CN106198430A - 基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，包括测试阶段和数据处理阶段，测试阶段包括：①不同比重Percoll混合液的制备，（2）不同比重梯度层的制备，（3）进样，（4）离心，（5）取样，（6）检测；数据处理是将Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值与空白样的吸光度值作差，对吸光度的差值进行求和，进而计算出不同梯度的Percoll溶液的吸光度差值占总和的比例，最后根据各梯度Percoll溶液的比重以及所占的比例，运用加权平均计算出污泥絮体的最终比重值。该方法将Percoll细胞分离液用于活性污泥絮体比重的测试与分析，同时结合分光光度测量方法，实现对活性污泥絮体比重的准确测定，以确定活性污泥絮体比重对活性污泥沉降性能的影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于活性污泥絮体比重的测定方法，属于污水处理技术领域。
背景技术
在污水生物处理领域，虽然活性污泥法作为一种经济高效的污水生物处理技术在全球范围内得到广泛应用，反映活性污泥沉降性能的参数指标主要是定性性、宏观性的指标，客观反映活性污泥比重的指标由于缺乏客观、准确的测量方法，由此导致在实际污水处理运行管理中无法通过分析活性污泥比重变化并确定其对活性污泥沉降性能的影响。
在病理和生物研究领域，Percoll密度梯度离心已被成功应用于动物细胞及其细胞器的分离纯化，包括血液细胞、骨髓细胞、红血球细胞、白血球细胞、淋巴细胞、肝细胞等在内的十余种动物细胞。目前，这一技术也开始用于分离和纯化植物原生质体、核、叶绿体和线粒体。Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性，具有渗透性低、不穿透细胞、粘度低、密度高和无毒害等优点。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，低渗透压(<20mosm/kg H2O)，低粘度，高密度(达1.3g/ml)，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度。
但是Percoll细胞分离液用于活性污泥絮体比重的测试与分析，还未见诸文献。
发明内容
本发明针对传统活性污泥絮体分析技术存在的不足，提供一种测定准确的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法。
本发明的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，包括测试阶段和数据处理阶段，具体过程如下所述：
(1)测试阶段：
①不同比重Percoll混合液的制备:
将Percoll试剂与8.5％NaCl(质量浓度8.5％的NaCl水溶液)以9:1的体积比例混合制成Percoll溶液，再根据所需的比重将Percoll溶液与生理溶液配制至少8种比重的Percoll混合液；
所述生理溶液是指0.85％NaCl或0.15mPBS(含有0.15摩尔的PBS水溶液)。
所述各比重的Percoll混合液的比重差为0.003g/ml。
②不同比重梯度层的制备：
选取4～8种不同比重的Percoll混合液，将相同体积的不同比重Percoll混合液按照比重从大到小的顺序依次加入到试管中，形成Percoll混合液梯度层；
所述Percoll混合液梯度层中相邻Percoll混合液层的比重差为0.003g/ml。
③进样：
(a)空白样的制备：按每种比重Percoll混合液的体积量，将蒸馏水加入第一份Percoll混合液梯度层的上层，制成空白样；
(b)测试样的制备：将待测活性污泥的浓度稀释为200mg/L～300mg/L，制成污泥制备液，将污泥制备液加入第二份Percoll混合液梯度层的上层，制成测试样；
④离心：
以195转/分钟～205转/分钟的转速将空白样及测试样离心4～6分钟；
⑤取样：
将离心后测试样最上层的与每种比重Percoll混合液相同体积量的水介质去除，然后将不同梯度层的Percoll和污泥絮体的混合溶液逐层分离，一种Percoll和污泥絮体的混合溶液置于一个试管内；空白样按上述同样操作，分离出的每种空白样分别置于一个试管内；
⑥检测：
将每个存有Percoll和污泥絮体混合液的试管中加入0.85％NaCl溶液稀释四倍，然后采用紫外分光光度计在285～289nm波长下测其吸光度值；同样，对逐层分离的空白样也在285～289nm波长下测其吸光度值；
