CZ309423B6

CZ309423B6 - Lipofilní deriváty trehalózy, jejich příprava a farmaceutická využitelnost

Info

Publication number: CZ309423B6
Application number: CZ2016-335A
Authority: CZ
Inventors: Ladislav DroĹľ; Drož Ladislav RNDr., Ph.D.; Miroslav HAVRÁNEK; Havránek Miroslav Mgr., Ph.D.; Martin Vařeka; Martin Bc. Vařeka
Original assignee: Apigenex S.R.O.
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2022-12-28
Also published as: CZ2016335A3

Abstract

Lipofilní deriváty trehalózy obecného vzorce I, kde R1, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku C1 až C12, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde X1, X2představují nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu, s podmínkou, že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I nejsou látky, kde X1, X2 představuje CH2, n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25 a R1, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík. Způsob výroby derivátů trehalózy obecného vzorce I a jejich použití pro přípravu léčiva využívajícího jejich imunostimulačních účinků, léčiva stimulujícího fagocytózu fagocytů nebo aktivitu makrofágů a dendritických buněk.

Description

Lipofilní deriváty trehalózy, jejich příprava a farmaceutická využitelnost

Oblast techniky

Vynález se týká nových lipofilních derivátů trehalózy jejich přípravy a farmaceutického uplatnění v oblasti imunostimulační aktivace makrofágů, neutrofilů, fagocytózy fagocytujících buněk, neutralizaci bakteriálních toxinů, léčení infekčních onemocnění nebo rakoviny u savců, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I.

Dosavadní stav techniky

Trehalóza 6,6'-dimykolát (dříve nazývaná „cord factor“; TDM 1) je jeden z hlavních glykolipidů vyskytujících se ve vnější části buněčné stěny bakterie Mycobacterium tuberculosis, zc které byla izolována již v první polovině 20. století.^1-3 Její přítomnost v buněčné stěně bakterie Mycobacterium tuberculosis hraje důležitou roli v patogenitě této bakterie, napomáhá pohlcení bakterií buňkami makrofágů a přežití uvnitř nich.⁴ V organismu je struktura trehalózy 6,6'dimykolátu rozpoznávána pomocí TLR receptorů (toll like receptor) buněk imunitního systému a rozpoznání její struktury vede k stimulaci imunitního systému.⁵ Potenciální využití trehalózy 6,6'dimykolátu jako adjuvancia do vakcín^6-7 případně její využití v protinádorové léčbě^8-9 je dobře dokumentováno v literatuře. Další podobnou látkou s jednodušší strukturou hydroxy mastné kyseliny nalezené v bakteriích rodu Corynebacteria je trehalóza 6,6'-dikorynomykolát (TDCM, 2).¹¹ Jejích využití v humánní medicíně bohužel brání jejich vysoká toxicita. Nabízí se však možnost využití základního farmakoforu pro design nových účinných imunostimulancií s nižší toxicitou.

TDK (B n « 13, X ~ M y - 11 z ~ 17 ^-,^χ^χ. | v

Λ

HOS (ŽL ⁸⁸⁵ S, X as 7

IDE (S, a M. 111< 11 30

Z těchto důvodů byly činěny pokusy o přípravu jednodušších a méně aktivních trehalózových derivátů na bázi jednoduchých mastných lineárních kyselin (TDE, 3). Z těchto látek se ukázala být aktivní pouze sloučenina s C22 uhlíkovým řetězcem jako trehalózadibehemát (TDB), který se však

-1 CZ 309423 B6 vykazuje velmi nízkou rozpustností.

V posledních letech byly zkoumány rozvětvené a, β a γ lipidní 6,6'-diacyltrehalózy z nichž pouze beta 6,6'-bis-O-(3-nonyldodekanoyl)-a,a'-trehalóza byla aktivní.¹²

Ideálního stavu tak nebylo zatím dosaženo, velkou výzvou tak stále zůstává nalezení nových bezpečných imunomodulačních substancí, na které jsou kladena tato kritéria:

- aktivní imunomodulancium;

- menší imunologická aktivita, než má TDM a TDCM;

- snadná a definovaná příprava;

- dobrá rozpustnost;

- stabilní pro zabudování do micel a lipozomů;

- nepyrogenní;

- bez zánětlivých a nekrotických vedlejších účinků.

Literatura

[1] Bloch, H. J. Exp. Med. 1950, 91, 197-218.

[2] Bloch, H.; Noll, H. J. Biol. Chem. 1955, 214, 251-265.

[3] Noll, H.; Bloch, H.: Asselineau, J.; Lederer, E. Biochim. Biophys. Acta 1956, 20, 299-309.

[4] Barry, C. E.; Lee, R. E.; Mdluli, K.; Sampson, A. E.; Schroeder, B. G.; Slayden, R. A.; Yuan, Y. Prog. Lipid. Res. 1998, 37, 143-173.

[5] Hořejší, V.; Bartůňková, J.; Brdička, T.; Spíšek, R. Základy imunologie, 5. vydání; TRITON: Praha, 2013. ISBN 978-80-7387-713-2.

[6] Leo, O.; Cunningham, A.; Stem, P. L. Perspectives in Vaccinology 2011,1, 25-59.

[7] Gracon, N.; Leroux-Roels, G.; Cheng W. Perspectives in Vaccinology 2011,1, 89-113.

[8] Bekierkunst, A.; Levij, I. S.; Yarkoni, E. Science, 1971,174, 1240-1242.

