KR101367896B1

KR101367896B1 - Ｍｓｍ을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 활성용 조성물

Info

Publication number: KR101367896B1
Application number: KR1020120009237A
Authority: KR
Inventors: 양영목; 정연희; 장주웅
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2014-02-26
Also published as: KR20130087952A

Abstract

본 발명은 MSM(methylsulfonylmethane)의 뼈 성장 활성용 조성물,중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화를 유도하는 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 사람과 동물의 조골세포(골아세포)에서 뼈 성장에 기여하고 있는 IGF-IR, IGF-1 및 GHR 유전자 발현을 매개하는 Jak2와 STAT5b 단백질을 조절 또는 활성화할 수 있어, 상기 Jak2와 STAT5b가 매개하는 뼈 성장을 활성화하여 성장기 어린이의 키를 키우는 효과가 있다. 또한 MSM이 중간엽 줄기세포에서 골 형성과 분화에 있어 GH과 함께 골 분화 marker 유전자들의 발현을 증가시켰고, 골 분화 후기에 중요한 미넬럴화를 강화시키는 효과가 있다.

Description

ＭＳＭ을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 활성용 조성물{Bonegrowth stimulating composition Comprising MSM}

본 발명은 MSM(methylsulfonylmethane)의 뼈 성장 활성용 조성물,중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화를 유도하는 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

생후 수직형(세로형) 뼈의 성장을 위하여 가장 중요한 것이 인슈린 유사 성장인자(IGF-1; insulin-like growth factor-1)와 성장호르몬(GH; growth hormone)이다. 이들 성장 관련 호르몬은 뇌하수체에서 나오며, 이것이 간의 세포에 이르면 IGF-1이라는 인슐린 유사 성장인자 유전자를 작동시킨다. 이 IGF-1은 연골과 뼈로 전달되면서 키가 자라나게 되는 것이다. IGF-1 유전자에 결함이 있는 사람은 임신 중 태아가 제대로 성장하지 못하거나 출생 후에도 성장지체아가 되는 것으로 알려져 있다. 뇌에서 호르몬이 전혀 분비되지 않는 아이들에게 성장호르몬을 공급하거나 성장호르몬의 유전자를 활성화시키는 물질을 공급해주면 당연히 키 성장에 바로 도움이 될 것이다. 하지만 모든 아이들이 뇌에서 공급하는 호르몬이 부족한 것은 아닐 것이다. 뇌에서 충분한 호르몬은 공급되지만 이것이 공급되는 과정에서 다른 기관들이 그것을 IGF-1으로 제대로 변환시키지 못하는 경우에도 키의 성장은 둔화될 수 있다. 즉 뇌에서 충분한 호르몬을 공급하던 공급하지 못하던 뼈를 만드는 조골세포(골아세포)에서 IGF-1이 활성화되어 그 양을 증가시켜줄 경우 연골과 뼈에 키 성장을 위한 충분한 조건을 공급해주면 될 것이다.

한편, IGF-IR(Insulin-like growth factor-1 receptor)은 IGF-I과 IGF-Ⅱ라는 리간드와 인슐린에 의해 활성화되는 transmembrane receptor tyrosine kinase로서, 이 IGF-1R 유전자를 결손 시킨 생쥐(KO mice; knock out mice)는 호흡기관 근육의 발달 미비로 인하여 생후에 바로 호흡 기능의 실패로 사망할 정도의 강력한 성장 관련 단백질이다. 그런데 이러한 IGF-1과 IGF-1R 유전자와 세포 내 핵(nuclear)에서 이 두 유전자의 promoter 부위와 결합(binding)하는 전사조절 단백질이 있는데, 그게 바로 STAT5(signal transducer and activator of transcription 5) 단백질이다. 최근 이 STAT5 단백질의 기능이 차츰 중요시되어 가고 있다. 즉, STAT5(또는 STAT5b)를 활성화시켜 모집하는 기능을 하는 데에는 Jak2 등과 같은 kinase 효소가 중요한 역할을 담당하며, 이로 인해 활성화된 STAT5는 조골세포 증식 및 뼈 성장의 주요 조절자로 알려진 IGF-I 및 IGF-IR 유전자의 프로모터에 직접 결합(binding)하여 이들의 유전자와 단백질 발현을 조절한다는 것이다.

