JPWO2016104647A1 - 糖鎖結合ワクチン抗原及び糖鎖導入剤 - Google Patents

Abstract

ガラクトースα１−３ガラクトース（Ｇａｌα１−３Ｇａｌ）を含む糖鎖がリンカーを介して結合しているワクチン抗原を提供する。ワクチン抗原を、下記式（２）で表される基、Ｌは少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、Ａは抗原、Ｚはリンカーと抗原との結合、ｍは１以上の整数を示す。）で表される化合物で構成する。抗原は、がん細胞、がん細胞の成分、がん抗原又はがん抗原ペプチドであることが好ましい。

Description

本発明は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が結合しているワクチン抗原及び当該ワクチン抗原を含むワクチン、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入できる糖鎖導入剤、並びに当該糖鎖導入剤を用いて抗原に前記糖鎖を導入する方法に関する。

がんワクチン療法は、化学療法、放射線治療に次ぐ第三の非手術療法として実地臨床の場で行われている。しかし、全身状態不良のがん患者では、免疫機能が低下しているため、腫瘍抗原に対する抗原提示能が低いという問題がある。

一方、がんの中でも、特に、膵がんは、極めて予後不良な疾患で、診断時には手術適応のない患者が非常に多い。このため、延命効果を目的とした抗がん薬投与の他、ワクチン療法も行われている。ワクチン療法に用いられる膵がんワクチンには、ＭＵＣ１、ＶＥＧＦ、ＷＴ１などのペプチドワクチンが知られている。しかし、膵がんワクチンにおいても、前記の腫瘍抗原に対する抗原提示能の低さなどの理由により、その有効性には限界がある。

このような中、エピトープを付加することにより、抗原提示能をさらに向上させようとする試みもなされつつある。例えば、本発明者らは、α１−３ガラクトース転移酵素の遺伝子発現によって、α１−３ガラクトースエピトープを過剰発現させた膵がん細胞のライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が、マウスのがんモデルにおいて非常に強いワクチン効果を有することを報告している（非特許文献１）。また、α１−３ガラクトース転移酵素によるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での酵素反応により、膵がん細胞にα１−３ガラクトースエピトープを付加する技術も知られている。

なお、α１−３ガラクトースエピトープは、α１−３ガラクトース転移酵素によって作られる糖鎖構造で、旧猿人以下の動物は持っているが、進化の過程でヒトではα１−３ガラクトース転移酵素が偽遺伝子となっているため、この糖鎖構造を持たない。しかし、ブタや牛などの食物摂取により、この糖鎖抗原に暴露されているため、ヒトの血中ＩｇＧの約１％はα１−３ガラクトースに対する自然抗体が存在し、この抗体価はがん末期患者でも維持される。実際、ブタの臓器をヒヒに移植すると、α１−３ガラクトースに対する超急性拒絶反応が起こり、ブタの臓器は排除されることが知られている。このため、α１−３ガラクトースエピトープは、ブタ型糖鎖とも言われている。

しかし、従来の方法では、α１−３ガラクトース転移酵素を利用するため、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基）のコンセンサス配列において、Ａｓｎ（アスパラギン）側鎖のアミノ基にしか、ブタ型糖鎖を導入することができない。
すなわち、転移酵素を利用する方法では、Ｎ型糖鎖しか形成できないため、ブタ型糖鎖の付加数は、導入されるタンパク質が有する上記コンセンサス配列数の範囲内にとどまる。

Cancer Res.70(13),5259-69,2010 Deguchi T, Tanemura M, Miyoshi E et al.

本発明の目的は、ガラクトースα１−３ガラクトース（Ｇａｌα１−３Ｇａｌ）を含む糖鎖がリンカーを介して結合しているワクチン抗原、及び当該ワクチン抗原を含むワクチン、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入できる糖鎖導入剤、並びに当該糖鎖導入剤を用いて抗原に前記糖鎖を導入する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（ｉ）Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖と、抗原が有する官能基［例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基などの抗体を構成するペプチドやタンパク質（又はペプチドやタンパク質を構成するアミノ酸）が有する官能基］と反応して結合形成可能な官能基（反応性基又は活性化基）とをリンカーを介して結合できること、（ｉｉ）このようなリンカーを介して両者が結合した化合物と抗原とを接触させることで、効率よく抗原に前記糖鎖を導入できること、（ｉｉｉ）このような前記糖鎖が導入された抗原は、前記糖鎖が優れたアジュバントとして機能し、高い抗原性のワクチン（又はその有効成分）として有効であることを見出し、さらに検討を重ねて、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の各発明を包含する。
［１］下記式（２）
（式中、Ｇは、下記式
で表される基、Ｌは少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、Ａは抗原、Ｚはリンカーと抗原との結合、ｍは１以上の整数を示す。）
で表される化合物で構成されたＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖がリンカーを介して結合しているワクチン抗原。
［２］式（２）で表される化合物が、下記式（２Ａ）
（式中、Ｌ^１は糖ユニット、Ｌ^２は少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、ａは０又は１を示し、Ｇ、Ａ、Ｚ及びｍは前記式（２）と同じ。）
で表される化合物である前記［１］記載のワクチン抗原。
［３］抗原が、がん細胞、がん細胞の成分、がん抗原又はがん抗原ペプチドである前記［１］又は［２］記載のワクチン抗原。
［４］がん抗原ペプチドが、ＭＵＣ１ペプチド、ＶＥＧＦペプチド、ＷＴ１ペプチド又はｅＥＦ２Ｌペプチドである前記［３］記載のワクチン抗原。
［５］がんが、膵がんである前記［３］又は［４］記載のワクチン抗原。
［６］抗原に、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入するための糖鎖導入剤であって、下記式（１）
［式中、Ｇは、下記式
で表される基、Ｌは少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、Ｘは抗原が有する官能基Ｙとの反応により結合を形成可能な官能基を示す。］
で表される化合物で構成された糖鎖導入剤。
［７］式（１）で表される化合物が、下記式（１Ａ）
（式中、Ｌ^１は糖ユニット、Ｌ^２は少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、ａは０又は１を示し、Ｇ及びＸは前記式（１）と同じ。）
で表される化合物である前記［６］記載の糖鎖導入剤。
［８］リンカーが、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ８）のいずれかで表される基である前記［６］又は［７］記載の糖鎖導入剤。
−Ｒ− （Ｌ１）
−（Ｒ−Ｅ）_ｋ− （Ｌ２）
−（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ３）
−Ｅ−（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ４）
−（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ５）
−（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ６）
−Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ７）
−Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ８）
（式中、Ｒは炭化水素ユニット、Ｅはヘテロ原子を有するユニット、ｋは１以上の整数を示す。）
［９］Ｒがアルキレン基であり、Ｅがエーテル基又はアミド基である前記［８］記載の糖鎖導入剤。
［１０］Ｘが活性エステル基、スルホン酸エステル基、マレイミド基、ハロゲン原子、アジド基、アルキニル基、又はヘキサトリエン−β−カルボニル骨格を有する基である前記［６］〜［９］のいずれかに記載の糖鎖導入剤。
［１１］官能基Ｙが、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、アジド基、及びアルキニル基から選択された少なくとも１種である前記［６］〜［１０］のいずれかに記載の糖鎖導入剤。
［１２］抗原と、前記［６］〜［１１］のいずれかに記載の糖鎖導入剤とを接触させ、抗原にＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入する方法。
［１３］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のワクチン抗原を含むワクチン。
［１４］前記［６］〜［１１］のいずれかに記載の糖鎖導入剤により、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入された抗原を含むワクチン。
［１５］Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入されたがん細胞、がん細胞の成分又はがんワクチンである前記［１４］記載のワクチン。
［１６］Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入された膵がん細胞、膵がん細胞の成分又は膵がんワクチンである前記［１４］又は［１５］記載のワクチン。

さらに、本発明には、前記ワクチン抗原（又はこのワクチン抗原を含むワクチン）を、ヒトに投与し、抗原に対応する疾患（例えば、膵がんなどのがん）を治療する方法も含まれる。

本発明により、リンカーを介してＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が結合しているワクチン抗原を提供することができる。また、本発明では、化学合成的手法により、Ｇａｌα１−３Ｇａｌ骨格と、特定の官能基に対する反応性基とがリンカーを介して結合した化合物（糖鎖導入剤）を得ることができる。そして、このような化合物によれば、抗原（例えば、がん細胞やがんペプチドワクチンなど）にＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を効率よく導入できる。

本発明の化合物によれば、抗原が有する官能基（例えば、抗原を構成するペプチドやタンパク質が有するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基など）との反応を利用するため、Ｎ型糖鎖を形成する必要が無く、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列によらずとも、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入できる。そのため、抗原にＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を数多く導入でき、このような糖鎖が導入された抗原では、非常に高い免疫反応を得ることができる。

さらに、本発明の化合物は、ＭＵＣ１、ＶＥＧＦ、ＷＴ１などの既に臨床応用されている公知のワクチン抗原（特にがんワクチン抗原）に対してＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を数多く導入できる。そのため、明らかな副作用を生じることなく、強力なアジュバント効果を得ることができる。特に、本発明では、リンカーを介してＧａｌα１−３Ｇａｌ骨格を導入できるので、抗Ｇａｌα１−３Ｇａｌ抗体に認識されやすいワクチン抗原を効率よく得ることができる。

図１は、実施例１３で得られた抗ＢＳＡ抗体をウェスタンブロッティングで検出した結果である。 図２は、実施例１３で得られた抗ＭＵＣ１抗体をウェスタンブロッティングで検出した結果である。

［糖鎖導入剤］
本発明の化合物は、下記式（１）で表される。このような化合物は、抗体に認識されるエピトープであるＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入するための糖鎖導入剤として使用できる。