[9] Furukawa, M.; Ohtsubo, Y.; Sugimoto, N.; Katoh, Y.; Dohi, Y. FEMS Microbiol. Immunol. 1990, 2, 83-88.

[10] Numata, F.; Nishimura, K.; Ishida, Η.; Ukei, S.; Tone, Y.; Ishihara, C.; Saiki, I.; Sekikawa, I.; Azuma, I. Chem. Pharm. Bull 1985, 33, 4544-4555.

[11] loneda, T.; Lenz, M.; Pudles: J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1963, 13, 110.

[12] Hirofumi Yamamoto, Mugio Nishizawa; J. Med. Chem. 2013, 56, 381-385.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je příprava a použití lipidních trehalózových derivátů struktury obecného vzorce I

(I),

-2 CZ 309423 B6 kde Ri, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci až C12, který je lineární nebo rozvětvený anebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I nejsou látky, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík.

Způsob přípravy těchto látek zahrnuje kroky podle schématu 1:

Schéma 1

i) současné nebo postupné reakce derivátu trehalózy II:

(Π), kde R5 představuje trimethylsilyl nebo benzyl, s karbonylovými sloučeninami obecných vzorců III a IV:

(III),

-3 CZ 309423 B6

Rs

(IV), kde Ri, R2, R₃, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku C1-C12, který je lineární nebo rozvětvený anebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem III a IV nejsou látky, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík;

a kde LGi a LG2 představuje nezávisle OH skupinu, halogen nebo zbytek ze skupiny radikálů, které představují LG-*:

za vzniku derivátu trehalózy V:

(V), kde Ri, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci až C12, který je lineární nebo rozvětvený anebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu kde R5 představuje trimethylsilyl nebo benzyl; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem V nejsou látky, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík.

Reakce kroku i) se provádí při stechiometrickém poměru látek II : III od 0,5 do 0,1 při teplotách

-4 CZ 309423 B6 od 0 °C do 120 °C v rozmezí od 10 min do 5 dnů, kdy k reakci dochází v roztoku látek II a III v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí za míchání či třepání v homogenních nebo heterogenních fázích v různých poměrech při nízkých i vysokých teplotách v aprotických rozpouštědlech, ve výhodném provedení v halogenovaných polárních i nepolárních rozpouštědlech, kterými mohou být hexan, toluen, benzen, heptan, petrolether, cyklohexan, dichlormethan, chloroform, tetrachlormethan, dichlorethan, tetrachlorethylen, dioxan, tetrahydrofuran, acetonitril, aceton, ethylacetát, diethylether, terc-butyl methyl ether, 1,2dimethoxy ethan, dimethoxymethan, N, JV-di methyl form am id, pyridin, triethylamin, ethyldiisopropylamin a jejich směsí.

Ve výhodném provedení se působí na látku II roztokem látky III kde LG je OH skupina za přítomnosti dehydratačních a aktivačních činidel, kterými mohou být karbodiimidy, uroniové a fosfoniové soli (DIC (diisopropylkarbodiimid), EDCI (l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyljkarbodiimid volný nebo jako HC1 sůl), TCTU ((O-(6-chlor-lhydroxybenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluorborát)), HOAT (3hydroxytriazolo[4,5-b]pyridine), HOBt (benzotriazol-l-ol), PyBOP ((benzotriazol-1yloxyjtripyrrolidinofosfonium hexafluorfbsfát), HATU (l-[bis(dimethylamino)methylen]-lHl,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorfbsfát),oxyma(ethyl kyano(hydroxyimino)acetát)). Reakce probíhá za použití terciární báze, kterou mohou být ethyldiisopropylamin, sym-colidin, DMAP (4-VA-dimethylaminopyridin).

V kroku ii), se produkt V (R5 = trimethylsilyl - TMS) podrobí kyselému zpracování trifluoroctovou kyselinou, CF3SO3H nebo iontoměničem v H⁺ cyklu podle schématu 2:

Schéma 2

Nebo se produkt V (R5 = benzyl-Bn) podrobí hydrogenolytickému zpracování např H2 na 10% Pd na uhlí podle schématu 3:

Schéma 3

Imunostimulační aktivita

Experimentálním měřením bylo zjištěno, že látky obecné struktury I vykazují imunostimulační účinky, které se projevují ve zvýšené aktivaci buněk imunitního systému především meyloidních diferencovaných buněk (makrofágů, dendritických buněk, žímých buněk /NK buněk/) obecně

-5 CZ 309423 B6 fagocytózou fagocytujících buněk.

Bylo rovněž prokázán vliv látek obecné struktury I ve složení experimentální vakcíny s BSA antigenem na myším modelu ve srovnání s LPS (lipopolysacharidem) a TDCM.

Testovány rovněž byly aktivity látek obecné struktury I na produkci cytokinu IL-8, TNF-α a IFNγ; aktivaci neutrofilů izolovaných z myší krve.

Přežívání myší po intravenózní intraperitoneální intoxikaci Escherichia Colli myšího kmenu BALB/c v profylaktickém i terapeutickém modelu (časování 1, 3 den po infekci a -7, -1 před infekcí) kdy bylo dosaženo 95% procentního přežívání oproti kontrolám.

Studován byl rovněž vliv látek obecné struktury I na tvorbu sekundárních plicních metastáz nádorového modelu melanomu (B16-F0) u myší (C57BL/6).

Příklady uskutečnění vynálezu

Předmět vynálezu je doložen příklady provedení, aniž se tím jakkoli omezuje.

