TW201908728A - 抗老化物質之篩選方法 - Google Patents

抗老化物質之篩選方法

Info

Publication number
TW201908728A
TW201908728A TW107124814A TW107124814A TW201908728A TW 201908728 A TW201908728 A TW 201908728A TW 107124814 A TW107124814 A TW 107124814A TW 107124814 A TW107124814 A TW 107124814A TW 201908728 A TW201908728 A TW 201908728A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
aging
dermal
cells
stem cells
performance
Prior art date
Application number
TW107124814A
Other languages
English (en)
Inventor
江連智暢
豊田美郷
Original Assignee
日商資生堂股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商資生堂股份有限公司 filed Critical 日商資生堂股份有限公司
Publication of TW201908728A publication Critical patent/TW201908728A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9794—Liliopsida [monocotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/906—Zingiberaceae (Ginger family)
    • A61K36/9066—Curcuma, e.g. common turmeric, East Indian arrowroot or mango ginger
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
    • A61K36/738—Rosa (rose)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4745—Insulin-like growth factor binding protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7042—Aging, e.g. cellular aging

Abstract

本發明之課題在於開發一種抗老化物質之篩選方法。 本發明係發現如下現象，即，由於老化細胞所分泌之真皮老化因子對正常細胞發揮作用，故而會促進真皮成分之產生之降低或真皮成分之分解，從而開發出一種藉由將真皮老化因子作為指標而篩選抗老化物質之方法。

Description

抗老化物質之篩選方法
本發明係關於一種將真皮老化因子之表現作為指標之抗老化物質之篩選方法。
伴隨年齡增長之各種老化現象係不可避免之問題，以抑制老化進行或改善老化為目的，進行科學地分析老化之研究。美容上關注度最高之皮膚老化之原因就宏觀上而言，年齡增長為重要因素，但除此以外，亦可列舉由乾燥、氧化、紫外線等所產生之影響作為與皮膚老化相關之直接因素。作為皮膚老化之外觀現象，可列舉肌膚之皺紋(大紋及小紋)、鬆弛、黃褐斑、暗沉、紋理之劣化等，作為其原因，可列舉：膠原蛋白之減少、膠原蛋白交聯反應、以玻尿酸為代表之黏多糖類之減少、黑色素之增加、表皮代謝回轉之降低。該等原因主要分為真皮性之原因與表皮性之原因，必須分別對應。對於真皮性之原因，明確玻尿酸之產生促進、基質金屬蛋白酶(MMP)之產生/活性之抑制、膠原蛋白之產生促進、酯酶之活性之阻礙作用對真皮之抗老化較為有效。作為如此之抗老化研究，進行使表皮或真皮層之細胞活化，近來對藉由使幹細胞、尤其是體性幹細胞活化所進行之皮膚之抗老化之技術進行研究。
幹細胞定義為具有自我複製能力與分化為其他種類之細胞之分化能力之細胞。已知作為幹細胞，除了存在如胚性幹細胞(ES細胞)或誘導多能性幹細胞(iPS細胞)般具有可分化為形成一個體之所有系統之細胞型之分化萬能性的幹細胞以外，亦存在雖然對於成人之生物體內之各組織亦無分化萬能性，但具有可分化為複數個系統之分化多能性的體性幹細胞。已知體性幹細胞有助於組織損傷時之組織修復、組織之恆常性之維持或老化。已知體性幹細胞存在於各種組織中，作為存在於皮膚組織之幹細胞，已知有存在於表皮層之表皮幹細胞、與存在於真皮層及皮下脂肪層之間葉系幹細胞等。
眾所周知於表皮中在表皮基底層存在表皮幹細胞，又，報告有於稱為毛囊之隆起區域之區域存在毛囊上皮幹細胞或皮膚色素幹細胞。另一方面，報告有於真皮存在分化為脂肪、神經膠、軟骨、肌肉等複數個細胞株之皮膚源性前驅細胞(skin-derived precursors：SKP)(非專利文獻1：Wong CE et al., J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006)，進而將稱為真皮間葉系幹細胞之細胞單離出(專利文獻1：WO2011/034106)。
