CZ2016335A3

CZ2016335A3 - Lipofilní deriváty trehalózy, jejich příprava a farmaceutická využitelnost

Info

Publication number: CZ2016335A3
Application number: CZ2016-335A
Authority: CZ
Inventors: Ladislav DroĹľ; Miroslav Havránek; Martin Vařeka
Original assignee: Apigenex S.R.O.
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2017-12-13
Also published as: CZ309423B6

Abstract

Příprava a použití nových lipofilních derivátů trehalózy vzorce I s uplatněním v oblasti imunologické imunostimulační aktivace makrofágů, neutrofilů, NK buněk, dendriticných buněk, kdy dochází k ovlivnění fagocytózy fagocytujících buněk a jejího využití pro neutralizaci bakteriálních toxinů, jako adjuvancií při konstrukci vakcín a léěení infekčních a rakovinových onemocnění u savců, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I. Metoda přípravy derivátů trehalózy vzorce Ije uplatnitelná pro syntézu látek v multikilogramovém množství.

Description

Vynález se týká nových lipofilních derivátů trehalózy jejich přípravy a farmaceutického uplatnění v oblasti imunostimulační aktivace makrofágů, neutrofilů; fagocytózu fagocytujících buněk; neutralizaci bakteriálních toxinů, léčení infekčních onemocnění nebo rakoviny u savců, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I.

Dosavadní stav techniky

Trehalóza 6,6'-dimykolát (dříve nazývaná „cord factor“; TDM 1) je jeden z hlavních glykolipidů vyskytujících se ve vnější části buněčné stěny bakterie Mycobacterium tuberculosis, ze které byla izolována již v první polovině 20. století.¹³ Její přítomnost v buněčné stěně bakterie Mycobacterium tuberculosis hraje důležitou roli v patogenitě této bakterie, napomáhá pohlcení bakterií buňkami makrofágů a přežití uvnitř nich.⁴ V organismu je struktura trehalózy 6,6'-dimykolátu rozpoznávána pomocí TLR receptorů (toll like receptor) buněk imunitního systému a rozpoznání její struktury vede k stimulaci imunitního systému.⁵ Potenciální využití trehalózy 6,6'-dimykolátu jako adjuvancia do vakcín^{6 7} případně její využití v protinádorové léčbě^8-9 je dobře dokumentováno v literatuře. Další podobnou látkou s jednodušší strukturou hydroxy mastné kyseliny nalezenou v bakteriích rodu Corynebacteria je trehalóza 6,6'-dikorynomykolát (TDCM, 2).¹¹ Jejích využití v humánní medicíně bohužel brání jejich vysoká toxicita. Nabízí se však možnost využití základního farmakoforu pro design nových účinných imunostimulancií s nižší toxicitou.

TDM (1). e.g. n - 13. x = 16. y = 12,z = 17

TDCM (2), e.g. n = 5,x = 7

TDE (3), e.g. n = 4,10, 14, 16, 20 • · : i: *· ·: :: : :::

·..··..· .........

Z těchto důvodů byly činěny pokusy o přípravu jednodušších a méně aktivních trehalozových derivátů na bázi jednoduchých mastných lineárních kyselin (TDE, 3). Z těchto látek se ukázla být aktivní pouze sloučenina s C22 uhlíkovým řetězcem jako trehalóza dibehemát (TDB), který se však vykazuje velmi nízkou rozpustnost.

V posledních letech byly zkoumány rozvětvené α, β a y lipidní 6,6'-diacyltrehalózy z nichž pouze beta 6,6'-bis-O-(3-nonyldodekanoyl)-a,a'-trehalóza byla aktivní.¹²

Ideálního stavu tak nebylo zatím dosaženo, velkou výzvou tak stále zůstává nalezení nových bezpečných immunomodulačních substancí, na které jsou kladena tato kritéria:

- aktivní immunomodulancium

- menší imunologická aktivita než má TDM a TDCM

- snadná a definovaná příprava

- dobrá rozpustnost

- stabilní pro zabudování do micel a lipozomů

- nepyrogenní

- bez zánětlivých a nekrotických vedlejších účinků

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je příprava a použití lipidních trehalozových derivátů struktury obecného vzorce I

R1

(O kde R,, R₂, R_3i R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku C,C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde Xn X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu.

Způsob přípravy těchto látek zahrnuje kroky podle schématu 1 :

• · • · · • · · · • · · • · · « · · · · • · · • · • · • · • · · · • · · · ·· ··

I

Schéma 1

i) současné nebo postupné reakce derivátu trehalózy II:

kde R₅ představuje trimethylsilyl nebo benzyl, s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce III a IV:

R1 ⁿ LG, (III)

R₃ ⁿ lg₂ (iv) kde Ri, R₂, R₃₁ R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku C,C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde X1, X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu a kde a LG₂ představuje nezávisle OH skupinu, halogen nebo nebo zbytek ze skupiny radikálů, které představují LG-*:

0-*

o—»

X*

Ri

N N H

za vzniku derivátu trehalózy V:

(V) kde Rn R₂, R₃₁ R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku C_rC₂₅₁ který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde Xi, X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu a kde R₅ představuje trimethylsilyl nebo benzyl;

Reakce kroku i se provádí při stechiometrickém poměru látek ll:lll od 0,5 do 0,1 při teplotách od 0°C do 120°C v rozmezí od 10 min do 5 dnů, kdy k reakci dochází v roztoku látek II a III v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí za míchání či třepání v homogenní nebo heterogenní fázích v různých poměrech při nízkých i vysokých teplotách v aprotických rozpouštědlech, ve výhodném provedení v halogenovaných polárních i nepolárních rozpouštědlech, kterými mohou být hexan, toluen, benzen, heptan, petrolerther, cyklohexan, dichloromethan, chloroform, teterachlormethan, dichloroethan, terachloroethylen, dioxan, tetrahydrofuran, acetonitril, aceton, ethylacetát, diethylether, terc-butylmethylether, 1,2-dimethoxyethan, dimethoxymethan, Λ/,/V-dimethylformamid, pyridin, triethylamin, ethyldiisopropylamin a jejich směsí.