［式中、Ｇは、下記式
で表される基（又は糖鎖）、Ｌはリンカー（又はスペ−サー）、Ｘは官能基Ｙとの反応により結合を形成可能な官能基を示す。］

上記式(１)において、ＧはＧａｌα１−３Ｇａｌ（又はＧａｌα１−３Ｇａｌユニット）である。なお、Ｇは、Ｌ（又は後述のＬ^１又はＬ^２）の種類等に応じて、α体（α結合）又はβ体（β結合）のいずれであってもよく、α体とβ体の混合物であってもよい。

式（１）において、Ｌは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌユニットと官能基Ｘとを連結するためのリンカー（連結基、スペーサー）である。
リンカーＬは、糖ユニット（糖の残基）を含んでいてもよい。なお、糖ユニットは、通常、Ｇａｌα１−３Ｇａｌユニットに隣接（又はグリコシド結合）している場合が多い。このような糖ユニットを含んでいてもよい式（１）で表される化合物としては、例えば、下記式（１Ａ）で表される化合物などが挙げられる。

（式中、Ｌ^１は糖ユニット、Ｌ^２はリンカー（詳細には糖ユニット以外のリンカー）、ａは０又は１を示し、Ｇ及びＸは前記式（１）と同じ。）

糖ユニットＬ^１において、糖は、単糖であってもよく、オリゴ糖であってもよい。なお、オリゴ糖は、ホモ多糖であってもよく、ヘテロ多糖であってもよい。
また、糖は誘導体（例えば、還元末端が修飾された糖、糖を構成するヒドロキシル基がアシルオキシ基などに置換された糖）であってもよい。さらに、糖は、環状構造（環状アセタール又は環状ケタール）であってもよく、開環した鎖状構造であってもよい。このような鎖状構造は、環状構造の糖の誘導体化により形成された構造（例えば、還元末端のヒドラジンやオキシムによる修飾により開環した構造など）であってもよい。

具体的な糖としては、例えば、ペントース（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、デオキシリボースなど）、ヘキソース（例えば、フルクトース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、ガラクトサミンなど）、これらの単糖類が結合したオリゴ糖又は多糖［例えば、二糖（例えば、マルトース、コージビオース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチビオース、ラクトースなど）など］などが挙げられる。

なお、エピトープであるＧａｌα１−３ＧａｌユニットにＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ−１，４結合した下記のユニットは、ブタ型糖鎖（α−Ｇａｌ）である。

（式中、Ａｃはアセチル基を示す）

転移酵素による場合には、ラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）をブタ型糖鎖（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に転移させるため、Ｎ−アセチルグルコサミンユニットが必須となるが、本発明では、このようなＮ−アセチルグルコサミンユニットがなくても、Ｇａｌα１−３Ｇａｌユニットを導入できる。

具体的な基Ｇ−Ｌ^１−としては、例えば、下記式（Ｇ１）で表される基（糖ユニットがＮ−アセチルグルコサミンユニットである基）、このような基Ｇ１において還元末端が修飾されたユニット（例えば、下記式（Ｇ２）で表される基、下記式（Ｇ３）で表される基、下記式（Ｇ４）で表される基）、これらの基において、Ｎ−アセチルグルコサミンを他の糖ユニットに置換した基Ｇ−Ｌ^１−などが含まれる。

（式中、Ｒ^ａは、炭化水素基（例えば、アルキル基（メチル基など）などの後述の炭化水素基）などの置換基を示し、Ｇ及びＡｃは前記と同じ。）

式（１）又は式（１Ａ）において、リンカー（−Ｌ−又は−Ｌ^２−）としては、特に限定されないが、通常、少なくとも炭化水素ユニット（炭化水素単位、炭化水素基）を有している場合が多い。

炭化水素ユニットとしては、２価の炭化水素基、例えば、脂肪族炭化水素ユニット［例えば、アルキレン（又はアルキリデン基を含む、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンなどのＣ_１−２０アルキレン、好ましくはＣ_１−１２アルキレン、さらに好ましくはＣ_１−８アルキレン）ユニット、アルケニレン（例えば、ビニレン、プロペン−１，２−ジイルなどのＣ_２−２０アルケニレン、好ましくはＣ_２−１２アルケニレン、さらに好ましくはＣ_２−８アルケニレン）ユニット、アルキニレン（例えば、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ−）などのＣ_２−２０アルキニレン、好ましくはＣ_２−１２アルキニレン、さらに好ましくはＣ_２−８アルキニレン）ユニットなどの鎖状脂肪族炭化水素ユニット；シクロアルキレン（例えば、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレンなどのＣ_４−１０シクロアルキレン、好ましくはＣ_５−８シクロアルキレン）ユニット、シクロアルケニレン（例えば、シクロヘキセニレンなどのＣ_５−１０シクロアルケニレン、好ましくはＣ_５−８シクロアルケニレン）ユニットなどの脂環式炭化水素ユニット］、芳香族炭化水素ユニット［例えば、アリーレン（例えば、フェニレン、トリレンなどのＣ_６−２０アリーレン、好ましくはＣ_６−１２アリーレン、さらに好ましくはＣ_６−１０アリーレン）］などが挙げられる。

また、炭化水素ユニットには、上記ユニットが２以上連結したユニット［例えば、アルキレン−アリーレン基（例えば、メチレンフェニレン基、エチレンフェニレン基など）、アルケニレン−アリーレン基（例えば、ビニレンフェニレン基など）など］も含まれる。

さらに、炭化水素ユニットには、上記ユニットに置換基が置換したユニットも含まれる。置換基としては、特に限定されず、例えば、炭化水素基｛例えば、アルキル基[例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などのアルキル基（例えば、Ｃ_１−１２アルキル基、好ましくはＣ_１−８アルキル基）]、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロへキシル基などのＣ_４−１０シクロアルキル基、好ましくはＣ_５−８シクロアルキル基）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、フェネチル基などのＣ_６−１０アリールＣ_１−４アルキル基）、多環式脂肪族炭化水素基（例えば、デカリニル基、ノルボルニル基、アダマンチル基など）などの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基；アリール基（例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基などのＣ_６−１２アリール基）などの芳香族炭化水素基｝、ヘテロ原子含有基｛例えば、窒素原子含有基［例えば、アミノ基、基−ＮＲ^ａＲ^ｂ（式中、Ｒ^ａは前記例示の炭化水素基、Ｒ^ｂは水素原子又は前記例示の炭化水素基を示す）で表される基（例えば、モノ又はジアルキルアミノ基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基などのモノ又はジＣ_１−２０アルキルアミノ基）など）、カルバモイル基、基−ＣＯＮＲ^ａＲ^ｂ（式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは前記と同じ）で表される基、窒素含有環基（例えば、ピリジル基など）］、酸素原子含有基[例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、基−ＯＲ^ａ（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）で表される基（例えば、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などのＣ_１−２０アルコキシ基、好ましくはＣ_１−１０アルコキシ基）など）、ホルミル基、基−ＣＯＲ^ａ（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）で表される基（例えば、アルカノイル基（例えば、アセチル基、プロピオニル基などのＣ_２−２０アルカノイル基）など）、基−ＣＯＯＲ^ａ（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）で表される基（例えば、アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などのＣ_１−１０アルコキシ−カルボニル基）など）、酸素含有環基（例えば、テトラヒドロフラニル基など）など]、硫黄原子含有基[例えば、メルカプト基、基−ＳＲ^ａ（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）で表される基（例えば、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ基などのＣ_１−２０アルキルチオ基、好ましくはＣ_１−１０アルキルチオ基）など）、基−ＣＳＲ^ａ（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）で表される基、硫黄含有環基（例えば、チオフェン−２−イル基など）など]など｝、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）などが挙げられる。

置換基は、単独で又は２以上組み合わせて炭化水素ユニットに置換していてもよい。

代表的な炭化水素ユニットには、アルキレン基、アリーレン基などが含まれる。

リンカーは、１又は２以上の炭化水素ユニットを有していてもよい。

リンカーは、ヘテロ原子を含むユニットを含んでいてもよい。ヘテロ原子を含むユニットにおいて、ヘテロ原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。ヘテロ原子を含むユニットは、２以上のヘテロ原子を有していてもよい。
具体的なヘテロ原子を含むユニットとしては、窒素原子を含むユニット｛例えば、イミノ基（−ＮＨ−）、置換イミノ基（例えば、−ＮＲ^ａ−（式中、Ｒ^ａは前記と同じ）など）、アミド基（−ＮＨＣＯ−）、ウレタン基（−ＮＣＯ−）、尿素基（−ＮＨＣＯＮＨ−）、アゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）、ヒドラゾン基（−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−）、窒素含有環基（例えば、ピペリジン、ピリジン、インドール、キノリン、カルバソールなどの窒素含有ヘテロ環式化合物に対応する多価基）など｝、酸素原子を含むユニット｛例えば、酸素原子（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、エステル基（オキシカルボニル基、−ＯＣＯ−）、酸素含有環基（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、フラン、モルホリン、キサンテンなどの酸素含有ヘテロ環式化合物に対応する多価基）など｝、硫黄原子を含むユニット｛例えば、硫黄原子（−Ｓ−）、チオカルボニル基（−ＣＳ−）、硫黄含有環基（例えば、チオフェン、テトラヒドロチオピラン、チアゾールなどの硫黄含有ヘテロ環式化合物に対応する多価基）など｝、これらのユニットが２以上連結したユニットなどが含まれる。

さらに、ヘテロ原子を有するユニットには、その種類に応じて、上記ユニットに置換基が置換したユニットも含まれる。置換基としては、炭化水素基を有するユニットの項で例示した置換基（例えば、炭化水素基、ハロゲン原子など）などが含まれる。