已知間葉系幹細胞於皮膚受到外傷時被引誘至外傷部位。揭示有如下內容：認為被引誘至外傷部位之間葉系幹細胞會使周圍之皮膚細胞活化而促進細胞增殖，並且自身亦分化為皮膚細胞而蓋住外傷，有助於治癒，且某種類黃酮具有間葉系幹細胞之引誘作用(非專利文獻2：PLOS ONE DOI:10.137/journal. pone. 0144166)。認為參與皮膚損傷之治癒之間葉系幹細胞除了經由血管搬運之骨髓源性間葉系幹細胞以外，亦為存在於皮下組織之脂肪幹細胞、或存在於皮脂腺、汗腺、毛囊等器官之周圍或血管附近之真皮間葉系幹細胞。作為間葉系幹細胞，先前主要將骨髓源性幹細胞作為研究對象，但若自脂肪組織單離出脂肪幹細胞，則由於其獲取之容易性、及具有可分化為各種細胞株之多分化能力，故而期待對各種再生治療之應用(非專利文獻3：World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68)。真皮間葉系幹細胞雖然存在於血管附近，但關於其分化能力或性質存在較多未知之方面，關於其應用亦期待今後之研究。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2011/034106號 [專利文獻2]日本專利特表2013-507956號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1]J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006 [非專利文獻2]PLOS ONE DOI:10.137/journal. pone. 0144166 [非專利文獻3]World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於開發一種抗老化物質之篩選方法。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人對真皮進行老化研究，結果令人驚訝地發現如下現象，即，由於老化細胞所分泌之因子(以下稱為真皮老化因子)對正常細胞發揮作用，故而會促進真皮成分之產生之降低或真皮成分之分解。本發明者等人基於該見解，從而開發出藉由將真皮老化因子作為指標而篩選抗老化物質之方法。更具體而言，本發明係關於以下內容。
[1]一種抗老化物質之篩選方法，其係將真皮老化因子之表現作為指標。 [2]如項目1所記載之篩選方法，其包括如下步驟： 利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養； 測定培養物中之真皮老化因子之表現；及 選擇可抑制真皮老化因子之表現之候選藥劑。 [3]如項目2所記載之篩選方法，其中皮膚細胞培養物進而包含幹細胞。 [4]如項目1至3中任一項所記載之篩選方法，其中真皮老化因子之表現係藉由測定真皮老化因子之基因表現或蛋白質量而進行。 [5]如項目1至4中任一項所記載之篩選方法，其中真皮老化因子為IGFBP7、CFD、或RSPO4。 [6]一種真皮老化因子之表現抑制劑，其含有薑黃萃取物或野薔薇果萃取物。 [7]如項目6所記載之真皮老化因子之表現抑制劑，其中真皮老化因子為CFD。 [8]一種薑黃萃取物或野薔薇果萃取物，其係用以經由真皮老化因子之表現抑制而於皺紋、鬆弛、或肌膚老化之治療中使用。 [9]一種美容或非治療方法，其係改善皺紋、鬆弛、或肌膚老化者，且投予含有薑黃萃取物或野薔薇果萃取物之組合物。 [10]如項目9所記載之方法，其係經由真皮老化因子之表現抑制而改善皺紋、鬆弛、或肌膚老化。 [12]如項目9或10所記載之方法，其係對患有皺紋、鬆弛、或肌膚老化之對象投予。 [13]一種薑黃萃取物或野薔薇果萃取物之用途，其係用以製造真皮老化因子之表現抑制劑。 [14]一種皮膚改善方法，其包括：對患有皺紋、鬆弛、或肌膚老化之對象投予含有薑黃萃取物或野薔薇果萃取物之組合物。 [15]一種用以改善皺紋、鬆弛、或肌膚老化之美容或非治療方法，其特徵在於抑制真皮老化因子之表現。 [16]如項目15所記載之美容或非治療方法，其中上述真皮老化因子為IGFBP7、CFD、或RSPO4。 [17]如項目16所記載之美容或非治療方法，其包括：為了抑制真皮老化因子之表現而投予薑黃萃取物或野薔薇果萃取物。 [發明之效果]
本發明之篩選方法可將真皮老化因子作為指標而篩選抗老化物質。藉由對經由真皮老化因子之老化之新的老化機制進行解析，並將此種因子作為指標，可獲取先前之篩選方法無法篩選出之物質作為抗老化物質。
本發明係關於一種將真皮老化因子之表現作為指標之抗老化物質之篩選方法。更具體而言，該篩選方法包括以下之步驟： 利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養； 測定培養物中之真皮老化因子之表現；及 選擇可抑制真皮老化因子之表現之候選藥劑。
本發明之篩選方法亦可於利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養的培養步驟之前，進而包括於未添加候選藥劑之培養基中培養包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物之預培養步驟。預培養可於任意之期間進行，但一般而言可於皮膚細胞培養物之播種後達到亞融合或融合之前進行。利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養之步驟亦可藉由對預培養步驟之培養基添加候選藥劑、或替換為含有候選藥劑之培養基而達成。