Ve výhodném provedení se působí na látku II roztokem látky III kde LG je OH skupina za přítomnosti dehydratačních a aktivačních činidel, kterými mohou být karbodiimidy, uroniové a fosfoniové soli (DIC (diisopropylkarbodiimid), EDCI (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid volný nebo jako HCI sůl), TCTLI ((O-(6-chloro-1 -hydroxybenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborát)), HOAT (3-hydroxytriazolo[4,5-bJpyridine), HOBt (benzotriazol-1-ol), PyBOP ((benzotriazol-1 • · yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfát), HATU (1-[bis(dimethylamino)methylen]-1 H-1,2,3 triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorofosfát), oxyma (ethyl kyano(hydroxyimino)acetát)). Reakce probíhá za použití terciární báze, kterou mohou být ethyldiisopropylamin, sym-colidin, DMAP (4-Λ/,Ν dimethylaminopyridin).

V kroku ii, se produkt V (R₅ = trimethylsilyl - TMS) podrobí kyselému zpracování trifluoroctovou kyselinou, CF₃SO₃H nebo iontoměničem v H⁺ cyklu podle schémata 2:

v

Schéma 2

Nebo se produkt V (R₅ = benzyl- Bn) podrobí hydrogenolytickému zpracování např H₂ na 10% Pd na uhlí podle schématu 3:

V

Ri

š OH

Schéma 3

Imunostimulační aktivita

Experimentálním měřením bylo zjištěno že látky obecné struktury I vykazují imunostimulační účinky, které se projevují ve zvýšené aktivaci buněk imunitního systému především v meyloidních diferencovaných buněk (makrofágů, dendritických buněk, žírných buněk /NK buněk/) obecně fagocytózu fagocytujících buněk.

Bylo rovněž prokázán vliv látek obecné struktury I ve složení experimentální vakcíny s BSA antigenem na myšším modelu ve srovnání s LPS (lipopolysacharidem) a TDCM.

Testovány rovněž byly aktivity látek obecné struktury I na produkci cytokinu IL-8, TNF-α a IFN-ý; aktivaci neutrofilů izolovaných z myší krve.

Přežívání myší po intravenózní intraperitoneální intoxikaci Escheríchia Colli myší kmenu BALB/c v profylaktickém i terapeutickém modelu (časování 1, 3 den po infekci a -7, -1 před infekcí) kdy bylo dosaženo 95% procentního přežívání oproti kontrolám.

Studován byl rovněž vliv látek obecné struktury I na tvorbu sekundárních plicních metastáz nádorového modelu melanomu (B16-F0) u myší (C57BL/6).

Literatura [1] Bloch, H. J. Exp. Med. 1950, 91,197 - 218.

[2] Bloch, Η.; Noll, H. J. Biol. Chem. 1955, 214, 251 - 265.

[3] Noll, H.; Bloch, H.; Asselineau, J.; Lederer, E. Biochim. Biophys. Acta 1956, 20, 299 - 309.

[4] Barry, C. E.; Lee, R. E.; Mdluli, K.; Sampson, A. E.; Schroeder, B. G.; Slayden, R. A.; Yuan, Y. Prog. Lipid. Res. 1998, 37,143-173.

[5] Hořejší, V.; Bartůňková, J.; Brdička, T.; Špíšek, R. Základy imunologie, 5. vydání; TRITON. Praha, 2013. ISBN 978-80-7387-713-2.

[6} Leo, O.; Cunningham, A.; Stem, P. L. Perspectives in Vaccinology 2011, 1, 25 - 59.

[7] Gracon, N.; Leroux-Roels, G.; Cheng W. Perspectives in Vaccinology 2011, 1, 89 - 113.

[8] Bekierkunst, A.; Levij, I. S.; Yarkoni, E. Science, 1971, 174,1240-1242.

[9] Furukawa, M.; Ohtsubo, Y.; Sugimoto, N.; Katoh, Y.; Dohi, Y. FEMS Microbiol. Immunol. 1990, 2, 83 - 88.

[10] Numata, F.; Nishimura, K.; Ishida, H.; Ukei, S.; Tone, Y.; Ishihara, C.; Saiki, I.; Sekikawa, I.; Azuma, I. Chem. Pharm. Bull 1985, 33, 4544 - 4555.

[11] loneda, T.; Lenz, M.; Pudles: J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1963,13, 110 [12] Hirofumi Yamamoto, Mugio Nishizawa; J. Med. Chem. 2013, 56, 381-385

• · ·

Příklady provedení

Předmět vynálezu je doložen příklady provedení, aniž se tím jakkoli omezuje.

Příklad 1

4.3.7. Obecný postup pro syntézu 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'- di-O-acyl-a,ď-Dtrehalóz z příslušných kyselin

Příslušná kyselina (1,61 mmol; 2,5 ekv.), 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-a,a'- D-trehalóza (500 mg; 645 pmol; 1 ekv.), /V-(3-dimethylaminopropyl)-A/'- ethylkarbodiimid hydrochlorid (EDCI) (495 mg;

2,58 mmol; 4 ekv.) a 4-(dimethylamino)pyridin (DMAP) (64,5 mg; 63,5 pmol; 1 ekv.) byly suspendovány v bezvodém toluenu (10 ml). Reakční směs byla míchána při 70°C a po detekci plné konverze pomocí TLC (2 dny) bylo rozpouštědlo podařeno na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v dichlormethanu (10 ml), odpařen na rotační vakuové odparce společně se silikagelem (2 g) a čištěn pomocí sloupcové chromatografie.

