CZ130398A3

CZ130398A3 - Lipofilní analogy N-acetyl-normuramoyl-L-alfa-aminobutanoyl-D-isoglutaminu s imunostimulační aktivitou

Info

Publication number: CZ130398A3
Application number: CZ981303A
Authority: CZ
Inventors: Miroslav Rndr. Csc. Ledvina; Jan Rndr. Csc. Ježek; Věra Rndr. Hříbalová; Jaroslav Rndr. Turánek
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 1999-11-17
Also published as: CZ296720B6

Description

Oblast techniky

Vynález se týká lipofilních derivátů N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu s imunostimulační aktivitou, t.j. analogů MDP modifikovaných v cukerné a peptidové části molekuly, a způsobu jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Peptidoglykan n = 10 -100; GMDP n = 1

Obr.1

V důsledku negativních změn životního prostředí, narůstajícího významu infekcí poškozujících imunitu (např. AIDS), ale i některých therapeutických postupů, jako je např. rádio- a farmakotherapie nádorových onemocnění, došlo ke značnému nárůstu chorobných stavů charakterisovaných nedostatečnou imunitou. Rovněž ústup od přirozených vakcín a přechod k bezpečnějším semisynthetickým, rekombinantním a synthetickým vakcínám sí vyžádal nová a strukturně definovaná adjuvans. Proto je v posledních letech věnována značná pozornost vývoji látek s imunostimulační aktivitou. Významnými představiteli této skupiny látek jsou muramylové glykopeptidy. Muramyldipeptid (MDP, N-acetyl-muramoyl-Lalanyl-D-isoglutamín; obr.l) je nejmenší strukturní jednotkou peptidoglykanu bakteriální stěny, která si zachovala imunostimulační aktivitu. Tato aktivita spolu s dalšími biologickými účinky vedla ksynthese značného počtu analogů MDP, s cílem zvýšit strukturními změnami specifitu účinku ve zvoleném směru a potlačit nežádoucí vedlejší účinky, zejména pyrogenitu. Tento výzkum poskytl několik analogů MDP, které se staly předmětem zájmu farmaceutického průmyslu (viz obr. 2).(Adam A. et al.: Med. Res. Rev., 4, 111 (1984); Leclerc C. et al.: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 2> 353 (1986); Baschang G.: Tetrahedron 45, 6331 (1989)). Modifikací karboxyterminální oblasti byl získán silně adjuvantní a nepyrogenní analog Murabutid (Bahr GM. et al.: Int. J. Immunopharmacol. 17, 117 (1995); Riveau G. et al.: in: Immunopharmalogy of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvant and Modulators of non-Specific Resistance (JA. Majde, Ed.), str. 213. A.R. Liss, N.Y., 1987; Parant M.A. et al.: in: Microbial Infections: Role of Biological Response Modifiers (H. Friedman and T. Klein, Eds.), str. 179. Plenům Press, N.Y., 1992). Látka byla vyvinuta v Institut Choay, Paris, Francie, úspěšně prošla fází I a Ha klinických zkoušek a je testována zejména na zvyšování nespecifické resistence k infekcím a jako adjuvans v očkovacích látkách. Zavedení lipofilního zbytku do terminální oblasti peptidového řetězce molekuly MDP vedlo k další k potenciaci mechanismů nespecifické resistence vůči bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím a nádorovému bujení. Z této skupiny látek jsou v nejpokročilejším stádiu