利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養的培養步驟之培養時間就確保候選藥劑對細胞發揮作用之時間之觀點而言，為24小時以上，較佳為3天以上，進而較佳為5天以上。亦可於利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養的培養步驟之後，進而包括後續培養步驟，其係於未添加候選藥劑之培養基中進而培養包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物。
只要細胞可生存，則培養用培養基可為任意之溶液，可使用通常為了培養皮膚細胞培養物而使用之任意之培養基。作為一例，可使用DMEM、EMEM、RPMI1640等。培養條件可使用通常為了培養皮膚細胞培養物而使用之培養條件。作為一例，於5%CO2 、37℃、加濕環境下進行培養。
所謂真皮老化因子係指自老化細胞主要分泌之因子，且係指對正常之真皮細胞發揮作用而抑制真皮成分之產生、或促進分解之因子。作為真皮老化因子之一例，可列舉IGFBP7、CFD、及RSPO4等。藉由將該等因子之1種或2種、或所有組合之表現作為指標，可篩選抗老化物質。
測定培養物中之真皮老化因子之表現之步驟係指藉由任意之方法測定培養物中之真皮老化因子之基因表現量或蛋白質量之步驟。老化因子之表現量可使用分子生物學方法適當測定。作為一例，於測定蛋白質量之情形時，可藉由製作對各真皮老化因子之特異性抗體，並使用西方點墨、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)等方法測定蛋白質量。關於真皮老化因子之基因表現量，可藉由使用下述引子進行RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反轉錄-聚合酶鏈反應)而測定，但並非意圖限定於該等方法。只要為業者，則可適當選擇內部標準。 [表1]
選擇可抑制真皮老化因子之表現之候選藥劑之步驟係指於真皮老化因子之表現降低之情形時選擇候選藥劑作為抗老化因子之步驟。作為比較對象，可於僅未添加候選藥劑之方面不同之對照群中，測定培養物中之真皮老化因子之表現，與對照群之測定結果進行比較。關於對照群之實驗，可與本發明之篩選方法同時進行，亦可預先進行關於對照群之實驗，僅比較結果。於另一態樣中，將候選藥劑添加前之真皮老化因子之表現量與添加後之真皮老化因子之表現量進行比較，於真皮老化因子之表現降低之情形時，可選擇候選藥劑作為抗老化因子。真皮老化因子之表現只要較對照群降低即可，亦可以顯著差降低。
皮膚細胞之培養物可為構成皮膚之任意細胞之培養物。作為構成皮膚之細胞，可列舉：表皮之角化細胞、真皮之纖維芽細胞、及存在於皮下脂肪層之脂肪細胞、或其他細胞例如蘭格漢氏細胞、黑色素、Merkel細胞、組織球、肥胖細胞、漿細胞、幹細胞等，又，亦可包含構成存在於皮膚之各器官例如皮脂腺、汗腺、毛囊等之細胞。可將真皮纖維芽細胞單獨培養，亦可與其他細胞共培養。作為共培養之一態樣，亦可對藉由將真皮纖維芽細胞與表皮細胞共培養而構築之皮膚三維模型之培養物添加候選藥劑。於又一態樣中，亦可使用將真皮纖維芽細胞與幹細胞共培養之培養物。作為幹細胞，可列舉存在於表皮之表皮幹細胞、存在於真皮或皮下脂肪組織之間葉系幹細胞。
真皮纖維芽細胞係屬於間葉系之細胞，且係產生膠原纖維或彈性纖維、黏多糖之細胞。纖維芽細胞之分裂速度相對較快，藉由反覆繼代，可獲取老化之纖維芽細胞。
所謂間葉系幹細胞，一般係指來自分類為間葉系之任意組織之幹細胞。作為分類為間葉系之組織，可列舉骨髓、胎盤、脂肪組織、真皮等，作為來自該等組織之幹細胞之例，可列舉骨髓源性間葉系幹細胞(以下簡稱為骨髓幹細胞)、胎盤源性間葉系幹細胞、脂肪組織源性間葉系幹細胞(以下簡稱為脂肪幹細胞)、齒髓源性間葉系幹細胞、臍帶血源性間葉系幹細胞、真皮源性間葉系幹細胞(以下簡稱為真皮幹細胞)等，又，毛乳頭細胞之一部分亦視為間葉系幹細胞。
骨髓源性間葉系幹細胞係存在於骨髓之幹細胞。骨髓幹細胞具有向心肌細胞、骨骼肌細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞之類的多種組織之分化能力。骨髓源性間葉系幹細胞係以CD105、CD73、CD90作為陽性標記而被賦予特徵，但並非意圖限定於表現該等標記之細胞。認為骨髓間葉系幹細胞會根據組織之損傷等信號而釋出至血液中從而發揮於創傷部之治癒功能。
所謂脂肪組織源性間葉系幹細胞，亦可簡稱為脂肪幹細胞，係存在於脂肪組織中之間葉系幹細胞之一種。已知脂肪幹細胞具有遷移能力(非專利文獻3及專利文獻2)，視為可於脂肪組織中移動。脂肪幹細胞係藉由CD90標記、CD105標記等之表現而被賦予特徵，但並非意圖限定於表現該等標記之細胞。