Příklad 2

2,2',3,3',4,4'-Hexa-0-trimethylsilyl-6,6'-bis-0(16-ethyloktadekanoyl)-a,a'-D-trehalóza (7a)

Látka 7a byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-ethyloktadekanové (4a) (547 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 831 mg (94 %); bezbarvý olej; C70H146O13SÍ6 [1364,41 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,84 (t, J= 7,3 Hz, 12H);

1,11 - 1,36 (m, 58H); 1,53 - 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J = 1,9; 7,5 Hz, 4H); 3,41 - 3,52 (m, 4H); 3,91 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,96 -4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C

NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 10,91; 24,79; 25,43; 26,77; 29,16; 29,31; 29,48; 29,62; 29,65; 29,68; 29,70; 29,71; 29,73; 30,15; 32,75; 34,14; 36,53; 40,36; 63,28; 70,71; 71,91; 72,64;

73,46; 94,36; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C70H146O13Si6Na: 1386,9; nalezeno: 1387,1; TLC Rf = 0,45 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 3

2,2 ,3,3',4,4 -Hexa-O-trimethylsilyl-6,6 -bis-O(16-propylnonadekanoyl)-o,o - D-trehalóza (7b)

Látka 7b byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-propylnonadekanové (4b) (592 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 —> 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 871 mg (95 %); bezbarvý olej; C74H154O13SÍ6 [1420,52 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,88 (t, J= 7,0 Hz, 12H); 1,13-1,36 (m, 66H); 1,54-1,70 (m, 4H); 2,35 (dt, J= 2,1; 7,6 Hz, 4H); 3,40-3,53 (m, 4H); 3,91 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,96-4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 2,0; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 14,18; 23,17; 24,79; 26,71; 28,87; 29,16; 29,32; 29,49; 29,64; 29,67; 29,71; 29,72; 30,17; 33,38; 33,70; 34,14; 37,34; 63,28; 70,71; 71,91; 72,63; 73,46; 94,37; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C74H154Ol3Si6Na: 1443,0; nalezeno: 1442,8; TLC Rf = 0,45 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

• ·

Příklad 4

Látka 7c byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-butylikosanové (4c) (638 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -* 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje. Výtěžek: 777 mg (82 %); bezbarvý olej; C78H162O13SÍ6 [1476,63 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,90 (t, J= 6,9 Hz, 12H); 1,12-1,41 (m, 72H); 1,55 - 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J= 2,1; 7,6 Hz, 4H); 3,41 -3,54 (m, 4H); 3,91 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,97 - 4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,7 Hz, 2H); 4,93 (d, J = 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,16; 0,87; 1,05; 14,54; 19,80; 24,79; 26,68; 29,16; 29,32; 29,48; 29,63; 29,66; 29,69; 29,72; 30,17; 33,67; 34,14; 36,10; 36,94; 63,27; 70,72; 71,91; 72,63; 73,46; 94,36;

173,71 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C78H162O13Si6Na: 1498,1; nalezeno: 1493,3; TLC Rf = 0,47 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 5

2,2',3,3',4,4'-Hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-bis-O-(16-hexyldokosanoyl)-a,a'-D-tnehalóza (7d)

Látka 7d byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 16-hexyldokosanové (4d) (684 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -► 95/5). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 736 mg (72 %); bezbarvý olej; C86H178O13SÍ6 [1588,84 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,14 (s, 18H); 0,14 (s, 18H); 0,16 (s, 18H); 0,89 (t, 7,0 Hz, 12H);

1,00-1,40 (m, 90H); 1,53 - 1,71 (m, 4H); 2,35 (dt, J= 2,1; 7,5 Hz, 4H); 3,39 - 3,54 (m, 4H); 3,91 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,96 -4,11 (m, 4H); 4,28 (dd, J= 1,8; 11,4 Hz, 2H); 4,93 (d, J= 3,2 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,17; 0,88; 1,06; 14,13; 22,72; 24,80; 26,67; 26,71,29,18; 29,33; 29,50; 29,65; 29,69; 29,73; 29,84; 30,17; 31,97; 33,71; 34,15; 37,40; 63,29; 70,73; 71,92; 72,64; 73,47;

94,37; 173,72 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C86H178O13Si6Na: 1610,2; nalezeno: 1410,6; TLC Rf = 0,51 (cyklohexan/ethylacetát = 95/5, CAM).

Příklad 6

2,2',3,3',4,4'-Hexa-0-trimethylsilyl-6,6'-bis-0-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-o,cr'- D-trehalóza (8a)

» ·

Látka 8a byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(hexadecyloxy)octové (6a) (483 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -* 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 832 mg (96 %); bezbarvý olej; C66H138O15SÍ6 [1340,31 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13-0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,11 -

1,42 (m, 52H); 1,55 - 1,68 (m, 4H); 3,39 - 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,96 - 4,06 (m, 2H); 4,08 - 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J = 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J = 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,12; 0,82; 1,00; 14,08; 22,66; 25,99; 29,33; 29,46; 29,55; 29,59; 29,63; 29,67; 31,90; 63,60; 68,07; 70,62; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C66H138O15Si6Na: 1361,9; nalezeno: 1362,9; TLC Rf = 0,20 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM).

