後，進行觸媒過濾、除去、溶劑某德除去箅一船虛拽夕 後，以溶劑萃取、氧化石夕膠透層析法等一般製f般處之 <合成簡圈6_5> 【化12】
FU
(20) 土述合成簡圖中’ 、尺2及尺4係與上述相同。 得所;ίΙΙϋΐ时（19)所衫錢_加水分解，以製 條件ΐί;水iiit 反應。於紐斜下或驗性 29/106 201016221 山友Ϊ'ΐΐ·件係只要將驗類添加至溶劑即可，而作，口亜β 可廣泛制’可列舉如 鹼金^ SL氧化物：魏化解驗土金屬氫氡 =鉀等 鹼金屬碳酸鹽；碳酸氫鈉、魏缺金^ · υ鉀等 驗金屬氫化物；氫化齡給土全麗. ，虱化納、風化钟等 lit ^ «+, - _a &地 —〇胺MN，W——甲基苯胺、吡啶、4--甲尬 一疊氮雙環辛燒（DABC 赘 ❹ ❹ 炉：惫Ϊ8曰化ίί劑的例ί ’可列舉苯、曱苯、二曱苯等芳i H甲、厂氯^ί自ί芳香烴；正己烧、環己院、石油_等脂肪 了，甲烷、1，2 —一氣乙烷、氣仿、四氣化碳等鹵化脂肪烴；二 祕魅了異丙醚、二噁烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚等 丙ί、2 —丁酮、甲基異丁基_等酮類；乙腈、丙腈、苯甲： ，Ν，Ν-二曱基曱酿胺、六甲基填醯三胺（ΗΜΡ Α)等 ^人基亞砜等亞颯等。此等溶劑可一種單獨使用，亦可兩種以上 於該反應中，反應溫度與反應時間等可自廣泛的範圍中來適當選 ^應溫度通常設為〇t至1〇〇t左右，而反應時間通常可設為 30分鐘至2〇小時左右。 巧 應結束後，以使用氧化矽膠透層析法、減壓蒸餾等周知之分離 及積製方法來將標的化合物分離、精製。 人从以式所表示之化合物中，X為Rl —CHR2—、η為2之化 口物，亦可藉由例如以下合成簡圖7所表示之反應來合成。 <合成簡囷7> 【化13】 30/106 201016221
OH
上述合成簡圖中’尺：及只2係與上述相同。
G
合成簡圖7為下_述的反應：相對於式（16)所表示的酮類化合 物’以式（21)所表示的二乙基—3 —羥基丙烯基膦酸酯作為H〇mer -Emmons試劑反應形成碳一碳雙鍵，而製得式（22)所表示的化合 ^ ;再進行催化氫化，製得式（23)所表示的化合物，其後進行醇的 氧化反應，即製得作為羰基化合物之式（24)所表示的化合物。再 者，於上述合成簡圖中，就以式（22)所表示的化合物而言，雖僅記 載雙鍵之順（cis)—反（trans)立體異構物其中一方，但不僅限於該 立艘異構物。 ' 使用Homei^Emmons試劑的反應及催化氫化，可分別參照合成簡 圖6—3、合成簡圖6—4同樣地進行。此外，醇的氧化反應，可藉由 使用強氧化劑將醇氧化以進行之，可使用鉻酸氧化、J〇nes氧化等周 知方法來適當進行。舉例而言，在鉻酸氧化中，可使用二氧化鉻、 酸、二鉻酸等鹽類或錯合物來進行。 反應結束後’進行觸媒過濾除去、溶劑蒸餾除去等一般處理之 後，以溶劑萃取、氧化矽膠透層析法等一般方法來精製。 本說明書中，免疫賦活係指使細胞性免疫、體液免疫等各種免疫 作用活性化’而免疫賦活劑可指’表示該等免疫活性化作用令任一 者。本發明之海藻糖化合物係假定：即使在免疫系統中，亦至少進行 被稱為「細胞性免疫」之巨噬細胞及中性白金球等免疫作用的活性 化’然而亦廣泛包含使細胞性免疫活性化的結果，且透過該等細胞釋 出細胞因子（cytokine)等，進一步使體液免疫活性化的場合等' 本說明書中，巨噬細胞賦活係指，原本巨噬細胞係具有對來自外 界之異物的吞噬作用者，以提高巨噬細胞之吞噬作用的方式作用，並 提升對巨噬細胞組織的附著性及運動性，而吞噬自外部所侵入之細菌 或變性後之自身成分的狀態。在巨噬細胞已活性化的狀態中，已^一 氧化氮（NO)的排放和活性氧的釋出會增大，測定該等释出物質的 31/106 201016221 ί放iff，活性化的指標；又，測定吞健用的宄進本 身’亦可將其作為巨嗟細胞活性化的指標。 本說明書中，中性白血球賦活係指，原本中性白血球本身亦1 對與巨嗡細胞相同之異物的吞嗟作用，使中性 巧^田菌等的狀態。在中性白血球已活性化的狀 ^^^的^^和/^氧的釋出會增大-此外’已知根據中性白企 ❹ ❹ (azurophilic granule) 所產生之生理活性物質的釋出。測定該等 血球活性化的指標，又，測定吞嗟作 用的:進本£則可將其作為中性白血球活性化的指標。 吞噬細胞可列舉巨噬細胞、單核細胞、多核白 吞ΐ制係指，作為免疫系統細胞，藉由將作 3Si=iiHys〇s〇me)融合’藉此消化該異物的反應。吞 it f者’並無特殊限定。較佳為使巨嗟細胞及中性白企 球中的一方或雙方亢進的吞噬作用者。 举、斥本細菌感染症劑係指’只要是會減輕細菌引起的感 在f體内而引起的各種症狀者即可。細菌為例如產 ft ίί卜^包含綠膿湖、病雜大腸菌等。 二生毒素中和劑係指，減輕細菌所產生的毒素的 菌之ί音鹵ί染症劑的場合中’藉由抑制細菌的增殖或來自細 毒音中ittU對於亦包含可減輕_所引起的各種症狀者，在 降低喜ί ’岐在僅毒纽與生物體反應的航下，亦可 f吸附#素或使毒素轉變成不活性物質，使毒素嗟 步消化被噬入之毒素等作用。 療祕係指’具有抗腫顏性，並用於癌症的預防或治 i瘤。二本中抗癌劑所作用的趙瘤，不拘為原發性腫瘤或轉移 亦可用於肩路的抗癌劑，不僅是原發性癌及轉移腫瘤的治療， ίΞ _瘤’可列舉如乳癌、精巢癌、睪丸朦瘤、 ί 2臟癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、子宮 癌、戚if細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、甲狀腺癌、皮膚 髓瘤了軟部组織:滤黑t瘤（_melanoma)、神經膠質瘤、骨肉瘤、骨 ’、肉瘤、成神經細胞瘤（neur〇biast〇ma)、惡性淋巴瘤 32/106 201016221 I白H但其#可較佳例示為乳癌、精巢癌、胰麵或横繼 學+可容許之含有該化合物與藥理 、抗癌劑等醫藥用途。 於免疫賦活劑、細菌毒素f和劑 劑學上^容許:即I理係指’只要是藥理學上及製 之擔體之外，溶化鮮-般使驗製劑製造 ❹ ❹ 料）等、柔軟劑、u界包劑、著色料（染料、顏 明之海藻糖化合i = 配載體，亦可對本發 態產生變化。 收性或血中遭度產生影響，而使體内動 兹以:ίίί?至:化’ 製造。'射劑（液劑、懸浮劑、乳劑）等。該等製劑能以常用方法來 鱼装製歉投予量可依_法、患者年齡、_、病患程度 宜選擇’通常，將作為有效成分的海藻糖化合物 、），對體重1kg，分作一次〜數次，每日投予〇〇丄〜]〇〇 mg，較佳為〇.1〜5〇mg β ιυυ 上述投予量由於係依各種條件而更動’不僅有少於上述範圍之投 卞里即足夠的場合，亦有必須超過上述範圍之投予量的場合。 再者’本說明書中所使用之用語係用於說明特定之實施型離，並 非意圖限定發明。 又’本說明書中所使用的用語「含有」係指：排除與文脈中意義 ，顯相異之場合，記述之事項（部件、步驟、要素、數字等）g存 ^ ’但未排除：除此以外之事項（部件、步驟、要素、數字等）已存 在0 33/106 201016221 用注，此處所使用崎有用語（含技姻語及科學 義°。°此發明所屬技術_領域人士廣泛理解之同等意 書及相語除非明示相異之定義，係應作為具有與本說明 義的铃冑祕轉，孩紐想化或過度 m昧本實施型態雖有參雌式圖且同時·的場合，但為模式 圖時〗為明確說明亦有誇張表現的場合。 ’
si#莖〔第二」等用語係為了表現各種要素而使用，但可理 受到其等用語的限定。該等用語係僅為了將一個要素 使，：㈣如，將第—要素記為「第二要素」，同樣 將，一要素」記為「第一要素」，並未脫離本發明之範圍。 實施例以更具體說明本發明’但本發明原本即不受下 限制’亦能夠於可合於上，下述之意旨的範圍内，適當加 >變更來實施之，且其等無論何者皆包含於本發明的技術範圍内。 【實施例】 <實施例海藻糖二_化合物的化學合成> 圖1中所示，式（3)所表示之糖之羥基被保護的海藻糠 各自以式（4)或式（6)所表示之所期望的数基化合物進行 $化反，，合成式（7)所表示之化合物後，再進行糖之羥基的去保 護’即製得所期望之海藻糖二酯化合物。 以下指出其一部份的製造例，但本發明並未限定於以下的製造 例。 製造例A-1 〔6，6’一雙一〇 — ( 2-癸基十二醢基）一2，3，4，2,， 3’，4’一六笨甲基一α，tt，一海藻糖的合成〕 【化14】
0 Ci〇H2i
C10H21 ΒηβΟ〇 ΒπΟ 〇 34/106 201016221 ,ιΐΐ製造例C — 1中記載之方法所得之羧酸（2 ~癸基十二酸） j，1 m g，4 2 5 μπι。1 )與海蕩糖衍生物（2，3，4， $，4，一六苯甲酸基_α，α，_海藻糠）（i5〇mg，iT 〇 1 )溶於無水二氣甲烷溶液（2m1)，依序添加粉末分子 A ( 〇.3 g )、4_二曱胺基吡啶（2〇.8mg，Ι70μπιο ( 3—二曱胺丙）碳二亞胺鹽酸鹽〔以下簡稱為
I〕（9 7.8mg ’ 5 1 Ομιηο 1 )，進行加熱迴流反應4 士時。^用矽藻土一 5 3 5 (celite— 5 3 5 )過濾，加入蒸餾水以二 烷萃取3次。於有機層中加入無水硫酸鎂並乾燥，過濾後濃縮。 將殘留物以管柱層析法cj^omatography)(己烧：乙酸乙醋 =1 0 : 1)精製，即製得作為二酯體之6，6,一雙一〇— ( 2 _癸 ，十亏醯基）一2’3,4,2，，3，’ 4,一六苯甲基一α，α，一海 藻糖（242mg，93%)的無色、無定形固體。 ,n,1C〇^i?%〇5^P；ia]l)20 +57 7〇(c °·9 CHQ3)； FT IR (neat) 3088, 3064, 18°4, 1741 Cml ; lR (300 MH2 in CDC13) δθ.87 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.14-1.32 (64H, m), 1.43 (4H, m), 1.55 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz) 3 56 (2H t J = 9 0
Hz), 4.04 (2H, t，J = 9.0 Hz)，4.10 (2H, m)，4.19 (4H m) 4 53 (M d J = 10.8 Hz), 4.67 (2H, d, J = 11.7 Hz), 4.72 (2H, d J = il.7 Hz) 4 85 i2H d )= 4·;7 (2〒，V ^a8 % 4 99 (2HU, J = 1。.8 ά)，5.18 (;H: m)； (75 MHz ώ CDC13) 614.13, 22.69,27.41,27.45,29.33,29.35,29.51,29.53,29 63 31 90 32 32 45 70 62.07, 69.16, 73.04, 75.28, 75.71，77.82, 79.68 8’1.55 b.78 ’127.38, 127·73, 127·86» 127-92, 128.34, 128.43, 137.79^137.94, 138.59^ 176.16. 製造例A-2 〔6，6’一雙一0 — (2 —辛基癸速基）一 2,3，4，2，，3，， 4’一六苯甲基一α，《，一海藻糖的合成〕 【化15】 35/106 201016221 ο
叛酸係使用由製造例C — 2中記載的方法所得之2 —辛基癸酸’ 並以與製造例A—1相同之方法，製得6，6,一雙一〇—(2—辛基 癸醢基）一2 ’ 3，4，2’，3’，4’一六苯甲基一α，α’.一海讓 糖。 colorless syrup; [α]〇16 +62.3°(c 1.0 CHC13); FT JR (neat) 3088, 3064, 3031, 2927, 2855, 1947, 1868, 1808, 1737 cm'1; ]H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.85 (6H, t5 J = 6.9 Hz), 0.86(6H, t, J = 6.9 Hz), 1.12-1.34 (48H, m), 1.43 (4H, m), 1.55 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 3.57 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.10 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H, d, J = 10.5 Hz),4.67 (2H, d, J = 11.7 Hz), 4.71 (2H, d, J = 11.7 Hz), 4.85 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.5 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.22-7.38 (30H, m); 13CNMR (75 MHz in CDCI3) 514.12, 22.64, 22.67, 27.40, 27.45, 29.27, 29.45, 29.48, 29.62, 31.83, 31.85, 32.34, 45.71, 62.06, 69.15, 73.04, 75.27, 75.71, 77.24, 77.82, 79.68, 81.55, 93.75,127.37, 127.61, 127.72, 127.84, 127.91, 127.93, 128.38, 128.44, 137.80, 137.95, 138.59, 176.15; FABMS m/z (%)1438 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C90H126O13Na (IVT+Na) 1437.9096, Found 1437.9126. 製造例A-3 〔6，6，一雙一0 - (2—壬基十一醢基）一2，3，4，2,， 3’，4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕 【化16】 36/106 201016221
羧酸係使用由製造例C — 3中記載的方法所得之2 _壬基+一酸 ，並以與製造例A— 1相同之方法，製得6，6，一雙一〇— ( 2 —壬
基十一醯基）一2,3,4,2’，3，，4，一六苯甲基—α，α，_海 藻糖。 colorless syrup; [a]D16 +64.8°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3088 3064 3031, 2926, 2854, 1946, 1871, 1806, 1738 cm'1 ； !h NMR (300 MHz in CDC13) δθ.86 (6H, t, J = 7.0 Hz), 0.87(6H, t, J = 7.0 Hz), 1.10-1.34 (56H, m), 1.43 (4H, m), 1.55 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.55 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 3.57 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.11 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H, d, J = 10.2 Hz),4.67 (2H, d, J = 11.7 Hz), 4.72 (2H, d, J = 11.7 Hz), 4.85 (2H, d, J = 10.2 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.5 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.22-7.37 (30H, m); 13CNMR (75 MHz in CDCI3) 514.11, 22.67, 27.39, 27.45, 29.28, 29.30, 29.48, 29.51, 29.56, 29.57, 29.61, 31.85, 31.88, 32.33, 45.69, 62.06, 69.15, 73.03, 75.26, 75.70, 77.23, 77.82, 79.68,81.54, 93.75, 127.36, 127.59,127.71, 127.83, 127.90, 127.91, 128.37, 128.42, 137.79, 137.93, 138.58, 176.12^FABMS m/z (%) 1934 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C94H134〇i3Na (M^+Na) 1493.9722, Found 1493.9701. 製造例A-4 〔6，6，一雙一0 - (2—十一基十三醢基）一2，3，4，2,， 3’，4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕 【化17】 37/106 201016221 ο
ΒΠ〇 Ο 酸 .苯甲基一α，α’ 紐係使用由製造％ :=載=所f之2-十-基十三 ，並以與製造例A:1#:门弋方法9,製f，6，6’-雙-〇_ (2-十一基十三醯基）一2 ’ 3 ’ 4 ’ 2 ’ 3 ’ 4，~亡贫审其一《，α，
❹ _海藻糖。 colorless syrup； [α]〇2° +60.0°(c 0.9 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2940, 2862, 1946, 1869, 1805, 1740 cm'1 ; !H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.87 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.14-1.34 (72H, m), 1.43 (4H, m), 1.56 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 10.2, 3.6 Hz), 3.56 (2H, t, J = 8.7 Hz), 4.04 (2H, t, J = 10.2 Hz), 4.12 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H, d, J =10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.85 (2H, d, J = 10.8 Hz), 4.88 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.8 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.22-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13)514.12, 22.67, 27.40, 27.44, 29.34, 29.50, 29.52, 29.62, 31.90, 32.30, 45.68, 62.05, 69.14,73.03, 75.25, 75.69, 77.80, 79.66, 81.52,93.76, 127.35, 127.58, 127.70,127.82,127.90,128.36,128.40,137.76,137.92,138.57,176.12. 製造例A—5 〔6，6’一雙一0— ( 2 —十二基十四醢基）一2，3 ’ 4，2,， 3’ ’ 4’一六苯甲基一α，α，一海藻糖的合成〕 【化18】
〇 C12H C12H25 C
ΒηΟ 5 38/106 201016221 羧酸係使用由製造例C — 5中記載的方法所得之2—十二基十四 酸，並以與製造例A—1相同之方法，製得6，6’一雙一〇— (2 — 十二基十四醯基）_2，3，4，2,，3,，4’一六苯甲基一α，α’ —海藻糖。 ❹ colorless syrup; [a]D20 +60.8°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2940, 2862, 1946, 1869, 1804, 1739 cm'1; NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.14-1.34 (80H, m), 1.43 (4H, m), 1.56 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 3.57 (2H, t, J = 8.4 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.12 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.86 (2H, d, J = 10.8 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.8 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.24-7.37 (30H, m); NMR (75 MHz in CDC13) 614.12, 22.69, 27.41, 27.46, 29.36, 29.53, 29.66, 31.92, 32.32, 45.70, 62.09, 69.19, 73.07, 75.27, 75.71, 77.86, 79.72, 81.56, 93.78, 127.71, 127.62, 127.74, 127.86,127.94,128.40,128.45, 137.83,138.00, 138.64,176.17. 製造例A—6 〔6 ’ 6’一雙一 0—（2 —h 三基十五慧基）一 2，3，4，2 ’， 3,，4，一六苯甲基一α，α，一海藻糖的合成〕 【化19】
c 13Η27^Α.〇_ ο 叛酸係使用由製造例C 一 6中記載的方法所得之2 —三基十五 酸’並以與製造例A—1相同之方法，製得6，6，一雙_0二^2 — 十三基十五醢基）一2，3 ’4, 2，’ 3，，4,一六苯甲基一α，α， —海藻糖。 colorless syrup; [α]〇 +50.2°(c 1.1 CHC13); FT IR (neat) 3088 3064 3031 2929, 2855, 1945, 1868, 1804, 1739 cm" ； ^ NMR 300 ώίζ in CDCI3) δθ.88 (12H, t, J = 6.6 Hz), 1.10-1.34 (88H, m) 1 44 (4H m) 1 56 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 9.8, 3.6 Hz) 3 58 (2H ?t J = 9 8 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.8 Hz), 4.13 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H d J = 39/106 201016221 10.8 Hz), 4.66 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.73 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.85 (2H, d, J = 11.0 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.8 Hz), 4.99 (2H, d, J = ll.〇 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.20-7.38 (30H, m); liC NMR (75 MHz in CDC13) 614.11, 22.70, 27.42, 27.46, 29.37, 29.54, 29.66, 31.93, 32.33, 45.72, 62.12, 69.23, 73.10, 75.26, 75.69, 77.23, 77.67, 77.91, 79.77, 81.58, 93.77, 127.42, 127.61, 127.74, 127.85, 127.94, 128.40, 128.44, 128.46, 137.86, 138.05, 138.68,176.15. 製造例A—7 〔6，6’一雙一O— ( 2 ~十五基十七醢基）一2，3，4，2,， 3,，4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕 ❹ 【化20】
羧酸係使用由製造例C — 8中記載的方法所得之2 —十五基十七 酸’並以與製造例A—1相同之方法，製得6，6，~雙一Ο—（2 — 十五基十七醒基）一2，3，4， 一海藻糖。 2，，3，，4，一六苯甲基_α，α’ colorless syrup; [a]D +44.3°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2941, 2861, 1945, 1868, 1812, 1739 cm'1 ； 2h NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (12H, t, J = 7.2 Hz), 1.12-1.38 (104H, m), 1.43 (4H, m), 1.56 (4¾ m), 2.32 (2H, m), 3.54 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 3.57 (2H, t, J = 8.7 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.12 (2H, m), 4.20 (4H, m), 4.53 (2H, d, J = 10.5 Hz)，4.67 (2H，d，J = 12.0 Hz), 4.72 (2H，d, J = 12.0 Hz), 4.86 (2H，d， J = 10.8 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.8Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.5 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.22-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.14, 22.70, 27.25, 27.42, 27.45, 29.38, 29.55, 29.68, 29.72, 31.94, 32.32, 45.70, 62.07, 69.16, 73.05, 75.29, 75.72, 77.82, 79.68, 81.55, 93.78, 127.40, 127.62,127.75,127.95,128.41, 128.45,137.81, 137.95, 138.61,176.19. 40/106 201016221 製造例A—8 〔6 ’ 6,一雙一0一 3,，4，-六苯f基一 (2—十六基十八雄基）~~2，3，4 α，α’一海藻糖的合成〕 2,， 【化21】