所謂真皮源性間葉系幹細胞，亦可簡稱為真皮幹細胞，係存在於真皮之幹細胞。真皮幹細胞經由向纖維芽細胞之分化、或纖維芽細胞之活化而補充纖維芽細胞從而有助於維持真皮層之恆常性。真皮間葉系幹細胞於真皮層中作為類外被細胞之細胞群主要存在於微小血管部位、或皮脂腺、汗腺、毛囊等器官之周圍。認為其於皮膚之損傷時活化，分化為纖維芽細胞、肌纖維芽細胞而有助於皮膚之再生、修復。真皮幹細胞藉由CD34及NG2之雙重陽性而被賦予特徵，但並非意圖限定於表現該等標記之細胞。於真皮幹細胞存在之各器官之周圍遍佈有毛細血管，因此認為真皮幹細胞通過血管進行補充。因此，真皮幹細胞可具有與骨髓間葉系幹細胞相近之性質。
於添加候選藥劑前，必須產生老化因子，因此較佳為所使用之細胞為已老化之細胞。作為已老化之細胞，較佳為使用進行一定期間、例如進行3個月以上之繼代培養而增殖變慢之細胞(例如倍化時間未達0.5/週，Pdl＞50)。又，藉由自老人獲取初代細胞，亦可獲取已老化之細胞。於較佳之態樣中，於如此獲得之老化細胞中，較佳為使用確認到選自由IGFBP7、CFD、及RSPO4所組成之群中之老化因子之表現之細胞。老化細胞只要為皮膚中所含之細胞，則可為任意細胞，就表現出選自由IGFBP7、CFD、及RSPO4所組成之群中之老化因子之觀點而言，較佳為真皮纖維芽細胞。
於皮膚細胞培養物僅包含真皮纖維芽細胞之情形時，藉由篩選方法所選擇之抗老化物質對已老化之真皮纖維芽細胞直接發揮作用，藉此可抑制老化因子之表現。另一方面，於皮膚細胞培養物為真皮纖維芽細胞與其他細胞之共培養物之情形時，藉由篩選方法所選擇之抗老化物質對已老化之真皮纖維芽細胞直接發揮作用，或經由經共培養之其他細胞間接地發揮作用，藉此可抑制老化因子之表現。作為間接作用，例如認為經由經共培養之細胞之活性而控制老化真皮纖維芽細胞中之老化因子之表現。顯示出藉由使間葉系幹細胞對真皮纖維芽細胞間接地發揮作用，可抑制老化因子(IGFBP7)之表現(圖5)。
於進行共培養之情形時，真皮纖維芽細胞與其他細胞可混合地播種至同一部位，可積層而培養，亦可於同一培養容器內隔離而培養。於在同一培養容器內隔離而培養之情形時，可更換培養基，但因培養基經由阻礙細胞移動之程度之孔而混合，一細胞所分泌之因子可對另一細胞產生影響。於一實施態樣中，可將幹細胞與真皮纖維芽細胞共培養。此種幹細胞具有可分化為真皮纖維芽細胞之分化能力，並且可藉由釋出一些因子而對周圍之細胞發揮作用。因此，藉由使用該共培養系，能夠篩選可對幹細胞發揮作用而抑制由老化真皮纖維芽細胞所產生之老化因子之抗老化物質。
因此，藉由本發明之篩選方法所選擇之抗老化物質可為伴隨著其所使用之系而直接對老化細胞發揮作用從而抑制老化因子之分泌之抗老化物質，亦可為藉由對其他細胞、例如對幹細胞發揮作用而間接地抑制老化因子之分泌之抗老化物質。對老化細胞直接發揮作用之抗老化物質亦可稱為老化因子之表現抑制劑。老化因子係抑制真皮成分之產生、或促進分解。因此，老化因子之表現抑制具有使膠原蛋白或彈力蛋白等真皮成分增加之作用。因此，抗老化物質可作為真皮成分之增加促進劑、及皺紋或鬆弛改善劑、抗老化劑而調配至化妝品或醫藥品中。對幹細胞發揮作用而間接地抑制老化因子之分泌之抗老化物質可作為幹細胞活化劑而使用，可單獨使用，但藉由與幹細胞治療併用、或與幹細胞引誘劑一起投予，可進一步發揮所期望之抗老化作用。
使用複數種化妝品素材作為候選藥劑而執行本發明之篩選方法，結果薑黃萃取物及野薔薇果萃取物可作為抗老化因子表現抑制劑而篩選出。
薑黃萃取物係指原產印度之薑科薑黃屬(Curcuma Longa)之多年生草本植物之萃取物。作為進行萃取之部位，可列舉全草、葉、花、根，尤佳為根莖。萃取方法可使用任意方法，作為一例，可藉由對經乾燥之根進行水蒸汽蒸餾或溶劑萃取而獲得萃取物。又，作為溶劑，可使用任意之萃取溶劑，可使用50%丁二醇等。
野薔薇果萃取物係指原產東亞之野薔薇(Rosa multiflora)之假果或果實之萃取物。萃取方法可使用任意方法，作為一例，可藉由對經乾燥之假果或果實進行水蒸汽蒸餾或溶劑萃取而獲得萃取物。又，作為溶劑，可使用任意之萃取溶劑，可使用乙醇水溶液或50%丁二醇等。
作為候選藥劑，可使用屬於任意之藥劑資料庫之藥劑。作為藥劑資料庫，可使用有機化合物資料庫、萃取物資料庫、化妝品素材資料庫、醫藥品資料庫等。就經皮投予候選藥劑之觀點而言，較佳為使用已顯示出經皮投予中之穩定性之化妝品素材作為候選藥劑。
藉由本發明之方法所篩選出之抗老化物質可調配至任意之組合物、例如化妝品、醫藥品、或準醫藥品中。調配有抗老化物質之化妝品、醫藥品、或準醫藥品係被用於苦惱於皺紋或鬆弛等肌膚老化之對象。苦惱於此種肌膚老化之對象亦可稱為於皮膚中老化因子之表現較高之對象。尤其於美容領域中期望抗老化，因此較佳為調配至化妝品中。所調配之化妝品之劑型為任意，可以液體、凝膠、氣泡、乳液、乳霜、軟膏、片材等形態調配而使用。作為所調配之化妝品，可應用於外用藥用製劑、化妝水、乳液、乳霜、軟膏、啫喱、油、面膜等基礎化妝料、洗面乳或皮膚洗淨料、除毛劑、脫毛劑、鬚後水、剃鬚液、剃鬚膏、粉餅、口紅、腮紅、眼影、眼線、睫毛膏等容妝化妝料、洗髮精、潤絲精、護髮素、洗前護髮素、整髮劑、燙髮劑、養髮劑、染髮劑、生髮劑等頭髮化妝料、浴用劑等各種製品。
本發明中，IGFBP7、CFD、及RSPO4被定為老化因子。因此，藉由調查該等因子之表現，可決定細胞之老化度。例如藉由測定對成為內部標準之基因之表現量，可決定細胞之老化度。亦可對自生物體獲取之細胞、尤其對皮膚細胞決定老化度，亦可對培養細胞決定老化度。因此，於本發明之又一態樣中，本發明係關於一種將老化因子之表現量作為指標之細胞之老化度決定方法。