代表的なヘテロ原子を含むユニットとしては、イミノ基、置換イミノ基（アルキルイミノ基など）、アミド基、酸素原子（エーテル基、−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、エステル基（−ＯＣＯ−、−ＣＯＯ−）、チオ基（−Ｓ−）、チオカルボニル基（−ＣＳ−）などが挙げられる。

リンカーは、１又は２以上のヘテロ原子を含むユニットを有していてもよい。

リンカーが、炭化水素ユニットとヘテロ原子を有するユニットとを有する場合、リンカーにおけるこれらのユニットの位置関係は特に限定されないが、通常、炭化水素ユニットとヘテロ原子を有するユニットとは隣接（又は結合）している場合が多い。また、複数の炭化水素ユニットを有する場合には、炭化水素ユニット間にヘテロ原子を有するユニットが位置していてもよい。

さらに、リンカーは、炭化水素ユニットとヘテロ原子を有するユニットとの結合ユニット［例えば、オキシアルキレンユニット（例えば、オキシエチレン基などのオキシＣ_２−４アルキレン基）、ペプチドユニットなど］を１つのユニットとして、繰り返し単位（繰り返しユニット）を形成していてもよい。このような場合、繰り返しの数は、２以上（例えば、２〜２０、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜６程度）であってもよい。

代表的なリンカー（−Ｌ−又は−Ｌ^２−）としては、例えば、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ８）で表される基（リンカー）が挙げられる（なお、左端の「−」はＧ又はＬ^１との結合、右端の「−」はＸとの結合を示す）。
−Ｒ− （Ｌ１）
−（Ｒ−Ｅ）_ｋ− （Ｌ２）
−（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ３）
−Ｅ−（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ４）
−（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ５）
−（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ６）
−Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ７）
−Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ８）
（式中、Ｒは炭化水素ユニット、Ｅはヘテロ原子を有するユニット、ｋを１以上の整数を示す。）

炭化水素ユニットＲ及びヘテロ原子を有するユニットＥとしては、前記例示のユニットが挙げられる。特に、炭化水素ユニットは、アルキレン基であってもよく、Ｅはエーテル基（−Ｏ−）又はアミド基（−ＮＨＣＯ−）であってもよい。
なお、上記式において、Ｒ又はＥが複数である場合、複数のＲ又はＥは同一又は異なるユニットであってもよい。

より具体的なリンカー（Ｌ又はＬ^２）としては、例えば、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ６）で表される基（リンカー）などが含まれる。
−Ｒ^１− （Ｌ１）
−Ｒ^１−ＣＯ−ＮＨ− （Ｌ２）
−Ｒ^１−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ^２− （Ｌ３）
−Ｒ^１−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ^２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ^３− （Ｌ４）
−（Ｒ^４−Ｏ）_ｋ−Ｒ^１− （Ｌ５）
−（ＣＯ−Ｒ^５−ＮＨ）_ｋ−Ｒ^５− （Ｌ６）
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は同一の又は異なる二価の炭化水素基、Ｒ^４はＣ_２−４アルキレン基、Ｒ^５はアミノ酸の残基を示し、ｋは前記と同じ。）

上記式において、二価の炭化水素基及びＣ_２−４アルキレン基としては、前記例示の基が挙げられる。

Ｒ^１〜Ｒ^３は、代表的にはアルキレン基であってもよい。特に、Ｒ^１はメチレン基、Ｒ^２及びＲ^３が炭素数２以上のアルキレン基（例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基などのＣ_２−１０アルキレン基など）であってもよい。

また、Ｒ^４としては、エチレン基、プロピレン基などが挙げられ、特に、エチレン基（−ＣＨ_２ＣＨ_２−）であってもよい。

また、Ｒ^５はアミノ酸の残基、すなわち、アミノ酸からアミノ基及びカルボキシル基を除いた基である。例えば、アミノ酸がグリシンである場合、Ｒ^５はメチレン基である。なお、ｋは１以上の整数である。ｋが２以上であるとき、ｋの数（繰り返し数）は、例えば、２〜２０、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜６程度であってもよい。

式（１）又は（１Ａ）において、官能基Ｘとしては、官能基Ｘとは異なる官能基Ｙと反応して結合を形成可能な官能基であればよい。
なお、官能基Ｙは、通常、ペプチド又はタンパク質（例えば、抗原を構成するペプチド又はタンパク質）が有する官能基［例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基などのペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸が有する官能基］であってもよく、ペプチド又はタンパク質に導入された官能基［例えば、アジド基、アルキニレン基（アセチレン基など）など］などであってもよい。

官能基Ｘとしては、例えば、カルボキシル基又は誘導体化（活性化）されたカルボキシル基｛例えば、カルボキシル基とＮ−ヒドロキシアミン類（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アルキルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミドなど）又はその誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート）とがエステル結合した基、酸ハライド基、酸無水物基、酸アジド基などの活性エステル基｝、誘導体化（活性化）されたヒドロキシル基［例えば、スルホン酸エステル基（例えば、トシラート基、メシラート基、トリフラート基など）など］、マレイミド基、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、アジド基、アルキニル基（例えば、エチニル基又はアセチレン基など）、ヘキサトリエン−β−カルボニル骨格を有する基（例えば、下記式で表される基）などが挙げられる。

（式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは前記と同じ。）

なお、カルボキシル基又は誘導体化されたカルボキシル基はヒドロキシル基、アミノ基などの官能基Ｙと、誘導体化されたヒドロキシル基はヒドロキシル基、カルボキシル基などの官能基Ｙと、マレイミド基はメルカプト基などの官能基Ｙと、ハロゲン原子はメルカプト基、窒素環を構成する窒素原子やイミノ基（例えば、ヒスチジンを構成するイミダゾイル環のイミノ基）などの官能基Ｙと、アジド基はアルキニル基などの官能基Ｙと、ヘキサトリエン−β−カルボニル骨格を有する基はアミノ基などの官能基Ｙと、それぞれ反応する。

代表的な官能基Ｘと官能基Ｙとの組み合わせ、及びこの組み合わせにより形成される結合を下記表に示す。なお、表中、Ｒ^ａなどの記号は前記と同じである。

また、式（１）又は（１Ａ）において、Ｇ又はＧ−Ｌ^１に結合する基−Ｌ−Ｘ又は基−Ｌ^２−Ｘとしては、前記例示のＬ又はＬ^２と、前記例示のＸとのすべての組み合わせを含むが、その一例を下記表に示す。なお、表中、Ｒ^１などの記号は前記と同じである。

なお、糖鎖導入剤（式（１）又は（１Ａ）で表される化合物）の製造方法は、公知の有機化学的手法を用いて製造できる。

例えば、Ｇ又はＧ−Ｌ^１に対応する糖の還元末端を慣用の方法（例えば、保護された糖の還元末端のヒドロキシル基をアリルエーテル化したのち酸化する方法、還元末端のヒドロキシル基をアルカリ化したのち、モノクロロ酢酸と反応させる方法、還元末端の糖に対するグリコシル化反応など）によりカルボキシメチル化し、Ｎ−ヒドロキシアミン類又はその誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート）とを反応させることで、リンカーとしてメチレン基、官能基Ｘとして活性エステル基を有する化合物を得ることができる。

また、上記のようにしてカルボキシメチル化し、エチレンジアミンと反応させたのち、ヨード酢酸を反応させることで、リンカーとして−ＣＨ_２−ＣＯＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−、官能基Ｘとして−Ｉを有する化合物を得ることができる。一方、エチレンジアミンと反応させた後、さらに、グリコール酸と反応させ、塩化パラトルエンスルホニルと反応させることで、リンカーとして−ＣＨ_２−ＣＯＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−、官能基Ｘとしてトシルオキシ基を有する化合物を得ることができる。

さらに、糖の還元末端にエチレンオキシドを付加させたのち、カルボキシメチル化し、Ｎ−ヒドロキシアミン類と反応させることで、リンカーとして、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｋ−ＣＨ_２−、官能基Ｘとして活性エステル基を有する化合物を得ることができる。

［糖鎖導入剤の用途］
本発明の糖鎖導入剤（式（１）又は（１Ａ）で表される化合物）は、Ｇａｌ１−３Ｇａｌ骨格と官能基Ｘとを有しており、抗原にＧａｌ１−３Ｇａｌ骨格（Ｇａｌ１−３Ｇａｌを含む糖鎖）を導入し、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖がリンカーを介して結合している抗原（ワクチン抗原）を製造するのに有用である。

抗原は、ペプチド又はタンパク質で構成されており、そして、このペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸には、官能基Ｘと反応可能な種々の官能基Ｙを有している。例えば、官能基Ｘとして活性エステル基を有する糖鎖導入剤は、官能基Ｙとしてアミノ基を有するアミノ酸と反応して結合を形成する。

すなわち、抗原と糖鎖導入剤とを接触（又は反応）させることにより、糖鎖導入剤の官能基Ｘと、抗原の官能基Ｙとを反応させ、抗原にＧａｌ１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入できる（又はリンカーを介して結合できる）。

なお、アミノ酸は、ペプチド又はタンパク質の末端に官能基Ｙを有していてもよく、主鎖の側鎖として官能基を有していてもよい。例えば、末端に位置するアミノ酸はアミノ酸の種類によらず官能基Ｙとしてアミノ基やカルボキシル基を有しており、リシン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸などのアミノ酸ではペプチド結合に関与しない官能基Ｙを有しているため、これらのアミノ酸では、末端に加え、ペプチド又はタンパク質の側鎖として官能基Ｙ（例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基など）を有している。