Příklad 1

4.3.7 . Obecný postup pro syntézu 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-di-O-acyl-a,a'-Dtrehalóz z příslušných kyselin

Příslušná kyselina (1,61 mmol; 2,5 ekv.), 2,2,3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-a,a'-.D-trehalóza (500 mg; 645 pmol; 1 ekv.), A'-(3-dimcthylaminopropyl)-A-cthylkarbodiimidhydrochlorid (EDCI) (495 mg; 2,58 mmol; 4 ekv.) a 4-(dimethylamino)pyridin (DMAP) (64,5 mg; 63,5 pmol; 1 ekv.) byly suspendovány v bezvodém toluenu (10 ml). Reakční směs byla míchána při 70 °C a po detekci plné konverze pomocí TLC (2 dny) bylo rozpouštědlo podařeno na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml), odpařen na rotační vakuové odparce společně se silikagelem (2 g) a čištěn pomocí sloupcové chromatografie.

Příklad 2

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(16-ethyloktadekanoyl)-a,a'-D-trehalóza (7a)

Látka 7a byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-ethyloktadekanové (547 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g Si O21 eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 831 mg (94 %); bezbarvý olej; C70H146O13SÍ6 [1364,41 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,84 (t, J= 7,3 Hz, 12H); 1,11 až 1,36 (m, 58H); 1,53 až 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J= 1,9; 7,5 Hz, 4H); 3,41 až 3,52 (m, 4H); 3,91 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,96 až 4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCh) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 10,91; 24,79; 25,43; 26,77; 29,16; 29,31; 29,48; 29,62; 29,65; 29,68; 29,70; 29,71; 29,73; 30,15; 32,75; 34,14; 36,53; 40,36; 63,28; 70,71; 71,91; 72,64; 73,46; 94,36; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺CvoHneOnSieNa: 1386,9; nalezeno: 1387,1; TLC R<= 0,45 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 3

2,2',3,3'4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(16-propylnonadekanoyl)-a,íz'-Z)-trehalóza (7b)

Látka 7b byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-propylnonadekanové (4b) (592 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g S1O2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 871 mg (95 %); bezbarvý olej; C74H154O13SÍ6 [1420,52 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,88 (t, J= Ίβ Hz, 12H); 1,13 až 1,36 (m, 66H); 1,54 až 1,70 (m, 4H); 2,35 (dt, J = 2,1; 7,6 Hz, 4H); 3,40 až 3,53 (m, 4H); 3,91 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,96 až 4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 2,0; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCh) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 14,18; 23,17; 24,79; 26,71; 28,87; 29,16; 29,32; 29,49; 29,64; 29,67; 29,71; 29,72; 30,17; 33,38; 33,70; 34,14; 37,34; 63,28; 70,71; 71,91; 72,63; 73,46; 94,37; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺C74Hi54Oi3Si6Na: 1443,0; nalezeno: 1442,8; TLC R<= 0,45 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 4

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(16-butylikosanoyl)-a,íz'-D-trehalóza (7c)

-7 CZ 309423 B6

(7c)

Látka 7c byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-butylikosanové (638 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografíe (20 g SiO21 eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -A· 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 777 mg (82 %); bezbarvý olej; C78H162O13SÍ6 [1476,63 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 12H); 1,11 až 1,41 (m, 72H); 1,55 až 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J=2,l; 7,6 Hz, 4H); 3,41 až 3,54 (m, 4H); 3,91 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,97 až 4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 14,54; 19,80; 24,79; 26,68; 29,16; 29,32; 29,48; 29,63; 29,66; 29,69; 29,72; 30,17; 33,67; 34,14; 36,10; 36,94; 63,27; 70,72; 71,91; 72,63; 73,46; 94,36; 173,71 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (Μ + Na)⁺ CvsH^OisSieNa: 1498,1; nalezeno: 1493,3; TLC R/= 0,47 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 5

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(16-hexyldokosanoyl)-a,íz'-D-trehalóza (7d)

(7d)

Látka 7d byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-hexyldokosanové (684 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografíe (20 g S1O2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -A· 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 736 mg (72 %); bezbarvý olej; CseHnsOnSie [1588,84 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,89 (t, J = Ί,ύ Hz, 12H); 1,00 až 1,40 (m, 90H); 1,53 až 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J=2,l; 7,5 Hz, 4H); 3,39 až 3,54 (m, 4H); 3,91 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,96 až 4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,4 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 3,2 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,17; 0,88; 1,06; 14,13; 22,72; 24,80; 26,67; 26,71, 29,18; 29,33; 29,50; 29,65; 29,69; 29,73; 29,84; 30,17; 31,97; 33,71; 34,15; 37,40; 63,29;

-8 CZ 309423 B6

70,73; 71,92; 72,64; 73,47; 94,37; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺CseHnsOnSieNa: 1610,2; nalezeno: 1410,6; TLC R<= 0,51 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 6

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8a)

(8a)

Látka 8a byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(hexadecyloxy)octové (6a) (483 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g S1O2; eluění roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 832 mg (96 %); bezbarvý olej; CeeEUsOisSie [1340,31 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ = 0,13 až 0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J= Ίβ Hz, 6H); 1,11 až 1,42 (m, 52H); 1,55 až 1,68 (m, 4H); 3,39 až 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,96 až 4,06 (m, 2H); 4,8 až 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ= 0,12; 0,82; 1,00; 14,08; 22,66; 25,99; 29,33; 29,46; 29,55; 29,59; 29,63; 29,67; 31,90; 63,60; 68,07; 70,62; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CeeHnsOisSieNa: 1361,9; nalezeno: 1362,9; TLC R^=0,20 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM).