本說明書中言及之所有文獻係藉由引用而將其整體引入至本說明書中。
以下所說明之本發明之實施例僅以例示作為目的，並非限定本發明之技術範圍。本發明之技術範圍僅受申請專利範圍之記載限定。以不脫離本發明之主旨為條件，可進行本發明之變更、例如本發明之構成要件之追加、削除及替換。
實施例1：老化細胞對正常細胞之影響細胞培養 利用添加有10%FBS之杜爾貝寇改良伊格爾培養基對自成人(21歲)之背部之皮膚建立之真皮纖維芽細胞進行培養。作為通常之纖維芽細胞(幼期纖維芽細胞)，使用未達1個月之培養期間且Pdl＜30之細胞。將該細胞培養3個月以上，使用增殖變慢之細胞(倍化時間未達0.5/週，Pdl＞50)作為老化纖維芽細胞。將通常之纖維芽細胞以成為1250個細胞/cm2 之密度之方式播種至填滿添加有10%FBS之杜爾貝寇改良伊格爾培養基的6孔之Transwell系統(Falcon; Franklin Lakes, NJ)之上層。將局部收縮狀態之老化纖維芽細胞及通常之纖維芽細胞分別播種至Transwell系統之下層之2個孔。組合Transwell系統之上層及下層，於37℃、5%CO2 加濕環境下培養2天後，分別使用Qiazole(Qiagen)回收上層之細胞與下層之細胞。
定量之 RT-PCR 自所回收之細胞裂解物，依照製品說明書使用RNeasy Protect Kit(Qiagen)提取RNA，繼而，依照製品說明書使用Superscript VILO(Invitrogen)將其轉譯為cDNA。以28SrRNA作為內部標準，使用關於下述基因之引子對，利用LightCycler(銷售商)進行即時PCR。將結果示於圖1。將藉由Lightcycler software ver.3.5所計算出之循環閾值(Ct值)針對各樣品之GAPDHmRNA進行標準化。 [表2] 如圖1(A)所示，於將老化纖維芽細胞播種至下層之情形時，與不將細胞播種至下層之情形相比，MMP1之表現顯著增加，又，彈力蛋白及膠原蛋白之表現顯著減少。於將通常之纖維芽細胞(幼期纖維芽細胞)播種至下層之情形時，與未於下層播種細胞之情形相比並未顯示出顯著之變化(未記載資料)。根據該結果明確，藉由自老化細胞分泌出一些老化因子，於共有培養基之真皮纖維芽細胞中，會產生基因表現之變化。
於老化纖維芽細胞中表現增加之基因之特定 藉由微陣列分析調查幼期纖維芽細胞與老化纖維芽細胞中之基因表現之不同。鑑定與幼期纖維芽細胞之基因表現量相比顯示出2.5倍以上之表現量之基因。將下述表所記載之基因作為老化因子之候選： [表3]
於該等老化因子之候選基因中，以減弱CFD之方式設計siRNA(SI00030100或SI00030107；Qiagen，兩者具有相同之阻礙效果)，作為陰性對照，使用siRNA(SI030640318；Qiagen)。依照上述細胞培養法，於Transwell系統之下層播種將siRNA導入至老化纖維芽細胞而減弱CFD基因之細胞，與上層之細胞一起進行2天培養。分別獲取下層之細胞與上層之細胞，對下層之細胞調查CFD之表現，對上層之細胞調查MMP1之基因表現。於將CFD經減弱之老化纖維芽細胞播種至下層之情形時，自上層之細胞之MMP1之表現降低。將結果示於圖2。根據該結果，特定出CFD為老化因子。
老化細胞中之老化因子之表現 於老化纖維芽細胞與幼期纖維芽細胞中比較由本發明者等人特定出之老化因子(CFD)及候選老化因子(IGFBP7、RSPO4)之表現。分別培養老化纖維芽細胞及幼期纖維芽細胞，並使用Qiazole(Qiagen)進行回收。使用與上述RT-PCR相同之方法，對經回收之細胞裂解物調查老化因子之表現。使用下述引子對。將結果示於圖3。顯示本發明中特定出之老化因子及候選老化因子之表現均於老化纖維芽細胞中變高。 [表4]
老化因子之添加 於培養幼期纖維芽細胞之培養基中以0 μg/ml、10 μg/ml之濃度添加候選老化因子(IGFBP7、RSPO4)之蛋白質(Serotec，自R&D SYSTEMS購入)，培養2天後，分別使用Qiazole(Qiagen)回收細胞。關於所回收之細胞裂解物，與定量之RT-PCR之欄所記載者同樣地調查MMP1及膠原蛋白之表現量。將結果示於圖4。IGFBP7及RSPO4使膠原蛋白之表現降低，又，使MMP1之表現增加。藉此，表示IGFBP7及RSPO4亦作為老化因子發揮作用。
實施例2：利用間葉系幹細胞之老化因子之抑制細胞培養 將老化纖維芽細胞以成為1250個細胞/cm2 之密度之方式播種至填滿添加有10%FBS之杜爾貝寇改良伊格爾培養基的6孔之Transwell系統(Falcon; Franklin Lakes, NJ)之上層。間葉系幹細胞(MSC)係自Lonza購入，於MessenPro培養基中培養。將局部收縮狀態之MSC播種至Transwell系統之下層之孔。於24小時後將培養基更換為含有10%FBS、250 μM抗壞血酸之DMEM，開始共培養。於2天後使用Qiazole(Qiagen)回收細胞。使用與上述之RT-PCR相同之方法對所回收之細胞裂解物調查老化因子(IGFBP7)之基因表現。將結果示於圖5。作為對照群，於無MSC之條件下以纖維芽細胞單獨進行培養。於MSC存在下，IGFBP7之基因表現顯著減少(司徒頓t字檢定：P＜0.05)。