このように、本発明では、抗原において、ペプチド又はタンパク質の末端や側鎖に位置する官能基Ｙを利用できるため、前記のような特定のコンセンサス配列のＡｓｎが有するアミノ基に限定されることなく、官能基Ｘと反応させることができ、効率よく多数のＧａｌ１−３Ｇａｌ骨格を抗原に導入できる。特に、本発明では、側鎖の官能基Ｙを利用できるので、非常に多くのＧａｌ１−３Ｇａｌ骨格を導入することができる。

そのため、官能基Ｙは、特に、特定のコンセンサス配列のＡｓｎが有するアスパラギン由来のアミノ基以外の官能基を含んでいてもよい。このような官能基としては、例えば、リシン由来のアミノ基、システイン由来のメルカプト基、セリン由来のヒドロキシル基、トレオニン由来のヒドロキシル基、アスパラギン酸由来のカルボキシル基、グルタミン酸由来のカルボキシル基、これらのアミノ酸を含むアミノ酸由来のアミノ基及び／又はカルボキシル基などが挙げられる。

また、抗原に元来存在しない官能基Ｙを導入し、糖鎖導入剤の官能基Ｘと反応させることもできる。例えば、抗原に、官能基Ｙとしてアジド基やアセチレン基を導入し、官能基Ｘとしてアセチレン基やアジド基を有する糖鎖導入剤と反応させてもよい。このような官能基Ｘと官能基Ｙとの反応を利用する方法は、クリックケミストリー的手法ということもできる。

代表的な官能基Ｙとしては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、アジド基、アセチレン基などが挙げられる。抗原は、これらの官能基を２種以上組み合わせて有していてもよい。

抗原としては、特に限定されず、例えば、病原体（例えば、インフルエンザウイルスなどのウイルス又は細菌）、がん抗原などが挙げられる。また、がん細胞（又はがん組織）そのものを抗原としてもよい。

抗原は、特に、がん細胞、がん細胞の成分、がん抗原又はがん抗原ペプチドであってもよい。なお、がん細胞の成分としては、細胞の形態を保持していない細胞の構成成分であれば特に限定されず、例えば、ライセート（例えば、膜成分を含むライセート、膜成分を含まないライセートなど）、膜成分（膜タンパクなど）などが挙げられる。

対象となるがん（悪性腫瘍）は、特に限定されず、例えば、甲状腺がん、肺がん、乳がん、胃がん、膵がん、肝臓がん、腎臓がん、大腸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、皮膚がん、白血病、悪性リンパ腫などが挙げられる。特に、膵がんは、予後不良ながんであり、強力な免疫原性が要求されるため、膵がん抗原に対して本発明の糖鎖導入剤を利用する有用性は極めて高い。

がん抗原としては、対象となるがんの種類に応じて、種々の抗原を利用できる。例えば、膵がん抗原ペプチドとしては、ＭＵＣ１（ペプチド）、ＶＥＧＦ（ペプチド）、ＷＴ１（ペプチド）などが挙げられる。

本発明には、前記糖鎖導入剤により、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入されたワクチン抗原も含まれる。

このようなワクチン抗原（糖鎖導入抗原）は、転移酵素によりブタ型糖鎖が導入された抗原（がん細胞）とは異なる構造を有している。例えば、本発明のワクチン抗原は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が、転移酵素では導入され得ないリンカーを介して抗原に結合している構造を有している。

また、官能基Ｙが特定のコンセンサス配列のアスパラギンに由来するアミノ基以外の官能基に対しても反応し、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入される。そのため、単に、抗原に対する結合形式において異なるだけでなく、通常、Ｇａｌα１−３Ｇａｌ骨格の導入量が、転移酵素を用いる場合に比べて、大きくなる。

さらに、リンカーが糖ユニットとしてＮ−アセチルグルコサミンユニットを含まない場合でも、抗原にＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入される。

なお、このようなワクチン抗原は、下記式（２）又は下記式（２Ａ）で表すことができる。下記式（２）及び下記式（２Ａ）は、それぞれ、前記式（１）で表される化合物及び前記式（１Ａ）で表される化合物を用いる場合に対応している。

（式中、Ａは抗原、Ｚはリンカーと抗原との結合、ｍは１以上の整数を示し、Ｇ、Ｌ、Ｌ^１、Ｌ^２、及びａは前記と同じ。）

上記式（２）及び（２Ａ）において、Ｚは式（１）の官能基Ｘと抗原が有する官能基Ｙ（例えば、抗原が有するアミノ酸由来の官能基）との反応により形成された結合である。特に、官能基Ｙは、少なくともアスパラギン由来のアミノ基以外の官能基を含んでいてもよい。なお、結合の例は、前記表などに例示の通りである。例えば、官能基Ｘが活性エステル基、官能基Ｙがアミノ基（例えば、リシン由来のアミノ基）である場合、Ｚはアミド結合（−ＮＨＣＯ−）である。

さらに、ｍは１以上の整数である。すなわち、抗原に、１以上のＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖が導入されている。抗原は、通常、官能基Ｘと反応する官能基Ｙを複数有している場合が多いため、ｍは、通常、複数又は２以上（例えば、３〜１０００個、好ましくは５〜５００個、さらに好ましくは１０〜３００個）であってもよい。抗原の種類等によっては、多数のＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を結合させることも可能である。

本発明のワクチン抗原は、前記の通り、ワクチンとして使用できる。本発明のワクチンは、本発明のワクチン抗原を含む限り、その形態は特に限定されない。例えば、本発明のワクチンは、本発明のワクチン抗原のみで構成してもよく、投与形態等に応じて、組成物（医薬組成物）を構成してもよい。また、本発明のワクチンは、適宜、本発明のワクチン抗原を製剤（例えば、固形製剤、液状製剤など）化してもよい。なお、医薬組成物の構成や製剤化においては、慣用の添加剤や製剤化方法を使用できる。

本発明のワクチンは、１種以上のアジュバントを含んでいてもよく、アジュバントを含んでいなくてもよい。本発明のワクチンは、アジュバントを含まなくても高いアジュバント効果を得ることもできる点で有用性が高い。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲリガンドまたはこれらの組み合わせである。

本発明には、上記ワクチン（又は糖鎖導入抗原又は医薬組成物）を投与し、対応する疾患（例えば、がん）を治療する方法も含まれる。

ワクチンの投与量は、疾患の種類やワクチンの種類などに応じて適宜選択できる。

なお、本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。

［実施例１］糖鎖導入剤の合成
下記工程に従い、化合物１３を得た。

（式中、Ｐｈはフェニル基、Ｂｎ及びＢｚはベンジル基、Ｔｒｏｃは２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、Ａｌｌｙｌはアリル基、Ａｃはアセチル基、Ｍｅはメチル基を示す。）

（化合物２の合成）
亜鉛粉末（４ｇ）を含む水懸濁液を３０分間超音波処理した。２．０％のＣｕＳＯ_４水溶液を添加したのち、混合物を濾過した。活性化されたＺｎ／Ｃｕ残渣を、室温で、化合物１（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍＬ）、酢酸（２０ｍＬ）及び無水酢酸（２０ｍＬ）を含む溶液に添加した。室温で１．５時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１／０から２０／１）にて精製し、白色固体として化合物２を得た（７０７ｍｇ、９０％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．５１−７．１６（ｍ，１０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８５（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２），５．６０（ｓ，１Ｈ，−ＣＨＰｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＮＨ−），５．２８−５．１９（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ _２），４．９２（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．８６（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．６３（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．３３−４．２６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−４），４．１６（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．０，６．３，１．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２−ＣＨ＝ＣＨ_２），３．９６（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．０，６．３，１．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２−ＣＨ＝ＣＨ_２），３．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．８０−３．７０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−６），１．９２（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．７，１３８．５，１３７．３，１３３．４，１２８．９，１２８．３，１２７．９，１２７．６，１２６．０，１１８．０，１０１．２，９７．３，８２．７，７６．０，７４．０，６９．０，６８．４，６２．９，５２．４，２３．４．
ＨＲＭＳ （ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２５Ｈ_２９Ｏ_６Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，４６２．１８８７，ｆｏｕｎｄ ４６２．１８８７．

（化合物３の合成）
化合物２（５０ｍｇ、１１４μｍｏｌ）及び塩化メチレン／アセトニトリル／水（２／２／３、２．５ｍＬ）を含む溶液に、室温で、ＮａＩＯ_４（２００ｍｇ、９１０μｍｏｌ）及びＲｕＣｌ_３・Ｈ_２Ｏ（１．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ）を添加した。室温で３時間撹拌後、反応混合物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出した、有機層を水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮することで、粗生成物として化合物３を得た。

（化合物４の合成）
化合物３（１１４μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）を含む溶液に、室温で、ヨウ化メチル（３５μＬ、５７０μｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（７９ｍｇ、５７０μｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を水で希釈し、クロロホルムで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて精製し、白色固体として化合物４を得た（３３ｍｇ、６１％、２段階）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．５１−７．２４（ｍ，１０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．９５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，−ＮＨ−），５．５９（ｓ，１Ｈ，−ＣＨＰｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．８２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．６６（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．３４（ｔｄ，Ｊ＝９．４，１３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．３，４．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），４．１８（ｄｄ，Ｊ＝１９．８，１６．８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ），３．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．８１−３．７６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６），３．７５（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３），１．９２（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７０．２，１７０．１，１３８．５，１３７．３，１２９．０，１２８．３，１２８．２，１２７．９，１２７．６，１２６．０，１０１．３，９９．２，８２．５，７６．０，７４．０，６８．８，６４．６，６３．５，５２．２，５２．１，２３．３．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２５Ｈ_２９Ｏ_８Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，４９４．１７８５，ｆｏｕｎｄ ４９４．１７９０．