Příklad 7

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8b)

(8b)

Látka 8b byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(heptadecyloxy)octové (6b) (506 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g S1O2; eluění roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 858 mg (97 %); bezbarvý olej; C68H142O15SÍ6 [1368,36 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃) δ = 0,12 až 0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,13 až 1,41 (m, 56H); 1,53 až 1,67 (m, 4H); 3,37 až 3,58 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,8 Hz, 2H); 3,94 až 4,07 (m, 2H); 4,06 až 4,18 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,1; 11,8 Hz, 2H); 4,90 (d, J = 3,0 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) δ = 0,13; 0,81; 1,02; 14,10; 22,67; 26,00; 29,33; 29,46; 29,57; 29,61; 29,63; 29,68; 31,91; 63,60; 68,08; 70,62; 71,74; 72,58; 73,34; 94,34; 170,59 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CesH^OisSieNa: 1389,9; nalezeno: 1391,1; TLC R< = 0,20 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM).

Příklad 8

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(oktadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8c)

(8c)

Látka 8c byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(oktadecyloxy)octové (528 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g S1O2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 —> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 873 mg (97 %); bezbarvé krystaly; C70H146O15SÍ6 [1396,41 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13 až 0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J= 6,9 Hz, 6H); 1,12 až 1,41 (m, 60H); 1,54 až 1,67 (m, 4H); 3,38 až 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,95 až 4,05 (m, 2H); 4,08 až 4,21 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,1; 11,5 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,6 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,14; 0,81; 1,01; 14,09; 22,68; 25,99; 29,31; 29,48; 29,56; 29,57; 29,65; 29,68; 31,91; 63,60; 68,07; 70,63; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CvoHueOisSieNa: 1417,9; nalezeno: 1417,4; TLC R< = 0,22 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 38,7 až 39,8 °C.

Příklad 9

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(nonadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8d)

(8d)

Látka 8d byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(nonadecyloxy)octové

- 10CZ 309423 B6 (550 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g S1O2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 902 mg (98 %); bezbarvé krystaly; C72H150O15SÍ6 [1424,47 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCh) 0,13 až 0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 6H); 1,09 až 1,42 (m, 64H); 1,54 až 1,68 (m, 4H); 3,39 až 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,97 až 4,06 (m, 2H); 4,07 až 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCh) δ = 0,14; 0,83; 1,01; 14,09; 22,67; 25,99; 29,33; 29,48; 29,55; 29,59; 29,64; 29,67; 31,91; 63,61; 68,08; 70,62; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,49 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (Μ + Na)⁺ C72Hi5oOi5SieNa: 1446,0; nalezeno: 1447,2; TLC R/ = 0,23 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 46,0 až 46,7 °C.

Příklad 10

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(ikosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8e) (8e)

Látka 8e byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(ikosyloxy)octové (573 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiCE; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 —> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 902 mg (96 %); bezbarvé krystaly; C74H154O15SÍ6 [1452,52 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ = 0,13 až 0,15 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 6H); 1,13 až 1,41 (m, 68H); 1,54 až 1,67 (m, 4H); 3,41 až 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,96 až 4,06 (m, 2H); 4,07 až 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J = 2,2; 11,8 Hz, 2H); 4,90 (d, J = 2,8 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDCh) δ = 0,14; 0,85; 1,02; 14,10; 22,68; 26,02; 29,36; 29,49; 29,57; 29,61; 29,62; 29,66; 29,70; 31,92; 63,62; 68,10; 70,63; 71,76; 72,59; 73,35; 94,35; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ C74Hi540i5SieNa: 1474,0; nalezeno: 1474,2; TLC R/= 0,24 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 47,0 až 48,1 °C.

Příklad 11

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(henikosyloxy)acetyl)-a,íz'-D-trehalóza (8f)

- 11 CZ 309423 B6

(8f)

Látka 8f byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(henikosyloxy)octové (6f) (596 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografíe (20 g SiO₂; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 893 mg (94 %); bezbarvé krystaly; CveHissOisSie [1480,57 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃) δ = 0,13 až 0,15 (m, 36H); 0,16 (s, 18H); 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 6H); 1,14 až 1,42 (m, 72H); 1,53 až 1,65 (m, 4H); 3,39 až 3,55 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,98 až 4,06 (m, 2H); 4,7 až 4,21 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) δ= 0,14; 0,83; 1,01; 14,09; 22,67; 26,00; 29,34; 29,49; 29,57; 29,59; 29,62; 29,65; 29,68; 31,91; 63,62; 68,09; 70,63; 71,76; 72,59; 73,36; 94,37; 170,49 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CveHissOisSieNa: 1502,0; nalezeno: 1503,2; TLC R< = 0,26 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 53,9 až 54,5 °C.

Příklad 12

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(2-(dokosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (8g)

(8g)

Látka 8g byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(dokosyloxy)octové (618 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografíe (20 g SiO₂; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 —> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 870 mg (89 %); bezbarvé krystaly; C78H162O15SÍ6 [1508,62 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃) δ = 0,13 až 0,15 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J= 6,7 Hz, 6H); 1,17 až 1,42 (m, 76H); 1,55 až 1,68 (m, 4H); 3,40 až 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,97 až 4,06 (m, 2H); 4,07 až 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) δ = 0,15; 0,84; 1,02; 14,10; 22,68; 26,01; 29,35; 29,49; 29,57; 29,60; 29,62; 29,65; 29,69; 31,92; 63,62; 68,09; 70,63; 71,76; 72,59; 73,36; 94,37; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CvsH^OisSieNa: 1530,0; nalezeno: 1531,3; TLC R/= 0,27 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 57,7 až 58,1 °C.