따라서 이러한 핵심 기능을 가진 STAT5 단백질을 조절 또는 증가할 수 있는 여러 가지 방법이나 약물들을 찾아내는 일이야말로 뼈의 성장 및 키를 키우는 데 큰 도움이 될 것이다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020010101425호는 '뼈의 촉진인자 '에 관한 것으로, 포유 동물 뼈 성장을 증가시키거나 촉진시키는 폴리펩티드, 관련 뉴클레오티드 서열, 항체, 진단 키트 및 치료제로, 폴리펩티드 Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Glu Ser의 서브서열은 성장을 촉진시키는 것으로 나타났으며, 서브서열은 Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys를 포함한다고 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020110062429호는 '젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물'에 관한 것으로, 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 조골세포를 유의적으로 증식시키고 뼈의 길이를 효과적으로 성장시켜 성장기 어린이를 위한 식품원으로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 특히 골강도 증진 및 성장촉진용으로 용이하게 사용 가능한 젤라틴 유래 효소분해물(저분자 펩타이드)을 유효성분으로 포함하는 골 성장 촉진용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 조골세포의 증식과 성장 인자들의 활성화에 관여하여 뼈 활성화, 뼈 성장 및 키 키우는 데 도움이 되는 조성물을 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 중간엽줄기세포로부터 조골세포로 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중간엽줄기세포로부터 조골세포로 분화 유도방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인슐린유사 성장인자(IGF)-1R, STAT(signal transducer and activator of transcription)5b, p-STAT(signal transducer and activator of transcription)5 또는 야누스 키나제(Jak) 2 단백질 수준을 농도의존적으로 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane) 및 성장 호르몬을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 STAT(signal transducer and activator of transcription)5b, 또는 야누스 키나제(Jak) 2의 인산화를 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane)을 유효성분으로 포함하는 중간엽줄기세포로부터 조골세포로 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)에 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane)를 처리하여 완전 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

용어 "약학적 허용 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 효능 및 성질을 보유하고, 다수의 경우에서, 본 발명의 화합물은 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 이와 유사한 기의 존재에 의한 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.

약학적 허용 염기 부가 염은 무기 및 유기 염기로부터 생성될 수 있다.

무기 염기로부터 유도된 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염 등이 있으나, 이는 예로서 제시한다.

유기 염기로부터 유도된 염의 예로는 1차, 2차 및 3차 아민, 예컨대 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환된 알킬 아민, 디(치환된 알킬) 아민, 트리(치환된 알킬) 아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환된 알케닐아민, 디(치환된 알케닐) 아민, 트리(치환된 알케닐) 아민, 시클로알킬 아민, 디(시클로알킬) 아민, 트리(시클로알킬) 아민, 치환된 시클로알킬 아민, 이중치환된 시클로알킬 아민, 삼중치환된 시클로알킬 아민, 시클로알케닐 아민, 디(시클로알케닐) 아민, 트리(시클로알케닐) 아민, 치환된 시클로알케닐 아민, 이중치환된 시클로알케닐 아민, 삼중치환된 시클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로시클릭 아민, 디헤테로시클릭 아민, 트리헤테로시클릭 아민, 혼합된 디아민 및 트리아민(여기서 아민상의 치환체의 2 이상은 상이하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐,시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭 등임)의 염으로 구성된 군에서 선택되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 아미노 질소와 함께 2 또는 3 개의 치환체는 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 기를 형성하는 아민도 포함된다. 아민의 적절한 예로는 이소프로필아민,트리메틸 아민, 디에틸 아민, 트리(이소프로필) 아민, 트리(n-프로필) 아민, 에탄올아민,2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인,에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, N-에틸피페리딘 등이 있으나, 이는 단지 예로서 제시하는 것이다.