0
羧酸係使用由製造1載2所得之2 -十六基十八 酸，並以與製造例A一 1相同之方法，製侍6，6,一雙一Ο—（2_ 十六基十八醯基）一2 ’ 3 ’ 4 ’ 2’ ’ 3’ ’ 4’一六苯甲基一α，α’
colorless syrup; Nd +48.8 Ο 1·〇 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2938, 2857, 1944, 1869, 1808, 1739 cm'1 ; !H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.10-1.36 (112H, m)5 1.43 (4H, m), 1.56 (4H, m), 2.32 (2H, m), 3.55 (2H, dd, J = 9.3, 3.6 Hz), 3.57 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.04 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.11 (2H, m), 4.19 (4H, m), 4.53 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.86 (2H, d, J =10.8 Hz), 4.87 (2H, d, J = 10.5Hz), 4.99 (2H, d, J = 10.8 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.22-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.15, 22.71, 27.43, 29.39, 29.56, 29.69, 29.73, 31.94, 32.31, 45.70, 62.08, 69.17, 73.05, 75.31, 75.74, 77.83, 79.68, 81.56, 93.81, 127.41, 127.64, 127.76, 127.96,128.42,128.47,137.83,138.00,138.62,176.22. 實施例1:製造例 α— 1 j； 6，6’一雙一〇— (2—癸基十二醮基）_α, α，一海藻糖的合成 【化22】 41/106 201016221 ο
將由製造例A—1中記載的方法所得之6，6，一雙一Ο— (2 — 癸基十二醯基）~2,3,4,2，，3，，4,一六苯甲基一 α，α，一 海藤糖（200mg，ΐ31μιη〇 1)溶於氯仿：甲醇：乙酸 (1 : 1 : 0·0 5 )之混合溶劑（4m 1 )，加入氩氧化把（2 〇w /w% ’Smg’iupmoi)，於氫氣1大氣壓下攪拌6小 時。將反應混合液過濾後濃縮’並以管枉層析法（二氯甲烷：甲醇= 1 0 : 1 )精製殘留物，即製得6，6，一雙一〇— ( 2—癸基十二醢 基）一α ’ α’一海藻糖（i25mg，97%)之無色、無定形固 體。 colorless syrup; [a]D20 +61.8°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3358, 2940, 2861, 1746 cm'1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.25 (56H, m),1.45 (8H, m), 1.58 (4H, m), 1.83 (4H, m), 2.58 (2H, m), 4.18 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.3, 3.6 Hz), 4.73 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.88 (2H, dd, J = 11.7, 5.1 Hz), 5.07 (4H, m), 5.87 (2H, d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.29, 22.95, 27.75, 27.80, 29.62, 29.80, 29.90, 29.95, 32:14, 32.82, 46.16, 63.93, 71.54, 71.94, 73.31，74.81，95.69, 176.26; FABMS m/z (%) 1010 (TVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C56Hi〇6〇i3Na (M"+Na) 1009.7532, Found 1009.7498. 實施例2 :製造例《— 2 〔6，6 ’一雙一Ο — ( 2 _辛基癸酱基）一α ’ <*’一海藻糖的合成〕 【化23】 42/106 201016221
以由製造例A—2中記載的方法所得之θ，6’ —雙一0_ (2一 辛基癸醯基）_2，3，4，2，，3，，4,一六苯曱基一α，α’ —海 藤糖作為原料化合物使用’並以與製造例α—1相同之方法’製付 6，6’一雙一〇_ (2—辛基癸醯基）一α，α，一海藻糖。 colorless syrup; [a]D14 +70.2°(c 0.6 CHC13)； FT IR (neat) 3300, 2929, 2856, 1743 cm·1; 4 NMR (300 MHz in C5D5：i) δ〇·86 (12H，t, J = 6_9 Hz), 121 (40H, m),1.46 (8H, m), 1.57 (4H, m), 1.80 (4H, m), 2.56 (2H, m), 4.19 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.6 Hz),
4.88 (2H，dd, J = 12.0, 4.8 Hz), 5.08 (4H, m), 5.87 (2H, d，J = 3.6 Hz); C NMR (75 MHz in C5D5N) 513.69, 22.32, 27.12, 27.19,28.96,29.11, 29.33, 31.47, 32.23, 45.55, 63.25, 70.94, 71.30, 72.69, 74.18 95^14, 175.68; FABMS m/z (%) 898 (M"+Na); HRMS (FAB+)WZ calcd for C48H9〇〇i3Na (IVf+Na) 897.6279, Found 897.6249. 實施例3:製造例3 , . 〔Θ，6，一雙一〇 —（ 2—壬基H•一醯基）一α，α —海藻糖的〇成 【化24】
壬基十一醯基） ，6,—雙一〇_ (2-’一六苯甲基一α，α’一 以由製造例Α —3中記載的方法所得，之61 +—酿基）一2 ’ 3 ’ 4 ’ 2 ’ 3 43/106 201016221 海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例α—1相同之方法，製得 6 ’ 6’一雙一0— ( 2 —壬基十一酿基），α’一海藻糖。 colorless syrup; [α]〇14+64.9° (c 0.6 CHCI3); FT IR (neat) 3306, 2928, 2855, 1742 cm^; !H NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.87 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.22 (48H, m), 1.42 (8H, m), 1.54 (4H, m), 1.79 (4H, m), 2.56 (2H, m), 4.19 (2H, t, J = 9.0 Hz),4.39 (2H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.88 (2H5 dd, J = 11.7, 4.8 Hz), 5.08 (4H, m), 5.88 (2H, d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 513.69, 22.32, 27.14, 27.20, 28.97, 29.17, 29.27, 29.34, 31.51, 32.22, 45.55, 63.28, 70.94, 71.31, 72.69, 74.18, 95.13, 175.67; FABMS m/z (%) 954 (IvT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C52H98〇i3Na (Μ"+Να) 953.6905,Found 953.6862. ❹ 實施例4 :製造例ct一 4： 〔6，6’一雙一0—（2 —I 基十三酱基）一a，a，一海藻糖的合 成〕 【化25】 〇
以由製造例A — 4中記載的方法所得之6，6，一雙一0—（2_ 十一基十三醯基）一2, 3，4, 2，，3’，4’一六苯曱基一 a，a， —海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例a—1相同之方法，製 付6 ’ 6’一雙一0_ (2 —h—基十三酿基）一a，a’一海藻糖。 colorless syrup; [a]D14 +58.5°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3297, 2934, 2856, 1742 cm'1; !H NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.88 (12H, t5 J = 6.6 Hz), 1.26 (64H, m),1.45 (8H, m), 1.58 (4H, m), 1.82 (4H, m), 2.58 (2H, m), 4.18 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz), 4.73 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.88 (2H, dd, J = 11.7, 5.1 Hz), 5.07 (4H, m)5 5.88 (2H, d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.29, 22.94,27.75, 27.80, 29.63, 29.81,29.96, 32.14, 32.81, 46.15, 63.93, 71.54, 71.94, 73.31, 74.81, 95.67, 176.25; FABMS m/z (%) 1066 (f^T+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C60H114O13Na(M++Na) 1065.8157, Found 1065.8160. 44/106 201016221 實施例5 :製造例α— 5 〔6 ’ 6’一雙_0—（2 —二基十四雄基）一α，α’一海藻糖的合 成〕 【化26】
以由製造例Α —5中記載的方法所得之6，6,一雙一0—（2 — 十二基十四醯基）一2,3,4,2，，3，，4’一六苯甲基一 α，α’ 一海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例α—1相同之方法，製 得6 ’ 6’一雙一 0— (2 —h二基十四酿基）_α，α’一海藻糖。 colorless syrup; [α]ϋ14 +54.6°(c 1.0 CHCI3)； FT IR (neat) 3310, 2937, 2857, 1742 cm1; NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.28 (72H, m),1.46 (8H, m), 1.58 (4H, m), 1.82 (4H, m), 2.59 (2H, m), 4.18 (2H, t，J = 9.0 Hz), 4.29 (2H, dd，J = 9.0, 3.6 Hz)，4.73 (2H，t，J = 9.0 Hz), 4.88 (2H, dd, J = 11.7, 5.1 Hz), 5.08 (4H, m), 5.87 (2H, d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 814.30, 22.97,27.77, 27.82,29.66,29.83,29.99, 32.17, 32.82, 46.16, 63.94, 71.53, 71.95, 73.31, 74.80, 95.66, 176.24; FABMS m/z (%) 1122 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C64Hi22〇i3Na (M"+Na) 1121.8784, Found 1121.8831. 實施例6:製造例a—6 〔6，6’一雙一0 —（2—十三基十五醢基）一a，a’一海藻糖的合 成〕 【化27】 45/106 201016221
以由製造例A-6中記載的方法所得之6，雙一0_ (2 一 十三基十五醯基）一2,3,4,2，，3，，4’一六苯甲基_α，α’ 一海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例α一1相同之方法’製 得6，6，一雙一0— (2—十三基十五醯基）一α，α’ —海藻糖。 colorless syrup; [α]〇19 +52.7°(c 0.6 CHCI3)； FT IR (neat) 3313, 2927, 2854, 1741 cm'1; ]H NMR (300 MHz in C5D5N) δ〇·88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.29 (80H, m),1.46 (8H, m), 1.58 (4H, m), 1.83 (4H, m), 2.59 (2H, m), 4.19 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.6, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.89 (2H, dd, J = 11.7, 5.1 Hz), 5.08 (4H, m), 5.88 (2H, d, J = 3.6 Hz); C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.28, 22.94,27.75, 27.80,29.63, 29.82,29.98, 32.14, 32.80, 46.14, 63.92, 71.53, 71.94, 73.30, 74.79, 95.66, 176.21; FABMS m/z (%) 1178 (MVNa); HRMS (FAB, m/z calcd for C6BH13〇〇i3Na (M^+Na) 1177.9409, Found 1177.9404. 實施例7:製造例a—7 〔6，6,一雙一〇— (2—十五基十七醢基）—a’a’一海藻糖的合 成〕 【化28】
以由製造例A —7中記載的方法所得之6 ’ 6’一雙一0— (2 — 十五基十七醯基）_2,3,4,2，，3，，4’一六苯曱基_〇1’€1’ 46/106 201016221 一海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例α—1相同之方法，製 得6，6’一雙一0— (2—十五基十七醯基）一α，α’一海藻糖。 colorless syrup; [a]D19 +44.8°(c 0.5 CHC13)； FT IR (neat) 3330, 2925, 2853, 1741 cm'1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.87 (12H, t, J = 7.2 Hz), 1.31 (96H, m),1.47 (8H, m), 1.58 (4H, m), 1.83 (4H, m), 2.59 (2H, m), 4.19 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.88 (2H, dd, J = 11.4, 4.8 Hz), 5.08 (4H, m), 5.87 (2H, d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.23, 22.89, 27.73, 27.79, 29.58, 29.80, 29.91, 29.97, 32.09, 32.78, 46.13, 63.92, 71.55, 71.95, 73.32, 74.80, 95.67, 176.21; FABMS m/z (%) 1290 (]νΓ+Να); HRMS (FAB+) m/z calcd for C76Hi46013Na (M^+Na) 1290.0661, Found 1290.0677. O 實施例8:製造例a—8 〔6 ’ 6’一雙一0— (2—十六基十八醮基）一a，a’一海藻糖的合 成〕 【化29】 0
❹ 以由製造例A—8中記載的方法所得之6，6’一雙一0— (2 — 十六基十八醯基）一2,3,4,2，，3，’ 4’一六苯甲基一 a，a’ 一海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例a—1相同之方法，製 得6 ’ 6，一雙一0 —（2—十六基十八醯基）—a，a’'海藻糖。 colorless syrup; [a]〇17 +45.1°(c 0.5 CHCb)； FT IR (neat) 3308, 2937, 2856, 1741 cm'1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.87 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.31 (104H, m), 1.46 (8H, m), 1.57 (4H, m), 1·8〇 (4H, m), 2.56 (2H, m), 4.19 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.29 (2H, dd, J = 9.3, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.88 (2H, dd, J = 11.4, 4.8 Hz), 5.08 (4H, m), 5.87 (2H, d,J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N)614.25, 22.90, 27.75, 27.80, 29.60, 29.82, 29.91, 29.99, 32.10, 32.80, 46.14, 63.91, 71.55,71.95, 73.32, 74.80, 95.66, 47/106 201016221 176.24; FABMS m/z (%) 1346 (Nf+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C8〇Hi54〇i3Na(M4'+Na) 1346.1288, Found 1346.1287. 製造例B-l 〔6 ’ 6，一雙一 0 — ( 3—壬基十二醢基）一2，3，4，2,， 3’ ’ 4’_六苯甲基一α ’ α’一海藻糖的合成〕 【化30】
將由製造例D—1中記載的方法所得之羧酸（3 —壬基十二酸） (236mg ’ 724μηιο 1)與海藻糖衍生物（2，3，4 , 2，3 ，4 —六苯甲酸基一 α，α’一海藻糖）（256mg，2Θ 〇0111〇1)溶於無水二氣甲烷溶液（1〇1111)，依序添加粉末分 子篩4 A ( 1 g)、4-二甲胺基吡啶（35.4mg，290μιηο 1 )、1 —乙一3— (3—二曱胺丙）碳二亞胺鹽酸鹽〔以下簡稱為 EDCI〕（222mg，l.l6 mm ο 1 )，加熱迴流反應 1 〇 小 時。使用矽藻土一 5 3 5過濾，加入飽和食鹽水以二氣甲烷萃取2 次。於有機層中加入無水硫酸鎂並乾燥，過濾後濃縮。將殘留物以管 柱層析法（己烷：乙酸乙酯=15 : 1)精製，即製得作為二酯體之 6，6+ —雙一0— (3 —壬基十二酸）_2，3，4，2，，3，，4, 二六苯甲基一α，α，一海藻糖（3 5 〇mg，8 〇%)的無色、無定 形固體。 9^UP1；i?K 1〇 CHChy\ FT ^ ^eat> 3〇88^ 3063» rnri 18?1, 18〇6> 1739 cm ; H mAR (300 in CDCls) δ〇^7 (12H t J = 5.1 Hz), 1.20 (64H, m), 1.81 (2H, m), 2.20 (4H, H： J = 9 3 叫，3 56 (2H, m)，4 04 (2H，t，J = 9 3 ^ 4?3T (2H，m)，451 (2H，d,J = 1()·5 叫，467 (2H，d，J =
27Η,ΪΓ12GHz)，486 (4H，d，卜1G·5 叫，5GG (2H,d，J -10.5 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.6Hz), 7.23-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 48/106 201016221 MHz in CDC13) 614.13, 22.68, 26.51, 29.33, 29.56, 29.64, 29.92, 31.89, 33.65, 33.76, 34.89, 39.08, 62.35, 69.12, 72.94, 75.30, 75.70, 77.60, 79.38, 81.56, 94.02, 127.44, 127.63, 127.78, 127.92, 128.09,128.41, 128.47, 137.78, 137.84, 138.60, 173.24; FABMS mJz (%) 1522 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C96Hi3g〇i3Na (M^+Na) 1522.0036, Found 1522.0020. 製造例B—2 〔6，6，一雙一0—（ 3—辛基十一醢基）一2，3，4，2,， 3’，4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕
【化31】
羧酸係使用由製造例D —2中記載的方法所得之3 —辛基十一酸， 並以與製造例Β—1相同之方法’製得6，6’一雙一0—（3—辛基 十一醯基）一2，3，4，2’，3’，4’一六苯甲基一α，α’一海藻 糖。 colorless syrup; [α]ϋ2° +41.8°(c 2.0 CHC13); FT JR (neat) 3088, 3064, 3031, 2932, 2855, 1947, 1867, 1806, 1739 cm-1; NMR (300 MHz in CDCI3) δθ.86 (6H, t, J = 6.9 Hz), δθ.87 (6H, t, J = 6.9 Hz), 1.20 (56H, m), 1.81 (2H, m)5 2.20 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (2H, t, J = 8.4 Hz), 3.56 (2H, m), 4.04 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.09 (4H, m), 4.23 (2H, m), 4.51 (2H, d, J =10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.5 Hz), 5.00 (2H, d, J = 10.5 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.23-7.37 (30H, m); NMR (75 MHz in CDC13) 514.14, 22.69, 26.52, 29.32, 29.61, 29.94, 31.89, 33.69, 33.80, 34.91, 39.10, 62.38, 69.14,72.96, 75.29, 75.70, 77.62, 79.40, 81.58, 93.95, 94.04, 127.44, 127.62, 127.77, 127.91, 128.07, 128.41, 128.46, 137.78, 137.85, 138.59, 173.23; FABMS m/z (%) 1466 (JVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C92Hi3〇013Na (M^+Na) 1465.9409, Found 1465.9392. 製造例B~3 49/106 201016221 〔6 , 6，-雙~〇_ ( 3’，4’一六苯甲基_tt， 【化32】 (3—癸基十三醢基）一2，3，4，2 ，<*’一海藻糖的合成〕
羧酸係使用由製造例D一 3中記載的方法所得之3 —癸基十三酸， 並以與製造例Β~~ 1相同之方法，製得6，6,一雙一〇~ ( 3 —癸基 十三基）一2，3，4，2，，3，，4,一六苯甲基—α’α’一海藻 糖。 colorless syrup； [a]D20 +53.6°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3063, 3030, 2926, 2854, 1946, 1874, 1804, 1739 cm'1 ; NMR (300 MHz in CDC13) δθ.87 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.21 (72H, m), 1.81 (2H, m), 2.19 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (2H,t, J = 8.4 Hz), 3.56 (2H, m), 4.04 (2H, t, J = 8.4 Hz), 4.11 (4H, m), 4.21 (2H,m), 4.51 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.0Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.5 Hz), 5.00 (2H, d, J =10.5 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.6Hz), 7.23-7.36 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDCI3) 514.14, 22.70, 26.51, 29.36, 29.66, 29.95, 31.93, 33.67, 77.23, 77.62, 79.40, 81.58, 94.04, 127.46, 127.65,127.80, 127.93, 128.10, 128.43, 128.49, 137.80, 137.87, 138.62, 173.27; FABMS m/z (%) 1579 (M^H+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C100H147〇13Na 〇vi"+H+Na) 1579.0787, Found 1579.0763. 製造例B — 4 〔6，6，一雙一Ο — (3-十一基十四醢基）一2 ’ 3，4，2,， 3,，4’一六苯甲基_α，α’一海藻糖的合成〕 【化33】 50/106 201016221