Příklad 7

2,2',3,3',4,4'-Hexa-Otrimethylsilyl-6,6'-bis-0-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,ď-D-trehalóza (8b)

8b

Látka 8b byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(heptadecyloxy)octové (6b) (506 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 ->· 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 858 mg (97 %); bezbarvý olej; C68H142O15SÍ6 [1368,36 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,12 -0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,13-

1,41 (m, 56H); 1,53 - 1,67 (m, 4H); 3,37 - 3,58 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,8 Hz, 2H); 3,94 - 4,07 (m, 2H); 4,06-4,18 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,1; 11,8 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 3,0 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,13; 0,81; 1,02; 14,10; 22,67; 26,00; 29,33; 29,46; 29,57; 29,61; 29,63; 29,68; 31,91;

63,60; 68,08; 70,62; 71,74; 72,58; 73,34; 94,34; 170,59 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C68H142O15Si6Na: 1389,9; nalezeno: 1391,1; TLC Rf = 0,20 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM).

• ·

···

Příklad 8

8c

Látka 8c byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(oktadecyloxy)octové (6c) (528 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 873 mg (97 %); bezbarvé krystaly; C70H146O15SÍ6 [1396,41 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13-0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, 6,9 Hz, 6H); 1,12-

1,41 (m, 60H); 1,54 - 1,67 (m, 4H); 3,38 - 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,95 - 4,05 (m, 2H); 4,08 - 4,21 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,1; 11,5 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,6 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,14; 0,81; 1,01; 14,09; 22,68; 25,99; 29,31; 29,48; 29,56; 29,57; 29,65; 29,68; 31,91; 63,60; 68,07; 70,63; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C70H146O15Si6Na: 1417,9; nalezeno: 1417,4; TLC Rf = 0,22 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 38,7-39,8 ’C.

Příklad 9

8d

Látka 8d byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(nonadecyloxy)octové (6d) (550 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 902 mg (98 %); bezbarvé krystaly; C72H150O15SÍ6 [1424,47 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13-0,14 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J= 6,4 Hz, 6H); 1,09-

1,42 (m, 64H); 1,54 - 1,68 (m, 4H); 3,39 - 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,97 - 4,06 (m, 2H); 4,07 - 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J = 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J = 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,14; 0,83; 1,01; 14,09; 22,67; 25,99; 29,33; 29,48; 29,55; 29,59; 29,64; 29,67; 31,91;

63,61; 68,08; 70,62; 71,75; 72,58; 73,35; 94,34; 170,49 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C72H150O15Si6Na: 1446,0; nalezeno: 1447,2; TLC Rf = 0,23 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 46,0-46,7 Ό.

Příklad 10

Látka 8e byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(ikosyloxy)octové (6e) (573 mg; 1,61 mmol; 1 ekv,). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů. Výtěžek: 902 mg (96 %); bezbarvé krystaly; C74H154O15SÍ6 [1452,52 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13-0,15 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J= 6,6 Hz, 6H); 1,13-

1,41 (m, 68H); 1,54 - 1,67 (m, 4H); 3,41 - 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, J= 8,9 Hz, 2H); 3,96 - 4,06 (m, 2H); 4,07-4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,8 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,8 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,14; 0,85; 1,02; 14,10; 22,68; 26,02; 29,36; 29,49; 29,57; 29,61; 29,62; 29,66; 29,70;

31,92; 63,62; 68,10; 70,63; 71,76; 72,59; 73,35; 94,35; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C74H154O15Si6Na: 1474,0; nalezeno: 1474,2; TLC Rf = 0,24 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM); B.t. 47,0-48,1 ’C.

Příklad 11

2,2',3,3',4,4'-Hexa-0-trimethylsilyl-6,6'-bis-0-(2-(henikosyloxy)acetyl)-a,o'- D-trehalóza (8f)

Látka 8f byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(henikosyloxy)octové (6f) (596 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 893 mg (94 %); bezbarvé krystaly; C76H158O15SÍ6 [1480,57 g/mol]

IH NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13-0,15 (m, 36H); 0,16 (s, 18H); 0,90 (t, J= 6,8 Hz, 6H); 1,14-

1,42 (m, 72H); 1,53 - 1,65 (m, 4H); 3,39 - 3,55 (m, 8H); 3,90 (t, J = 8,9 Hz, 2H); 3,98 - 4,06 (m, 2H); 4,07-4,21 (m, 6H); 4,34 (dd, 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,14; 0,83; 1,01; 14,09; 22,67; 26,00; 29,34; 29,49; 29,57; 29,59; 29,62; 29,65; 29,68; 31,91; 63,62; 68,09; 70,63; 71,76; 72,59; 73,36; 94,37; 170,49 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C76H158O15Si6Na: 1502,0; nalezeno: 1503,2; TLC Rf = 0,26 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM);B.t. 53,9-54,5 Ό.

Příklad 12

2,2', 3,3',4,4'-Hexa-Otrimethylsilyl-6,6'-bis-0-(2-(dokosyloxy)acetyl)-cr, a -D-trehalóza (8g) • 9

8g

Látka 8g byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(dokosyloxy)octové (6g) (618 mg; 1,61 mmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok: cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -»· 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 870 mg (89 %); bezbarvé krystaly; C78H162O15SÍ6 [1508,62 g/mol]

1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ = 0,13 - 0,15 (m, 36H); 0,15 (s, 18H); 0,89 (t, J = 6,7 Hz, 6H); 1,17-

1,42 (m, 76H); 1,55 - 1,68 (m, 4H); 3,40 - 3,57 (m, 8H); 3,90 (t, 8,9 Hz, 2H); 3,97 - 4,06 (m, 2H);

4,07 - 4,20 (m, 6H); 4,34 (dd, J= 2,2; 11,9 Hz, 2H); 4,90 (d, J= 2,9 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ = 0,15; 0,84; 1,02; 14,10; 22,68; 26,01; 29,35; 29,49; 29,57; 29,60; 29,62; 29,65; 29,69; 31,92; 63,62; 68,09; 70,63; 71,76; 72,59; 73,36; 94,37; 170,50 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C78H162O15Si6Na: 1530,0; nalezeno: 1531,3; TLC Rf = 0,27 (cyklohexan/ethylacetát = 90/10, CAM);B.t. 57,7-58,1 ’C.