기타의 카르복실산 유도체, 예를 들면, 카르복스아미드를 비롯한 카르복실산 아미드, 저급 알킬 카르복스아미드, 디알킬 카르복스아미드 등은 본 발명의 실시에 유용할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

약학적 허용 산 부가 염은 무기산 및 유기산으로부터 생성될 수 있다. 무기산으로부터 유도된 염의 예로는 염산염, 수소화브롬산염, 황산염, 질산염, 인산염 등이 있다. 유기산으로부터 유도된 염의 예로는 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 안식향산,신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등 등이 있다.

한 구체예에 의하면, 본 발명의 화합물을 1 이상의 약학적 허용 담체와 혼합하여 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 표준 경로에 의하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼합물은 국소, 경피, 경구, 직장 또는 비경구 (예, 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물을 경구 투여할 경우, 화합물은 액제, 분말, 정제, 캡슐 또는 로젠지로서 투여된다. 화합물은 정제, 캡슐, 로젠지 및 기타의 경구 투여 가능한 형태로 사용되는 1 이상의 통상의 약학적 첨가제 또는 부형제와 혼합하여 사용될 수 있다.

비경구, 보다 바람직하게는 정맥내 주사로 투여할 경우, 본 발명의 화합물을 염수 용액 및/또는 통상의 IV 용액과 혼합할 수 있다. 또한, 혼합물을 화합물의 지연 방출을 가능케 하는 생분해성 중합체에 혼입될 수 있으며,

한 구체예에서, 전달 비이클은 약물 전달을 희망하는 부위, 예를 들면 종양 부위의 부근에 착상된다. 본 발명에 사용하기에 적절한 생분해성 중합체는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[Brem et al., J.Neurosurg. 74: 441-446 (1991)]에 상세하게 기재되어 있다.

활성 화합물의 투여량은 치료하고자 하는 상태, 특정의 화합물 및 기타의 임상적 요인, 예컨대 사람 및 동물의 체중 및 상태 및, 화합물의 투여 경로에 따라 달라진다. 본 발명은 사람 및 수의적 용도 모두에 대한 적용예를 갖는 것으로 이해하여야 한다. 사람에게 경구 투여와 관련된 한 구체예에서, 약 0.1 내지 300 ㎎/㎏/일, 또는 약 0.5 내지 50 ㎎/㎏/일, 또는 약 1 내지 10 ㎎/㎏/일의 투여량이 일반적으로 충분하다.

본 발명의 화합물 이외에, 본 발명의 조성물은 가용화제, 불활성 충전제, 희석제, 부형제 및 향미료를 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 STAT5 단백질을 조절 또는 증가시켜 조골세포 증식과 성장 인자들의 활성화에 관여하여 뼈 성장 및 키 키우는 데 도움이 되는 조성물을 제조하고자 예의 노력을 기울인 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane)은 화학적으로 합성 또는 소나무류에서 증류 추출할 수 있다.

본 발명은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있고, 그 예로는 단백질, 탄수화물, 당, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 칼슘 카보네이트, 전분-젤라틴 페이스트와 같은 영양물, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 및 용매로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 뼈 성장 및 키를 키우는 데 기여하고 있는 IGF-I, IGF-IR 및 GHR 유전자 및 단백질 발현을 매개하는 STAT5(또는 STAT5b) 단백질을 조절 또는 증가시킬 수 있어, 상기 STAT5가 매개하는 뼈 활성, 뼈 성장 및 키 키우는 효과가 있다.

도 1은 MSM에 의한 조골세포의 생존능력에 미치는 영향을 나타내는 그림이다.
도 2는 MSM이 IGF-IR, STAT5b, p-STAT5b와 Jak2 단백질들의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그림이다.
도 3은 MSM에 의한 IGF-IR 및 GHR 유전자와 단백질 발현 증가를 나타내는 그림이다.
도 4는 MSM이 STAT5b 단백질과 IGF-IR 유전자 간의 결합 부위 및 상호 결합력에 미치는 영향을 나타내는 그림이다.
도 5는 MSM에 의한 IGF-IR와 IGF-1의 프로모터의 활성 조사를 나타내는 그림이다.
도 6은 MSM이 Jak2/STAT5b 활성화를 통한 GH 신호조절에 미치는 영향을 나타내는 그림이다.
도 7은 MSM이 중간엽 줄기세포에서 골 분화에 미치는 영향을 나타내는 그림이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

하기 화학식 1의 MSM은 (주)케어메딕스(대전시 유성구)에서 구입하여 사용하였다.