44 • · · · • ·· • 4 4

Φ 4 ·

ΦΦΦΦ **

4' ·

Φ ··*·

4ΦΦΦΦ

ΦΦΦ Φ ·*· • 4·ΦΦ 4 ΦΦΦΦ Φ • 4 · '·ΦΦ

ΦΦ Φ ···· vývoje jako potenciální imunotherapeutika studovány muramyltripeptid-fosfatidylethanolamin (MTP-PE) a MDP-Lys-L-18 (Romurtid). Obě látky prošly fází I a II klinických zkoušek. MTP-PE je analog specielně navržený pro jeho in vivo směrování k makrofágům prostřednictvím liposomů. Fosfolipidový charakter lipidické části molekuly je zvlášť vhodný k jejímu zabudování do liposomů konstruovaných z fosfolipidů. Látka je pod označením CGP 19835 A vyvíjena v koncernu Ciba-Geigy, Ltd., Basel, Švýcarsko a hlavními aplikačními směry je therapie a profylaxe nádorových a některých závažných virových onemocnění (Kleinerman E.S. et al.: J. Immunotherapy, 17, 181 (1995); Kleinerman E.S.: J. Clin. Oncology 10, 310 (1992)). Hlavním nežádoucím vedlejším účinkem MTP-PE je jeho poměrně vysoká pyrogenita..(Pro přehled viz: Lopez-Berestein G. , Fidler I.J.; Liposomes in the Therapy of Infectíous Diseases and Cancer, Alan R. Liss, lne., NY 1989). Látka MDP-Lys-L-18 (Romurtid) je vyvíjena v koncernu Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japonsko. Hlavním směrem její praktické aplikace je stimulace nespecifické resistence proti bakteriálním a virovým infekcím u pacientů s nádorem podrobených radiotherapii nebo chemotherapii (Otani T. et al.: Arzneim. Forsch. Drug Res. 35 (II), 969 (1988); Akasaki M.: ibid., str. 976; Akasaki M. et al.: ibid., str. 978). MDP-Lys-L-18 je méně pyrogenní než MDP a úspěšně prošel fází II klinických zkoušek (Azuma I.: Int. J. Immunopharmacol. 14, 487 (1992)). Ve vývoji této firmy jsou též analogy nesoucí objemné lipoíilní skupiny acylového typu na primární OH skupině sacharidového zbytku 6-O-stearoyl-MDP (L18-MDP) a 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl)-MDP (B30-MDP), navržené jako potenciální adjuvans zejména pro buňkami zprostředkovanou imunitu. B30-MDP je ve srovnání s MDP méně pyrogenní a má vyšší imunostimulační aktivitu (Tsujimoto M. et al.: Vaccine 7,39 (1989).

CHaCHCO-L-Ala-D-GIn O(CHá₃CH₃

Murabutid

99.99 ·' · ·* • ·♦ ·· ··

999*··

9

9>

• ····

99

9 «· ♦ 9<9

9'9 9'9 ♦ 9^·

9···

O

0Η₃0Η00-ί-Αΐ3-0-ί8θΘ1π<-Αΐ3ΝΗ-εΗ₂0Η₂Ο-ρ-Ο-έΗ₂

OH

MTP-PE

CH2OOCC15H31

ČHOOCC₁₅H₃1

CH3CHCO-L-Ala-D-ísoGln-L’Lys-OH •-CO(CH2)i₆CH₃

MDP-Lys-L18

CH₃CHCO-L-Ala-D-isoGln

L18-MDP

CH₃CHCO-L-Ala-D-isoGln

B30-MDP

Obr. 2

Podstata vynálezu

Nevýhodou jako imunotherapeutika vyvíjených derivátů MDP s výjimkou Murabutidu je jejich značná pyrogenita. Tuto nevýhodu řeší předmětný vynález, t.j. látky konstruované na bázi Nacetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu, který je ve srovnání s MDP méně pyrogenní amá vyšší adjuvantní aktivitu (Jones G.H. et al.: Ger. Offen. 2718010; Chem. Abstr.: 88, 191481 (1978); Rotta J. et al.: in: Synthetic Immunomodulators and Vaccines, Proč. Int. Symp., October 14-18, 1985, Třeboň, Czechoslovakia (M. Zaoral, O. Mikeš, Z. Havlas and Ž. Procházka, Eds), p. 129. Inst. Org. Chem. Biochem., Czechoslov. Acad. Sci., Prague 1986.).

14	4«	«1	•	• 4 4«
• 4	• 4	i 4	•	4 4 4 ·
•	··	• 4	4 ·	4. 4 44
•	• 4	• 4 4	4444	4 4*4 4 4
φ .	4 4	4 4	4	• 4 4
4444	• 4	44	4	44 ··

Předmětem vynálezu jsou lipofilní deriváty N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoybDisoglutaminu obecného vzorce I,

CH₂CO-L-Abu-D-ísciGln

I kde R je lipofilní acylový zbytek (počet atomů uhlíku C4 až C70), který může být lineární, větvený, cyklický nebo polycyklický, např. palmitoyl, stearoyl, 2-tetradecyldexadekanoyl, adamantylkarbonyl atd, Tyto látky se vyznačují vysokou imunoadjuvantní aktivitou a sníženou, resp. zcela potlačenou pyrogenitou a jsou rovněž vhodné k zabudování do liposomů. Inkorporací do liposomů se nejen zvyšují imunostimulační účinky, ale současně se i snižují případné toxické efekty.