Příklad 13

4.3.8 Obecný postup pro syntézu 6,6'-di-O-acyl-a,a'-D-trehalóz z příslušných 2,2',3,3',4,4'hexa- O-trimethylsilyl-6,6'-di- O-acyl-cr, σ'-D-trehalóz

K roztoku příslušné 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'-di-O-acyl-a,a'-D-trehalóza (499 pmol; 1 ekv.) ve směsi dichlormethan/methanol (4/1; 10 ml) byl přidán Dowex® 50W X8 (Sigma Aldrich) (250 mg). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě. Po detekci plné konverze pomocí TLC (2 hodiny) byla reakční směs zfiltrována. Při vzniku sraženiny v průběhu reakce byla reakční směs před filtrací naředěna tetrahydrofuranem (10 ml). Filtrát byl odpařen na vakuové rotační odparce a surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie.

Příklad 14

6,6'-Bis-O-(16-ethyloktadekanoyl)-a,a'-D-trehalóza (10a)

Látka 10a byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-Otrimethylsilyl-6,6'bis-O-(16-ethyloktadekanoyl)-a,a'-D-trehalózy (7a) (681 mg; 499 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -»82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 324 mg (70 %); lyofilizát; C52H98O13 [931,33 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,86 (t, J= 7,3 Hz, 12H); 1,11 - 1,42 (m, 58H); 1,64 (tt, J= 7,0 Hz, 4H); 2,34 (t, 7,3 Hz, 4H); 4,18 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,32 (dd, J = 3,5; 9,5 Hz, 2H); 4,76 (t, J= 9,0 Hz,

2H); 4,84 (dd, J= 5,5; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (d, J= 11,0 Hz, 2H); 5,11 (dd, J= 4,4; 10,3 Hz, 2H); 5,90 (d,

3,2 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 11,58; 25,78; 26,18; 27,57; 29,88; 30,09; 30,28; 30,43; 30,48; 30,55; 30,95; 33,53; 34,92; 41,05; 64,85; 72,05; 72,49; 73,85; 75,34; 96,29; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C52H98NaO13: 953,7; nalezeno: 954,4; TLC Rf = 0,40 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM).

Příklad 15

6,6'-Bis-0-(16-propylnonadekanoyl)-a,cr'-D-trehalóza (10b)

Látka 10b byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(16-propylnonadekanoyl)-a,a'-D-trehalózy (7b) (717 mg; 505 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v

1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilízován.

Výtěžek: 430 mg (86 %); lyofilizát; C56H106013 [987,43 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,92 (t, 6,9 Hz, 12H); 1,13-1,41 (m, 66H); 1,64 (tt, J = 7,0 Hz,

4H); 2,34 (dt, J=1,5; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J= 9,4 Hz, 2H); 4,33 (dd, J= 3,8; 9,4 Hz, 2H); 4,76 (t, J =

9,2 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (d, J= 11,1 Hz, 2H); 5,11 (dd, J= 4,4; 10,3 Hz, 2H);

5,90 (d, J= 3,8 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 15,25; 20,57; 25,78; 27,48; 29,88; 30,09; 30,27; 30,44; 30,48; 30,52; 30,54; 30,55; 30,99; 34,44; 34,91; 36,81; 37,68; 64,84; 72,05;

72,49; 73,85; 75,34; 96,29; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C56H106NaO13: 1009,8; nalezeno: 1010,5; TLC Rf = 0,27 (dichlormethan/methanol = 90/10, CAM).

Příklad 16

Látka 10c byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(16-butylikosanoyl)-o,o'-D-trehalózy (7c) (623 mg; 422 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -+ 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován. Výtěžek: 371 mg (84 %); lyofilizát; C60H114013 [1043,54 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,93 (t, J= 6,8 Hz, 12H); 1,12- 1,41 (m, 74H); 1,64 (tt, J= 7,1 Hz, 4H); 2,34 (dt, J=1,7; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J= 9,4 Hz, 2H); 4,33 (dd, J= 3,8; 9,4 Hz, 2H); 4,77 (t,

9,2 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (dd, 1,2; 11,5 Hz, 2H); 5,07 - 5,15 (m, 2H); 5,91 (d, J= 3,6 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,87; 23,97; 25,78; 27,54; 29,72; 29,88; 30,09; 30,28; 30,44; 30,49; 30,53; 30,55; 30,56; 31,00; 34,17; 34,50; 34,91; 38,14; 64,84; 72,05; 72,50; 73,86; 75,35; 96,30; 174,12 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C60H114NaO13: 1065,8; nalezeno: 1066,6; TLC Rf = 0,34 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM).

• · · · ·

Příklad 17

6,6'-Bis-O-(16-hexyldokosanoyl)-a,cr'-D-trehalóza (1 Od)

6.6'-Bís-€>-(16-bexyldokosaBoyQ-<^a^r-D-trebalóza (lOd)

OH O

HO

O

HO¹

o

lOd

Látka 10d byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0(16-hexyldokosanoyl)-a,a'-D-trehalózy (7d) (582 mg; 366 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Čistý produkt byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (2 ml), převeden do vialky a roztok byl lyofilizován.