羧酸係使用由製造例D — 4中記載的方法所得之3 —十一基十四 酸，並以與製造例B—1相同之方法，製得6，6’一雙一〇一（3 — 十一基十四醯基）一2,3,4,2,，3,，4,一六苯甲基一α，α’ _° colorless syrup; [α]〇2° +58.1°(c 1.0 CHC13)； FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2926, 2854, 1946, 1867, 1806, 1739 cm'1 ； NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (12H, t, J = 7.2 Hz), 1.21 (80H, m), 1.81 (2H, m), 2.19 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (2H,t, J = 8.4 Hz), 3.55 (2H, m), 4.04 (2H, t, J = 6,9 Hz), 4.10 (4H, m), 4.20 (2H,m), 4.51 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.71 (2H, d, J = 12.0Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.5 Hz), 5.00 (2H, d, J =10.5 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.6Hz), 7.19-7.36 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDCI3) 814.14, 22.71, 26.53, 29.38, 29.67, 29.95, 31.93, 33.68, 33.79, 34.91, 39.10, 62.37, 69.14, 72.96, 75.31, 75.71, 77.63, 79.40, 81.58, 94.04, 127.46, 127.64, 127.80, 127.93, 128.10, 128.43, 128.49, 137.80, 137.87, 138.62, 173.27; FABMS m/z (%) 1635 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C104H154〇13Na (IVT+Na) 1634.1288, Found 1634.1298. 製造例B—5 〔6，6，一雙一0—（3_十二基十五醯基）一2，3，4，2,， 3’ ’ 4’一六苯甲基一α，α，一海藻糖的合成〕 【化34】
51/106 201016221 羧酸係使用由製造例D_ 5中記載的方法所得之3 _十二基十五 酸，並以與製造例B — 1相同之方法’製得6，6，一雙一0 - (3 — 十二基十五醯基）一2 ’ 3，4，2’ ’ 3’ ’ 4’一六苯甲基一α，α， 一海藻糖。 。 colorless syrup; [〇]d2 +68.9°(c 0.9 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3063, 3031, 2925, 2853, 1944, 1867, 1806, 1739 cm'1; NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (12H, t, J - 6.9 Hz), 1.21 (88H, m), 1.81 (2H, m), 2.20 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (2H,t, J = 8.7 Hz), 3.57 (4H, m), 4.05 (2H, t, J = 8.7 Hz), 4.05 (2H, t, J = 8.7 Hz), 4.11 (2H, m), 4.21 (2H, m), 4.52 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.3 Hz), 4.72 (2H, d, J = 12.3 Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.5 Hz), 5.01 (2H, d, J = 10.5Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.3 Hz), 7.21-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.14,22.70,26.53, 29.38,29.67, 29.95, 31.92, 33.67, 33.78, 34.91, 39.10, 62.37, 69.14, 72.96, 75.30, 75.71, 77.63, 79.40, 81.57, 94.03, 127.45, 127.63,127.79, 127.93, 128.09,128 42, 128.48, 137.79, 137.87, 138.62, 173.26; FABMS m/z (%) 1691 (IVT+H+Na); HRMS (FAB) m/z calcd for C108H163O13Na (lif+H+Na) 1691.1993, Found 1691.1992. 製造例B — 6 〔6 ’ 6’一雙一0— (3 —f~ 三基十六雄基）一2，3，4，2 ’， 3’，4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕 【化35】
缓酸係使用市售的3—h三基十六酸（和光純藥工業股份有限公 司製）’ ^以與製造例B一1相同之方法，製得6，6,一雙一0 — (3_十三基十六醯基）一2,3,4,2，，3，，4，一六苯甲基一 α ’ α’一海藻糖。 colorless syrup; [a]D20 +49.5°(c 0.9 CHC13); FT IR (neat) 3088, 3064, 3031, 2925, 2853, 1944, 1871, 1806, 1739 cm'1; !H NMR (300 MHz in 52/106 201016221 CDC13) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.23 (96H, m), 1.81 (2H, m), 2.20 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (4H,m), 4.04 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.11 (4H, m), 4.21 (2H, m), 4.51 (2H, d, J = 10.8Hz), 4.67 (2HS d, J = 12.0 Hz), 4.72 (2H, d, J =12.0 Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.8 Hz), 5.00 (2H, d, J = 10.8 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.6 Hz), 7.23-7.37 (30H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13)514.16, 22.72, 26.54, 29.40, 29.69, 29.72, 29.97, 31.95, 33.68, 33.79, 34.92, 39.11, 62.37,69.14, 72.96, 75.33, 75.72, 77.24, 77.62,79.40, 81.59, 94.07, 127.46, 127.66, 127.81, 127.94, 128.11, 128.44, 128.50, 137.80, 137.87,138.63, 173.28; FABMS m/z (%) 1691 〇VT+H+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for Cii2Hi7i〇i3Na(]Vf+H+Na) 1747.2619, Found 1747.2618. 製造例B-7 ❹ 〔6，6’一雙一O— (3 —h四基十七雄基）一2，3，4，2 ’， 3’ ’ 4’一六苯甲基一α，α’一海藻糖的合成〕 【化36】
羧酸係使用由製造例D —6中記載的方法所得之3—十四基十七 © 酸’並以與製造例B_1相同之方法，製得6，6,一雙一0— (3 — 十四基十七醯基）一2,3,4’2，，3，，4，一六苯甲基一α，α， 一海藻糖。 colorless syrup; [a]D20 +43.7°(c 1.0 CHC13); FT IR (neat) 3087, 3064, 3032, 2924, 2853, 1943, 1871, 1796, 1739 cm·1; 4 NMR (300 MHz in CDCls) δθ.88 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.23 (104H, m), 1.80 (2H, m), 2.19 (4H, d, J = 6.9 Hz), 3.54 (4H, m), 4.04 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.11(4¾ m), 4.21 (2HS m), 4.51 (2H, d, J = 10.5 Hz), 4.67 (2H, d, J = 12.0 Hz), 4.72 (2H, d, J =12.0 Hz), 4.86 (4H, d, J = 10.5 Hz), 5.00 (2H, d5 J = 10.5 Hz), 5.17 (2H, d, J = 3.3 Hz), 7.22-7.37 (30H, m);13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.16, 22.72, 26.55, 29.39, 29.70, 29.73, 29.97, 31.95, 33.68, 33.79, 34.92, 39.11, 62.38, 69.15, 72.97, 75.32, 75.72, 77.23, 77.63, 79.41, 81.59, 94.06,127.46, 127.65, 127.81，127.94, 128.11，128.44, 128.49, 137.81，137.88, 138.63, 53/106 201016221 173.27; FABMS m/z (%) 1802 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcdfor C116H178013Na(M"+Na) 1802.3185, Found 1802.3175. 實施例9:製造例P-1 〔6，6’一雙一0—（3—壬基十二醢基）_«，《’一海藻糖的合成
Cg c9h19
nu 〇 將由製造例B — 1中記載的方法所得之6，6’一雙_〇_ ( 3 — 壬基十二醯基）_2，3,4,2’，3’，4’一六苯甲基_α，α’一 海藻糖（35〇mg，233μιηο 1)溶於氣仿：曱醇：乙酸 (5 : 1 : 0.5)之混合溶劑（5 m1)，加入氫氧化把（3 w/w %，13mg，18*5pmol)，於氫氣1大氣壓下挽拌2 7小 時。將反應混合液過濾後濃縮，並以管柱層析法（二氯甲烷：甲醇= 1 5 : 1 )精製殘留物，即製得6，6’一雙一〇—（ 3—壬基十二酿 基）一α，α’一海藻糖（135mg，61%)之無色、無定形固 ❹ 體。 colorless syrup; [α]〇21 +62.8°(c 0.7 CHCI3); FT IR (neat) 3316, 2926, 2854, 1743 cm'1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.81 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.23 (64H, m),1.99 (2H, m), 2.33 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.13 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.25 (2H, dd,J = 9.6, 3.9 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.78 (2H, d, J = 12.3 Hz), 4.93 (2H, d, J = 12.3 Hz), 4.98 (2H, m), 5.81 (2H, d, J = 3.9 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.29, 22.94, 29.84, 29.62, 29.91, 29.94, 30.22, 32.12, 34.10, 35.23, 39.33, 64.26, 71.48, 71.96,73.35, 74.82, 95.82, 173.51; FABMS m/z (%j 982 (MVNa);HRMS (FAB) m/z calcd for C54H1〇2〇i3Na (M"+Na) 981.7218, Found 981.7198. 實施例1 5 :製造例P— 2 54/106 201016221 〔6 6雙—〇 (3辛基十一缝基）—α，α，—海藻糖的合成 ❹ 【化38】 C8Hi7- c8h17
❹ 以由製造例B — 2中記載的方法所得之6，6,一雙一〇一（3 — 基）_2 ’3 ’4、，2,’3，，4，-六苯甲基-α，α，_ 海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例β_ 1相同之方法，製得 6，6’一雙一〇 — ( 3 —辛基十一醯基）—α，α，_海藻糖。 colorless syrup; [a]D21 +70.7°(c 0.4 CHC13); FT IR (neat) 3275, 2925, 2854,1742 cm'1; LH NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.86 (12H, t, J = 7.2 Hz), 1 24 (56H, m),2.03 (2H, m), 2.37 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.19 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.31 (2H, dd,J = 9.6, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.85 (2H, dd, J =11.7, 5.7 Hz), 5.01 (2H, d, J = 11.7 Hz), 5.11 (2H, m), 5.89 (2H, d, J = 3.9 Hz); 13C NMR (75 MHzin C5D5N) 614.28, 22.93, 26.83, 26.87, 29.59, 29.87, 30.21, 32.11, 34.10, 35.23, 39.32, 64.26, 71.48, 71.95, 73.35, 74.83, 95.82, 173.52; FABMS m/z (%) 926 (IVT+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C5〇H94〇i3Na (NT+Na) 925.6592, Found 925.6585. 實施例10 :製造例P— 3 6，—雙—〇_ (3 一癸基十三醢基）一α，α’一海藻糖®合 成〕 【化39】 55/106 201016221
❹ 以由製造例B — 3中記載的方法所得之6 ’ 6’一雙一〇_ (3 — 癸基十三醯基）一2,3,4,2，，3，，4, 一六苯曱基—α ’ α’_ 海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例β一1相同之方法’製得 6，6,一雙一0 —（3—癸基十三醯基）一α，α’一海藻糖。 colorless syrup; [α]〇21 +60.9°(c 0.9 CHCI3)； FT IR (neat) 3279, 2924, 2854, 1742 cm1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) 60.83 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.24 (72H, m),2.00 (2H, m), 2.35 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.14 (2H, t, J = 8.7 Hz), 4.26 (2H, dd,J = 9.6, 3.3 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.78 (2H, dd, J =11.7, 5.4 Hz), 4.95 (2H, d, J = 12.0 Hz), 5.01 (2H, m), 5.82 (2H, d, J = 3.9 Hz); 13C NMR (75 MHzin C5D5N) 614.10, 22.74, 26.65, 29.41, 29.73, 30.00, 31.92, 33.87, 35.03, 39.16, 64.10, 71.10, 71.57, 72.92, 74.38, 95.14, 173.52; FABMS m/z (%) 1037 (FAB+) m/z calcd for C58Hn〇013Na (M^+Na) 1037.7903, Found 1037.7874. 實施例1 1 :製造例P— 4 〔6 ’ 6 ’一雙一0 — ( 3 —H—基十四薙基）一α ’ α’一海藻糖的合 成〕 【化40】
nw 〇
C
C”H23 C C11H23 以由製造例Β —4中記載的方法所得之6 ’ 6,一雙一0—（3 — Η 基十四醢基）一2 ’ 3 ’ 4 ’ 2，，· 3，，4’一六苯甲基一a’a’ 56/1〇6 201016221 —海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例β_ 1相同之方法，製 得6 ’ 6’一雙一 〇 —（3 —-h—基十四醢基）一α，α’一海藻糖。 colorless syrup; [a]D21 +60.6°(c 0.5 CHC13)； FT IR (neat) 3289, 2925, 2853, 1743 cm'1; !H NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.86 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.28 (80¾ m),2.04 (2H, m), 2.38 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.19 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.31 (2H, dd5J = 9.0, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.85 (2H, dd, J =11.7, 5.1 Hz), 5.05 (2H, d, J = 11.7 Hz), 5.01 (2H, m), 5.89 (2H, d, J = 3.9 Hz); 13C NMR (75 MHzin C5D5N) 514.30, 22.96, 26.92, 29.64, 30.00, 30.27, 32.14, 34.14, 35.26, 39.37, 64.30, 71.52, 72.00, 73.40, 74.87, 95.86, 173.53; FABMS m/z (%) 1094 〇Vf+Na);HRMS (FAB+) m/z calcd for C62Hn8〇i3Na(]Vr+Na) 1093.8470, Found 1093.8458. o 實施例12 :製造例p— 5 〔6 ’ 6’一雙一O — (3 —h二基十五雄基）一a，ct’一海藻糖的合 成〕 【化41】
以由製造例B — 5中記載的方法所得之6，6’一雙一0—（3 — 十二基十五醯基）一2,3,4,2’，3’，4’一六苯甲基一a，a’ 一海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例β—1相同之方法，製 得6，6 ’雙一 0 — ( 3 —h二基十五酿基）一a，a’一海蕩糖。 colorless syrup; [α]〇21+52.5° (c 0.3 CHCI3)； FT IR (neat) 3271, 2923, 2853, 1743 cm'1; NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.84 (12H, t, J = 6.3 Hz), 1.25 (88H, m), 2.02 (2H, m),2.36 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.15 (2H, t, J = 9.0 Hz), 4.27 (2H, dd, J= 9.9, 3.6 Hz), 4.74 (2H, t, J = 9.6 Hz), 4.81 (2H, dd, J =11.4, 4.8 Hz), 4.97(2H, d, J = 11.4 Hz), 5.02 (2H, m), 5.84 (2H, d, J = 2.4 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.18, 22.82, 26.73, 29.50, 29.87, 30.12, 32.01, 33.97, 35.12, 39.25,64.18, 71.25, 71.71, 73.06, 74.51, 95.38, 173.52; FABMS m/z (%) 1150 (M"+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd for C66Hi26〇i3Na (IVT+Na) 1149.9110, Found 1149.9103. 57/106 201016221 實施例1，3 :製造例p_ 6 ί ? 6雙~~〇_ (3 ϊ"二基十六斑基）一α，α，一海藻糖的合 【化42】
一以由製造例Β —6中記載的方法所得之6，6,一雙一〇_ (3 — 十六醯基）一2,3’4’2，，3，，4，一 六苯甲基一α，α， 二海藻糖，作為原料化合物使用’並以與製造例β— 1相同之方法，製 得6，6’''雙—0—（3—十三基十六醯基）一α，α，一海藻糖。 colorless syrup； [a]D21 +42.3°(c 0.5 CHC13); FT IR (neat) 3321, 2925, 2853, 1742 cm'1 ； ]H NMR (300 MHz in C5D5N) 60.83 (12H, t, J = 6.6 Hz), 1.27 (96H, m),2.02 (2H, m), 2.36 (4H, d, J = 6.9 Hz), 4.15 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.27 (2H, dd,J = 9.3, 3.3 Hz), 4.75 (2H, t, J = 9.3 Hz), 4.80 (2H, dd, J =12.0, 5.4 Hz), 4.97 (2H, d, J = 12.0 Hz), 5.02 (2H, m), 5.84 (2H, d, J = ❹ 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHzin C5D5N) δ14·30, 22.96, 26.91，29.65, 30.03, 30.28, 32.15, 34.12, 35.25, 39.36, 64.28, 71.51, 71.99, 73.38, 74.85, 95.83, 173.51; FABMS m/z (%) 1206 〇vT+Na);HRMS (FAB+) m/z calcd for C7〇H134〇i3Na (Nf+Na) 1205.9770, Found 1205.9746. 實施例14 :製造例P— 7 〔6，6，一雙一〇— (3—十四基十七殖基）一α，α’一海藻糖的合 成〕 【化43】 58/106 201016221
❹ ❹ 以由製造例B —7中記載的方法所得之6 ’ 6’ —雙一〇— (3 — 十四基十七醯基）一2,3,4,2，，3’，4’一六苯甲基_α，α， —海藻糖作為原料化合物使用，並以與製造例β—1相同之方法，製 得6，6，一雙一0— (3_十四基十七醯基）—α，α’ —海藻糖。 colorless syrup; [a]D21 +55.7°(c 1.0 CHC13)； FT JR (neat) 3310, 2925, 2853, 1743 cm·1; Ή NMR (300 MHz in C5D5N) δθ.84 (12H, t, J = 6.9 Hz), 1.26 (104H, m), 2.03 (2H, m), 2.37 (4H, d, J = 6.6 Hz), 4.15 (2H, t, J = 9.9 Hz), 4.28 (2H, dd, J = 9.6, 3.9 Hz), 4.74 (2H, t, J =9.9 Hz), 4.81 (2H, dd, J =11.7, 5.4 Hz), 4.97 (2H, d, J = 11.7 Hz), 5.03 (2H, m), 5.84 (2H,d, J = 3.6 Hz); 13C NMR (75 MHz in C5D5N) 514.05, 22.67, 26.55, 29.36, 29.67, 29.74, 29.94,31.87, 33.74, 34.95, 39.14, 64.02, 70.91, 71.46, 72.77, 74.20, 94.69, 173.45; FABMS m/z (%) 1262 (M"+Na); HRMS (FAB+) m/z calcd forC74Hi42〇i3Na(]Vr+Na) 1262.0348, Found 1262.0348. 〔作為原料之羧酸化合物的合成〕 製造例C 一1 〔2—癸基十二酸的合成〕 【化44】 0