（化合物５の合成）
化合物４（１４３ｍｇ、３０２μｍｏｌ）、トリエチルシラン（１４４μＬ、９０６μｍｏｌ）及び蒸留塩化メチレン（１．４ｍＬ）を含む溶液に、アルゴン雰囲気下、−２０℃で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（１１５μＬ、９０６μｍｏｌ）を滴下した。０℃で１．５時間、その後室温で一晩、撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、塩化メチレンで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、白色固体として化合物５を得た（７８ｍｇ、５５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３６−７．２６（ｍ，１０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．１１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＮＨ−），４．７８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．７３（ｄｄ，Ｊ＝１３．５，１１．７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．５７（ｄｄ，Ｊ＝２１．６，１２．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，９．５，３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝２１．０，１６．８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ），３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．７７−３．６７（ｍ，６Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６，−ＣＨ _３），３．６１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），２．７０（ｍ，１Ｈ，−ＯＨ），１．９８（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７０．５，１７０．３，１３８．５，１３７．８，１２８．５，１２８．４，１２８．０，１２７．８，１２７．７，１２７．６，９８．９，８０．０，７４．０，７３．６，７１．４，７１．１，７０．０，６４．４，５２．０，５１．８，２３．４．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２５Ｈ_３１Ｏ_８Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，４９６．１９４２，ｆｏｕｎｄ ４９６．１２４７．

（化合物７の合成）
化合物６（３５０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）及びアセトン（７ｍＬ）を含む溶液に、室温で、Ｎ−フェニルトリフルオロアセトイミダートクロリド（２４５ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（５２５ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌後、反応混合物を濾過し、減圧濃縮した。残渣を凍結乾燥し、粗生成物として化合物７を得た。

（化合物９の合成）
ドナーである化合物７（２２６ｍｇ、３６６μｍｏｌ）、アクセプターである化合物８（１９６ｍｇ、３６６μｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ、及び無水塩化メチレン（８．４ｍＬ）を含む溶液に、アルゴン雰囲気下、−２０℃で、トリメチルシリルトリフラート（１３μＬ、７３．２μｍｏｌ）を添加した。アルゴン雰囲気下、−２０℃で１時間撹拌した後、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、塩化メチレンで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル＝６０／１）にて精製し、白色固体として化合物９を得た（２１５ｍｇ、７７％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．０７−６．９０（ｍ，２９Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．６２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），５．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１８（ｓ，１Ｈ，−ＣＨＰｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．７９（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），４．７３−４．５４（ｍ，４Ｈ，Ｈ−６，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．４３（ｄｄｄ，Ｊ＝１６．６，１１．６，５．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−６’），４．０４−３．９９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’，Ｈ−５’），３．９５（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），３．８２（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨＰｈ），３．７４（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，３．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），３．５７（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），３．３９（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−５，−ＣＨ _２Ｐｈ），１．９０（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３），１．８０（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７０．２，１６６．０，１６４．８，１３８．８，１３８．６，１３８．１，１３７．７，１３３．５，１３３．２，１２９．８，１２９．６，１２９．６，１２８．８，１２８．６，１２８．４，１２８．３，１２８．１，１２８．１，１２７．６，１２７．５，１２６．２，１００．８，９６．０，８７．５，７６．１，７５．２，７４．４，７４．３，７３．９，７２．１，６８．８，６５．８，６２．９，２１．１，２０．４．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_５６Ｈ_５４Ｏ_１３Ｓ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，９８９．３１７７，ｆｏｕｎｄ ９８９．３１８９．

（化合物１０の合成）
ドナーである化合物９（９４ｍｇ、９７μｍｏｌ）、アクセプターである化合物５（４６ｍｇ、９７μｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ、及び無水塩化メチレン（４ｍＬ）を含む溶液に、アルゴン雰囲気下、−２０℃で、Ｎ−ヨードスクシンイミド（２６ｍｇ、１１６μｍｏｌ）及びトリフルオロメタンスルホン酸（３．４μＬ、３９μｍｏｌ）を添加した。アルゴン雰囲気下、−２０℃で２．５時間撹拌したのち、反応混合物を、トリエチルアミンでクエンチし、塩化メチレンで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル＝３／１）にて精製し、白色固体として化合物１０を得た（１０６ｍｇ、８３％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．０６−７．２２（ｍ，３５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＮＨ−），５．５１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），５．５２（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１７（ｓ，１Ｈ，−ＣＨＰｈ），５．０６（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．９６（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’’），４．７２−４．６０（ｍ，６Ｈ，Ｈ−１’，Ｈ−６，Ｈ−６’，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．２９−４．２１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ，Ｈ−２’’），４．１２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’’），４．０６−４．０２（ｍ，３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ，Ｈ−４’’），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，１．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．７２−３．６２（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _３，Ｈ−３，Ｈ−５’，Ｈ−５’’），３．５０（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’’），３．４３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），３．３８（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，１．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），３．２６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），１．９０（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３），１．８１（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７０．２，１６４．５，１３９．０，１３８．８，１３８．６，１３３．６，１３３．２，１２９．８，１２９．４，１２８．９，１２８．７，１２８．５，１２８．２，１２８．２，１２８．１，１２７．９，１２７．８，１２７．６，１２７．５，１２７．４，１２６．２，１００．８，１００．３，９８．４，９６．０，７７．８，７６．０，７４．４，７４．２，７４．１，７４．０，７４．０，７３．５，７２．１，７１．１，７１．０，６８．８，６７．７，６５．３，６４．４，６２．９，６１．７，５２．０，４１．０，２３．３，２０．１．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_７４Ｈ_７７Ｏ_２１Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，１３３８．４８８０，ｆｏｕｎｄ １３３８．４８９１．

（化合物１１の合成）
化合物１０（８８ｍｇ、６７μｍｏｌ）及び塩化メチレン（８．８ｍＬ）を含む溶液に、水（０．８８ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（１．７６ｍＬ）を室温で添加した。室温で４５分撹拌後、反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、塩化メチレンで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝６０／１）にて精製し、白色固体として化合物１１を得た（１０６ｍｇ、８３％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．０４−７．２３（ｍ，３０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＮＨ−），５．５５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），５．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１３（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），４．９７（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．７８−４．７６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１’，Ｈ−１’’），４．７６９−４．５６（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６，Ｈ−６’，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．４５−４．３６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ _２Ｐｈ），４．２５（ｔｄ，Ｊ＝１３．０，１０．３，３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’’），４．１５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’’），４．０９−４．０５（ｍ，３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ，Ｈ−４’’），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，３．２Ｈｚ，Ｈ−３’），３．７２−３．４５（ｍ，１１Ｈ，−ＣＨ _３，−ＣＨ _２Ｐｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−３’’，Ｈ−５，Ｈ−５’，Ｈ−５’’），３．３０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），２．６０（ｓ，１Ｈ，−ＯＨ），２．４７（ｓ，１Ｈ，−ＯＨ），１．８９（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３），１．８３（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７０．２，１７０．１，１６６．０，１６４．７，１３９．０，１３８．４，１３８．１，１３７．９，１３３．７，１３３．３，１２９．８，１２９．６，１２９．６，１２９．３，１２８．８，１２８．５，１２８．２，１２７．９，１２７．９，１２７．８，１２７．８，１２７．６，１２７．５，１２７．４，１００．６，９８．５，９４．１，７７．８，７４．９，７４．２，７３．６，７３．３，７２．８，７２．７，７１．７，７１．１，７１．０，６９．３，６８．９，６７．７，６４．９，６４．４，６２．９，６１．６，５２．１，５２．０，２３．３，２０．４．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_６７Ｈ_７３Ｏ_２１Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，１２５０．４５６７，ｆｏｕｎｄ １２５０．４５７８．

（化合物１２の合成）
化合物１１（８２ｍｇ、６７μｍｏｌ）及びメタノール（４．１ｍＬ）を含む溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）_２（８２ｍｇ）を室温で添加した。１．５ＭＰａの水素雰囲気下、室温で一晩撹拌後、反応混合物をメンブランフィルター（フロロポア（登録商標））で濾過し、減圧濃縮した。
粗生成物（６７μｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン／１，４−ジオキサン／水（２／１／０．５、１．２ｍＬ）を含む溶液に、室温で、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（２８ｍｇ、６６８μｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌後、反応混合物をイオン交換樹脂（ダウエックス（ＴＭ）、５０ＷＸ８ ５０−１００）でクエンチし、濾過し、減圧濃縮した。残渣を、１％の酢酸水溶液を用いたゲル濾過（セファデックス（ＴＭ） ＬＨ−２０）にて精製し、白色固体として化合物１２を得た（３２ｍｇ、８０％、２段階）。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝４．９３（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’’），４．６３（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’’），４．３３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），４．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１Ｈ，Ｈ−４’’），３．９７（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ），３．９４−３．９２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３’），３．８３−３．７７（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４’，Ｈ−５），３．７３−３．６８（ｍ，５Ｈ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−６，−Ｏ−ＣＨ _２−Ｃ＝Ｏ），３．６５−３．５３（ｍ，８Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−５’，Ｈ−５’’，Ｈ−６’，Ｈ−６’’），３．４８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），１．９１（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ _３）
^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝１７３．７，１０５．０，９８．９，９７．７，８０．９，７９．８，７６．７，７２．４，７１．９，７１．４，７１．２，７１．０，７０．２，６８．１，６６．８，６２．７，６２．５，６１．７，５４．５，２２．８．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２２Ｈ_３７Ｏ_１８Ｎ＋Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋，６２６．１９０３，ｆｏｕｎｄ ６２６．１９１２．