- 12CZ 309423 B6

Příklad 13

4.3.8 Obecný postup pro syntézu 6,6'-di-O-acyl-a,a'-Z)-trehalóz z příslušných 2,2',3,3',4,4'-hexaO-trimethylsilyl-6,6'-di-O-acyl-a,íz'-D-trehalóz

K roztoku příslušné 2,2',3,3'4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-di-O-acyl-a,íz'-.D-trehalóza (499 pmol; 1 ekv.) ve směsi dichlormethan/methanol (4/1; 10 ml) byl přidán Dowex® 50W X8 (Sigma Aldrich) (250 mg). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě. Po detekci plné konverze pomocí TLC (2 hodiny) byla reakční směs zfiltrována. Při vzniku sraženiny v průběhu reakce byla reakční směs před filtrací naředěna tetrahydrofuranem (Í0 ml). Filtrát byl odpařen na vakuové rotační odparce a surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie.

Příklad 14

6,6'-Bis-O-( 16-ethyloktadekanoyl)-cr, ď-D-trchalóza (10a)

Látka 10a byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(16-ethyloktadekanoyl)-a,a'-Z)-trehalózy (7a) (681 mg; 499 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g S1O2; eluění roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 324 mg (70 %); lyofilizát; C52H98O13 [931,33 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridin-J) δ= 0,86 (t, J = 7,3 Hz, 12H); 1,11 až 1,42 (m, 58H); 1,64 (tt, J = 7,0 Hz, 4H); 2,34 (t, J= 7,3 Hz, 4H); 4,18 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,32 (dd, J= 3,5; 9,5 Hz, 2H); 4,76 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,84 (dd, J = 5,5; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (d, J = 11,0 Hz, 2H); 5,11 (dd, J = 4,4; 10,3 Hz, 2H); 5,90 (d, J = 3,2 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridm-J) δ = 11,58; 25,78; 26,18; 27,57; 29,88; 30,09; 30,28; 30,43; 30,48; 30,55; 30,95; 33,53; 34,92; 41,05; 64,85; 72,05; 72,49; 73,85; 75,34; 96,29; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ C^H^NaOi ť 953,7; nalezeno: 954,4; TLC R<= 0,40 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM).

Příklad 15

6,6'-Bis-O-( 16-propylnonadekanoyl )-a, ď-/)-trchalóza (10b)

- 13 CZ 309423 B6

(10b)

Látka 10b byla připravena podle obecného postupu

Látka 10b byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsiiyl-6,6'bis-O-(16-propylnonadekanoyl)-a,a'-D-trehalózy (7b) (717 mg; 505 pmok 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCh; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 430 mg (86 %); lyofilizát; CsďHioďOb [987,43 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridm-óA) δ= 0,92 (t, J = 6,9 Hz, 12H); 1,13 až 1,41 (m, 66H); 1,64 (tt, J = 7,0 Hz, 4H); 2,34 (dt, J= 1,5; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J = 9,4 Hz, 2H); 4,33 (dd, J= 3,8; 9,4 Hz, 2H); 4,76 (t, J = 9,2 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (d, J= 11,1 Hz, 2H); 5,11 (dd, J= 4,4; 10,3 Hz, 2H); 5,90 (d, J= 3,8 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridin-óA) δ= 15,25; 20,57; 25,78; 27,48; 29,88; 30,09; 30,27; 30,44; 30,48; 30,52; 30,54; 30,55; 30,99; 34,44; 34,91; 36,81; 37,68; 64,84; 72,05; 72,49; 73,85; 75,34; 96,29; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺CseHioeNaOn: 1009,8; nalezeno: 1010,5; TLC R<= 0,27 (dichlormethan/methanol = 90/10, CAM).

Příklad 16

6,6'-Bis-O-( 16-butylikosanoyl)-cr, a'-/)-trchalóza (10c)

(10c)

Látka 10c byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(16-butylikosanoyl)-a,a'-Z)-trehalózy (7c) (623 mg; 422 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCh; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 371 mg (84 %); lyofilizát; C60H114O13 [1043,54 g/mol]

- 14CZ 309423 B6 'HNMR (300 MHz, pvridin-J) δ= 0,93 (t, J= 6,8 Hz, 12H); 1,12 až 1,41 (m, 74H); 1,64 (tt, J= 7,1 Hz, 4H); 2,34 (dt, J= 1,7; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J= 9,4 Hz, 2H); 4,33 (dd, J= 3,8; 9,4 Hz, 2H); 4,77 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (dd, J= 1,2; 11,5 Hz, 2H); 5,07 až 5,15 (m, 2H); 5,91 (d, J= 3,6 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridin-J) δ = 14,87; 23,97; 25,78; 27,54; 29,72; 29,88; 30,09; 30,28; 30,44; 30,49; 30,53; 30,55; 30,56; 31,00; 34,17; 34,50; 34,91; 38,14; 64,84; 72,05; 72,50; 73,86; 75,35; 96,30; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CeoHiwNaOis: 1065,8; nalezeno: 1066,6; TLC R^= 0,34 (dichlomnethan/methanol = 85/15, CAM).