Synthesa látek obecného vzorce I vychází z dobře dostupného benzyl 2-acetamido-2-deoxy4,6-0-isopropyliden-3-0-methoxykarbonylmethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce Π, (Ledvina M. et al.: Collect. Czech. Chem. Commun. 54,2784 (1989)).

CH₂COOCH₃

II

Methylester II se převede na benzyl 2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-isopropyliden-3-Okarboxymethyl-a-D-glukopyranosid vzorce III působením base ve směsi voda - s vodou mísitelné organické rozpouštědlo, s výhodou působením hydroxidu sodného ve směsi voda methanol.

Kondensací látky III s benzylesterem L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu promotovanou s výhodou Ν,Ν’-dicyklohexyIkarbodiimidem a 1-hydroxybenzotriazolem se připraví benzylester »4 44*

4 4 » ·· · ♦ ·· ♦ · · · • · 4 4 4 444444 • 4 · » «·

4W44 44 4«4

N-[2-0-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-4,6-O-isopropyliden-a-D-glukop}Tanosid-3-y!)glykoloylJ-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu vzorce IV.

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl)

IV

Acetalová chránící skupina látky IV se odstraní kyselou hydrolysou, s výhodou působením směsi kyselina octová - voda za zvýšené teploty, za vzniku benzylesteru N-[2-O-(benzyl 2acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu vzorce V.

CH2CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl)

Parciální acylací látky V se získají 6-O-acylderiváty benzylesteru N-[2-O-(benzyl 2acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu obecného vzorce VI, kde R je lipofilní acylový zbytek (počet atomů uhlíku C4 až C70), který může být lineární, větvený, cyklický nebo polycyklický, např. palmitoyl, stearoyl, 2tetradecyldexadekanoyl, adamantylkarbonyl atd. Objemný acylový zbytek na primární OH(6) skupinu látky V se s výhodou zavede její reakcí s karboxylovou kyselinou (např. kyselinou stearovou nebo 2-tetradecylhexadekanovou) v přítomnosti hydrochloridu N-(3dimethylaminopropyl)-N'-ethylkarbodiimidu (WSC) a 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) v N,N-dimethylformamidu.

CH₂CO-l_-Abu-D-isoGln(OBzl)

VI

Hydrogenolytickým odštěpením benzylových chránících skupin z látky V a látek obecného vzorce VI (R je acyl), s výhodou za použití paladiového katalysátoru na uhlí v kyselině octové,

• to	• to	4«	4	·»	44
• to	•	4 · 4		• to	to	♦
4	··	to 4	• ·	• ·	• ·
•	•	• to » ·	totoi 4	• «toto	to	to
. «	to	to to «	to	to	•	v
«•toto	»to	to ·	to	«·	toto

se připraví N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutamin obecného vzorce I (kde R = H) a jeho 6-O-acylderiváty obecného vzorce I (kde R = acyl, např. stearoyl nebo 2tetradecylhexadekanoyl).

Příklady provedení vynálezu » V dalším je předmět vynálezu doložen příklady provedení, aniž se tím jakkoli omezuje

J

Příklad 1

K míchanému roztoku methylesteru II (4.235 g; 10 mmol) v methanolu (60 ml) se přidá 0.5 M NaOH (40 ml; 20 mmol). Po 4 h se směs zneutralizuje přidáním Dowexu 50 v pyridiniové formě. Ionex se odfiltruje, promyje 50% vodným methanolem (3 x 50 ml) a filtrát se vakuově zahustí. Zbytek se opakovaně vakuově zahustí s benzenem (3 x 100 ml) a lyofilizuje se z benzenu. Výtěžek 4.05 g (99%) benzyl 2-acetamido-3-0-karboxymethyl-2-deoxy*4_s6-0isopropyliden-a-D-glukopyranosidu (III), který je při chromatografii na tenké vrstvě na Silikagelu v soustavách ethyl acetát - toluen (2 : 1) a n-butanol - kyselina octová - voda (4:1: 1) chromatograficky jednotný. [cx]d +90° (c 0,6; chloroform). Pro látku III (C20H27NO8) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 409,4; monoisotopická hmotnost 409,1. FABMS: m/z 410,1 [M + H]⁺, 432,1 [M + Na]⁺. Pro C₂oH₂₇N0₈ (409,4) vypočteno: 58,67% C, 6,64% H, 3,42% N; nalezeno: 58,75% C, 6,50% H, 3,57% N.