（化合物１３の合成）
化合物１２（４．５ｍｇ、７．５μｍｏｌ）及び無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）を含む溶液を、トリエチルアミン（１．２μＬ、９．０μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ，２．７ｍｇ、９．０μｍｏｌ）を室温で添加した。アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、化合物１３を得た。

［実施例２］糖鎖導入剤の合成
下記工程に従い、化合物１４を得た。

化合物１２（４１０μｇ、０．６８μｍｏｌ）及び無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３７μＬ）を含む溶液に、トリエチルアミン（０．９μＬ、６．８μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ，３０１μｇ，１．０μｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。反応混合物に、２−マレイミドエチルアミン（２０７μｇ，０．８２μｍｏｌ）を加えた後、１時間撹拌した。減圧濃縮することで、化合物１４を得た。

［実施例３］糖鎖導入剤の合成
下記工程に従い、化合物１５を得た。

化合物１２（２００μｇ，０．３３μｍｏｌ）及び無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６７μＬ）を含む溶液に、トリエチルアミン（１．４μＬ，１．０μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ，３０１μｇ，１．０μｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に６−アミノヘキサン酸（４８μｇ，０．３６μｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．４μＬ，１．０μｍｏｌ）を溶解した水溶液（６７μＬ）を加えた後、１．５時間撹拌し、反応液を凍結乾燥した。残渣を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６７μＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．７μＬ，０．５０μｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（１５０μｇ，０．５０μｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌し、減圧濃縮することで化合物１５を得た。

［実施例４］化合物１３を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、ＢＳＡに糖鎖を導入した。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＳＩＧＭＡ製、６６０μｇ、１０ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１００μＬ，ｐＨ＝８）に溶解し、化合物１３（３００ｎｍｏｌ）を加え、室温で１５時間インキュベートした。反応混合液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，５０，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１００００ｒｐｍで５分間）。これに蒸留水を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液から水への溶液の置換を３回行い、糖鎖を導入したＢＳＡ１６を得た。

ＢＳＡ１６には、１０〜１２個の糖鎖（ｎ＝１０〜１２）が導入されていた。
なお、糖鎖の導入（化合物１３とＢＳＡとの反応による結合形成）は、マススペクトルを反応前後のＢＳＡにおいて測定することで確認した。すなわち、反応前のＢＳＡの分子量は約６６０００であり、反応後のＢＳＡの分子量は約７３０００であった。
この結果より、化合物１３は、タンパク質を構成するアミノ酸と反応して結合形成することを確認できた。また、化合物１３によれば、多数の糖鎖を導入できることも確認できた。

［実施例５］化合物１４を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＢＳＡ１７を得た。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＳＩＧＭＡ製、７４８μｇ、１１．３ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１１３μＬ，ｐＨ＝７）に溶解し、化合物１４（３４０ｎｍｏｌ）を加え、室温で１６時間インキュベートした。反応混合液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，５０，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１００００ｒｐｍで１０分間）。これに蒸留水を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液から水への溶液の置換を３回行い、糖鎖を導入したＢＳＡ１７を得た。
ＢＳＡ１７には、１つの糖鎖（ｎ＝１）が導入されていた。糖鎖が１個導入されたのは、ＢＳＡが有する３５個のシステイン単位のうち３４個がジスルフィド結合しているため、１個のシステイン由来のメルカプト基が化合物１４と反応したためである。
なお、糖鎖の導入（化合物１４とＢＳＡとの反応による結合形成）は、マススペクトルを反応前後のＢＳＡにおいて測定することで確認した。すなわち、反応前のＢＳＡの分子量は約６６０００であり、反応後のＢＳＡの分子量は約６７０００であった。
この結果より、化合物１４は、タンパク質を構成するアミノ酸と反応して結合形成することを確認できた。

［実施例６］化合物１５を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＢＳＡ１８を得た。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＳＩＧＭＡ製、７４８μｇ、１１．３ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１００μＬ，ｐＨ＝８）に溶解し、化合物１５（３４０ｎｍｏｌ）を加え、室温で１５時間インキュベートした。反応混合液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，５０，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１００００ｒｐｍで５分間）。これに蒸留水を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液から水への溶液の置換を３回行い、糖鎖を導入したＢＳＡ１８を得た。
ＢＳＡ１８には、約６個の糖鎖（ｎ＝６）が導入されていた。
なお、糖鎖の導入（化合物１５とＢＳＡとの反応による結合形成）は、マススペクトルを反応前後のＢＳＡにおいて測定することで確認した。すなわち、反応前のＢＳＡの分子量は約６６０００であり、反応後のＢＳＡの分子量は約７００００であった。
この結果より、化合物１５は、タンパク質を構成するアミノ酸と反応して結合形成することを確認できた。また、化合物１５によれば、多数の糖鎖を導入できることも確認できた。

［実施例７］化合物１３を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＭＵＣ１ペプチド２０を得た。

ＭＵＣ１ペプチド１９（配列番号１で示されるアミノ酸配列、１．５ｍｇ、７７０ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（７７０μＬ，ｐＨ＝８）に溶解し、化合物１３（３．８６μｍｏｌ）を加え、室温で１６時間インキュベートした。反応混合液をＨＰＬＣに打ち込み精製し［ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ_１８−ＡＲ−３００，１０×２５０ｎｍ；ＭｅＣＮ ｉｎ Ｈ_２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ（０−１００％ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｖｅｒ ５０ｍｉｎ，１ｍＬ／ｍｉｎ）；ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｔ ２２０ｎｍ；ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：３０ｍｉｎ］、糖鎖を導入したＭＵＣ１ペプチド２０（１．３ｍｇ，６７％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｂｉｔｒａｐ） ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ_１０４Ｈ_１６５Ｎ_２７Ｏ_４６Ｎａ_２［Ｍ＋２Ｎａ］^２＋ １２８７．５６０８，ｆｏｕｎｄ １２８７．５６２９

なお、ＭＵＣ１ペプチド１９は、以下のようにして、合成した。

ＭＵＣ１ペプチド１９は一般的なＦｍｏｃ固相合成法のプロトコルに従って合成した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸として、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｖａｌを用い、Ｎ末端にはＢｏｃ−Ｇｌｙを使用した。

グリシン ２−クロロトリチルレジン（Ｇｌｙｃｉｎｅ ２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ）（０．１９５ｍｍｏｌ ｓｃａｌｅ，０．７８ｍｍｏｌ／ｇ，１００−２００ｍｅｓｈ，１％ＤＶＢ，渡辺化学）を使用し、すべてのアミノ酸の縮合は以下の手順に従って行った。
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．９７５ｍｍｏｌ）１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ，１３２ｍｇ，０．９７５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ，３０５μＬ，１．９５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解し、３０分間混合することで試薬を活性化させた。
活性化した試薬を樹脂に加え、その懸濁液を室温で２時間振とうした。すべてのＦｍｏｃ基の除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を樹脂に加え、室温で３０分振とうすることで行った。すべての縮合が終了した後、樹脂に酢酸（ＡｃＯＨ）／トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１／１／８，３ｍＬ）を加え、２時間振とうし、その上清にジエチルエーテル（Ｅｔ_２Ｏ）（３０ｍＬ）を加え、遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ，５分間）、上清を除いた。得られた沈殿にＥｔ_２Ｏ（３０ｍＬ）を加え、同様の遠心分離の操作を２回行い、粗精製の保護アミノ酸（３４３ｍｇ，６２％）を沈殿として得た。得られた保護アミノ酸（２１ｍｇ）に９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、２．５％Ｈ_２Ｏの混合液を４００μＬ加え、室温で５時間振とうし、その上清にＥｔ_２Ｏ（４ｍＬ）を加え、遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ，５分間）、上清を除いた。得られた沈殿にＥｔ_２Ｏ（４ｍＬ）を加え、同様の遠心分離の操作を２回行い、粗精製の１９を沈殿として得た。得られた沈殿をＨＰＬＣにより精製し（ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００，１０×２５０ｎｍ；ＭｅＣＮ ｉｎ Ｈ_２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ（０−１００％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｖｅｒ ５０ｍｉｎ，１ｍＬ／ｍｉｎ）；ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｔ ２２０ｎｍ；ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：３１ｍｉｎ）、ＭＵＣ１ペプチド１９（１５ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｂｉｔｒａｐ） ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ_８２Ｈ_１３０Ｎ_２６Ｏ_２９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ９７２．９８３５，ｆｏｕｎｄ ９７２．９８４０．

［実施例８］化合物１３を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＷＴ１ペプチド２２を得た。

ＧＳＴ−ＷＴ１−Ｆｒ１ペプチド２１（１−１８２ ａａ， １８２ａａ長、配列番号２で示されるアミノ酸配列、３３μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ緩衝液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，３，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１３，２００ｒｐｍ，５分間）。これに０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１００μＬ，ｐＨ＝８）を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液の置換を７回行った。得られたタンパク質溶液（５０μＬ）に化合物１３（１５０ｎｍｏｌ）を加え、室温で２０時間インキュベートした。反応混合液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，３，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１３，２００ｒｐｍで５分間）。これに蒸留水を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液から水への溶液の置換を３回行い、糖鎖を導入したＧＳＴ−ＷＴ１−Ｆｒ１ペプチド２２を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＬＩＴ−Ｏｂｉｔｒａｐ） ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_１０４Ｈ_１６５Ｎ_２７Ｏ_４６Ｎａ_２［Ｍ＋２Ｎａ］^２＋ １２８７．５６０８，ｆｏｕｎｄ １２８７．５６２９