Příklad 17

6,6'-Bis-O-( 16-hexyldokosanoyl)-a,ď-Zt-trchalóza (1 Od)

Látka 10d byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(16-hexyldokosanoyl)-a,a'-D-trehalózy (7d) (582 mg; 366 pmol; 1 ekv ). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCL; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 —> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 232 mg (55 %); lyofilizát; CósHboOb [1155,75 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridin-J) δ= 0,93 (t, J= 6,8 Hz, 12H); 1,12 až 1,40 (m, 90H); 1,64 (tt, J = 7,3; 7,5 Hz, 4H); 2,34 (dt, J=l,5; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J= 9,4 Hz, 2H); 4,32 (dd, J= 3,7; 9,7 Hz, 2H); 4,77 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (dd, J= 1,9; 11,7 Hz, 2H); 5,07 až 5,15 (m, 2H); 5,91 (d, J = 3,6 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridin-J) δ= 14,82; 23,50; 25,79; 27,51; 27,56; 29,90; 30,11; 30,30; 30,47; 30,52; 30,58; 30,63; 31,03; 32,71; 34,53; 34,92; 38,23; 64,84; 72,06; 72,50; 73,86; 75,35; 96,28; 174,11 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺CesHnoNaOn: 1177,9; nalezeno: 1178,8; TLC R^= 0,41 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM).

Příklad 18

6,6'-Bis-O-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (1 la)

- 15 CZ 309423 B6

(Ha)

Látka 1 la byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8a) (724 mg; 540 pmok 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCE; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 428 mg (87 %); bezbarvé krystaly; CrsHgoOis [907,22 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyndin-rk) ú = 0,88 (t, J= 6,6 Hz, 6H); 1,20 až 1,43 (m, 52H); 1,62 (tt, J= 7,0 Hz, 4H); 3,56 (t, J = 6,5 Hz, 4H); 4,16 (t, J = 9,4 Hz, 2H); 4,22 (d, J = 3,2 Hz, 4H); 4,26 až 4,34 (m, 2H); 4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,6; 11,8 Hz, 2H); 5,01 až 5,15 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,6 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridm-ík) δ = 14,78; 23,43; 26,87; 30,11; 30,26; 30,42; 30,49; 30,56; 32,62; 65,12; 68,93; 71,96; 72,28; 72,42; 73,79; 75,31; 96,45; 174,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CrsHgoNaOn: 929,6; nalezeno: 930,4; TLC R< = 0,34 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 142,6 až 143,5 °C.

Příklad 19

6,6'-Bis-O-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (11b)

OK O

(lib)

Látka 11b byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8b) (730 mg; 534 pmok 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCE; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 —> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 410 mg (82 %); bezbarvé krystaly; C5oHg40i5 [935,27 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridm-ík) δ= 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,13 až 1,43 (m, 56H), 1,54 až 1,69 (m, 4H); 3,55 (t, J= 6,5 Hz, 4H); 4,10 až 4,25 (m, 6H); 4,30 (dd, J= 3,6; 9,4 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,0; 11,2 Hz, 2H); 4,99 až 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,4 Hz, 2H) ppm; ¹³CNMR(75 MHz, pyridm-ík) δ= 14,79; 23,45; 26,89; 30,12; 30,27; 30,44; 30,51; 39,57; 32,63; 65,10; 68,92; 71,95; 72,27; 72,41; 73,77; 75,29; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ C5oHg4NaOi5: 957,7; nalezeno: 958,4; TLC R< = 0,35 (dichlormethan/methanol = 85/15,

- 16CZ 309423 B6

CAM); B.t. 140,2 až 140,8 °C.

Příklad 20

6,6'-Bis-O-(2-(oktadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (11c)

(He)

Látka 11c byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(oktadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8c) (767 mg; 549 pmok 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g S1O2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 435 mg (82 %); bezbarvé krystaly; C52H98O15 [963,33 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridin-ók) δ= 0,88 (t, J= 6,6 Hz, 6H); 1,11 až 1,46 (m, 60H), 1,54 až 1,67 (m, 4H); 3,55 (t, J = 6,2 Hz, 4H); 4,08 až 4,25 (m, 6H); 4,29 (dd, J= 3,4; 9,6 Hz, 2H); 4,75 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,1; 11,3 Hz, 2H); 4,99 až 5,17 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,2 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridin-ók) δ= 14,80; 23,46; 26,88; 30,13; 30,28; 30,44; 30,51; 32,63; 65,10; 68,92; 71,95; 72,27; 72,41; 73,78; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺C52Hg8NaOi5: 985,7; nalezeno: 986,4; TLC R = 0,40 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 139,0 až 139,8 °C.

Příklad 21

6,6'-Bis-O-(2-(nanodecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (1 Id)

Látka 1 Id byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(nonadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8d) (810 mg; 569 pmok 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g S1O2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 —> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 495 mg (88 %); bezbarvé krystaly; C54H102O15 [991,38 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridin-ók) δ= 0,88 (t, J= Ίβ Hz, 6H); 1,16 až 1,44 (m, 64H), 1,54 až 1,68

- 17CZ 309423 B6 (m, 4H); 3,56 (t, J= 6,3 Hz, 4H); 4,09 až 4,25 (m, 6H); 4,30 (dd, J= 3,6; 9,4 Hz, 2H); 4,75 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 4,7; 11,1 Hz, 2H); 5,00 až 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,0 Hz, 2H) ppm; ¹³CNMR(75 MHz, pyridm-iA) δ= 14,79; 23,45; 26,89; 30,12; 30,28; 30,44; 30,52; 30,57; 32,63; 65,11; 68,92; 71,96; 72,28; 72,41; 73,78; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ C54Hio2NaOi5: 1013,7; nalezeno: 1014,5; TLC R<= 0,48 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 137,8 až 138,6 °C.