Příklad 2

Roztok benzyl esteru /er/-butyloxykarbonyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu (4,22 g; 10,0 mmol) ve směsi dichlormethan - kyselina trifluoroctová (1 : 1; 40 ml) se ponechá reagovat při pokojové teplotě 30 min. Potom se směs vakuově zahustí, sirupovitý zbytek se rozetře s diethyletherem (3 x 50 ml) a nerozpustný zbytek se odpaří s dichlormethanem (2 x 50 ml) a závěrečně se vysuší při vakuu 1,32 Pa po dobu 2h za pokojové teploty. Získaný sirup se rozpustí v DMF (20 ml) a vzniklý roztok trifluoracetátu benzyl esteru L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu se ihned použije ke kondenzaci s kyselinou III.

K míchanému roztoku kyseliny III (4,094 g; 10 mmol) a monohydrátu 1-hydroxybenzotriazolu (1,531 g; 10 mmol) ve směsi N,N-dimethylformamidu (10 ml) a dichlormethanu (40 ml) se při 0° C přidá 1M roztok N,N -dicyklohexylkarbodiimidu v dichlormethanu (10 ml; 10 mmol). Po lh při 0° C se odfiltruje vysráženáN,N -dicyklohexylmočovina (2 g; 89%) a filtrát se vakuově zahustí na cca 20 ml. K tomuto roztoku se při 0° C přidá shora uvedený roztok trifluoracetátu benzyl esteru L-oc-aminobutanoyl-D-isoglutaminu a diisopropylethylamin (1,88 ml; 11 mmol) a směs se míchá lh při 0° C a přes noc při pokojové teplotě (pH musí být 7 až 8). Potom se přidá ethylacetát (500 ml) a přes noc vysrážená N,N -dicyklohexylmočovina se odfiltruje. Filtrát se ' ochladí v ledové lázni a extrahuje se nasyceným roztokem hydrogen uhličitanu sodného (3 x 100 ml) a 5% roztokem chloridu sodného (3 x 100 ml), vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje. Filtrát se vakuově zahustí na cca 30 ml a přidá se petrolether (80 ml). Směs se ponechá při + 3° C přes noc. Získaný krystalický produkt (6,46 g) se rekrystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru. Výtěžek 4,71 g (66%) benzyl esteru N-[2-O(benzyl 2-acetamido- 2,3-didcoxy-4,6-0-isopropyliden-a-D-glukopyranosid~3-yl)-glykoloyI]-Lα-aminobutanoyl-D-isoglutaminu IV. Látka je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě

	··	99	•
• ·	• »	9	9
«	··	« ·	• ·
	• «		«···
·	* 9	• ·	•
v···	99	• >	•

• f &· » · · • ·

414 · 4 · 4 *· 44

Silikagelu v systémech chloroform - methanol (10 : 1) a n-butanol- kyselina octová - voda (4 : 1 : 1); b.t, 136-137°C, [a]_D +63° (c 0,6; chloroform). Pro látku IV (C36H48N4O1]) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 712,8; monoisotopická hmotnost 712,3. FABMS: m/z 713,6 [M + H]⁺ . Aminokyselinová analýza: Glu 1,03, Abu 1,04, kyselina normuramová 0.96. Pro (712,8) vypočteno: 60,66% C, 6,78% H, 7,86% N; nalezeno: 60,49% C, 6,88% H, 7,65% N.