なお、ペプチド２１は、以下のアミノ酸配列を有するペプチド（１−１８２ ａａ， １８２ａａ長）であり、合成したものを使用した。

ＭＧＳＤＶＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧＧＣＡＬＰＶＳＧＡＡＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＧＧＰＡＰＰＰＡＰＰＰＰＰＰＰＰＰＨＳＦＩＫＱＥＰＳＷＧＧＡＥＰＨＥＥＱＣＬＳＡＦＴＶＨＦＳＧＱＦＴＧＴＡＧＡＣＲＹＧＰＦＧＰＰＰＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳＱＰＡＩＲＮＱＧＹＳＴＶＴＦＤＧＴＰＳＹＧＨＴＰＳＨＨＡＡＱＦＰＮＨＳＦＫＨＥＤＰＭ

［実施例９］化合物１３を用いた糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したｅＥＦ２Ｌペプチド２４を得た。

ＧＳＴ−ｅＥＦ２Ｌペプチド２３（５０μＬ，０．１５μｇ／μＬ、配列番号３で示されるアミノ酸配列）の０．２％アジ化ナトリウム含有炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．６）に化合物１３（１５０ｎｍｏｌ）を加え、室温で２０．５時間インキュベートした。反応混合液を遠心式フィルター［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） ＹＭ−１０，３，０００ｃｕｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］を用いて限外濾過した（１３，２００ｒｐｍで５分間）。これに蒸留水を加えた。この限外濾過を用いた緩衝液から水への溶液の置換を３回行い、糖鎖を導入したＧＳＴ−ｅＥＦ２Ｌペプチド２４を得た。

なお、ペプチド２３は、以下のアミノ酸配列を有するペプチドであり、合成したものを使用した。

ＹＡＦＧＲＶＦＳＧＬＶＳＴＧＬＫＶＲＩＭＧＰＮＹＴＰＧＫＫＥＤＬＹＬＫＰＩＱＲＴＩＬＭＭＧＲＹＶＥＰＩＥＤＶＰＣＧＮＩＶＧＬＶＧＶＤＱＦＬＶＫＴＧＴＩＴＴＦＥＨＡＨＮＭＲＶＭＫＦＳＶＳＰＶＶＲＶＡＶＥＡＫＮＰＡＤＬＰＫＬＶＥＧＬＫＲＬＡＫＳＤＰＭＶＱＣＩＩＥＥＳＧＥＨＩＩＡＧＡＧＥＬＨＬＥＩＣＬＫＤＬＥＥＤＨＡＣＩＰＩＫＫＳＤＰＶＶＳＹＲＥＴＶＳＥＥＳＮＶＬＣＬＳＫＳＰＮＫＨＮＲＬＹＭＫＡＲＰＦＰＤＧＬＡＥＤＩＤＫＧＥＶＳＡＲＱＥＬＫＱＲＡＲＹＬＡＥＫＹＥＷＤＶＡＥＡＲＫＩＷＣＦＧＰＤＧＴＧＰＮＩＬＴＤＩＴＫＧＶＱＹＬＮＥＩＫＤＳＶＶＡＧＦＱＷＡＴＫＥＧＡＬＣＥＥＮＭＲＧＶＲＦＤＶＨＤＶＴＬＨＡＤＡＩＨＲＧＧＧＱＩＩＰＴＡＲＲＣＬＹＡＳＶＬＴＡＱＰＲＬＭＥＰＩＹＬＶＥＩＱＣＰＥＱＶＶＧＧＩＹＧＶＬＮＲＫＲＧＨＶＦＥＥＳＱＶＡＧＴＰＭＦＶＶＫＡＹＬＰＶＮＥＳＦＧＦＴＡＤＬＲＳＮＴＧＧＱＡＦＰＱＣＶＦＤＨＷＱＩＬＰＧＤＰＦＤＮＳＳＲＰＳＱＶＶＡＥＴＲＫＲＫＧＬＫＥＧＩＰＡＬＤＮＦＬＤＫＬ

［実施例１０］ライセートへの糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＰＡＮＣ１細胞のセルライセートを得た。

ＰＡＮＣ１細胞のライセート（１２μｇ／μＬ）を１００μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８）に懸濁させ、化合物１３（０．２μｍｏｌ）を加え、室温で１２時間インキュベートした。この反応液を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ，１５分間）、上清を除いた。これに蒸留水（４００μＬ）を加え、同様の遠心分離の操作を５回繰り返し、糖鎖を導入したセルライセートを得た。

なお、ＰＡＮＣ１細胞のライセートは、以下のようにして調製した。
ほぼｃｏｎｆｌｕｅｎｔのＰＡＮＣ−１細胞１００ｍｍ ｄｉｓｈ１枚（５〜６ｘ１０^６個）分を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−０．０１ｍＭ ＥＤＴＡで処理して剥がし、ｆｒｅｓｈ ｍｅｄｉｕｍで再懸濁した細胞液を１５ｍｌチューブに回収した。１００ｘｇ，５ｍｉｎ，４℃で遠心した後、上清を除き、ＰＢＳ（−）１ｍｌを加えてピペッティングで懸濁後、全細胞液を１．５ｍｌチューブに移した。６００ｘｇ，３ｍｉｎ，４℃で遠心した後、上清を除き、セルライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）調製時まで−８０℃保存した。連続してライセート（ｌｙｓａｔｅ）調製を行う場合は、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）の量に対して等量から２倍量のｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８，１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を加え、ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ型超音波破砕機（ＢｉｏＲａｐｔｏｒ）を用いて、氷冷下１５ｓｅｃ ＯＮ／ＯＦＦ ｉｎｔｅｒｖａｌで７〜８ｍｉｎ細胞の破砕操作を行った。その後、２０，０００ｘｇ，１５ｍｉｎ，４℃で遠心した。遠心終了後上清を回収したものをｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅとして、糖鎖導入時まで−８０℃で保存した。

［実施例１１］ＰＡＮＣ１細胞への糖鎖導入
下記工程に従い、糖鎖を導入したＰＡＮＣ１細胞を得た。

固定化したＰＡＮＣ１細胞（２．５×１０^７個）を２．５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８）に懸濁させ、化合物１３（７．５μｍｏｌ）を加え、室温で２０時間インキュベートした。この反応液を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ，５分間）、上清を除いた。これにＰＢＳ（２．５ｍＬ）を加え、同様の遠心分離の操作を３回繰り返し、糖鎖を導入したＰＡＮＣ１細胞を得た。

なお、固定化したＰＡＮＣ１細胞は、以下のようにして調製した。
実施例１０に記載の方法にて回収した細胞ペレットに対して、−２０℃メタノール１０分の固定化条件で処理した。
この処理の後、３００ｘｇ，３ｍｉｎ，４℃で遠心し、固定液を除き、ＰＢＳで３度洗浄して残存固定液を除いた。その後、固定化を行った細胞ペレットは、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＦＡＣＳ測定まで４℃で保存した。

なお、固定化したＰＡＮＣ１細胞に糖鎖が導入されていることは、ＦＡＣＳ解析を行うことによって確認した。ＦＡＣＳ解析方法は、以下の通りである。
固定化した細胞１０^５個程度を、１００μｌのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、Ｍ８６抗体２μｌを加え、５０倍希釈で使って氷上３０分で染色した。その後３００ｘｇで３分遠心して上清を除き、ＰＥラベルのａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ Ａｂ １μｌを１００μｌのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ／Ｄ−ＰＢＳ）に加え（１００倍希釈）、これで細胞を再懸濁、氷上２０〜３０分静置して、再度３００ｘｇで３分遠心、上清を除いた後、１００μｌのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、この一部を使ってＦＡＣＳ解析を行った。

［実施例１２］Ｍ８６抗体を用いたＥＬＩＳＡによる同定
上記実施例で得られた、ＢＳＡ１６について、Ｍ８６抗体（α−Ｇａｌを認識する抗体）を用いたＥＬＩＳＡによる同定を行った。なお、比較のため、同定は、糖鎖を導入していない対象（陰性対照、ネガティブコントロール）及び陽性対照（ポジティブコントロール）についても行った。
結果は以下の通りである。なお、下記表において、倍率とはＭ８６抗体の希釈倍率を示す。

上記表の結果から明らかなように、実施例で得られた試料は、導入した糖鎖（α−Ｇａｌ）を認識することがわかった。

なお、ＥＬＩＳＡによる同定は、以下のようにして行った。
９６ ｗｅｌｌ マイクロプレートを用い、ウェルあたり０．５μｇ（５ｎｇ／μｌを１００μｌ）の試料を含む液（試料液）を加え、クリーンベンチ内でオーバーナイト蒸発乾固した。Ｍ８６抗体によるＧａｌα１−３Ｇａｌ（又はブタ型糖鎖）の導入確認では、希釈系列を作成する必要があるため、１種類の試料に対し、８ウェルを準備した。ポジコンとしては、α−Ｇａｌエピトープを発現するブタ腎臓片タンパク（ＰＫＦ）を用いた。
ドライアップしたウェルに抗体の非特異的吸着を防止するため、１％ＢＳＡ／カーボネートバッファー１５０μｌを加え、プレートをラップで包んだ後、３７℃の気相恒温槽で２時間インキュベートした。その後このブロッキング溶液を除き、２００μｌのＰＢＳで２回洗浄の後、洗浄液をペーパータオル上でプレートを叩く方法により出来るだけ完全に除去した。

使用する各ウェル全てに５０μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加えた。α−Ｇａｌを認識するＭ８６抗体［Galili先生（マサチューセッツ大学、シカゴ大学）より入手］は、２倍の希釈系列を作成するため、最初のウェルに１２．５倍希釈のＭ８６抗体液を５０μｌ加え、良く撹拌後５０μｌを次のウェルに移すという作業を順次行い、最終的に３２００倍希釈までの希釈系列を作成した。最終８列目の過剰な５０μｌは除いた。この後、ＥＬＩＳＡプレートをラップで包み、３７℃の気相恒温槽で２時間インキュベートした。
抗体液を捨て、各ウェルを２００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２回洗浄の後、洗浄液をペーパータオル上でプレートを叩く方法により出来るだけ完全に除去した。