Ci〇H21^A〇h
Cl〇H21 1)添加至乾燥後的二口燒瓶，並於瓶内 3 9 7mg，9.93mm。1)，冷卻 酯（ 5 3 0mg，3 3imm〇"。於0 f (2'22g * B.28mmo 1 ) 、攪拌6】時加入飽和氣化銨水溶液，並以醚萃取3次，使用 59/106 201016221 無水硫酸鎂乾燥有機層，過濾後濃縮。將製得的殘留物溶於1 〇 N氫 氧化鈉水溶液（4m1)與正丁醇（8m1)的混合溶劑，加熱迴流 6小時。其後’冷卻至室溫，加入1n鹽酸，再以謎萃取3次，使用 無水硫酸鎂乾燥有機層，過濾後濃縮。將製得的殘留物溶於乙酸（3 3 m1)，加熱迴流18小時。冷却後，減壓濃縮以去除乙酸，由氧 化矽凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯==7 : 1 )精製殘留物，即製 得叛酸（2—癸基十二酸）（7 1〇mg，63%)之無定形白色粉 末。 white powder; FT JR (neat) 3041, 2943, 2857, 2689, 1714 cm'1 · NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 7.6Hz), 1.21 (32H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m),2.34 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514 13 〇 22.72, 27.40^ 29.37, 29.50, 29.64, 31.95, 32.19, 45.61, 183.22; CIMS m/z (%) 341 (1VT+H); HRMS (CI+) m/z calcd for 〇22氏5〇2(1^++11) 341.3420, Found 341.3421. ’ 製造例C_2 〔2 —辛基癸酸的合成〕 【化45】 c8h17 丫JL〇h c8h17 使用1一破辛烧取代1一破癸炫，並以與製造例c — 1相同的方 法製得2 —辛基癸酸。 white powder; FT IR (neat) 3032, 2927, 2856, 1707 cm'1; !H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.26 (24H, m), 1.48 (2HS m), 1.63 (2H, m), 2.34 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.12, 22.70, 27.40, 29.30, 29.45, 29.60, 31.90, 32.20, 45.66, 183.50; CIMS m/z (%) 285 (MVH); HRMS (Cf) m/z calcd for C18H3702(]Vr+0) 285.2794, Found 285.2772. 製造例C-3 〔2—壬基十一酸的合成〕 【化46】 60/106 201016221
使用1 —碘壬烷取代1_碘癸烷，並以與製造例c—1相同的方 法製得2 —壬基十一酸。 white powder; FT IR (neat) 3019, 2934, 2858, 1712 cm'1; NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.26 (28H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m), 2.33 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.14, 22.72, 27.40, 29.34,29.50, 29.60, 31.92, 32.20,45.60, 183.11; CIMS m/z (%) 313 (MVH); HRMS (Cf) m/z calcd for Qo^uO/iyr+H) 313.3106, Found 313.3111. 製造例C一4 〔2—十一基十三酸的合成〕 【化47】
使用1一碘十一烷取代1一碘癸烷，並以與製造例C — 1相同的方 法製得2 —I—基十三酸。 white powder; FT IR (neat) 3028, 2941,2858,1712 cm*1; NMR (300 MHz in CDCls) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.25 (36H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m)s 2.35 (1H, m); 13C NMR (75 MHzin CDC13) 514.17, 22.74, 27.41, 29.40, 29.51, 29.61, 29.65, 29.69, 29.72, 31.97, 32.20, 45.55, 182.81; CIMS m/z (%) 369 (TVf+H); HRMS (Cf) m/z calcd for 024Η49〇2(Μ^+Η) 369.3732, Found369.3731. 製造例C-5 〔2—十二基十四酸的合成〕 【化48】 61/106 201016221 Ο C12H25
OH C12H25 使用1_碘十二烷取代1 —碘癸烷，並以與製造例c _1相同的 方法製得2—十二基十四酸。
white powder; FT IR (neat) 3028, 2943, 2860, 2691, 1714 cm'1; NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 7.1Hz), 1.25 (40H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m),2.34 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.16, 22.76, 27.43, 29.43, 29.54, 29.64, 29.68, 29.71, 29.72, 31.99, 32.22, 45.68^ 183.46; CIMS m/z (%) 397 (IVT+H); HRMS (Cf) m/z calcd for 〇26Η53〇2(Μ"+Η) 397.4045, Found 397.4043. 製造例C — 6 〔2 —h三基十五酸的合成〕 【化49】 ο
OH 使用1一碘十三烷取代1一碘癸烷，並以與製造例C_1相同的方 法製得2 —三基十五酸。 ❹ white powder; FT IR (neat) 3032, 2922, 2851, 2691, 1712 cm-1 ; NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.25 (44H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m),2.35 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.14, 22.72, 27.40, 29.39, 29.50, 29.60, 29.64, 29.69, 31.96, 32.19, 45.54, 182.79; CIMS m/z (%) 425 (M^+H); HRMS (CI^) m/z calcd for C28H57〇2(M++H) 425.4358, Found 425.4341. 製造例C ~ 7 〔2 —h四基十六酸的合成〕 【化50】 62/106 201016221
使用1 —碘十四烷取代1 —碘癸烧，並以與製造例C_1相同的方 法製得2 —h四基十六酸。 white powder; FT IR (neat) 3028, 2928, 2854, 2684, 1706 cm'1 ; !H NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 7.2Hz), 1.25 (48H, m), 1.48 (2H, m), 1.60 (2H, m),2.34 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.13, 22.72, 27.40, 29.40, 29.50, 29.60, 29.64, 29.73, 31.96, 32.19, 45.57, 182.87; CIMS m/z (%) 453 (100 MVh); HRMS (Cr1") m/z calcd for CsoHeiCbCM^+H) 453.4671，Found 453.4677. 製造例C-8 〔2—十五基十七酸的合成〕 【化51】
使用1_碘十五烷取代1一碘癸烷，並以與製造例C一1相同的方 法製得2_十五基十七酸。 white powder; FT IR (neat) 3028, 2911, 2848, 2650, 1703 cm"1 ; NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.25 (52H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m),2.35 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.05, 22.65, 27.33, 29.33, 29.43, 29.53, 29.57, 29.66, 31.90, 32.14, 45.43, 182.41; CIMS m/z (%) 481 (IVf+H); HRMS (Cf) m/z calcd for C32H65〇2(TVr+H) 481.4984, Found 481.4977. 製造例C _ 9 〔2_十六基十八酸的合成〕 【化52】 63/106 201016221 ο 使用1 —碘十六烷取代1 —碘癸烷，並以與製造例C 一1相同的方 法製得2 —十六基十八酸。 Ο
white powder; FT JR (neat) 3028, 2914, 2848, 2691, 1705 cm'1 ; lR NMR (300 MHzin CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9Hz), 1.25 (56H, m), 1.48 (2H, m), 1.61 (2H, m),2.35 (1H, m); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.14, 22.72, 27.40,29.40, 29.50, 29.60, 29.64, 29.73, 31.96, 32.20, 45.51,182.51; CIMS m/z (%) 509 (IVT+H); HRMS (Cf) m/z calcd for C34H6902(]^+H) 509.5297, Found 509.5298. 製造例D_1 〔3—壬基十二酸的合成〕 自以下製造例D—1 — 1，由D—1 — 5中記載的方法，合成3 一壬基十二酸。 製造例D—1—1 〔N_甲氧一N —甲基癸醢胺的合成〕 【化53】 〇 ❹
CoH _9Π19 Λ Ν τ ▼癸g，2 3.2mmo 1 )溶於無水二氣甲烷溶液（8 〇 ，1—幾二咪咕（1，1—carbonyldiimidazole) (4· 二1 )攪拌1·5小時。接著加入Ν，Ο—二甲基 ，27.9mm。1)，再搜拌3 小時。加入 院萃取2次。於有機層中加人無水硫酸鎖並乾 Ϊ的，管柱層析法（己烧：乙酸乙醋=8 : 精製所 传的卩巧作為醯胺之Ν_甲氧_Ν_甲基癸 g，9j%)的無色透明液體。 h 说（neat) 2927, 2854, 1731 cm_1; lH (300 MHz j 7 8 ^ J=69 ^ 127 (12^ 163 (2¾ m)5 241 (¾ J 一 7 8 叫 318 (3H，s), 3·68 (3H，s); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 64/106 201016221 製造例D~1 —2 〔10—十九烷酮的合成〕 【化54】 Ο
CgH19· Λ
加熱已研磨的屑狀鎖（3.2 g，1 3 4mm ο 1 )，緩緩滴入1 :漠，气（1 2.9m 1 ’ 6 7.5mm〇 1 )的無水THF溶液（6 8 j。加熱迴流1.5小時後’將反應液冷卻至室溫，並將其滴入 号^^造例D — 1_1記載的方法所得之N _甲氧一 N _甲基癸醢胺 2 2.5mm〇 1 )的丁hf (8 0mL)溶液中。攪拌 子2气鐘ΐ，加人1N鹽酸且以二乙謎萃取2次。於有機層中加人無 水硫I鎂並乾燥，過濾後濃縮。用管柱層析法（己烷··乙酸乙酯= 8 : 1)精製所得的殘留物，即製得作為酮之丄〇 _十九烷酮（6 〇 g ’ 9 5%)的白色無定形固體。 汉（neat) 2953, 2916, 2847, 1698 cmVH NMR (6H，U=69 叫，126 (24H, m)，155 (4H，m), !i/ ^i7 〇5^； C ^75 ώ CDC13) 514.03, 22.63, 23.84, 29 24, 29.41, 31.84,42.74, 211.49; CIMS m/z (%) 282 (IVT); HRMS (Cf) m/z calcd for C19H380 (IVT) 282.2882, Found 282.2902. 製造例D-1-3 〔3 —壬一2 —十二稀酸乙酯（ethyl3 — nonyl— 2 — dodecenoate) 的合成〕 【化55】 〇9^19 〇
CgH^^^^OEt 65/106 201016221 H ’ 6 g ’ 1 4 2 mm 〇 1 )溶於無水τ (34ml，^71) ’冷卻1 至、〇°〇後，滴入磷醯基乙酸乙ϋ酯 加以製造例3 ?，。升溫至室溫後，添 2 1 · 3 mm ο 1 ) , 3-壬—2 上? ： };精製所得的殘留物’即製得作為醋之 Ί2 一ί—烯酸乙酯（7.6g，9 9%)的無色透明液體。 in CDCUHO 88V6H ^ 512?55, 1718 Cm 1 ； ^ ^300 MHz J = 7 8 7 It Au t ^ 127 (27H> 144 (4¾ 2.12 (2H, ❹
’ A (2H，t，J = 8·1 Hz)，4·14 (2H a J = 7 9 Hr、s /Ί W br s); C (75 廳 in CDC13) δ14 14( 22^^68¾^ 29.34, 29.49, 29.52, 29.60, 30.01；31.92 32 19 38 44 59 ^ ΓΗ^Ω^^ο^ο ^ (%) 352 (C^ 111/2 ^alcd fo^ C23H44O2 (W) 352.3349, Found 352.3345. 製造例D-1-4 〔3—壬基十二酸乙磨（ethy丨3_nouyldodecanoate)的合成〕 【化56】 ^θΗ19 〇 CgHig^-^OEt 將由製造例D — 1 — 3記載的方法所得之3 —壬一2 —卜二稀酸 乙酯（7.6g，21.7mmo 1)溶於氣仿：甲醇（5 : 1 )之混 合溶劑（1 0 〇m 1 )，加入P t 02觸媒（3 w/w%，2 2 3m g，9 8 3μπιο 1 )於氫氣1大氣壓下攪拌2 3小時。用濾紙濾去 P t 〇2觸媒並濃縮之。以管柱層析法（己烷：二乙醚=5 0 : 1 ) 精製所得的殘留物，即製得3—壬基十二酸乙酯（7.1 g，9 2%) 之無色透明液體。 colorless oil; FT IR (neat) 2929, 2855, 1739 cm'1; !H NMR (300 MHz in CDCI3) δθ.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (35H, m), 1.84 (1H, m), 2.21 (2H, 4 J = 6.6 Hz), 4.12 (2H, q, J = 7.2 Hz); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.16, 14.32, 22.73, 26.55, 29.38, 29.64,29.66, 29.93, 31.95, 33.91, 35.10, 66/106 201016221 39.40, 60.07, 173.73; CIMSm/z (%) 354 (IVT); HRMS (CI+) m/z calcd for C23H4602 (M1) 354.3508, Found 354.3503. 製造例D —1 — 5 〔3—壬基十二酸的合成〕 【化57】
Ο
將由製造例D — 1 — 4記載的方法所得之3 —壬一十二酸乙酯（6. 3g’17_7mmol)溶於水飽和丁醇溶液（8 〇 m 1 )，添加κ 〇H(l〇g，177mm ο 1)加熱迴流4 · 5小時，加入1N鹽 酸並以二乙醚萃取2次。於有機層中加入無水硫酸鎂並乾燥，過濾後 濃縮。以管柱層析法（己烧：乙酸乙醋=1 〇 : 1 )精製所得的殘留 物’即製得3 —壬基十二酸（6.3g ’ 99%)的無色透明液體。 colorless oil; FT IR (neat) 2925, 2854, 1709 cm'1; NMR (200 MHz in CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (32H, m), 1.85 (1H, m), 2.27 (2H, d, J = 6.9 Hz); 13C NMR (75 MFIz in CDC13) 514.16, 22 73 26 52 29 38 29.65, 29.89, 31.95, 33.79, 34.87, 39.00, 179.94; CIMS m/z (%) 326 〇Vf)： HRMS (Cf) m/z calcd for Cn^OiQ^t) 326.3129, Found 326.3157., 製造例D-2 〔3—辛基'f 酸的合成〕 【化58】
CgH17 〇 Η1 起始化合物係使用辛酸取代製造例D — 1 — 1記載的癸酸，並使用 1 —溴辛烷取代製造例D—1一 2記載之1 —溴壬烷，各步驟中所製 造之化合物係用於以下步驟，使其與由製造例D—1 — 1至d_工一 5記載之方法相同來合成，即製得3—辛基十一酸。 in FT m (neat) 29205 2855} 1712 cm l» lH NMR (300 MHz
d, J (6H，U = 6 6 出)，1 26 (28H，m), 185 (1H，m) 2.27 (2H， 6 9 Hz)； 13C NMR (75 MHz in CDC13) d 14.16, 22.71, 26.52, 29.34, 67/106 201016221 29.61, 29.89, 31.93, 33.80, 34.88, 38.94, 179.58; CIMS m/z (%) 298 〇f)· HRMS (Cf) m/z calcd for C19H3802(]Vr) 298.2876, Found 298.2874. ’ 製造例D-3 〔3 _癸基十三酸的合成〕 【化59】
C10H21 Ο ci〇H2i^X^'〇H ❹
起始化合物係使用Η —酸取代製造例D — 1 — 1記載的癸酸，並 使用1一溴癸烧取代製造例D — 1一 2記載之1 —溴壬烧’各步驟中 所製造之化合物係用於以下步驟，使其與由製造例D_1 — 1至D — 1 — 5記載之方法相同來合成，即製得3 —癸基十三酸》
colorless oil; FT IR (neat) 2935, 2857, 1711 cm'1; NMR (300 MHz in CDCls) δθ.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (36H, m), 1.85 (1H, m), 2.27 (2H d，J = 6.9 Hz); 13C NMR (75 MHz in CDC13) δ14.15, 22.72, 26.51，29.38’ 29.66, 29.88, 31.94, 33.78, 34.86, 38.95, 179.79; CIMS m/z (%) 354 (M"); HRMS (Cf) m/z calcd for 〇23^6〇2(^0 354.3498, Found 354.3503. ’ 製造例D-4 〔3 —H—基十四酸的合成〕 【化60】
C11H23 OH 起始化合物係使用十二酸取代製造例D— 1 — 1記載的癸酸，並 使用1 —溴十一烷取代製造例D—1 — 2記載之1_溴壬烷，各步驟 中所製造之化合物係用於以下步驟，使其與由製造例D—1 — 1至D —1 — 5記載之方法相同來合成，即製得3 —I 基十四酸。 colorless solid; FT JR (neat) 2923, 2853, 1707 cm1; !H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9 Hz), 1.26 (40H, m), 1.85 (1H, m), 2.27 (2H, d, J = 6.9 Hz); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 514.17, 22.74, 26.53, 29.40, 68/106 201016221 29.69, 29.72, 29.89, 31.96, 33.79, 34.88, 38.98,179.82; CIMS m/z (%) 382 Of); HRMS (Cf) m/z calcd for C25H5〇〇2(M+) 382.3811, Found 382.3816. 製造例D-5 〔3—十二基十五酸的合成〕 【化61】 C12H25 〇
V X 使用由製造例D — 5 — 4記載的方法所得之3 —十二基十五酸乙 酯來取代製造例D—1一 5記載之3 —壬基十二酸乙酯，並以與製造 例D— 1 — 5相同之方法製得3—十二基十五酸。 起始化合物係使用十三酸取代製造例D_1 — 1記載的癸酸，並 使用1一溴十二烷取代製造例D—1 — 2記載之1 —溴壬烷’各步驟 中所製造之化合物係用於以下步驟，使其與由製造例D_1 — 1至D —1一5記載之方法相同來合成，即製得3—十二基十五酸。 colorless solid; FT IR (neat) 2928, 2854, 1709 cm'1; NMR (300 MHz m CDCI3) δθ.88 (6H, t, J = 6.6 Hz), 1.26 (44H, m), 1.85 (1H, m), 2.27 (2H, d, J = 6.9 Hz); 13C NMR (75 MHz in CDC13) 614.15, 22.72, 26.51, 29.39, 29.68, 29.71, 29.88, 31.96, 33.78, 34.86, 39.00, 180.00; CIMS m/z (%) 410 (M"); HRMS (Cf) m/z calcd for C27H54〇2(Mf) 410.4066, Found 410.4095 製造例D—6 〔3—十四基十七酸的合成〕 ❹ ❹ 【化62】 C14H29 ο 起始化合物係使用十五酸取代製造例D—1 — 1記載的癸酸’並 使用1厂溴十四烷取代製造例D一1一 2記載之1 —溴壬烷，各步驟 中所製造$化合物係用於以下步驟，使其與由製造例D 一1一1至d 1 — 5 δ己載之方法相同來合成，即製得3 _十四基十七酸。 69/106 201016221 colorless solid; FT IR (neat) 2915, 2849, 1704 cm'1; !H NMR (300 MHz in CDC13) δθ.88 (6H, t, J = 6.9 Hz), 1.26 (52H, m), 1.85 (1H, m), 2.27 (2H, d, J = 6.9 Hz); l3C NMR (75 MHz in CDC13) 614.15, 22.73, 26.52, 29.41, 29.73, 29.90, 31.96, 33.78, 34.88, 38.99, 179.72; CIMS m/z (%) 466 (IVT); HRMS (Cf) m/z calcd for 〇31设202(]^ 466.4685, Found 466.4717. 〔其他化合物的合成〕 使該等與上述製造例相同，以製得實施例16至2 2的化合物。 就本發明之式（1)所表示的化合物，該等化合物係式中X、X，、η 及η’為以下表1所示者。 〇 【化63】
【表1】 X n X* k Π 舍施例1S 笨基 〇 笨基 0 實施例17 #基 〇 萘基 0 赏施例18 璟己基 〇 環己基 〇 貫施例19 環庚基 0 環庚基 〇 舍施例20 CH (C I 4 Hz9 C 1 eHSa) 〇 CH (Ο..Η5βαΐΛΗ,J 0 货施例21 〇 C “Ημ 0 W施例22 C 1 eHaa 〇 C 1 eHs 3 0 貫施例23 CH (CI2HSi〇CH,) s 〇 CH (C,aHi4OCHsj , 0 貫施例24 CH (C,3H»6〇H) 2 〇 CH (C,aH„〇H), 0 〔生理活性的測定〕 就本發明的化合物，進行以下試驗以測定活性。 70/106 201016221 發明的實施例化合物，實施例編號、製造例編 ΪΪ不表χ2:ί施:T合物/，本發明之式⑴尨 。视式rx、x 'RrRi、^、:^’^及…係表示以下者 【化64】
〇 【表2】 實施例 製造例 X ： Rj-CHRj-X* ： R,1 -CHR,t - n及n* R,及 R,’ 112及 R,· 2 α-2 n —CeH17 0 3 〇 — 3 n — C 19 π - C 9 H i 分 0 1 α — 1 n —C10H21 n -C,0H2i 0 4 α — 4 η —CnHja π — C h 0 5 ft — 5 η —CjiHii n — Ci 2H2S 0 6 α — 6 n-C,3H27 ft — C，3 H2 7 0 7 α — 7 n — C1SH31 n —C , aH3, 0 8 α-8 n Ci «Has n "*C1«H33 0 15 β-2 π 1f η —C*H1? 1 9 0-1 n —C*H, a n — C » H19 ----- 1 10 β-3 n -CieH21 n ~ C1 〇 H 21 i 1 1 0 — 4 n **C! i H2a n iH23 ---— 1 12 0 - 5 n ~C12H2e n-CiaHas 1 13 B-e n—Cl3H2t Π — C 1 3 H2 7 1 14 β~7 ϋ 一 C i 4H2， π 14H29 " "*..... · ..............i-im. 此外，在試驗中以由結核菌而來之周知天然化合物的T D CM作 為正控制（positive control)使用。再者，TD CM係由以下化學結構 式表示。 71/106 201016221 【化65】
試驗例1 (巨噬細胞活性化能力的測定） 試驗例1 (1)<使用螢光強度測定裝置之來自小 活性氧释出測定> 吸肢巨噬知跑的 <磷竣緩衝液（P B S)的調製> 以1 0 0 〇m 1蒸餾水（D.W.)溶解氣化鈉8 〇 g、磷酸氫二鈉（Na2HP04) 1.1 5g、磷酸二氫2氣化鉀〇.2 <小鼠腹腔巨噬細胞的調製> 將5 %硫代乙醇酸（thioglycolic acid)培養基（d .