Příklad 3

Plně chráněný derivát IV (6,36 g; 8,92 mmol) se zahřívá za míchání v 50% vodné kyselině octové (140 ml) na 60° C po dobu 2 h. Rozpouštědla se vakuově odpaří a zbytek se vakuově kodestiluje s toluenem (3 x 100 ml). Přidá se diethyl ether a petrolether a směs se ponechá přes noc v lednici. Získaná pevná látka se chromatografuje na koloně Silikagelu C18 v systému voda- methanol (lineární gradient 50—>80% za 60 min.). Výtěžek 4,8 g (80%) benzyl esteru N[2-O-(benzyl 2-acetamido- 2,3 -dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-aaminobutanoyl-D-isoglutaminu V, který se krystaluje ze směsi methanolu, diethyl etheru a petroletheru. Výtěžek 4,25 g (71%) látky V; b.t. 208°C, |a]o + 63° (c 0,2; methanol). Pro látku V (C33H44N4O11) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 672,7; monoisotopická hmotnost 672,3. FABMS: m/z 673,4 [M + H]⁺ , 695,3 [M + Na]⁺ . Pro C33H44N4O11 (672,7) vypoČteno:58,91% C, 6,59% H, 8,32% N; nalezeno: 58,66% C, 6,48% H, 8,40% N.

Příklad 4

K míchanému roztoku látky V (1,345 g; 2 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (80 ml) se přidá kyselina stearová (740 mg; 2,6 mmol), WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol). Po 6 h míchání při pokojové teplotě se přidá další várka WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol) a míchání pokračuje přes noc (14 h). Průběh reakce se sleduje tenkovrstvou chromatografií v soustavě chloroform - methanol (10 : 1). K reakční směsi se přidá methanol (5 ml) a směs se míchá 30 min. za pokojové teploty a potom se rozpouštědla vakuově oddestilují. Zbytek se rozpustí v chloroformu (200 ml) a roztok se extrahuje dvakrát roztokem KH2PO4, jehož pH bylo předem upraveno na pH 3 kyselinou sírovou (6 g KH2PO4 a 2 ml kyseliny sírové ve 40 ml vody) a dvakrát 5% roztokem chloridu sodného (60 ml), vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje. Filtrát se vakuově zahustí. Získaná látka se chromatografuje na koloně Silikagelu C18 v systému voda - methanol (lineární gradient 90—>100% za 60 min.). Výtěžek 900 mg (48%) benzyl esteru N-[2-O-(benzyl 2-acetamido-2,3dideoxy-6-0-oktadekanoyl-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu VI (kde R = oktadekanoyl); [α]π + 33° (c 0,4; chloroform). Pro látku VI (kde R = oktadekanoyl) (C51H78N4O12) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 939,2; monoisotopická hmotnost 938,6. FABMS: m/z 939,3 [M + H]⁺ , 961,3 [M + Na]⁺. Pro C₅iH₇8N₄0i2 (939,2) vypočteno: 65,22% C, 8,37% H, 5,96% N; nalezeno: 65,41% C, 8,23% H, 6,13% N.

Příklad 5

K míchanému roztoku látky V (1,345 g; 2 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (80 ml) se přidá kyselina 2-tetradecylhexadekanová (1,177 g; 2,6 mmol), WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol). Po 6 h míchání při 50° C se přidá další várka WSC (728 mg; 3,8

v f» wc • * · · « ·· * · « · · ··· « · · ··*· · ··· ·* • · · · ·· *> · ·· ·· mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol) a míchám pokračuje při téže teplotě dalších 6 h. Průběh reakce se sleduje tenkovrstvou chromatografií v soustavě chloroform - methanol (10 : 1). Po ochlazení na laboratorní teplotu se k reakční směsi přidá methanol (5 ml) a směs se míchá 30 min. za pokojové teploty a potom se rozpouštědla vakuově oddestilují. Zbytek se rozpustí v chloroformu (200 ml) a roztok se extrahuje stejně jako ve výše uvedeném příkladu, vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje. Filtrát se vakuově zahustí. Získaná látka se chromatografuje na koloně Silikagelu Cl8 v systému voda - methanol (lineární gradient 95—>100% za 60 min.). Výtěžek 1,20 g (54%) benzyl esteru N-{2-O-[benzyl 2-acetamido-2,3dideoxy-6-0-(2-tetradecylhexadekanoyl)-a-D-glukopyranosid-3-yl]-glykoloyl}-L-aaminobutanoyl-D-isoglutaminu VI (kde R = 2-tetradecylhexadekanoyl); [ajo +30° (c 0,6; chloroform). Pro látku VI (kde R = 2-tetradecylhexadekanoyl) (C«Hio2N₄Oi2) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 1107,5; monoisotopická hmotnost 1106,7. FABMS: m/z 1107,7 [M + H]⁺ , 1130,3 [M + Na]⁺. Pro C₆₃Hi₀₂N₄Oi2 (1107,5) vypočteno: 68,32% C, 9,28% H, 5,05% N; nalezeno: 68,52% C, 9,13% H, 5,15% N.