各ウェルに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで５００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ抗体５０μｌを加え、ラップで包んだ後、室温で１時間インキュベートした。
抗体液を捨て、各ウェルを２００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２回洗浄の後、洗浄液をペーパータオル上でプレートを叩く方法により出来るだけ完全に除去した。
各ウェルにＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）溶液（ＯＰＤ１ｔａｂｌｅｔを１１ｍｌのペルオキシダーゼバッファーに溶解後、４μｌの過酸化水素水を加え良く混合したもの）を１００μｌずつ加え、発色具合を見ながら適当なところで１Ｍ硫酸溶液５０μｌを加えて発色反応を停止させた。
この後、プレートリーダーを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
使用したバッファー組成は以下の通りである。
カーボネートバッファー：１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、３．１ｍＭ ＮａＮ_３（ｐＨ９．５）
ペルオキシダーゼバッファー：５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、６０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．０）

［実施例１３］アジュバント効果のウェスタンブロット法による確認
糖鎖を導入した標識体であるＢＳＡ１６、ＭＵＣ１ペプチド２０、これらに対応する未標識体［すなわち、糖鎖を導入していないＢＳＡ及びＭＵＣ１ペプチド（ペプチド２０）］のそれぞれに対するワクチン実験は、２０〜２５週齢のα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ノックアウトマウス［Galili先生（マサチューセッツ大学、シカゴ大学）より入手］に、２５０ｍｇ／ｍｌに調製したブタ腎臓フラグメント（粗タンパク液）４００μｌを用いて、１週間に１度、４週に渡って腹腔内投与を行い、α−Ｇａｌ抗原に対して、ヒトと同じ免疫反応が引き起こされるように抗α−ｇａｌ抗体価を高めたマウスを用いて行った。

なお、マウス血清中における抗α−Ｇａｌ抗体価は、実施例１０に記載した方法を用い、経時的に測定して判断した。

１度のワクチン実験に用いたタンパク量は、ＢＳＡの場合は標識体、未標識体とも１０μｇ／ｈｅａｄで、ＭＵＣ１ペプチドの場合は、標識体、未標識体とも２．５μｇ／ｈｅａｄであり、１群５匹のマウスを用意した。１週に１度の腹腔内投与を５週間に渡り行い、各投与後およそ１週間ごとに２００〜３００μｌの血液をサンプリングし、血清を調製した。各々の血清は複数本のマイクロチューブに分注し、−８０℃で保存した。

そして、マウス血清中に誘導された抗体を、以下のようにして検出した。

（抗ＢＳＡ抗体の検出）
１ ｌａｎｅあたり市販のＢＳＡ１μｇを用い、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、１５０Ｖの等電圧で電気泳動を行った。その後、ニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にセミドライ型のブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて１２０ｍＡで６０分転写した。
転写後のニトロセルロースフィルターは、各レーン毎に切断分離し、５％スキムミルク／ＴＢＳＴを用いて、４℃でオーバーナイトブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、５％スキムミルク／ＴＢＳＴで１０００倍に希釈した市販の抗ＢＳＡ抗体（ＢＥＴＨＹＬ）、ＢＳＡワクチン血清、α−ｇａｌ−ＢＳＡワクチン血清の３種を１次抗体として用い、室温１時間反応させた。反応終了後、抗体液を吸引除去し、ＴＢＳＴで１０分、３度洗浄操作を行った。ＴＢＳＴを除去後、抗ＢＳＡ抗体に対する２次抗体としては、５％スキムミルク／ＴＢＳＴで１００００倍に希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を、２種のマウス血清に対しては、５％スキムミルク／ＴＢＳＴで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、室温で１時間反応させた。反応終了後、同様にＴＢＳＴで１０分、３度洗浄操作を行った後、ＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅ （ＧＥ）を用いて、化学発光で目的バンドの検出を行った。化学発光の検出には、ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ）を使用した。

（抗ＭＵＣ１抗体の検出）
１ ｌａｎｅあたり膵癌細胞株Ｐａｎｃ１のｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ３０μｇを用い、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、１５０Ｖの等電圧で電気泳動を行った。その後、ニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にセミドライ型のブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて１２０ｍＡ、６０分転写した。転写後のニトロセルロースフィルターは、各レーン毎に切断分離し、５％スキムミルク／ＴＢＳＴを用いて、４℃でオーバーナイトブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、５％スキムミルク／ＴＢＳＴで１０００倍に希釈した市販の抗ＭＵＣ１抗体（ＣＳＴ）、ＭＵＣ１ペプチドワクチン血清、α−ｇａｌ−ＭＵＣ１ペプチドワクチン血清、ネガティブコントロールとしてα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）血清の４種を１次抗体として用い、室温で１時間反応させた。反応終了後、抗体液を吸引除去し、ＴＢＳＴで１０分、３度洗浄操作を行った。ＴＢＳＴを除去後、抗ＭＵＣ１抗体並びに３種のマウス血清に対する２次抗体としては、５％スキムミルク／ＴＢＳＴで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を用い、室温で１時間反応させた。反応終了後、同様にＴＢＳＴで１０分、３度洗浄操作を行った後、ＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ）を用いて、化学発光で目的バンドの検出を行った。化学発光の検出には、ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ）を使用した。

抗ＢＳＡ抗体の検出結果を図１に、抗ＭＵＣ１抗体の検出結果を図２に示す。なお、図１において、「ＰｏｎｃｅａｕＳ」はＢＳＡのバンドを確認したものである。
図の結果から明らかなように、α−Ｇａｌを導入したＢＳＡ及びＭＵＣ１ペプチドにおいて、アジュバント効果が得られていることがわかる。

本発明の化合物又は糖鎖導入剤は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を抗原に容易に導入できる。特に、アミノ酸（又はアミノ酸配列）の種類によらず、当該糖鎖を導入できるため、当該糖鎖を多く導入でき、非常に高い免疫反応を得ることができる。また、公知のワクチン抗原に当該糖鎖を導入できるため、高いアジュバント効果を得ることもできる。そのため、本発明の化合物（又は糖鎖導入剤）は、アジュバント（免疫賦活剤、免疫増強剤）として用いることもできる。
このような本発明の糖鎖導入剤及びワクチン抗原は、がん（悪性腫瘍）、感染症（インフルエンザなど）などの各種疾患の治療に有用であり、特に、膵がんなどのがんワクチン療法において有用である。

Claims (13)

1. 下記式（２）
   （式中、Ｇは、下記式
   で表される基、Ｌは少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、Ａは抗原、Ｚはリンカーと抗原との結合、ｍは１以上の整数を示す。）
   で表される化合物で構成されたＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖がリンカーを介して結合しているワクチン抗原。
2. 式（２）で表される化合物が、下記式（２Ａ）
   （式中、Ｌ^１は糖ユニット、Ｌ^２は少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、ａは０又は１を示し、Ｇ、Ａ、Ｚ及びｍは前記式（２）と同じ。）
   で表される化合物である請求項１記載のワクチン抗原。
3. 抗原が、がん細胞、がん細胞の成分、がん抗原又はがん抗原ペプチドである請求項１又は２記載のワクチン抗原。
4. がん抗原ペプチドが、ＭＵＣ１ペプチド、ＶＥＧＦペプチド、ＷＴ１ペプチド又はｅＥＦ２Ｌペプチドである請求項３記載のワクチン抗原。
5. がんが、膵がんである請求項３又は４記載のワクチン抗原。
6. 抗原に、Ｇａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入するための糖鎖導入剤であって、下記式（１）
   ［式中、Ｇは、下記式
   で表される基、Ｌは少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、Ｘは抗原が有する官能基Ｙとの反応により結合を形成可能な官能基を示す。］
   で表される化合物で構成された糖鎖導入剤。
7. 式（１）で表される化合物が、下記式（１Ａ）
   （式中、Ｌ^１は糖ユニット、Ｌ^２は少なくとも炭化水素ユニットを含むリンカー、ａは０又は１を示し、Ｇ及びＸは前記式（１）と同じ。）
   で表される化合物である請求項６記載の糖鎖導入剤。
8. リンカーが、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ８）のいずれかで表される基である請求項６又は７記載の糖鎖導入剤。
   −Ｒ− （Ｌ１）
   −（Ｒ−Ｅ）_ｋ− （Ｌ２）
   −（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ３）
   −Ｅ−（Ｒ−Ｅ）_ｋ−Ｒ− （Ｌ４）
   −（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ５）
   −（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ６）
   −Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ− （Ｌ７）
   −Ｒ−（Ｅ−Ｒ）_ｋ−Ｅ− （Ｌ８）
   （式中、Ｒは炭化水素ユニット、Ｅはヘテロ原子を有するユニット、ｋは１以上の整数を示す。）
9. Ｒがアルキレン基であり、Ｅがエーテル基又はアミド基である請求項８記載の糖鎖導入剤。
10. Ｘが活性エステル基、スルホン酸エステル基、マレイミド基、ハロゲン原子、アジド基、アルキニル基、又はヘキサトリエン−β−カルボニル骨格を有する基である請求項６〜９のいずれかに記載の糖鎖導入剤。
11. 官能基Ｙが、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、アジド基、及びアルキニル基から選択された少なくとも１種である請求項６〜１０のいずれかに記載の糖鎖導入剤。
12. 抗原と、請求項６〜１１のいずれかに記載の糖鎖導入剤とを接触させ、抗原にＧａｌα１−３Ｇａｌを含む糖鎖を導入する方法。
13. 請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン抗原を含むワクチン。