D、c〇de.225640、Lot .619237^ C〇、B ^至小鼠（I CR小鼠（SPF)、5週歲、公）腹3nu投 後’以二乙醚使小鼠致死。於腹部中央之表皮處以剪刀言二投予4曰 =腹部以剝去腹部表皮，再以裝有2 6 G之針的χ 〇 = #口牌 Tf〇.05%EDTA 之 PBS( —) (EDTA2Na、:酸: f) ) 5 m1全部注入其腹腔内。其後，抓住腹部側邊，按摩4 0〜 £〇次左右，並將腹腔内部的液體以2 3 G針筒缓缓採樣至小離心管 重複該操作2次。將採樣後之巨噬細胞以1〇 〇 0 r p m離心8 g鐘，倒去上清液，並以RPMI 1 6 4 0培養基（含RPM1 — 1 04〇、含L—穀胺醢胺及紛紅（phenolred)、和光製（公司名）、 189 — 02025、Lot .WRM8043 中含有10 . 6 丄％非動化血清（Bi〇 West)和1 %青黴素（penicillin)鏈黴素 72/106 201016221 iSieiHCini (^^C〇))使沈澱物懸浮。以R PM I 1 6 4 0培 音?f π r P m離心8分鐘。倒去上清液’ 。養基懸洋後，以〇ne Cei1 c〇unter (和研藥 急13??蔣^^二,用尺13旭1 — 1 6 4 0培養基，稀釋至 任辰度，並將以此方式所侍之小鼠腹腔巨噬細胞用於以下的試驗。 < 4OmM試驗化合物溶液的調製> 4 OmM試驗化合物溶液以下述方式調製。 在大試管中秤量B S A〇.7 g。加入滅菌p B s (一）工〇
❹
/土（Proofs) 除去B S A溶液中所含有之雜質。其後，將處理後 B S A溶液以滅&過濾器（〇.2gm)過濾。接著使用n D r〇£ =D:l〇〇〇進行蛋白定量，以滅菌pBS(—)稀釋D 俾使最終濃度為2 %。將秤量後之試驗化合物與2%BSA (將2% 〒8入溶於1^8^:)者）2 5 0卩1一併加入至均質機 (homog^u^) |^，並在加入於均質機的狀態下以水浴式（^出 typ=)超音波裝置處理1 5 0秒將以此方式所調製之溶液移至微離 心管（eppentube)，用於以下試驗。作為正控制，試驗化合物係使用 D CM並同樣調製，而作為負控制（negative c〇ntr〇1)則未加入任 試驗化合物並同樣調製。就未含有試驗化合物之調製液，以下稱為 「vehicle」。 ” <漢克平衡鹽溶液（Hank’s Balanced Salt, HBS)的調製> 以蒸餾水（D _W,)溶解氯化_ 〇 · 4 g、鱗酸二氫钟〇 ,〇 6 磷酸氫二鈉0.1 〇 7 g及氯化鈉8 g後，以1 Ν氳氧化鈉調整至ρ Η 7.4，再以蒸餾水（D.W.)使全部液量成為丄〇 〇 〇m丨，來調製 漢克平衡鹽溶液（HBS)。 <葡萄糖及含有BSA之漢克平衡鹽溶液（HBSG —BSA)的調 製> 將葡萄糖O.lg及BSA (sigma) 0.0 3 g溶於上述調製之Η B S 1 0 0 m 1，以調製葡萄糖及含有B S Α之漢克平衡睡、玄液（u BSG —BSA)(用時調製）。 :來自巨噬細胞之活性氧釋出的測定: 73/106 201016221 使小鼠腹腔巨噬細胞、4 0mM試驗化合物溶液及含有B sA之 漢克平衡鹽溶液（HBSG — BSA)與上述同樣調製。 以Η B S G — B S A將巨噬細胞洗淨後，以5 m L左右之η B S G B S Α懸浮之，以各1 〇 〇 μ 1分別注入至9 6孔（well)之膠原 蛋白加樣孔（collagen well,TC —PLATE 96WELL，STERILE wini LID ’ IND PACLED )中’於 3 7 °c 進行培養（incubate ) 1 小時， 並使細胞佈滿加樣孔中。倒去上清液，加入H BSG_BSA 1C)〇 μΐ^再，添加1 〇mM之H2DCFDA (2，，7，一二氯二氫螢光素二 乙酯（2’，7’ -dichlorodihydrofluorescein diacetate)、invitrogen) 1 μ 1。於3 7 C進行培養1小時，倒去上清液後，添加含有試驗化合物 且作，HB S G — B S A或負控制之v e h i c 1 e，以使試驗化合 物之取終濃度為5 ΟμΜ，1小時後以Genios營光強度測定裝置測定 之。 此外’上述H2D C F D A為螢光探針（fluorescent probe)，其係 在過氧化氫（H2〇2)的存在下，用於增加螢光強度，並藉由測‘螢 光強度可測定過氧化氫（H2〇2)之產量。過氧化氫（h2〇2)為巨 噬細胞產生之超氧化物（〇2-)所衍生的物質，以過氧化氫（H2〇 2)產量作為指標，可表示巨噬細胞的活性化程度。 測定結果示於圖1。 圖1<來自小鼠腹腔巨噬細胞之活性氧釋出量> 如圖上所示，本發明試驗化合物無論何者，皆顯示出與TDCM 同等或更1¾之促進由小鼠腹腔巨嗟細胞而來之活性氧產生的反應。尤 其是在本發明化合物中’實施例1之化合物及實施例9之化合物顯示 出超過TD CM 2倍的高活性。 試驗例1 ( 2 )<小鼠腹腔巨噬細胞噬菌能力的測定> 使小鼠腹腔巨噬細胞、4OmM試驗化合物溶液及RPMI 16 40培養基與上述相同來調製。 以下’螢光微珠（fluorescent beads)係使用Fluoresbrite (商標） Catboxylate Microspheres (2-58% Solids - Latex ) YG (Polysciences 公司）。 在 丁 C —板（細胞培養板，TC —PLATE 24WELL，STERILE WITH LID ’ IND PACKED、greiner bio—one)上添加巨嗤細胞，以使 融合性成為8 0 % ( 8 0 % confluent)。於3 7 °C培養2小時後， 倒去上清液’並以5 〇〇μ1之RPMI 164 0培養基再次洗淨細 胞。將下述表3所表示之組成組合於T C —板上，於3 7°C培養2小 74/106 201016221 時後，倒去上清液後，以3 〇 0 μ 1之滅菌p B S ( —）洗淨細胞。 為了除去未置入之螢光微珠，重複該洗淨操作2次。以2 Ο 1之 滅菌P B S (-)剝去巨噬細胞，並將巨噬細胞移至微離心管。以1, 5 0 0 Γ pm離心8分鐘後，除去上清液，以1 ο 〇μ 1之滅菌P B S (—)使其充份懸浮。再度以1,5 〇 〇 r p m離心8分鐘後，倒去 上清液’以1 〇 〇μ 1之滅菌P B S (—)使其充份懸浮。 使用FUJIFILMFLA— 2 〇 〇 〇來測定置入至細胞内之螢光微珠的 數量〔螢光強度（Fluor4 73nm，Y520 Filter)〕，解析則使 用 Image Reader V 1.4 J。 【表3】 1 2 f 試驗化合物（最終滾度5 0 μ M) - 0.4 5 [ LPS ㈠ 2% BSA i n PBS 0.4 5 … -- 登光微珠 <2. OX 1 i ο o 1 0 0 RPM I 1 6 4 0培養基 19 9. 5 19 9, 5 ~1
測定結果示於圖2。 圖2<小鼠腹腔巨噬細胞噬菌能力>
如圖2所示’本發明試驗化合物無論何者，皆顯示出與丁D 同等或更高之使小鼠腹腔巨噬細胞之吞噬作用的反應。尤▲是在太= 明化合物中，實施例1之化合物及實施例9之化合物顯示出超 CM2倍的高活性。 1 D 試驗例2(中性白血球活性化能力的澍定） <兔子中性白血球懸浮液的調製> 使漢克平衡鹽溶液（HBS)、葡萄糖及含有BsA之漢吉承你 鹽溶液（HBSG —BSA)與試驗例1 ( 1 )相同來調製。、兄十衡 <檸樣酸一葡萄糖溶液（ACD液）的調製>
以蒸餾水（D.W.) 2 5 0m 1溶解擰檬酸鈉6.2 5 g、檸撥納Q 1 2 5 g及葡萄糖5 g，至使用前係保存於4°C。 毁3 <紅血球溶解溶液（L y s i s液）的調製> 以蒸餾水（D.W.) 1 〇 ◦ 〇m 1 溶解EDTA 〇·〇 3 7 泛 Λ 酸氫鈉1 g及氯化銨8.3 g，至使用前係保存於4°C。 & 75/106 201016221 <構酸緩衝液（P B S)的調製> 使其與試驗例1(1)相同來調製。 <1.2%葡聚糖（dextran) —PBS溶液的調製> 以蒸餾水（D.W.) i 〇〇1111溶 jh=cia) "g ’ 以滅菌釜（aut〇cla 匍 |『丁、5 〇 又 鐘）滅菌，至使用前係保存於4。〇 丄J1 C 2 0刀 <兔子中性白血球懸浮液的調製方法> ❹ 將5mlACD液取至2 0ml針筒（注射斜料「M _ i) 2同樣將針筒内·。以針筒採樣來自兔子耳ί (ear 〈丄 ΰ m 1 ’ 型號.Falcon)内，於 下以 i η 分鐘後，將上清液回收至離心管（ 2回2 7葡聚糖-P B S溶液並緩緩倒轉混i ί ί3,£ 、。確認界面，將上清液倒入至新的離 (50ml H.Falcon)。剩餘溶液中加入等量之1 2%葡 聚糖一P B S溶液並緩緩倒轉混合後，於室溫下放置3 〇鐘 f認?將上，液倒入至離心管（5 〇m丨，型號：Falc〇n)。將回 收之亡h液於4 C下以2,000 rp m離心1 〇分鐘後，除去上清 液。在沉澱物中加入L y s i s液15 m1，靜靜地使其懸浮後，再 加入L y s i s液5 m1倒轉混合，放置於冰中5分鐘。以ϋ B S G 一B S Α使全部液量成為5 〇m 1，於4°C下以2,0 0 0 r pm離心 土 0分鐘後，倒去上清液e#HBSG — BSA2ml使沉澱物懸 浮’並將該細胞懸浮液穩穩地疊層於Lymphoprep〔Nyeomed，8 0 8 0 6 8〕2m1 (離心管、15m1型）的上層，以i200rpm 離心2 0分鐘後（離心機條件：accel 0 · 5、break Off)，以抽氣機 (aspirator)抽去上清液。為了除去殘留之Lyphoprep，而使沉殿物 (中性白血球）懸浮於HBSG — BSA中，再次以1,5 0 0 r p m 卞心5分鐘後’倒去上清液。以ΗB S G — B SA使中性白血球懸 浮’並使用細胞數計測裝置「celltac」〔曰本光電〕來測定細胞數 目0 :試驗化合物之乳膠（emulsion)溶液的調製> 使試驗化合物及TDCM之乳膠溶液與試驗例1(1)同樣調 製 76/106 201016221 1 (^nM H2D C FD A ( 2’，7’_二氣二氮螢光素二乙酯分子探 對（Moiecular probes)的調製> 以 lml DMSO 溶解 4.86mg 之 H2DCFDA。 試験例2 (1) <來自兔子中性白血球之活性氡释出量的測定> 由以下步驟來測定對來自兔子中性白血球之活性氧釋出的影響。 /於9 6孔的培養板上（Falcon)播種中性白血球（1·〇χ1 〇 5個 ^ΙΟΟμΙ)。於其中添加 l〇mMti2DCFDA Ιμΐ ，於 37 ^下培養1小時。為了除去多餘之H2DCFDA，加入HB S 3 0 Ο 〇μ 1並使其懸浮後’以8,0 0 0 r p m離心5分鐘。倒去上清液且 f HB S。使其懸浮後’再添加hb S而使最終濃度成為5 ΟμΜ。使 其於3 7°C下培養2小時後，以螢光測定裝置測定活性氧釋出量（£ x:485nm，Em:535nm)。 結果不於圖3。 圖3<來自兔子中性白血球之活性氧釋出量> 如圖3所示’本發明化合物顯示出大致與td CM相同或更高之 使由兔子中性白血球而來之活性氧釋出活性化的反應。尤其是在本發 明化合物中，實施例1之化合物顯示出超過TDCΜ大約2倍的高活 性。 試驗例2 (2) <兔子中性白血球嗔菌艇力的測定> 髎 （2)氨苄青黴素（ampicillin)抗性大腸菌及調理化（opsonization)大 腸菌作成法 <L —b r 〇 t h的調製> 將色胺酸（tryptophan) 10g、NaCl5g、Yeast E x t r a c t 5 g及Mg S 〇4 lm 1 溶於蒸餾水（d_W.) 1 L。 <調理化劑的調製> 以5 0 0 μ 1超純水溶解1 0 m g之調理化劑（BioParticles Opsonizing Reagent (分子探針））。 <氨苄青擻素抗性大腸菌的作成> 77/106 201016221 將孔（electroporation)用細胞（J Μ 1 〇 9 )溶於冰中，且 為了將截下青徽素抗性基因（ampicilin比咖加從gene )導入至大腸 菌，在JM1 〇 9中加入2μ1氨苄青黴素抗性質粒（plasmid) (p T7Blue、Novagen、i〇〇n δ/μ1 )並使其懸浮， 將該懸浮液移至電穿孔用液槽（cuvette)，施加脈衝（2. § k V，2 0〇n，25mF)。將施加脈衝後之菌液移至添加有lml — b
r o t h培養基之5m 1管中，於3 7°C培養3小時。將該溶液塗佈 於含0 · 0 0。5 %氨苄青黴素之L — b r 〇 t h寒天（洋菜粉）培養 基，於3 7°C下培養一夜（灑於培養基上時，以3,5 〇 〇 r pm進行 ^心5 $鐘後，倒去上清液8 〇 〇μ 1，並使沉澱物懸浮後，灑於培 養皿上）。翌日將生成於培養皿上之菌取下少量，溶於2m丨之L_ b r 〇 t h培養基，進行攪拌培養約4小時。 <調理化大膦菌作成法> 使由上述作成的氛苄青黴素抗性大腸菌溶液1 〇 1、與已溶解 的調理化劑1 〇 〇μ1懸浮於微離心管内。將所得的懸浮“ 培養1小時，以P B S使該懸浮液3 〇 ◦μ 1懸浮後，以丄2 〇 〇
Li ϋ分登，除去上清液。而後，以3〇〇μ1 PBS將所得 弓，。將Ιμΐ菌液加入至100μ1 L_br〇th，U Jf :曾，釋1 ? 0倍，釋丄0 0倍之菌液添加於工〇上2; 數器C one cell counter)，以顯微鏡計數菌數。 <兔子中性白血球噬菌能力的測定> Γο B〇 δ〇Α.；ΐ；；ϊ ί,ϊίί^ί j? o r〇 -- 78/106 201016221 t有〇 · 〇〇 5%氨$青黴素之普通寒天培養基菌塗抹 ° ^里，中性白血球内部之大腸菌的菌落（colony)數。 多口果不於圖4。 圖4<兔子中性白血球嗟菌活性> 球之明ί合物無論何者，皆顯示出使兔子中性白血 化合物顯“超過⑶乂;忠化合物中’實施例1的 試驗例3
〈以巧n合物處理之來自小鼠腹腔巨嗔細胞的細胞因子釋出測定> 0培養基係ί上述同樣調製 Ο = H C —板上添加巨噬細胞，以使融合性成為8〇% ( 8 〇 C ^nf 1 uen t)。於37。〇培養2小時後，倒去上清液，以 。4 〇培養基洗淨細胞，並重複該洗淨操作2次 ，f ίϊ 濃度1Q ϋμΜ)的乳膠溶贿^細胞反應 液移至其他微離心'管’並以該上清液為樣品，使 t IL — 6、TNF — a Quantikine Immunoassay ( R&D Systems (商標））解析所釋出之細胞因子。 ，來自^鼠腹腔巨嗟細胞之工L_6的釋出而言，相對於作為負 f^之v e h1 c 1 e的値，IL — 6的釋出約為1 5 p g/m1， 贫物中特別是可認係為活性甚高之實施例1的化合物顯示 0 0 p g/m1的活性。此外，就來自小鼠腹腔巨噬細胞之丁 ^义―α ^釋出而言相對於作為負控制之v e h i c 1 e的値約為 8 0 p g/m1 ,實施例1的化合物則顯示出約工〇 〇 〇 p ^ 的活性。 試驗例4 <以試驗化合物處理之來自THP—1細胞的il — 8释出測定法> 使RPMI培養基溶液與上述同樣調製’並使用該溶液，如 製試驗化合物之R PM I培養基溶液。 ^ 於2 5μΙ之DMSO中，將試驗化合物〗〇111&進行超音波處理 約1分鐘’使其溶解。將如此所得之4 〇mM試驗化合物原液添加至 1〇〇μ1 RPMI培養基中，以使其為5〇μΜ (最終濃度），並以 79/106 201016221 超音波進行處理5秒。作為控制的v e h i c 1 e係僅將溶劑添加相 同的量於RPM I培養基中來取代4 〇m]y[的試驗化合物原液，並以 超音波進行處理5秒。 於R PM I培養基調製Τ Η P ~1細胞（自理研細胞b A N K所 購得）’以使其成為1小1〇6以118/10卟1，並以100 μ 1分別注入至各滅菌微離心管。將如上所調製之試驗化合物的Rp Μ I培養基溶液1 〇 〇 μ 1進行超音波處理5秒後，將細胞全部添加 至已分注的微離心管^ 2小時後，將反應微離心管以5,〇 〇 〇 I· pm 離心 5 分鐘’利用 ELISA kit (human IL-8 ELISA kit (R&D Systems (商標））測定上清液中IL —8的釋出量。 試驗結果示於圖5。 ® 本發明化合物中，_就特別可認係為免疫賦活活性甚高之化合物而 測定之際，如圖5所示，實施例丄的化合物及實施例9的化合物顯示 TD CM之約0.6倍、約0.8倍的活性。 試驗例5 <投予試轮化合物之小鼠對末稱血中IL — 6、τ N F —α、I F N — γ的釋出測定> 如下調製試驗化合物的乳膠溶液。 以下，試驗化合物係指製造例α—1至8中所合成的化合物、製造 例β—1至7中所合成的化合物及作為比較例的Τ ϋ CΜ。 秤量試驗化合物（1〇 〇pg/小鼠），並使用微量匙 (microspatula)將全部量到入均質機（WeaTON USA 1 〇 _ m 1 )的底部。滴入1滴礦物油（Nacaraj TeSque)，均質化後以水浴 式超音波進行處理1 5 0秒。接著，將含有i.i^Twe e n 8 〇 (聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、；1^03^丁684116)與5.6%甘露醇 (mannitol)的生理食鹽水i.〇mi添加至均質機内。進行均質化數 次，將溶解試驗化合物確物油與溶劑充份溶合，再將已完成之溶液移 至微離心管，於6 2°C進行低溫殺菌3 〇分鐘。 將均質機預先浸潰於冰中3分鐘。將l.〇mg的各個試驗化合物 分別取至均質機内，添加礦物油並以超音波進行處理丄5 〇秒。確認 油變黏稠後，向其加入1 · 〇 m 1生理食鹽水（含有1 1 %Tw e e η及5.6%甘露醇），進行均質化約1分鐘。將樣品移至微離心管， 於6 2°C低溫殺菌3 0分鐘。 將如上述所調製的試驗化合物乳膠溶液（1 〇 小鼠）以靜 脈注射投予至1組2隻的小鼠，2小時進行後心臟採血（肝素採 80/106 201016221 血）。以10,〇〇〇rp m離心1 〇分鐘後，僅使用血漿，以ELISA kit(IL — 6'TNF—a' IFN ~yQ u a n t i k i n e I m munoassay (R&D Systems (商標））測定各種細胞因子 的量。 測定結果示於圖6、圖7、圖8。 圖6<小鼠血漿中I L — 6濃度（p g/m 1 ) > 圖7〈小鼠血漿中I FN-γ濃度（p g/m i ) > 圖8〈小鼠血漿中TNF-α濃度（p g/m i ) > ❹