(2)数据处理
将相同梯度层的Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值与空白样的吸光度值作差，对各梯度层的吸光度的差值进行求和，进而计算出不同梯度的Percoll溶液的吸光度差值占总和的比例，最后根据各梯度Percoll溶液的比重以及所占的比例，运用加权平均计算出污泥絮体的最终比重值。
上述方法，利用活性污泥絮体自身比重的差异，在Percoll溶液中形成的连续密度梯度，通过对不同密度梯度层取样，在波长287nm条件下对不同密度梯度层内Percoll和污泥絮体混合溶液吸光度值的测定，准确检测每个梯度层中污泥含量。结合对照实验组吸光度值进行数据处理，采用加权平均法计算获得活性污泥絮体的比重。
本发明提出将Percoll细胞分离液用于活性污泥絮体比重的测试与分析，同时结合分光光度测量方法实现对活性污泥絮体比重的准确测定。该方法可精确检测活性污泥絮体比重指标，确定影响活性污泥沉降性能的活性污泥絮体比重指标。
附图说明
图1是不同密度的Percoll溶液与吸光度之间的线性关系示意图。
图2是不同浓度的活性污泥絮体与吸光度值的相关性分析示意图。
具体实施方式
本发明的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，包括测试阶段和数据处理阶段。
一.测试阶段
(1)不同比重Percoll混合液的制备:
为达到生理性渗透压，将Percoll试剂与8.5％NaCl(质量浓度8.5％的NaCl溶液)以9:1体积比例混合制成Percoll溶液，再根据所需的比重将Percoll溶液与生理溶液(0.85％NaCl或0.15mPBS)按照下表比例进行配制。
表1不同比重梯度的Percoll混合液配制表
(2)不同比重梯度层的制备：
为了准确测定活性污泥絮体比重，选取相邻4-8个(本实施例选取6个)比重层，每个比重层混合液体积为1ml，在10ml的玻璃试管中制成由上到下比重逐渐增加的梯度层，相邻比重层的比重差为0.003g/ml。
根据选取的6个相邻的比重层，按照比重从大到小的顺序，采用1ml长针头微量注射器将配制好的Percoll混合液依次加入到试管中。需注意在使用注射器将Percoll混合液加入试管的过程中，针头斜面要紧贴管壁，使Percoll混合液缓缓流下，防止在注射过程中产生泡沫，影响Percoll混合液的流态，导致梯度层比重的变化。
为了提高测定的准确性，应尽量使污泥均匀分布在Percoll混合液梯度层中。通过试验离心观察污泥絮体在比重梯度层中的分布，调整梯度层的比重。
(3)进样：
(a)空白样的制备：采用1ml长针头微量注射器吸取1ml蒸馏水，将其缓缓加入已制好的Percoll混合液梯度层的上层。
(b)测试样的制备：首先以稀释后污泥浓度为300mg/L左右(通常根据已知污泥比重确定其稀释浓度为200mg/L～300mg/L)为标准，对待测活性污泥样品进行稀释，制成污泥制备液。用1ml长针头微量注射器吸取1ml污泥制备液，将其缓缓加入已制备好的Percoll混合液梯度层的上层。需注意，对于污泥制备液，稀释后需立即加入并测试，防止活性污泥絮体由于生物絮凝作用影响污泥的比重测定。
(4)离心
以转速为200r/min(通常以195r/min～205r/min)将空白样及测试样离心4-6分钟(本实施例为5分钟)。需注意，应尽快进行离心以防止活性污泥絮体因为其他因素在Percoll混合液中发生变化而影响测定结果。由于多层Percoll混合液之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要平稳。
(5)取样
因为水介质比重小于Percoll梯度溶液且存在渗透压差的作用，在200r/min的离心力下，水无法穿破Percoll混合液层，使得水介质留在最上层。而活性污泥絮体由于其比重的差异分布于不同Percoll梯度层中。利用1ml长针头微量注射器将最上层1ml的水介质去除，然后将不同梯度层的Percoll和污泥絮体的混合溶液逐层分离至6个玻璃试管内。空白样操作与之相同。
(6)检测
为方便测定，将抽取出的Percoll和污泥絮体的混合液稀释4倍，向每个存有Percoll和污泥絮体混合液的试管中加入4ml 0.85％NaCl溶液，然后采用紫外分光光度计测其吸光度值。
直接用紫外分光光度计测定Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值，其值较大甚至超出测量范围。经过对所有比重梯度的Percoll溶液进行全波长扫描，不同比重梯度吸光度值以及同一波长条件下不同比重梯度吸光度值与梯度比重之间的相关性分析，得到：