Výtěžek: 232 mg (55 %); lyofilizát; C68H130O13 [1155,75 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,93 (t, J= 6,8 Hz, 12H); 1,12-1,40 (m, 90H); 1,64 (tt, J= 7,3;

7,5 Hz, 4H); 2,34 (dt, J=1,5; 7,5 Hz, 4H); 4,19 (t, J = 9,4 Hz, 2H); 4,32 (dd, J= 3,7; 9,7 Hz, 2H); 4,77 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,84 (dd, J= 5,3; 11,7 Hz, 2H); 5,02 (dd, J= 1,9; 11,7 Hz, 2H); 5,07-5,15 (m, 2H); 5,91 (d, J= 3,6 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,82; 23,50; 25,79; 27,51; 27,56; 29,90; 30,11; 30,30; 30,47; 30,52; 30,58; 30,63; 31,03; 32,71; 34,53; 34,92; 38,23; 64,84;

72,06; 72,50; 73,86; 75,35; 96,28; 174,11 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C68H130NaO13: 1177,9; nalezeno: 1178,8; TLC Rf - 0,41 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM).

Příklad 18

6,6'-Bis-O-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-a,cr'-D-trehalóza (11a)

11a

Látka 11a byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-Otrimethylsilyl-6,6'bis-0-(2-(hexadecyloxy)acetyl)-o,a'-D-trehalózy (8a) (724 mg;

540 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -» 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů. Výtěžek: 428 mg (87 %); bezbarvé krystaly; C48H90O15 [907,22 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyrídin-d5) δ = 0,88 (t, J= 6,6 Hz, 6H); 1,20- 1,43 (m, 52H); 1,62 (tt, J= 7,0 Hz, 4H); 3,56 (t, J=6,5 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,4 Hz, 2H); 4,22 (d, J= 3,2 Hz, 4H); 4,26-4,34 (m, 2H);

4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,6; 11,8 Hz, 2H); 5,01 - 5,15 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,6 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,78; 23,43; 26,87; 30,11; 30,26; 30,42; 30,49; 30,56; 32,62; 65,12; 68,93; 71,96; 72,28; 72,42; 73,79; 75,31; 96,45; 174,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C48H90NaO13:929,6; nalezeno: 930,4; TLC Rf = 0,34 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 142,6-143,5 °C.

Příklad 19

6,6'-Bis-O-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,cr-D-trehalóza (11b)

Látka 11b byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(2-(heptadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8b) (730 mg; 534 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 —> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

• · · · «

• ·· · • ·· • ·· · · • · ·· • · ·· • ·· · • · • · · • · • · • ·

Výtěžek: 410 mg (82 %); bezbarvé krystaly; C50H94O15 [935,27 g/mol]

IH NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, J= 7,0 Hz, 6H); 1,13 - 1,43 (m, 56H), 1,54 -1,69 (m, 4H);

3,55 (t, J= 6,5 Hz, 4H); 4,10 - 4,25 (m, 6H); 4,30 (dd, J= 3,6: 9,4 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H);

4,86 (dd, J= 5,0; 11,2 Hz, 2H); 4,99 - 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,4 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,79; 23,45; 26,89; 30,12; 30,27; 30,44; 30,51; 39,57; 32,63; 65,10; 68,92; 71,95; 72,27; 72,41; 73,77; 75,29; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C50H94NaO15: 957,7; nalezeno: 958,4; TLC Rf = 0,35 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 140,2 -140,8 ’C.

Příklad 20

6,6'-Bis-O-(2-(oktadecyloxy)acetyl)-a,ď-D-trehalóza (11c)

11c

Látka 11c byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(oktadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8c) (767 mg; 549 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 —► 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 435 mg (82 %); bezbarvé krystaly; C52H98O15 [963,33 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, J= 6,6 Hz, 6H); 1,11 - 1,46 (m, 60H), 1,54-1,67 (m, 4H);

3,55 (t, J= 6,2 Hz, 4H); 4,08 - 4,25 (m, 6H); 4,29 (dd, 3,4; 9,6 Hz, 2H); 4,75 (t, J = 9,2 Hz, 2H);

4,86 (dd, J = 5,1; 11,3 Hz, 2H); 4,99 - 5,17 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,2 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,80; 23,46; 26,88; 30,13; 30,28; 30,44; 30,51; 32,63; 65,10; 68,92; 71,95; 72,27; 72,41; 73,78; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C52H98NaO15: 985,7; nalezeno: 986,4; TLC Rf = 0,40 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 139,0 -139,8 'C.

Příklad 21

6,6'-Bis-0-(2-(nonadecyloxy)acetyl)-a,o'-D-trehalóza(11d)

• · ·

• ·

lid

Látka 11 d byla připravena podle obecného postupu 4,3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(2-(nonadecyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8d) (810 mg; 569 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -> 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 495 mg (88 %); bezbarvé krystaly; C54H102O15 [991,38 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, 7,0 Hz, 6H); 1,16 - 1,44 (m, 64H), 1,54-1,68 (m, 4H);

3,56 (t, 6,3 Hz, 4H); 4,09 - 4,25 (m, 6H); 4,30 (dd, J= 3,6; 9,4 Hz, 2H); 4,75 (t, J= 9,0 Hz, 2H);

4,86 (dd, J = 4,7; 11,1 Hz, 2H); 5,00-5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J = 3,0 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,79; 23,45; 26,89; 30,12; 30,28; 30,44; 30,52; 30,57; 32,63; 65,11; 68,92; 71,96; 72,28; 72,41; 73,78; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C54H102NaO15: 1013,7; nalezeno: 1014,5; TLC Rf = 0,48 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 137,8 - 138,6 'C.