如圖6可見’就投予本發明試驗化合物之小鼠而言，可看出血漿 中I L _ 6濃度的增加。特別是本發明化合物令實施例1之化合物、 實施例9之化合物’無論何者，相對於作為正控制之來自天然的周知 海藻糠二醋化合物的T D C Μ，各自顯示出約1.2倍、約1.5倍左 右的高I L — 6釋出活性。相對於TD CΜ，實施例13之化合物及 實施例14之化合物亦各自顯示出約一半或是大約相同的活性。 如圖7可見，就投予本發明試驗化合物之小鼠而言，可看出血浆 中I F Ν—γ漠度的增加。特別是本發明化合物_實施例1之化合物 及實施例9之化合物’無論何者’相對於作為正控制之丁d CΜ，顯 示出約1.5倍左右的I F Ν —γ釋出活性，且相對於τ D C Μ，實施 例13之化合物及實施例14之化合物亦各自顯示出約一半或是大約 相同的活性。 如圖8可見，就投予本發明試驗化合物之小鼠而言，可看出血聚 中丁NF _α濃度的增加。然而對比於作為正控制之td CM，實施 例1之化合物亦與TDCM大約相同，而其他本發明之化合物，^體 則顯示出TDCM之1/2左右的活性。 σ 試驗例6 <依據投予產氣莢琪梭菌（Clostridium perfringens )之小宣决左妙!^ 分別秤量以製造例α—l中記載的方法所合 ng，與上述同樣來調製試驗化合物的乳g溶液 作為試驗化合物， 化合物及TDCM 1 (1mg/m1)。 產氣莢膜梭菌（TypeA NTCT8237)係如下調製。 <產氣莢膜梭菌調製方法> 將腦心浸液（brain heart inflision，BHI) ( D i f c 〇 )粉.7 4 mg溶於蒸餾水2 0 〇m 1。以移液管（transfer pipette)吸取所ϋ 81/106 201016221
ί液ι( = Ιΐ該溶液稱為「BHI培養基」）4〇ml，加入$9n =燒高其t蒸氣滅菌（121 °c，=)二S 並產tit 生成於螺口試管内之菌（生菌的清洗台内變汙濁 瓶，將is)營ΐϋ=4〇ιηι ^11培養基的2〇〇mi三角燒 ❹
ίΐ橡if綿t裝著於三角燒瓶後(為了使產氣莢膜梭菌產ί ; ti需），於3 7 °c培養4—5小時。將培養後之產氣 莢，梭囷移至離心用管，進行離心分離（9000rpm，15分 倒去上清液。在沉澱物中加入滅菌生理食鹽水2 〇m i使菌懸 ^後，離心分離（9,0 0 0 r pm，1 5分鐘），倒去上清液。將所 1=；^^試㈣之B H 1培養基，雜胞計數器 <投予產氣莢膜梭菌之生存試驗方法> 將小鼠（ICR、6週歲）分成3組，進行以下試驗。 對1組4隻的小鼠，僅將試驗化合物之乳膠溶液、TDCM之乳 膠溶液或作為控制之乳膠溶液各1 〇 〇pg/小鼠（僅為乳膠溶液 時’係1 0 Ομί/小鼠），投予至其等腹腔内。3小時後，將產氣 莢膜梭菌（2.4x107ce 1 1 s /小鼠）投予至小鼠腹腔内。之 後，進行經時觀察。 結果不於表4。 【表4】 投予產氣莢膜梭苗後之小鼠生存率 試驗化合物 生存數爐理鈒 2小時後 6小時後 12小時後 24小時後 48小時後 寳施例1 4/4 4/4 4/4 3/4 3/4 TDCM 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 控制 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 如表4所示，就已投予作為本發明化合物之實施例1之化合物的 小鼠而言，產氣莢膜梭菌之死亡模態（model)中，投予組4隻中的 3隻係免於死亡。 82/106 201016221 試驗例7 <依^巧予產氣笑族$菌毒素之小氣生存試驗（實施例1之化合物）> 將試驗化合物之乳膠溶液（lmg/m1)與上述同樣調製。 產氣莢膜梭菌毒素則如下調製。 < 產氣莢膜梭菌毒素的調製方法> Ο 將枯草鼬α毒素基因轉化體在L_Broth中 攪拌的同時，並於3 7°C培養1 4小時後，於4°C以8,〇 〇 〇 r pm 離，2 0分鐘，將培養上清液於冰冷下攪拌，同時定時’少量添加硫酸 巧（硫安）（Nacarm Tesque)後，作成最終濃度為7 〇%之飽和硫安 2g/L) ’並靜置—夜。其後，於4°C以9,5〇〇 r pm離 心3 0分鐘，將生成的沈渣溶於〇〇 2M TB(pH7.5)，以 相同緩衝液於4°C透析一夜。透析後，於4。〇以1 5,0 〇 〇 I· pm離 心3 0分鐘，將該上清液作為粗毒素（硫安毒素）標準品。以1M = aCl—TB (pH7.5)稀釋，以使該粗毒素標品最終濃度成為 0.5M NaCl後，將粗毒素標準品施打至預先以〇5M Na Cl-TB (pH7.5)平衡化之銅螯合親和管柱（copper chdate affimty column) ( 1.5x9 cm)内’接著’依序流洗各工 〇 〇m l 之 0.5M NaCl—TB(PH7.5)、0.5M NaCl-〇. 1M PB (ρΗ6·5)、〇.5M NaCl-〇.〇2M乙酸緩衝 液（pH4.5) ’ 以及 0.5M NaCl—O.lM P B ( p H 6 5 )。次之，以 1 5 mM L —組胺酸（histidine) (Nacarai Tesque) -0·5M NaCl-〇-lM PB(pH6·5)1〇〇mi 將鍵結於管柱中之毒素溶出後，以針筒過濾器（syringe filter) (DISMIC — ADVANTEC )過濾該溶出液後，以超濾過遽器 (ultrafiltration filter) Amicon (商標）U1 t ra — 15 二 (MILLIPORE)離心濃縮，並以 〇·〇 2Μ ΤΒ(ρΗ8.〇)於 4 °〇透析該濃縮液一夜’以15,〇〇〇rp m離心3 〇分鐘後，施；η· 5 UNO(»)Q-l R Column (ΒΙΟ-ΓΑΒ) ί 出係使0.02M Τ Β ( ρ Η 8.0 )中的氣化鈉濃度由〇至〇 〇 5
Μ以直線變化，並以流量1. 〇 m 1 /m i η進行。就各溶出物（〇 5m 1 )的區分（fraction) ’係在對於抗α毒素血清的奧脫洛尼 (Ouchterlony)反應中辨識沉降線，且以SDS — PAGE &集含相 當於α毒素之約4 3 k D a的單一譜帶（band)的區分，並將i增娘 至約 l.Omi。以 0·02Μ ΤΒ (ρΗ7·⑶。cJSJS 液一夜後，再於4°C以1 5,000 rp m離心3 0分鐘，分取此上清 83/106 201016221 液^重組α毒素）。所得的重組毒素係以sds —PAGE確認雜質 的有無後，至使用前保存於—8 〇 Q(：> 予產氣莢膜梭諸毒素之生存試驗方法> ，小鼠分成（Ic R、6週歲）3組，進行以下試驗。 對1組4隻的小鼠，僅將試驗化合物之乳膠溶液、tdCM之乳 作為控制的乳膠溶液1 〇 〇μ2/小鼠（僅為乳膠溶液時， 2 Si1/小鼠）’投予至其等腹腔内。3小時後，投予產氣莢 p菌蚕素（2 Q Q n g/核）至小鼠腹腔内n進行經時觀
❹ 結果不於表5。 【表5】 _投予產氣萊膜梭苗後之小留生友宏 試驗化合物 生存處理數 Η施例1 TDCM ^ ' "J'時俊 4/4 —4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 Ϊ2小時後 4/4 4/4 0/4 24小時後 3/4 2/4 0/4 梠小時後 3/4 2/4 0/4 ,丨、窟1就已投予作為本發明化合物之實施例1之化合物的 免於死產氣莢膜梭菌毒素之死亡模態中，投予組4隻中的3隻係 試轮例8 <依=^ Ϊ膿桿菌之小鼠生存試驗（實施例1之化合物）> 1 m β·Ί驗合^，秤量由製造例α— 1記載之方法所合成之化合物 上述調製試驗化合物之乳膠溶液。 來者，ίΓτ(調7 1 1 1 5 S 1 r a 1 n)為使用由患者而 <綠踉桿菌調製方法> 瓶中 br〇 th4〇mi ’ 滴入至一2〇〇mi 燒 口試管另外將5m 1 L —b r G t h加人至其他2支螺 使L-b r將巧般及螺口試管在1 2代掛置於滅轉2 0分鐘。 冷藏庫之綠，至f，’在清洗台内將保管於超低溫 逢（shakinUt L — b Γ 0 t h，在培養室進行振 液。, 以9 0 0 0 r pm進行離心1 5分鐘，倒去上音 添加減菌生理食鹽水2 〇m 1，利用漩渦器（vortex) 84/106 201016221 後，進行厂以9 0 〇 〇 r 次。添加滅菌生理食睡欢ϋ離Ύ15分鐘、倒去上清液」等步驟3 成為菌原液。使用稀^水丄气5用渦旋器使之混合，此即作 後，將菌原液稀釋至所期^^^|二S計數器計數菌數 <投予綠膿桿菌之生存試驗方法> 以下兩種實驗。 i溶i ί i 〇 3d J、cR、5週歲），將上述試驗化合物之乳ttmil ?5%gxf s , # s/小鼠）投予至腹腔内，之後進 ❹
Celly行經時觀察。（B)對1群q售，丨〆rTrD r- χ 諮r ? rui η、。i严.小鼠（1 CR、5週齢），將綠膿桿 驗介人物夕六=^ 小鼠）投予至其等腹腔内，並將上述試 = 0 小鼠）投予至腹腔内’經過3小 ΐϊ將上述试驗化合物之乳膠溶液（1 0 Ogg/小鼠）投予至豆 等腹腔内，其後進行經時觀察。 臥）杈卞主八 結果示於表6及表7。 【表6】 (A祖庠先投予試驗ft：合物後，再投予綠膜择菌時之小鼠牛存宝 試驗化合物 生存#/處理» ~ .2小時後 4小時後 1 S小時後 2 4小時後 4 8小時後 SHE例 1 3/3 3/3 2/3 2/3 2/3 控制 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 如表6所示’在投予綠膿桿菌前預先投予試驗化合物之A組中， 3隻中的2隻因綠膿桿菌而免於死亡。初感染時無法辨識與控制組之 間有太大的變化’但約8小時後小鼠成為逐漸可以行走的狀態。
【表7】 ίΒ祖)投予綠瞌桿菌後，再投予試驗化合物時之小鼠生存率 試驗化合物 生存數/處理敎 2小時後 4小時後 1 5小時後 2 4小時後 4 8摘後 離例1 3/3 3/3 3/3 1/3 1/3 控制 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 如表7所示，在投予綠膿桿菌後投予試驗化合物之Β組中，3隻 中的1隻因綠膿桿菌而免於死亡。 試驗例9 <來自ΤΗΡ — 1細胞之細胞因子釋出> 85/106 201016221 、、于於實施例9$得的試驗化合物來進行處理，並根據£匕〗SA 法進行由來自人類單核細胞白血病（monocytic ley^emia )細胞之Τ η Ρ — 1細胞而來的各類細胞因子及趨化因子（chemokine)釋出量的 測定。此外，使用來自人類肺癌細胞的A 5 4 9細胞及來自人 癌細胞的D L D _1細胞，並進行相同的解析。 <Τ Η P — 1知跑的培養方法> (1 )血清的批量核對（lotcheck) 在清洗台内將培養後之ΤΗΡ—l細胞移至1 5m1離心管。將 細胞以1,0 0 0 r· pm於2 0°C離心5分鐘後，倒去上清液。將該沉 ❹
;殿物分別懸洋於RPMI 1 6 4 0 (含1 0%批量核對用f B S ) 培養基lm 1中，使用血球計（hemoCyt〇meter)(萱垣醫理科工業） ，蓋玻片5 (cover glass}(三商}計數細胞數後，養基稀釋至、2 5x10 cel Is/ml。將細胞懸浮液各〇.5m }分別注入至浮
游培養用多孔細胞培養板(MULTI WELL PLATE) 2 4 w e 1 1 S (SUMILON) ’每天觀察細胞之增殖或形態1次。2〜3日後以谇 養基將培養液稀釋1 〇 〇倍，取4μ 1以計數板計數細胞數，並比^ ^殖的優劣。將增殖及形態良好的細胞自加樣孔回收，並以相養 _洗淨後，再稀釋成2.5><1〇5(：6118//1111，加入1111/至| 游培養用多孔細胞培養板6we 1 1 s (SUMILON)，於3 7°C、 S ί %之^条^牛下培養。每隔2 4小時進行培養基交換，' 將每個培 ^ Pm離心（ΤΟΜΥ) 5分鐘後，徐徐倒去培養基， 添加新的培養基1ml，並進行培養基的交換作業2次。自第3天以 交換"f養基後，將細胞稀釋1 0 0倍，以計數板計數並測定增殖 程度。之後，進行此操作數日，選擇增殖或形態良好之培養基。 (2)血清的非動化舆分別注入 將在4 C解束之胎牛血清(Fetal bovine serum) ( F B S ) 5 〇 〇 m【於5 6 °C一邊持績攪拌，一邊培養3 〇分鐘， 二其後於清洗台内，未將血清磁即分別注人至5 〇m 1 離心管各3 0m 1，並保存於一 8 CTC。使用前預先於4°c解凍。 1 . 1 6· 4 〇巧養基（1 0%非動化F B s + 1%青黴 素鏈巧 J'P enicillin Streptomycin))
内.’將以非動化F B s 6 0 m 1 與 Acrodisc 2 5 mm 針4過濾斋(Syringe Filter (Pall公司）過濾之（青黴素鏈黴素G j B 86/106 201016221 ^0) 添加至RPMI 1 6 4 0液體培養基（Wak〇) 5〇 0m1，並混合以使其均勻。製作完成之培養基未過濟即昭 用。於4。(：進行贿，使帛前預級細至室^禾偏卩，”、原樣使 (4 )細跑的繼代培養（subculture) r胞於I5請2之浮游培養用燒般（SUMrL〇N) (增殖9 0%以上）内培養，觀察形態及增殖。在細胞形狀良好、丄 2細^浮新燒瓶、或在使用中的燒飯添加^ 動觀察其過程或添加等量之新培養基，進行繼代培養。 #对+ ❹