實施例3：將老化因子作為指標之篩選方法 將老化纖維芽細胞以成為2500個細胞/cm2 之密度之方式播種至24孔板。於播種24小時後，分別以0.5%之濃度添加作為化妝品素材之下述萃取物：野薔薇果萃取物、薑黃萃取物。將僅添加有萃取物之萃取溶劑之群作為對照。於萃取物添加24小時後，使用Qiazol(Qiagen)回收細胞。針對所回收之細胞裂解物，藉由與定量之RT-PCR之欄所記載者相同之方法調查RSPO4之表現量。將對照群之RSPO4表現設為100而表示添加群中之RSPO4表現。將結果示於圖6。
圖1(A)表示Transwell系統之模式圖，於上層培養通常(幼期)纖維芽細胞，於下層培養老化纖維芽細胞。圖1(B)～(D)係表示於下層不培養細胞之情形(Blank)與於下層培養老化纖維芽細胞之情形(+Senescent)時之(B)膠原蛋白1A1(COL1A1)、(C)彈力蛋白(ELN)、及(D)基質金屬蛋白酶1(MMP1)之基因表現量之比較的圖。 圖2係表示於Transwell系統之下層之老化纖維芽細胞中抑制CFD之基因表現之情形(A)時上層之纖維芽細胞中之MMP1基因表現之變化的圖(B)。 圖3係表示老化纖維芽細胞與通常(幼期)纖維芽細胞之間的老化因子(A)IGFBP7、(B)RSPO4、及(C)CFD之基因表現量之比較的圖。 圖4係表示於添加了IGFBP7及RSPO4之情形時(A)MMP1基因用量依存性地表現增加、及(B)膠原蛋白1基因表現降低的圖。 圖5係表示於老化纖維芽細胞與間葉系幹細胞之共培養系中藉由間葉系幹細胞之存在而使老化因子(IGFBP7)之表現降低的圖。 圖6係表示於對老化纖維芽細胞之培養物添加薑黃萃取物或野薔薇果萃取物而培養之情形時，相對於對照，作為老化因子之RSPO4之表現降低的圖。

Claims (9)

  1. 一種抗老化物質之篩選方法，其係將真皮老化因子之表現作為指標。
  2. 如請求項1之篩選方法，其包括如下步驟： 利用含有候選藥劑之培養用培養基對包含真皮纖維芽細胞之皮膚細胞培養物進行培養； 測定培養物中之真皮老化因子之表現；及 選擇可抑制真皮老化因子之表現之候選藥劑。
  3. 如請求項2之篩選方法，其中皮膚細胞培養物進而包含幹細胞。
  4. 如請求項1至3中任一項之篩選方法，其中真皮老化因子之表現係藉由測定真皮老化因子之基因表現或蛋白質量而進行。
  5. 如請求項1至4中任一項之篩選方法，其中真皮老化因子為IGFBP7、CFD、或RSPO4。
  6. 一種真皮老化因子之表現抑制劑，其含有薑黃萃取物或野薔薇果萃取物。
  7. 如請求項6之真皮老化因子之表現抑制劑，其中真皮老化因子為CFD。
  8. 一種用以改善皺紋、鬆弛、或肌膚老化之美容或非治療方法，其特徵在於抑制真皮老化因子之表現。
  9. 如請求項8之美容或非治療方法，其中上述真皮老化因子為IGFBP7、CFD、或RSPO4。
TW107124814A 2017-07-18 2018-07-18 抗老化物質之篩選方法 TW201908728A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-139181 2017-07-18
JP2017139181 2017-07-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201908728A true TW201908728A (zh) 2019-03-01

Family

ID=65015112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107124814A TW201908728A (zh) 2017-07-18 2018-07-18 抗老化物質之篩選方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200232972A1 (zh)
EP (1) EP3656867A1 (zh)
JP (1) JP7258749B2 (zh)
CN (1) CN110546270A (zh)
TW (1) TW201908728A (zh)
WO (1) WO2019017356A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7272808B2 (ja) * 2019-02-07 2023-05-12 ポーラ化成工業株式会社 抗皮膚老化剤のスクリーニング方法
CN111909960A (zh) * 2020-08-14 2020-11-10 广州市乾相化妆品有限公司 一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法
CN112553288B (zh) * 2020-12-09 2022-06-07 汤臣倍健股份有限公司 一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998036742A1 (en) 1997-02-25 1998-08-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for preventing and treating chronological aging in human skin