[화학식 1]

실시예 1: 세포배양

MG-63과 UMR-106 조골 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100 U/㎖ 페니실린이 포함된 MEM 배지(Sigma Chemical, USA)에서 배양하였다.

또한, COS-7 원숭이 신장세포를 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루타민 및 100U/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Gibco-BRL, USA)에서 배양하였다.

Primary bone marrow mesenchymal stem cell은 6주령 BALB/c 쥐의 대퇴골과 경골에서 골수를 배양액으로 빼낸 후 원심분리 하여 pellet의 세포들만 남겨 10% FBS와 1% 페니실린이 포함된 α-MEM에 배양한 후, 6일째 되는 날, 10 MM sodium βglycero phosphate and 50 μg/ml ascorbic acid가 포함된 α-MEM 배지(complete media)로 갈아주고 2일에 한번 씩 배지를 갈아주어 골 분화를 유도한다.

상기 배양된 세포들은 실험시마다, 2.5×10⁵cells/㎖ 밀도로 적당한 배지에 재현탁하여 사용하였다.

실시예 2: MSM 에 의한 조골세포의 생존능력에 미치는 영향에 대한 조사

본 발명은 먼저 96-well plates에 인간 조골 세포주 MG-63과 쥐 조골 세포주 UMR-106을 사용하여 MSM을 농도 (0, 5, 10, 15 및 20 mM)에 따라 처리하고, 24시간 동안 배양한 다음 생존해 있는 세포에만 활성을 띠어 염색(blue formazan)되는 MTT를 처리한 다음 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 세포를 파쇄하고 세포 파쇄액을 얻었다. Formazan 생산물은 각 well에 DMSO를 첨가하여 용해시킨 후 550nm에서 읽는다. 상기 과정을 3번 반복하여 실험하고 대표적인 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와같이 MSM이 조골세포에서 독성이 없음을 확인하였다.

실시예 3: MSM 이 IGF - IR , STAT5b , p- STAT5b 와 Jak2 단백질들의 발현에 미치는 영향 조사

MSM이 IGF-1R, STAT5b, p-STAT5b와 Jak2 단백질들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

인간 조골 세포주 MG-63과 쥐 조골 세포주 UMR-106을 사용하여 MSM을 농도 (0, 5, 10, 15 및 20 mM)에 따라 처리하고, 24 시간 동안 배양하여, MSM에 의해 조절되는 각 단백질들의 발현 정도를 조사하였다.

즉, 상기 배양된 각각의 세포에 RIPA lysis 완충액(Gibco-BRL, USA)를 첨가하여 얻은 세포 파쇄액을 10% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상에서 전개시키고 다시 니트로셀룰로스 막 위에 이동시킨 다음 IGF-1R, STAT5b, p-STAT5와 Jak2 단백질에 대한 항체를 사용하여 블럿팅하고, 항-β-액틴 항체를 사용하여 표지하였다(도 2). 도 2에 나타낸 바와 같이, 인슐린유사 성장인자(IGF)-1R, STAT(signal transducer and activator of transcription)5b, p-STAT(signal transducer and activator of transcription)5와 야누스 키나제(Jak) 2의 단백질 수준은 MSM에 의해 용량과 농도-의존적으로 증가됨(up-regulated)을 알 수 있었다.

실시예 4: MSM 에 의한 IGF - IR 및 GHR 유전자와 단백질 발현 증가 조사

MSM에 의해 자극을 받은 쥐 조골 세포(UMR-106 cell)에서 IGF-1R와 GHR의 전사 활성과 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 이용한 total RNA Semi- quantitative analysis와 단백질을 추출하여 Western blot analysis를 하였다.