Příklad 22

_oA/°

Ile

Látka 11e byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-O-(2-(ikosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8e) (840 mg; 578 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl

čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 395 mg (67 %); bezbarvé krystaly; C56H106015 {1019,43 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, J= 5,9 Hz, 6H); 1,17-1,44 (m, 68H), 1,54-1,68 (m, 4H);

3,56 (t, J= 6,3 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,8 Hz, 2H); 4,22 (d, 2,5 Hz, 4H); 4,30 (dd, J= 3,2; 8,9 Hz,

2H); 4,74 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,86 (dd, 5,3; 11,5 Hz, 2H); 5,00-5,17 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,2 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,80; 23,46; 26,89; 30,13; 30,28; 30,44; 30,46; 30,53; 30,58; 32,63; 65,10; 68,93; 71,96; 72,28; 72,41; 73,79; 75,31; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C56H106NaO15:1041,7; nalezeno: 1042,6; TLC Rf = 0,48 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 135,0- 136,3 ’C.

Příklad 23

llf

Látka 11f byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(2-(herrikosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8f) (874 mg; 591 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -»82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 539 mg (87 %); bezbarvé krystaly; C58H110015 [1047,48 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,17-1,44 (m, 72H), 1,54 - 1,69 (m, 4H);

3,56 (t, J= 6,4 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,2 Hz, 2H); 4,22 (d, 3,0 Hz, 4H); 4,30 (dd, J = 3,2; 8,9 Hz,

2H); 4,74 (t, J= 9,1 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 4,9; 11,3 Hz, 2H); 5,01 - 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,4 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,80; 23,46; 26,90; 30,13; 30,28; 30,44; 30,53; 32,63; 65,10; 68,92; 71,96; 72,28; 72,42; 73,79; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C58H110NaO15:1069,8; nalezeno: 1070,7; TLC Rf = 0,50 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM); B.t. 133,8-135,1 ’C.

Příklad 24

6,6'-Bis-O-(2-(dokosyloxy)acetyl)-a,ď-D-trehalóza (11g) • · · · • · • ···· · ···· • ·· ··· ·· ·· ···· ···· ·· ·· · · · ·

lig

Látka 11 g byla připravena podle obecného postupu 4.3.8 z 2,2',3,3',4,4'-hexa-O-trimethylsilyl-6,6'bis-0-(2-(dokosyloxy)acetyl)-a,a'-D-trehalózy (8g) (770 mg; 511 pmol; 1 ekv.). Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (12 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 -» 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 523 mg (95 %); bezbarvé krystaly; C60H114015 [1075,54 g/mol]

1H NMR (300 MHz, pyridin-d5) δ = 0,88 (t, J= 6,4 Hz, 6H); 1,15 - 1,44 (m, 76H), 1,54 - 1,69 (m, 4H);

3,56 (t, J= 6,5 Hz, 4H); 4,16 (t, J= 9,5 Hz, 2H); 4,22 (d, J= 2,6 Hz, 4H); 4,30 (dd, J= 3,1; 9,1 Hz, 2H); 4,74 (t, J= 9,0 Hz, 2H); 4,86 (dd, J= 5,3; 11,3 Hz, 2H); 4,99- 5,16 (m, 4H); 5,87 (d, J= 3,4 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, pyridin-d5) δ = 14,80; 23,46; 26,89; 30,13; 30,28; 30,44; 30,53; 32,64; 65,11; 68,92; 71,96; 72,27; 72,41; 73,79; 75,30; 96,44; 171,48 ppm; MS (ESI) m/z vypočteno (M + Na)+ C60H114NaO15:1097,8; nalezeno: 1098,7; TLC Rf = 0,50 (dichlormethan/methanol = 85/15, CAM). B.t. 136,5-138,2 Ό.

Příklad 25

2,2',3,3',4,4'-Hexa-0-benzyl-6,6'-bis-0-(2-((16-ethyloktadecyl)oxy)acetate))-a,a'-D-trehalóza

Látka 8d byla připravena podle obecného postupu 4.3.7 z kyseliny 2-(16-ethyloktadecyl)oxy)octové (23k) (1,61 mmol; 1 ekv.) a hexabenzyltrehalózy. Surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (20 g SiO2; eluční roztok; cyklohexan/ethylacetát = 100/0 -> 93/7). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: 902 mg (92 %); bezbarvé krystaly; C98H142O15 [1560,17 g/mol] • · • · • ·

Příklad 26

6,6'-bis-O-(2-((16-ethyloktadecyl)oxy)acetate))-a,a'-D-trehalóza

18k

K roztoku příslušné 2_!2',3,3',4,4'-ΙτθΧ3-0·όθηζγΙ-6,6'-άί-θ3ογΙ-σ₎σ'-0-ίΓβή3ΐόζχ 17k (500mg) ve směsi dichlormethan/tetrahydrofuran (4/2; 10 ml) bylo přidáno 300 mg 10% Pd/C (Aldrich, sušeného ve vakuu pod Ar). Reakční směs byla míchána pň laboratorní teplotě 2 dny v atmosféře vodíku za laboratorní teploty a tlaku 1 atm.. Po detekci plné konverze pomocí byla reakční směs zfiltrována. Filtrát byl odpařen na vakuové rotační odparce a surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie (16 g SiO2; eluční roztok: dichlormethan/methanol = 100/0 82/18). Produkt byl izolován ve formě bezbarvých krystalů.