JP4201399B2 (ja) * 1998-10-06 2008-12-24 花王株式会社 皮膚老化防止・改善剤
JP2002080338A (ja) * 2000-06-20 2002-03-19 Shiseido Co Ltd 老化防止用皮膚外用剤
US20030113388A1 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 Dung Phan Methods of treatment for skin disorders using turmeric extract and a hydroxy acid
JP2003342159A (ja) 2002-03-18 2003-12-03 Nikko Chemical Co Ltd 皮膚老化防止化粧料
JP2004075632A (ja) 2002-08-21 2004-03-11 Noevir Co Ltd 真皮線維芽細胞賦活剤
JP5164198B2 (ja) 2007-05-15 2013-03-13 丸善製薬株式会社 プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及び毛穴目立ち抑制剤
CN102498205B (zh) 2009-09-15 2014-06-11 株式会社资生堂 真皮干细胞的分离方法
US8808682B2 (en) 2009-10-23 2014-08-19 Rnl Bio Co., Ltd Method for inducing migration of adipose-derived adult stem cells
WO2012036211A1 (ja) 2010-09-17 2012-03-22 株式会社資生堂 Pdgf-bb活性亢進による皮膚賦活化
US20120283112A1 (en) 2011-02-22 2012-11-08 The Procter & Gamble Company Systems and Methods for Identifying Cosmetic Agents for Skin Care Compositions
WO2012151346A1 (en) * 2011-05-03 2012-11-08 Dermachip Inc. Expression signatures of genes and gene networks associated with skin aging
US9326932B2 (en) * 2011-07-25 2016-05-03 Us Cosmeceutechs, Llc Botanical antioxidant compositions and methods of preparation and use thereof
WO2013192076A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 The Procter & Gamble Company Methods and models for assessing anti-aging benefits of agents
CN103239380A (zh) * 2013-05-20 2013-08-14 刘小青 一种中药的应用及其筛选方法和抗衰老药物
US20160279161A1 (en) * 2013-11-14 2016-09-29 Newsouth Innovation Pty Limited Senescence and senescence associated secretory phenotype
CN106687137A (zh) * 2014-09-16 2017-05-17 昂考梅德药品有限公司 纤维化疾病的治疗
JP6773362B2 (ja) 2015-10-30 2020-10-21 ハウスウェルネスフーズ株式会社 経口摂取又は投与用皮膚保湿剤
FR3042974B1 (fr) 2015-11-04 2017-12-08 Isp Investments Inc Extrait synergique de palmaria palmata et de jasmin, compositions le comprenant et utilisations
JP2017112892A (ja) 2015-12-24 2017-06-29 ポーラ化成工業株式会社 皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法
CN105816807A (zh) * 2016-04-28 2016-08-03 四川力久知识产权服务有限公司 一种含有玄参的用于化妆品的抗衰老中药组合物
JPWO2019017355A1 (ja) * 2017-07-18 2020-05-28 株式会社 資生堂 間葉系幹細胞誘引剤

Also Published As

Publication number Publication date
US20200232972A1 (en) 2020-07-23
WO2019017356A1 (ja) 2019-01-24
JP7258749B2 (ja) 2023-04-17