먼저, 쥐 조골 세포주 UMR-106을 사용하여 MSM을 농도(0, 10 및 20 mM)에 따라 처리하여 24시간 동안 배양하거나, 쥐 조골 세포주 UMR-106을 사용하여 Jak2 억제제인 AG490을 전처리 한 다음 20 mM MSM을 처리하여 mRNA와 단백질을 추출하여 IGF-1R와 GHR 유전자의 전사 mRNA를 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)과 Western blot을 수행하여 각각 측정하였다. 각 측정값은 상기 β-액틴 mRNAs 수준을 정상화하여 3번 반복 측정하여 얻어졌다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, MSM을 처리한 경우, IGF-IR와 GHR 유전자와 단백질 발현이 증가하였고, AG490을 전처리한 것은 IGF-1R와 GHR 유전자와 단백질 발현이 감소함을 알 수 있었다. 따라서 MSM에 의해 유도된 signaling은 Jak2/STAT5b를 통한 GH signaling과 비슷하게 조절됨을 알 수 있었다(도 3).

실시예 5: MSM 이 STAT5b 단백질과 IGF - IR 유전자 간의 결합 부위 및 상호 결합력에 미치는 영향 조사

본 발명은 MSM이 STAT5b 단백질과 IGF-1R 유전자 간의 결합 부위 (binding sites)및 상호 결합력에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 쥐 조골 세포주 UMR-106을 사용하여 20 mM MSM을 시간(0, 12, 24 h) 동안 처리한 후 핵 단백질을 추출하였다. MSM에 의해 세포질 내에서 발현된 STAT5b가 핵 안의 IGF-IR 프로모터에 결합함으로써 활성화에 영향을 주는지를 확인하기 위해 EMSA(kit: Promega Corp, WI)를 실시하였고 MSM이 핵 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 Western blot을 시행하였다.

그 결과, MSM에 의해 시간에 따라 IGF-IR 유전자와 STAT5b 결합력이 강해지는 것을 알 수 있었고(도 4A), IGF-1R와 p-STAT5b 발현 또한 증가함을 알 수 있었다(도 4B).

실시예 6: MSM 에 의한 IGF - IR 와 IGF -1의 프로모터의 활성 조사

STAT5b 단백질에 의해 IGF-1R 프로모터와 IGF-I 프로모터가 활성화되는지 여부를 조사하기 위하여, COS-7 cell을 사용하여 MSM 및 AG490을 전 처리한 세포에 MSM 처리에 의한 STAT5b/IGF-1R pGL2P 및 STAT5b/700bpIGF-I-pGL2 프로모터(Dr. Honglin Jiang, Virginia Polytechnic Institute and State University, USA.)의 활성화 정도를 조사하였다. 상기 프로모터의 700bpIGF-I-pGL2 부위는 5-말단으로부터 700bp 떨어진 부위로 IGF-I 유전자의 STAT5 결합 부위를 포함하고 있다.

구체적으로, MSM 및 AG490을 전 처리한 세포에 MSM 처리에서 각각 STAT5b/IGF-1R pGL2P 및 STAT5b/700bpIGF-I-pGL2 프로모터의 활성화 정도를 상대적인 루시페라제 활성을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, MSM에 의해 STAT5b/IGF-1R pGL2P 및 STAT5b/700bpIGF-I-pGL2 프로모터의 활성이 증가하였고, Jak2 inhibitor인 AG490을 전 처리 한 다음 MSM 처리한 것의 STAT5b/IGF-1R pGL2P 및 STAT5b/700bpIGF-I-pGL2 프로모터의 활성이 감소되는 것을 알 수 있었다(도 5).

실시예 7: MSM 이 Jak2 / STAT5b 활성화를 통한 GH 신호조절에 미치는 영향 조사

쥐 조골 세포(UMR-106 cell)에 Growth hormone 30 nM을 2 시간 동안 처리한 후 MSM을 농도(0, 10 및 20 mM)에 따라 처리한 후 24 시간 동안 배양한다.