(a)在波长285～289nm条件下，各梯度浓度其吸光度值基本处于波峰位置，且285～289nm波长下吸光度值差别不大。
(b)在波长285～289nm条件下，对同一波长条件下吸光度值与比重之间的相关性分析发现，r2范围基本在0.995～0.996之间，相关程度较高。
(二)数据处理
将Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值与空白对照试验的吸光度值作差，对吸光度的差值进行求和，进而计算出不同梯度的Percoll溶液其吸光度差值占总和的比例，最后根据各梯度Percoll溶液的比重以及所占的比例，运用加权平均计算出污泥絮体的最终比重值。
表2使用Percoll溶液测定污泥絮体比重的数据处理
说明：以某生活污水处理厂活性污泥絮体测试为例，进行数据处理的解释说明。
(1)将空白样各梯度Percoll溶液的吸光度值进行线性处理，如图1所示，通过相关性分析，若相关性较低则重新进行空白试验，使其相关性维持在较高水平。根据线性拟合公式计算不同梯度Percoll混合液的吸光度值A0 287。
(2)将Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值A1 287与空白试验的吸光度值A0 287作差，对6个梯度层吸光度差值进行求和，进而计算出不同梯度层吸光度差值占总和的比例(如表2所示)，通过吸光度差值的大小来判断不同梯度Percoll混合液中活性污泥絮体的含量。
(3)根据各梯度Percoll溶液的比重以及所占的比例，运用加权平均计算出污泥絮体的最终比重值。
Claims (4)
1.一种基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，包括测试阶段和数据处理阶段，其特征是：
(1)测试阶段：
①不同比重Percoll混合液的制备:
将Percoll试剂与8.5％NaCl以9:1的体积比例混合制成Percoll溶液，再根据所需的比重将Percoll溶液与生理溶液配制至少8种比重的Percoll混合液；
②不同比重梯度层的制备：
选取4～8种不同比重的Percoll混合液，将相同体积的不同比重Percoll混合液按照比重从大到小的顺序依次加入到试管中，形成Percoll混合液梯度层；
③进样：
(a)空白样的制备：按每种比重Percoll混合液的体积量，将蒸馏水加入第一份Percoll混合液梯度层的上层，制成空白样；
(b)测试样的制备：将待测活性污泥的浓度稀释为200mg/L～300mg/L，制成污泥制备液，将污泥制备液加入第二份Percoll混合液梯度层的上层，制成测试样；
④离心：
以195转/分钟～205转/分钟的转速将空白样及测试样离心4～6分钟；
⑤取样：
将离心后测试样最上层的与每种比重Percoll混合液相同体积量的水介质去除，然后将不同梯度层的Percoll和污泥絮体的混合溶液逐层分离，一种Percoll和污泥絮体的混合溶液置于一个试管内；空白样按上述同样操作，分离出的每种空白样分别置于一个试管内；
⑥检测：
将每个存有Percoll和污泥絮体混合液的试管中加入0.85％NaCl溶液稀释四倍，然后采用紫外分光光度计在285～289nm波长下测其吸光度值；同样，对逐层分离的空白样也在285～289nm波长下测其吸光度值；
(2)数据处理
将相同梯度层的Percoll和污泥絮体混合溶液的吸光度值与空白样的吸光度值作差，对各梯度层的吸光度的差值进行求和，进而计算出不同梯度的Percoll溶液的吸光度差值占总和的比例，最后根据各梯度Percoll溶液的比重以及所占的比例，运用加权平均计算出污泥絮体的最终比重值。
2.根据权利要求1所述的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，其特征是，所述(1)①中的生理溶液是指0.85％NaCl或0.15mPBS。
3.根据权利要求1所述的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，其特征是，所述(1)①中各比重的Percoll混合液的比重差为0.003g/ml。
4.根据权利要求1所述的基于分光光度与细胞分离的活性污泥絮体比重测定方法，其特征是，所述(1)②中Percoll混合液梯度层中相邻Percoll混合液层的比重差为0.003g/ml。
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