(5)細胞的保存 將於7 5 cm2之浮游培養用燒瓶（增殖9 〇%以上）内 細胞10〜15 m1移至離心管，以工,〇 〇 〇 r p m離心5分‘ 去上清液。於該沉澱物中加入細胞凍結保存液Cell banker (日 ί業）I。1 ’使其懸浮，並分別注入至金清管（sefum tube)，g 存於一 8 0 C。 (6)保存細胞的再培養 ^於了 8 0°C下所結凍之細胞以3 7。(：水浴急速解凍。立即將細· 胞保存液添加至預先加入有9〜10m1之Rpm I 1 640典養 ί的2丨！？丄？心管，倒轉混合之。以1，0 0 0 r㈣離心5 ‘鐘 後，倒去上清;^·，以1 〇m 1之新培養基再使其懸浮，將細胞懸浮液 移至7 5 cm之浮游培養用燒瓶。其後，加入新的培養基使其全部 量成為2 0〜3 0ml，於3 7°C、5%C〇2之條件下進行 <Elisa kit的試劑調製；> 洗淨液的調製 以超純水（S.D.W.)將洗淨液稀釋2 5倍，於室溫下使用。 標準基質液的調製 事先將標準基質液用稀釋液6 〇 〇pL添加至2支微離心管 (microtube )。以標準基質液用稀釋液imL溶解標準品 (standard)之基質（2450pg/mL)，將其移至 1 〇 〇μΕ 微 離心管溶解之（3 5 0 p g/mL )，再將其1 〇 0pL添加至別的 87/106 201016221 微離心管並溶解之（5 〇 p g/m l)，進行稀釋。以標準基質液用 稀釋液作為控制使用（q p g/ml)。 呈色液的調製 混合各等量之呈色試劑(c〇l〇r reagent) A與呈色試劑B，並添加 「1 Ο Ο μ 1 /well X測定之加樣孔」的呈色液。此係使用前工5分鐘 以内預先調製。 <樣品測定> 將所使用的ELISA kit試劑回升至常溫，於各加樣孔中加入各種濃 度之標準基質液及分析緩衝液(assaybuffer)5 OpL，再進一步添加樣 〇 品5 OpL。輕敲培養板1分鐘，覆蓋罩子於培養板上，於室溫培養 2小時。之後’以洗淨液洗淨5次（可使用抽氣機），將調製後的結 合(conjugate)液各添加1 〇 〇μΕ，覆蓋罩子於培養板上，於室溫培養 2小時。之後’以洗淨液洗淨5次後，遮光的同時各添加呈色試劑 (color reagent)溶液Α與Β之混合液1 〇 〇pL，並使培養板於室溫、 暗處培，3 0分鐘。最後各添加反應停止液1 〇 〇μΕ，於3 〇分鐘 以内以微量培養板判讀儀（utopiate reader )( M〇iecular Devices spectra MAX 340PC)測定吸光度（45〇nm—55〇n m)。自標準基質液之直線圖算出各樣品的細胞因子釋出量。 <實驗方法> 於清洗台内將培養後之THP — 1細胞移至5 〇m1離心管，以 1，〇 〇 〇 r P m於2 0 °C離心5分鐘後’倒去上清液^使該沉澱物懸 © 洋於新的無血清RPM I 1 6 4 0培養基（Wako) lm 1，並將1 Ομί細胞懸浮液加入至事先添加有無血清RPM〗i 6 4 〇培養基 9 9 0 μ 1之滅菌微離心管内，稀釋1〇 〇倍。以丘球計數板計數1 〇 〇倍稀—液4μ1之細胞數，並以無血清RPMI 1 6 4 0培養基 將細胞懸浮液稀釋成1 X 1 〇 7 c e 1 1 s /m ^。將1 〇 〇从七之尺 PM I培養基取至微離心管，添加4 〇 mM之試驗化合物（實施例 9 ) /DMS 0溶液，以配成2 〇 〇μΜ，並施加超音波5秒。添加 1 0 0 μ 1之Τ Η Ρ _1細胞（試驗化合物之最終濃度為1 〇 〇 μ Μ)。於3 7 C培養2小時後，以5000rpm離心10分鐘，將 上清液取至別的微離心管内，以ELASAkit進行樣品測定。 此外’作為正控制，試驗化合物係使用6，6，—雙—〇_( 2 — 十四基十六醯基）一α，α’_海藻糖（以下稱為「對照化合物A」） 88/106 201016221 二π)為負控制則無加入任何試驗化合 <實驗結果> 始制相比較，來自以實施例9之化合物處理之τ Η P - 1細 的ΜΨ 的釋出报明顯高出約8〜1 0倍。此外，TNF—α 竑也丨^二丨、負控制細胞相較之下幾近相等。結果示於圖9。又’就實 得良好2業=合$而對M1 p- 1P的釋出而言，與正控制相比可 近而就TNF_a的釋出’與負控制相比則幾 ❹
試驗例1 〇 工—1細胞的細胞毒性研討及突變性（mutaSeniciiy)試驗> 試谢的liSr 一1細胞之臺盼藍（trypan Wue)的細胞毒性研討> 0.3%臺盼藍/PBS ( —）的調製 以P B S (―) 1 0 〇m 1 溶解0.3 g 臺盼藍（Nacarai)。 ΤΗΡ-1細胞的調製 於清洗台内將培養後的THP —1細胞移至5 〇m1離心管，以 〇 37 P m於2 0 °C離心5分鐘後’除去上清液。將其沉殺物懸 洋於新的無血清RPM I 1 6 4 0培養基（Wako) lm 1内。將該 ^胞懸浮液1 〇μ1加入至預先添加無血清rPM I 1 6 4 0培養基 9 9 Ομί的滅菌微離心管，稀釋1〇 〇倍。以企球計數板計^工古 〇倍稀釋液1 0μ 1的細胞數，再以無血清R PM I 1 6 4 0培養某 將細胞懸浮液稀釋成IxlC^cells/ml。 ° ^ <實驗方法> 添加試驗化合物（實施例9) /D M S 0溶液或D M S Ο於R p Μ I培養基1 〇 〇 μ 1，以配成2 〇 〇 μΜ ’進行超音波5秒。丄外， 作為正控制，試驗化合物係使用6 _ 0 _(2 —癸基十二醯基）—α ~~葡萄糖（以下稱為「對照化合物Β」）及TD CM同樣調製。此外 ’作為負控制則未添加任何試驗化合物’同樣調製（V e h i c 1 e )。添加調製完成之THP — 1細胞1 0 0μ1於l.〇xi〇7ce 1 1 s/m 1，於3 7°C培養2小時或2 4小時。其後，加入〇 3% 89/106 201016221 臺盼藍/PBS ( —）2 Ομί並使其懸浮後，即刻以細胞數測定絮 置（CYRORECON)解析細胞的生存率。 <突變性試驗（Am e s試驗）> 試谢的調製 0 · 1Μ磷酸鈉緩衝液的調製 將Na2HP〇4 5.6 8 g溶於蒸餾水200mL，徐徐添加至 以蒸館水1 〇 OmL溶解NaH2HP〇4 · 2H2〇之溶液，調整成 PH 7.4 ’並進行高壓蒸氣滅菌。 队 最小葡萄糖寒天换卷某的作成 〇 ( 1 ) VB培養基：將Mg S04 · 7H2〇 〇 4g、含水檸檨 酸4g、K2HP〇4 2 0 g、NaNH4HP〇4 · 4H2〇 溶 於蒸餾水2 0 OmL ’進行高壓蒸氣滅菌。 —(2 )將葡萄糖4 0 g溶於蒸餾水2 0 OmL，進行高壓墓氣滅 (3)將寒天粉末3 0 g懸浮於蒸餾水16 0 OmL，進行高壓 蒸氣滅菌。 將（3 )的試劑冷卻至約6 CTC後，混合（1 )與（2 )之試 劑，並以各約3 0 m L灑於培養皿中。 、 上t羞天培養基的作成 一將^天气末1.2 g與N a C 1 1 g懸浮於水2 0 〇mL並進行 向壓蒸礼減囷’移至5 Om 1管中。使用前混》合〇. 5 in Μ組胺酸/維 響 生素H (biotin)溶液2 OmL，保溫於4 7°C。 沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium)培養用 Ο X 〇 i d Nut r i e n t B r o t h培養基的調製 將Ox o i d 營養肉湯(Nutrient Broth) (Difco) 2.5 g 溶於蒸 館水10 0 m1 ’將其中5 m1加入至螺口試管並進行滅菌。之後， ，種TA9 8 (沙門氏桿菌TA9 8)之菌液約1OpL，於3 7 °C振動培養一夜，調製菌懸浮液。 S 9m i X的調製 將 Co factorA mix (ORIENTAL YEAST) 9 m 1 加入至 1 m 1 之 S 9 ° 90/106 201016221 標準突變性物質的調製 4—NQO/DMSO的調製 將 4-硝’基嗤琳 N-氧化物(4 — Nitroquinoline N — oxide) ( 4 — >^〇)(東京化成工業股份有限公司）〇.3111忌溶於1〇1111〇]^ SO。 2_胺基蔥(2—aminoanthrathen)/ D M S Ο 的調製 將 2 —胺基蔥（ALDRICH) 〇 · 5 m g 溶於 3 0 m 1 DMSO。 <實驗方法> ❹
於微離心管中準備2組標準突變性物質、實施例9之試驗化合物 、對照化合物B或TDCM1 OgL各2支。添加S9mi X或10 OmM磷酸緩衝液〇.5mL後，加入菌懸浮液1 〇 〇μί進行預先培 養（preincubation) ( 3 7。(：、振盪2 0分）。添加含組胺酸/維生 素H之軟瓊脂（soft agar)(保溫於4 7°C者）2mL並緩緩懸浮 之’灑於最小葡萄糖寒天培養基，進行培養（3 7°C、2天）。之 後，計數H i s+的菌落數。 <實驗結果> 為了研討對於Τ Η P — 1細胞的細胞毒性，藉由臺盼藍染色進行 以實施例9所得的試驗化合物所處理2小時及2 4小時之ΤΗΡ — 1 細胞的生存率分析的結果，雖可辨識對照化合物3處理細胞中的細胞 毒性’但未觀察到以實施例9所得的化合物所處理之細胞的細胞毒 性。結果示於圖10。此外，就實施例1所得的化合物而言，亦可獲得 同樣顯著的結果（未顯示數據）。 更且，關於實施例9所得的試驗化合物，在s 9m丨叉的存在下 在ΐ 雖進行了 Am e s試驗，但任何試驗化合物皆未顯示出 突變性。此外，在本解析條件下之標準物質（2 一胺美苗， 〇) ΐ突>?性為陽性（圖11)。此外’就實施例1所得的化合物而 言’亦可獲得同樣顯著的結果（未顯示數據）。 試驗例1 1 <對小鼠腹腔内的細胞浸潤> <PB S (~)溶液的調製> 91/106 201016221 將Na C 1 4g、Na2HP〇4 · 1 2h
⑽行Lii滅ΐ匕，溶於蒸一⑶W <0·0 5% EDTA/PB S (―)溶液的調製> 將EDTA (nacalai tesque c〇de 51:30)50mg溶於PBS(-)l0〇ml後 m過濾器進行過濾滅菌。 π < 1 m g/m L乳膠溶液的調製> ❹ 將Na C 1 〇.9g、聚^乙烯山梨糖醇酐單油酸酯 (Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate) (Tween8〇) i i 】 风呼〜耳，两X低》益救菌，於b 2 c進行處理3 〇分鐘。作為正控 ，試驗化合物係使用對照化合物A及TD CM並同樣調製。^外， 為負控制，則未添加任何試驗化合物且同樣調製（v e h i c i )° 及D (—) —甘露醇(Mannitol) 5 · 6 g溶於蒸餾水丄〇 〇 m i m 〇·2μιη過濾器進行滅菌過濾。將實施例9所得之試 ^^^f^CWEATON USA l〇mL^AsSne(^4 名））的底部，添加1滴礦物油，施予超音波2分鐘的同時進行均質 化。之後，加入lmL之1.1% Tween—5.6%甘露醇食鹽水，使 白f且變均勻為止進行均質化。將全部量的試驗化合物溶液移 至微離心管，為了低溫殺菌，於6 2。(：進行處理3 〇分鐘。作為正控 制，試驗彳h么％在店田啦B2儿人仏Λ — ·“ 一 " 作為 e <腹腔内浸濁細跑的回收> ^將1m g/m L·之試驗化合物（實施例9)溶液投予至小鼠（i = ) 週歲、公、體重：20〜22g))腹腔内 投予量為1 〇 〇μ^/小鼠。 2小時後或2 4小時後’以二乙醚使腹腔投予試驗化合物之小鼠 。=腹部中央之表皮處以剪刀剪出小缺口，抓住腹部以剝去腹部 ί皮鑷子將腹膜輕輕夾起，以勿使針刺入内臟的方式，將〇 〇 5 ΖΛ f-SIf1 in PBS (―) 5mL 以裝有 2 6G 之針的工 〇 注入至腹腔内。其後，抓住腹部側邊，按摩4 0〜5 0 右故腔内部的液體緩緩採樣至小尺寸的離心管。再次重複該 ί作、後之細胞以1，0 0 〇 r p m離心1〇分鐘。倒去上清 位義其姑尤私I^ 6 4 〇培養基使沉澱物懸浮。以RPMI 1640 培養基裝滿離心管’再度以1，Q G 〇 !· p m離心1 G分鐘。倒去上清 92/106 201016221 液’以RPMI 164 0培養基使其懸浮後，利用細胞計數盤計測細 胞數。使用RPMI — 16 4 0培養基’稀釋至任意濃度。 <細胞的吉姆沙染色（Giemsa staining) > <1/15M磷酸納緩衝液（ρΗ6·4)的調製> 以2 5 Om 1蒸餾水分別溶解N aH2P〇4 6.0 g ' N a 2 Η P °4 7.0 6 g，測定磷酸氫二鈉溶液之p ϋ的同時添加磷酸二氫鈉 溶液’使其ρ Η等於6.4 ’於1 2 1 °C滅菌蒼中進行滅菌2 〇分鐘。
將lmg/mL試驗化合物溶液投予至小鼠腹腔，且此投予量為 1 0 Opg/小鼠，2 4小時後使用 0.05% EDTA/PB S (―)以回收浸潤於腹腔内的細胞。其後，以1〇 〇 〇 r pm進行離 〇 心8分鐘，倒去上清液。以1 〇 〇gL碟酸緩衝液使細胞懸浮，載置 於染色用載玻片上。確認水分蒸發，在染色用槽（staining vat)上滴 下梅-格二氏染色液（May-Grunwald stain solution) 1 〇 〜1 5 滴，靜 置2〜3分鐘。於未使梅-格二氏染色液流動下，滴入磷酸緩衝液1 0〜15滴’靜置2〜3分鐘。添加適當量吉姆沙染色液，靜置3 0 分鐘。將載玻翻面並用水沖過後乾燥載玻片，並以顯微鏡進行觀 察。 <依據小鼠腹腔内中C D 8陽性細胞之流式細跑術（flow cytometry) 的解析> 試姻的調製
P B S ( —）溶液的調製 以與試驗例11相同之方法來調製。 物（乳膠溶液)的調製 乂與试驗例11相同之方法來調製。 edta/pbs( —) 調整 滅菌50mg溶於i〇〇mi pbs(-)，於 滅讀蚤12 1C，進行減菌20分鐘。 〇.5%BSA—〇·05% EDTA/PBS (-)溶液的調整 93/106 201016221 將EDTA2Na 5〇mg溶於l〇〇mi pbs ( —），於 滅&蚤121C ’進行滅菌2 〇分鐘。其後，用事調整溶解〇· 5 %之 B S Α。 <實驗方法>
投予lmg/mL之試驗化合物乳膠溶液至小鼠（丄〇 〇pg/小 鼠）腹腔，2 4小時後使用〇.〇5%EDTa/PBS (―)以回收 浸潤於腹腔内之細胞。其後，將採樣後之腹腔細胞3 〇 〇 g離心工0 分鐘後，倒去上清液，並以1m 1 〇_〇5%EDTA (以0.5%B S A/P B S溶解）使調製完成之腹腔細胞懸浮。以流式細胞用篩 (mesh)將細胞懸浮液進行過濾，測定1〇〇倍稀釋後之細胞懸浮液 中細胞數。將各個樣品之細胞調整成l〇7ce 1 1 s/samp 1 e後，取3 0 0 g進行離心1〇分鐘，倒去上清液。以1〇 〇 μ 1之 0.0 5%丑〇丁八（以0,5%6 3八/?3 8溶解）使其懸浮，添 加10μ1之CD1 lb、CD4、CD8抗體（分別為FITC抗小 鼠 c D 1 1 b /M a c — 1 (BECKMAN)、FITC 抗小鼠 C D 4 (BECKMAN COULTER ) 、PE 抗小鼠 C d 8 a ( BD Pharmingen))。於2-8°C、暗處，培養l〇分鐘後，以i-2m 3之005%EDTA (以〇.5%BS A/P B S溶解）使細胞懸 浮’用3 0 〇 g離心1〇分鐘後，倒去上清液。以之005% EDTA (以〇.5%B S A/P B S溶解）使其懸浮後，使用流式細 胞術解析之。 〈實驗結果：> 以PBS (-) lmL使細胞懸浮。將Hemolinac(商品名）（溶 血血紅素試劑）1 〇 〇μΐ添加至細胞懸浮液以破壞紅血球。之後， 藉由細胞測定裝置（CYTORECON、GEhealthcare)來測定細胞數。 此外，將調製完成之細胞播種於2 4孔之膠原蛋白加樣孔（g I· ^ 2 e r)，培養2小時。其後，吸去上清液，重複以rpm I培 養基來進行的細胞洗淨2次。加入RpM〗培養基3 〇 〇μ1，藉由 倒立顯微鏡來觀察細胞。 其π果為，投予實施例9中所得之試驗化合物的小鼠其腹腔内， 可辨識出時間依存性之浸潤細胞的増加，且2 4小時處理後，與ν e h i c 1 e處理比較之下，增加了 15〜20倍（圖12)。 94/106 201016221 Ο
此外，為了進行浸潤細胞的解析，藉由下述以處理細胞：根據吉 姆沙染色的細胞形態觀察；相對於單核細胞（monocyte)與巨嗔細胞 的抗原（CDllb)、淋巴球的抗原（CD4)、以及NK細胞的 抗原（C D 8)等各種抗體，並以流式細胞術來進行解析。其結果 為：投予實施例9中所得的試驗化合物2 4小時後，C D1 1b陽性 細胞、CD 4陽性細胞及CD 8陽性細胞的全鱧數目，相較於V e h i c 1 e處理之細胞’增加了15〜20倍。然而，CD11b陽性 細胞及CD 4陽性細胞的存在比率，相較於Vehi c 1 e處理的條 件下，卻幾乎無法辨識出其變化。另一方面，CD 8陽性細胞的存在 比率相較於V e h i c 1 e處理的小鼠，則約增加了 2〜3倍（圖13 〜15)。 . 自以上看來’藉由實施例9之試驗化合物，顯示出使小鼠腹腔内 吞噬細胞系的細胞聚集’且當中亦顯示出NK細胞之比例較大。 試驗例1 2 莢膜梭菌感染小鼠或綠膿桿菌感染小鼠的影響（實施例9之 化合物）> <產氣莢琪梭菌調製方法> f肉(COOKED MEAT)培養基的調製（以下略稱「CM培養 基」）