즉, 상기 배양된 각각의 세포에 RIPA lysis 완충액(Gibco-BRL, USA)를 첨가하여 얻은 세포 파쇄액을 Jak2 항체와 침전(immunoprecipitation)시킨 후 protein G agarose bead를 첨가하여 얻은 침전된 단백질을 8 ~ 10% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상에서 전개시키고 다시 니트로셀룰로스 막 위에 이동시킨 다음 phoshpotyrosine (4G10) 항체와 Jak2 항체를 사용하여 블럿팅하고, 항-β-액틴 항체를 사용하여 표지하였다.

또한, 쥐 조골 세포(UMR-106 cell)에 GH 30 nM을 처리하기 6 시간 전에 Jak2 억제제인 AG490을 처리한 다음 20 mM MSM 20 mM을 처리한 후 24 시간 동안 배양한다. 위와 같은 방법으로 얻은 세포 패쇄액을 STAT5b 항체와 침전(immunoprecipitation)시킨 후 protein G agarose bead를 첨가하여 얻은 침전된 단백질을 8 ~ 10% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상에서 전개시키고 다시 니트로셀룰로스 막 위에 이동시킨 다음 phoshpotyrosine (4G10) 항체와 STAT5b 항체를 사용하여 블럿팅하고, 항-β-액틴 항체를 사용하여 표지하였다(도 6A).

그 결과, GH과 MSM을 처리한 경우, GH만 처리했을 경우보다 Jak2의 인산화가 증가하는 것을 알 수 있었고, 도 6B 나타난 바와 같이, GH과 MSM을 처리한 경우에 STAT5b의 인산화가 증가하였고, Jak2 억제제인 AG490을 전 처리한 경우에는 STAT5b 인산화가 다시 감소함을 알 수 있었다. 따라서 MSM이 Jak2/STAT5b를 통한 GH signaling을 강화함을 알수 있었다.

실시예 8: MSM 이 중간엽 줄기세포에서 골 분화에 미치는 영향 조사

조골세포 분화의 early-differentiation marker이며 bone matrix 단백질인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성화를 보기 위해 골수세포에서 추출한 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)에 complete 배지로 조골세포 분화를 유도하고, MSM을 농도(0, 5, 10 및 20 mM)에 따라 처리한 후 시간(1, 3, 5 및 7 days)에 따라 배양 한다. 그 다음 ALP kit를 이용하여 세포에 ALP substrate solution을 처리하여 실온에서 40~ 60 분 동안 incubation한 후, absorbance plate reader로 405 nm에서 ALP 활성화를 측정한다.

그 결과, MSM의 농도에 따라 5 day에서 ALP 활성화가 증가함을 알 수 있었다(도 7A).

또한, 조골세포에서 MSM이 matrix mineralization에 미치는 영향을 알아보기위해 골수세포에서 추출한 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)에 cmplete 배지와 MSM을 농도(0, 10 및 20 mM)에 따라 처리하여 21 days 동안 배양한 후 Alizarin Red S로 염색하여 미넬화 정도를 측정한다. 그 결과, MSM 농도에 따라 mineralization이 증가함을 알 수 있었다(도 7B).

또한, MSM이 osteogenic marker 유전자인 ALP, Osteonectin(ON), Bone sialoprotein(BSP), Osteocalcin(OCN) 및 Osterix(Osx)의 전사활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 이용한 total RNA Semi- quantitative analysis를 하였다. 그 결과, 위 osteogenic marker 유전자의 mRNA 발현이 MSM의 농도(0, 10 및 20 mM)에 따라 증가함을 알 수 있었다(도 7C). 이는 MSM에 의해 골 분화의 초기단계 marker인 ALP 뿐만 아니라 중간단계 marker인 ON과 BSP, 후기단계 marker인 OCN과 Osx까지 모두 positive한 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 따라서, MSM이 중간엽줄기세포에서 조골세포 분화를 더 강화함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane)을 유효성분으로 포함하는 중간엽줄기세포로부터 조골세포로 분화 촉진용 조성물.
인 비트로에서 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)에 메틸설포닐메탄(methylsulfonylmethane)을 처리하여 완전 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화를 유도하는 방법.