Příklad 6

Látka V (673 mg; 1 mmol) v kyselině octové (150 ml) se hydrogenolyzuje za přítomnosti 10% Pd/C katalyzátoru (200 mg) za pokojové teploty 24 h. Na konci hydrogenolýzy se aparatura evakuuje a propláchne argonem. Katalyzátor se odfiltruje, promyje kyselinou octovou (3 x 30 ml), a filtrát se lyofilizuje. Produkt se chromatografuje na koloně silikagelu Cl8 v soustavě methanol - voda (1:19). Homogenní frakce odpovídající a- a β-anomeru v poměru 2 : 1 se vakuově zahustí a zbytek se lyofilizuje z vody. Výtěžek 480 mg (91%) dihydrátu Nacetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu I (kde R = H); [a]o +34° (c 0,5; methanol) a [«]□ +11° (c 0,5; voda, po 24 h). Literatura (Jones G.H. et al.: Ger. Offen. 2718010; Chem. Abstr.: 88,191481 (1978)) uvádí: b.t. 133-144°C (krystalizace s 2,5 molekulami vody); [α]ο +33° (c 0,3; methanol). Pro látku I (kde R = H) (C ^32^()1 j) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 492,5; monoisotopická hmotnost 492,2. FABMS: m/z 493,1 [M + H]⁺, 515,1 [M + Na]⁺. Aminokyselinová analýza: Glu 1,05; Abu 1,03; kyselina normuramová 0,94. Pro C₁₉H32N₄0ii x 2H₂O (528,5) vypočteno: 43,17% C, 6,86% H, 10,60%N; nalezeno: 43,21% C, 6,75%H, 10,74% N.

Příklad 7

Látka VI (R = oktadekanoyl) (380 mg; 0.4 mmol) v kyselině octové (50 ml) se hydrogenolyzuje za přítomnosti 10% Pd/C katalyzátoru (400 mg) při laboratorní teplotě 16 h a zpracuje se analogicky jako v příkladě 6. Lyofilizovaný produkt se chromatografuje na koloně Silikagelu C18 v soustavě methanol - voda (9:1). Homogenní frakce se vakuově zahustí a zbytek se lyofilizuje z kyseliny octové. Výtěžek 200 mg (66%) 6-O-oktadekanoyl-N-acetylnormuramoylL-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu I (kde R = oktadekanoyl); [a]n +17° (c 0,1; kyselina octová). Pro látku I (kde R = oktadekanoyl) (C37H66N₄Oi2) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 759,0; monoisotopická hmotnost 758,5. FABMS: m/z 759,4 [M + H]⁺, 781,4 [M + Na]⁺. Pro CsvH^Ou (759,0) vypočteno: 58,55% C, 8,76% H, 7,38% N; nalezeno: 58,67% C, 8,61% H, 7,20% N.

Příklad 8 *

«» ·· * « · • ·* * « · · • ♦ · · ·«« · * • · · • · · · • · · • · · · • * • *

Látka VI (kde R = 2-tetradecylhexadekanoyl) (1,2 g; 1,084 mmol) v kyselině octové (50 ml) se hydrogenolyzuje za přítomnosti 10% Pd/C katalyzátoru (400 mg) za laboratorní teploty 16 h a zpracuje se analogicky jako v příkladě 7. Lyofilizovaný produkt se chromatografuje na koloně Silikagelu C18 v soustavě methanol - voda (9:1). Homogenní frakce se vakuově zahustí a zbytek se lyofilizuje z kyseliny octové. Výtěžek 698 mg (69%) 6-0-(2tetradecylhexadekanoyl)-N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu I (kde R = 2-tetradecylhexadekanoyl); [ct]o +13° (c 1,0; kyselina octová). Pro látku I (kde R = 2tetradecylhexadekanoyl) (C49H90N4O12) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 927,3; monoisotopická hmotnost 926,7. FABMS: m/z 927,9 [M + H]⁺, 949,9 [M + Na]⁺. Pro C49H90N4O12 (927,3) vypočteno: 63,46% C, 9,78% H, 6,04%N; nalezeno: 63,68% C, 9,96% H, 5,81% N.