Příklad 22

6,6'-Bis-O-(2-(ikosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (1 le)

(He)

Látka 1 le byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(ikosyloxy)acetyl)-a,a'-.D-trehalózy (8e) (840 mg; 578 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g S1O2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 395 mg (67 %); bezbarvé krystaly; CseHioeOis [1019,43 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridm-óA) δ= 0,88 (t, J= 5,9 Hz, 6H); 1,17 až 1,44 (m, 68H), 1,54 až 1,68 (m, 4H); 3,56 (t, J= 6,3 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,8 Hz, 2H); 4,22 (d, J= 2,5 Hz, 4H); 4,30 (dd, J= 3,2; 8,9 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,3; 11,5 Hz, 2H); 5,00 až 5,17 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,2 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridm-óA) δ = 14,80; 23,46; 26,89; 30,13; 30,28; 30,44; 30,46; 30,53; 30,58; 32,63; 65,10; 68,93; 71,96; 72,28; 72,41; 73,79; 75,31; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CseHioeNaOis: 1041,7; nalezeno: 1042,6; TLC R^= 0,48 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 135,0 až 136,3 °C.

Příklad 23

6,6'-Bis-O-(2-(henikosyloxy)acetyl)-a,a'-.D-trehalóza (1 If)

(llf)

Látka 1 Ifbyla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(henikosyloxy)acetyl)-a,a'-.D-trehalózy (8f) (874 mg; 591 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCL; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

- 18CZ 309423 B6

Výtěžek: 539 mg (87 %); bezbarvé krystaly; CssHnoOis [1047,48 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridm-óA) δ= 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,17 až 1,44 (m, 72H), 1,54 až 1,69 (m, 4H); 3,56 (t, J= 6,4 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,22 (d, J= 3,0 Hz, 4H); 4,30 (dd, J= 3,2; 8,9 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 4,9; 11,3 Hz, 2H); 5,01 až 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,4 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridm-óA) δ = 14,80; 23,46; 26,90; 30,13; 30,28; 30,44; 30,53; 32,63; 65,10; 68,92; 71,96; 72,28; 72,42; 73,79; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CssHnoNaOis: 1069,8; nalezeno: 1070,7; TLC R/ = 0,50 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 133,8 až 135,1 °C.

Příklad 24

6,6'-Bis-O-(2-(dokosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalóza (11 g)

Hg

Látka 1 Ig byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(dokosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8 g) (770 mg; 511 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiCL; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 523 mg (95 %); bezbarvé krystaly; CeoHmOis [1075,54 g/mol]

Ή NMR (300 MHz, pyridm-óA) δ= 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H); 1,15 až 1,44 (m, 76H), 1,54 až 1,69 (m, 4H); 3,56 (t, J= 6,5 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,5 Hz, 2H); 4,22 (d, J= 2,6 Hz, 4H); 4,30 (dd, J= 3.1; 9,1 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,3; 11,3 Hz, 2H); 4,99 až 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,4 Hz, 2H) ppm; ¹³C NMR (75 MHz, pyridm-óA) δ = 14,80; 23,46; 26,89; 30,13; 30,28; 30,44; 30,53; 32,64; 65,11; 68,92; 71,96; 72,27; 72,41; 73,79; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)⁺ CeoHmNaOis: 1097,8; nalezeno: 1098,7; TLC R/= 0,50 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM). B.t. 136,5 až 138,2 °C.

Příklad 25

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-benzyl-6,6'-bis-O-(2-((16-ethyloktadecyl)oxy)acetyl))-a,a'-.D-trehalóza (17k)

- 19CZ 309423 B6

Látka 17k byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(16ethyloktadecyl)oxy)octové (1,61 mmol; 1 ekv.) a hexabenzyltrehalózy. Surový produkt byl čištěn pomoci sloupcové chromatografíe (20 g S1O2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 902 mg (92 %); bezbarvé krystaly; C98H142O15 [1560,17 g/mol]

Příklad 26

6,6'-bis-O-(2-(( 16-ethyloktadecyl)oxy)acetyl))-a,ď-/)-trchalóza (18k)

(18k)

K roztoku příslušné 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-benzyl-6,6'-di-O-acyl-a,a'-D-trehalózy 17k ( 500 mg) ve směsi dichlormethan/tetrahydrofůran (4/2; 10 ml) bylo přidáno 300 mg 10% Pd/C (Aldrich, sušeného ve vakuu pod Ar). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 2 dny v atmosféře vodíku za laboratorní teploty a tlaku 101,3 kPa (1 atm.). Po detekci plné konverze pomocí byla reakční směs zfiltrována. Filtrát byl odpařen na vakuové rotační odparce a surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografíe (16 g SÍO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: (89 %); bezbarvé krystaly; CseHioeOis [1019,43 g/mol]

Příklad 27

Imunostimulační aktivita

Experimentálním měřením bylo zjištěno že látky obecné struktury I vykazují imunostimulační účinky, které se projevují ve zvýšené aktivaci buněk imunitního systému především meyloidních diferencovaných buněk (makrofágů, dendritických buněk, žímých buněk /NK buněk/) obecně fagocytózou fagocytujících buněk.