JPWO2019017356A1 (ja) 2020-05-28
EP3656867A1 (en) 2020-05-27
CN110546270A (zh) 2019-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Patil et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor
US10639264B2 (en) Mesenchymal stem cell extract and its use
Schosserer et al. Urine is a novel source of autologous mesenchymal stem cells for patients with epidermolysis bullosa
KR102360077B1 (ko) 탯줄 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물
TW201908728A (zh) 抗老化物質之篩選方法
EP3656850A1 (en) Mesenchymal-stem-cell induction agent
Ghufran et al. Curcumin preconditioned human adipose derived stem cells co-transplanted with platelet rich plasma improve wound healing in diabetic rats
JP6735887B2 (ja) 間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤、間葉系幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、間葉系幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び間葉系幹細胞の細胞老化抑制方法
WO2017022091A1 (ja) 脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤
JP7019338B2 (ja) 幹細胞性維持及び賦活化剤、並びにそれを含有する皮膚外用剤及び化粧品
Fan et al. Overexpression of klotho in adipose-derived stem cells protects against UVB-induced photoaging in co-cultured human fibroblasts
Bellei et al. Regenerative Medicine-Based Treatment for Vitiligo: An Overview
Kuo et al. Use of proteomic differential displays to assess functional discrepancies and adjustments of human bone marrow-and Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells
JP2018536646A (ja) 脱毛を防ぐ製剤
JP2024500973A (ja) 臍帯由来間葉系幹細胞培養液を有効成分として含む皮膚改善用組成物
KR102153636B1 (ko) 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
JP2017112998A (ja) 細胞積層体、生体移植材料、表皮の分化状態の評価方法及び細胞積層体の製造方法、並びにインスリン様成長因子−１産生促進剤
KR20120058864A (ko) 비피더스균 추출물을 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 및 피부세포 증식용 조성물
TWI674104B (zh) 包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑
JP2018052879A (ja) 幹細胞の細胞老化抑制剤、幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び幹細胞の細胞老化抑制方法
KR102618453B1 (ko) 제대혈 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 튼살 예방 또는 개선용 조성물
KR102153637B1 (ko) 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
KR102153635B1 (ko) 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
Kumar et al. Stem Cells in Dermatology: What the Future May Hold
JP2021092534A (ja) 抗老化成分のスクリーニング方法