Příklad 9

Biologická aktivita látek obecného vzorce I (kde R = oktadekanoyl nebo 2tetradecylhexadekanoyl)

Biologická aktivita látek obecného vzorce I (kde R = H, oktadekanoyl nebo 2tetradecylhexadekanoyl) byla testována standardními testy pro imunoadjuvantní účinek a pyrogenitu. Jako referenční látky byly použity MDP a jeho analog N-acetylnormuramoyl-L-aaminobutanoyl-D-isoglutamin obecného vzorce I, (kde R - H).

Pyrogenita byla testována na králících testem předepsaným ve farmakologii léčiv. Použity byly dávky 40, 200, and 1000 nM na králíka. V testované sekvenci MDP a jeho analogů, pyrogenita klesá v pořadí MDP, N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutamin obecného vzorce I, (kde R = H), jeho 6-O-oktadekanoyl derivát obecného vzorce I (kde R = oktadekanoyl) a jeho 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl) derivát obecného vzorce I (kde R = 2tetradecylhexadekanoyl). Posledně uvedený 2-tetradecylhexadekanoyl derivát I (kde R = je 2tetradecylhexadekanoyl) je apyrogenní dokonce při nej vyšší testované dávce.

Adjuvantní aktivita byla testována pomocí indukce experimentální alergické encephalomyelitidy na morčatech. V tomto testu rostla adjuvantní aktivita v pořadí MDP, 6-Ooktadekanoyl derivát obecného vzorce I (kde R = oktadekanoyl), N-acetylnormuramoyl-L-aaminobutanoyl-D-isoglutamin obecného vzorce I, (kde R = H) a 6-0-(2tetradecylhexadekanoyl) derivát obecného vzorce I (kde R = 2-tetradecylhexadekanoyl).

Průmyslová využitelnost

Látky podle vynálezu lze využít v základním výzkumu, ve farmaceutickém průmyslu a v humánním i veterinárním lékařství..

Claims

V''

1. Lipofilní analogy N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu s imunostimulační aktivitou obecného vzorce I, _______ _ __ _ - —

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln kde R je lipofilní acylový zbytek (počet atomů uhlíku C4 až C70), kteiý může být lineární, větvený, cyklický nebo polycyklický, např. palmitoyl, stearoyl, 2-tetradecyldexadekanoyI, adamantylkarbonyl atd, aniž se tímto předmět vynálezu jakkoliv omezuje.
2. Způsob přípravy N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu obecného vzorce I, kde R = H a jeho lipofilních analogů podle nároku 1, vyznačující se tím, že: a) jako výchozí látka se použije benzyl 2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-isopropyliden-3-Omethoxykarbonylmethyl-a-D-glukopyranosid vzorce II,

II který se po zmýdelnění na benzyl 2-acetamidO’2-deoxy-4,6-O-isopropyliden-3-Okarboxymethyl-a-D-glukopyranosid vzorce III kondenzuje s peptidovou komponentou za vzniku látky IV,

I

« * • · • * • « · 99 • 9 · • • • « • « • • • • · • « 9 • * 9 9 • · • • • 9 · · ♦ • « · · • • • · • • 9 • 9 • • · · « ♦ · • · ·.» a ·

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl)

IV

b) látka IV se převede odštěpením isopropylidenové skupiny na benzyl ester N-[2-O-(benzyl 2acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-a-aminobutanoyl-Disoglutaminu vzorce V,

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl)

V který se parciálně acyluje za vzniku 6-O-acylderivátů benzylesteru N-[2-O-(benzyl 2-acetamido2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl]-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu obecného vzorce VI,

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl)

VI

c) z látek V a VI se hydrogenolýzou odštěpí benzylové chránící skupiny za vzniku N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-isoglutaminu obecného vzorce I (kde R = H) a jeho 6-0acyl derivátů obecného vzorce I (kde R = acyl).