Byl rovněž prokázán vliv látek obecné struktury I ve složení experimentální vakcíny s BSA antigenem na myším modelu ve srovnání s LPS (lipopolysacharidem) a TDCM.

Přežívání myší po intravenózní intraperitoneální intoxikaci Escherichia Colli myší kmenu BALB/c v profylaktickém i terapeutickém modelu (časování 1, 3 den po infekci a -7, -1 před infekcí) kdy bylo dosaženo 95% procentního přežívání oproti kontrolám.

Studován byl rovněž vliv látek obecné struktury I na tvorbu sekundárních plicních metastáz

-20CZ 309423 B6 nádorového modelu melanomu (B16-F0) u myší (C57BL/6).

Průmyslová využitelnost

Uvedenou metodologii přípravy lze použít pro syntézu látek v laboratorním i průmyslovém měřítku. Látky připravené podle vynálezu lze použít v základním výzkumu, ve farmaceutickém průmyslu, tj. ve výrobcích obsahujících tyto látky nebo jejich směsí, určených k použití při terapeutickém ošetřování lidského nebo zvířecího těla a diagnostických metodách používaných na 10 lidském nebo zvířecím těle.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Trehalózové sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I:

kde Ri, R₂, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci až C12, který je lineární nebo rozvětvený a/nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I nejsou sloučeniny, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík.
2. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I:

(I), kde Ri, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci až C12, který je lineární nebo rozvětvený a/nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I nejsou sloučeniny, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n’ nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík, vyznačený tím, že tento způsob zahrnuje kroky:

i) současné nebo postupné reakce derivátu trehalózy II:

-22CZ 309423 B6

(Π), kde R5 představuje trimethylsilyl nebo benzyl, s karbonylovými sloučeninami obecných vzorců III a IV:

(III),

(IV),

10 kde Ri, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku CiC12, který je lineární nebo rozvětvený a/nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu; s podmínkou že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem III a IV nejsou sloučeniny, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík;

15 a kde LGi a LG2 představují nezávisle OH skupinu, halogen nebo zbytek ze skupiny radikálů, které představují LG-*:

za vzniku derivátu trehalózy V:

-23 CZ 309423 B6

(V), kde Ri, R2, R3, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku CiC12, který je lineární nebo rozvětvený a/nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 11 do 25, kde Xi, X2 představuje nezávisle kyslík, nebo CH2 skupinu a kde R5 představuje trimethylsilyl nebo benzyl; s podmínkou, že sloučeniny reprezentované obecným vzorcem V nejsou sloučeniny, kde Xi, X2 představuje CH2 skupinu a kde n, n' nabývá hodnot od 11 do 25 a kde Ri, R2, R3, R4 představují vodík;

ii) krok následné deprotekce derivátu V provedené odstraněním chránících skupin R5 pomocí hydrolýzy nebo redukce.
3. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačený tím, že se reakce kroku i) provede při stechiometrickém poměru sloučenin II: III od 0,5 do 0,1 při teplotách od 0 °C do 120 °C v rozmezí od 10 min do 5 dnů, kdy k reakci dochází v roztoku sloučenin II a III v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí za míchání či třepání v homogenní nebo heterogenní fázích v různých poměrech při nízkých i vysokých teplotách.
4. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačený tím, že se reakce kroku i) provede v aprotických rozpouštědlech, ve výhodném provedení v halogenovaných polárních i nepolárních rozpouštědlech, kterými mohou být hexan, toluen, benzen, heptan, petrolether, cyklohexan, dichlormethan, chloroform, tetrachlormethan, dichlorethan, tetrachlorethylen, dioxan, tetrahydrofuran, acetonitril, aceton, ethylacetát, diethylether, terc-butylmethylether, 1,2-dimethoxyethan, dimethoxymethan, Λζ/V-dimethylformamid, pyridin, triethylamin, ethyldiisopropylamin a jejich směsí.
5. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se v kroku i) ve výhodném provedení působí na sloučeninu II roztokem sloučeniny III, kde LG je OH skupina, za přítomnosti dehydratačních a aktivačních činidel, kterými jsou karbodiimidy, uraniové a fosfoniové soli, kterými jsou:

diisopropylkarbodiimid, l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid volný nebo jako hydrochloridová sůl, (O-(6-chlor-1 -hydroxybenzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3tetramethyluroniumtetrafluorborát, 3 -hydroxytriazolo [4,5 -ó]pyridin, benzotriazol-1 -ol, (benzotriazol-1 -yloxy)tripyrrol idinfosfoniumhexafluorfbsfát, 1 -[bis(dimethylamino)methylen] - IHl,2,3-triazolo[4,5-ó]pyridinium 3-oxidhexafluorfbsfát, ethylkyano(hydroxyimino)acetát, kdy reakce probíhá za použití terciární báze, kterou je ethyldiisopropylamin, sym-colidin nebo 4-N,Ndimethylaminopyridin.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se v kroku ii) produkt V podrobí kyselému zpracování trifluoroctovou kyselinou, CF3SO3H nebo iontoměničem v H⁺ cyklu.
7. Trehalózové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1, pro použití jako imunostimulátory.
8. Trehalózové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1, pro použití jako stimulatory fagocytózy.

-24CZ 309423 B6
9. Použití trehalózových derivátů obecného vzorce I podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro stimulaci aktivity makrofágů a dendritických buněk.