Hi試管添加CM^養基（125mg/mi &DW)，考 S3鐘養基内的空氣。進行由滅菌爸（1 2 TC，' 2 0分）之局壓蒸氣滅囡，並冷卻至室溫。 =浸液(Brain Heart InfusiGn)(以下略稱「BH丨」）培養基的 將37mg的BHI培養基溶於1〇 〇 i基德火 mL至螺π試管，以及加人4 5 菌蚤（1 2 It，2 0分）進行高壓蒸以滅 菌的保存 將產氣爽膜梭菌Type—A NC下「只997 添加至製作完成之CM培養基，於3 卷9 #，朴j f L C + ) 保存於室溫下。 丨L培養2天作為保存菌液而 菌的培養暨菌液的製作 95/106 201016221 自各坪存囷液取出〇 · 2 m L的囷液並添加至4.5 m L之前培養用 Β Η I培養基内，於3 7 °c培養一夜。將該培養液全部量添加至4 〇 mL BH 1培養基内’進行氮氣取代（1 0分鐘）後再次於3 7°C培 養5小時。其後’移至培養液5 0 m L管内，進行離心分離（4 °C， 9000rpm，15分鐘）。倒去上清液，添加生理食鹽水並充份 洗淨後，，再進行離心分離（4°c，9 〇 〇 〇 r pm，1 5分鐘）以集 菌。^複該洗淨2次。於其沉澱物中加入bhI培養基4.5mL並使 其懸浮’。以該懸浮液作為原液。將原液稀釋1〇 〇 〇倍，藉由滅菌釜 (土 2 It： ’ 2 0分鐘）進行高壓蒸氣滅菌後，使用細胞計數器以計 測菌數。製作菌濃度為l><l〇8ce 1 1 s /m L之菌液，並使用於 實驗中 <綠膿桿菌調製方法>
Luria-Bertani B r 〇 t h培養基（L-Br〇t h)的調製
If a c t 〇TM 胰蛋白腺(Tryptone) (Difco) 1 0·0 g、B a c t 〇 TM 蛋黃萃取物(Yeast Extract) (Difco) 5.0 g 及氣化納（N a Cl) (nacalai tesque) 5 · 0 g 溶於蒸餾水，添加 1 Μ M g S 〇4 l.OmL’以IN Na OH調整成PH 7.5，再以蒸餾水使全部 液量為1，0 0 OmL後，於滅菌釜1 2 It：高壓蒸氣滅菌2 0分鐘， 並冷卻至室溫。 菌的保存 將綠膿桿菌（p · aeruginosa) 〇 , 2 m L 添加至 L - B r 〇 t h l OmL ’於3 7°c培養一夜。於該培養液中添加滅菌丙三醇1 (丙三醇），進行璇渦。將菌液各3 〇 〇>l分別添加至減菌微離心 管中’保存於一8 0°C。 取各保存菌液0.2mL添加至4 OmL L-B r 〇 t h培養基 内，。於3 7°C培養一晚。其後，移至5 OmL管内，進行離心分離 (4°C，9000rpm，15分鐘）。倒去上清液，添加生理食鹽 水並充份洗淨後，再度進行離心分離（4。(：，9〇〇〇 rpm， 分鐘）以集菌。重複該洗淨2次。於該沉澱物中添加生理食鹽水4.5 mL並使其懸浮。以該懸浮液作為原液，將稀釋原液1〇 〇 〇 〇倍後 之菌液以減菌釜（1 2 1°C，2 0分鐘）進行高壓蒸氣滅菌後，使用 96/106 201016221 細胞計數器以計測菌數。製作菌濃度為lx i 〇8 c e 1 1 s r 之菌液並用於實驗中。 h <實驗方法：試驗化合物的前投予> 投予1 0 Opg/小鼠的試驗化合物（實施例9)乳膠溶液至小窗 腹腔，2 4小時後，再投予3.〇χ1 〇 10 CFU/mL的綠膿桿菌或 5·〇χ1 〇 CFU/mL的產氣笑膜梭菌至腹腔内，每隔2小睥對二、 鼠進行觀察。’ 乙J吋對小 <實驗方法：試驗化合物的後投予>
〇1/〇cFu/mi^綠膿桿菌至小鼠腹腔3小時後， i〇>°μ§/小鼠的試驗化合物（實施例9)乳膠溶液至鹿 腔。其後，母隔2小時對小鼠進行觀察。 <實驗結果> 雅明tm,17所示，以實施例9的試驗化合物處理之小鼠的死亡 ^^^=°3’感染綠膿桿菌3小時後再投予實施例9 3 驗化σ物的、纟^果，小鼠的死亡顯著受到抑制（圖18)。 碑 試驗例1 3 <敗血症觀察> 1 1 ίΤί ^'ϋ 1 0 C F U/mL·之綠膿桿菌。投予 部ii以肝素於針尖的注射器進行心臟採血，將： 並計ϋίίΰίίί錢寒天培養基上，㈣養㈣養1 6小^ 倍、？血量以生理食鹽水稀釋成1 0倍、1 〇 0 m 3?9Q/Qut驗普通寒天培躲上。 液内卻未檢測ί菌?檢測㈣，但投予實施例9的試驗化合物時，灰 試驗例1 4 <抗腫瘤效果> 至小合物 (乳膠溶液）1 〇 〇μβ/小氣 4小時後將乳癌細胞（ρ μ 3 Α細胞）接種至腹腔 97/106 201016221 組織切片進行蘇木精—卜將，隔膜、賊及精巢之 觀察。其結果為：接種乳病f 後，透過顯微鏡進行 約1 〇 g，可確認為大|的jU：相^於，制的小鼠’體重增加 膜、胰臟及精巢中可觀察出明龜種乳癌細胞的小鼠其橫膈 實施例的試驗化合=，移:另-方面，以 以相同’更且’全然未辨識出對各器官的ίϊίίί: Ο ❹ 適宜作為醫藥品使用。本案彳:合物的毒性‘^ 來自低。此外，本案化合=突& ί^ί,ϊί^ ^ 内之=3明合物顯示出，就投予產氣魏梭菌至腹腔 有ί，對投予產氣莢膜梭菌所產生之毒素至 海f糖^合物亦發現：對綠膿桿菌的腹腔因ί優異 抗鼬活性之故而降低該細菌的致死性。 、 干屮機f ’當投予本剌之_糖化合物時，在顯 L性、中性白血球嚆菌能力、巨嗔細胞嗟 = ϊΐ5ίίΐίίΐ遍症作嶋刚胞或中性白血球等 等試驗結果，本發明之海藻糖化合物係賦予巨噬細胞或中性 ίίίίίϊ性免疫之活性化者’難作為巨伽胞或中性白血球之 的細f、病毒或真料所51發之感染症，透露出在廣泛 自係有用。其具有以下的有利點：相較於在治療感染症而使用 生素之際，要徹底了解作為對象的原因菌，對此，以必須適當選擇 二芝抗菌範圍（antibacterial spectrum)的抗生素方面而言，、則會有抗 性囷出現的風險，更且在抗性菌出現時，對該抗性菌又必須適當選擇 98/106 201016221 具有抗菌範圍之其他抗生素的習之方法，本發明為簡便且確實的方 法。 再者’抗生素對病毒並無效用，習知技術的現狀為只能投予疫苗 (vaccine)來預防，在可提供對病毒之治療藥方面上係為有用。 如此一來，其中，在本發明的海藻糖二酯化合物中，活性特高之 化合物顯示出具有TD CM約2倍，且於活性特高者中具有約8倍〜 10倍的活性，且在低毒性方面係為特別有用。 Ο ❹ 更且’測定投予本發明之海藻糖化合物後的細胞因子應答的結 果，就I L一 6、I F Ν—γ、TNF~a的釋出，無論何者皆可看出 增加的傾向。又進行體外(in vitro)試驗與體内(ώ ^〇)試驗，本發明的 化合物中’活性特高之化合物在體外試驗中發現，雖亦有使該等細胞 因子明顯增大的方面，但在體内試驗中TNF_a的釋出卻不太有大 量增加。此外，在由來自人類之THP —1細胞而來之j L_8釋出 ^性中，發現本發明化合物中之活性特高之化合物非為如TD 般 ^活性化者。而且，使用來自人類之THp —i細胞、A5 胞、DLD_1細胞以進行測定的結果，THp — }細麻顯 Λ ，，如過敏性休克（anaphylaxiS sh〇d〇或過敏性 ，會有過多的弊害。本發明之海藻糖化合物對可 因子之ί L-8釋出的活性化並不至於會過度，顯 活:用’但免疫作用過度反應而產生炎症等J作用的疫： 一方面，在免疫作用的一個過程中，亦有：一房鏗甚低。另 ’且對應於感染 如上所述，細胞因子或趨化因子係根據其性 ^場合、非大量㈣之場合、和不成為問題之大量釋 各種可能，但使本發明之海藻糖化合物在期望釋7?根^情況會有
的場合，或是在不成為問題之場合中，以 8或TIMF
~~α等釋出的方式，或非意圖抑制該等的釋出， 8或丁 n F 用特定種類之本發_海驗化合物，皆n明量使 99/106 201016221 &在投予本發明海藻糖化合物之接種乳癌細胞的小鼠中，已 器官的浸潤或轉移明顯受到抑制。此 抗癌=有為本發明海藻糖化合物的抗感染症治療劑及 【產業上利用之可能性】 低， ΐϊί發明所提供的海藻糖化合物係免疫賦活活性高且毒性亦 用太所引發之感染症的治療係為有用。具體上，藉由^ 糖化合物’產生由投予抗生素之際破壞菌體所引發的 的副作用的危險性較低，可提供於病原菌毒素本身中亦 Ο 的醫藥品。此外，藉由使用本發明的海藻糖化合物， 供ΐ由多劑抗性菌所引發之感染症中亦有治療效果的醫藥。更 ί二明的化合物於醫藥品的製造中亦為有用，且該醫藥品有 較^之產生多餘免疫應答之類的危險性。 過ί發明之海藻糖化合物的製造方法，不含非對稱合成即 可大重且有效率地合成本發明相關的海藻糖化合物。 【圖式簡單說明】 士恭f \係表示使小鼠腹腔巨噬細胞與TDCM、ν e h i c 1 e或 本發i之試驗化合物反應時來自小鼠腹腔巨噬細胞的活性氧釋出量； 士饮^ 2/糸表示使小鼠腹腔巨噬細胞與TDCM、ν e h i c 1 e或 發Li之試驗化合物反應時小鼠腹腔巨嗤細胞吞嗟能力； 〇 s示使兔子中性白血球與TD CM或本發明之試驗化合物 反應時來自兔子_性白血球之活性氧釋出量； g處f i 示使兔子中性白血球與T D C M或本發明之試驗化合物 反應時兔子中性白血球吞噬能力； 圖^係表示使來自人類之THP—1細胞與TD CM、v e h i 上^或本發明之試驗化合物反應時來自ΤΗΡ — 1細胞之IL — 8 釋出重； 表示投TTDCM、veh i c i 6或本發明之試驗化合 物至小鼠時小鼠灰漿中之IL — 6濃度； f ,表示投予TD CM、v e h i c 1 e或本發明之試驗化合 物至小鼠時小鼠血漿中之I F Ν—γ濃度； 必表示投予TDCM、veh i c 1 e或本發明之試驗化合 物至小鼠時小鼠血漿中之TNF_a濃度； 100/106 201016221 圖9係表示使來自人類細胞與TDCM、vehi c 1 e或本發 明之試驗化合物反應時由來自人類細胞而來之Μ I Ρ—]_β及TNF —α釋出量。數値係以rme an 土 S.D. (n = 5)」表示。*表示 相較於控制，Ρ<〇·〇 1的場合； 圖10係表示來自人類之ΤΗΡ— 1細胞中，TD CM、ν e h i c 1 e或本發明之試驗化合物的細胞毒性。白色的長條為2小時、 ，色的長條為2 4小時，分別表示以試驗化合物處理時的結果。數値 斤^「1116 311±3.0.(11 = 5)」表示。*表示相較於控制，？< 0.0 1的場合； ❹
圖11係表示根據Ame s試驗之TDCM、v e h i c 1 e或 本發明之試驗化合物的突變性的測定結果； 〆 ，12係表示使小鼠腹腔内浸潤細胞與td CM、v e h i c 1 ，或本發明之試驗化合物反應時之細胞數暨顯微鏡影像。數値係以 1^4上n±S D· ( n = 5 )」表示。*表示相較於控制，p<〇 .〇 v e h i c f u你衣示使小鼠腹腔内浸潤細胞與丁DCjv e或^發明之試驗化合物反應時吉姆沙染色的結果，· 物反使丁則、Vehi c 1 Μ本發明之試驗化合 鼠驗崎麻射，崎微綱示之CD —8陽性 物反CM、V e h 土 C 1 e或本發明之試驗化合 細胞内次潤細胞中’以流式細胞術所示之CD-8陽性 化合D = h i e丨e或本發明之試驗 響。*表示气述化合物對小鼠生存數的影 的標準結果；、工 P 001的場合。且表不進行試驗8次中 化合= 、v e h i c i e或本發明之試驗 表示相較於控制予、化合，*鼠生存數的影響。* 結果； ·ϋ 1的场s。且表不進行試驗8次中的標準 i c T 桿菌後’在投予TD CM、V e h 示相較於㈣合物對小鼠生存數的影響。*表 果； ·υ 1的场合。且表示進行試驗8次中的標準結 101/106 201016221 圖19係表示對投予v e h i c 1 e或本發明之試驗化合物的小 鼠投予綠膿桿菌時小鼠血中的綠膿桿菌數；以及 圖20係表示接種乳癌細胞小鼠之TD CM、v e h i c 1 e或 本發明之試驗化合物對癌細胞轉移的影響。 【主要元件符號說明】 無
102/106

Claims (1)

  1. 201016221 七、申請專利範圍： 1.一種以下式（1)所表示之化合物， 【化1】 〇
    ❹ 參 j式基、萘基或R1_CHR2—所表示之 基、萘基或Ri’一CHR2，一所表示之基團， 围入為以本 在士，R!、1^’、只2及112，係各自獨立的氫原子或ei — 就、Ri’、R2、R2’而言，各烷基中的氫原子可以羥基、g 取代，而各烧基的全部或一部份亦可形成4 — §元環，此外， R2、Rr及R2’可個別互相連結而形成4_8元環，且及，#夂 自獨立之GJL3的錄， 然而，排除： (1) X為Ri — CHR2—，X’為Rr—CHR2，一，Ri、Ri，、 R2及R2’為各自獨立的氫原子或未取代且直鏈的O-c 6烧基，且η 及η’為〇的化合物，以及， (2) X為R1-CHR2— ’ X’為Rr-CHRV -，Ri、Ri，、 R2及R2’為Ci4直鍵烧基，且η及!1’為Q的化合物。〕 2.如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係： X為Ri — CHR2—，X’為Ri’一CHR2’一的化合物。 3.如申請專利範圍第2項所述之化合物，其中該化合物係： Ri、R〆、R2及R2,為各自獨立之直鏈C7-C21烷基，且n&n 為各自獨立之〇或1的化合物。 103/106 201016221 4. 如申請專利範圍第2項所述之化合物，其中該化合物係： Ri、Ri，、R2及R2,為各自獨立之直鏈C8-Ci6烷基，且η及η， 為0的化合物。 5. 如申請專利範圍第2項所述之化合物，其中該化合物係： R1、R1’、R 2及R 2’為各自獨立之直鏈C 9 — C 14烧基，且η及η ’ 為1的化合物。 6. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係： 1^與尺1’相同、R2與R2’相同，且η與η’相同的化合物。 7. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係以下之任一 化合物： 6，6’一雙一〇— (2—辛基癸酿基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一0— (2—壬基十一醯基）一α，α’一海藻糖、 6，6,一雙一〇_ (2—癸基十二醯基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一〇_ (2 —~h—基十三酿基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一0— (2 —h二基十四酿基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一〇— (2 —h三基十五驢基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一〇— (2 —h五基十七酿基）一α，α’一海藻糖，或 6，6’一雙一0— (2—十六基十八醯基）一α，α’一海藻糖。 8. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係以下之任一 〇 化合物： 6，6’一雙一0— (3—壬基十二醯基）一α，α’一海藻糖、 6 ’ 6’一雙一0 —（ 3 —癸基十三酿基）一α，α’一海藻糖、 6 ’ 6’一雙一0— (3 —f 基十四酿基）一α’α’一海藻糖、 6，6’一雙一〇一（3 —h二基十五酿基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一(3 —十三基十六醯基）一α，α’一海藻糖，或 6，6’一雙一〇一（3 —h四基十七臨基）一α，α’一海藻糖。 9. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係以下之任一 化合物： 6，6,一雙一〇一（2—癸基十二醯基）一α，α’一海藻糖、 6，6’一雙一0— (3—壬基十二酿基）一α，α’一海藻糖、 104/106 201016221 6，6’一雙一Ο — ( 3 —十三篡硫f、 .. 6,6，-雙.十“識=::::: 嫌，处第9項任一項所述 tlZl ： ❹ ΐί^ίίΐϊί9. 一項所述之化合物的使用，其 U用H這作為免疫賦活劑、巨噬細胞賦活劑、中性白血球 ^ mam 之魏動物的絲症或癌症的獅方法躲療方法， 二法4將治療上有效劑量之中請專利範圍第1項至第9項任 項所述之化σ物投予至該哺乳動物的方法。 菌產生毒素中和劑，其特徵在於： 含有以下式（2)所表示之化合物：
    【化2】
    105/106 201016221 基^基或Rl —CHR2—所表示之基團，x,為以 笨基、#基或R! —CHR2，一所表示之基團， ϋ匕、R“ :及R2’係各自獨立的氫原子*0^-021院基’ it而而言’各燒基中的氫原子可以經基、烧氧基 ^代R H基，^rt部或一部份亦可形成4 — 8元環，此外，Rl及 15_厂種中和劑，其中該中和劑係含有以下之任—化合物： 6，一〜2一癸基ί二醒基）—α，α，—海藻糖、 6 6 ❹ 6,一ί—〇〜Η一十，夸十二酿基）—α，α，一海藥糖、 6，一雙一D〜壬二酸基）—α，α，~海藤糖、 6,—雙一〇二9 一ΐ二ί十六酿基）—α，α，—海藤糖，或 υ〜（3—十四基十七醯基）—α，α，—海藻糖。 ❹ 106/106
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