Výtěžek: (89 %); bezbarvé krystaly; C56H106O15 [1019,43 g/mol]

Příklad 27

Imunostimulační aktivita

Testovány rovněž byly aktivity látek obecné struktury I na produkci cytokinu IL-8, TNF-α a IFN-y; aktivaci neutrofilů izolovaných z myší krve.

Přežívání myší po intravenózní intraperitoneální intoxikaci Escherichia Colli myší kmenu BALB/c v profylaktickém i terapeutickém modelu (časování 1, 3 den po infekci a -7, -1 před infekcí) kdy bylo • ·

dosaženo 95% procentního přežívání oproti kontrolám.

Průmyslová využitelnost

Uvedenou metodologii přípravy použít pro syntézu látek v laboratorním i průmyslovém měřítku. Látky připravené podle vynálezu lze použít v základním výzkumu, ve farmaceutickém průmyslu.

1. Trehalózové sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I:

Claims

kde Ri, R₂, R₃, R4 představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci-C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde Χ_Ί, X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu.
2. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I:

(I) kde Ri, R₂, R₃, R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci-C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde Xi, X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu, kdy tento způsob zahrnuje kroky:

i) současné nebo postupné reakce derivátu trehalózy II:

kde R₅ představuje trimethylsilyl nebo benzyl, • · • · · · • · · • · · • · s karbonylovou sloučeninou obecného vzorce lil a IV:

(IV) kde Ri, R₂, R₃, R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci-C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde X_n X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu a kde LG₁ a LG₂představuje nezávisle OH skupinu, halogen nebo nebo zbytek ze skupiny radikálů, které představují LG-*:

F za vzniku derivátu trehalózy V:

(V) kde R,, R₂, R₃, R₄ představují nezávisle vodík, nebo uhlovodíkový zbytek o počtu atomů uhlíku Ci-C₂₅, který je lineární nebo rozvětvený a nebo cyklický, kde n, n' nabývá nezávisle hodnot od 0 do 25, kde Χ_Ί, X₂ představuje nezávisle kyslík, nebo CH₂ skupinu a kde R₅ představuje trimethylsilyl nebo benzyl;

ii) krok následného deprotekce derivátu V provedeném ostraněním chráních skupin R₅ pomocí hydrolýzy nebo redukce.
3. Způsob přípravy podle nároku 2, se vyznačuje tím, že se reakce kroku i provede při stechiometrickém poměru látek 11:111 od 0,5 do 0,1 při teplotách od 0°C do 120°C v rozmezí od 10 min do 5 dnů, kdy k reakci dochází v roztoku látek II a III v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí za míchání či třepání v homogenní nebo heterogenní fázích v různých poměrech při nízkých i vysokých teplotách.
4. Způsob přípravy podle nároku 2, se vyznačuje tím, že se reakce kroku i provede v aprotických rozpouštědlech, ve výhodném provedení v halogenovaných polárních i nepolárních rozpouštědlech, kterými mohou být hexan, toluen, benzen, heptan, petrolerther, cykiohexan, dichloromethan, chloroform, teterachlormethan, dichloroethan, terachloroethylen, dioxan, tetrahydrofuran, acetonitril, aceton, ethylacetát, diethylether, terc-butylmethylether, 1,2-dimethoxyethan, dimethoxymethan, Λ/,/V-dimethylformamid, pyridin, triethylamin, ethyldiisopropylamin a jejich směsí.
5. Způsob podle nároku 2 v kroku i, se vyznačuje tím, že se ve výhodném provedení se působí na látku II roztokem látky III kde LG je OH skupina za přítomnosti dehydratačních a aktivačních činidel, kterými mohou být karbodiimidy, uraniové a fosfoniové soli (DIC (diisopropylkarbodiimid), EDCI (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid volný nebo jako HCI sůl), TCTU ((O-(6-chloro-1-hydroxybenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborát)), HOAT (3-hydroxytriazolo[4,5-b]pyridine), HOBt (benzotriazol-1-ol), PyBOP ((benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfát), HATU (1[bis(dimethylamino)methylen]-1 H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorofosfát), oxyma (ethyl kyano(hydroxyimino)acetát)). Reakce probíhá za použití terciární báze, kterou mohou být ethyldiisopropylamin, sym-colidin, DMAP (4-N,/V-dimethylaminopyridin).
6. Způsob podle nároku 2 v kroku ii, se vyznačuje tím, že produkt V podrobí kyselému zpracování trifluoroctovou kyselinou, CF₃SO₃H nebo iontoměničem v H⁺ cyklu.
7. Imunostimulační účinky trehalózových sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1.
8. Imunostimulační účinky trehalózových sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 stimulující fagocytózu fagocytů.
9. Imunostimulační účinky trehalózových sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 stimulující aktivitu makrofágů a dendritických buněk.
10. Způsob indukující cytokin, vyznačující se tím, že cytokin je vybrán ze skupiny sestávající z IL8, TNF-α a IFN-y; aktivaci neutrofilů; aktivace fagocytózu fagocytujících buněk; neutralizaci bakteriálního toxinu; prevenci nebo léčbu bakteriální infekční choroby, nebo prevenci nebo léčbu rakoviny, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny reprezentované obecného vzorce I podle nároku 1.
11. Způsob imunostimulačni; aktivace makrofágů; aktivace neutrofilů; aktivace dendritických buněk, aktivace NK buňek, aktivace fagocytózu fagocytujících buněk; neutralizaci bakteriálního toxinu; nebo prevenci nebo léčení infekčního onemocnění nebo rakoviny u savce, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny reprezentované obecným vzorcem I podle nároku 1.